CN101914093A - 反应性的杂环取代的7-羟基香豆素类以及它们的结合物 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了化学反应性的、水溶性的、杂环取代的7-羟基香豆素染料、它们的生物结合物和用途。衍生自反应性的杂环取代的7-羟基香豆素染料的结合物用于分析生物化合物。这些杂环取代的7-羟基香豆素染料特别用作生物聚合物检测试剂例如抗体或核酸探针的荧光标记。本发明的染料-抗体结合物特别用于使用配有紫激光作为激发光源的流式细胞计数仪对被分析物进行分析，因为它们在405nm处有强吸收且荧光量子收率高。

Description

反应性的杂环取代的7-羟基香豆素类以及它们的结合物
发明背景
发明领域
本发明涉及包括反应性染料和染料-结合物的荧光化学品；以及涉及它们的用途。
相关技术的描述
被分析物特异性荧光探测剂是分析样品中的被分析物的有用试剂。被分析物通过特异结合到探测剂上变成标记的，并且标记使得被分析物的检测变得容易。用于分析样品内被分析物的荧光探测剂的应用包括荧光免疫分析，它包括通过流动细胞计数法、荧光显微镜检查鉴别和/或分离细胞混合物中的细胞亚群，和通过荧光染色使凝胶分离的被分析物可视化。这些技术被Herzenberg等人，″CELLULAR IMMUNOLOGY″第3版，第22章；Blackwell ScientificPublications(1978)；和被Goldman，″FLUORESCENCE ANTIBODY METHODS″Academic Press，New York，(1968)；和被Taylor等人，APPLICATIONS OFFLUORESCENCE IN THE BIOMEDICAL SCIENCES，Alan Liss Inc.，(1986)所描述，它们各自在此引入作为参考。
当为上述目的使用荧光染料时，有许多需要考虑的因素影响荧光染料的选择。其中一个需要考虑的是荧光染料的吸收和发射特性，因为许多受试样品例如血液、尿液、脑脊髓液中的配体、受体和材料，将发荧光并干扰精确测定荧光标记的荧光。这一现象被称为自发荧光或背景荧光。第二个需要考虑的因素是荧光染料与配体、受体以及其它生物或非生物材料结合的能力，以及所述结合对荧光染料的影响。在许多情况下，同另一种分子的结合可能导致荧光染料的荧光特性的本质变化，并且在某些情况下，本质上破坏或减少荧光染料的量子效率。同荧光染料的结合也将有可能使被标记的分子的功能失活。第三个需要考虑的因素是荧光染料的量子效率，其优选是对检测高灵敏度的。第四个需要考虑的因素是荧光染料的光吸收能力或吸光系数，其优选尽可能大。进一步需要考虑的因素是荧光分子在十分接近时是否将彼此相互作用，从而导致自猝灭。另一个需要考虑的因素是是否存在荧光染料与其它化合物或容器壁的非特异性结合，该结合是通过它们自身进行的或同荧光染料所结合的化合物共同进行的。
上述方法的适用范围和重要性与合适荧光化合物的可得性紧密相联系。具体地，需要可以被商业上可行的活性激光源如紫激光(405nm)、氩激光(488nm)和He-Ne激光(633nm)所激活的荧光物质。有许多为氩激光(488nm激发)和He-Ne激光(633nm激发)所研发的荧光染料。例如，能很好地被488nm氩激光所激发的荧光素在绿色区域中是有用的发射极。然而，很少有可用于405nm紫激光的荧光染料。
一些香豆素染料已经在多种生物检测应用中表现出其实用性。例如参见，美国专利6,207,404，Miller等人；美国专利5,830,912，Gee等人；和美国专利4,956,480，Robinson。同其它荧光染料如荧光素类、若丹明类和青色素类相比，许多香豆素染料具有一定的优点。更小尺寸的香豆素染料减少了染料对染料标记的抗原特异性试剂的亲和性和特异性的影响。此外，更小的香豆素比荧光素类、若丹明类和青色素类具有更高标记效率。然而，已知许多香豆素染料均有一定的缺陷，例如由于它们很强的疏水性和高pKa，同蛋白质结合的羟基香豆素染料的荧光剧烈猝灭。香豆素的荧光猝灭起因于自猝灭(香豆素标记间的近距离)和/或由富含电子的氨基酸残基(如组氨酸、色氨酸和酪氨酸等)引起的猝灭。此外，香豆素类在405nm处的典型弱吸收严重限制了它们使用紫外激发激光来分析细胞的应用，例如在一些流式细胞计数法中的使用。
氯化的香豆素类已经被用于标记有机小分子(例如，Zlokarnik等人，1998，Science 279：84和美国专利5,955,604)。对于标记有机小分子，自猝灭和由底物引起的猝灭都不是严重的问题，因为在每个结合物中仅存在单个香豆素分子。相反地，对于标记抗体，因为希望把多种染料分子结合到各自抗体上去所以自猝灭和由底物引起的猝灭都是重点关注的。通常认为由于所谓“重原子作用”和增加的疏水性，香豆素类或荧光素类的氯化将导致抗体的较差标记(美国专利5,516,629，Park等人；美国专利5830912，Gee等人；美国专利6,472,205，Tsien and Zlokarnik；Haugland，Handbook of Fluorescent Probes andResearch Chemicals，Molecular Probes，第9版，7-74页，2002)。
于2008年7月29日递交的共同待决的美国专利申请系列12/220,939在此引入作为参考，其中描述了结合了多种单氯化的7-羟基香豆素染料的抗体以及它们在生物测定中的应用。这些单氯化的羟基香豆素染料在每个抗体多种染料情况下用作抗体标记时出人意料地展现出减少的自猝灭。这些染料标记的抗体典型地表现出最大接近于405nm的吸收并且在蓝色区域表现出最大发射。
发明概述
本发明提供一种水溶性、杂环取代的7-羟基香豆素染料以及水溶性、杂环取代的7-羟基香豆素染料的衍生物，包括反应性染料和染料结合物。
本发明的水溶性、杂环取代的7-羟基香豆素染料展现出新的性质组合，这使得这些荧光染料特别适于在生物测定中使用，包括用作生物聚合物的标记。我们发现7-羟基香豆素类中杂环的取代和水溶性基团的加入出人意料地产生荧光香豆素类新品种，其用于生物测定和制备在405nm有强吸收的生物结合物并且是高荧光的。此外，杂环取代的7-羟基香豆素类的卤化显著地降低香豆素染料的pKa从而使得到的香豆素结合物在生理学pH范围中具有它们的荧光极大值。这些杂环取代的7-羟基香豆素染料是强荧光的，并且本发明的杂环取代的7-羟基香豆素染料结合物的增强了的荧光强度导致更高的检测灵敏度。
本发明的杂环取代的7-羟基香豆素染料典型地展现出接近于405nm的吸收最大值，并且可以选择本发明的染料去匹配紫激光的主要发射谱线，像例如在许多流式细胞计数法中存在的那样。本发明的反应性染料和染料结合物的一个具体优点是这一种类的染料在绿色区域(约500-540nm)典型地展现出发射极大值。据我们所知，本发明提供了在绿色区域发射并且在一般的生物测定反应条件下用于标记生物分子的一类小分子荧光染料的第一次描述。
在一个方面，本发明提供了化学反应性的、水溶性的、杂环取代的7-羟基香豆素化合物用作荧光染料。本发明的反应性的、水溶性、杂环取代的7-羟基香豆素染料可以与多种有机或无机物(“底物”)反应，所述底物含有或经修饰而含有合适反应性的官能团，从而使染料与所述物质的结合。在本发明的一个方面，本发明的反应性染料被直接用于荧光染色或标记样品从而使该样品可以被检测、鉴别或定量化。
在另一个方面，本发明提供染料结合物，其含有一种或多种结合到底物上的本发明的水溶性、杂环取代的7-羟基香豆素类。在优选的实施方案中，该染料结合物被用作荧光检测试剂以检测、鉴别、定位或定量化样品中的被分析物。
在本发明的一个优选实施方案中，染料结合的底物为生物聚合物并且该生物聚合物与本发明一种或多种或水溶性、杂环取代的7-羟基香豆素类结合以获得荧光生物聚合物。本发明的荧光生物聚合物染料-结合物作为或部分作为检测试剂是有用的，包括作为被分析物特异性检测试剂。有用的生物聚合物包括，例如，氨基酸聚合物、核酸聚合物、多糖、碳水化合物和脂类。在一个优选的实施方案中，如本文广泛定义的那样，染料-生物聚合物结合物的生物聚合物组分是氨基酸聚合物。在一个优选的实施方案中，所述生物聚合物为单克隆的抗体。
在另一个方面，本发明提供了含有本发明的反应性染料或染料结合物的试剂盒。本发明的试剂盒可以含有用于实现预期应用的另外组分，例如其它试剂或缓冲液。
本发明反应性的、水溶性、杂环取代的7-羟基香豆素染料具有式1的结构：
Figure BSA00000194309800041
式1
其中
HC为杂环；
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地是H、卤素、烷基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基(alkylthiol)、芳硫基(arylthiol)、叠氮基、氨基、羟基、磺酰基、膦酰基、硼酸(boronic acid)、L-RG、WSG或其本身被卤素、氨基、羟基、磺酰基、膦酰基、羰基、硼酸、L-RG或WSG一次或多次取代的烷基或烷氧基；
RG是化学反应性基团；
L是任选的连接体；
WSG是水溶性基团；
R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少一个含有L-RG；和
R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少一个是WSG。
优选地，杂环部分HC选自下列：
优选地，反应性基团RG是丙烯酰胺、胺、羧酸、羧酸的活性酯、酰叠氮、酰基腈、醛、烷基卤、酐、芳基卤、叠氮化物、氮丙啶、硼酸酯、重氮烷、卤代乙酰胺、卤代三嗪、肼、羟胺、亚氨基酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、反应性铂络合物、磺酰卤或补骨脂素衍生物。
优选地，任选的连接体L是没有、烷基、烷氧基、硫代烷基、氨基酸、磺基氨基酸(sulfo amino acid)、多胺、聚乙二醇、芳基或杂芳基。
优选地，水溶性基团WSG是磺酸根、硫代磺酸根、膦酸根、硼酸根、铵、吡啶鎓(pyridium)、喹啉鎓(quinolium)或吖啶鎓(acridinium)基团。
在优选的实施方案中，本发明的反应性的、水溶性的、杂环取代的7-羟基香豆素染料具有式2的结构：
Figure BSA00000194309800052
式2
其中
X是O、S、NH或NR10；
Y是NH、NR11、CH或CR12；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R10、R11和R12独立地是H、卤素、烷基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、叠氮基、氨基、羟基、磺酰基、膦酰基、硼酸、L-RG、WSG或其本身任选地被卤素、氨基、羟基、磺酰基、膦酰基、羰基、硼酸、L-RG或WSG一次或多次取代的烷基或烷氧基；
RG是化学反应性基团；
L是任选的连接体；
WSG是水溶性基团；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R10、R11和R12中的至少一个含有L-RG；和
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R10、R11和R12中的至少一个是WSG。
在另一个优选的实施方案中，本发明的反应性的、水溶性的、杂环取代的7-羟基香豆素染料具有式3的结构：
式3
其中
X是O或S；
R1、R2、R3、R4、R10、R11和R12独立地是H、卤素、烷基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、叠氮基、氨基、羟基、磺酰基、膦酰基、硼酸、L-RG、WSG或其本身任选地被卤素、氨基、羟基、磺酰基、膦酰基、羰基、硼酸、L-RG或WSG一次或多次取代的烷基或烷氧基；
RG是化学反应性基团；
L是任选的连接体；
WSG是水溶性基团；
R1、R2、R3、R4、R10、R11和R12中的至少一个含有L-RG；和
R1、R2、R3、R4、R10、R11和R12中的至少一个是WSG。
在另一个优选的实施方案中，本发明的反应性的、水溶性的、杂环取代的7-羟基香豆素染料具有式4的结构：
Figure BSA00000194309800062
式4
其中
X是O或S；
R1、R2、R3、R4、R10和R11独立地是H、卤素、烷基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、叠氮基、氨基、羟基、磺酰基、膦酰基、硼酸、L-RG、WSG或其本身任选地被卤素、氨基、羟基、磺酰基、膦酰基、羰基、硼酸、L-RG或WSG一次或多次取代的烷基或烷氧基；
RG是化学反应性基团；
L是任选的连接体；
WSG是水溶性基团；
R1、R2、R3、R4、R10和R11中的至少一个含有L-RG；
R1、R2、R3、R4、R10和R11中的至少一个是WSG；和
R10和R11中的至少一个含有磺酸盐。
在另一个优选的实施方案中，本发明的反应性的、水溶性的、杂环取代的7-羟基香豆素染料具有式5的结构：
Figure BSA00000194309800071
式5
其中
X是O或S；
R1、R2、R3、R4、R10和R11独立地是氢、氯、氟、氰基或磺酸盐；
RG是化学反应性基团；
L是任选的连接体；和
其中R10和R11中的至少一个是磺酸盐。
在另一个优选的实施方案中，本发明的反应性的、水溶性的、杂环取代的7-羟基香豆素染料具有式6的结构：
Figure BSA00000194309800072
式6
其中
R1、R2、R3、R4、R10和R11独立地是氢、氯、氟、氰基或磺酸盐；
RG是化学反应性基团；
L是任选的连接体，它是没有、烷基、烷氧基、硫代烷基、氨基酸、磺基氨基酸、多胺、聚乙二醇、芳基、芳烷基或杂芳基，和
