CN117015711A - 用于阻止聚合物染料-抗体缀合物之间的非特异性相互作用的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本公开内容涉及包含聚合物染料的非荧光组分(例如聚合物染料的单体组分、光漂白的聚合物染料和/或包含猝灭部分的聚合物染料)的组合物，其用于例如在生物样品的流式细胞术分析中降低聚合物染料缀合物的非特异性相互作用。还提供了用于使用这样的组合物的方法和包含这样的组合物的试剂盒。

Description

用于阻止聚合物染料-抗体缀合物之间的非特异性相互作用 的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请作为PCT国际专利申请于2022年2月4日提交，并要求于2021年2月5日提交的美国临时申请No.63/146,498的权益和优先权，该临时申请通过引用以其整体并入。

背景技术

聚合物染料缀合物是明亮的(bright)，并提供可用于多色流式细胞术测定的优异性能。一般而言，聚合物染料缀合物由于其独特且复杂的结构而表现出高亮度。但是其独特且复杂的结构也导致一些显著的限制。

聚合物染料是疏水性的，并具有大的表观分子量，这使得它们易于在水性缓冲剂中聚集。因此，当聚合物染料与抗体缀合时，所得缀合物也可具有与彼此相互作用和/或与同一样品中存在的其他聚合物染料缀合物相互作用的倾向。当使用多于一种聚合物染料缀合物对同一样品进行染色时，可发生聚合物染料之间的非特异性相互作用，这可以导致数据欠补偿。

可消除聚合物染料缀合物之间非特异性相互作用的专门的染色缓冲剂是高度期望的。

发明内容

聚合物染料缀合物由于其性质可彼此相互作用，导致非特异性结合。本公开内容提供了用于降低或阻止聚合物染料缀合物之间的非特异性相互作用的组合物。

本公开内容提供了能够降低染料缀合物之间的非特异性相互作用的组合物，其包含聚合物染料的一种或更多种非荧光组分和缓冲剂。所述组合物任选地还可包含非离子表面活性剂。所述组合物任选地还可包含蛋白质稳定剂。所述组合物任选地还可包含防腐剂。

本公开内容提供了染色缓冲剂组合物，其包含聚合物染料的一种或更多种非荧光组分、非离子表面活性剂和缓冲剂，其中所述组合物能够降低非特异性结合，例如一种或更多种荧光聚合物染料缀合物之间的聚合物-聚合物相互作用。

聚合物染料的非荧光组分可以是聚合物染料的单体组分、光漂白的聚合物染料和包含猝灭部分的聚合物染料(例如猝灭的聚合物染料)中的一种或更多种。

本公开内容提供了这样的组合物，其包含在缓冲剂中的聚合物染料的单体组分。

本公开内容提供了这样的组合物，其包含在缓冲剂中的光漂白的染料。

本公开内容提供了这样的组合物，其包含在缓冲剂中的猝灭的聚合物染料。

本公开内容提供了这样的组合物，其包含在缓冲剂中的聚合物染料的单体组分和猝灭的聚合物染料。

本公开内容提供了这样的组合物，其包含在缓冲剂中的聚合物染料的单体组分和光漂白的染料。

本公开内容的组合物任选地还可包含蛋白质稳定剂、非离子表面活性剂和/或防腐剂。例如，本公开内容的工作浓度组合物(1×)还可包含0.1至10mg/mL、0.5至5mg/mL、1至3mg/mL、或约2mg/mL的蛋白质稳定剂。

本公开内容的浓缩的染色缓冲剂组合物(10×)还可包含1至100mg/mL、2至50mg/mL、5至40mg/mL、10至30mg/mL、或约20mg/mL的蛋白质稳定剂。在一些实施方案中，蛋白质稳定剂以0.1至100mg/mL、0.2至50mg/mL、1至20mg/mL或1至10mg/mL存在。

本公开内容的工作浓度组合物(1×)可包含0.01％至10％、0.01％至4％、0.01％至2％、0.01％至0.4％或约0.02％(重量/体积)的非离子表面活性剂。

本公开内容的浓缩的染色缓冲剂组合物(10×)可包含0.1％至40％、0.5％至20％、1％至10％或约5％(重量/体积)的非离子表面活性剂。

本公开内容的组合物可任选地还包含0.01％至0.5％、0.03％至0.3％、或0.05％至0.2％、或约0.1％(重量/体积)的防腐剂。

例如，本公开内容提供了工作浓度染色缓冲剂组合物(1×)，其包含在生物缓冲剂中的0.3至1.5mg/mL、0.5至1.2mg/mL或约1mg/mL的猝灭的聚合物染料和任选地0.1至10mg/mL或0.2至5mg/mL的蛋白质稳定剂，所述生物缓冲剂例如PBS缓冲剂，其包含0.01％至10％或0.1％至4％(重量/体积)的非离子表面活性剂。

