CN107325083A - 一种用于铁离子检测的香豆素荧光基团比率荧光分子探针及其合成和使用方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于铁离子检测的含香豆素荧光基团的荧光分子探针及其合成和使用方法，它涉及荧光分子探针及其合成与应用。它要解决现有的Fe3+的荧光探针易受pH影响、其他金属离子干扰、水溶性差、检测限高、灵敏度差的问题。该荧光分子探针为4‑甲基‑7‑羟基‑8‑[3‑(1H‑咪唑)丙酸基‑2‑氨亚甲基]‑2H‑吡喃‑2‑酮。它采用4‑甲基‑7‑羟基‑8‑醛基香豆素和L‑组氨酸缩合而成，产率70～80％。将该荧光分子探针溶于二甲基亚砜与HEPES缓冲溶液的混合液中，测试样品加入前后的吸光度值或荧光强度变化来判断铁离子的存在，可用于水中Fe3+污染的检测。

Description

一种用于铁离子检测的香豆素荧光基团比率荧光分子探针及 其合成和使用方法
技术领域
本发明涉及用于铁离子检测的荧光分子探针的合成及应用。
背景技术
铁是生物体中重要的生命元素之一，广泛的存在于生物体细胞中，如肌红蛋白，血红蛋白，细胞色素等。它的存在对于人体的造血功能有着很大的关系，它在细胞中参于合成血红蛋白以及各种生物酶，促进细胞的生长和代谢。由于它较活泼的氧化还原性能以及对氧较强的亲和力，使得它在氧代谢和形成DNA及RNA的电子转移过程中起着不可替代的作用。另外它在血液中还起到运输养料和氧气的作用，人体缺铁就会引起缺铁性贫血，并可能导致新陈代谢紊乱以及免疫功能下降，从而诱发各种疾病。但是高浓度的Fe3+会引起细胞的癌变和某些器官如心脏、肝脏和胰腺等的功能紊乱，因此，铁离子的检测对生物科学和医学都有着重大意义。现有的检测铁离子的荧光探针有罗丹明衍生物荧光探针和以香豆素为荧光基团的荧光探针，其中罗丹明衍生物荧光探针化合物发表在《传感器和执行器》(Sensors and Actuators B)2014年第204卷的第617-621页的文章《水相中高选择性识别铁离子的纳米级罗丹明探针》(Rhodamine based organic nanoparticles for sensingof Fe3+with high selectivity in aqueous medium:Application to iron supplementanalysis)上，其结构式如a式所示：
咪唑衍生物荧光探针是发表在《传感器》(Sensors)2014年第14卷的1358-1371页上的文章《识别铜离子和铁离子的香豆素类荧光探针及生物成像应用》(Coumarin-BasedFluorescent Probes for Dual Recognition of Copper(II)and Iron(III)Ions andTheir Application in Bio-Imaging)上，其结构式如b式所示。
上述的两种荧光探针识别Fe3+主要采用两种信号特征，探针分子识别铁离子后波长不变，只是荧光强度表现为增强或淬灭，但是这种信号都存在容易受到pH、浓度、其他金属离子干扰的影响，导致在识别过程中容易受到干扰检测数据不准确，而且其识别铁离子的灵敏度也相对较低。
发明内容
本发明是要解决现有的识别Fe3+的荧光探针易受到pH影响、其他金属离子干扰、水溶性差、检测限不理想和灵敏度差的问题，而提供一种用于铁离子检测的香豆素荧光基团比率荧光分子探针及其合成方法。
本发明的用于铁离子检测的香豆素荧光基团比率荧光分子探针为4-甲基-7-羟基-8-[3-(1H-咪唑)丙酸基-2-氨亚甲基]-2H-吡喃-2-酮，其结构式为：
上述的用于铁离子检测的香豆素荧光基团比率荧光分子探针的制备方法是采用4-甲基-7-羟基-8-醛基香豆素和L-组氨酸缩合而成，其反应式如下：
其具体合成步骤为：
一、按4-甲基-7-羟基-8-醛基香豆素与L-组氨酸的摩尔比为1:(1～2)，将4-甲基-7-羟基-8-醛基香豆素与L-组氨酸加入到酸性溶剂中，回流反应4～6h，趁热抽滤，得到反应混合物；