其中R10和R11中的至少一个是磺酸盐。
在另一个优选的实施方案中，本发明的反应性的、水溶性的、杂环取代的7-羟基香豆素染料具有式7的结构：
式7
其中
R3、R4、R10和R11独立地是氢、氯、氟、氰基或磺酸盐；
n为1-10的整数；和
其中R10和R11中的至少一个是磺酸盐。
在另一个优选的实施方案中，本发明的反应性的、水溶性的、杂环取代的7-羟基香豆素染料具有式8的结构：
式8
其中
R3和R4独立地是氢、氯、氟或磺酸盐；和
R10和R11中的至少一个是磺酸盐。
在下表1中给出本发明所选择的反应性染料的实施方案。表1中反应性染料的编号对应于实施例中所描述的化合物的编号。
表1
本发明的反应性染料实例
Figure BSA00000194309800091
Figure BSA00000194309800101
Figure BSA00000194309800111
Figure BSA00000194309800131
Figure BSA00000194309800141
本发明的染料结合物包括与本发明的一种或多种染料结合的底物。典型地，染料结合物通过本发明反应性染料和底物之间的反应制备，该底物含有或已经经修饰从而含有具有合适反应性的官能团，导致染料化学连接到该底物上。作为反应性染料和底物上官能团之间结合反应的结果，染料反应性基团的一个或更多原子一般被结合入使染料连接到底物上的新的键中。
一般而言，本发明的染料结合物具有式9的结构：
式9
其中
HC为杂环；
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地是H、卤素、烷基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、叠氮基、氨基、羟基、磺酰基、膦酰基、硼酸、WSG或其本身被卤素、氨基、羟基、磺酰基、膦酰基、羰基、硼酸或WSG一次或多次取代的烷基或烷氧基；
WSG是水溶性基团；
n是1-35的整数；
SUB是底物；
R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少一个通过任选的连接体L共价结合到S上；和
R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少一个是WSG。
在一个优选的实施方案中，本发明的染料结合物具有式10的结构：
式10
其中
X是O、S、NH或NR10；
Y是NH、NR11、CH或CR12；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R10、R11和R12独立地是H、卤素、烷基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、叠氮基、氨基、羟基、磺酰基、膦酰基、硼酸、WSG或其本身任选地被卤素、氨基、羟基、磺酰基、膦酰基、羰基、硼酸或WSG一次或多次取代的烷基或烷氧基；
WSG是水溶性基团；
n是1-35的整数；
SUB是底物；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R10、R11和R12中的至少一个通过任选的连接体L共价结合到S上；和
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R10、R11和R12中的至少一个是WSG。
在另一个优选的实施方案中，本发明的染料结合物具有式11的结构：
Figure BSA00000194309800161
式11
其中
X是O或S；
R1、R2、R3、R4、R10、R11和R12独立地是H、卤素、烷基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、叠氮基、氨基、羟基、磺酰基、膦酰基、硼酸、WSG或其本身任选地被卤素、氨基、羟基、磺酰基、膦酰基、羰基、硼酸或WSG一次或多次取代的烷基或烷氧基；
WSG是水溶性基团；
n是1-35的整数；
SUB是底物；
R1、R2、R3、R4、R10、R11和R12中的至少一个通过任选的连接体L共价结合到S上；和
R1、R2、R3、R4、R10、R11和R12中的至少一个是WSG。
在另一个优选的实施方案中，本发明的染料结合物具有式12的结构：
Figure BSA00000194309800171
式12
其中
X是O或S；
R1、R2、R3、R4、R10和R11独立地是H、卤素、烷基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、叠氮基、氨基、羟基、磺酰基、膦酰基、硼酸、WSG或其本身任选地被卤素、氨基、羟基、磺酰基、膦酰基、羰基、硼酸或WSG一次或多次取代的烷基或烷氧基；
WSG是水溶性基团；
n是1-35的整数；
SUB是底物；
R1、R2、R3、R4、R10和R11中的至少一个通过任选的连接体L共价结合到S上；
R1、R2、R3、R4、R10和R11中的至少一个是WSG；和
R10和R11中的至少一个含有磺酸盐。
在另一个优选的实施方案中，本发明的染料结合物具有式13的结构：
Figure BSA00000194309800172
式13
其中
X是O或S；
R1、R2、R3、R4、R10和R11独立地是氢、氯、氟、氰基或磺酸盐；
L是任选的连接体；
SUB是底物；和
其中R10和R11中的至少一个是磺酸盐。
杂环部分、连接体和水溶性基团的优选实施方案如以上对反应性染料所描述的。
附图说明
附图1表示通过4-羰基间苯二酚类与杂环乙酸酯化合物的碱催化缩合反应(方法A)或基于乙酸酐的缩合反应(方法B)合成反应性香豆素的简图。
附图2表示在pH＝9.0缓冲液中的化合物7的吸收和发射光谱。化合物7在414nm附近有它的最大吸收，这很好地与典型的流式细胞计数器的405nm紫激光激发相匹配。
附图3表示使用CD3抗体结合化合物7的染料结合物在用于标记淋巴细胞的染料与蛋白质之比范围内所获得的数据曲线。
附图4表示使用CD4抗体结合化合物7的染料结合物在用于标记淋巴细胞的染料与蛋白质之比范围内所获得的数据曲线。
附图5表示表示使用CD8抗体结合化合物7的染料结合物在用于标记淋巴细胞的染料与蛋白质之比范围内所获得的数据曲线。
附图6表示使用CD45抗体结合化合物7的染料结合物在用于标记淋巴细胞的染料与蛋白质之比范围内所获得的数据曲线。
发明详述
为了使本文所述的本发明可以被完全地理解，许多术语在下面被明确地定义。没有被明确定义的术语意味它们具有在化学和生物领域中通常的意思。本文所有在上面和下面引用的参考资料，在此引入作为参考。
术语“7-羟基香豆素”或“7-羟基香豆素衍生物”，自身或作为另一个基团的一部分在本文中使用，表示含有一个或多个下列稠环结构或其衍生物的任意化合物或取代基：
Figure BSA00000194309800181
7-羟基香豆素
可以理解的是本发明的香豆素染料可以以一个或另一个具体的电子共振结构画出。本发明每一方面均等地适用于形式上绘制为其它允许的共振结构的染料，因为在该染料上的电荷遍及染料自身离域分布。
术语“杂原子”，自身或作为另一个基团的一部分在本文中使用，表示氧原子(“O”)、硫原子(“S”)或氮原子(“N”)。公认当杂原子是氮时，它可以形成NR1R2部分，其中R1和R2彼此独立地为氢或烷基，或同它们连接的氮一起形成饱和或不饱和的5-、6-或7-元环。
术语“杂环”或“杂芳基”，自身或作为另一个基团的一部分在本文中使用，是指具有5至14个环原子并含有碳原子以及1、2、3或4个氧、氮或硫杂原子的基团。杂环基团的例子包括噻吩基、苯并[b]噻吩基、萘并[2，3-b]噻吩基、噻蒽基、呋喃基、吡喃基、异苯并呋喃基、苯丙噁唑基、色烯基、呫吨基、啡噁噻基(phnoxathiinyl)、2H-吡咯基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吲嗪基、异吲哚基、3H-吲哚基、吲哚基、吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、异喹啉基、喹啉基、酞嗪基、萘啶基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、咔唑基、菲啶基、吖啶基、萘嵌间二氮苯基、二氮杂菲基、吩嗪基、异噻唑基、吩噻嗪基、异噁唑基、呋咱基(furazanyl)、吩噁嗪基和四唑基的基团。杂环基已经在文献中被广泛地描述(参见，例如，Katritzky，Alan R.，Charles W.Rees，和Colin J.Drayton.1984.Comprehensive heterocyclicchemistry：the structure，reactions，synthesis，and uses of heterocycliccompounds.第8卷，第6部分.索引.Oxford[Oxfordshire]：PergamonPress.，在此引入作为参考)。
任意芳基和杂芳基环体系可以是未取代的或任选地和独立地被合成上易取得的和化学上稳定结合的取代基所取代，例如H、卤素、氰基、磺基、磺基的碱金属或铵盐、硝基、羧基、烷基、全氟(代)烷基、烷氧基、烷硫基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基或烷基酰胺基，其烷基部分具有18个或更少的碳。
本文中使用的术语“取代的”，是指用可选择的基团对化学结构部分或官能团上的氢进行的形式取代。在化合物、化学结构部分或官能团被描述为取代的时，可选择的基团取代基部分通常选自羟基、氧代、硝基、三氟甲基、卤素、烷氧基、烯基二氧基、氨基烷基、氨基烷氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷基羰基氨基、烷氧基羰基氨基、烷氧基羰基、羧基、羟基烷氧基、烷氧基烷氧基、单烷基氨基烷氧基、二烷基氨基烷氧基单(羧基烷基)氨基、双(羧基烷基)氨基、烷氧基羰基、炔基羰基、烷基磺酰基、烯基磺基酰基、炔基磺酰基、芳基磺酰基、烷基磺酰基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰胺基，芳基磺酰胺基，烷基磺酰胺基、羧基烷氧基、羧基烷基，羧基烷基氨基、氰基、三氟甲氧基、全氟(代)乙氧基、胍、脒基、氧胍基、烷基亚氨基、甲酰基亚氨基、酰基腈、酰叠氮、乙酰基叠氮化物、二氯三氮烯、异硫氰酸酯、磺酰卤、磺基琥珀酰亚氨基酯、异氰酸酯、酰卤、醛、卤乙酰胺、马来酰亚胺、氮丙啶基、烷硫基(二硫化物)、丙烯酰(acrylo)、卤烷基羰基、硼酸酯、酰肼、氨基脲、碳酰肼、芳烷基、杂芳烷基、环烷基烷基、环烯基烷基、环杂烷基烷基和环杂烯基烷基。
本文所用的“反应性基团”，表示为“RG”，系指化合物上能够与不同化合物上的官能团发生化学反应形成共价键的结构部分。
本文所用的在两个结构部分之间的“连接体”，表示为“L”，如果这两个结构部分可以直接彼此连接或通过该连接体作为中间物进行连接，则称为是“任选的”。使用这一文字以简化对区别仅在于存在或不存在连接体的很多备选结构的描述。在本发明中，例如香豆素染料分子可以直接结合于生物聚合物或可选择地通过连接体(L)间接结合于生物聚合物。为了更简约的表示，这两种选择在本文描述为具有任选的连接体的单一结构。具有任选的连接体(L)的结构的一个实施方案，其中连接体不存在时可以被描述为其中L是“没有”的结构。
本文所用的术语“水溶性基团”或“WSG”是指提高其所连接的化合物的水溶性的任意取代基。优选地，水溶性基团(WSG)是磺酸根、硫代磺酸根、膦酸根、硼酸根、铵、吡啶鎓、喹啉鎓、吖啶鎓或多羟基(例如糖如葡萄糖)基团。
术语“磺酸盐”，自身或作为另一个基团的部分，是指含有一个或多个具有下列结构的结构部分的任意化合物或取代基：
Figure BSA00000194309800201
其中R是氢或其他反离子，例如金属离子或铵离子。
本文所用的术语“染料结合物”是指染料和“底物”或“物质”之间的结合物。
术语“被分析物”在本文广泛用于指将被分析、检测、测量或标记的任意物质。被分析物的例子包括但不限于蛋白质、肽类、荷尔蒙、半抗原、抗原、抗体、受体、酶类、核酸、多糖、化学品、聚合物、病原体、毒素、有机药物、无机药物、细胞、组织、微生物、病毒、细菌、真菌、藻类、寄生虫、变应原、污染物质及它们的组合。按惯例，将要被测定的特定细胞类型的细胞，其细胞组分分子或细胞本身可以被描述为被分析物。
本文使用术语“被分析物-特异性试剂”或“靶点-特异性试剂”来广泛地指相对于其它可能地存在于样品中的被分析物优先结合到感兴趣的被分析物或靶点的任意试剂。靶点(被分析物)和靶点特异性(被分析物特异性)试剂是结合对的成员，该结合对的任一成员可以用作靶点特异性试剂以选择性结合于该结合对的另一个成员。靶点和靶点特异性试剂对的例子包括，但不限于，在下表2中提供的。优选的靶点特异性试剂为抗体，其包括特异性结合(与之免疫应答)抗原的抗原结合位点。
表2
代表性的特异结合对
  抗原   抗体
  生物素   抗生物素蛋白，抗生蛋白质链菌素或抗生物素抗体
  IgG(免疫球蛋白质)   蛋白质A或蛋白质G
  药物   药物受体
  毒素   毒素受体
  碳水化合物   外源凝集素或碳水化合物受体
  肽   肽受体
  核苷酸   互补核苷酸
  蛋白质   蛋白质受体
  酶底物   酶
  核酸   核酸
  荷尔蒙   荷尔蒙受体
  补骨脂素   核酸
  靶分子   RNA或DNA适体
本文所用的“检测试剂”是指用来使被分析物易于光学检测的任意化合物。检测试剂一般包括结合于荧光标记的被分析物特异性试剂，并且包括：其中底物组分(一般为生物聚合物)自身为被分析物-特异性试剂的染料-结合物，以及结合到充当荧光标记的染料结合物上的被分析物-特异性试剂。
本文所用的术语“生物聚合物”一般用于指氨基酸聚合物、核酸聚合物、碳水化合物、多糖类和脂类，其各自在此广泛定义。
