CN111233722A - 一种Mcl-1小分子荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种Mcl‑1小分子荧光探针和其制备方法和应用，所属化合物结构如通式Ⅰ所示。本发明的探针结构新颖，对Mcl‑1蛋白的结合亲和力强，具有良好的荧光特性，且反应时间快、专属性强，可以特异性识别且定量测定Mcl‑1蛋白。本发明的探针可以实现Mcl‑1蛋白抑制剂的高通量筛选及在制备用于检测抑制Mcl‑1蛋白试剂中的应用。本发明的荧光探针可以用于Mcl‑1蛋白高表达的肿瘤细胞的标记。本发明探针原料便宜易得，反应步骤简单，后处理过程简便。

Description

一种Mcl-1小分子荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及药物技术领域，具体涉及Mcl-1小分子荧光探针及其制备方法，及其在Mcl-1蛋白特异定量检测、Mcl-1抑制剂活性筛选、细胞毒性评价及细胞成像中的应用。
背景技术
细胞凋亡(程序性细胞死亡)是一个保守进化的细胞过程，对胚胎的发育和组织稳态起着非常重要的作用。细胞凋亡功能的异常会导致多种人类疾病的发生，包括神经退行性疾病，自身免疫性疾病和癌症等等。因此，通过调节凋亡途径中的关键蛋白进而调节细胞凋亡可能是癌症有效的治疗方法。
细胞凋亡主要包括外源性通路与内源性线粒体通路两种途径。在线粒体介导的内源性凋亡通路中，Bcl-2家族蛋白可通过靶向线粒体外膜，以改变其线粒体外膜的通透性，然后释放细胞色素c，激活细胞凋亡蛋白酶，最终导致细胞死亡。Bcl-2家族由促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白组成。对于促凋亡蛋白，可进一步分为多结构域蛋白质(例如，BAX，BAk，Bcl-Xs和BAK)和BH3-only蛋白质(例如BIM，BID，BAD，PUMA和NOXA)。BAK和BAX可诱导细胞色素c释放。BH3-only蛋白质促进BAX和BAK的动态激活。抗凋亡蛋白成员，如Bcl-2，Bcl-xL，Bcl-w和Mcl-1蛋白，通常共享四个BH域(BH1-4)。它们与促凋亡蛋白相结合，防止BAX和BAK之间的结合相互作用，促进细胞存活。抗凋亡蛋白的过度表达，使得肿瘤细胞可以逃避凋亡的生理过程，进而获得生存优势。
作为抗凋亡蛋白家族的重要成员，Mcl-1蛋白过表达可导致癌变细胞无法发生凋亡，从而影响肿瘤的治疗效果，产生耐药性。因此，针对Bcl-2蛋白家族抗凋亡成员的抑制剂研究已经成为近年来抗肿瘤药物的研究热点。Mcl-1蛋白过表达在多种癌症细胞中均可以被监测，包括乳腺癌，肺癌，前列腺癌，卵巢癌，胰腺癌和宫颈癌以及白血病和黑色素瘤等，成为癌细胞抵抗常规化疗药物的重要作用机制。因此，有效的Mcl-1抑制剂和抗细胞凋亡机制的进一步研究是非常有必要的。
为了更好地分析Mcl-1的抗细胞凋亡机制，制定癌症治疗策略，小分子荧光探针可以最低限度地影响天然Mcl-1蛋白的性质，为检测肿瘤细胞提供了广泛的应用。目前，小分子荧光探针，由于其独特的优势，包括低成本，高灵敏度，操作步骤简单，被广泛地应用于蛋白质、核酸等重要生物分子的生物学和药理学检测中，对疾病机制探讨、临床诊断及药物筛选等领域的发展具有重要的意义。然而，目前的Mcl-1蛋白荧光探针数量非常少，且存在选择性差、灵敏度低以及荧光背景干扰大等问题，因此，开发新型的Mcl-1蛋白小分子荧光探针是非常有意义的。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供一种Mcl-1小分子荧光探针及其制备方法、光学活性、生物活和在制药领域中的应用。
具体技术方案如下：
一、Mcl-1小分子荧光探针
