CN110025790A - 一种还原响应型康布斯汀的两亲性聚合物药物前体及其制备方法和应用 - Google Patents
一种还原响应型康布斯汀的两亲性聚合物药物前体及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种还原响应型康布斯汀的两亲性聚合物药物前体及其制备方法和应用，其具有如下所示的分子结构：其中，聚合度n为5～1000，m为1或2，X为O或NH。本发明提供的药物前体能够实现靶向给药，既保留了纳米载药系统的优势，同时又发挥了二硫键在肿瘤部位特异性降解的特点。与常规的2,2′‑二硫代二乙酸、3,3′‑二硫代二丙酸等连接臂相比，无需通过进一步水解就可以得到原药分子形式的抗癌药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种两亲性聚合物药物前体及其制备方法和应用，尤其涉及一种康布斯汀的两亲性聚合物药物前体及其制备方法和应用。
背景技术
Combretastatin A-4(CA-4)(简称:康布斯汀)是从南非灌木柳树皮中分离得到的天然强效小分子抗有丝分裂剂，为一种多羟基二苯乙烯类天然化合物，化学名为顺式-1-(3，4，5-三甲氧苯基)-2-(3′-羟基-4′-甲氧苯基)乙烯，其作用位点与秋水仙碱相同，能够抑制微管蛋白的聚合，同时能够抑制细胞中微管蛋白的解聚和有丝分裂物的累积。CA-4能针对肿瘤的血管显示出特异性靶向和破坏已生成的肿瘤血管，使肿瘤得不到氧气和营养，直到肿瘤“饿死”，从而达到杀死肿瘤细胞的作用，有望开发成临床上有效的抗肿瘤药物。但是CA-4具有很多缺陷，比如水溶性差，反式构型没有活性，且极差的水溶性使CA4口服的生物利用度较低。为了提高CA4的水溶性，使其更易于体内用药，传统方式是将CA4设计改造成磷酸二钠前药(CA4P)，其磷酸盐基团在体内需要在磷酸酯酶的作用下转化成CA4，但是完全转化尚需要较长的时间，另外，药物动力学研究表明，CA4P的半衰期仅几分钟，在体内消除很快，为维持阻断肿瘤血管，必须短时间内反复用药，副作用较大，因此临床应用受到限制。
通过化学修饰在药物的分子结构中引入亲水性基团，制备得到水溶性的前药，可以有效的解决疏水性药物的水溶性问题。在水溶性高分子聚合物中，聚乙二醇得到了广泛关注。聚乙二醇是一种生物相容性优异的高分子材料，已经被美国FDA批准为可体内注射的药用高分子聚合物之一。疏水性药物经聚乙二醇修饰之后，水溶性和体内稳定性均得以提高，并能显著降低肾脏清除率，大大延长血液循环时间，还能通过EPR效应增强肿瘤处的积聚，这些均对提高肿瘤治疗效果、降低毒副作用具有至关重要的作用。
近年来，纳米给药系统以其优良特性受到了广泛的关注，纳米给药系统具有以下特征:较大程度提高药物的水溶性、通过提高渗透性和保留效应 (EPR)来实现对肿瘤的被动靶向、延长体内循环时间、提高药物利用率以及降低毒副作用等。然而，普通的纳米制剂并不能识别肿瘤部位与正常部位，也不能区分细胞内及细胞外的环境，因此如何让纳米制剂在体内选择性的释放出原药仍然是一大难题。