本文所用的术语“氨基酸聚合物”一般用于指氨基酸的任意聚合物，包括肽类、多肽和蛋白质，包括那些已经接受过共转译或转移后修饰的蛋白质，例如糖蛋白类。氨基酸聚合物可以包括标准(即，由标准遗传密码也称为蛋白质原所编码的20种氨基酸中的一种)和非标准氨基酸，可以由例如磷酸盐、碳水化合物或C1至C25羧酸所衍生、保护或取代。术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”根据聚合物的长度在此处可无区别地交换使用，虽然氨基酸的短聚合物一般称为肽或多肽，和氨基酸的更长聚合物尤其是那些天然存在和/或具有生物学功能的称为蛋白质。
本文所用的术语“抗体”包括衍生或可衍生自抗体或抗体基因的所有产品，其用作靶点特异性结合试剂。“抗体”因此包括天然抗体、抗体片段、抗体衍生物和基因工程化的抗体、抗体片段和抗体衍生物等。
本文所用的术语“核酸聚合物”、“核酸”和“低聚核苷酸”是指聚脱氧核糖核酸类(含有2-脱氧-D-核糖)、聚核糖核苷酸类(含有D-核糖)、和为嘌呤或嘧啶碱或者经过修饰的嘌呤或嘧啶碱的N糖苷的任意其它类型的多核苷酸。在术语“核酸”和“低聚核苷酸”之间在长度上未打算进行区分，并且这些术语可以互换使用。这些术语仅仅是指分子的一级结构。因此，这些术语包括双链和单链DNA，以及双链和单链RNA。核酸聚合物旨在包括肽核酸，例如N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元(参见Nielsen等，美国专利5,539,082，在此引入作为参考)。
反应性染料
本发明的反应性的、水溶性的、杂环取代的7-羟基香豆素类具有在式1-8的任一个中所示的通式结构。具体例子在表1中表示并且在实施例中进行描述。
所述反应性的、水溶性的、杂环取代的7-羟基香豆素染料含有一个反应性基团RG，其通过任选的连接体L共价连接于染料。在某些实施方案中，连接染料至RG的共价键含有多个充当间隔物的插入原子。
本发明的反应性的、水溶性的、杂环取代的7-羟基香豆素类染料可以与各种含有或经修饰含有具有适合反应性的官能团的有机或无机物质反应，导致染料化学连接于该物质。一般地，反应性染料和物质上官能团之间的结合反应导致反应性基团RG上的一个或更多原子被包括到将染料连接至该物质的新键中。
一般地，反应性基团是亲电基团或亲核基团，它可以通过暴露于分别为亲核基团或亲电基团的相应的官能团而形成共价键。所选择的亲电基团和亲核基团反应对、以及由它们反应产生的共价键的例子，表示在下表3中。
表3
反应性的亲电基团和亲核基团，以及产生的结合物
  亲电基团   亲核基团   产生的结合物
  活性酯类*   胺类/苯胺类   羧酰胺类
  丙烯酰胺类   硫醇类   硫醚类
  酰叠氮类**   胺类/苯胺类   羧酰胺类
  酰卤类   胺类/苯胺类   羧酰胺类
  酰卤类   醇类/酚类   酯类
  酰腈类   醇类/酚类   酯类
  酰腈类   胺类/苯胺类   羧酰胺类
  醛类   胺类/苯胺类   亚胺类
  醛类或酮类   肼类   腙类
  醛类或酮类   羟胺类   肟类
  烷基卤类   胺类/苯胺类   烷基胺类
  烷基卤类   羧酸类   酯类
  烷基卤类   硫醇类   硫醚类
  烷基卤类   醇类/酚类   醚类
  磺酸烷基酯类   硫醇类   硫醚类
  磺酸烷基酯类   羧酸类   酯类
  磺酸烷基酯类   醇类/酚类   酯类
  酐类   醇类/酚类   酯类
  酐类   胺类/苯胺类   羧酰胺类
  芳基卤类   硫醇类   苯硫酚类
  芳基卤类   胺类   芳胺类
  氮丙啶类   硫醇类   硫醚类
  硼酸酯类   二醇类   硼酸酯类
  碳化二亚胺类   羧酸类   N-酰基脲或酐类
  重氮烷类   羧酸类   酯类
  环氧化物   硫醇类   硫醚类
  卤乙酰胺类   硫醇类   硫醚类
  卤铂酸盐类   氨基   铂络合物
  卤铂酸盐类   杂环   铂络合物
  卤铂酸盐类   硫醇   铂络合物
  卤三嗪类   胺类/苯胺类   氨基三嗪类
  卤三嗪类   醇类/酚类   三嗪醚类
  亚氨基酯类   胺类/苯胺类   脒类
  异氰酸酯类   胺类/苯胺类   脲类
  异氰酸酯类   醇类/酚类   氨基甲酸酯类
  异硫氰酸酯类   胺类/苯胺类   硫脲类
  马来酰亚胺类   硫醇类   硫醚类
  亚磷酰胺类   醇类   亚磷酸酯类
  甲硅烷基卤   醇类   甲硅烷基醚类
  磺酸酯类   胺类/苯胺类   烷基胺类
  磺酸酯类   硫醇类   硫醚类
  磺酸酯类   羧酸类   酯类
  磺酸酯类   醇类   醚类
  磺酰基卤   胺类/苯胺类   磺酰胺类
  磺酰基卤   酚类/醇类   磺酸酯类
*活性酯类，如在现有技术中理解的那样，通常具有式-COW，其中W为好的离去基团(例如琥珀酰亚胺氧基(succinimidyloxy)(-OC4H4O2)磺基琥珀酰亚胺氧基(-OC4H3O2-SO3H)，-1-氧苯并三唑基(-OC6H4N3)；或用于形成活性芳基酯的芳氧基或被吸电子取代基如硝基、氟、氯、氰基或三氟甲基或其组合一次或多次取代的芳氧基；或被碳化二亚胺活化以形成酸酐或混合酸酐-OCOAlk或-OCN(Alk1)NH(Alk2)的羧酸，其中Alk1和Alk2可以相同或不同的且为C1-C20烷基、C1-C20全氟(代)烷基或C1-C20烷氧基；或环己基，3-二甲基氨基丙基或N-吗啉代乙基)。
**酰叠氮也可以重排为异氰酸酯类。
用于使染料连接到被结合的物质上的反应性基团的选择一般取决于被结合的物质上的官能团以及所希望的共价键的类型和长度。在有机或无机物质中一般存在的官能团类型包括，但不限于，胺类、酰胺类、硫醇、醇类、酚类、醛类、酮类、磷酸盐类、咪唑类、肼类、羟胺类、二取代的胺类、卤化物、环氧化物、羧化物酯类、磺酸酯类、嘌呤类、嘧啶类、羧酸、烯键或这些基团的组合。单个反应点类型在该物质上是可得的(一般对于多糖来说)，或可以产生多种位点(例如胺类，硫醇类、醇类、酚类)，这对于蛋白质来说是典型的。结合的物质可以结合于不止一种染料，染料可以是相同或不同的，或者结合于额外地被半抗原修饰的物质，例如生物素。
虽然一些选择性可以通过反应条件的小心控制获得，但是标记的选择性最好通过适当的反应性染料的选择而获得。
一般地，反应性基团RG将与胺、硫醇类、醇、醛或酮反应。优选地，RG与胺或巯基官能团反应。在一个实施方案中，RG为丙烯酰胺、反应性胺(包括尸胺或乙二胺)、羧酸的活性酯(一般为羧酸的琥珀酰亚胺基酯)、酰叠氮、酰基腈、醛、烷基卤、酐、苯胺、芳基卤、叠氮化物、氮丙啶、硼酸酯、羧酸、重氮烷、卤代乙酰胺、卤代三嗪、肼(包括酰肼)、亚氨基酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、亚磷酰胺、反应性铂络合物、磺酰基卤或巯基基团。“反应性铂络合物”尤其是指例如在美国专利5,580,990、5,714,327、5,985,566中所描述的化学反应性铂络合物，在此引入作为参考。
当RG为羧酸的活性酯时，反应性染料具体地用于制备蛋白质、核苷酸类、低聚核苷酸类或半抗原的染料结合物。当RG为马来酰亚胺或卤代乙酰胺时，反应性染料具体地用于结合含有巯基的物质。当RG为酰肼时，反应性染料具体地用于结合高碘酸盐氧化的碳水化合物和糖蛋白类，而且此外是用于细胞显微注射的醛可固定的极性示踪剂。优选地，RG为羧酸、羧酸的琥珀酰亚胺基酯、卤代乙酰胺、肼、异硫氰酸酯、马来酰亚胺基团、脂肪族胺、全氟(代)苯甲酰氨基、叠氮基全氟(代)苯甲酰氨基或补骨脂素。更优选地，RG为羧酸的琥珀酰亚胺基酯、马来酰亚胺、碘乙酰胺或反应性的铂络合物。
可选择地，反应性基团RG为可光活化的基团，例如叠氮化物、双吖丙啶基(diazirinyl)、叠氮芳基或补骨脂素衍生物，在这一例子中染料只有在用适当波长的光照射后才能变成化学反应性的。
反应性染料的合成
本发明的水溶性的、杂环取代的7-羟基香豆素类是通过4-羰基间苯二酚类与杂环乙酸的基于乙酸酐的缩合或4-羰基间苯二酚类与活性亚甲基化合物的碱催化缩合而制备的。这些基本结构在合成期间或之后，被任选地进一步取代，以给出相应的如上所定义的香豆素染料取代基。公认的是其中有许多可以产生同等结果的可能变化。本发明的反应性香豆素染料的典型合成在图1中被图解说明。文献中其它已知的香豆素合成方法可以通过本领域技术人员公知的某些修改而适用于制备本发明的化学反应性的香豆素类(参见，例如，Bentsen等，美国专利6,566,508；Dittmer等，2005，J.Org.Chem.70：4682；Shi等，2005，分析化学33：1452；Sivakumar等，2004，Org.Lett 6：4603；Zhao等，2004，J.Am.Chem.Soc.126：4653；Huang等，1994，J.Chem.Soc.PerkinTrans.1：102；以及Kuznetsova和Kaliya，1992，Russ.Chem.Rev.61：1243；它们各自在此引入作为参考)。
合成含有反应性基团的染料的方法在现有技术中已经有很多文献了。一般通过将羟酸与相对酸性的“离去基团”相结合而合成胺-反应性染料，例如羧酸的“活性酯”。其它优选的胺-反应性基团包括磺酰基卤，其使用卤化剂如PCl5或POCl3从磺酸来制备；卤三嗪类，其通过氰尿酰卤(cyanuric halide)与胺类的反应而制备；以及异氰酸酯类或异硫氰酸酯类，其分别通过胺类和光气或硫光气而制备。
具体地用于结合于羧酸、醛类和酮类的含有胺类和酰肼类的染料，最经常通过羧酸的活性酯或磺酰基卤与二胺如尸胺，或与肼反应来合成。可选择地，芳族胺类通常通过硝基芳族化合物的化学还原而合成。胺类和肼类是通过标准方法合成硫醇类-反应性卤乙酰胺或马来酰亚胺的特别有用的前体。
染料结合物
本发明的反应性的、水溶性的、杂环取代的7-羟基香豆素染料可以与各种含有或经修饰含有具有适合反应性的官能团的有机或无机物质(本文称为“底物”)反应，导致染料与该物质相结合。有用的染料结合物除此之外还包括底物为氨基酸、核苷酸、生物聚合物(例如氨基酸聚合物，核酸聚合物，多糖，碳水化合物或脂类)、抗原、类固醇、维生素、药物、半抗原、代谢物、毒素、环境污染物质、离子络合结构部分或玻璃、塑料或者其它非生物聚合物的结合物。在一些实施方案中，底物为细胞、细胞系统、细胞碎片或组分或亚细胞颗粒(例如，病毒颗粒，细菌颗粒或其组分)。反应性染料一般地标记细胞表面上、细胞膜、细胞器或细胞质中的官能团。
在生物测定中所使用的底物一般地为氨基酸、核苷酸或生物聚合物，例如氨基酸聚合物、核酸聚合物、碳水化合物或多糖。染料-聚合物结合物可以被制备得引入多种结合到底物的染料分子以增加来自染料结合物的荧光信号。
在一个实施方案中，底物是氨基酸或氨基酸聚合物，例如肽或蛋白质。本发明可用的氨基酸聚合物的例子包括，但不限于，抗体(如上广泛定义)、IgG结合蛋白质(例如蛋白质A、蛋白质G、蛋白质A/G等等)、酶类、外源凝集素类、糖蛋白类、组蛋白质类、白蛋白质类、脂蛋白质类、抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、蛋白质A、蛋白质G、藻胆蛋白质以及其它荧光蛋白质、荷尔蒙类、毒素、趋化激素、生长因子、神经肽类、细胞因子类、毒素、蛋白质酶底物以及蛋白质激酶底物。在一个优选的实施方案中，生物聚合物底物为单克隆抗体。
在另一个实施方案中，底物为核酸碱、核苷、核苷酸或核酸聚合物。核酸聚合物包括经修饰含有用于与本发明的染料结合的额外的连接体或间隔物的那些，例如炔基连接体(美国专利5,047,519)、氨基烯丙基连接体(美国专利4,711,955)、杂原子取代的连接体(美国专利5,684,142)或其它连接体。在另一个实施方案中，结合的物质为核苷或核苷酸类物，其通过非环形间隔物连接嘌呤或嘧啶碱至磷酸酯或聚磷酸酯结构部分。在另一个实施方案中，染料一般地通过羟基但是选择性地通过巯基或氨基结合于核苷酸或核苷的碳水化合物部分(例如，如美国专利5,659,025；5,668,268；5,679,785中所描述)。一般地，结合的核苷酸为三磷酸核苷或脱氧三磷酸核苷或双脱氧三磷酸核苷。向磷酸酯或聚磷酸酯结构部分中引入亚甲基结构部分或氮或硫杂原子也是有用的。非嘌呤和非嘧啶碱诸如7-去氮杂嘌呤(美国专利6,150,510)和含有这种碱的核酸也可以与本发明染料连接。通过脱嘌呤核酸与胺、酰肼或羟胺衍生物反应而制备的核酸加合物提供了额外的标记和检测核酸的方法，例如“A methodfor detecting abasic sites in living cells：age-dependent changes in baseexcision repair”Atamna等，2000，Proc Natl Acad Sci 97：686-691。
优选的核酸聚合物结合物是标记的，单链或多链的、天然或合成的DNA或RNA、DNA或RNA低聚核苷酸类、或DNA/RNA混合物，或引入罕见的连接体如吗啉衍生的磷酸酯类，或肽核酸类如N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元。当核酸为合成的低聚核苷酸时，其一般地含有少于50个核苷酸，更为一般地少于25个核苷酸。肽核酸类(PNA)结合物(Nielsen等，美国专利5,539,082)由于它们通常更快的杂交速率对于一些应用可以是优选的。
在另一个实施方案中，底物为碳水化合物，其一般地为多糖如葡聚糖、肝素、糖原质、支链淀粉、甘露聚糖、菊糖、淀粉、琼脂糖和纤维素。可选择地，碳水化合物为多糖，其为脂多糖。优选的多糖结合物为葡聚糖或脂多醣结合物。
在另一个实施方案中，底物为脂质(一般地具有6-60个碳)，包括糖脂类、磷脂类、鞘脂类和类固醇。可选择地，结合的底物是脂质集合体，如脂质体。可以使用亲脂性的结构部分以在细胞中保留结合的物质，如在美国专利5,208,148中描述的那样。本发明的某些极性染料也可以被捕捉于脂质集合体中。