二、将反应混合物加入到N,N-二甲基甲酰胺与乙醇的混合溶剂中，加热溶解，然后冷却，重结晶析出固体；将固体过滤出来，得到4-甲基-7-羟基-8-[3-(1H-咪唑)丙酸基-2-氨亚甲基]-2H-吡喃-2-酮，即为用于铁离子检测的香豆素荧光基团比率荧光分子探针。
上述的用于铁离子检测的香豆素荧光基团比率荧光分子探针的使用方法按以下步骤进行：
一、将用于铁离子检测的香豆素荧光基团比率荧光分子探针溶解于二甲基亚砜与HEPES缓冲溶液的混合液中，得到荧光分子探针溶液；其中HEPES缓冲溶液混合液的pH＝7.2，混合液中二甲基亚砜与HEPES缓冲溶液的体积比为3：(6～7)，混合液中荧光分子探针的浓度为8～10μmol/L；
二、取荧光分子探针溶液，向其中加入待测样品，混合均匀，得到样品溶液；
三、用紫外分光光度计测试荧光分子探针溶液在波长为350nm处的吸光度值A1，再测试样品溶液在波长为260nm处的吸光度值A2，如果A2≥2A1，则可判定样品中含有Fe3+；或者用荧光光谱仪测试荧光分子探针溶液在发射波长为447nm时的荧光强度B1，再测试样品溶液在发射波长为447nm时的荧光强度B2，如果B2≤10％B1，则可判定样品中含有Fe3+。
本发明的这种含有香豆素荧光基团的Fe3+的荧光探针可实现在水环境体系中对Fe3+的选择性识别功能，不受水溶液中其他金属离子的干扰，具有较强的抗干扰能力。该荧光分子探针在识别Fe3+之后在pH值为4～11范围内都显示荧光淬灭现象，该荧光分子探针识别响应非常迅速，能够在0.5分钟内完成在水体系环境中的Fe3+。
该荧光分子探针的合成所需原料简单易得，成本低；步骤简单；反应条件温和，产物分离提纯过程简单，收率高，产率高达70～80％。
本发明的荧光探针可应用在水体系中Fe3+污染的前期检测中，具有极高的应用价值。
附图说明
图1是实施例1中荧光分子探针在DMSO/HEPES缓冲溶液(v/v＝3/7，pH＝7.2)体系中的紫外光谱图，横坐标为波长，纵坐标为吸光度。
图2是实施例1中荧光分子探针在DMSO/HEPES缓冲溶液(v/v＝3/7，pH＝7.2)体系中的荧光发射光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。
图3是实施例1中荧光分子探针在DMSO/HEPES缓冲溶液(v/v＝3/7，pH＝7.2)体系中加入20μmol/L浓度的金属阳离子(Cr3+,Ag+,Co2+,Cu2+,Hg2+,K+,Ni2+,Cd2+,Pb2+,Ba2+,Mg2+,Al3+,Ca2+,Zn2+,Fe3+,Na+)后荧光发射光谱变化情况，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。
图4是实施例1中荧光分子探针在DMSO/HEPES缓冲溶液(v/v＝3/7，pH＝7.2)体系中加入400μmol/L浓度的Fe3+与400μmol/L浓度的不同共存金属离子后的荧光发射光谱变化情况，横坐标为金属离子，纵坐标为荧光强度。
图5是实施例1中荧光分子探针在DMSO/HEPES缓冲溶液(v/v＝3/7，pH＝7.2)体系中，荧光发射光谱随Fe3+浓度(0–2当量)增加的变化情况，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。
图6是实施例1中荧光分子探针的荧光强度随Fe3+的浓度变化曲线图；
图7是实施例1中荧光分子探针检测Fe3+最低检测限的测定曲线图；
图8是实施例1中荧光分子探针在DMSO/HEPES缓冲溶液(v/v＝3/7，pH＝7.2)体系中，加入20μmol/L浓度的Fe3+前后在不同pH值(pH值从4-11)条件下的荧光发射光谱变化情况，横坐标为pH，纵坐标为荧光强度。