研究发现，细胞内的谷胱甘肽浓度(0.5～10mM)是细胞外谷胱甘肽浓度(2～20μM)的200倍以上，二硫键在一定量的谷胱甘肽(GSH)或二硫苏糖醇(DTT)等还原剂存在下被还原生成巯基，但是在人体的正常体温、 pH和氧化等环境下非常稳定，即细胞外的谷胱甘肽浓度不足以还原二硫键，另外，肿瘤组织细胞比正常组织细胞缺氧，更具有还原性环境。因此，可以将亲水性的聚合物和疏水性的药物通过二硫键链接，并在溶剂中自组装成纳米胶束，通过细胞内吞作用进入靶细胞后被GSH还原，即二硫键断裂生成巯基，从而快速有效地释放药物，并扩散到细胞核等结构，从而杀死癌细胞。目前最常用的二硫键连接臂主要为2,2′-二硫代二乙酸、3,3′-二硫代二丙酸等，但以这些二硫键连接臂连接亲水性的聚合物与疏水性药物后，在GSH、 DTT等还原条件下，二硫键迅速发生断裂，但是断裂后释放的药物上还连接有巯基和酯键这样的一个“尾巴”，而并非原料分子形式，中国专利 CN102775596所公开的聚合物药物前体在二硫键断裂释放药物的时候即属于上述的情况，要想得到原料分子形式的药物需再经过酯键水解的步骤，而在人体细胞内的弱碱性条件下，酯键的水解缓慢且不完全，直接影响药物的抗肿瘤效果。
发明内容
本发明针对现有技术公开的二硫键连接亲水性聚合物与疏水性药物形成的聚合物药物在二硫键断裂时不能释放原药的不足，提供一种还原响应型康布斯汀的两亲性聚合物药物前体及其制备方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种还原响应型康布斯汀的两亲性聚合物药物前体，具有如下所示的分子结构式：
其中，聚合度n为5～1000，m为1或2，X为O或NH。
本发明提供的聚合物药物前体释放原药分子的机理为：
本发明采用了肿瘤微环境靶向给药的思路，通过引入对还原环境敏感的自毁式二硫键连接臂，在肿瘤细胞内谷胱甘肽提供的还原条件下，聚合物药物前体的二硫键发生断裂，二硫键断裂后生成一个自由的巯基，由于受到结构稳定因素的影响，该巯基会亲核进攻邻近的酯键从而生成一个稳定的五元环或六元环结构，同时释放抗癌药物的原药分子，其还原响应释放原药分子的机理如图2所示。
本发明提供的聚合物药物前体的有益效果为：
1)本发明提供的药物前体能够实现靶向给药，既保留了纳米载药系统的优势，同时又发挥了二硫键在肿瘤部位特异性降解的特点。与常规的2,2′ -二硫代二乙酸、3,3′-二硫代二丙酸等连接臂相比，无需通过进一步水解就可以得到原药分子形式的抗癌药物。
2)本发明得到的两亲性聚合物药物前体，可以在溶剂中自发组装成纳米胶束。
本发明还要求保护由上述的聚合物药物前体制备而成的聚合物纳米胶束，所述聚合物纳米胶束是由如下方法制成的，将前述的聚合物药物前体和脂肪酸甘油三酯置于水中溶解得二者的混合溶液，后将溶液超声，过滤膜，向其中加入甘露醇冻干，即得聚合物纳米胶束，所得胶束的粒径为10～400 nm，载药量为1～50wt％。
本发明还要求保护前述的药物前体以及由本发明的药物前体制备而成的聚合物纳米胶束在抗肿瘤药物领域的应用。
进一步，所述肿瘤指的是结直肠癌。
本发明还提供了上述聚合物药物前体的制备方法，包括如下步骤：
1)将含有2-3个碳原子的巯基醇或巯基胺与2,2′-二硫二吡啶反应，制得吡啶基二硫基醇或吡啶基二硫基胺；
2)使用对硝基氯甲酸苯酯与步骤1)得到的吡啶基二硫基醇或吡啶基二硫基胺进行偶联反应制得碳酸酯或氨基碳酸酯；
3)将步骤2)所得的碳酸酯或氨基碳酸酯与康布斯汀通过酯交换反应生成偶联物；
4)将步骤3)所得的偶联物与巯基化聚乙二醇(PEG-SH)通过巯基- 二硫键交换反应，制得含有二硫键和聚乙二醇的两亲性聚合物药物前体；
反应路线如下：
进一步，具体反应步骤如下：
步骤一：将含有2-3个碳原子的巯基醇或巯基胺和2,2′-二硫二吡啶按照摩尔比1:(1～3)加入溶剂中，室温搅拌反应12～48小时，反应完毕，浓缩、硅胶柱分离、浓缩、干燥得吡啶基二硫基醇或吡啶基二硫基胺；
