JP2023121159A - 標的リガンド - Google Patents
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Abstract
【課題】脂質異常症の予防及び/又は治療に用いるための、ANGPTL3の標的リガンド化合物、及び該標的リガンドとsiRNAのコンジュゲートを提供する。
【解決手段】本発明による標的リガンドと特異的な低分子干渉RNA配列とはsiRNAコンジュゲートを形成し、ANGPTL3を標的とし、細胞中のANGPTL3遺伝子の転写物を分解することにより、ANGPTL3タンパク質の発現量を低下させ、それにより、本開示による標的リガンドによって形成されるsiRNAコンジュゲートは、脂質異常症の予防及び/又は治療に有用である。前記標的リガンドは、少なくとも1つのN-アセチル-ガラクトサミンを含む。
【選択図】図1
【解決手段】本発明による標的リガンドと特異的な低分子干渉RNA配列とはsiRNAコンジュゲートを形成し、ANGPTL3を標的とし、細胞中のANGPTL3遺伝子の転写物を分解することにより、ANGPTL3タンパク質の発現量を低下させ、それにより、本開示による標的リガンドによって形成されるsiRNAコンジュゲートは、脂質異常症の予防及び/又は治療に有用である。前記標的リガンドは、少なくとも1つのN-アセチル-ガラクトサミンを含む。
【選択図】図1
Description
(関連出願の相互参照)
本出願は、分割出願であり、親出願は、PTC出願が中国国家段階に入った出願であり、親出願の出願番号が2021800229023であり、PTC国際出願日が2021年09月30日であり、中国国家段階に入った日付が2022年10月18日であり、親出願の発明名称が「アンギオポエチン様3のsiRNA及びその用途」である。
本出願は、分割出願であり、親出願は、PTC出願が中国国家段階に入った出願であり、親出願の出願番号が2021800229023であり、PTC国際出願日が2021年09月30日であり、中国国家段階に入った日付が2022年10月18日であり、親出願の発明名称が「アンギオポエチン様3のsiRNA及びその用途」である。
本開示は、遺伝子工学技術分野に関し、具体的には、本開示は、標的リガンドとすることができる新たな化合物に関する。
高脂血症は、脂質異常症とも呼ばれ、脂肪代謝又は運転異常により血漿脂質が正常値よりも高くなる全身性疾患である。脂質異常症の臨床症状としては、大きく分けて、(1)脂質の皮内沈着による黄色腫、(2)脂質の血管内皮沈着によるアテローム性動脈硬化症、冠動脈性心疾患、末梢血管疾患などが挙げられる。調査によれば、成人での総血中コレステロール(TC)又はトリグリセリド(TG)の上昇は約10%から20%程度、また小児でも約10%もの高脂血症が見られる。従来の脂質異常症の治療薬としては、スタチン類、コレステロール吸収阻害剤、樹脂類、プロベナゾール類、フィブラート類、ニコチン酸及びその誘導体が主流であった。
アンギオポエチン様タンパク質3(ANGPTL3、NM_014495.4)は、主に肝臓細胞で発現される分泌タンパク質である。アンジオポエチン様タンパク質3(ANGPTL3)は、LDL-C、HDL-C及びトリグリセリド代謝の重要な調節因子であり、様々な潜在的な作用ノードを有することが研究によって示されており、ANGPTL3の機能喪失型突然変異は、LDL-C、VLDL-C、HDL-C及びトリグリセリド(TG)の低下をもたらし、GWASに基づく心血管疾患のリスクを低下させ、既知の遺伝子欠損の有害表現型がない。従って、ANGPTL3活性の阻害は、脂質異常症の予防又は治療に有効である。
従来技術では、ANGPTL3抗体を用いてその活性を阻害することが多い。
出願番号がCN201280038908.0である中国特許には、ヒトアンジオポエチン様タンパク質3(hANGPTL3)に特異的に結合し、その少なくとも1つの活性を阻害または干渉する、完全ヒト化抗体又はヒト抗体の抗原結合断片が開示されている。このヒト抗hANGPTL3抗体は、ANGPTL3に関わる疾患又は障害、例えば、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、カイロミクロン血症などを含む高脂血症、高リポタンパク血症及び脂質異常症などの治療に有用である。
出願番号がCN201780026147.Xである中国特許には、HeFH及びHoFHを含む家族性高コレステロール血症を患っている患者を治療するための方法が開示されている。ANGPTL3に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片の治療有効量を他の薬物と組み合わせて投与することによって、患者の少なくとも1つの脂質パラメーターを低下させる。高トリグリセリド血症、カイロミクロン血症などを含む高コレステロール血症及び高脂血症、高リポタンパク血症及び脂質異常症の治療に有用である。
siRNA薬物は、抗体と比較して標的候補が豊富であり、開発サイクルが短く、臨床開発の成功率が高いなどの利点を有する。このため、慢性疾患用薬の点では、より優位性がある。しかしながら、siRNA薬物自体の欠点(例えば、安定性の欠如、膜貫通の困難性など)は、その臨床用途を制限する。siRNAの構造改変又はコンジュゲートの構築は、いずれも、siRNAの成薬確率をある程度まで改善し得る。コンジュゲートを構築する構成分子の探索は、脂質異常症のためのsiRNA薬物の開発の必須ルートであり、解決すべき課題でもある。
本開示は、関連技術における技術的課題の1つを少なくともある程度解決することを目的とする。そのために、本開示の1つの目的は、ANGPTL3の発現を阻害するためのsiRNAを提供することであり、本開示の発明者らは、適切な特異的な低分子干渉RNA配列を設計し、それを標的リガンドに結合させてsiRNAコンジュゲートを形成することにより、ANGPTL3を標的とし、細胞中のANGPTL3遺伝子の転写物を分解することにより、ANGPTL3タンパク質の発現量を低下させ、それにより、本開示によるsiRNAは、脂質異常症の予防及び/又は治療に有用である。
そのために、本開示の一態様は、siRNAを提供する。本開示の実施例によれば、前記siRNAは、センス鎖と、アンチセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖は、前記センス鎖と相補的に対合する相補性領域を含み、ここで、前記センス鎖は、SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:154の各鎖のヌクレオチド配列と5ヌクレオチド以下だけ異なるヌクレオチド配列から選択され、前記アンチセンス鎖は、SEQ ID NO:155-SEQ ID NO:308の各鎖のヌクレオチド配列と5ヌクレオチド以下だけ異なるヌクレオチド配列から選択される。
本開示の発明者らは、適切な低分子干渉RNA(siRNA)配列を設計することにより、肝細胞におけるANGPTL3の合成を特異的に減少させるとともに、脱標的効果を回避する。siRNAは、サイレンシング複合体(RNA-induced silencing complex:RISC)を形成し、標的遺伝子(ANGPTL3遺伝子)のmRNAの配列と相補的に対合し、標的遺伝子のmRNAを分解して標的遺伝子の発現を阻害し、更にLDL-C、VLDL-C、HDL-C及びトリグリセリド(TG)のレベルを低下させる。