本公开内容提供了浓缩的染色缓冲剂组合物(10×)，其包含在生物缓冲剂中的3至15mg/mL、5至12mg/mL、或约10mg/mL的猝灭的聚合物染料和任选地1至100mg/mL或2至50mg/mL的蛋白质稳定剂，所述生物缓冲剂例如PBS缓冲剂，其包含0.1％至40％或1％至10％(重量/体积)的非离子表面活性剂。发现该组合物显著降低了多色染料缀合物组中的非特异性聚合物染料缀合物相互作用。这在FCA流式细胞术分析中通过将染色且裂解的血液样品与没有所述猝灭的聚合物染料的情况下的相同样品比较得到证明。

本公开内容提供了工作浓度染色缓冲剂组合物(1×)，其包含在生物缓冲剂中的20至40mg/mL、或约30mg/mL的聚合物染料的单体组分；0.2至0.8mg/mL或0.3至0.7mg/mL的猝灭的聚合物染料；以及0.01％至10％或0.1％至4％的非离子表面活性剂。工作浓度组合物(1×)还可包含0.1至10mg/mL、0.5至5mg/mL的蛋白质稳定剂。

本公开内容提供了浓缩的染色缓冲剂组合物(10×)，其包含在生物缓冲剂中的200至400mg/mL、或约300mg/mL的聚合物染料的单体组分；2至8mg/mL或3至7mg/mL猝灭的聚合物染料；以及0.1％至40％或1％至20％的非离子表面活性剂。浓缩的组合物(10×)还可包含1至100mg/mL或5至50mg/mL的蛋白质稳定剂。

发现该组合物显著降低了多色染料缀合物组中的非特异性聚合物染料缀合物相互作用。这在FCA流式细胞术分析中通过将染色且裂解的全血样品与没有所述单体组分且没有所述猝灭的聚合物染料的情况下的相同样品比较得到证明。

本公开内容提供了工作浓度染色缓冲剂组合物(1×)，其包含在生物缓冲剂中的20至40mg/mL、或约30mg/mL的聚合物染料的单体组分；0.2至0.8mg/mL、0.3至0.7mg/mL、或约0.5mg/mL的光漂白的聚合物染料；以及0.01％至10％或0.1％至4％的非离子表面活性剂。工作浓度组合物(1×)还可包含0.1至10mg/mL或0.5至5mg/mL的蛋白质稳定剂。

本公开内容提供了浓缩的染色缓冲剂组合物(10×)，其包含在生物缓冲剂中的200至400mg/mL、或约300mg/mL的聚合物染料的单体组分，2至8mg/mL、3至7mg/mL、或约5mg/mL的光漂白的聚合物染料，以及0.1％至40％或1％至20％的非离子表面活性剂。浓缩的组合物(10×)还可包含1至100mg/mL或2至50mg/mL的蛋白质稳定剂。

发现该组合物显著降低了多色染料缀合物组中的非特异性聚合物染料缀合物相互作用。这在FCA分析中通过将染色且裂解的全血样品与没有所述单体组分且没有所述光漂白的聚合物染料的情况下的相同样品比较得到证明。

提供了用于与至少一种荧光聚合物染料一起使用以用于对生物样品染色的组合物，所述荧光聚合物染料与结合配偶体缀合，所述组合物包含非离子表面活性剂和生物缓冲剂；其中所述组合物与不存在所述组合物的情况下的至少一种荧光聚合物染料缀合物相比，降低了所述至少一种荧光聚合物染料缀合物的非特异性结合。非离子表面活性剂可以是泊洛沙姆(poloxamer)。

提供了用于检测样品中分析物的方法，其包括：将至少一种或至少两种聚合物染料缀合物添加至根据本公开内容的染色缓冲剂组合物以形成聚合物染料缀合物组合物；使怀疑包含分析物的生物样品与聚合物染料缀合物组合物接触以与分析物形成荧光聚合物染料缀合物复合物；将可激发至少一种或至少两种荧光聚合物染料缀合物复合物的光源施加于样品；以及检测从荧光聚合物染料缀合物复合物发射的光。检测光可包括通过流式细胞术进行分析以获得第一流式细胞术图，其中当与包括使生物样品与不含非离子表面活性剂并且不含第一聚合物染料的非荧光组分的组合物接触而获得的第二流式细胞术图相比时，所述第一流式细胞术图表现出由以下组成的组中的一者或更多者：聚合物染料缀合物的非特异性相互作用降低；和聚合物染料缀合物的聚集减少。

生物样品可以是血液、骨髓、脾细胞、淋巴细胞、骨髓吸出物、尿液、血清、唾液、脑脊液、尿液、羊水、间质液、粪便、黏液、组织样品或细胞培养样品。生物样品可以是全血样品。

来自光源的光的波长可为约340nm至约800nm，或约340nm至约450nm。

本公开内容提供了包含根据本公开内容的染色缓冲剂组合物的试剂盒，其中所述试剂盒包含单独的容器，所述单独的容器包含所述第一聚合物染料的一种或更多种非荧光组分；和所述至少一种荧光聚合物染料缀合物。染色缓冲剂组合物可包含在包含一种或更多种非荧光组分的同一容器中的非离子表面活性剂。染色缓冲剂组合物可包含在一个容器中的第一聚合物染料的两种或更多种非荧光组分和任选地非离子表面活性剂；以及在单独容器中的至少一种荧光聚合物染料缀合物。