一种Mcl-1小分子荧光探针，具有下述结构通式Ⅰ所示的结构：
Figure BDA0002374212330000021
其中，R1为磺酰氯类荧光团，R2为羧基或四氮唑。
优选地，所述R1为丹磺酰氯，喹啉磺酰氯，10-乙基-吖啶酮-2-磺酰氯，4-(N-苯并吡咯酮)-苯磺酰氯荧光团；R2为羧基。
更优选地，Mcl-1小分子荧光探针选自具有以下结构式DNSH的化合物：
Figure BDA0002374212330000022
二、Mcl-1小分子荧光探针的制备方法
Mcl-1小分子荧光探针的制备方法以化合物DNSH为例，其反应过程如下：
Figure BDA0002374212330000031
具体步骤为：
(1)4-氨基-1-萘酚和丹磺酰氯在二氯甲烷和三乙胺的条件下生成中间体3；
(2)步骤(1)所得中间体3在高碘酸钠环境下进行氧化得中间体4；
(3)步骤(2)所得中间体4与巯基乙酸在DMF溶液中发生加成反应，得到终产物探针分子DNSH。
三、Mcl-1小分子荧光探针的应用
本发明的Mcl-1小分子荧光探针可以作为特异性识别且定量测定Mcl-1蛋白的探针。
本发明的Mcl-1小分子荧光探针可以实现Mcl-1蛋白抑制剂的高通量筛选及在制备用于检测抑制Mcl-1蛋白试剂中的应用。
本发明的Mcl-1小分子荧光探针可以用于Mcl-1蛋白高表达的肿瘤细胞的标记。
本发明的Mcl-1小分子荧光探针在制备筛选Mcl-1蛋白相关疾病的药物制剂中的应用，所述的相关疾病为恶性肿瘤；优选的，所述Mcl-1蛋白过表达相关恶性肿瘤为胰腺癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、多发性骨髓瘤以及白血病。
本发明的有益效果：
1.本发明的探针结构新颖，对Mcl-1蛋白的结合亲和力强。探针的斯托克位移较大，且对周围环境的变化较为敏感，表明探针具有良好的荧光特性，且反应时间快、专属性强。
2.本发明的探针DNSH可以特异性识别且定量测定Mcl-1蛋白。本发明的探针可以实现Mcl-1蛋白抑制剂的高通量筛选及在制备用于检测抑制Mcl-1蛋白试剂中的应用。本发明的荧光探针可以用于Mcl-1蛋白高表达的肿瘤细胞的标记。本发明的Mcl-1小分子荧光探针在制备筛选Mcl-1蛋白相关疾病的药物制剂中的应用，所述的相关疾病为恶性肿瘤；优选的，所述Mcl-1蛋白过表达相关恶性肿瘤为胰腺癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、多发性骨髓瘤以及白血病。
3.本发明探针原料便宜易得，反应步骤简单，后处理过程简便。
附图说明
图1为(A)探针DNSH的吸收光谱(B)不同浓度下探针在PBS缓冲溶液中的荧光激发光谱(C)不同浓度下探针在PBS缓冲溶液中的荧光发射光谱(D)不同的溶剂中探针的荧光激发光谱(E)不同溶剂中探针的荧光发射光谱。
图2为探针DNSH对Mcl-1蛋白荧光特异性鉴别实验。(A)室温下5μM的荧光探针与不同浓度的Mcl-1蛋白(0.45,0.3,0.225,0.1125and 0mg/mL)在缓冲溶液中孵育20min后的荧光发射光谱。(B)495nm处的荧光强度与Mcl-1蛋白浓度的线性关系图。(C)5μM的荧光探针与5μM的荧光探针和0.225mg/mL的Mcl-1蛋白在室温下孵育后每两分钟测定的495nm处的荧光强度。(D)室温下5μM的荧光探针、5μM的荧光探针和0.225mg/mL的Mcl-1蛋白、5μM的荧光探针和0.225mg/mL的Mcl-1蛋白和5μM蛋白抑制剂UMI-77、5μM的荧光探针和0.225mg/mL的Mcl-1蛋白和100μM蛋白抑制剂UMI-77在缓冲溶液中孵育的荧光发射光谱。(E)室温下5μM的荧光探针与0.225mg/mL的Mcl-1蛋白、Bcl-2蛋白以及BSA蛋白在缓冲溶液中孵育的荧光发射光谱。(F)室温下5μM的荧光探针与0.225mg/mL的Mcl-1蛋白、Bcl-2蛋白以及BSA蛋白在缓冲溶液中孵育后495nm处的荧光强度柱状图。