图9是实施例1中荧光分子探针在DMSO/HEPES缓冲溶液(v/v＝3/7，pH＝7.2)体系中，加入Fe3+后荧光发射光谱随时间响应的变化情况，横坐标为测试时间，纵坐标为荧光强度。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的用于铁离子检测的香豆素荧光基团比率荧光分子探针为4-甲基-7-羟基-8-[3-(1H-咪唑)丙酸基-2-氨亚甲基]-2H-吡喃-2-酮，其结构式为：
具体实施方式二：具体实施方式一所述的用于铁离子检测的香豆素荧光基团比率荧光分子探针的制备方法如下：
一、按4-甲基-7-羟基-8-醛基香豆素与L-组氨酸的摩尔比为1:(1～2)，将4-甲基-7-羟基-8-醛基香豆素与L-组氨酸加入到酸性溶剂中，回流反应4～6h，趁热抽滤，得到反应混合物；
二、将反应混合物加入到N,N-二甲基甲酰胺与乙醇的混合溶剂中，加热溶解，然后冷却，重结晶析出固体；将固体过滤出来，得到4-甲基-7-羟基-8-[3-(1H-咪唑)丙酸基-2-氨亚甲基]-2H-吡喃-2-酮，即为用于铁离子检测的香豆素荧光基团比率荧光分子探针。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是步骤一中的酸性溶剂为冰乙酸、浓硫酸或浓盐酸；其它与具体实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是步骤三中N,N-二甲基甲酰胺和乙醇的体积比是1：(6～10)；其它与具体实施方式二或三相同。
具体实施方式五：具体实施方式一所述的用于铁离子检测的香豆素荧光基团比率荧光分子探针的使用方法按以下步骤进行：
一、将用于铁离子检测的香豆素荧光基团比率荧光分子探针溶解于二甲基亚砜与HEPES缓冲溶液的混合液中，得到荧光分子探针溶液；其中HEPES缓冲溶液混合液的pH＝7.2，混合液中二甲基亚砜与HEPES缓冲溶液的体积比为3：(6～7)，混合液中荧光分子探针的浓度为8～10μmol/L；
二、取荧光分子探针溶液，向其中加入待测样品，混合均匀，得到样品溶液；
三、用紫外分光光度计测试荧光分子探针溶液在波长为350nm处的吸光度值A1，再测试样品溶液在波长为260nm处的吸光度值A2，如果A2≥2A1，则可判定样品中含有Fe3+；或者用荧光光谱仪测试荧光分子探针溶液在发射波长为447nm时的荧光强度B1，再测试样品溶液在发射波长为447nm时的荧光强度B2，如果B2≤10％B1，则可判定样品中含有Fe3+。
本实施方式中HEPES缓冲溶液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液。
用以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例1：本实施例的用于铁离子检测的香豆素荧光基团比率荧光分子探针的制备方法如下：
一、将204mg(1mmol)4-甲基-7-羟基-8-醛基香豆素与155mg(1mmol)L-组氨酸加入到15mL冰乙酸中，回流反应6h，趁热抽滤，得到反应混合物；
三、将反应混合物加入到N,N-二甲基甲酰胺与乙醇的体积比为1：8的混合溶剂中，加热使固体溶解，冷却，重结晶析出固体，过滤、干燥，得到4-甲基-7-羟基-8-[3-(1H-咪唑)丙酸基-2-氨亚甲基]-2H-吡喃-2-酮，即为用于铁离子检测的香豆素荧光基团比率荧光分子探针。经计算，产率为80％。
本实施例制备的用于铁离子检测的香豆素荧光基团比率荧光分子探针的红外光谱、质谱及在氘取代的DMSO溶剂中的1H NMR谱数据如下：
1H NMR(500MHz,DMSO)δ(ppm):8.69(s,1H,CH＝N),7.61(m,2H,Ar),6.87(d,J＝10Hz,1H,Ar),6.62(d,J＝10Hz,1H,Ar),6.06(s,1H,Ar),5.34(t,J＝5Hz,1H,CH),4.75(s,1H,NH),2.35(s,3H,CH3)。MS,m/z:342.10831；Anal.Calcd.for C17H15N3O5:C,59.82；H,4.43；N,12.31.Found:C,89.95；H,4.40；N,12.27.