附图说明

图1示出了使用三种SuperNova(SNv)染料抗体缀合物CD56-SNv428、CD20-SNv605和CD4-SNv786的混合物的测试染色缓冲剂用染色且裂解的全血在预添加或没有预添加测试染色缓冲剂的情况下的FCA点印迹比较。对淋巴细胞(lymphocyte，LY)设门。如上面三幅图所示，在不存在测试染色缓冲剂的情况下可出现异常染色，并且数据可出现欠补偿。在存在包含光漂白的聚合物和聚合物染料的单体组分的测试染色缓冲剂的情况下，如下面三幅图所示，发生了显著降低的非特异性聚合物染料缀合物相互作用。

图2A示出了在没有染色缓冲组分的情况下，用三种SuperNova紫色聚合物染料缀合物(包括CD56-SNv428+CD19-SNv605+CD4-SNv786)的混合物的染色且裂解的全血样品的FCA点图。点图中的阳性和阴性细胞群体不对齐并看起来倾斜，表明非特异性聚合物染料的相互作用。

图2B示出了在商业对比染色缓冲剂存在的情况下，用三种SuperNova紫色聚合物染料缀合物(包括CD56-SNv428+CD19-SNv605+CD4-SNv786)的混合物的染色且裂解的全血样品的FCA点图。与图2A相比，略微降低的非特异性相互作用是明显的。

图2C示出了在具有泊洛沙姆非离子表面活性剂的生物缓冲剂中，用三种SuperNova紫色聚合物染料缀合物(包括CD56-SNv428+CD19-SNv605+CD4-SNv786)的混合物以及包含单体A和光漂白的染料428的根据本公开内容的测试染色缓冲剂的染色且裂解的全血样品的FCA点图。当与图2A相比时，测试染色缓冲剂组合物显示出降低的溢出(spillover)，并且与图2B中的现有技术对比缓冲剂相比，显示出略微降低的非特异性聚合物-聚合物相互作用。

图3示出了猝灭的聚合物的AFU相比于波长的荧光谱的图。聚合物1Dabcyl(QY0.01)、聚合物2Dabcyl(QY 0.005)、聚合物2DY425Q(QY 0.01)、聚合物3Dabcyl(QY 0.005)、聚合物3Dabcyl plus(QY 0.015)和聚合物3DY425Q(QY 0.009)。图3插图示出了代表性母体荧光聚合物(聚合物3QY 0.54)在与猝灭部分缀合以获得猝灭的聚合物之前和之后的图，该猝灭的聚合物在被405nm激光激发时表现出显著降低的荧光QY。QY是指量子产率(quantumyield)。

图4示出了在没有染色缓冲剂添加剂猝灭的聚合物的情况下，当对淋巴细胞设门时，在用两种聚合物染料缀合物CD4-紫外可激发聚合物染料(CD4-UVEPD)和CD20-紫色可激发聚合物染料(CD20-VEPD)(均为Beckman Coulter Life Sciences，左上图)的混合物以及两种聚合物染料缀合物CD4-BUV395(BD Biosciences)和CD20-VEPD(Beckman CoulterLife Sciences，右上图)的混合物进行染色之后，染色且裂解的全血样品的FCA点图(上排，从左至右)。当两种不同的染料缀合物在没有猝灭的聚合物的情况下混合时，点图显示出非特异性相互作用和相关的溢出。在用CD4-UVEPD和CD20-VEPD(左下图)、或BUV395-CD4和CD20-VEPD(右下图)染色期间，添加根据本公开内容的猝灭的聚合物(猝灭的聚合物2-DYQ425)降低了非特异性相互作用和溢出。

图5示出了在没有染色缓冲剂添加剂猝灭的聚合物的情况下，当对淋巴细胞设门时，在用两种聚合物染料缀合物CD4-紫外可激发聚合物染料(CD4-UVEPD)和CD20-紫色可激发聚合物染料(CD20-VEPD)(均为Beckman Coulter Life Sciences，左上图)以及两种聚合物染料缀合物CD4-BUV395(BD Biosciences)和CD20-VEPD(Beckman Coulter LifeSciences，右上图)的混合物进行染色之后，染色且裂解的全血样品的FCA点图(上排，从左至右)。当两种不同的染料缀合物在没有猝灭的聚合物存在的情况下混合时，点图显示出非特异性相互作用和相关的溢出。在用CD4-UVEPD和CD20-VEPD(左下图)、或BUV395-CD4和CD20-VEPD(右下图)染色期间，添加根据本公开内容的猝灭的聚合物(猝灭的聚合物2-Dabcyl)降低了非特异性相互作用和溢出。

图6示出了在用包含低效光漂白的染料(导致缀合物不期望的溢出)的组合物(左图)的情况下在制备的样品中SuperNova聚合物染料缀合物CD56-SNv428/CD4-SNv786的二维FCA点图。相比之下，右图示出了根据本公开内容的组合物的作用，所述组合物包含合适光漂白的染料，其当用405nm激光激发时，在10μg/mL下QY≤0.056且<47个AFU。缀合物的溢出显著降低。