底物为离子络合结构部分的结合物用作钙、钠、镁、锌、钾或其它生物学上重要的金属离子的指示剂。优选的离子络合结构部分为冠醚(美国专利5,405,975)；1，2-双-(2-氨基苯氧基乙烷)-N，N，N′，N′-四乙酸的衍生物(BAPTA螯合剂；美国专利5,453,517、5,516,911和5,049,673)；2-羧基甲氧基苯胺-N，N-二-乙酸的衍生物(APTRA螯合剂；Am.J.Physiol.256，C540(1989))；或基于吡啶和二氮杂菲的金属离子螯合剂(美国专利5,648,270)；或次氨基三乙酸的衍生物，参见例如“Single-step synthesis and characterization ofbiotinylated nitrilotriacetic acid，a unique reagent for the detectionof histidine-tagged proteins immobilized on nitrocellulose”，McMahan等，1996，Anal Biochem 236：101-106。优选地，离子络合结构部分为冠醚螯合剂、BAPTA螯合剂、APTRA螯合剂或次氨基三乙酸的衍生物。
其它非生物材料的结合物包括以下物质的染料结合物：有机或无机聚合物、聚合薄膜、聚合晶片(polymeric wafers)、高分子膜、聚合颗粒或聚合微粒；包括磁性或非磁性微球；铁、金或银颗粒；传导和非传导金属以及非金属；以及玻璃和塑料表面及颗粒。通过制备聚合物时含有合适官能团的染料的共聚作用，或通过含有具有合适化学反应性的官能团的聚合物的化学修饰，来任选地制备结合物。用于制备聚合物的染料结合物的其它类型的反应包括催化聚合作用或烯烃的共聚作用以及二烯与二烯亲合物的反应、酯交换作用或转氨基作用。
在一些实施方案中，染料结合物进一步被至少一种第二发光染料(其任选地为本发明的额外染料)所标记，以形成能量传递对。在本发明的某些方面，被标记的结合物起到酶底物的作用，并且酶水解作用使能量传递中断。
荧光染料-结合物，尤其其中底物是生物聚合物时，每一个底物分子可以引入多个染料以增大荧光信号。优选地，至少3个染料分子被引入染料生物-聚合物结合物中。在生物聚合物为抗体的实施方案中，至少三个或更优选至少6个染料分子被结合到抗体。在一些实施方案中，多达约35个染料分子可以结合到抗体而不会有显著的自猝灭，但是更通常是多达约15-20个。本领域技术人员可以理解的是，每个结合物底物的染料各自所述的范围旨在描述为在这一范围中的所有值。因此，例如，通过说明本发明的荧光生物聚合物含有6-15个染料分子，含有6、7、8、...、或15个染料分子的生物聚合物也是本发明的一部分。
染料-结合物的制备
本发明的荧光染料-结合物一般地作为底物和反应性的、水溶性的、杂环取代的7-羟基香豆素染料之间的反应产物而被合成。使用反应性染料制备染料结合物有很多文献记载，例如Hermanson，1996，Biocojugate Techniques(Academic Press，New York，NY)；Haugland，1995，Methods Mol.Biol.45：205-21；以及Brinkley 1992，Bioconjugate Chemistry 3：2，各自在此引入作为参考。结合物一般由将合适的反应性染料与待结合的物质在二者都在其中可溶的合适的溶剂中混合而得到。本文描述的反应性的、水溶性的、杂环取代的7-羟基香豆素染料类的水溶液容易制造，使与大部分生物材料的结合反应变得容易。对于这些光活化的反应性染料，结合作用需要照射反应混合物以活化反应性染料。
本发明的荧光生物聚合物一般作为生物聚合物和反应性的、水溶性的、杂环取代的7-羟基香豆素染料之间的反应产物而被合成，其中反应条件导致多种染料分子结合于每个生物聚合物。可选择地，荧光生物聚合物可以通过亚单位分子的聚合反应而被合成，其中一种或多种亚单位分子已经先于生物聚合物的聚合作用被结合至反应性的、水溶性的、杂环取代的7-羟基香豆素中。后面一种方法的例子为使用标准的亚磷酰胺化学作用合成低聚核苷酸，其中至少一种亚磷酰胺是染料标记的。
应用以及使用方法
在发明的一个方面，本发明的反应性染料被用于直接染色或标记样品或样品的组分，以便可以鉴定或定量化该样品。如上所述，化学反应性染料化合物将共价结合于在各种各样材料上的相应的官能团，形成染料结合物。
在优选的实施方式中，本发明的反应性染料化合物被用于直接染色或标记有生物组分的样品。样品可以包括非均匀的组分混合物(包括完整的细胞、细胞提取物、细菌、病毒、细胞器及它们的混合物)、或单一的组分或均匀的组分组(例如天然或合成的氨基酸、核酸或碳水化合物聚合物或类脂膜络合物)。这些染料在一般使用的浓度内通常对活细胞以及其它生物组分是没有毒性的。
为了直接染色，染料化合物与样品以有利于染料化合物与感兴趣的样品组分之间的接触的任意方式混合。一般地，染料化合物或含有染料化合物的溶液被简单地加入至样品。本发明的某些染料，尤其是被一个或多个磺酸结构部分取代的那些，往往对生物细胞膜是非渗透的，且一旦处于活细胞内部就一般被很好地保留。使质膜可渗透化的处理，例如电穿孔、振动处理或者高细胞外ATP可以用于将所选择的染料化合物导入到细胞中。可选择地，所选的染料化合物可以物理上插入细胞中，例如通过压力显微注射、刮除负载、修补钳方法或吞噬作用。
引入脂族胺或肼残基的染料可以被显微注射入细胞中，其中它们可以通过醛固定剂例如甲醛或戊二醛固定于某位置。这一固定能力使得所述染料对于细胞内应用例如神经元追踪是有用的。
具有亲脂性取代基例如磷脂的染料化合物将非共价结合入脂质集合体中，例如用作膜结构的探针；或用于在脂质体、脂蛋白质、薄膜、塑料、亲脂性微球体或类似材料中的引入；或用于追踪。亲脂性染料作为膜结构的荧光探针是有用的。
为了在生物应用中直接对被分析物进行染色，本发明染料化合物一般在根据本领域公知的方法制备的含水的、大部分含水的或可与水混溶的溶液中使用。染料化合物的准确浓度取决于试验条件以及所希望的结果，但是一般地是从约1纳摩尔至1毫摩尔或更多的范围。通过系统性变化直至实现有最小背景荧光的满意结果而测定最佳浓度。
在本发明的另一方面，本发明的荧光染料-结合物作为检测试剂或作为检测试剂的一部分用以促进被分析物的光学检测和分析，所述检测试剂一般地为被分析物-特异性检测试剂。在一个实施方案中，染料-结合物底物自身是被分析物-特异性试剂，并且荧光染料结合物被用作检测试剂以标记感兴趣的被分析物。在一个可选择的实施方案中，荧光染料-结合物被结合于被分析物-特异性试剂，并且该组合的实体被用作检测试剂以标记感兴趣的被分析物。在这一可选择的实施方案中，染料结合物作为结合于被分析物-特异性试剂的荧光标记。
其中使用被分析物特异性检测试剂标记一种或多种感兴趣的被分析物并且随后进行光学分析的分析方法是本领域公知的，并且当前的荧光染料-结合物在所述测定中通常用作检测试剂。例如，样品中的蛋白质可以使用由可以特异性结合于被分析物蛋白质的标记蛋白质(一般为抗体)组成的检测试剂来标记。所得的被标记的被分析物蛋白质的检测可以使用许多公知的分析格式和仪器来实现，包括使用流动细胞计数法、扫描细胞计数法、图像和凝胶分析。流动细胞计数法在这一领域的大量文献中被详尽地描述，包括例如，Landy等(eds.)，Clinical Flow Cytometry，Annals of the New York Academy of Sciences 677卷(1993)；Bauer等(eds)，Clinical Flow Cytometry：Principles andApplications，Williams & Wilkins(1993)；Ormerod(ed.)，Flow Cytometry：A Practical Approach，Oxford Univ.Press(1997)；Jaroszeski等(eds.)，Flow Cytometry Protocols，Methods in Molecular Biology第91期，HumanaPress(1997)；以及Practical Shapiro，FlowCytometry，第4版，Wiley-Liss(2003)；所有在此引入作为参考。荧光显微成像公开在，例如，Pawley(ed)，Handbook of Biological Confocal Microscopy，第2版，Plenum Press(1989)中，其在此引入作为参考。
用于激发本发明的荧光聚合物的照明光源包括，但不限于，手提式紫外灯、汞弧光灯、氙气灯、激光和激光二极管。这些照明光源任选地整合入激光扫描仪、荧光微板读数仪、标准或小型荧光计或者色谱检测器中。本发明优选的荧光聚合物在或接近于405nm处是可激发的，并且可以使用相对廉价的紫激光激发源来激发。
试剂盒
本发明的一个方面为使得使用如上所述的本发明的任一种染料的各种分析实践容易进行的试剂盒形式。本发明的试剂盒一般包括本发明的有色的或荧光染料，其或者以用于制备染料-结合物的化学反应性标记物的形式存在，或者以染料结合物的形式存在，其中结合的物质为特异性结合对成员或者核苷、核苷酸、低聚核苷酸、核酸聚合物、肽或者蛋白质。该试剂盒任选地进一步包括一种或多种缓冲试剂，其一般地以水溶液存在。本发明的试剂盒任选地进一步包括额外的检测试剂、用于纯化所得标记的物质的纯化介质、标准光源(luminescence standards)、酶、酶抑制剂、有机溶剂或者用于进行本发明分析的说明书。
实施例
下列实施例中提供所选染料的合成策略、所选荧光生物聚合物的合成、它们的特征描述以及使用方法的例子。进一步的修改以及变化对本领域技术人员来说是显而易见的。给出下列实施例以举例说明本发明的实践，并且不打算限制或限定本发明的整个范围。
实施例1
化合物1的制备
化合物1
将4-氯间苯二酚(50g)溶于无水乙醚中(200ml)。在搅拌下往溶液中加入精细粉末化的氰化锌(60g)以及氯化钾(12g)。该悬浮液被冷却至0℃。一股强烈的氯化氢气体流在剧烈搅拌下被吹入溶液中。在大约30-60分钟后反应物得到溶解。氯化氢气体的加入持续到它在乙醚溶液中的吸收停止为止。悬浮液在冰上继续搅拌一个小时。该乙醚溶液从被冰处理过的固体中倾倒而出并且水浴加热至100℃。冷却后，产品以有光泽的片的形式从溶液中结晶出来，通过过滤移出产品并且风干以给出所希望的醛。
实施例2
化合物2的制备
Figure BSA00000194309800331
化合物2
2-噻吩乙酸乙酯(10g)与6-溴己酸乙酯(12g)溶解于二氯甲烷(200ml)中。在干燥氮气保护下伴随着剧烈搅拌于0℃下往溶液中加入无水AlCl3(24g)。在干燥氮气保护下于0℃下搅拌反应混合物，并且当通过TLC表明反应已经完成时加热至室温。反应混合物被倒入冰水中，并且用氯仿(3×200ml)进行萃取。合并氯仿层，用无水Na2SO4干燥，并且在真空下除去溶剂以给出粗固体。粗固体进一步用一定梯度的氯仿/乙酸乙酯作为洗脱液在硅胶柱上纯化以生成所希望的化合物2。
实施例3
化合物3的制备
化合物3
化合物2(10g)溶于乙醇中(100ml)。往溶液中加入5M NaOH(65ml)。在室温下搅拌反应混合物，并且当通过TLC表明反应已经完成时用浓HCl中和。所得到的反应混合物用乙酸乙酯(3×200ml)进行萃取。合并乙酸乙酯层，用无水Na2SO4干燥，并且在真空下除去溶剂以给出所希望的化合物3。
实施例4
化合物4的制备
化合物4
将化合物1(6g)和化合物3(5.8g)悬浮于乙酸酐(100ml)中。在室温下往悬浮液中加入三乙胺(6ml)。于120-140℃下加热反应混合物直至通过TLC表明反应已经完成。冷却至室温后，将混合物倾倒入冰水中，并且抽滤生成的沉淀物从而收集固体，风干该固体。重结晶粗产物以获得所希望的化合物4。
实施例5
化合物5的制备
Figure BSA00000194309800341
化合物5
将化合物4(5g)悬浮于20％HCl(300ml)中。于60-70℃下加热反应混合物直至通过TLC表明反应已经完全。用水(200ml)对反应混合物进行稀释，并且用乙酸乙酯(3×300ml)进行萃取。合并乙酸乙酯层，用无水Na2SO4干燥，并且在真空下除去溶剂以给出粗化合物5。粗物质进一步用一定梯度的氯仿/甲醇作为洗脱液在硅胶柱上纯化以生成所希望的化合物5。
实施例6
化合物6的制备
Figure BSA00000194309800342
化合物6
将化合物5(1g)悬浮于浓H2SO4(5ml)中。往悬浮液中加入20％发烟H2SO4(5ml)。反应混合物于0℃下搅拌直至通过TLC表明反应已经完成。往冷乙醚(200ml)中滴加反应混合物并伴随着剧烈搅拌以获得作为黄色沉淀物的粗化合物6。粗物质进一步通过制备HPLC使用在水中的0.1％TFA-在MeCN缓冲系统中的0.1％TFA进行纯化以产生所希望的化合物6。
实施例7
化合物7的制备
Figure BSA00000194309800351
化合物7
化合物6(100mg)和N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(85mg)溶于DMF(5ml)中。在干燥氮气保护下伴随着剧烈搅拌于室温下往溶液中加入4-二甲基氨基吡啶(5mg)以及无水三乙胺(0.1ml)。在干燥氮气保护下在室温下搅拌反应混合物直至通过TLC表明反应已经完成。反应混合物被倒入乙醚中，并且通过过滤收集所得沉淀物。该固体用乙醚洗涤以生成所希望的化合物7。
实施例8
化合物8的制备
Figure BSA00000194309800352
化合物8
往在DMF(0.5ml)中的无水肼(100μl)中加入在DMF(0.5ml)中的化合物7(100mg)。混合物于环境温度下搅拌15分钟。将反应溶液倾倒入水中，并且离心分离所得沉淀物以收集固体，该固体用水洗涤并且风干。粗产物进一步用HPLC纯化。