本開示の実施例によるsiRNAは、以下の付加的な技術的特徴の少なくとも1つを更に有してもよい。
本開示は、siRNAを更に提供する。前記siRNAは、
(1)アンギオポエチン様タンパク質3遺伝子配列の60-80位のヌクレオチドを特異的に標的とすることができるものであって、好ましくは、前記siRNAのセンス鎖は、SEQ ID NO:10から選択され、アンチセンス鎖は、SEQ ID NO:165から選択されるものと、
(2)アンギオポエチン様タンパク質3遺伝子配列の107-133位のヌクレオチドを特異的に標的とすることができるものであって、好ましくは、前記siRNAのセンス鎖は、SEQ ID NO:17から選択され、アンチセンス鎖は、SEQ ID NO:171から選択され、又は、前記siRNAのセンス鎖は、SEQ ID NO:18から選択され、アンチセンス鎖は、SEQ ID NO:172から選択されるものと、
(3)アンギオポエチン様タンパク質3遺伝子配列の163-187位のヌクレオチドを特異的に標的とすることができるものであって、好ましくは、前記siRNAのセンス鎖は、SEQ ID NO:19から選択され、アンチセンス鎖は、SEQ ID NO:173から選択されるものと、
(4)アンギオポエチン様タンパク質3遺伝子配列の304-388位のヌクレオチドを特異的に標的とすることができ、好ましくは、アンギオポエチン様タンパク質3遺伝子配列の304-359位のヌクレオチドを特異的に標的とすることができるものであって、より好ましくは、前記siRNAのセンス鎖は、SEQ ID NO:27から選択され、アンチセンス鎖は、SEQ ID NO:181から選択され、
又は、前記siRNAのセンス鎖は、SEQ ID NO: 29から選択され、アンチセンス鎖は、SEQ ID NO:183から選択され、
又は、前記siRNAのセンス鎖は、SEQ ID NO: 31から選択され、アンチセンス鎖は、SEQ ID NO:185から選択され、
又は、前記siRNAのセンス鎖は、SEQ ID NO: 32から選択され、アンチセンス鎖は、SEQ ID NO: 186から選択され、
又は、前記siRNAのセンス鎖は、SEQ ID NO: 35から選択され、アンチセンス鎖は、SEQ ID NO: 189から選択され、
又は、前記siRNAのセンス鎖は、SEQ ID NO: 36から選択され、アンチセンス鎖は、SEQ ID NO: 190から選択されるものと、
(5)アンギオポエチン様タンパク質3遺伝子配列の430-459位のヌクレオチドを特異的に標的とすることができるものであって、好ましくは、前記siRNAのセンス鎖は、SEQ ID NO:43から選択され、アンチセンス鎖は、SEQ ID NO:197から選択され、
又は、前記siRNAのセンス鎖は、SEQ ID NO: 44から選択され、アンチセンス鎖は、SEQ ID NO: 198から選択されるものと、
(6)アンギオポエチン様タンパク質3遺伝子配列の1360-1430位のヌクレオチドを特異的に標的とすることができ、好ましくは、アンギオポエチン様タンパク質3遺伝子配列の1397-1430位のヌクレオチドを特異的に標的とすることができるものであって、より好ましくは、前記siRNAのセンス鎖は、SEQ ID NO:145から選択され、アンチセンス鎖は、SEQ ID NO:299から選択され、
又は、前記siRNAのセンス鎖は、SEQ ID NO: 150から選択され、アンチセンス鎖は、SEQ ID NO: 304から選択され、
又は、前記siRNAのセンス鎖は、SEQ ID NO: 151から選択され、アンチセンス鎖は、SEQ ID NO: 305から選択され、
又は、前記siRNAのセンス鎖は、SEQ ID NO: 152から選択され、アンチセンス鎖は、SEQ ID NO: 306から選択され、
又は、前記siRNAのセンス鎖は、SEQ ID NO: 154から選択され、アンチセンス鎖は、SEQ ID NO: 308から選択されるものとのいずれかの群のいずれか一対のsiRNAから選ばれる。
本開示の実施例によれば、前記siRNAは、少なくとも1つの修飾されたヌクレオチドを含み、
任意選択的に、前記修飾されたヌクレオチドは、
5'-ホスホロチオエート化ヌクレオチド、5-メチル化シトシンヌクレオチド、2'-O-メチル修飾ヌクレオチド、2'-O-2-メトキシエチル修飾ヌクレオチド、2'-フルオロ修飾ヌクレオチド、3'-窒素置換修飾ヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロ修飾ヌクレオチド、2'-デオキシ修飾ヌクレオチド、固定化ヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2'-アミノ修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ポリペプチドヌクレオチド、ホスホルアミデート、及び非天然塩基を含むヌクレオチドのうちの少なくとも1つから選択される。
本開示の実施例によれば、前記相補性領域の長さは、少なくとも17bpであり、
任意選択的に、前記相補性領域の長さは、18-21bpであり、
任意選択的に、前記相補性領域の長さは、19bpである。
本開示の実施例によれば、前記siRNAにおけるセンス鎖とアンチセンス鎖の長さは、25bp以下であり、
任意選択的に、前記siRNAにおけるセンス鎖とアンチセンス鎖の長さは、18-25bpであり、
任意選択的に、前記siRNAにおけるセンス鎖とアンチセンス鎖の長さは、21bpである。
本開示の実施例によれば、前記siRNAにおけるセンス鎖とアンチセンス鎖の塩基は、1対1で相補的に対合してもよく、数個の塩基ずれているが、少なくとも17bpの相補性領域を有してもよい。
本開示の別の態様は、siRNAコンジュゲートを提供する。前記siRNAコンジュゲートは、前述したsiRNAと標的リガンドを含み、ここで、前記siRNAは、標的リガンドに共有結合的に連結され、
好ましくは、前記標的リガンドは、前記siRNAにおけるセンス鎖に連結され、
より好ましくは、前記標的リガンドは、チオリン酸エステル結合を介して前記siRNAにおけるセンス鎖の5'末端に連結される。
本開示の実施例によれば、前記標的リガンドは、少なくとも1つのN-アセチル-ガラクトサミンを含む。
本開示の実施例によれば、前記標的リガンドは、GalNAC標的ヘッド化合物である。
本開示の実施例によれば、前記GalNAC標的ヘッド化合物は、1043、1046、1048であり、その構造は、下記式に示すとおりである。
本開示の実施例によれば、前記標的リガンドは、前記siRNAにおけるセンス鎖に連結される。
本開示の別の態様は、医薬組成物を提供する。本開示の実施例によれば、前記医薬組成物は、前記siRNA及び/又は前記siRNAコンジュゲートを含み、任意選択的に、前記医薬組成物は、薬学的に許容される添加物を更に含む。
これにより、本開示の実施例による医薬組成物は、細胞におけるANGPTL3の合成を阻害し、それによりLDL-C、VLDL-C、HDL-C及びトリグリセリド(TG)のレベルを低下させて、高脂血症及び高トリグリセリド血症の予防及び/又は治療に使用することができる。
本開示のまた1つの態様は、化合物を提供する。
