CN104974744A

CN104974744A - 一种硫氧还蛋白还原酶荧光探针及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN104974744A
Application number: CN201410137070.1A
Authority: CN
Inventors: 卜宪章; 吴海强; 黄磊; 陈雨
Original assignee: Shenzhen Hankang Technology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Hankang Technology Co Ltd
Priority date: 2014-04-08
Filing date: 2014-04-08
Publication date: 2015-10-14
Anticipated expiration: 2034-04-08
Also published as: CN104974744B

Abstract

本发明公开了一种硫氧还蛋白还原酶荧光探针及其制备方法和用途，所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针为含有7-二乙胺基香豆素荧光团和呋喃丙烯酰荧光淬灭基团的化合物。该荧光探针通过迈克尔加成反应共价结合到硫氧还蛋白还原酶上，从而发射荧光，荧光强度高低与硫氧还蛋白还原酶含量成正比。且该荧光探针对硫氧还蛋白还原酶有较高的抑制活性和选择性，对生物体系中其它含量很高的巯基小分子响应很低，可广泛应用于样品中硫氧还蛋白还原酶含量的检测，尤其适用于检测活体肿瘤细胞中硫氧还蛋白还原酶含量。

Description

一种硫氧还蛋白还原酶荧光探针及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种硫氧还蛋白还原酶荧光探针及其制备方法和用途。

背景技术

硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase，TrxR）是二聚体硒酶，属于吡啶核苷酸二硫化物氧化还原蛋白酶家族成员。硫氧还蛋白还原酶、硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(triphosphopyridinenucleotide，NADPH)共同构成了硫氧还蛋白系统，该系统主要作用是调节细胞内氧化还原平衡。大量研究表明硫氧还蛋白还原酶在多种人原发性肿瘤中过表达，是肿瘤异常增生的关键调控酶，可以作为肿瘤标志物检测其在人体内的活性，从而监测体内肿瘤的发生和发展。因此一种能特异性检测硫氧还蛋白还原酶表达量的荧光探针有十分重要的临床意义。

硫氧还蛋白还原酶的活性位点是碳端一段保守的序列(-Gly-Cys-Sec-Gly)，其中Cys497，Sec498对其还原活性起到关键作用。大量文献表明，许多含有α，β-不饱和酮结构的化合物能抑制硫氧还蛋白还原酶的活性。姜黄素作为一种被广泛研究的化合物，依赖它结构中的α，β-不饱和酮，表现出较好的硫氧还蛋白还原酶抑制活性。其抑制作用机制是姜黄素分子通过迈克尔加成反应共价结合到该酶的Cys497，Sec498。本课题组从事硫氧还蛋白还原酶抑制剂的研究多年，通过大量结构的分析，发现呋喃丙烯酰结构是硫氧还蛋白还原酶抑制的药效团。

目前，文献报道只有一种含有环状二硫键的荧光探针分子用于检测硫氧还蛋白还原酶。然而，该荧光探针是非共价结合的。因此一种新的能共价结合到硫氧还蛋白还原酶，实现原位定点检测的荧光探针将会有更广泛的应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种可与硫氧还蛋白还原酶共价结合，具有较高检测特异性的硫氧还蛋白还原酶荧光探针。

本发明采用的技术方案是提供一种硫氧还蛋白还原酶荧光探针，所述荧光探针为(E)-7-(二乙胺基)-3-(3-(5-甲基呋喃-2-基)丙烯酰)-2氢-苯并吡喃-2-酮，其结构式为：

本发明的目的还在于提供所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：4-二已胺基水杨醛用溶剂溶解后，加入乙酰乙酸乙酯和哌啶，搅拌并加热回流，冷却后过滤获得中间体化合物；

步骤二：取所述中间体化合物，用溶剂溶解后，加入5-甲基呋喃醛及哌啶，搅拌并加热回流，冷却后柱层析分离获得所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针。

本发明的目的还在于提供所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针的用途，将所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针应用于检测硫氧还蛋白还原酶及同家族酶、同工酶、结构相似酶的活性、含量。

本发明的目的还在于提供所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针的用途，将所述荧光探针应用于制备硫氧还蛋白还原酶及同家族酶、同工酶、结构相似酶的检测试剂、检测试剂盒。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