图7示出了两种SuperNova聚合物染料缀合物CD3-SNv428/CD19-SNv605在添加至生物样品中之前在单独预配制有或没有单体A+聚Dabcyl添加剂的情况下的二维FCA点图。在没有添加剂的情况下(左图)，非特异性相互作用是明显的。在存在单体A+聚-Dabcyl添加剂的情况下(右图)，聚合物染料缀合物的非特异性相互作用显著降低。

图8示出了在不含猝灭的聚合物(左上)、含1％ PF-68(右上)、含10μg猝灭的聚合物2-Dabcyl(左下)、含10μg猝灭的聚合物2-Dabcyl和1％ PF-68非离子表面活性剂(右下)的血液样品中，用染料缀合物CD19-SNv428(Beckman Coulter Life Sciences)和CD4-BV650(BD Biosciences)的混合物的染色且裂解的细胞的FCA点图。与不含缓冲剂的对照样品(MFI 7804)相比，含10μg猝灭的聚合物2-Dabcyl(MFI 2172)和1％ PF-68(MFI 2400)的测试样品组合物显示出降低的非特异性结合。与对照样品相比，含10μg猝灭的聚合物2-Dabcyl和1％ PF-68(MFI 1327)的测试样品组合物表现出改善的降低的MFI、改善的降低的非特异性结合和改善的降低的聚合物-聚合物相互作用。

图9示出了在不含缓冲剂(上图)、含0.1％非离子表面活性剂(左下图)、0.5％非离子表面活性剂(中下图)和1％非离子表面活性剂(重量/体积)(右下图)的情况下用CD4-BV650(BD Biosciences)和CD19-SNv428(Beckman Coulter Life Sciences)的混合物的染色且裂解的细胞的FCA点图。提高浓度的非离子表面活性剂(0.1％至1％重量/体积)的存在与混合物中降低的溢出和非特异性相互作用有关，如与不含非离子表面活性剂的情况相比改善的分离所证明的。

图10示出了可用于在染色缓冲剂组合物中的FCA分析中降低非特异性相互作用和溢出的两种非荧光聚合物染料在415至700nm的发射光谱和量子产率的图。还示出了DHP-吡咯聚合物(QY 0.043)和DHP-硝基加帽聚合物(QY 0.092)的结构。

描述

现在将详细参考所公开主题的某些实施方案，其实例部分地在附图和实施例中举例说明。尽管将结合所列举的权利要求描述所公开的主题，但是应理解，示例性主题并不旨在将权利要求书限于所公开的主题。

本文中提供了用于(例如，在包含多种染料缀合物的多色组中)降低聚合物染料缀合物的非特异性相互作用的组合物和方法。所述组合物和方法可用于降低聚合物-聚合物相互作用，例如，所述聚合物-聚合物相互作用可导致在流式细胞术中到其他通道的提高的溢出。

本公开内容一般性地涉及设计成降低荧光聚合物染料缀合物之间的非特异性相互作用的染色缓冲剂、包含这样的聚合物的组合物以及使用包含与结合配偶体缀合的荧光聚合物(例如，与抗体缀合的聚合物染料，在本文中称为“聚合物染料缀合物”)的组合物来检测样品中分析物的方法。例如，根据本公开内容的组合物包含液体染色缓冲剂(其包含聚合物染料的至少一种或至少两种非荧光组分)、缓冲剂和任选地非离子表面活性剂。聚合物染料的非荧光组分可以是聚合物染料的一种或更多种单体组分、光漂白的聚合物染料和包含猝灭部分的聚合物染料。

例如，本文中所述的组合物可包含聚合物染料的单体组分和光漂白的聚合物染料；聚合物染料的单体组分和包含猝灭部分的聚合物染料；或光漂白的聚合物染料和非离子表面活性剂。根据本公开内容的组合物能够降低多色组中不同聚合物染料缀合物之间的非特异性聚合物-聚合物相互作用。

聚合物染料

本公开内容的染色缓冲剂组合物可包含聚合物染料的一种或更多种非荧光组分。非荧光组分可以是非荧光聚合物染料。聚合物染料的非荧光组分可以是包含猝灭部分的聚合物染料。聚合物染料的非荧光组分可以是光漂白的聚合物染料。聚合物染料的非荧光组分可以是聚合物染料的单体组分(“单体”)。在一些实施方案中，聚合物染料的非荧光组分不包含结合配偶体。在一些实施方案中，聚合物染料还包括聚合物串联染料。在一些实施方案中，聚合物染料还包括与官能部分缀合的聚合物染料。

本公开内容的组合物可与一种或更多种荧光聚合物染料缀合物一起使用。在一些实施方案中，聚合物染料还包括与结合配偶体缀合的聚合物染料。在一些实施方案中，聚合物染料还包括与官能部分缀合的聚合物染料。