TO26とのうちのいずれか1つの構造を有する。
本発明のまた1つの態様は、前記化合物の、siRNAコンジュゲートの製造への用途を提供する。
本開示のまた1つの態様は、前記化合物及び/又は中間体の、薬物又はキットの製造への用途を提供し、前記薬物又はキットは、ANGPTL3遺伝子の発現を阻害するために用いられる。
好ましくは、前記薬物又はキットは、脂質異常症の予防及び/又は治療に用いられ、さらに好ましくは、前記脂質異常症は、高脂血症と高トリグリセリド血症を含む。
本開示のまた1つの態様は、キットを提供する。本開示の実施例によれば、前記キットは、前記siRNA及び/又はsiRNAコンジュゲートを含む。
これにより、本開示の実施例によるキットは、細胞におけるANGPTL3遺伝子の発現を阻害し、それによりLDL-C、VLDL-C、HDL-C及びトリグリセリド(TG)のレベルを低下させて、高脂血症及び高トリグリセリド血症の予防及び/又は治療に使用することができる。
本開示のまた1つの態様は、被験体のANGPTL3遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。前記方法は、被験体に前記siRNA及び/又は前記siRNAコンジュゲートを投与し、ANGPTL3遺伝子の発現を阻害することを含む。
本開示のまた1つの態様は、細胞におけるANGPTL3遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。本開示の実施例によれば、前記方法は、前記siRNA及び/又は前記siRNAコンジュゲートを用いて前記細胞をトランスフェクトし、前記細胞におけるANGPTL3遺伝子の発現を阻害することを含む。
本開示の実施例による細胞におけるANGPTL3遺伝子の発現を阻害する方法は、siRNAを利用してサイレンシング複合体を形成し、標的遺伝子であるANGPTL3遺伝子のmRNAの配列と相補的に対合し、標的遺伝子のmRNAを分解して標的遺伝子の発現を阻害し、更にLDL-C、VLDL-C、HDL-C及びトリグリセリド(TG)のレベルを低下させる。
本開示の実施例によれば、前記細胞は、哺乳動物に由来し、
任意選択的に、前記細胞は、ヒトに由来し、
任意選択的に、前記細胞は、肝臓細胞である。
本開示によるsiRNAを利用して、ヒトの肝臓細胞においてサイレンシング複合体を形成し、ANGPTL3遺伝子のmRNAの配列と相補的に対合し、ANGPTL3遺伝子のmRNAを分解してその発現を阻害し、更にLDL-C、VLDL-C、HDL-C及びトリグリセリド(TG)のレベルを低下させる。
本開示のまた1つの態様は、前記siRNA及び/又は前記siRNAコンジュゲートの、薬物又はキットの製造への用途を提供する。本開示の実施例によれば、前記薬物又はキットは、ANGPTL3遺伝子の発現を阻害するために用いられる。
本開示によるsiRNAを利用して薬物又はキットを製造し、前記薬物又はキットは、そのうちのsiRNAによって細胞におけるANGPTL3遺伝子の発現レベルを低下させることによって、脂質異常症の予防及び/又は治療を行う。
本開示の実施例によれば、前記薬物又はキットは、脂質異常症の予防及び/又は治療に用いられ、
任意選択的に、前記脂質異常症は、高脂血症と高トリグリセリド血症を含み、
任意選択的に、前記薬物又はキットは、細胞におけるANGPTL3遺伝子の発現の阻害に用いられる。
本開示のまた1つの態様は、脂質異常症の予防及び/又は治療のための方法を提供する。本開示の実施例によれば、前記方法は、被験体に前記siRNA及び/又は前記siRNAコンジュゲートを投与することを含む。
本開示の実施例によれば、前記脂質異常症は、高脂血症と高トリグリセリド血症を含む。
本開示の付加的な態様と利点は、以下の記述において部分的に与えられ、その一部が以下の説明から明らかとなるか又は本開示の実践によって理解される。
本発明の有益な効果は以下のとおりである。
本発明による標的リガンドとsiRNAとがコンジュゲートを形成した後に、コンジュゲートは、細胞モデルとマウスモデルの両方でANGPTL3の発現を低減でき、対照群に比べ50%以上の発現量の低減が可能であり、最高90%ほど低減でき、良好な臨床応用の見通しがある。
本開示の上記及び/又は付加的な態様と利点は、以下の図面を参照しながら記述される実施例の記述から明らかであり、容易に理解される。ここで、
以下、本開示の実施例を詳しく記述する。以下に記述された実施例は、例示的なものであり、本開示の解釈のみに用いられるが、本開示を限定するものと理解されるべきではない。
「薬学的に許容される担体」は、当技術分野において公知のものであり、哺乳動物への本開示の化合物の投与に適した薬学的に許容される材料、組成物、又は担体を含む。前記担体は、ホスト物質を担持するか、又はホスト物質をある器官もしくは体の一部から別の器官もしくは体の別の一部に移すことに関与する液体又は固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒又は封入材料を含む。各担体は、製剤中の他の成分と適合性があり、患者に有害でないという意味で「許容される」でなければならない。薬学的に許容される担体として有用な材料の幾つかの例は、ラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖類、トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン類、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロースなどのセルロース及びその誘導体、トラガカント粉末、麦芽、ゼラチン、タルク、カカオ脂及び坐剤ワックスなどの賦形剤、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及びダイズ油などの油、プロピレングリコールなどのグリコール類、グリセロール、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどの多価アルコール類、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル類、寒天、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、アルギン酸、発熱物質を含まない水、リンゲル溶液、エタノール、リン酸緩衝剤、並びに医薬製剤に使用される他の無毒性適合性物質を含む。
組成物において、湿潤剤、乳化剤、及び潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム、並びに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、及び香料、防腐剤、及び抗酸化剤が存在してもよい。
本開示の医薬組成物は、経口、経鼻、局所、頬側、舌下、直腸及び/又は非経口投与に適したものを含む。製剤は、単位剤形で好都合に存在してもよく、且つ薬学分野で周知の任意の方法によって調製されてもよい。単一剤形を調製するために担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は、一般的には、治療の役割を果たす化合物の量である。一般的には、100分の1を単位として、この量は、約1%から約99%、好ましくは約5%から約70%、最も好ましくは約10から約30%の活性成分である。