图3为5μM探针分子DNSH在PC-3和HUVEC细胞有无抑制剂UMI-77(100μM)存在条件下的成像(A：HUVEC细胞B、C：PC-3细胞；A1、B1、C1：明场；A2、B2、C2：绿色荧光蛋白通道)镜头的放大倍数:63×。
图4为室温下5μM的荧光探针、5μM的荧光探针和100μM蛋白抑制剂UMI-77与PC-3细胞共孵育后使用流式细胞仪测得的流式结果(曲线1：阴性对照；曲线2：5μM的荧光探针DNSH和100μM蛋白抑制剂UMI-77与PC-3细胞共孵育；曲线3：5μM的荧光探针DNSH与PC-3细胞共孵育)。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1：5-(二甲氨基)-N-(4-羟基萘-1-基)萘-1-磺酰胺(3)的制备
圆底烧瓶中加入20mL二氯甲烷后，冰浴条件下，向烧瓶中加入4-氨基-1-萘酚(0.39g，2mmol)，滴加三乙胺溶液(0.42ml，3mol)使其溶解。逐勺加入丹磺酰氯(0.59g，2.2mml)，撤去冰浴，35℃水浴反应5h。反应结束后水洗除去三乙胺，干燥过滤旋干后经柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝5：1，V/V)得到红棕色固体5-(二甲氨基)-N-(4-羟基萘-1-基)萘-1-磺酰胺，产率为83％,mp:216-218℃。
1H NMR(400MHz,DMSO)8.48(d,J＝8.6Hz,1H),8.39(d,J＝8.5Hz,1H),8.00(d,J＝8.3Hz,1H),7.86(d,J＝7.2Hz,1H),7.74(d,J＝8.4Hz,1H),7.61(t,J＝8.1Hz,1H),7.48–7.41(m,1H),7.32(t,J＝7.6Hz,1H),7.26(d,J＝7.5Hz,1H),7.19(t,J＝7.6Hz,1H),6.75(d,J＝8.1Hz,1H),6.61(d,J＝8.1Hz,1H),2.82(s,6H).
实施例2：5-(二甲氨基)-N-(4-氧杂萘-1(4H)-亚烷基)萘-1-磺酰胺(4)的制备
高碘酸钠(0.82g，3.84mmol)加入到圆底烧瓶中，加水溶解，再加入二氧化硅(4.11g，19.2mol)搅拌8h，过滤干燥。圆底烧瓶中加入乙酸乙酯，50℃的油浴条件下，向其中加入化合物3(1g，2.56mmol)，后逐勺加入制备好的高碘酸钠的二氧化硅分散相(4.93g,3.84mmol)搅拌6h。反应结束后过滤(二氯甲烷：甲醇＝20:1冲洗滤饼)旋干，后经柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝15：1)得到红色固体5-(二甲氨基)-N-(4-氧杂萘-1(4H)-亚烷基)萘-1-磺酰胺，产率为20％，mp:125-128℃。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.61(d,J＝8.5Hz,1H),8.39(d,J＝7.2Hz,1H),8.31(d,J＝10.5Hz,1H),8.19(d,J＝8.6Hz,1H),8.03(d,J＝7.5Hz,1H),7.90(d,J＝7.7Hz,1H),8.88–6.96(m,16H),7.84(t,J＝7.2Hz,1H),7.78–7.71(m,2H),7.66(t,J＝8.1Hz,1H),7.31(d,J＝7.6Hz,1H),7.14(d,J＝10.5Hz,1H),2.87(s,6H).