从以上数据可以得到本实施例制备的用于铁离子检测的香豆素荧光基团比率荧光分子探针的结构式如下：
其化学名称为：4-甲基-7-羟基-8-[3-(1H-咪唑)丙酸基-2-氨亚甲基]-2H-吡喃-2-酮。
将本实施例制备的荧光分子探针进行紫外光谱检测，方法如下：按4-甲基-7-羟基-8-[3-(1H-咪唑)丙酸基-2-氨亚甲基]-2H-吡喃-2-酮的浓度为10μmol/L，将4-甲基-7-羟基-8-[3-(1H-咪唑)丙酸基-2-氨亚甲基]-2H-吡喃-2-酮加入到DMSO/HEPES缓冲(v/v＝3/7，pH＝7.2)溶液中，30min后检测其紫外吸收光谱，得到的紫外吸收光谱图如图1所示，由图1可知，本实施例制备的荧光分子探针的紫外最大吸收波长在350nm。(注：DMSO/HEPES缓冲(v/v＝3/7，pH＝7.2)溶液是指DMSO与HEPES缓冲溶液的混合液，其中HEPES缓冲溶液pH＝7.2，混合液中DMSO与HEPES缓冲溶液的体积比为3：7)
将本实施例制备的荧光分子探针的进行荧光发射光谱测试，方法如下：按4-甲基-7-羟基-8-[3-(1H-咪唑)丙酸基-2-氨亚甲基]-2H-吡喃-2-酮的浓度为10μmol/L，将荧光分子探针加入到DMSO/HEPES缓冲(v/v＝3/7，pH＝7.2)溶液中，5min后检测其荧光发射光谱，荧光发射光谱图如图2所示。由图2可知，本实施例制备的荧光分子探针在447nm处具有发射峰，荧光强度较强。
测试本实施例制备的荧光分子探针与不同金属离子作用后的荧光发射光谱，具体方法如下：
按4-甲基-7-羟基-8-[3-(1H-咪唑)丙酸基-2-氨亚甲基]-2H-吡喃-2-酮的浓度为10μmol/L，将4-甲基-7-羟基-8-[3-(1H-咪唑)丙酸基-2-氨亚甲基]-2H-吡喃-2-酮加入到DMSO/HEPES缓冲(v/v＝3/7，pH＝7.2)溶液中，再按金属离子的浓度为20μmol/L加入一种金属离子，30min后测试溶液的荧光发射光谱，其中金属离子分别为Cr3+,Ag+,Co2+,Cu2+,Hg2+,K+,Ni2+,Cd2+,Pb2+,Ba2+,Mg2+,Al3+,Ca2+,Zn2+,Fe3+,Na+，得到的荧光发射光谱图如图3所示，由图3可知，加入不同的金属离子之后，特征发射峰没有明显的变化。当加入Fe3+时，荧光强度淬灭到原来的1/10。因此，荧光分子探针4-甲基-7-羟基-8-[3-(1H-咪唑)丙酸基-2-氨亚甲基]-2H-吡喃-2-酮对Fe3+有良好的选择性和区分能力。
将本实施例制备的荧光分子探针进行抗金属离子干扰测试，方法如下：按4-甲基-7-羟基-8-[3-(1H-咪唑)丙酸基-2-氨亚甲基]-2H-吡喃-2-酮的浓度为10μmol/L，将4-甲基-7-羟基-8-[3-(1H-咪唑)丙酸基-2-氨亚甲基]-2H-吡喃-2-酮加入到DMSO/HEPES缓冲(v/v＝3:7，pH＝7.2)溶液中，再分别加入20μmol/L的常见金属离子(Cr3+,Ag+,Co2+,Cu2+,Hg2 +,K+,Ni2+,Cd2+,Pb2+,Ba2+,Mg2+,Al3+,Ca2+,Zn2+,Fe3+,Na+)，5min后检测溶液的荧光发射光谱变化如图3所示，取荧光强度峰值进行比较(如图4所示。由图4可以看出，其他常见金属离子(Cr3+,Ag+,Co2+,Cu2+,Hg2+,K+,Ni2+,Cd2+,Pb2+,Ba2+,Mg2+,Al3+,Ca2+,Zn2+,Na+)与Fe3+的同时存在，Fe3+依然能够使荧光分子探针的荧光强度发生淬灭，淬灭强度与不存在干扰金属离子时相当，即荧光分子探针Fe3+的选择性识别不受其他金属离子的干扰。