步骤二：在碱性条件下，将步骤一所得的吡啶基二硫基醇或吡啶基二硫基胺溶于溶剂中，搅拌下将对硝基氯甲酸苯酯缓慢滴加至溶液中，控制吡啶基二硫基醇或吡啶基二硫基胺与对硝基氯甲酸苯酯的摩尔比为1：(1～3)，室温搅拌反应1～10小时，浓缩、硅胶柱分离、浓缩、干燥得碳酸酯或氨基碳酸酯；
步骤三：在碱性条件下，将步骤二所得的碳酸酯或氨基碳酸酯和康布斯汀按摩尔比1:(1～3)溶于溶剂中，室温搅拌反应12～48小时，反应液经酸洗、分液、干燥、浓缩、硅胶柱纯化、浓缩、真空干燥得二者的偶联物；
步骤四：搅拌条件下将巯基化聚乙二醇(PEG-SH)滴加到步骤三所得偶联物的溶液中，控制巯基化聚乙二醇和偶联物的摩尔比为1:(1～3)，室温下搅拌反应12～48小时，浓缩、硅胶柱纯化、浓缩、溶解、过滤、冻干，得含有二硫键的聚乙二醇抗癌药物前体。
本发明提供的两亲性聚合物药物前体的制备方法的有益效果是：原料易得、反应条件温和、产率和产物纯度高等优点，利于批量生产。
附图说明
图1为实施例1制备的康布斯汀的两亲性聚合物药物前体的核磁共振氢谱；
图2为本发明的聚合物药物前体还原响应释放原药分子的机理示意图；
图3为实施例1所得聚合物药物前体在DTT条件下还原响应释药结果图；
图4为实施例2所得胶束的粒径分布图；
图5为实施例2所得胶束与对结直肠癌细胞HCT116的增殖抑制活性。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1：
一种还原响应型康布斯汀的两亲性聚合物药物前体，具有如下所示的分子结构：
其中5<n<100。
上述两亲性聚合物药物前体的制备方法如下：
1)2-(2-吡啶基二硫基)乙醇的制备：
将2-巯基乙醇(1.0g，12.8mmol)和2，2′-二硫二吡啶(Py-SS-Py，8.46 g，38.4mmol)加入100mL甲醇中，室温搅拌反应12小时。减压蒸去甲醇，过硅胶柱纯化，浓缩，真空干燥得2.2g淡黄色固体产物，收率84％。
(2)4-硝基苯基-2-(2-吡啶基二硫基)乙基碳酸酯的制备：
将2-(2-吡啶基二硫基)乙醇(2.2g，10.8mmol)和三乙胺(2.2g，21.6 mmol)溶于100mL二氯甲烷中，搅拌下将对硝基氯甲酸苯酯(6.5g，32.4mmol)缓慢滴加至溶液中，滴毕，室温搅拌反应1小时。浓缩，硅胶柱分离、浓缩、真空干燥得白色固体产物2.58g，收率67.7％。得到式b所示结构的4-硝基苯基-2-(2-吡啶基二硫基)乙基碳酸酯。
(3)2-(2-吡啶基二硫基)乙基碳酸酯与康布斯汀偶联物的制备：
将4-硝基苯基-2-(2-吡啶基二硫基)乙基碳酸酯(2.58g，7.32mmol) 和康布斯汀(1.93g，6.11mmol)溶于200mL二氯甲烷中，加入4ml三乙胺，室温搅拌反应48小时。反应完毕，用稀盐酸水溶液水洗有机相、分液、干燥、浓缩、经硅胶柱纯化、浓缩，真空干燥得2.6g淡黄色固体，收率为 80％。得到式c所示结构的2-(2-吡啶基二硫基)乙基碳酸酯与康布斯汀偶联物(Py-SS(O)-CA-4)。
(4)聚乙二醇-二硫键-康布斯汀的制备：
将mPEG2000-SH(4.6g，2.3mmol)溶于200mL二氯甲烷中，搅拌下，滴加PySS(O)-CA-4(1.4g，2.5mmol)的二氯甲烷(100mL)溶液，室温下搅拌反应48小时。减压蒸去二氯甲烷，经硅胶柱纯化，浓缩得到3.4g 淡黄色固体，收率为60.7％。对产物进行1H NMR测试，表明得到式d所示结构的聚乙二醇-二硫键-康布斯汀，如图1。