（1）以呋喃丙烯酰基为药效团，以香豆素作为荧光团而设计的荧光探针，对于硫氧还蛋白还原酶作用的专一性强。

（2）本发明荧光探针自身荧光信号很弱，与硫氧还蛋白还原酶作用后荧光显著增强，并且，该荧光探针能与硫氧还蛋白还原酶共价结合，荧光不会被稀释，检测灵敏度高。

（3）本发明硫氧还蛋白酶还原酶自身化学性质稳定，无自氧化作用，与目标物作用迅速且作用后无光漂白现象。

（4）本发明所提供制备方法合成路线简单，易于制备，便于推广应用。

本发明硫氧还蛋白还原酶荧光探针性能优异，为进一步研究细胞中硫氧还蛋白还原酶生物学功能提供了可靠实用的工具。

附图说明

图1为本发明硫氧还蛋白还原酶荧光探针检测原理示意图；

图2为本发明实施例3中硫氧还蛋白还原酶荧光探针与硫氧还蛋白还原酶反应的紫外可见吸收光谱图；

图3为本发明实施例4中硫氧还蛋白还原酶荧光探针与不同浓度的硫氧还蛋白还原酶反应的荧光发射光谱图；

图4为本发明实施例5中硫氧还蛋白还原酶荧光探针与不同物质作用的荧光强度变化柱状图；

图5为本发明实施例6中硫氧还蛋白还原酶荧光探针与硫氧还蛋白还原酶及其它含巯基化合物反应的荧光强度的动力学曲线图；

图6为本发明实施例7中硫氧还蛋白还原酶荧光探针与待检测细胞内硫氧还蛋白还原酶的荧光成像图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。

本发明实施例提供硫氧还蛋白还原酶荧光探针，所述荧光探针为含有7-二乙胺基香豆素荧光基团和呋喃丙烯酰荧光淬灭基团的化合物(E)-7-(二乙胺基)-3-(3-(5-甲基呋喃-2-基)丙烯酰)-2氢-苯并吡喃-2-酮，其分子结构式如下式所示：

其中，硫氧还蛋白还原酶荧光探针可以制备成药物学上可接受的盐；所述药物学上可接受的盐为锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铁盐、铜盐、有机铵盐、盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、乙二酸盐或柠檬酸盐；有机铵盐包括甲胺盐、乙胺盐、三乙基胺盐或N，N－二异丙基乙胺盐。

本发明实施例硫氧还蛋白还原酶荧光探针的的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

其制备路线如下所示：

具体地，所述4-二已胺基水杨醛、乙酰乙酸乙酯、哌啶的质量比为1:1.0～3.5:0.1～1.2；所述中间体化合物、5-甲基呋喃醛、哌啶的质量比为1:0.4～1.6:0.2～1.6。步骤一中所述加热回流的温度为60～180℃，加热回流的时间为3～12小时；步骤二中所述加热回流的温度为60～180℃，加热回流的时间为8～24小时。

更具体地，所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针的制备方法包括以下步骤:

步骤一：在容器中加入4-二已胺基水杨醛,15～20ml无水乙醇溶解后，加入乙酰乙酸乙酯及哌啶,其中4-二乙胺基水杨醛、乙酰乙酸乙酯、哌啶之间的用量比例范围为：1：1.5-2.0：0.2，搅拌并加热至80～100℃，回流3～5小时，冷却后析出黄色固体，过滤得中间体化合物3-乙酰基-7-(二乙胺基)-2氢-苯并吡喃-2-酮。

步骤二：在容器中加入中间体化合物3-乙酰基-7-(二乙胺基)-2氢-苯并吡喃-2-酮，用15～20ml无水乙醇溶解后，加入5-甲基呋喃醛及哌啶,其中中间体化合物、5-甲基呋喃醛、哌啶之间的用量比例范围为：1:1:1，搅拌并加热至80～100℃，回流8～10小时。冷却后，通过层析柱分离的目标化合物(E)-7-(二乙胺基)-3-(3-(5-甲基呋喃-2-基)丙烯酰)-2氢-苯并吡喃-2-酮。

本发明硫氧还蛋白还原酶荧光探针能抑制硫氧还蛋白还原酶，对硫氧还蛋白还原酶有较高的抑制活性，通过DTNB法测得其体外抑制硫氧还蛋白还原酶的IC₅₀为0.52μM。

硫氧还蛋白还原酶荧光探针，基于以呋喃丙烯酰基为药效团，以香豆素作为荧光团，对于硫氧还蛋白还原酶作用的专一性强，并且，所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针能与硫氧还蛋白还原酶共价结合，荧光不会被稀释。因此，所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针能用通过其荧光的变化检测硫氧还蛋白还原酶含量，可应用于生理条件下硫氧还蛋白还原酶的荧光检测。

将硫氧还蛋白还原酶荧光探针用于检测硫氧还蛋白还原酶，其方法依赖于以下的作用反应机制：7-二乙胺基香豆素作为荧光团，呋喃丙烯酰基作为荧光淬灭基团；富电子的7-二乙胺基中的电子通过分子内电子转移（ICT）转移至缺电子的呋喃丙烯酰基，从而荧光处于淬灭状态；当荧光探针通过迈克尔加成共价结合到硫氧还蛋白还原酶上的巯基和硒巯基，α，β-不饱和酮结构被破坏，分子内电子转移过程被破坏，探针分子发射荧光。其反应过程如图1所示。