用語「治療」は、所望の薬理学的及び/又は生理学的効果を得ることを指すために使用される。前記効果は、疾患又はその症状の完全又は部分的予防の観点から予防的であってもよく、及び/又は疾患の部分的又は完全な治癒に起因する有害作用の観点から治療的であってもよい。本明細書で使用される「治療」は、哺乳動物、特にヒトの疾患をカバーし、この疾患は、(a)疾患にかかりやすいが、疾患がまだ確定的に診断されていない個体における疾患又は状態の発症の予防、(b)疾患の阻害、例えば、疾患の進行の遅延、又は(c)疾患の軽減、例えば、疾患に関連する症状の軽減を含む。本明細書で使用される「治療」は、個体における疾患を治療、治癒、緩解、改善、軽減又は阻害するために、薬物又は化合物を個体に投与する任意の使用をカバーし、本明細書に記載の化合物を含む薬物を、それを必要とする個体に投与することを含むが、これらに限定されない。
本開示は、ANGPTL3の発現を阻害するためのsiRNAを提供する。本開示の実施例によれば、前記siRNAは、センス鎖と、アンチセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖は、前記センス鎖と相補的に対合する相補性領域を含み、ここで、前記センス鎖は、SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:154の各鎖のヌクレオチド配列と5ヌクレオチド以下だけ異なるヌクレオチド配列から選択され、前記アンチセンス鎖は、SEQ ID NO:155-SEQ ID NO:308の各鎖のヌクレオチド配列と5ヌクレオチド以下だけ異なるヌクレオチド配列から選択される。
本開示の実施例によれば、前記センス鎖は、表2に示すSEQ ID NO:1-SEQ ID NO:154を含むのに加えて、表2に示すセンス鎖と1、2、3、4、5ヌクレオチドだけ異なる連続したヌクレオチド配列を更に含む。
本開示の実施例によれば、前記アンチセンス鎖は、表2に示すSEQ ID NO:155-SEQ ID NO:308を含むのに加えて、表2に示すアンチセンス鎖と1、2、3、4、5ヌクレオチドだけ異なる連続したヌクレオチド配列を更に含む。
本開示の実施例によれば、前記siRNAは、少なくとも1つの修飾されたヌクレオチドを含み、
前記修飾されたヌクレオチドは、
5'-ホスホロチオエート化ヌクレオチド、5-メチル化シトシンヌクレオチド、2'-O-メチル修飾ヌクレオチド、2'-O-2-メトキシエチル修飾ヌクレオチド、2'-フルオロ修飾ヌクレオチド、3'-窒素置換修飾ヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロ修飾ヌクレオチド、2'-デオキシ修飾ヌクレオチド、固定化ヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2'-アミノ修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ポリペプチドヌクレオチド、ホスホルアミデート、及び非天然塩基を含むヌクレオチドのうちの少なくとも1つから選択される
本開示の実施例によれば、前記相補性領域の長さは、18-21bpであり、例えば、19bpである。
本開示の実施例によれば、前記siRNAにおけるセンス鎖とアンチセンス鎖の長さは、18-25bpであり、例えば、21bpである。
本開示の具体的な実施例によれば、前記siRNAにおけるセンス鎖とアンチセンス鎖の長さは、21bpであり、前記センス鎖とアンチセンス鎖における塩基は、1対1で相補的に対合し、又は、前記siRNAにおけるセンス鎖とアンチセンス鎖において、19個の連続した相補的な塩基を有し、即ち、前記相補性領域の長さは、19bpである。
本開示の実施例によれば、前記siRNAを用いて肝臓細胞をトランスフェクトし、細胞におけるANGPTL3遺伝子の発現を阻害する。
アンギオポエチン様3(ANGPTL3)遺伝子標的に対して、本開示の発明者らは、適切な特異的な低分子干渉核酸(siRNA)配列を設計し、siRNAを合成し、トランスフェクト試薬を用いてsiRNAを細胞内に導入してサイレンシング複合体(RNA-induce siliencing complex:RISC)を形成し、標的遺伝子のmRNA配列を特異的に認識して標的結合し、5'末端から10-11位のクリップ間でmRNAを切断することにより、転写後遺伝子サイレンシングを起こさせ、アンジオポエチン様3分泌タンパク質の発現を調節する。
本開示の実施例によれば、前記siRNAは、標的リガンドに共有結合的に連結される。
本開示の実施例によれば、前記標的リガンドは、少なくとも1つのN-アセチル-ガラクトサミンを含む。
本開示の実施例によれば、前記標的リガンドは、前記siRNAにおけるセンス鎖に連結される。
以下、本開示の実施例を詳しく記述する。以下に記述された実施例は例示的なものであり、本開示を解釈するためのものだけであり、本開示を限定するものと理解されるべきではない。実施例における具体的な技術や条件は明記されていないものは、当該技術分野における文献に記載の技術や条件に従って、あるいは、生成物仕様に従って、行われる。使用する試薬又は機器のうち、メーカーが明記されていないものは、いずれも市販で入手可能な通常のものである。
本実施例の一部の合成ルートは、CN202110397429.9、CN202110008013.3を参照してもよい。本出願の実施例は、ソースの導入により上記の2つの特許出願に組み込まれる。
実施例1 インビトロ細胞モデル(Hep 3B細胞)による低分子干渉核酸(siRNA)の活性の試験
1)懸濁トランスフェクト試薬の調合:siRNA母液の濃度は、50μMであり、DEPC水で希釈して10μM siRNAシステムを得て、50μL Opti-MEMで希釈して0.2μM siRNAシステムを得て、3-5回ブローイングして均一に混合した(最終濃度10nM)。50μL Opti-MEMで0.5uL 0.2μMのSiRNAを希釈して0.002μMのsiRNAシステムを得て、3-5回ブローイングして均一に混合した(最終濃度0.1nM)。50μL Opti-MEMで希釈して2μL RNAiMAXを得て、3-5回ブローイングして均一に混合した。トランスフェクト試薬と低分子干渉核酸希釈液をそれぞれ混合し、3-5回ブローイングして均一に混合し、室温で10min静置した。
2)細胞の処理:Hep3B細胞株コンフルエンス率>70%が顕微鏡で観察され、細胞をプレーティングし、2x105細胞/ウェルで12ウェルプレートにプレーティングし、各ウェルに10% FBS含有DMEM培地900μLを添加し、トランスフェクト複合体を12ウェルプレートに添加し、37℃、5%CO2インキュベーターで培養した。
3)24h後に、細胞の総RNAを抽出し、リアルタイム定量PCR(Quantitative Real-Time PCR)によって細胞におけるANGPTL3 mRNA配列の発現状況を検出し、ここで、内部標準遺伝子PPIB、ANGPTL3の増幅に用いられるPCRプライマーを表1に示す
上記方法を利用して表2における、154対のsiRNAによってそれぞれ0.1 nMと10 nMの濃度でHep 3B細胞をトランスフェクトした後、ANGPTL3遺伝子(NM_014495.4)の発現に対する阻害率の結果を得る。