实施例9
化合物9的制备
化合物9
在室温下向在DMF(0.2ml)中的化合物7(10mg)中加入4当量的三乙胺和1.2当量的N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺、三氟乙酸盐(Sigma-Aldrich)。混合物于环境温度下搅拌60分钟。将DMF溶液倾倒入水中，并且离心分离所得悬浮物以收集固体，该固体被风干。粗产物进一步用硅胶色谱纯化以产生所希望的化合物9。
实施例10
化合物10的制备
Figure BSA00000194309800361
化合物10
化合物10从4-氯-2-氟间苯二酚(Fanbo Biochemicals公司，中国，北京)制备得到，类似于制备化合物1的步骤。
实施例11
化合物11的制备
Figure BSA00000194309800362
化合物11
化合物11从化合物10与化合物3的缩合制备得到，类似于制备化合物4的步骤。
实施例12
化合物12的制备
Figure BSA00000194309800363
化合物12
化合物12从用20％HCl进行的化合物11的酸性水解来制备，类似于制备化合物5的步骤。
实施例13
化合物13的制备
Figure BSA00000194309800371
化合物13
化合物13从化合物12的磺化作用制备得到，类似于制备化合物6的步骤。
实施例14
化合物14的制备
Figure BSA00000194309800372
化合物14
化合物14从化合物13与N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯的缩合制备得到，类似于制备化合物7的步骤。
实施例15
化合物15的制备
化合物15
化合物15从2，4-二氯间苯二酚(Fanbo Biochemicals公司)制备得到，类似于制备化合物1的步骤。
实施例16
化合物16的制备
Figure BSA00000194309800374
化合物16
化合物16从化合物15与化合物3的缩合制备得到，类似于制备化合物4的步骤。
实施例17
化合物17的制备
Figure BSA00000194309800381
化合物17
化合物17从用20％HCl进行的化合物16的酸性水解来制备，类似于制备化合物5的步骤。
实施例18
化合物18的制备
Figure BSA00000194309800382
化合物18
化合物18从化合物17的磺化作用制备得到，类似于制备化合物6的步骤。
实施例19
化合物19的制备
Figure BSA00000194309800383
化合物19
化合物19从化合物18与N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯的缩合制备得到，类似于制备化合物7的步骤。
实施例20
化合物20的制备
Figure BSA00000194309800391
化合物20
将2-噻吩乙酸乙酯(5g)与4-溴甲基苯甲酸甲酯(6.2g)溶解于二氯甲烷(200ml)中。在干燥氮气保护下伴随着剧烈搅拌于0℃下往溶液中加入无水AlCl3(12g)。在干燥氮气保护下于0℃下搅拌反应混合物，并且当通过TLC表明反应已经完成时加热至室温。反应混合物被倒入冰水中，并且用氯仿(3×200ml)进行萃取。合并氯仿层，用无水Na2SO4干燥，并且在真空下除去溶剂以给出粗固体。粗固体进一步用一定梯度的氯仿/乙酸乙酯作为洗脱液在硅胶柱上纯化以生成所希望的化合物20。
实施例21
化合物21的制备
Figure BSA00000194309800392
化合物21
将化合物20(5g)溶于乙醇(50ml)中。往溶液中加入5M NaOH(65ml)。在室温下搅拌反应混合物，并且当通过TLC表明反应已经完成时用浓HCl中和。反应混合物用乙酸乙酯(3×200ml)进行萃取。合并乙酸乙酯层，用无水Na2SO4干燥，并且在真空下除去溶剂以给出所希望的化合物21。
实施例22
化合物22的制备
Figure BSA00000194309800401
化合物22
化合物22从化合物21与化合物1的缩合制备得到，类似于制备化合物4的步骤。
实施例23
化合物23的制备
Figure BSA00000194309800402
化合物23
化合物23从用20％HCl进行的化合物22的酸性水解来制备，类似于制备化合物5的步骤。
实施例24
化合物24的制备
Figure BSA00000194309800403
化合物24
化合物24从化合物23的磺化作用制备得到，类似于制备化合物6的步骤。
实施例25
化合物25的制备
Figure BSA00000194309800411
化合物25
化合物25从化合物24与N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯的缩合制备得到，类似于制备化合物7的步骤。
实施例26
化合物26的制备
Figure BSA00000194309800412
化合物26
将化合物1(1g)和2，5-二羧甲基噻吩(6g，Sigma-Aldrich)悬浮于乙酸酐(100ml)中。在室温下往悬浮液中加入三乙胺(6ml)。于120-140℃下加热所得到的反应混合物直至通过TLC表明反应已经完成。冷却至室温后，将混合物倾倒入冰水中，并且抽滤得到的沉淀物从而收集固体，风干该固体。粗固体进一步用一定梯度的氯仿/甲醇作为洗脱液在硅胶柱上纯化以生成所希望的化合物26。
实施例27
化合物27的制备
Figure BSA00000194309800413
化合物27
化合物27从用20％HCl进行的化合物26的酸性水解来制备，类似于制备化合物5的步骤。
实施例28
化合物28的制备
Figure BSA00000194309800421
化合物28
化合物28从化合物27的磺化作用制备得到，类似于制备化合物6的步骤。
实施例29
化合物29的制备
Figure BSA00000194309800422
化合物29
化合物29从化合物24与N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯的缩合制备得到，类似于制备化合物7的步骤。
实施例30
化合物30的制备
Figure BSA00000194309800423
化合物30
化合物30从2，4-二羟基-5-甲酰基苯甲酸(Fanbo Biochemicals公司)与2-噻吩乙酸的缩合制备得到，类似于制备化合物4的步骤。
实施例31
化合物31的制备
Figure BSA00000194309800424
化合物31
化合物31从用20％HCl进行的化合物30的酸性水解来制备，类似于制备化合物5的步骤。
实施例32
化合物32的制备
Figure BSA00000194309800431
化合物32
化合物32从化合物31的磺化作用制备得到，类似于制备化合物6的步骤。
实施例33
化合物33的制备
Figure BSA00000194309800432
化合物33
化合物33从化合物32与N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯的缩合制备得到，类似于制备化合物7的步骤。
实施例34
化合物34的制备
Figure BSA00000194309800433
化合物34
将2-苯并噻唑乙酸乙酯(5g，Sigma-Aldrich)、2，4-二羟基-5-甲酰基苯甲酸(2g，Fanbo Biochemicals公司)，0.5ml哌啶与0.3ml乙酸在100ml甲醇中在回流下加热至通过TLC表明反应已经完成。冷却至室温后，过滤该混合物并且浓缩滤液。把浓缩的滤液倾倒入水中，并且抽滤所得到的沉淀物从而收集固体，风干该固体。粗产品进一步用硅胶色谱纯化以生成所希望的化合物34。
实施例35
化合物35的制备
Figure BSA00000194309800441
化合物35
化合物35从化合物34的磺化作用制备得到，类似于制备化合物6的步骤。
实施例36
化合物36的制备
Figure BSA00000194309800442
化合物36
化合物36从化合物35与N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯的缩合制备得到，类似于制备化合物7的步骤。
实施例37
化合物37的制备
Figure BSA00000194309800443
化合物37
将甲基4-羧甲基吡啶(Methyl 4-carboxymethylpyridine)(5g)和6-溴己酸甲酯(8g)在1，2-二氯苯(50ml)中加热至通过TLC表明反应已经完成。冷却至室温后，过滤该混合物以收集固体，该固体用乙醚洗涤并且风干。粗产物无需进一步纯化被直接用于下一步反应中。
实施例38
化合物38的制备
Figure BSA00000194309800444
化合物38
化合物38从化合物37与间苯二酚的哌啶催化的缩合制备得到，类似于制备化合物34的步骤。
实施例39
化合物39的制备
Figure BSA00000194309800451
化合物39
化合物39从化合物38的水解作用制备得到，类似于制备化合物5的步骤。
实施例40
化合物40的制备
Figure BSA00000194309800452
化合物40
化合物40从化合物39与N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯的缩合制备得到，类似于制备化合物7的步骤。
实施例41
蛋白质-染料结合物的制备
蛋白质-染料结合物可以通过标准方法制备得到，如那些在例如Haugland等，1995，Meth.Mol.Biol.45：205；Haugland，1995，Meth.Mol.Biol.45：223；Haugland，1995，Meth.Mol.Biol.45：235；Haugland，2000，CurrentProtocols In Cell Biology 16.5.1-16.5.22中描述的，其各自在此引入作为参考。例如，蛋白质-染料结合物可以使用本发明的琥珀酰亚胺基酯制备得到，如下所述。
制备约10mg/mL的蛋白质在0.1M碳酸氢钠中的溶液。将标记试剂以约10mg/mL的浓度溶于适合的溶剂例如水或DMF或DMSO中。在搅拌下将预定量的标记试剂加入蛋白质溶液中。反应混合物于室温下培养一个小时或于冰上培养几个小时。染料-蛋白质结合物一般地通过尺寸排阻色谱例如用磷酸缓冲盐水(PBS)平衡的Amersham PD-10树脂(GE Healthcare Bio-Sciences公司，Piscataway，NJ)与游离未反应的试剂分离开。收集最初的、含有蛋白质的染色带并且使用游离荧光团的吸光系数由各荧光团的吸光度极大值处的吸光度测定取代的程度。由此获得的染料-蛋白质结合物可以再分级以产生有更高、更低或更均匀DOS的结合物。
对于许多应用，例如用于生产染料标记的抗体，使用10至50当量染料比1当量蛋白质的摩尔比。可以理解的是，最佳的反应条件和反应物浓度一般根据经验来决定。染料-蛋白质结合的优化方法在本领域是公知的，并且例如在此处引用的参考文献中所描述。
实施例42
抗体-染料结合物的制备
下面描述制备IgG单克隆抗体的染料结合物的优选方案。如下所注解的，基本上使用该样品方案制备化合物7、13、14、19、25和60的染料-结合物，并有微小变动。
步骤1.制备抗体溶液：以约2-20mg/ml的浓度制备抗体在标记缓冲液(0.05M NaPi，pH 8.0+0.15M NaCl+20％甘油)中的溶液。
溶液中抗体的浓度可以利用比尔-兰伯特定律(A280＝εp·C·L)计算出来，其中A280是在280nm(其为蛋白质的最大吸收波长)处测量的吸光度，εp是抗体蛋白质的摩尔吸光系数，C是浓度，以及L是通过溶液的光程长度。典型的IgG抗体有224,000cm-1M-1的εp值。
步骤2.制备染料溶液：通过将染料溶解在DMSO中制备染料溶液。如下所述测定染料溶液的浓度。染料浓度测量的精确性可以通过先在pH 9.6的1M甘氨酸中以1/100稀释染料而得以提高。
溶液中染料的浓度可以利用比尔-兰伯特定律：Amax＝ε染料·C·L计算出来，其中Amax是在染料的最大吸收波长处测量的吸光度，ε染料是染料的摩尔吸光系数，C是浓度，以及L是通过溶液的光程长度。作为一个例子，化合物7酰胺的最大吸收波长约为415nm。对于其它染料化合物，反应性染料的最大吸收波长应该在结合前测量。
步骤3.进行结合反应：计算抗体和染料溶液的量以在反应中获得预期的摩尔过量的染料。为了优化研究，使用一定范围摩尔过量的染料进行反应，一般介于2×和60×之间的摩尔过量的染料。伴随着有效的搅拌或振荡，将抗体溶液加入到染料溶液中，并且保持反应混合物搅拌或振荡1-2小时以获得抗体-染料结合物。
步骤4.纯化结合物：抗体-染料结合物可以使用Bio-Spin柱进行纯化。装载50μl的抗体-染料结合物溶液以及50μl的追踪(chase)缓冲液(PBS+20％甘油+0.1％NaN3)于Bio-Spin柱上，将1ml chase缓冲液放入旋转(spin)柱的接收管中，并且分离。分离后涡旋。
可选择地，按照制造者的方案，抗体-染料结合物可以使用PD-10柱(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)进行纯化。
步骤5.测定抗体-染料结合物的取代度：取代度(DOS)使用下列等式进行计算：
DOS＝[染料]/[抗体]＝Amax·εp/ε染料·(A280-0.55·Amax))，
其中[染料]是染料浓度，[抗体]是抗体浓度，Amax是在染料的最大吸收波长处测量的吸光度，A280是在280nm处测量的吸光度，εp是抗体蛋白质的摩尔吸光系数，ε染料是染料的摩尔吸光系数。应当注意到的是，为获得准确的DOS，结合物不应该有未结合的染料。