上述合成路线如下：
为了验证实施例1所得的两亲性聚合物药物前体在还原条件下是否释放原药分子，我们将实施例1所得聚合物药物前体置于10mM的还原剂DTT 溶液中后不同时间的产物均进行了HPLC测试，结果如图3所示，由图3我们可以看出，实施例1所得聚合物药物前体在DTT溶液中放置10min后，产物中已经出现了原药分子康布斯汀，表明已经有一部分的聚合物药物前体分解释放出了原药，而随着放置时间的逐渐延长，原药分子康布斯汀的量逐渐增加，因而本申请提供的聚合物药物前体在还原条件下可以迅速分解释放原药。
实施例2：
一种含有实施例1所得两亲性聚合物药物前体的纳米胶束，采用如下方法制成：将20mg聚合物药物前体和10μL中链脂肪酸甘油三酯置于水中，然后超声1min，过滤膜，向其中加入甘露醇冻干，即得还原响应型聚合物纳米胶束冻干粉。利用动态光散射(DynamicLight Scattering，DLS)测定得到纳米胶束的粒径及分布(图4)。
实施例3：
一种还原响应型康布斯汀的两亲性聚合物药物前体，具有如下所示的分子结构：
其中100<n<1000。
上述两亲性聚合物药物前体的制备方法如下：
1)吡啶基二硫乙胺盐酸盐的制备：
将巯基丙胺盐酸盐(1.0g，7.9mmol)和2,2′-二硫二吡啶(Py-SS-Py， 2.3g，9.4mmol)加入60mL甲醇中，室温搅拌反应48小时。减压浓缩反应液，乙醚沉降目标产物，抽滤，真空干燥得如式e所示的1.39g淡黄色油状液体产物，收率74.4％。
2)4-硝基苯基-(2-吡啶基二硫基)氨基碳酸酯的制备：
将吡啶基二硫乙胺盐酸盐(1.39g，5.9mmol)和三乙胺(0.72g，7.1mmol) 溶于50mL二氯甲烷中，冰浴下将对硝基氯甲酸苯酯(1.65g，8.26mmol) 缓慢滴加至溶液中，滴毕，室温搅拌反应5小时。浓缩，硅胶柱分离、浓缩、真空干燥得式f所示的淡黄色油状液体1.70g，收率79.8％。
3)4-硝基苯基-(2-吡啶基二硫基)氨基碳酸酯与康布斯汀偶联物的制备：
将4-硝基苯基-2-(2-吡啶基二硫基)氨基碳酸酯(1.70g，4.66mmol) 和康布斯汀(4.42g，13.98mmol)溶于200mL二氯甲烷中，加入5ml三乙胺，室温搅拌反应12小时。反应完毕，用稀盐酸水溶液水洗有机相、分液、干燥、浓缩、经硅胶柱纯化、浓缩，真空干燥得1.89g淡黄色固体，收率为75％。得到式g所示结构的2-(2-吡啶基二硫基)氨基碳酸酯与康布斯汀偶联物(Py-SS(N)-CA-4)。
(4)聚乙二醇-二硫键-康布斯汀的制备：
将mPEG5000-SH(4.6g，0.92mmol)溶于200mL二氯甲烷中，搅拌下，滴加PySS(N)-CA-4(1.5g，2.76mmol)的二氯甲烷(50mL)溶液，室温下搅拌反应12小时。减压蒸去二氯甲烷，经硅胶柱纯化，浓缩得到3.7g 淡黄色固体h，收率为71.5％。
上述合成路线如下：
实施例3所得的聚合物药物前体制成纳米胶束的方法同实施例2。
为了验证本发明所得聚合物药物前体对肿瘤细胞的增殖抑制效果，我们取实施例2所得的聚合物胶束以及康布斯汀进行了体外抗肿瘤细胞的效果对比实验，我们以对结直肠癌细胞HCT116为例进行了实施例2所得的聚合物胶束与康布斯汀对肿瘤细胞的增殖抑制效果实验，具体操作过程如下：