检测本实施例制备的荧光分子探针对Fe3+选择性的灵敏度，具体方法如下：按4-甲基-7-羟基-8-[3-(1H-咪唑)丙酸基-2-氨亚甲基]-2H-吡喃-2-酮的浓度为10μmol/L，将4-甲基-7-羟基-8-[3-(1H-咪唑)丙酸基-2-氨亚甲基]-2H-吡喃-2-酮加入到DMSO/HEPES缓冲(v/v＝3:7，pH＝7.2)溶液中，加入0.01～2当量的Fe3+，测试出的荧光图谱变化情况(如图5所示)；由图5可以看出，随着Fe3+的量的不断增加，447nm处的发射峰的强度不断减小，当Fe3 +的浓度等于荧光分子探针的浓度时，荧光几乎完全淬灭。图6是荧光强度随Fe3+的浓度变化曲线图，从图6中也可以形象看出，荧光强度随Fe3+的量的增加，荧光强度不断减小，并且幅度逐渐变缓，当达到1当量时，荧光强度几乎不再变化，荧光淬灭完全，且荧光强度随Fe3+浓度变化呈很好的线性关系。
图7是本实施例的荧光分子探针检测Fe3+最低检测限的测定曲线图。横坐标为Fe3+浓度的对数值，纵坐标Y＝F0-F，其中F0为Fe3+浓度为0时的荧光强度，F为加入不同浓度Fe3+后的荧光强度，线性拟合方程为Y＝77.1435X+48.2017，R2＝0.9954，计算得出最低检测限为8.73×10-8mol/L浓度。
测试pH值对本实施例制备的荧光分子探针的影响，即检测荧光分子探针在不同pH值条件下加入Fe3+前后荧光变化情况，具体如下：按4-甲基-7-羟基-8-[3-(1H-咪唑)丙酸基-2-氨亚甲基]-2H-吡喃-2-酮的浓度为10μmol/L将4-甲基-7-羟基-8-[3-(1H-咪唑)丙酸基-2-氨亚甲基]-2H-吡喃-2-酮加入DMSO/HEPES缓冲(v/v＝3:7，pH＝7.2)溶液中，分别测定2–13之间不同pH值条件下的荧光发射光谱。同样测定加入20μmol/L的Fe3+之后不同pH值条件的的荧光发射光谱光谱，结果如图8所示。由图8可以看出，荧光分子探针在加入Fe3+后，荧光分子探针的荧光强度明显减弱，荧光淬灭明显，荧光强度几乎不随pH值变化而变化。这说明本实施例中的荧光分子探针对Fe3+识别在pH值4-11时具有稳定的荧光强度，受pH值变化较小。
测试本实施例制备的荧光分子探针对Fe3+响应时间，具体方法如下：按4-甲基-7-羟基-8-[3-(1H-咪唑)丙酸基-2-氨亚甲基]-2H-吡喃-2-酮的浓度为10μmol/L4-甲基-7-羟基-8-[3-(1H-咪唑)丙酸基-2-氨亚甲基]-2H-吡喃-2-酮加入到DMSO/HEPES缓冲(v/v＝3:7，pH＝7.2)溶液中，在体系中加入20μmol/L的Fe3+，在不同的时间条件下(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120s)测试其荧光发射光谱。取荧光发射光谱中的最大值得到探针对Fe3+的相应时间变化曲线，如图9所示。从图9中可以看到，在加入Fe3+后，40s之内荧光分子探针与Fe3+即可以完成络合，荧光发射强度完全猝灭。说明此探针对Fe3+的响应非常迅速，一分钟之内就能完成络合，在实际检测应用中有非常好的即时性优点。