为了有效地标记，取代度一般应落入3-20摩尔染料比一摩尔抗体的范围之间。作为本领域公知的，提供最佳标记的DOS将取决于抗体，以及在某些情况下，更高的DOS可能提供提高的标记。通过制备一定范围DOS的染料结合物并比较测得的荧光强度来经验性地决定最佳标记。例子公开在图中。
实施例43
高碘酸盐氧化的糖蛋白类的染料结合物的制备
在pH 5.5的1mL 0.1M乙酸盐、0.135M NaCl中的5mg山羊IgG抗体样品(其具有连接于蛋白质的多糖链)用2.1mg偏高碘酸钠在冰上处理根据经验判断的足以使糖蛋白上有所希望量的醛基的一段时间，其随后与化合物5反应。通过加入30μL乙二醇停止反应。在填充于pH 7.2的PBS中的Sephadex G25柱上纯化抗体。加入十分之一体积的1M碳酸氢钠以提高pH并且以50∶1的染料与蛋白质的摩尔比加入化合物5。反应物在室温下搅拌根据经验判断的足以产生所希望染料/蛋白质比例的一段时间。加入氰基硼氢化钠至10mM的最终浓度并且在室温下搅拌反应物4个小时。通过透析并在如上所述的Sephadex G25柱上纯化抗体结合物。凝胶中和污渍上的高碘酸盐氧化的糖蛋白也能被标记，基本上如Estep和Miller，1986，Anal.Biochem.157：100-105中所述，在此引入作为参考。
实施例44
使用巯基-反应性染料制备蛋白质-染料结合物
制备β-半乳糖苷酶(一种富含游离巯基基团的蛋白质)在PBS中的溶液(2.0mg在400μL中)。随后用在DMF中的马来酰亚胺衍生物化合物9的10mg/L溶液处理该蛋白质溶液。在旋转柱上移除未反应的染料。如实施例42中所描述的那样，使用游离染料的吸光系数估计被染料取代的程度。校正化合物9在280nm波长处的吸光度，由280nm处的吸光度估算蛋白质浓度。
实施例45
氨基葡聚糖-染料结合物的制备
如下所述制备氨基葡聚糖一染料结合物，使用用平均13个氨基衍生的70,000MW氨基葡聚糖(50mg)作为例子进行描述。将氨基葡聚糖(50mg)以10mg/mL溶解于0.1M NaHCO3中。加入化合物7、13、14、19、25或60以给出约10-15的染料/葡聚糖比例。6-12个小时后，所得结合物在SEPHADEX G-50上纯化并且用水洗脱。一般6-10摩尔染料被结合至70,000MW葡聚糖上。
实施例46
染料标记的微球体的制备
可以使用许多公知方案的任意一种用本发明的染料来标记微球体。例子在下面被描述。
进行化学修饰使表面上有官能团例如氨基、羧基或醛的微球体可以通过表面基团共价结合相应的如表1中所列的反应性染料而被表面标记。例如，胺修饰的微球体可以容易地通过琥珀酰亚胺基酯例如化合物7、13、14、19、25或60而结合本发明的染料。
如上所述制备的染料标记的蛋白质，可以通过它的胺残基使用乙基3-(二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDAC)被共价偶联至微球体上的羧化物基团。可选择地，染料标记的蛋白质可以被动地吸附在微球体上。例如，羧化物修饰的微球体被悬浮于溶液染料标记的蛋白质中，该蛋白质允许被动地吸附于微球体上，并且过量的蛋白质通过离心分离作用以及洗涤除去。不能被离心分离的这一尺寸的微粒利用经过有高MW截断的半透膜的透析或凝胶过滤层析与过量蛋白质中分离开。
如上所述，生物素化的微球体可以用结合至本发明的染料的链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白或抗生物素进行处理。
实施例47
核苷酸-染料结合物的制备
与本发明的染料结合的核苷酸可以通过本领域技术人员根据公知或出版的步骤例如那些公开在M.Nimmakayalu等，2000，Biotechniques 28，518-522；Muhlegger等，1990，Biol Chem Hoppe Seyler 371，953-965；和Giaid等，1989，Histochemistry 93，191-196中的步骤轻易地制备得到，其各自在此引入作为参考。在下面描述了具体的结合的例子。
向在100μl水中的2mg 5-(3-氨基烯丙基)-2′-脱氧尿苷5′-三磷酸酯(Sigma-Aldrich)中，加入在100μL DMF中的化合物7、13、14、19、25或60和5μL三乙胺。在3个小时后，蒸发溶液并且通过HPLC纯化残留物。对产物部分进行冻干以给出荧光核苷酸结合物。
可选择地，脱氧尿苷5′-三磷酸酯的荧光染料-结合物从5-(3-氨基-1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷5′-三磷酸盐来制备，或者通过用本发明的巯基-反应性的染料(例如马来酰亚胺化合物9)处理巯基化的核苷酸或硫代磷酸酯核苷酸来制备。
可选择地，2′-(或3′)-2-氨乙基氨基羰基腺苷5′-三磷酸酯与稍微过量的化合物7、13、14、19、25或60进行反应，接着用乙醇沉淀，利用制备HPLC纯化核糖修饰的产物。
实施例48
低聚核苷酸-染料结合物的制备
将5′-胺修饰的、18-碱M13引物序列(约100μg)溶解于4μl水中。往其中加入在pH 8.5的100μl 0.1M硼酸钠中的250μg化合物7、13、14、19、25或60。在16个小时后，加入10μl 5M NaCl和3体积的冷乙醇。将混合物冷却至-20℃、离心分离，将上清液倾倒出，用乙醇洗涤颗粒，并且随后将颗粒溶解于100μL水中。被标记的低聚核苷酸通过HPLC被纯化。收集所希望的峰并且蒸发给出发荧光的低聚核苷酸-染料结合物。
实施例49
使用染料-抗体结合物通过流式细胞计数法进行细胞分析
结合了本发明的染料化合物的被分析物-特异性抗体(即标记的抗体)用于通过流式细胞计数法进行血细胞(例如，在全血样品中)分析。所标记的抗体用于标记(染色)细胞的蛋白质，并且使用流式细胞计数仪测定所标记的蛋白质。
全血的样品(100μL)(优选收集在EDTA中)一般在黑暗中以每0.1ml血液1μg或更少的染料结合物浓度用抗体-染料结合物染色30-60分钟。染色后，将2mL的1×FACSTM溶解溶液(Lysing Solution)(BD Bioscience，San Jose，CA)加入到样品中，样品在旋涡搅拌器中以中等速度混合并且随后室温培养10分钟。以2-500g(优选2-300)离心样品5分钟并且倾倒出上清液。洗涤样品(在2mL 0.5％BSA/PBS洗涤缓冲液中再悬浮、混合并且离心)两次，在0.5mL洗涤缓冲液或150μl定色稳定缓冲液中再悬浮，并且保持在4℃直至进行流式细胞计数分析。
染色细胞的分析优选使用配备有蓝色(488nm)、红色(-633nm)和紫色(405nm)激光的BD LSR II流式细胞计数仪(BD Biosciences，San Jose，CA)来实现。检测光学包括在525/50nm荧光检测通道中进行检测。结合了染料化合物例如化合物7、13和25的荧光生物聚合物显示出密切匹配紫激光的405nm发射的激发极大值，并且来自生物聚合物的发射在525/50nm检测通道中进行测量。根据制造者的指令设定流式细胞计数仪。染色细胞样品的流式细胞计数分析根据制造者的方案进行，并且使用本领域公知的标准技术分析数据以获得感兴趣的细胞群的中值荧光强度。
将被理解的是，使用的具体的抗体结合物和所用的具体反应组分和具体反应条件会对获得的结果有影响。应当操作常规试验方法以测定优选的反应组分，例如缓冲液或溶解溶液，以及反应条件，包括染色时间和温度。所述分析条件的常规优化法是基于免疫染色分析领域中的标准实践。
实施例50
抗CD4、CD8和CD45抗体的染料结合物
使用对CD4和CD45(分别为克隆SK3和2D1，来自BD Biosciences，San Jose，CA)特异性的抗体制备染料-结合物，其各自在单独的制剂中以一定范围的染料与蛋白质之比结合至化合物7、13和25。抗体-染料结合物基本上如在上面实施例42中所描述的那样进行制备。CD4和CD45抗体的抗体-结合物基本上如在上面实施例49中所描述的那样被用于分析全血样品中的淋巴细胞。
数据表明了对于各抗体-染料对来说优选的染料与蛋白质之比。对于各抗体，最佳的染料与蛋白质之比对三种染料中的每一种出现在类似的比值处。比较与相同染料结合的不同的抗体，最佳的染料与蛋白质之比有显著不同，其中对于CD4在更高比例处观察到最佳的荧光。在这些实验中，对于染料与蛋白质之比高于最佳比值的(超出测试范围)CD4染料结合物，没有观察到可察觉得到的自猝灭，荧光仍然保持着最佳水平。相比之下，对于染料与蛋白质之比高于最佳比值的CD45染料结合物，观察到显著的自猝灭。比较使用各染料化合物获得的最大荧光染色，化合物7产生比化合物13更好的荧光染色，化合物13产生比化合物25更好的荧光染色。
该结果表明所有三种染料结合物能用于制备用于通过流式细胞计数仪进行分析的免疫荧光分析的抗原特异性检测试剂。一般而言，对于将被标记的各特异性抗体，各最佳的染料与蛋白质之比要经验性地来加以确定(通过常规优化法)。
实施例51
抗CD3、CD4、CD8和CD45抗体的染料结合物
使用四种不同的抗体CD3、CD4、CD8和CD45抗体(分别为克隆SK7、SK3、SK1和2D1，来自BD Biosciences，San Jose，CA)制备染料结合物，抗体各自在单独的制剂中以一定的染料/蛋白质比值范围结合至化合物7。抗体-染料结合物基本上如在上面实施例42中所描述的那样进行制备。CD3、CD4、CD8和CD45抗体的染料结合物基本上如在上面实施例49中所描述的那样被用于分析全血样品中的淋巴细胞。
分析结果概述在附图3-6中，其表示为对于各染料结合物的染料与蛋白质之比所绘制的染料结合物标记的淋巴细胞群的荧光强度的曲线。在附图3-5中，荧光强度被记录为“染色指数”，该染色指数提供了一种在测自未被染色、“负数”细胞群的信号(即，背景)上的被染色细胞群的荧光强度高于相对于由未染色细胞群测量的荧光分布宽度的量度(参见Maecker等，2004，Cytometry PartA 62A：169-173，在此引入作为参考)。染色指数如下定义：
染色指数＝(S-U)/(2*SD_负数)，
其中S是测量自染色细胞群的中值荧光强度(MFI)，U是未染色细胞群的MFI，以及SD_负数是未染色细胞群的荧光强度的标准偏差。在附图6中，荧光强度被记录为中值荧光强度(MFI)。因为CD45抗体结合至所有的淋巴细胞，所以其中没有被用作这些实验中背景的量度的未染色淋巴细胞群，且不能计算染色指数。
在下表4中提供了对于各染料结合的抗体的最佳染料与蛋白质之比。
表4
最佳的染料与蛋白质之比
  抗体特异性   优选的染料与蛋白质之比
  CD3   5
  CD4   25
  CD8   28
  CD45   9
附图3表示使用结合于化合物7的CD3抗体的染料结合物在一定范围的染料与蛋白质之比内所获得的数据曲线。所获得的最大染色指数说明化合物7所标记的这一CD3抗体的染料结合物使得在流式细胞计数免疫荧光分析中有可能辨别出超出背景荧光的染色的淋巴细胞群。对于这一抗体和染料组合，在高于最佳值的染料与蛋白质之比处观察到自猝灭。
附图4表示使用结合于化合物7的CD4抗体的染料结合物在一定范围的染料与蛋白质之比内所获得的数据曲线。所获得的最大染色指数说明化合物7所标记的这一CD4抗体的染料结合物使得在流式细胞计数免疫荧光分析中有可能辨别出超出背景荧光的染色的淋巴细胞群。对于这一抗体和染料组合，在高于最佳值的染料与蛋白质之比处观察到极少的自猝灭，从而提供了宽范围的可用比值。
附图5表示使用结合于化合物7的CD8抗体的染料结合物在一定范围的染料与蛋白质之比内所获得的数据曲线。所获得的最大染色指数说明化合物7所标记的这一CD8抗体的染料结合物使得在流式细胞计数免疫荧光分析中有可能辨别出超出背景荧光的染色的淋巴细胞群。对于这一抗体和染料组合，在高于最佳值的染料与蛋白质之比处观察到极少的自猝灭，从而提供了宽范围的可用比值。
附图6表示使用结合于化合物7的CD45抗体的染料结合物在一定范围的染料与蛋白质之比内所获得的数据曲线。由于MFI取决于，例如，光感测器的增益，所获得的最大值MFI并不直接表明染料结合物对于区别细胞群的用处。然而，观察到用化合物7标记的这一CD45抗体的染料结合物提供了在流式细胞计数免疫荧光分析中使用的淋巴细胞群的足够标记。对于这一抗体和染料组合，在高于最佳值的染料与蛋白质之比处观察到自猝灭，这表明可用比值的范围较窄。

Claims (31)

1.一种化合物，其具有以下结构：
其中
HC为杂环；
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地是H、卤素、烷基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、叠氮基、氨基、羟基、磺酰基、膦酰基、硼酸、L-RG、WSG或其本身被卤素、氨基、羟基、磺酰基、膦酰基、羰基、硼酸、L-RG或WSG一次或多次取代的烷基或烷氧基；
RG是化学反应性基团；
L是任选的连接体；
WSG是水溶性基团；
R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少一个含有L-RG；和
R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少一个是WSG。
2.权利要求1的化合物，其中HC选自：
Figure FSA00000194309700012
3.权利要求1的化合物，其具有以下结构：
Figure FSA00000194309700021
其中
X是O、S、NH或NR10；
Y是NH、NR11、CH或CR12；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R10、R11和R12独立地是H、卤素、烷基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、叠氮基、氨基、羟基、磺酰基、膦酰基、硼酸、L-RG、WSG或其本身任选地被卤素、氨基、羟基、磺酰基、膦酰基、羰基、硼酸、L-RG或WSG一次或多次取代的烷基或烷氧基；