荧光聚合物染料特别可用于化学和生物靶分析物的分析。由于它们包含多个发色团，因此它们是高度响应的光学报道子和有效的光吸收剂。

聚合物染料可包含任何先前所公开的或市售的荧光聚合物染料。例如，聚合物染料可以是在以下中所公开的任何染料：公开的PCT申请No.WO2022/013198；公开的PCT申请No.WO 2017/180998；美国申请No.2021/0047476；美国申请No.2020/0190253；美国申请No.2020/0048469；美国申请No.2020/0147615；美国申请No.2021/0108083；美国申请No.2019/0194467；美国申请No.2018/0364245；美国申请No.2018/0224460；美国专利No.11,034,840；美国专利No.11,119,107；美国专利No.10,962,546；美国专利No.10,920,082；美国专利No.10,001,475；美国专利No.10,107,818；美国专利No.10,228,375；美国专利No.10,844,228；美国专利No.10,604,657；美国专利No.10,545,137B2；美国专利No.10,533,092；美国专利No.10,472,521；美国专利No.10,240,000；美国专利No.9,758,625；美国专利No.9,719,998；美国专利No.7,214,489；美国专利美国专利No.9,012,643；美国专利No.8,623,332；美国专利No.8,431,416；美国专利No.8,354,239；美国专利No.8,575,303；美国专利No.8,969,509，其各自通过引用并入，如同以其整体在本文中充分阐述一样。聚合物染料可具有在公开的美国申请No.2020/0190253A1中公开的任何水溶性荧光聚合物染料的结构，该申请通过引用并入，如同以其整体在本文中充分阐述一样。聚合物染料缀合物可具有在公开的美国申请No.2019/0144601中所公开的任何水溶性荧光聚合物染料的结构，该申请通过引用并入，如同以其整体在本文中充分阐述一样。

聚合物染料可以是任何市售聚合物染料。在一些实施方案中，聚合物染料可由例如以下激发：紫外(例如，351nm、355nm、375nm、334至364nm、351至356nm)、紫色(例如，405nm、407nm、414nm、395至425nm)、蓝色(例如，436nm、458nm)、蓝绿色(例如，488nm)、绿色(例如，514nm、532nm、541nm、552nm)、黄绿色(例如，561nm、563nm)、黄色(例如568nm)、红色(例如，627至640nm、633nm、637nm、640nm、647nm)和/或近红外激光(例如，673nm、750nm、780nm或660至800nm)。聚合物染料可包含可由紫色激光激发的聚合物染料。聚合物染料或聚合物染料缀合物可包含可由波长为约395nm至约425nm，例如405nm、407nm或414nm的紫色激光激发的聚合物染料。聚合物染料或聚合物染料缀合物可包含紫色激光(405nm)可激发聚合物染料。在一些实施方案中，聚合物染料可以是非荧光聚合物染料。

在一些实施方案中，聚合物染料或聚合物染料缀合物可包含SuperNova聚合物染料(SN)(Beckman Coulter,Inc.)。SuperNova聚合物染料是可用于流式细胞术应用的新一代聚合物染料。聚合物染料或聚合物染料缀合物可包含SNv428、SNv605或SNv786。SNv428具有独特的光物理特性，当与抗体或其他结合配偶体缀合时，导致极其明亮的缀合物。例如，SNv428是一种聚合物染料，可由激发最大值为414nm、发射峰值为428nm的紫色激光(例如，405nm)最佳激发，并且可使用450/50带通滤光片或等效物进行检测。

SNv428是可由紫色激光激发的最亮染料之一，因此其特别适合于评估表达发暗的标志物。与抗体缀合的SuperNova聚合物染料可包含抗CD19抗体-SNv428、抗CD22抗体-SNv428、抗CD25抗体-SNv428和抗CD38抗体-SNv428抗体-聚合物染料缀合物。

SNv605和SNv786(Beckman Coulter,Inc.)是串联聚合物染料，其来源于核心SNv428。两者共有相同的吸光度特征，其中激发最大值在414nm下。由于SNv605和SNv786的发射峰分别在605nm和786nm下，因此使用流式细胞仪的610/20和780/60nm带通滤光片可对它们进行最佳检测。SNv605和SNv786可例如与结合配偶体(例如抗CD19抗体、抗CD22抗体、抗CD25抗体或抗CD38抗体)缀合。

聚合物染料可包含可由紫外(“UV”)激光激发的聚合物染料。聚合物染料或聚合物染料缀合物可包含可由波长为320nm至380nm、340nm至360nm、345nm至356nm、或者小于或等于380nm但大于或等于320nm的UV激光激发的聚合物染料。聚合物染料或聚合物染料缀合物可包含紫外可激发聚合物染料。紫外可激发聚合物染料或聚合物染料缀合物通常可发射波长为380nm至430nm、406nm至415nm、或者小于或等于430nm但大于或等于380nm的光。

