CN114426519A - 一种用于胱硫醚β裂解酶检测的荧光探针NI-CO-CYS - Google Patents

Abstract

一种用于胱硫醚β裂解酶检测的荧光探针NI‑CO‑CYS。本发明提供了一种可用于检测胱硫醚β裂解酶(Cystathionine beta lyase,简称CBL)的荧光探针。该探针

以4氨基‑1，8‑萘酰亚胺为荧光母体,通过一种氨基甲酸酯结构构建的linker连接酶识别位点半胱氨酸。CBL可以选择性识别与切断NI‑CO‑CYS,生成

。利用反应物与产物的荧光差别实现选择性地检测胱硫醚β裂解酶。该探针可以用于定性及定量植物细胞及组织中CBL含量，以及用于CBL抑制剂的筛选。

Description

一种用于胱硫醚β裂解酶检测的荧光探针NI-CO-CYS

技术领域

本发明涉及荧光探针领域，具体涉及一种可用于检测胱硫醚β裂解酶(Cystathionine beta lyase,简称CBL)的荧光探针NI-CO-CYS。该探针以4氨基-1，8-萘酰亚胺为荧光母体,通过一种氨基甲酸酯结构构建的linker连接酶识别位点半胱氨酸。CBL可以选择性识别与切断NI-CO-CYS。利用反应物与产物的荧光差别实现选择性地检测胱硫醚β裂解酶。

背景技术

胱硫醚β裂解酶(Cystathionine beta-lyase,CBL EC4.4.1.8)属于裂解酶类，催化胱硫醚β位裂解，在脱去丙酮酸和NH₃后，生成同型半胱氨酸,该步骤是微生物和植物蛋氨酸生物合成中的倒数第二个步骤。此外,胱硫醚β裂解酶还是产生硫化氢的主要途径,硫化氢被证实是细胞信号通路中信号转导过程中的重要分子。因此在微生物体及植物体中检测及定量CBL具有重要意义。另外,由于高等生物中不存在CBL,因此CBL还是开发抗生素和除草剂的重要目标。CBL抑制剂全新的化学结构、良好的作用效果和独特的作用靶点已引起国内外研究者广泛的兴趣。

荧光探针是有效检测生命体内CBL的手段之一，相比吸光度法,液相质谱法,同位素标记法具有检测便捷灵敏的优势。一个具有应用前景的荧光探针应具有作用前后荧光变化明显、对目标分子响应快、选择性好、合成简单等优点。目前还没有应用于检测CBL的荧光探针,开发CBL的荧光探针具有很大挑战性。

发明内容

本发明就是针对上述问题，提供了一种可用于选择性检测细胞内CBL的荧光探针NI-CO-CYS，此探针可以在缓冲液或水溶液中，或者植物细胞或组织中选择性地与CBL作用，作用后荧光改变明显。运用该探针可以进行CBL的活性检测或抑制剂筛选。

本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种可用于检测胱硫醚β裂解酶(Cystathionine beta-lyase,CBL)的荧光探针NI-CO-CYS。NI-CO-CYS以4氨基-1，8-萘酰亚胺为荧光母体,通过一种氨基甲酸酯结构构建的linker连接酶识别位点半胱氨酸。CBL可以选择性识别与切断NI-CO-CYS。利用反应物与产物的荧光差别实现选择性地检测胱硫醚β裂解酶(在缓冲液或水溶液中)。

合成的探针化合物的结构用代号NI-CO-CYS表示。所述荧光探针的结构式Ⅰ如下。

结构代号：NI-CO-CYS。

R可以为氢原子、或也可以为具有1-10个碳原子的取代烷基、或苯基、或取代苯基，取代苯基上的取代基为C1-C5的烷基，苯基上取代基的个数为1-5个。

所述的荧光探针的具体制备方法为：

1)在干燥乙醇50ml中加入4氨基-1,8萘二甲酸酐(cas：6492-86-0)2.13g，搅拌至全溶。加入0.87g正丁胺(cas：109-73-9)，加热回流12小时，回流12h，乙醇和多余正丁胺旋干，硅胶柱层析分离，洗脱梯度为(石油醚：乙酸乙酯＝3:1)。得到化合物1(4氨基-1,8萘酰亚胺)产率约为80％。得到后即投入使用。

2)在冰浴的无水二氯甲烷中，加入0.293三光气,加0.01N三乙胺搅拌，促使三光气分解，之后滴加0.268g 4氨基-1,8萘酰亚胺的二氯甲烷溶液，继续搅拌，点板监测反应，待其完全转化，继续加入1N(S)-methyl2-((tert-butoxycarbonyl)amino)-3-((2-hydroxyethyl)thio)propanoate，继续搅拌，点板监测反应，反应完全后，硅胶柱层析分离(二氯甲烷：甲醇＝20:1)，得到产物2，产率约50％.