実施例2、GalNAc結合標的ヘッドの合成
一、GalNAc標的ヘッド1043の合成
以下の方法に応じて、TO-23及びTP-23(1043標的ヘッド結合siRNAの前駆体)のジアステレオ異性体を合成した。
(1)N2雰囲気で、GC-1(12g、25.89mmol)をDCM(200mL)に溶解し、氷水浴で0-5℃に降温し、HBTU(11.78 g、31 mmol)とDIEA(10g,77.67mmol)を添加し、10分間撹拌した。
(2)続いて、N-tert-ブトキシカルボニル-1,4-ブタンジアミン(4.87 g、25.89 mmol)を添加し、25℃まで昇温し、16時間撹拌して反応させ、TLCにより原料が実質的に消失したことを確認した。
(3)飽和塩化アンモニウム溶液(100mL)を添加してクエンチし、分液し、DCM(100mL×2)で抽出した。
(4)有機相を合わせて飽和食塩水(100mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、濾過して濃縮した。カラムクロマトグラフィーによる精製(DCM / MeOH = 20 / 1)により、白色の固形化合物GN-17-01(15 g、収率91%)を得た。
(1)GN-17-01(15g、23.67 mmol)をDCM(150mL)に溶解し、TFA(50mL)を添加し、25℃で1時間撹拌し、TLCにより原料が実質的に消失したことを確認し、濃縮した。
(2)余分なTFAをアセトニトリル(100mL×3)とTFAとの共沸により除去して、フォーム状固体GN-17(TFA塩、12.6g)を得た。
(1)N2雰囲気で、NC-4(2.6g、4.7 mmol)をDCM(200mL)に溶解し、氷水浴で0-5℃まで降温し、HATU(5.6g、14.83mmol)とDIEA(4.85g、37.6 mmol)を添加し、20分間撹拌した。
(2)続いて、GN-17(8.45g、15.5 mmol)を添加し、25℃まで昇温し、4時間撹拌して反応させた。TLC検出によれば、原料が実質的に消失したことを確認した。
(3)飽和塩化アンモニウム溶液(50mL)を添加してクエンチし、分液し、DCM(100mL×2)で抽出した。
(4)有機相を合わせて飽和食塩水(100mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥した。
(5)濾過、濃縮して粗生成物を得た。カラムクロマトグラフィーによる精製(DCM / MeOH = 10 / 1)により、白色の固形物TO-23-01(6.3g、収率63.1%)を得た。
(1)TO-23-01(6.3g、3.0mmol)のMeOH(100mL)溶液に10%Pd/C(600mg)とPd(OH)2/C(600mg)を添加し、H2で3回置換し、25℃で3時間撹拌して反応させ、TLC(DCM / MeOH = 8 / 1)検出によれば、原料が実質的に消失したことを確認した。
(2)濾過、濃縮して粗生成物を得た。カラムクロマトグラフィーによる精製(DCM / MeOH / TEA = 10 / 1/ 0.1)により、白色の固形物TO-23(4.5g、収率75%)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.88-7.81 (m, 9H), 7.14 (s, 1H), 5.21 (d, J = 3.4 Hz, 3H), 4.95 (dd, J = 11.2, 3.4 Hz, 3H), 4.53 (d, J = 8.5 Hz, 3H), 4.07-3.97 (m, 9H), 3.88 (dt, J = 11.0, 9.0 Hz, 3H), 3.77-3.71 (m, 3H), 3.63-3.50 (m, 24H), 3.49-3.41 (m, 8H), 3.38-3.35 (m, 2H), 3.08-2.98 (m, 12H), 2.35- 2.25 (m, 14H), 2.10 (s, 9H), 2.00 (s, 9H), 1.89 (s, 9H), 1.78 (s, 9H), 1.40-1.33 (s, 12H).
MS (ESI): m/z [1/2M + H]+理論値は、1000.5であり、実測値は、1000.3である。
(1)N2雰囲気で、TO-23(2.3g、1.15 mmol)を乾燥DCM(40mL)に溶解し、DIEA(0.86mL、5.2mmol)を添加し、
シリンジを利用して2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト(0.46mL、2.1mmol)の乾燥DCM(2mL)溶液を徐々に滴加した。25℃で1時間反応させた。TLC検出によれば、原料が実質的に消失したことを確認した。
(2)飽和NaHCO3(20mL)を添加しクエンチし、分液し、有機相を飽和NaHCO3(20mL)溶液、飽和食塩水(20mL)で洗浄し、無水MgSO4で乾燥し、濾過、濃縮して粗生成物を得た。カラムクロマトグラフィーによる精製(シリカカラムを1.5%TEA/DCMによって予め塩基性化しており、DCM / MeOH / TEA = 15 / 1/ 0.1である)により、白色の固形物TP-23(1.8g、収率71.1%)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.91-7.79 (m, 9H), 7.15 (s, 1H), 5.21 (d, J = 3.4 Hz, 3H), 4.95 (dd, J = 11.2, 3.4 Hz, 3H), 4.53 (d, J = 8.5 Hz, 3H), 4.06-3.97 (m, 9H), 3.88 (dt, J = 11.1, 8.9 Hz, 3H), 3.78-3.66 (m, 6H), 3.63-3.41 (m, 36H), 3.07-2.98 (m, 12H), 2.76 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 2.35-2.24 (m, 14H), 2.10 (s, 9H), 2.00 (s, 9H), 1.89 (s, 9H), 1.78 (s, 9H), 1.40-1.33 (m, 12H), 1.13 (dd, J = 6.7, 4.1 Hz, 12H)、
31P NMR (162 MHz, DMSO-d6) δ 147.81、
MS (ESI): m/z [1/2M + Na] +理論値は、1122.5であり、実測値は、1122.4である。
二、GalNAc標的ヘッド1046の合成
以下の方法に応じて、TO25及びTP-25(1046標的ヘッド結合siRNAの前駆体)のジアステレオ異性体を合成した。
(1)N2雰囲気で、1000mL三口フラスコに、乾燥THF(300 mL)を添加し、氷浴で0-5℃に降温して撹拌し、60% NaH(14g、354.8mmol)を少しずつ加え、続いて、2-クロロエチルオキシエタノール(40g、322.5mmol)のTHF溶液(200mL)を徐々に滴加し、30分間保温して反応させ、更に、反応フラスコにベンジルブロミド(60.3g、354.8mmol)を滴加し、25℃まで昇温して16時間撹拌し、TLC検出によれば、原料が実質的に消費されたことを確認した。