聚合物染料可包含Brilliant Violet^TM染料(/Sirigen GroupLtd.)，例如Brilliant Violet 421^TM(激发最大值405nm，发射最大值421nm，450/50滤光片)、Brilliant Violet 510^TM(激发最大值405nm，发射最大值510nm，510/50滤光片)、Brilliant Violet 570^TM(激发最大值405nm，发射最大值570nm，585/42滤光片)、BrilliantViolet 605^TM(激发最大值405nm，发射最大值603nm，610/20滤光片)、Brilliant Violet650^TM(激发最大值405nm，发射最大值645nm，660/20滤光片)、Brilliant Violet711^TM(激发最大值405nm，发射最大值711nm，710/50滤光片)、Brilliant Violet 750^TM(激发最大值405nm，发射最大值750nm，780/60滤光片)、Brilliant Violet 785^TM(激发最大值405nm，发射最大值785nm，780/60滤光片)。

聚合物染料或聚合物染料缀合物可包括BD Horizon Brilliant^TMViolet(“BV”)聚合物染料(Becton,Dickinson and Co.,BD Life Sciences)。聚合物染料可以是BDHorizon Brilliant^TMBV421(450/40或431/28滤光片)、BV480(525/40滤光片)、BV510(525/40滤光片)、BV605(610/20滤光片)、BV650(660/20滤光片)、BV711(710/50滤光片)、BV786(786/60滤光片)。

聚合物染料可通过单体聚合来合成制备，这导致形成高度缀合的荧光骨架。可使用合适的官能度通过活化在聚合物上进行加帽，这导致聚合物能够与结合配偶体缀合。或者，可通过在聚合物主链外连接合适的官能度来活化聚合物以用于缀合或连接接受体染料。经活化的聚合物可例如与结合配偶体、接受体染料或猝灭部分缀合。可使用任何合适的结合配偶体(例如抗体)，然后例如通过使用标准操作进行纯化。官能团可选自胺、氨基甲酸盐/酯(carbamate)、羧酸、羧酸酯(carboxylate)、马来酰亚胺、经活化酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔烃、醛、硫醇及其被保护基团以用于与底物或结合配偶体缀合。

聚合物染料可包含具有芳基和/或杂芳基单体亚基的荧光聚合物染料，包括但不限于二氢菲(dihydrophenanthrene，DHP)、芴及其组合。在一些实施方案中，聚合物染料可具有式I的结构：

其中，

每个单体A独立地是芳族共聚单体

或杂芳族共聚单体；

每个任选的M是芳族共聚单体或杂芳族共聚单体；每个任选的L是接头；

每个G¹和G²是经修饰的聚合物末端或未经修饰的聚合物末端；

每个a是10％至100％的mol％，每个c是0至90％的mol％，并且每个d是0至25％的mol％；每个b独立地是0或1；并且每个m是1至约10,000的整数。

如在本公开内容通篇所使用的，“a”、“b”、“c”和“d”限定了每个单元的mol％，每个单元可均匀地或随机地重复。

每个单体A可被水溶性基团和/或任选的官能团取代，其可与例如接受体染料、结合配偶体或猝灭部分缀合。具有式I结构的聚合物中的每个单体A可以是相同的单体。具有式I结构的聚合物染料中的每个单体A可以是不同的单体。单体A可以是例如基于9,10-菲二酮的单体(例如，基于二氢菲(DHP)的单体)、基于芴的单体、基于芴并氧杂(fluorenooxepine)的单体。

单体A可以是基于DHP的单体、基于芴的单体、或咔唑单体，其具有例如式(II)的结构：

如本文中所使用的，每个“X”可独立地是C、N或Si。

如本文中所使用的，每个“Y”独立地选自CH₂、CR¹R²、SiR¹R²或键。当Y是键时，X与两个环直接键合。

如在本公开内容通篇所使用的，每个“R¹”独立地是水溶性部分、烯烃、炔烃、环烷基、卤代烷基、(杂)芳氧基、(杂)芳基氨基、PEG、羧酸、烷基铵盐、烷基氧基铵盐、寡聚醚铵盐、烷基磺酸盐、烷氧基磺酸盐、寡聚醚磺酸盐、磺酰胺基寡聚醚、磺酰胺、亚磺酰胺、膦酰胺酸酯、次膦酰胺、

如本文中所使用的，每个“R²”独立地是水溶性部分、接头部分、H、烷基、烯烃、炔烃、环烷基、卤代烷基、(杂)芳氧基、(杂)芳基氨基、磺酰胺-PEG、膦酰胺-PEG、烷基铵盐、烷氧基铵盐、寡聚醚铵盐、烷基磺酸盐、烷氧基磺酸盐、寡聚醚磺酸盐、磺酰胺基寡聚醚、磺酰胺、亚磺酰胺、膦酰胺酸酯、次膦酰胺、

如本文中所使用的，每个“R³”可独立地是水溶性部分。每个“R³”可以独立地是H、烷基、烯烃、炔烃、环烷基、卤代烷基、烷氧基、(杂)芳基氧基、芳基、(杂)芳基氨基或PEG基团。

如本文中所使用的，每个“R⁴”独立地是H、烷基、PEG、水溶性部分、接头部分、发色团、羧酸胺、胺、氨基甲酸盐/酯、羧酸、羧酸酯、马来酰亚胺、经活化酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔烃、醛、或硫醇、或其被保护基团。