3)在冰浴的无水二氯甲烷中，溶解产物2，缓慢滴加三氟乙酸，室温下反应完全后，缓慢滴加碳酸氢钠饱和溶液至不再冒泡即停止。硅胶柱层析分离(二氯甲烷：甲醇＝20:1),得到产物NI-CO-CYS 42mg，产率约10％。

步骤1)中所述的4氨基-1,8萘二甲酸酐,正丁胺的加入量为1:1.2；步骤2)中化合物三光气,三乙胺,4氨基-1,8萘酰亚胺的加入量为1:0.01:1。

所述步骤1)中,所用溶剂为乙醇,所述步骤2)-3)中，所用的溶剂为二氯甲烷；所述的步骤1)-3)中搅拌的方式为磁力搅拌。

所述的荧光探针可以被胱硫醚β裂解酶(Cystathionine beta-lyase,CBL)代谢而产生荧光变化。即所述的荧光探针与CBL作用后，荧光峰从467nm蓝移到542nm处，并且有短波荧光减弱,长波荧光增强的显著现象。

所述的荧光探针可以用于(在缓冲液或水溶液中)胱硫醚β裂解酶(Cystathioninebeta lyase,简称CBL)的检测。

所述的荧光探针可以用于(在缓冲液或水溶液中)检测植物细胞中的胱硫醚β裂解酶。

该探针可以用于(在缓冲液或水溶液中)胱硫醚β裂解酶的抑制剂筛选过程中。

该探针可以用于(在缓冲液或水溶液中)植物组织或细胞中胱硫醚β裂解酶的定量检测。

所述的荧光探针应用于检测CBL时，其荧光变化是因为生成具有结构II的化合物；

该探针可以用于胱硫醚β裂解酶(于缓冲液或水溶液中)的抑制剂筛选。

本发明的有益效果：该化合物在胱硫醚β裂解酶CBL存在下荧光发生显著改变，可用于高灵敏性、高通量地检测CBL酶活性。尤其是，该化合物可用于胱硫醚β裂解酶的抑制剂筛选。

本发明可用于检测体外或者体内胱硫醚β裂解酶(Cystathionine beta-lyase,CBL)的荧光探针。NI-CO-CYS

以4氨基-1，8-萘酰亚胺为荧光母体,通过一种氨基甲酸酯结构构建的linker连接酶识别位点半胱氨酸。CBL可以选择性识别与切断NI-CO-CYS。在CBL作用下，生成

利用反应前后荧光性质的差异实现对CBL的检测，该探针可以高灵敏性，高通量地用于CBL的活性检测以及抑制剂的筛选。

附图说明

图1实施例1中提供的荧光探针NI-CO-CYS的合成路线图；

图2本发明提供的荧光探针NI-CO-CYS检测CBL的原理示意图；

图3实施例1中合成的探针NI-CO-CYS的¹H NMR(a)，¹³C NMR(b)；

图4实施例2中荧光探针NI-CO-CYS水溶液的紫外可见吸收光谱、发射光谱；

图5实施例3中荧光探针NI-CO-CYS的水解产物水溶液的紫外可见激发光谱(a)、发射光谱(b)；

图6实施例4中荧光探针NI-CO-CYS与CBL响应后光谱随时间变化图；

图7实施例5中荧光探针NI-CO-CYS与不同浓度的CBL响应后线性关系图；

具体实施方式

下面将详细描述本发明的具体实施方式，这仅用于更加清楚的说明本发明，而不能视为对本发明的限制。

整个实验过程中，所有的操作方法和操作步骤以及底物的反应条件等，都是根据该技术领域的普通技术人员熟知的方法设计、实施的。

实施例1

所述的荧光探针的具体制备方法为：

1)在干燥乙醇50ml中加入4氨基-1,8萘二甲酸酐(cas：6492-86-0)2.13g，搅拌至全溶。加入0.87g正丁胺(cas：109-73-9)，加热回流12小时，回流12h，乙醇和多余正丁胺旋干，硅胶柱层析分离，洗脱梯度为(石油醚：乙酸乙酯＝3:1，v/v)。得到化合物1(4氨基-1,8萘酰亚胺)产率约为80％。得到后即投入使用。

2)在冰浴(零下-4至4℃)的10ml无水二氯甲烷中，加入0.293三光气,加0.01N(1mg)三乙胺搅拌，促使三光气分解，之后滴加0.268g 4氨基-1,8萘酰亚胺的10ml二氯甲烷溶液，继续搅拌，点板监测反应，待其完全转化，继续加入1N(0.279g)(S)-methyl2-((tert-butoxycarbonyl)amino)-3-((2-hydroxyethyl)thio)propanoate，继续搅拌，点板监测反应，反应完全后，硅胶柱层析分离(二氯甲烷：甲醇＝20:1)，得到产物2，产率约50％.

3)在冰浴(零下-4至4℃)的无水50ml二氯甲烷中，溶解产物2 100mg，缓慢滴加三氟乙酸24mg，室温下反应完全后，缓慢滴加碳酸氢钠饱和溶液至不再冒泡即停止。硅胶柱层析分离(二氯甲烷：甲醇＝20:1，v/v),得到产物NI-CO-CYS 42mg，产率约10％。产物NI-CO-CYS的检测数据，MS:474.16(positive mode).¹HNMR 8.412-8.488,m,3H；8.143-8.163,t,1H；7.699-7.739,t,1H；4.302-4.335,t,3H；4.021-4.059,t,2H；3.615-3.645,m,4H；2.810-2.913,m,4H；1.576-1.614,t,2H；1.310-1.366,t,2H；0.880-0.917,t,3H.¹³CNMR 174.92,163.86,163.09,154.15,140.95,131.99,131.23,129.66,128.56,126.98,124.37,122.50,119.08,117.26,64.60,54.85,51.94,36.92,30.90,29.8,20.29,14.26.