(2)飽和塩化アンモニウム溶液(150mL)を徐々に滴加してクエンチし、分液し、水相をEtOAc(100mL×2)で抽出し、有機相を合わせて飽和食塩水(300mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、濾過、濃縮して粗生成物を得た。粗生成物に対して、シリカカラムクロマトグラフィーによる精製(石油エーテル / EtOAc = 5/1)を行うことで、淡黄色油状化合物NC-6-01(53g、収率78%)を得た。
MS (ESI): m/z [M + H] + 理論値は、215.1であり、実測値は、215.1である。
(1)エチレンジアミン(196g、3.26mol)を2000mL三口フラスコに入れ、アセトニトリル(1000mL)、炭酸カリウム(90g、0.65 mol)及びヨウ化ナトリウム(60.6g、0.33mol)を添加して撹拌した。続いて、NC-6-01(70g、0.33mol)のアセトニトリル(100mL)溶液を反応フラスコに徐々に滴加し、60℃まで昇温し、16時間撹拌し、TLC検出によれば、原料が実質的に消費されたことを確認した。
(2)反応を中止し、濃縮し、精製水(300mL)を添加し、濃塩酸でpHを4-5に調整し、EtOAc(200mL×3)で三回抽出し、水相に水酸化ナトリウム固形物を添加してpHを13-14に調整し、DCM(200mL×3)によって三回抽出し、有機相を合わせて飽和食塩水(300mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、濾過、濃縮して淡黄色油状物NC-6-02(69.5g、87%)を得た。
MS (ESI): m/z [M + H] + 理論値は、239.2であり、時速値は、239.1である。
(1)NC-6-02(69.5g、0.29mol)とブロモ酢酸tert-ブチル(187g、0.96mol)をテトラヒドロフラン(700mL)と精製水(350mL)に添加し、撹拌し、氷水浴で5℃以下に降温し、炭酸カリウム(322g、2.34mol)を添加した。25℃で14時間撹拌して反応させ、TLC検出によれば、原料が完全に転化したことを確認した。
(2)反応液に精製水(300mL)を添加し、静置分層して有機相を分取し、水相をEtOAc(200mL×2)によって二回抽出し、有機相を合わせて、飽和食塩水(500mL)を添加して洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、濾過、濃縮して淡黄色油状物NC-6-03 (201g)を得た。
MS (ESI): m/z [M + H] + 理論値は、581.4であり、実測値は、581.3である。
(1)NC-6-03(23g、39.6mmol)を1,4-ジオキサン(200mL)に溶解し、濃塩酸(40mL)を添加し、60℃まで昇温して2時間反応させ、TLC検出によれば、原料が実質的に消費されたことを確認した。
(2)濃縮し、1,4-ジオキサン(200mL)を再添加して濃縮し、白色の固形物粗生成物を得て、粗生成物を酢酸エチル(200mL)に添加し、2時間パルプ化し、吸引ろかし、ケーキを収集し、50℃で真空乾燥により白色固形化合物NC-6(22.6g、96.9%)を得た。
(3)MS (ESI): m/z [M + H] + 理論値は、413.2であり、実測値は、413.1である。
(1)N2雰囲気で、NC-6(1.5g、3.6mmol)、HBTU(4.5g、12.0 mmol)及びDIEA(4.75g、36mmol)をDCM(50mL)に添加し、30分間撹拌し、続いて、GN-17(6.4g、12.0mmol)とDIEA(4.75g、36mmol)のDCM(50mL)溶液を滴加し、25℃で16時間撹拌し、LCMS検出によれば、原料が実質的に消費されたことを確認した。
(2)DCM(100mL)を添加して希釈し、反応液に1 N塩酸溶液(80mL×2)を添加して洗浄し、有機相を合わせて、飽和炭酸水素ナトリウム(100mL)で洗浄し、飽和食塩水(100mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、ろ過、濃縮して粗生成物を得た。粗生成物をシリカカラムクロマトグラフィーによる精製(DCM / MeOH = 7 / 1)により、白色の固形化合物TO-25-01(4.3g、収率60%)を得た。
(3)MS (ESI): m/z [M/2 + H] + 理論値は、980.0であり、実測値は、979.9である。
(1)TO-25-01(4.3g、2.2mmol)をメタノール(80mL)に溶解し、10%パラジウム炭素(1.0g)を添加し、H2で三回置換し、25℃で2時間撹拌し、LCMS検出によれば、原料が実質的に消失したことを確認した。
(2)ろ過、濃縮し、DCM(20 mL)を添加して溶解し、MTBE(300 mL)に徐々に滴加し、30分間撹拌して結晶化し、吸引濾過し、白色の固形化合物TO-25(3.7g、収率90%)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.48 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 8.06 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 7.85 (dd, J = 11.7, 6.8 Hz, 6H), 5.21 (d, J = 3.3 Hz, 3H), 4.95 (dd, J = 11.2, 3.3 Hz, 3H), 4.53 (d, J = 8.5 Hz, 3H), 4.08-3.83 (m, 14H), 3.75 (p, J = 4.8 Hz, 5H), 3.68-3.26 (m, 28H), 3.21-2.95 (m, 14H), 2.30 (q, J = 7.9, 6.7 Hz, 6H), 1.94-1.78 (m,, 36H), 1.41-1.38 (m, 12H)、
MS (ESI): m/z [1/2M + H] + 理論値は、934.9であり、実測値は、934.8である。
(1)N2雰囲気で、TO-25(700mg、0.37mmol)を乾燥DCM(10mL)に溶解し、DIEA(0.31mL、1.9mmol)を添加し、シリンジを利用して2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト(0.19mL、0.74mmol)の乾燥DCM(1mL)溶液を徐々に滴加し、25℃で30分間反応させ、TLC検出によれば、原料が実質的に消失したことを確認した。
(2)飽和NaHCO3(10mL)を添加してクエンチし、DCM(10mL)で希釈し、分液し、有機相を飽和NaHCO3(10mL)溶液、飽和食塩水(10mL)で洗浄し、無水NaSO4で乾燥し、ろ過、濃縮して粗生成物を得た。カラムクロマトグラフィーによる精製(シリカカラムを1.5%TEA/DCMによって予め塩基性化しており、DCM / MeOH / TEA = 15 / 1/ 0.1である)により、白色の固形物TP-25(405mg、収率53%)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.12 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 7.98-7.75 (m, 7H), 5.21 (d, J = 3.4 Hz, 3H), 4.96 (dd, J = 11.2, 3.4 Hz, 2H), 4.54 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.02 (q, J = 5.3, 4.5 Hz, 9H), 3.95-3.83 (m, 3H), 3.82-3.50 (m, 23H), 3.40-3.26 (m, 4H), 3.12-2.94 (m, 27H), 2.76-2.59 (m, 7H), 2.29 (t, J = 6.7 Hz, 5H), 2.11-1.78 (m, 38H), 1.38 (s, 12H), 1.16 (d, J = 7.5 Hz, 12H)、
