CN109988136A - 一种可响应pH的水溶性检测探针及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种pH探针及其合成方法与应用。具体地说，本发明涉及一种能够用于响应pH的检测探针，该探针由3‑乙酰基‑7‑羟基‑苯并吡喃‑2‑酮和4‑二乙氨基酮酸一起制备。该探针在响应pH时，能发生吸收和荧光信号变化，而且溶液的颜色也发生明显变化，可用于分析检测或成像研究。本发明的有益效果主要体现在：该探针含有酚羟基，在90℃的浓硫酸环境下合成，可以引入磺酸基，从而提高探针的水溶性。其次，该探针的pH响应范围较广，具有吸收和荧光两种信号，应用效果更广。最后，该探针上具有羧基、羟基等活性基团，可以进一步进行修饰，从而用于其他生物分子的检测。

Description

一种可响应pH的水溶性检测探针及其制备与应用

(一)技术领域

本发明涉及一种可响应pH的水溶性检测探针及其制备方法，以及其在分析检测和荧光成像中的应用。

(二)背景技术

pH作为氢离子的定量指标，在实验室pH控制、环境监测和生物医学诊断中具有重要应用价值。生命体内pH值的稳定是维持正常生理功能的重要因素，细胞增殖、离子输送等过程都需要稳定的pH环境进行调控。pH若发生异常，容易导致生物体内的功能紊乱，从而引发一些严重疾病，如癌症、中风、阿尔兹海默症等。因此，pH传感具有重要意义。而pH传感的一个重要方面是构建能够特异性响应pH的检测探针。

目前为止，已经开发了许多用于pH传感的技术，包括微电极、表面增强拉曼散射、核磁共振、比色法和荧光测定法。其中，荧光测定是最有效的pH传感方法之一，其操作简单、响应快速、灵敏度高，并且具有良好的时空分辨率。同时，荧光成像是细胞水平研究的首选，通过与共聚焦激光扫描显微镜相结合从而提供空间和时间信息。

目前已经开发了许多用于pH传感和成像的荧光探针。这些探针包括有机分子探针和基于纳米材料的探针，例如上转换纳米颗粒、半导体量子点、碳纳米材料和荧光纳米复合材料。这些纳米材料具有光谱可调、高斯托克斯位移、荧光稳定等优点。然而，它们仍然存在制备复杂、重现性差、均匀性低等缺点，从而限制了其应用。有机分子探针是另一种广泛使用的探针，它们制备成本低、重复性高、响应快，并且易于商业化。此外，近红外(NIR)荧光探针由于其光组织穿透深、自体荧光低和对生物体光损伤较小而引起了广泛关注。然而，人们普遍认为大部分有机染料主要溶于有机介质而不溶于水，但几乎所有的测量都在水溶液中进行。因此，仍然希望构建水溶性的荧光探针，从而进行分析与成像应用。

(三)发明内容

本发明目的即是提供一种可响应pH的水溶性检测探针及其制备方法，以及其在分析检测和荧光成像中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种可响应pH的水溶性检测探针，结构如式(I)所示：

该探针的水溶性良好，由于在浓硫酸环境下合成，结构中引入了磺酸基，从而提高了探针的水溶性，其合成路线与响应原理参见图1，该探针带有正电荷，通常以盐(比如高氯酸盐)的形式参与反应。在酸性条件下，探针中的羟基处于质子化状态，分子内电荷转移(ICT)较弱。随着pH增高，探针中的羟基会逐渐发生去质子化，从而使得探针的分子内电荷转移(ICT)增强。该探针在响应pH时，能发生吸收和荧光信号变化，而且溶液的颜色也发生明显变化。该探针对pH的响应灵敏度高、特异性强，可用于分析检测与成像研究。

本发明还涉及制备所述水溶性检测探针的方法，所述方法包括：乙酰基-7-羟基-苯并吡喃-2-酮与等摩尔量的4-二乙氨基酮酸溶于浓硫酸并在90～100℃搅拌反应8～20小时，反应完全后冷却到室温，所得混合液加入到碎冰中，然后继续加入高氯酸，抽滤减压得到的固体混合物经分离纯化，得到所述水溶性检测探针(即pH探针)。

所述分离纯化方法为：抽滤减压得到的固体混合物以二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂，用柱层析分离纯化，将收集的样品旋蒸除去溶剂后减压烘干，再用甲醇重结晶，得到所述水溶性检测探针。

所述二氯甲烷和甲醇体积比为100:1～2:1。

本发明还涉及所述的水溶性检测探针在分析检测中的应用。

本发明还涉及所述的水溶性检测探针在荧光成像中的应用。

本发明的有益效果主要体在：该探针可实现对pH的高灵敏、高特异性的响应；其次，该探针的pH响应范围较广，具有吸收和荧光两种信号，应用范围更广；最后，探针上具有羧基、羟基等活性基团，可以进一步进行修饰，从而用于其他生物分子的检测。