如本文中所使用的，每个“R⁷”是H、羟基、C₁-C₁₂烷基、C₂-C₁₂烯烃、C₂-C₁₂炔烃、C₃-C₁₂环烷基、C₁-C₁₂卤代烷基、C₁-C₁₂烷氧基、C₂-C₁₈(杂)芳基氧基、C₂-C₁₈(杂)芳基氨基、C₂-C₁₂羧酸、C₂-C₁₂羧酸酯或C₁-C₁₂烷氧基。

如本文中所使用的，每个“Q”独立地是键、NR⁴或-CH₂。

如本文中所使用的，每个“Z”独立地是CH₂、O或NR⁴。

如本文中所使用的，在一些情况下，R¹、R²、R³或R⁴中的至少一者包含水溶性部分。

如本文中所使用的，每个f独立地是0至50、1至50、2至40、5至20的整数；并且每个n独立地是1至20的整数。

基于DHP的单体A可例如具有式(III)的结构：

DHP单体可例如具有式(IV)的结构：

具有式I的结构的聚合物中的单体A可以是基于芴的单体或基于咔唑的单体，例如，具有式(Va)或(Vb)的结构，其中X分别是C或N：

单体A也可以是桥接单体。例如，桥接单体可以具有式(VIa)、(VIb)或(VIc)的结构：

具有式I的结构的聚合物中的单体A可以是基于氧杂的单体(例如，基于芴并氧杂的单体)，例如，其具有式(VIIa)、(VIIb)或(VIIc)的结构：

具有式I的结构的聚合物中的单体A可以是在WO 2022/013198(其通过引用整体并入本文)中所述的联萘单体。基于联萘的单体可具有式(VIId)：

具有式I的结构的聚合物中的每个任选的M可以是沿聚合物链均匀或随机分布的聚合物改性单元，并且可任选地被一个或更多个任选经取代的R¹、R²、R³或R⁴基团取代，如本文中所限定的。

每个任选的M可以是任选经取代的亚乙基或亚乙炔基。每个M可以是任选经取代的亚乙基部分，即，具有式-CR＝CR-的碳-碳双键，其中每个R独立地是H、烷基、烯基、炔基、环烷基、卤代烷基、烷氧基、(杂)芳基氧基、芳基、(杂)芳基氨基、PEG基团、烷基铵盐、烷氧基铵盐、寡聚醚铵盐、烷基磺酸盐、烷氧基磺酸盐、寡聚醚磺酸盐、磺酰胺基寡聚醚或部分

每个M可以是亚乙炔基部分，即，具有式-C≡C-的碳-碳三键。

每个任选的M可沿聚合物主链均匀或随机分布。每个任选的M可以是带隙改性单体。每个任选的M可独立地是：

其中，每个M可以是经取代的，并且被选自以下的官能团封端：胺、氨基甲酸盐/酯、羧酸、羧酸酯、马来酰亚胺、经活化酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔烃、醛、硫醇、酰胺、磺酰胺、醚、硫醚、硫代氨基甲酸酯、羟基、碘乙酰基、酰肼基(hydrazido)、肼基、酮、膦、环氧化物、脲、硫脲、硫酯、亚胺、二硫化物及其被保护基团，以用于与另一种底物、接受体染料、分子或结合配偶体缀合。

如本文中所使用的，每个“R⁵”独立地是H、C₁-C₂₀烷基、C₂-C₂₀烯基、C₂-C₂₀炔基、C₃-C₂₀环烷基、C₁-C₂₀卤代烷基、C₁-C₂₀烷氧基、C₂-C₂₆芳基氧基、C₂-C₂₆杂芳氧基、C₂-C₂₆芳基氨基、或C₂-C₂₆杂芳基氨基。

具有式I的结构的聚合物中的每个任选的L是接头。每个L可以是沿聚合物主链均匀或随机分布的芳基或杂芳基。L可以是沿着聚合物主链均匀或随机分布的芳基或杂芳基，并且可任选地被一个或更多个侧链(pendant chain)取代，所述侧链被用选自以下的官能团封端：胺、氨基甲酸盐/酯、羧酸、羧酸盐/酯、马来酰亚胺、经活化酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔烃、醛、硫醇、及其被保护基团，以用于与结合配偶体缀合。每个任选的L可独立地是

如本文中所使用的，每个R⁶独立地是H、OH、SH、NHCOO-叔丁基、(CH₂)_nCOOH、(CH₂)_nCOOCH₃、(CH₂)_nNH₂、(CH₂)_nNH-(CH₂)_n-CH₃、(CH₂)_nNHCOOH、(CH₂)_nNHCO-(CH₂)_n-CO-(CH₂)_n-CH₃、(CH₂)_nNHCOO-(CH₂)_n-CH₃、(CH₂)_nNHCOOC(CH₃)₃、(CH₂)_nNHCO(C₃-C₁₂)环烷基、(CH₂)_nNHCO(CH₂CH₂O)_f、(CH₂)_nNHCO(CH₂)_nCOOH、(CH₂)_nNHCO(CH₂)_nCOO(CH₂)_nCH₃、(CH₂)_n(OCH₂CH₂)_fOCH₃、N-马来酰亚胺、卤素、C₂-C₁₂烯烃、C₂-C₁₂炔烃、C₃-C₁₂环烷基、C₁-C₁₂卤代烷基、C₁-C₁₂(杂)芳基、C₁-C₁₂(杂)芳基氨基、任选地被一个或多个卤素取代的苄基、羟基、C₁-C₁₂烷氧基或(OCH₂CH₂)_fOCH₃、