RG是化学反应性基团；
L是任选的连接体；
WSG是水溶性基团；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R10、R11和R12中的至少一个含有L-RG；和
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R10、R11和R12中的至少一个是WSG。
4.权利要求1的化合物，其具有以下结构：
Figure FSA00000194309700022
其中
X是O或S；
R1、R2、R3、R4、R10、R11和R12独立地是H、卤素、烷基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、叠氮基、氨基、羟基、磺酰基、膦酰基、硼酸、L-RG、WSG或其本身任选地被卤素、氨基、羟基、磺酰基、膦酰基、羰基、硼酸、L-RG或WSG一次或多次取代的烷基或烷氧基；
RG是化学反应性基团；
L是任选的连接体；
WSG是水溶性基团；
R1、R2、R3、R4、R10、R11和R12中的至少一个含有L-RG；和
R1、R2、R3、R4、R10、R11和R12中的至少一个是WSG。
5.权利要求1的化合物，其具有以下化学式：
Figure FSA00000194309700031
其中
X是O或S；
R1、R2、R3、R4、R10和R11独立地是H、卤素、烷基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、叠氮基、氨基、羟基、磺酰基、膦酰基、硼酸、L-RG、WSG或其本身任选地被卤素、氨基、羟基、磺酰基、膦酰基、羰基、硼酸、L-RG或WSG一次或多次取代的烷基或烷氧基；
RG是化学反应性基团；
L是任选的连接体；
WSG是水溶性基团；
R1、R2、R3、R4、R10和R11中的至少一个含有L-RG；
R1、R2、R3、R4、R10和R11中的至少一个是WSG；和
R10和R11中的至少一个含有磺酸盐。
6.权利要求1-5中任一项的化合物，其中RG是丙烯酰胺、胺、羧酸、羧酸的活性酯、酰叠氮、酰基腈、醛、烷基卤、酐、芳基卤、叠氮化物、氮丙啶、硼酸酯、重氮烷、卤代乙酰胺、卤代三嗪、肼、羟胺、亚氨基酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、反应性铂络合物、磺酰卤或补骨脂素衍生物。
7.权利要求1-6中任一项的化合物，其中L是没有、烷基、烷氧基、硫代烷基、氨基酸、磺基氨基酸、多胺、聚乙二醇、芳基或杂芳基。
8.权利要求1-7中任一项的化合物，其中WSG是磺酸根、硫代磺酸根、膦酸根、硼酸根、铵、吡啶鎓、喹啉鎓或吖啶鎓。
9.权利要求1的化合物，其具有以下化学式：
Figure FSA00000194309700032
其中
X是O或S；
R1、R2、R3、R4、R10和R11独立地是氢、氯、氟、氰基或磺酸盐；
RG是化学反应性基团；
L是任选的连接体；和
其中R10和R11中的至少一个是磺酸盐。
10.权利要求9的化合物，其中RG是羧酸的活性酯、酰叠氮、酰基腈、醛、烷基卤、芳基卤、叠氮化物、氮丙啶、卤代乙酰胺、卤代三嗪、胺、肼、羟胺、亚氨基酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯或马来酰亚胺。
11.权利要求10或11中任一项的化合物，其中L是没有或具有3-20个碳原子的以下物质：烷基、烷氧基、硫代烷基、氨基酸、磺基氨基酸、多胺或聚乙二醇。
12.权利要求1的化合物，其具有以下化学式：
其中
R1、R2、R3、R4、R10和R11独立地是氢、氯、氟、氰基或磺酸盐；
RG是化学反应性基团；
L是任选的连接体，它是没有、烷基、烷氧基、硫代烷基、氨基酸、磺基氨基酸、多胺、聚乙二醇、芳基、芳烷基或杂芳基，和
其中R10和R11中的至少一个是磺酸盐。
13.权利要求12的化合物，其中RG是羧酸的活性酯、酰叠氮、酰基腈、醛、烷基卤、芳基卤、叠氮化物、氮丙啶、卤代乙酰胺、卤代三嗪、胺、肼、羟胺、亚氨基酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯或马来酰亚胺。
14.权利要求1的化合物，其具有以下化学式：
Figure FSA00000194309700042
其中
R3、R4、R10和R11独立地是氢、氯、氟、氰基或磺酸盐；
n为1-10的整数；和
其中R10和R11中的至少一个是磺酸盐。
15.一种染料结合物，其具有以下化学式：
Figure FSA00000194309700051
其中
HC为杂环；
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地是H、卤素、烷基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、叠氮基、氨基、羟基、磺酰基、膦酰基、硼酸、WSG或其本身被卤素、氨基、羟基、磺酰基、膦酰基、羰基、硼酸或WSG一次或多次取代的烷基或烷氧基；
WSG是水溶性基团；
n是1-35的整数；
SUB是底物；
R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少一个通过任选的连接体L共价结合到S上；和
R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少一个是WSG。
16.权利要求15的染料结合物，其中HC选自：
Figure FSA00000194309700052
17.权利要求15的染料结合物，其具有以下结构：
Figure FSA00000194309700061
其中
X是O、S、NH或NR10；
Y是NH、NR11、CH或CR12；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R10、R11和R12独立地是H、卤素、烷基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、叠氮基、氨基、羟基、磺酰基、膦酰基、硼酸、WSG或其本身任选地被卤素、氨基、羟基、磺酰基、膦酰基、羰基、硼酸或WSG一次或多次取代的烷基或烷氧基；
WSG是水溶性基团；
n是1-35的整数；
SUB是底物；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R10、R11和R12中的至少一个通过任选的连接体L共价结合到SUB上；和
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R10、R11和R12中的至少一个是WSG。
18.权利要求15的染料结合物，其具有以下结构：
Figure FSA00000194309700062
其中
X是O或S；
R1、R2、R3、R4、R10、R11和R12独立地是H、卤素、烷基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、叠氮基、氨基、羟基、磺酰基、膦酰基、硼酸、WSG或其本身任选地被卤素、氨基、羟基、磺酰基、膦酰基、羰基、硼酸或WSG一次或多次取代的烷基或烷氧基；
WSG是水溶性基团；
n是1-35的整数；
SUB是底物；
R1、R2、R3、R4、R10、R11和R12中的至少一个通过任选的连接体L共价结合到S上；和
R1、R2、R3、R4、R10、R11和R12中的至少一个是WSG。
19.权利要求15的染料结合物，其具有以下化学式：
Figure FSA00000194309700071
其中
X是O或S；
R1、R2、R3、R4、R10和R11独立地是H、卤素、烷基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、叠氮基、氨基、羟基、磺酰基、膦酰基、硼酸、WSG或其本身任选地被卤素、氨基、羟基、磺酰基、膦酰基、羰基、硼酸或WSG一次或多次取代的烷基或烷氧基；
WSG是水溶性基团；
n是1-35的整数；
SUB是底物；
R1、R2、R3、R4、R10和R11中的至少一个通过任选的连接体L共价结合到S上；
R1、R2、R3、R4、R10和R11中的至少一个是WSG；和
R10和R11中的至少一个含有磺酸盐。
20.权利要求15-19中任一项的染料结合物，其中L是没有、烷基、烷氧基、硫代烷基、氨基酸、磺基氨基酸、多胺、聚乙二醇、芳基或杂芳基。
21.权利要求15-20中任一项的染料结合物，其中WSG是磺酸根、硫代磺酸根、膦酸根、硼酸根、铵、吡啶鎓、喹啉鎓或吖啶鎓。
22.权利要求15-21中任一项的染料结合物，其中SUB为生物聚合物。
23.权利要求15-21中任一项的染料结合物，其中SUB为抗体。
24.权利要求15的染料结合物，其具有以下化学式：
Figure FSA00000194309700081
其中
X是O或S；
R1、R2、R3、R4、R10和R11独立地是氢、氯、氟、氰基或磺酸盐；
L是任选的连接体；
SUB是底物；和
R10和R11的至少一个是磺酸盐。
25.权利要求24的染料结合物，其中L是没有或具有3-20个碳原子的以下物质：烷基、烷氧基、硫代烷基、氨基酸、磺基氨基酸、多胺或聚乙二醇。
26.权利要求24的染料结合物，其中SUB为生物聚合物。
27.权利要求24的染料结合物，其中SUB为抗体。
28.检测样品中的被分析物的方法，包括
a)使所述样品与包含权利要求15-27中任一项的染料结合物的检测试剂在所述检测试剂将与所述被分析物形成络合物的条件下混合；
b)检测所述络合物。
29.一种试剂盒，其包含至少一种具有化学式1、化学式2、化学式3、化学式4、化学式5、化学式6、化学式7或化学式8结构的反应性染料化合物。
30.一种试剂盒，其包含至少一种具有化学式9、化学式10、化学式11、化学式12或化学式13结构的染料结合物。
31.一种化合物，其具有以下结构：
Figure FSA00000194309700082
Figure FSA00000194309700091
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103360377A (zh) * 2012-03-29 2013-10-23 住友化学株式会社 染料用化合物
CN109721592A (zh) * 2019-03-04 2019-05-07 河南理工大学 一种含香豆素的氨基吡嗪酰腙衍生物的荧光探针及其制备方法和应用
CN112679569A (zh) * 2020-10-22 2021-04-20 山西大学 一种荧光探针及其制备方法和应用
CN113121513A (zh) * 2021-04-26 2021-07-16 安徽大学 一种咔唑-香豆素基腙类化合物及其制备方法和用途
CN113646636A (zh) * 2019-01-21 2021-11-12 马克斯·普朗克科学促进学会 基于新型荧光染料的用于自动高性能鉴别碳水化合物和碳水化合物混合物组成模式的先进方法和系统以及用于校准多波长荧光检测系统的方法

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9400273B1 (en) 2009-12-09 2016-07-26 Life Technologies Corporation 7-hydroxycoumarin-based cell-tracking reagents
CN103476761B (zh) * 2011-03-30 2016-08-03 3M创新有限公司 荧光原性化合物或荧光性化合物及其用途
US9012643B2 (en) 2012-10-24 2015-04-21 Becton, Dickinson And Company Hydroxamate substituted azaindoline-cyanine dyes and bioconjugates of the same
ES2832527T3 (es) * 2015-06-29 2021-06-10 Immunogen Inc Conjugados de anticuerpos modificados con cisteína
ITUA20161706A1 (it) 2016-03-15 2017-09-15 Cyanagen S R L Nuovi coloranti cumarinici e relativi coniugati
KR102331668B1 (ko) 2016-04-15 2021-11-25 베크만 컬터, 인코포레이티드 광활성 거대분자 및 그의 용도
JP6821490B2 (ja) * 2017-04-03 2021-01-27 日本化薬株式会社 クマリン化合物又はそれらの塩、並びにこれを含んだ顔料組成物
GB201716931D0 (en) 2017-10-16 2017-11-29 Illumina Cambridge Ltd New fluorescent compounds and their use as biomarkers
EP3747957A1 (en) 2019-06-07 2020-12-09 Universidade de Évora Fluorescent vinyl tiophene and bitiophene coumarins dyes and method of synthesis thereof
CN117015711A (zh) 2021-02-05 2023-11-07 贝克曼库尔特有限公司 用于阻止聚合物染料-抗体缀合物之间的非特异性相互作用的组合物和方法