实施例3：2-((4-((5-(二甲氨基)萘)-1-磺酰胺基)-1-羟基萘-2-基)巯基乙酸(DNSH)的制备
化合物4 5-(二甲氨基)-N-(4-氧杂萘-1(4H)-亚烷基)萘-1-磺酰胺(0.12g，0.33mmol)加入到圆底烧瓶中，加入N,N-二甲基甲酰胺(10mL)使其溶解，逐滴加入巯基乙酸(0.07g，0.75mmol)，室温下搅拌2h。反应结束后加入大量的水淬灭N,N-二甲基甲酰胺，乙酸乙酯萃取旋干，后经柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝50：1)得到探针DNSH 2-((4-((5-(二甲氨基)萘)-1-磺酰胺基)-1-羟基萘-2-基)巯基乙酸为灰白色固体，产率为90％，mp:151-153℃。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.22(s,1H),10.06(s,1H),8.48(d,J＝8.6Hz,1H),8.39(d,J＝8.5Hz,1H),8.00(d,J＝8.3Hz,1H),7.86(d,J＝7.2Hz,1H),7.74(d,J＝8.4Hz,1H),7.61(t,J＝8.1Hz,1H),7.48–7.41(m,1H),7.32(t,J＝7.6Hz,1H),7.26(d,J＝7.5Hz,1H),7.19(t,J＝7.6Hz,1H),6.75(d,J＝8.1Hz,1H),6.61(d,J＝8.1Hz,1H),2.82(s,6H).
实施例4:探针光学活性的测定实验
本发明的荧光探针DNSH用二甲基亚砜配置成浓度为10mM的浓储备液，用PBS缓冲溶液稀释得到不同浓度的溶液；用不同的有机溶剂稀释成5μM的溶液，使用荧光分光光度计测定不同浓度和不同溶剂下探针DNSH的荧光光谱，以探究探针的荧光特性。探针DNSH的紫外最大吸收为314nm，最大荧光激发波长为340nm，荧光最大发射波长为545nm。从实验结果可以得出，探针的斯托克位移较大，且对周围环境的变化较为敏感，表明探针具有良好的荧光特性，见图1。
实施例5:生物活性的测定实验
以UMI-77为阳性药，采用FP荧光偏振实验，测定荧光探针分子与Bcl-2家族蛋白的结合活性实验，结果如表1所示。探针分子DNSH的活性与阳性对照药UMI-77活性相当，探针对Mcl-1的抑制活性比Bcl-2蛋白高20倍，表明探针对Mcl-1蛋白有特异性亲和力。
表1：探针分子对Bcl-2家族蛋白的抑制活性测定
Figure BDA0002374212330000061
实施例6探针DNSH对Mcl-1蛋白荧光特异性鉴别实验
图2结果表明，探针与不同浓度的Mcl-1蛋白在室温下孵育，随着蛋白浓度的升高，荧光强度逐渐增强，且荧光最大发射波长发生了一定程度的蓝移；蛋白浓度与荧光强度在一定范围内成正比，表明探针可以特异性且定量的识别Mcl-1蛋白。荧光强度在加入阳性抑制剂UMI-77后几乎被淬灭，进一步验证了探针对Mcl-1的荧光特异性。探针与蛋白在10min左右的赋予时间内荧光强度即可达到最大值，如此反应时间快、专属性强的荧光探针成为分子水平Mcl-1蛋白鉴别检测的有效工具。
实施例7探针DNSH在Mcl-1高表达及低表达PC-3细胞成像中的应用