实施例2：本实施例的用于铁离子检测的香豆素荧光基团比率荧光分子探针的制备方法如下：
一、按4-甲基-7-羟基-8-醛基香豆素与L-组氨酸的摩尔比为1:2，将4-甲基-7-羟基-8-醛基香豆素与L-组氨酸加入到20mL浓硫酸的乙醇溶液中，回流反应5h，趁热抽滤，得到反应混合物；其中浓硫酸的乙醇溶液是按10mL乙醇加入1mL质量百分浓度为98％的浓硫酸的比例配制而成的；
二、将反应混合物加入到N,N-二甲基甲酰胺与乙醇的体积比为1：7的混合溶剂中，加热溶解，冷却后重结晶，析出大量固体；过滤，干燥，得到4-甲基-7-羟基-8-[3-(1H-咪唑)丙酸基-2-氨亚甲基]-2H-吡喃-2-酮，即为用于铁离子检测的香豆素荧光基团荧光分子探针。经计算，产率为73％。
本实施例制备的用于铁离子检测的香豆素荧光基团比率荧光分子探针的红外光谱、质谱及在氘取代的DMSO溶剂中的1H NMR谱数据如下：
1H NMR(500MHz,DMSO)δ(ppm):8.69(s,1H,CH＝N),7.61(m,2H,Ar),6.87(d,J＝10Hz,1H,Ar),6.62(d,J＝10Hz,1H,Ar),6.06(s,1H,Ar),5.34(t,J＝5Hz,1H,CH),4.75(s,1H,NH),2.35(s,3H,CH3)。MS,m/z:342.10831；Anal.Calcd.for C17H15N3O5:C,59.82；H,4.43；N,12.31.Found:C,89.95；H,4.40；N,12.27.
从以上数据可以得到本实施例制备的用于铁离子检测的香豆素荧光基团比率荧光分子探针的结构式如下：
其化学名称为：4-甲基-7-羟基-8-[3-(1H-咪唑)丙酸基-2-氨亚甲基]-2H-吡喃-2-酮。
实施例3：本实施例的用于铁离子检测的香豆素荧光基团比率荧光分子探针的制备方法如下：
一、将385mg(1mmol)1-N-苯基-2-(2-氨基苯基)-1H-菲并[9,10-d]咪唑与1020mg(5mmol)4-甲基-7-羟基-8-醛基香豆素加入到20mL浓盐酸的乙醇溶剂中，回流反应4h，趁热抽滤，得到反应混合物；其中浓盐酸的乙醇溶剂是按10mL乙醇加入2mL质量百分浓度为36％的浓盐酸的比例配制而成的；
三、二、将反应混合物加入到N,N-二甲基甲酰胺与乙醇的体积比为1：8的混合溶剂中，加热溶解，冷却后重结晶，析出大量固体；过滤，干燥，得到4-甲基-7-羟基-8-[3-(1H-咪唑)丙酸基-2-氨亚甲基]-2H-吡喃-2-酮，即为用于铁离子检测的香豆素荧光基团荧光分子探针。经计算，产率为77％。
本实施例制备的用于铁离子检测的香豆素荧光基团比率荧光分子探针的红外光谱、质谱及在氘取代的DMSO溶剂中的1H NMR谱数据如下：
1H NMR(500MHz,DMSO)δ:8.64(s,1H,CH＝N),7.67(s,1H,Ar),7.62(d,J＝10Hz,1H,Ar),6.87(s,1H,Ar),6.58(d,J＝10Hz,1H,Ar),6.04(s,1H,Ar),4.73(t,J＝5Hz,1H,CH),3.25(q,1H,H-CH2),3.10(q,1H,H-CH2),2.34(s,3H,CH3).MS,m/z:342.10831；Anal.Calcd.for C17H15N3O5:C,59.82；H,4.43；N,12.31.Found:C,89.95；H,4.40；N,12.27.