因此，本发明中还提供一种硫氧还蛋白还原酶荧光探针的用途，将所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针用于检测硫氧还蛋白还原酶及同家族酶、同工酶、结构相似酶的活性或含量。硫氧还蛋白还原酶荧光探针可用于检测磷酸盐缓冲液中的硫氧还蛋白还原酶，或检测活体肿瘤细胞中硫氧还蛋白还原酶，还可以将所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针制备成药物学上可接受的盐。作为一种优选方案，所述药物学上可接受的盐包括锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铁盐、铜盐、有机铵盐、盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、乙二酸盐、柠檬酸盐等，有机铵盐包括甲胺盐、乙胺盐、三乙基胺盐、N，N－二异丙基乙胺盐等。

以下通过实施例对本发明做进一步说明。

实施例1硫氧还蛋白还原酶荧光探针的制备

将1g的4-二乙胺基水杨醛(5.17mmol)和1.35g的乙酰乙酸乙酯4-二乙胺基水杨醛(10.38mmol)溶解在20ml无水乙醇中，加入100μl哌啶作为催化剂。反应液加热回流5小时，冷却至室温，大量黄色固体析出。黄色固体经抽滤并用无水乙醇洗可得纯品中间体1a(1.2g，4.6mmol)，产率90%。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.46(s，1H)，7.40(d，J=9.0Hz，1H)，6.63(dd，J=9.0，2.3Hz，1H)，6.48(d，J=2.2Hz，1H)，3.47(q，J=7.1Hz，1H)，2.69(s，1H)，1.25(t，J=7.1Hz，1H).

取中间体1a（250.0mg，0.96mmol)以及5-甲基呋喃醛(106.0mg，0.96mmol)溶解在20ml无水乙醇中，加入100μl哌啶作为催化剂.反应液加热回流过夜。反应结束后减压旋干溶剂，经过柱层析分离得到深红色终产物1(135mg，0.38mmol)in40%yield:HPLC纯度>99.9%tR=15.51min.¹H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.51(s，1H)，7.87(d，J=15.4Hz，1H)，7.55(d，J=15.3Hz，1H)，7.43(d，J=8.9Hz，1H)，6.68(d，J=8.9Hz，1H)，6.62(s，1H)，6.55(d，1H)，6.10(s，1H)，3.47(q，J=6.6Hz，4H)，2.38(s，3H)，1.25(t，J=7.1Hz，6H).¹³C NMR(101MHz，CDCl3)δ186.15，160.69，158.53，155.89，152.71，150.88，148.26，131.63，129.76，120.72，117.76，117.22，109.86，109.19，108.75，96.81，45.21，14.04，12.44.HRMS calcd forC21H22O4N[M+H]+:352.15433，found352.15494.

实施例2荧光探针的硫氧还蛋白还原酶抑制活性测定

荧光探针抑制硫氧还蛋白还原酶活性测定采用DTNB法，所有实验均在25℃条件下，待测样品的总体积为40μl，其中包含0.3μl of TrxR。将待测样品加入到35.5μl缓冲液中，缓冲液包含1M磷酸盐(pH7.0)，500mM EDTA(pH7.4)，NADPH(0.48mM)及1μl不同浓度的荧光探针。孵育五分钟后，反应液中加入3.2μl of DTNB.对照组加入同体积的二甲基亚砜。用酶标仪测量其在120秒内紫外吸收强度在412nm处的增加过程，从而可以计算出荧光探针抑制硫氧还蛋白还原酶活性。测得IC₅₀=0.52μM。

实施例3荧光探针与硫氧还蛋白还原酶反应的紫外可见吸收光谱

取实施例1制备的荧光探针溶于二甲基亚砜中，制成浓度为10mmol/L的储备液。将5μM的硫氧还蛋白还原酶与25μM二硫苏糖醇在37℃条件下孵育1小时，进行硫氧还蛋白还原酶预处理。荧光探针用磷酸盐缓冲液（PH=7.4）稀释成终浓度为1.0μM，加入终浓度为1.0μM的硫氧还蛋白还原酶，另一组不加硫氧还蛋白还原酶作为空白对照，室温下孵育1小时。测得其紫外可见光谱如图2所示。由图2可见，荧光探针与硫氧还蛋白还原酶反应后最大吸收波长发生了从470nm到440nm的蓝移。

实施例4荧光探针与不同浓度的硫氧还蛋白还原酶反应的荧光发射光谱

取实施例2的荧光分子储备液，用磷酸盐缓冲液（PH=7.4）稀释成终浓度为1.0μM，加入不同终浓度的硫氧还蛋白还原酶（0-1.5μM），室温孵育1小时。在440nm激发波长下，测得其荧光发射光谱，如图3所示。由图3可见，荧光探针与硫氧还蛋白还原酶反应后，荧光在500nm处大大增强，且荧光强度随着硫氧还蛋白还原酶浓度的升高而增强，因此本发明荧光探针可应用于作为定性或定量检测试剂。