选择PC-3细胞为阳性细胞，选择HUVEC为阴性细胞，在相同条件下，加入抑制剂UMI-77作为阴性对照。具体步骤为：PC-3细胞与HUVEC细胞用含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基；在5％CO2空气及37℃的环境中进行培养，成像前，将细胞接种于共聚焦小皿中，培养12h，将培养基吸掉，用PBS洗涤三次，加入5μM探针分子DNSH孵育10-20min；相同条件下，另一小皿加入5μM探针DNSH与100μM抑制剂UMI-77作阴性对照，孵育相同的时间，用Zeiss Axio Observer A1成像。
成像结果如图3所示，与阴性细胞对比下，探针分子能够标记Mcl-1的蛋白高表达的PC-3肿瘤细胞。
实施例8探针DNSH用于筛选Mcl-高表达的PC-3细胞
流式实验可以用于筛选Mcl-1高表达的PC-3细胞，我们采用Mcl-1高表达的细胞株PC-3细胞，在实验前，将正处于指数增长的细胞离心后种于流失管中(每管50万个细胞)，实验设置空白对照为不加探针的PC-3细胞，实验组加入5μM探针和阴性对照组(加入5μM的荧光探针DNSH和100μM蛋白抑制剂UMI-77)，利用流式细胞仪进行流式实验。
流式实验结果见图4显示，相比空白对照组，加入探针后PC-3细胞荧光增强，当加入抑制剂后，细胞荧光减弱，说明探针分子与抑制剂UMI-77发生竞争作用，可以说明探针与UMI-77作用靶点均为Mcl-1蛋白。利用该项实验技术，可以筛选Mcl-1蛋白高表达的肿瘤细胞，出现荧光增强的现象即说明该细胞Mcl-1蛋白表达水平高，可能为肿瘤细胞。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种Mcl-1小分子荧光探针，其特征在于，具有下述结构通式Ⅰ所示的结构：
Figure FDA0002374212320000011
其中，R1为磺酰氯类荧光团，R2为羧基或四氮唑。
2.如权利要求1所述的Mcl-1小分子荧光探针，其特征在于，所述R1为丹磺酰氯，喹啉磺酰氯，10-乙基-吖啶酮-2-磺酰氯，4-(N-苯并吡咯酮)-苯磺酰氯荧光团；R2为羧基。
3.如权利要求2所述的Mcl-1小分子荧光探针，其特征在于，Mcl-1小分子荧光探针选自具有以下结构式DNSH的化合物。
Figure FDA0002374212320000012
4.如权利要求3所述的Mcl-1小分子荧光探针的制备方法，其特征在于，包括步骤：
(1)4-氨基-1-萘酚和丹磺酰氯在二氯甲烷和三乙胺的条件下生成中间体3；
Figure FDA0002374212320000013
(2)步骤(1)所得中间体3在高碘酸钠环境下进行氧化得中间体4；
Figure FDA0002374212320000021
(3)步骤(2)所得中间体4与巯基乙酸在DMF溶液中发生加成反应，得到终产物探针分子DNSH。
5.如权利要求1-3任一项所述的Mcl-1小分子荧光探针作为特异性识别且定量测定Mcl-1蛋白的探针的应用。
6.如权利要求1-3任一项所述的Mcl-1小分子荧光探针可以实现Mcl-1蛋白抑制剂的高通量筛选及在制备用于检测抑制Mcl-1蛋白试剂中的应用。
7.如权利要求1-3任一项所述的Mcl-1小分子荧光探针用于Mcl-1蛋白高表达的肿瘤细胞的标记。
8.如权利要求1-3任一项所述的Mcl-1小分子荧光探针在制备筛选Mcl-1蛋白相关疾病的药物制剂中的应用，所述的相关疾病为恶性肿瘤。
9.如权利要求8所述的Mcl-1小分子荧光探针的应用，所述Mcl-1蛋白过表达相关恶性肿瘤为胰腺癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、多发性骨髓瘤以及白血病。
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