31P NMR (162 MHz, DMSO-d6) δ 147.97、
MS (ESI): m/z [1/2M + Na] + の理論値は、1057.0であり、実測値は、1057.4である。
三、GalNAc標的ヘッド1048の合成
以下の方法に応じて、TO26及びTP-26(1048標的ヘッド結合siRNAのの前駆体)のジアステレオ異性体を合成した。
(1)N2雰囲気で、GC-2(20.1g、39.7mmol)をDCM(200mL)に溶解し、CDI(7.09g、73.7mmol)を少しずつ加え、25℃で3時間撹拌し、続いて、N-Boc-エチレンジアミン(7.0g、43.7mmol)とトリエチルアミン(12.05g、119.1mmol)を反応液に添加し、16時間反応させ、LCMS検出によれば、原料が実質的に消失したことを確認した。
(2)飽和炭酸水素ナトリウム溶液(200mL)を添加してクエンチし、分液し、水相をDCM(100mL×3)で抽出し、有機相を合わせて、飽和塩化アンモニウム溶液(200mL)、飽和塩化ナトリウム溶液(200mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、ろ過、濃縮して粗生成物を得た。粗生成物をメチルtert-ブチルエーテル(100mL)で洗浄し、油状生成物を濃縮して白色の固形化合物GN-18-01(24.43g、収率95.1%)を得た。
MS (ESI): m/z [M + H] + 理論値は、650.3であり、実測値は、650.5である。
(1)GN-18-01(45.52g、70mmol)をHCl / EtOAc溶液(2N、500mL)に少しずつ添加し、25℃で2時間撹拌し、LCMS検出によれば、原料が実質的に消失したことを確認した。
(2)溶媒を注ぎ出し、固形物を濃縮して粗生成物を得た。粗生成物をメチルtert-ブチルエーテル(200mL)でパルプ化して精製し、ろ過し、ろ過ケーキを40℃で真空乾燥して白色の固形物GN-18(49.6g)を得た。
MS (ESI): m/z [M + H] + 理論値は、550.3であり、実測値は、550.5である。
(1)N2雰囲気で、NC-6(1.5g、3.6mmol)、PyBOP(6.2g、12.0mmol)及びDIEA(4.75g、36mmol)をDCM(50mL)に添加して30分間撹拌し、続いて、GN-18(6.6g、12.0mmol)とDIEA(4.75g、36mmol)のDCM(50mL)溶液を滴加し、25℃で16時間撹拌し、LCMS検出によれば、原料が実質的に消費されたことを確認した。
(2)DCM(100mL)を添加して希釈し、反応液に1N塩酸溶液(80mL×2)を添加して洗浄し、有機相を合わせて、飽和炭酸水素ナトリウム(100mL)、飽和食塩水(100mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、ろ過、濃縮して粗生成物を得た。粗生成物に対して、シリカカラムクロマトグラフィーによる精製(DCM / MeOH = 7 / 1)を行うことで、白色の固形化合物TO-26-01(4.7g、収率65%)を得た。
MS (ESI): m/z [M/2 + H] + 理論値は、1004.0であり、実測値は、1004.2である。
(1)TO-26-01(4.0g、2.0mmol)をメタノール(80mL)に溶解し、10%パラジウム炭素(1.0g)を添加し、H2で三回置換し、25℃で2時間撹拌し、LCMS検出によれば、原料が実質的に消失したことを確認した。
(2)ろ過、濃縮し、DCM(20 mL)を添加して溶解し、MTBE(200 mL)に徐々に滴加し、30分間撹拌して結晶化し、吸引濾過し、白色の固形化合物TO-26(3.5g、収率91%)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.54 (s, 1H), 8.14 (s, 2H), 7.95-7.92 (m, 3H), 7.84 (d, J = 7.8 Hz, 3H), 5.21 (d, J = 3.4 Hz, 3H), 4.97 (dd, J = 11.2, 3.4 Hz, 3H), 4.54 (d, J = 8.5 Hz, 3H), 4.13-3.66 (m, 21H), 3.60-3.44 (m, 37H), 3.14 (d, J = 13.8 Hz, 15H), 2.31 (t, J = 6.4 Hz, 6H), 2.10 (s, 9H), 2.00 (s, 9H), 1.89 (s, 9H), 1.77 (s, 9H).
MS (ESI): m/z [1/2M + H] + 理論値は、958.9であり、実測値は、959.1である。
(1)N2雰囲気で、TO-26(900mg、0.47mmol)を乾燥DCM(12mL)に溶解し、DIEA(0.39mL、0.44mmol)を添加し、シリンジを利用して2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト(277mg、1.17mmol)の乾燥DCM(1mL)溶液を徐々に滴加し、25℃で30分間反応させ、TLC検出によれば、原料が実質的に消失したことを確認した。
(2)飽和NaHCO3(10mL)を添加してクエンチし、DCM(10mL)で希釈し、分液し、有機相を飽和NaHCO3(10mL)溶液、飽和食塩水(10mL)で洗浄し、無水NaSO4で乾燥し、ろ過、濃縮して粗生成物を得た。カラムクロマトグラフィーによる精製(シリカカラムを1.5%TEA/DCMによって予め塩基性化しており、DCM / MeOH / TEA = 15 / 1/ 0.1である)により、白色の固形物TP-26(600mg、収率60%)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.15 (s, 2H), 7.94-7.81 (m, 7H), 5.22 (d, J = 3.4 Hz, 3H), 4.97 (dd, J = 11.2, 3.4 Hz, 3H), 4.55 (d, J = 8.5 Hz, 3H), 4.03 (s, 8H), 3.88 (dt, J = 11.2, 8.9 Hz, 3H), 3.81- 3.67 (m, 7H), 3.64 - 3.46 (m, 30H), 3.11 (d, J = 13.1 Hz, 19H), 2.76 (t, J = 5.9 Hz, 3H), 2.65 - 2.54 (m, 7H), 2.31 (t, J = 6.6 Hz, 7H), 2.11 (s, 9H), 2.00 (s, 9H), 1.89 (s, 9H), 1.77 (s, 9H), 1.13 (d, J = 6.8, 12H).