实施例5荧光探针与各种氨基酸、金属离子反应后的荧光强度变化

取实施例2的荧光分子储备液，用磷酸盐缓冲液（PH=7.4）稀释成终浓度为1.0μM。加入终浓度为1.0mM的不同氨基酸（Ala，Arg，His，Gly，Lys，Pro，Ile，DTT，Cys，GSH）、金属离子(Ca²⁺，Cu²⁺，Fe²⁺，Fe³⁺，Mg²⁺，Zn²⁺)、过氧化氢以及终浓度为1.0μM的硫氧还蛋白还原酶，室温孵育0.5小时。在激发波长为440nm下，测其在500nm处的荧光强度，如图4所示。由图4可见，荧光探针对硫氧还蛋白还原酶的选择性较强。

实施例6荧光探针与硫氧还蛋白还原酶及其它含巯基化合物反应的荧光强度随时间变化的动力学曲线

取实施例2的荧光分子储备液，用磷酸盐缓冲液（PH=7.4）稀释成终浓度为1.0μM。加入终浓度为1.0mM的Cys，GSH，DTT，以及终浓度为1.0μM的硫氧还蛋白还原酶、牛血清蛋白（BSA）。在激发波长为440nm下，测其在500nm处荧光强度随时间变化的动力学曲线图，总时间为1小时，间隔时间为10秒，如图5所示。由图5可见，尽管Cys，GSH，DTT，的浓度是硫氧还蛋白还原酶的1000倍，但是荧光探针与硫氧还蛋白还原酶反应的速率远远大于与含巯基小分子化合物的反应速率。

实施例7荧光探针与检测细胞内硫氧还蛋白还原酶的荧光成像图

将人肺癌A549/CDDP细胞培养在激光共聚焦专用培养皿中，用磷酸缓冲液冲洗3次。其中一个培养皿加入终浓度2.5μM为荧光探针，在37℃下孵育5min，另外一个培养皿先加50μM顺丁烯马来酰亚胺孵育20min后，再加终浓度2.5μM的荧光探针，在37℃条件下孵育5min，然后分别用激光共聚焦显微镜进行荧光成像检测，如图6所示，其中（a-b）为未加顺丁烯马来酰亚胺孵育，（c-d）为加顺丁烯马来酰亚胺孵育。由图6可见，所述荧光探针在细胞水平也能很好的检测硫氧还蛋白还原酶。

综上所述，本发明公开了一种硫氧还蛋白还原酶荧光探针及其制备方法和用途。该探针可通过简单化学原料制备，该荧光探针通过迈克尔加成反应共价结合到硫氧还蛋白还原酶上，从而发射荧光，并且荧光强度高低与硫氧还蛋白还原酶含量成正比。通过该荧光探针对硫氧还蛋白还原酶的选择性实验数据，发现其对生物体系中硫氧还蛋白还原酶响应远远高于其它巯基小分子化合物，因此可广泛应用于样品中硫氧还蛋白还原酶含量的检测。

Claims

1.一种硫氧还蛋白还原酶荧光探针，其特征在于，所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针为(E)-7-(二乙胺基)-3-(3-(5-甲基呋喃-2-基)丙烯酰)-2氢-苯并吡喃-2-酮，其结构式为：

2.如权利要求1所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针，其特征在于，所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针制成药物学上可接受的盐；所述药物学上可接受的盐为锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铁盐、铜盐、有机铵盐、盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、乙二酸盐或柠檬酸盐。

3.如权利要求2所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针，其特征在于，所述有机铵盐为甲胺盐、乙胺盐、三乙基胺盐或N，N－二异丙基乙胺盐。

4.一种如权利要求1～3任意一项所述的硫氧还蛋白还原酶荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针的制备方法，其特征在于，所述4-二已胺基水杨醛、乙酰乙酸乙酯、哌啶的质量比为1:1.0～3.5:0.1～1.2。

6.根据权利要求4所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针的制备方法，其特征在于，所述中间体化合物、5-甲基呋喃醛、哌啶的质量比为1:0.4～1.6:0.2～1.6。

7.根据权利要求4所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤一中所述加热回流的温度为60～180℃，加热回流的时间为3～12小时。

8.根据权利要求4所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤二中所述加热回流的温度为60～180℃，加热回流的时间为8～24小时。

9.根据权利要求1所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针的用途，其特征在于，将所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针应用于检测硫氧还蛋白还原酶及同家族酶、同工酶、结构相似酶。

10.根据权利要求1所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针的用途，其特征在于，将所述荧光探针应用于制备硫氧还蛋白还原酶及同家族酶、同工酶、结构相似酶的检测试剂、检测试剂盒。