从以上数据可以得到本实施例制备的用于铁离子检测的香豆素荧光基团比率荧光分子探针的结构式如下：
其化学名称为：4-甲基-7-羟基-8-[3-(1H-咪唑)丙酸基-2-氨亚甲基]-2H-吡喃-2-酮。

Claims (5)

1.一种用于铁离子检测的含香豆素荧光基团的荧光分子探针，其特征在于该荧光分子探针为4-甲基-7-羟基-8-[3-(1H-咪唑)丙酸基-2-氨亚甲基]-2H-吡喃-2-酮，其结构式为：
2.制备权利要求1所述的一种用于铁离子检测的香豆素荧光基团荧光分子探针的方法，其特征在于该方法如下：
一、按4-甲基-7-羟基-8-醛基香豆素与L-组氨酸的摩尔比为1:(1～2)，将4-甲基-7-羟基-8-醛基香豆素与L-组氨酸加入到酸性溶剂中，回流反应4～6h，趁热抽滤，得到反应混合物；
二、将反应混合物加入到N,N-二甲基甲酰胺与乙醇的混合溶剂中，加热溶解，然后冷却，重结晶析出固体；将固体过滤出来，得到4-甲基-7-羟基-8-[3-(1H-咪唑)丙酸基-2-氨亚甲基]-2H-吡喃-2-酮，即为用于铁离子检测的香豆素荧光基团比率荧光分子探针。
3.根据权利要求2所述的一种用于铁离子检测的香豆素荧光基团比率荧光分子探针的制备方法，其特征在于步骤一中的酸性溶剂为浓硫酸的乙醇溶液、浓盐酸的乙醇溶液或冰乙酸。
4.根据权利要求2或3所述的一种用于铁离子检测的香豆素荧光基团比率荧光分子探针的制备方法，其特征在于步骤二中N,N-二甲基甲酰胺和乙醇的体积比为1:(6～10)。
5.权利要求1所述的一种用于铁离子检测的香豆素荧光基团比率荧光分子探针的使用方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
一、将用于铁离子检测的香豆素荧光基团比率荧光分子探针溶解于二甲基亚砜与HEPES缓冲溶液的混合液中，得到荧光分子探针溶液；其中HEPES缓冲溶液混合液的pH＝7.2，混合液中二甲基亚砜与HEPES缓冲溶液的体积比为3：(6～7)，混合液中荧光分子探针的浓度为8～10μmol/L；
二、取荧光分子探针溶液，向其中加入待测样品，混合均匀，得到样品溶液；
三、用紫外分光光度计测试荧光分子探针溶液在波长为350nm处的吸光度值A1，再测试样品溶液在波长为260nm处的吸光度值A2，如果A2≥2A1，则可判定样品中含有Fe3+；或者用荧光光谱仪测试荧光分子探针溶液在发射波长为447nm时的荧光强度B1，再测试样品溶液在发射波长为447nm时的荧光强度B2，如果B2≤10％B1，则可判定样品中含有Fe3+。
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