JP2024517437A (ja) 2021-05-04 2024-04-22 ベックマン コールター， インコーポレイテッド Ｕｖ吸収性ポリマー、組成物およびその使用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3044128A1 (de) * 1980-11-24 1982-07-15 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Cumarine, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
US5830912A (en) * 1996-11-15 1998-11-03 Molecular Probes, Inc. Derivatives of 6,8-difluoro-7-hydroxycoumarin
US20080071074A1 (en) * 2006-05-22 2008-03-20 Third Wave Technologies, Inc. Compositions, probes, and conjugates and uses thereof

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3556959A (en) * 1968-03-29 1971-01-19 Frank Passal Nickel plating
IT1088554B (it) * 1977-11-17 1985-06-10 F I D I A Spa Procedimento sellettivo per la preparazione di derivati della 7-indrossi cumarina
US4235781A (en) * 1979-09-20 1980-11-25 Thomas C. Elder, Inc. 6 Or 8 Haloallyl substituted 7-hydroxycoumarins
US4259233A (en) * 1979-10-23 1981-03-31 Miles Laboratories, Inc. β-Galactosyl-umbelliferone-labeled protein and polypeptide conjugates
US4711955A (en) 1981-04-17 1987-12-08 Yale University Modified nucleotides and methods of preparing and using same
SE8505716D0 (sv) 1985-12-03 1985-12-03 Biocarb Ab Novel compounds and conjugates thereof
US5047519A (en) 1986-07-02 1991-09-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Alkynylamino-nucleotides
US5049673A (en) 1987-10-30 1991-09-17 The Regents Of The University Of California Fluorescent indicator dyes for calcium working at long wavelengths
US5648270A (en) 1995-02-06 1997-07-15 Molecular Probes, Inc. Methods of sensing with fluorescent conjugates of metal-chelating nitrogen heterocycles
US5516629A (en) 1990-04-16 1996-05-14 Cryopharm Corporation Photoinactivation of viral and bacterial blood contaminants using halogenated coumarins
US5453517A (en) 1992-02-25 1995-09-26 Molecular Probes, Inc. Reactive derivatives of bapta used to make ion-selective chelators
US5405975A (en) 1993-03-29 1995-04-11 Molecular Probes, Inc. Fluorescent ion-selective diaryldiaza crown ether conjugates
US5714327A (en) 1990-07-19 1998-02-03 Kreatech Diagnostics Platinum-containing compounds, methods for their preparation and applications thereof
NL9001639A (nl) 1990-07-19 1992-02-17 Amc Amsterdam Pt-houdende verbinding, werkwijze voor de bereiding ervan, alsmede toepassing van dergelijke verbindingen.
US5208148A (en) 1990-12-07 1993-05-04 Molecular Probes, Inc. Lipophilic fluorescent glycosidase substrates
YU187991A (sh) 1990-12-11 1994-09-09 Hoechst Aktiengesellschaft 3-(2)-amino-ali tiol-modifikovani, s fluorescentnom bojom vezani nukleozidi, nukleotidi i oligonukleotidi, postupak za njihovo dobijanje i njihova upotreba
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5516911A (en) 1993-12-30 1996-05-14 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Fluorescent intracellular calcium indicators
US6150510A (en) 1995-11-06 2000-11-21 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Modified oligonucleotides, their preparation and their use
US5741657A (en) 1995-03-20 1998-04-21 The Regents Of The University Of California Fluorogenic substrates for β-lactamase and methods of use
US6342379B1 (en) * 1995-06-07 2002-01-29 The Regents Of The University Of California Detection of transmembrane potentials by optical methods
US5684142A (en) 1995-06-07 1997-11-04 Oncor, Inc. Modified nucleotides for nucleic acid labeling
US5668268A (en) 1995-11-27 1997-09-16 Hybridon, Inc. Passivated polymer supports for nucleic acid synthesis
US5955604A (en) 1996-10-15 1999-09-21 The Regents Of The University Of California Substrates for β-lactamase and uses thereof
US5696157A (en) * 1996-11-15 1997-12-09 Molecular Probes, Inc. Sulfonated derivatives of 7-aminocoumarin
US6221612B1 (en) * 1997-08-01 2001-04-24 Aurora Biosciences Corporation Photon reducing agents for use in fluorescence assays
US6372895B1 (en) * 2000-07-07 2002-04-16 3M Innovative Properties Company Fluorogenic compounds
US6207404B1 (en) 1999-09-30 2001-03-27 Gentest Corporation Coumarin-based CYP3A fluorescent assay reagents
US7304168B2 (en) * 2003-08-14 2007-12-04 Board Of Regents, University Of Texas System Photo-caged fluorescent molecules
US20100029017A1 (en) * 2008-07-29 2010-02-04 Becton, Dickinson And Company Mono-chlorinated hydroxycoumarin conjugates

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3044128A1 (de) * 1980-11-24 1982-07-15 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Cumarine, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
US5830912A (en) * 1996-11-15 1998-11-03 Molecular Probes, Inc. Derivatives of 6,8-difluoro-7-hydroxycoumarin
US20080071074A1 (en) * 2006-05-22 2008-03-20 Third Wave Technologies, Inc. Compositions, probes, and conjugates and uses thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
OTTO S.WOLFBEIS，ETC: "The unusually strong effect of a 4-cyano group upon electronic spectra and dissociation constants of 3-substituted 7-hydroxycoumarins", 《THE CHEMICAL SOCIETY OF JAPAN》 *
SERGE KIRKIACHARIAN，ETC: "Synthesis and binding affinity to human α and β estrogen receptors of various 7-hydroxycoumarins substituted at 4- and 3,4- positions", 《IL FARMACO》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103360377A (zh) * 2012-03-29 2013-10-23 住友化学株式会社 染料用化合物
CN103360377B (zh) * 2012-03-29 2017-09-19 住友化学株式会社 染料用化合物
CN113646636A (zh) * 2019-01-21 2021-11-12 马克斯·普朗克科学促进学会 基于新型荧光染料的用于自动高性能鉴别碳水化合物和碳水化合物混合物组成模式的先进方法和系统以及用于校准多波长荧光检测系统的方法
CN109721592A (zh) * 2019-03-04 2019-05-07 河南理工大学 一种含香豆素的氨基吡嗪酰腙衍生物的荧光探针及其制备方法和应用
CN109721592B (zh) * 2019-03-04 2022-09-30 河南理工大学 一种含香豆素的氨基吡嗪酰腙衍生物的荧光探针及其制备方法和应用
CN112679569A (zh) * 2020-10-22 2021-04-20 山西大学 一种荧光探针及其制备方法和应用
CN112679569B (zh) * 2020-10-22 2022-05-27 山西大学 一种荧光探针及其制备方法和应用
CN113121513A (zh) * 2021-04-26 2021-07-16 安徽大学 一种咔唑-香豆素基腙类化合物及其制备方法和用途
CN113121513B (zh) * 2021-04-26 2023-05-16 安徽大学 一种咔唑-香豆素基腙类化合物及其制备方法和用途

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