实施例2

如图4所示，将NI-CO-CYS溶于50mM的PH(8-9)硼酸硼砂缓冲液中，配置成20uM的溶液。用荧光酶标仪(Thermofisher)检测器检测NI-CO-CYS水溶液的荧光吸收光谱和荧光发射光谱；结果显示探针NI-CO-CYS的最大吸收/发射波长为367nm/476nm。

实施例3

如图5所示，将NI-CO-CYS溶于50mM的PH(8-9)硼酸硼砂缓冲液中，配置成20uM的溶液。加入1mg/L CBL蛋白10uL孵育30分钟后，用荧光酶标仪(Thermofisher)检测器检测该缓冲溶液的荧光激发光谱(a)、荧光发射光谱(b)；结果显示NI-CO-CYS的代谢产物的最大激发/发射波长为438/542nm。

实施例4

在193ul的硼酸硼砂缓冲液PH(8-9)中加2ul NI-CO-CYS的-DMSO溶液(2mM)，5ul的CBL酶(10mg/ml)。使用全波长扫描式多功能读数仪及96孔酶标板进行测量,每两分钟扫一次发射谱。λex1＝367nm，λ_em1＝476nm，λ_ex2＝438nm，λ_em2＝542nm，结果如图6显示,短波逐渐减低而长波逐渐升高,代表底物的减少以及产物的生成。

实施例5

将10mg/ml的CBL酶储液浓度梯度稀释，分别得到5mg/ml、2.5mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml的不同浓度酶储液。每个反应在178ul的PBS缓冲液PH(8-9)中加2ul NI-CO-CYS(浓度20uM)以及20ul上述不同浓度的酶储液，孵育1h后测量。使用全波长扫描式多功能读数仪及96孔酶标板进行测量。测量该工作液的荧光发射光谱，检测λex1＝367nm，λem1＝476nm，λex2＝438nm，λem2＝542nm处的发射值,结果显示如图7，随酶浓度的增长，F_542nm/F_476nm随酶浓度线性增长。

Claims (7)

1.一种荧光探针NI-CO-CYS，其特征在于：所述的荧光探针的结构为结构I所示，

结构代号：NI-CO-CYS；

R可以为氢原子、或也可以为具有1-10个碳原子的取代烷基、或苯基、或取代苯基，取代苯基上的取代基为C1-C5的烷基，苯基上取代基的个数为1-5个。

2.一种权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其具体步骤如下，

1)在乙醇50ml中加入4氨基-1，8萘二甲酸酐2.13g，搅拌至全溶；加入0.87g正丁胺，加热回流12小时，回流12h，乙醇和多余正丁胺旋干，硅胶柱层析分离，洗脱梯度为(石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1，体积比)，得到化合物1(4氨基-1，8萘酰亚胺)；

2)在冰浴(零下4度-4度)的10ml无水二氯甲烷中，加入0.293g三光气，加1mg三乙胺搅拌，促使三光气分解，之后滴加0.268g 4氨基-1，8萘酰亚胺的10ml二氯甲烷溶液，继续搅拌，点板监测反应，待其完全转化，继续加入0.279g(S)-methyl2-((tert-butoxycarbonyl)amino)-3-((2-hydroxyethyl)thio)propanoate，继续搅拌，点板监测反应，反应完全后，硅胶柱层析分离(二氯甲烷：甲醇＝20：1，体积比)，得到产物2；

3)在冰浴(零下4度-4度)的50ml无水二氯甲烷中，溶解产物2 100mg，滴加三氟乙酸24mg，室温下反应完全后，滴加碳酸氢钠饱和溶液至不再冒泡即停止，硅胶柱层析分离(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1，体积比)，得到产物。

3.一种权利要求1所述的荧光探针的应用，其特征在于：所述的荧光探针可以用于胱硫醚β裂解酶(Cystathionine beta lyase，简称CBL)的检测。

4.根据权利要求3所述的荧光探针的应用，其特征在于：所述的荧光探针可以用于检测植物细胞中的胱硫醚β裂解酶。

5.根据权利要求3所述的荧光探针的应用，其特征在于：该探针可以用于胱硫醚β裂解酶的抑制剂筛选过程中。

6.根据权利要求3所述的荧光探针的应用，其特征在于：该探针可以用于植物组织中胱硫醚β裂解酶的定量检测。

7.根据权利要求3-6任一所述的荧光探针的应用，其特征在于：所述的荧光探针应用于检测CBL时，其荧光变化是因为生成具有结构II的化合物；

R可以为氢原子、或也可以为具有1-10个碳原子的取代烷基、或苯基、或取代苯基，取代苯基上的取代基为C1-C5的烷基，苯基上取代基的个数为1-5个。

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