(四)附图说明

图1为本发明pH探针的合成路线以及响应原理；

图2为本发明pH探针的核磁氢谱表征图；

图3为本发明pH探针在不同pH条件下的吸收光谱图；

图4为本发明pH探针在不同pH条件下的吸收光谱变化图以及吸收比值与pH的线性关系图；

图5为本发明pH探针在不同pH条件下的荧光光谱变化图以及荧光峰值与pH的线性关系图；

图6为本发明pH探针用于分析各种金属离子和生物分子时的吸收和荧光信号变化情况；

图7为本发明pH探针在溶液酸碱循环变化过程中的吸收和荧光信号变化情况；

图8为肝癌细胞HepG2和正常肝细胞7701分别孵育不同浓度的pH探针24小时后的细胞生存情况。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：pH探针的合成方法及应用

pH探针的合成：

10mmol乙酰基-7-羟基-苯并吡喃-2-酮与10mmol 4-二乙氨基酮酸溶于30mL浓硫酸(质量浓度98％)并在90℃搅拌反应12小时。冷却到室温后，所得混合液加入到200g碎冰中，然后继续加入4mL 70％(w/w)的高氯酸。反应液抽滤减压得到固体混合物，以二氯甲烷和甲醇(100:1～2:1)作为洗脱剂，用柱层析分离纯化。将收集的样品旋蒸除去溶剂后减压烘干，再用甲醇重结晶后得到目标探针(高氯酸盐)。其结构可以用核磁氢谱进行表征，结果见图2。

探针的pH响应能力：

图3为pH探针在不同pH条件下的吸收光谱图，可以发现探针的吸收光谱可随着pH变化而变化。在酸性条件下，当探针中的羟基处于质子化状态时，分子内电荷转移(ICT)较弱。随着pH增高，探针中的羟基会逐渐发生去质子化，从而使得探针的分子内电荷转移(ICT)增强，吸收光谱发生红移。而在强碱性条件下，探针的羧基部位会发生类似罗丹明的螺化作用，从而使探针的最大吸收发生蓝移。这些结果说明，本发明合成的探针具有较好的pH响应能力，并且响应范围较广。

本发明重点研究了探针在pH4～7范围的信号变化情况。可以发现，随着pH升高，溶液的吸收光谱发生明显红移(图4)，并且荧光增强(图5)。并且，吸收比值与荧光峰值可以与溶液的pH值呈线性关系。

特异性实验：

用pH探针分别分析了各种金属离子(Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Ag⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺)和其他生物分子(Glu、Leu、His、Gly、Arg、AA、GSH、H₂O₂)。从图6可以发现，分析这些物质时，溶液的吸收和荧光信号都没有发生明显变化。这些结果可以看出，该探针对pH变化有特异响应能力。

稳定性与可逆性实验：

本发明继续通过pH探针在溶液酸碱循环变化过程中的吸收和荧光信号变化情况来考察其稳定性和可逆性情况。从图7可以发现，溶液中加入盐酸以降低pH值时，体系的最大吸收会发生蓝移，从而使吸收比值A₅₆₆/A₆₂₆增强。在这过程中，体系的荧光明显降低。当加入等当量的氢氧化钠中和时，溶液的吸收和荧光信号又会恢复到原来的情况。而且，探针溶液经4个循环的酸碱变化后，仍具有良好的响应效果。这些结果说明，本发明合成的pH探针具有良好的稳定性，并且其响应过程是可逆的。

细胞毒性实验：

本发明另外还考察了pH探针的细胞毒性。图8显示的是HepG2细胞和7701细胞(人正常肝细胞)孵育不同浓度的pH探针24小时后的细胞生存能力情况。可以看出，该探针对癌细胞和正常细胞都没有明显毒性。因此，该探针不仅适合进行分析检测研究，也适合应用于细胞等水平的荧光成像研究。

结论：

pH传感在实验研究、环境监测和生物医学诊断中具有重要应用价值。本发明主要提供一种可响应pH的检测探针及其合成方法。该探针可实现对pH的高灵敏、高特异性的响应，具有如下优势：1)探针结构中引入了磺酸基，水溶性良好；2)该探针的pH响应范围较广，具有吸收和荧光两种信号，应用范围更广；3)探针上具有羧基、羟基等活性基团，可进一步进行修饰，从而用于其他生物分子的检测。

Claims (6)

1.一种可响应pH的水溶性检测探针，结构如式(I)所示：

2.制备权利要求1所述水溶性检测探针的方法，所述方法包括：乙酰基-7-羟基-苯并吡喃-2-酮与等摩尔量的4-二乙氨基酮酸溶于浓硫酸并在90～100℃搅拌反应8～20小时，反应完全后冷却到室温，所得混合液加入到碎冰中，然后继续加入高氯酸，抽滤减压得到的固体混合物经分离纯化，得到所述水溶性检测探针。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述分离纯化方法为：抽滤减压得到的固体混合物以二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂，用柱层析分离纯化，将收集的样品旋蒸除去溶剂后减压烘干，再用甲醇重结晶，得到所述水溶性检测探针。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述二氯甲烷和甲醇体积比为100:1～2:1。

5.权利要求1所述的水溶性检测探针在分析检测中的应用。

6.权利要求1所述的水溶性检测探针在荧光成像中的应用。