31P NMR (162 MHz, DMSO-d6) δ 147.89、
MS (ESI): m/z 1/2[M-i-Pr2N] 理論値は、1007.9であり、実測値は、1008.2である。
実施例3、インビトロでの結合GalNAc標的ヘッド結合(修飾)siRNAコンジュゲートの構築
以下のRNAi剤二本鎖のアンチセンス鎖とセンス鎖のオリゴヌクレオチド配列部分、及び標的リガンドとRNAとの連結は、いずれも、J. Org. Chem. 2012, 77, 4566-4577,Curr. Protoc. Nucleic Acid Chem., 81, e107に記載のホスホロアミダイトカップリング技術によるオリゴヌクレオチド合成用固相での合成に従う。標的リガンド1046、1048、1043はいずれも、チオリン酸エステル結合を介してsiRNAセンス鎖の5'末端に連結される。
1048である。
核酸配列において、Aoは、アデニンヌクレオチドを表し、Uoは、ウリジンヌクレオチドを表し、Goは、グアノシンヌクレオチドを表し、Coは、シトシンヌクレオチドを表し、直接隣接するヌクレオチドの間に符号がなく、通常のリン酸エステル結合で連結されていることを示す。
DNA:A G C T (Aは、2'-デオキシアデニンヌクレオチドを表し、Tは、2'-デオキシシチミジンヌクレオチドを表し、Gは、2'-デオキシグアノシンヌクレオチドを表し、Cは、2'-デオキシシトシンヌクレオチドを表す)。
2'-F:aF gF cF uF (aFは、2'-フルオロアデニンヌクレオチドを表し、uFは、2'-フルオロウリジンヌクレオチドを表し、gFは、2'-フルオログアノシンヌクレオチドを表し、cFは、2'-フルオログアノシンヌクレオチドを表す)。
2'-OMe:aM gM cM uM(aMは、2'-O-メチルアデニンヌクレオチドを表し、uMは、2'-O-メチルウリジンヌクレオチドを表し、gMは、2'-O-メチルグアノシンヌクレオチドを表し、cMは、2'-O-メチルシトシンヌクレオチドを表す)。
*:は、チオリン酸エステル結合で連結されることを表す。
配列におけるy、zは、標的ヘッドの位置を表す。
実施例4:インビトロ細胞モデル(Hep 3B細胞)によるコンジュゲートの活性の試験
ヒト肝臓癌Hep3B細胞(中国科学院上海細胞バンク)を、10%牛胎児血清(FBS)(Gibco、US)が添加されたDMEM(Gibco、US)において培養し、37℃、5% CO2の条件で培養した(il60、Thermo Fisher)。トランスフェクト実験の当日に、0.25% Trysin(Gibco、US)を用いて細胞を消化し、計数し、450μL/ウェル、5万/ウェルの密度で24ウェルプレートに接種した。続いて、lipofectmine2000(Thermo Fisher)トランスフェクト方式で、被験試料を添加した。RNAiMAX試薬マニュアルにおける標準フローに応じてトランスフェクトを行い、siRNAの最終濃度は、10nM/1nM/ 0.5nM/0.25nM/0.1nM/0.05nM/0.01nMであった。トランスフェクト群について、siNCを陰性対照とし、その配列は、以下のとおりである。
センス鎖(sense):5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'
アンチセンス鎖(antisense):5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。
24h後、細胞の総RNAを抽出し、リアルタイム定量PCR(Quantitative Real-Time PCR)により、細胞におけるANGPTL3 mRNA配列の発現状況を検出し、ここで、内部標準遺伝子PPIB 、ANGPTL3の増幅に用いられるPCRプライマーは、表1に示すとおりである。
各コンジュゲートの活性試験結果(EC50値)は、図4に示すとおりである。
EC50値は、graphpad prismの非線形回帰によって算出され、半分のターゲットmRNA(ANGPTL3)の発現量を阻害する時のコンジュゲートの使用量を表す。
結果から分かるように、選択されたコンジュゲートは、インビトロでの活性試験の実験において、ANGPTL3の相対的表現レベルを良好に低下させた結果が示された。
実施例5:AAV-hANGPTL3マウスモデルの構築及び投与試験
実験動物の基本情報:
実験動物は、済南朋悦実験動物繁殖有限公司から購入され、SPF級動物である。投与前に、上記マウスの体重を測定し、状態を観察した。体重が均一であり、状態に異常がない動物を選択して後続の実験を行った。
モデル構築及び投与:各マウスに、2.5*10^11力価のウイルス溶液を、尾静脈を介して注射し、100uLとする。7日後、実験動物をランダムにグループ化し、各被験体に対して5mg/kgの用量で皮下投与した。投与してから72時間の後に、頚椎脱臼によって動物を犠牲し、肝組織を採取し、RNAの抽出と定量を行った。
各コンジュゲートの結果は、表3に示される。
本明細書の記載において、「一実施例」、「いくつかの実施例」、「例」、「具体的な例」、又は「いくつかの例」などの用語に関する記載は、その実施例又は例に関連して記載される具体的な特徴、構造、材料、又は特性が、本開示の少なくとも1つの実施例又は例に含まれることを意味する。本明細書において、上記用語の概略的な記述は、必ずしも同じ実施例又は例に向けられるものではない。そして、説明された具体的な特徴、構造、材料又は特性は、いずれか1つ又は複数の実施例又は例において、適切な方法で組み合わされ得る。なお、当業者は、互いに矛盾しない限り、本明細書に記載された異なる実施例又は例及び異なる実施例又は例の特徴を結合して組み合わせることができる。
以上において、本開示の実施例を示して記述したが、理解できるように、上記実施例は、例示的なものであり、本開示を限定するものと理解されるべきではない。当業者であれば、本開示の範囲内に上記実施例に対して変更、修正、置き換え及び変形を行うことができる。
Claims (13)
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- 請求項1~2のいずれか一項に記載の化合物の、siRNAコンジュゲートの製造への用途。
- 前記化合物は、標的リガンドとしてsiRNAに連結されることを特徴とする
請求項3に記載の用途。 - 前記siRNAコンジュゲートにおけるsiRNAは、センス鎖と、アンチセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖は、前記センス鎖と相補的に対合する相補性領域を含み、ここで、前記センス鎖は、SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:154の各鎖のヌクレオチド配列と5ヌクレオチド以下だけ異なるヌクレオチド配列から選択され、前記アンチセンス鎖は、SEQ ID NO:155-SEQ ID NO:308の各鎖のヌクレオチド配列と5ヌクレオチド以下だけ異なるヌクレオチド配列から選択されることを特徴とする
請求項4に記載の用途。 - 前記siRNAは、少なくとも1つの修飾されたヌクレオチドを含み。
前記修飾されたヌクレオチドは、
5'-ホスホロチオエート化ヌクレオチド、5-メチル化シトシンヌクレオチド、2'-O-メチル修飾ヌクレオチド、2'-O-2-メトキシエチル修飾ヌクレオチド、2'-フルオロ修飾ヌクレオチド、3'-窒素置換修飾ヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロ修飾ヌクレオチド、2'-デオキシ修飾ヌクレオチド、固定化ヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2'-アミノ修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ポリペプチドヌクレオチド、ホスホルアミデート、及び非天然塩基を含むヌクレオチドのうちの少なくとも1つから選択されることを特徴とする
請求項5に記載の用途。 - 前記siRNAは、前記標的リガンドに共有結合的に連結され、前記標的リガンドは、前記siRNAにおけるセンス鎖に連結され、前記標的リガンドは、チオリン酸エステル結合を介して前記siRNAにおけるセンス鎖の5'末端に連結されることを特徴とする、
請求項6に記載の用途。 - siRNAコンジュゲートの製造方法であって、請求項1~2のいずれか一項に記載の化合物を標的リガンドとしてsiRNAに共有結合的に連結することを含むことを特徴とする、siRNAコンジュゲートの製造方法。
-
-
- 請求項1~2のいずれか一項に記載の化合物及び/又は請求項10に記載の中間体の、薬物又はキットの製造への用途であって、前記薬物又はキットは、ANGPTL3遺伝子の発現を阻害するために用いられることを特徴とする、用途。
- 前記薬物又はキットは、脂質異常症の予防及び/又は治療に用いられることを特徴とする
請求項11に記載の用途。 - 前記脂質異常症は、高脂血症と高トリグリセリド血症を含むことを特徴とする
請求項12に記載の用途。
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