取对数生长期的细胞，调整适当的细胞密度，接种于96孔板内，100μl/well，培养于37℃，5％CO2的培养箱内。培养过夜后给药，分别加药作用 48h。分设空白组、给药组，每组设4个复孔。体外抗结直肠癌细胞效果如图4所示。从图4中可以看出,聚乙二醇-二硫键-康布斯汀聚合物胶束与康布斯汀具有近似的细胞毒性,聚乙二醇-二硫键-康布斯汀聚合物胶束对结直肠癌细胞HCT116的半数抑制率IC50小于0.01μM，有较强的抗肿瘤活性。
综上所述，本发明提供的两亲性聚合物药物前体不仅水溶性好，并且能够在水溶液中自组装成纳米胶束，且经过实验证明与原药具有基本相当的抗肿瘤活性，可以于48h内发挥出其对肿瘤细胞的抑制作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种还原响应型康布斯汀的两亲性聚合物药物前体，其特征在于，具有如下所示的分子结构式：
其中，聚合度n为5～1000，m为1或2，X为O或NH。
2.一种聚合物纳米胶束，其特征在于，所述聚合物纳米胶束是由如下方法制成的，将权利要求1所述的聚合物药物前体和脂肪酸甘油三酯置于水中溶解得二者的混合溶液，后将溶液超声，过滤膜，向其中加入甘露醇冻干，即得聚合物纳米胶束。
3.根据权利要求2所述的聚合物纳米胶束，其特征在于，所述聚合物纳米胶束的粒径为10～400nm，载药量为1～50wt％。
4.一种权利要求1所述的聚合物药物前体和权利要求2、3任一项所述的聚合物纳米胶束在抗肿瘤药物领域的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肿瘤是指结直肠癌。
6.一种权利要求1所述的两亲性聚合物药物前体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将含有2-3个碳原子的巯基醇或巯基胺与2,2′-二硫二吡啶反应，制得吡啶基二硫基醇或吡啶基二硫基胺；
2)使用对硝基氯甲酸苯酯与步骤1)得到的吡啶基二硫基醇或吡啶基二硫基胺进行偶联反应制得碳酸酯或氨基碳酸酯；
3)将步骤2)所得碳酸酯或氨基碳酸酯与康布斯汀通过酯交换反应生成偶联物；
4)将步骤3)所得的偶联物与巯基化聚乙二醇通过巯基-二硫键交换反应，制得含有二硫键的聚乙二醇两亲性聚合物药物前体；
反应路线如下：
7.根据权利要求6所述的两亲性聚合物药物前体的制备方法，其特征在于，具体反应步骤如下：
步骤一：将含有2-3个碳原子的巯基醇或巯基胺和2,2′-二硫二吡啶按照摩尔比1:(1～3)加入溶剂中，室温搅拌反应12～48小时，反应完毕，浓缩、硅胶柱分离、浓缩、干燥得吡啶基二硫基醇或吡啶基二硫基胺；
步骤二：在碱性条件下，将步骤一所得的吡啶基二硫基醇或吡啶基二硫基胺溶于溶剂中，搅拌下将对硝基氯甲酸苯酯滴加至溶液中，室温搅拌反应1～10小时，控制吡啶基二硫基醇或吡啶基二硫基胺与对硝基氯甲酸苯酯的摩尔比为1：(1～3)，浓缩、硅胶柱分离、浓缩、干燥得碳酸酯或氨基碳酸酯；
步骤三：在碱性条件下，将步骤二所得的碳酸酯或氨基碳酸酯和康布斯汀按摩尔比1:(1～3)溶于溶剂中，室温搅拌反应12～48小时，反应液经酸洗、分液、干燥、浓缩、硅胶柱纯化、浓缩、真空干燥得二者的偶联物；
步骤四：搅拌条件下将巯基化聚乙二醇滴加到步骤三所得偶联物的溶液中，控制巯基化聚乙二醇和偶联物的摩尔比为1:(1～3)，室温下搅拌反应12～48小时，浓缩、硅胶柱纯化、浓缩、溶解、过滤、冻干，得含有二硫键和聚乙二醇的两亲性聚合物药物前体。
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