每个G¹和G²可独立地是氢、卤素、炔烃、任选经取代的芳基、任选经取代的杂芳基、卤素取代的芳基、甲硅烷基、重氮盐、三氟甲磺酸盐/酯、乙酰氧基、叠氮化物、磺酸盐/酯、磷酸盐/酯、硼酸取代的芳基、硼酸酯取代的芳基、硼酸酯、硼酸、任选经取代的二氢菲(DHP)、任选经取代的四氢芘(THP)、任选经取代的芴、或芳基或杂芳基，其被一个或更多个侧链取代，所述侧链被可与底物或结合配偶体缀合的选自以下的官能团封端：胺、氨基甲酸盐/酯、羧酸、羧酸酯、马来酰亚胺、经活化酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔烃、醛、硫醇及其被保护基团。每个G¹和G²可独立地是

加帽单元可通过本领域已知的机制和如在美国公开申请No.2019/0144601和美国公开申请No.2020/0190253(其二者均以其整体并入)中所教导的那样与本发明的聚合物骨架缀合。

具有式(I)的结构的聚合物染料可利用二氢菲(DHP)、芴、咔唑和/或联萘单体，以及DHP、芴、咔唑和/或联萘单体的组合。具有式(I)的结构的聚合物染料可利用具有根据式(II)的结构的单体A，其中每个“X”可独立地是C、N或Si，并且每个“Y”可独立地是CH₂、CR¹R²、SiR¹R²或键。当Y是键时，X与两个环直接键合。

例如，聚合物染料可具有式(VIII)的结构：

聚合物染料可具有式(IX)的结构：

在一些情况下，聚合物可具有式(X)的结构：

在一些情况下，聚合物可具有式(XI)的结构：

在一些情况下，聚合物是共聚物并具有式(XII)的结构：

在一些情况下，聚合物是共聚物并具有式(XIII)的结构：

在一些情况下，聚合物是共聚物并具有式(XIV)的结构：

其中：

每个B独立地选自芳族共聚单体、杂芳族共聚单体、带隙改性单体、任选经取代的亚乙基、和亚乙炔基；

每个E是独立选择的发色团、官能部分或结合配偶体；

下标n和m独立地是1至10,000的整数；

下标p是0至10,000的整数；并且

下标n、m和p之和的范围为2至10,000；并且

每个t是1至20的整数。

本文中所述的聚合物的特征在于最小数均分子量(Mn)大于5,000g/mol、大于10,000g/mol、大于15,000g/mol、大于20,000g/mol、大于25,000g/mol、大于30,000g/mol、大于40,000g/mol、大于50,000g/mol、大于60,000g/mol、大于70,000g/mol、大于80,000g/mol、大于90,000g/mol或大于100,000g/mol。

本文中所述的聚合物的特征在于最小重均分子量(Mw)大于5,000g/mol、大于10,000g/mol、大于15,000g/mol、大于20,000g/mol、大于25,000g/mol、大于30,000g/mol、大于40,000g/mol、大于50,000g/mol、大于60,000g/mol、大于70,000g/mol、大于80,000g/mol、大于90,000g/mol或大于100,000g/mol。

术语“Mw”是指重均分子量，并且“Mn”是指数均分子量。数均分子量和重均分子量值可通过凝胶渗透色谱(gel permeation chromatography，GPC)使用聚合物标准品(例如，聚苯乙烯或类似物质)来确定。

缀合的聚合物

具有式(I)的结构的聚合物可与接受体染料、官能团(包括猝灭部分)和/或结合配偶体缀合。缀合可发生在聚合物上的不同位置处，例如式(I)的聚合物结构中的单体A、L、G1或G2。

例如，如美国公开申请No.2019/0144601(其通过引用整体并入本文)中所述的，接受体染料可通过接头L与聚合物连接：

串联聚合物染料和其他官能化聚合物可通过在聚合之后修饰聚合物中间体来制备，如在美国公开申请No.2020/0190253中所述，其通过引用整体并入本文。例如，具有式(XVI)的增溶侧基可与单体A连接：

并转化为根据式(XVII)的官能化增溶基团：

其中W是水溶性部分，并且L¹和L²是连接部分。在一些情况下，具有式(XVI)的结构的L1-W基团可以是R¹或R²。在一些实施方案中，每个E是独立选择的发色团、官能部分(例如猝灭部分)或结合配偶体。在一些实施方案中，每个E是独立选择的发色团(例如，和独立选择的荧光团)。在一些实施方案中，聚合物中的所有E部分具有相同的结构。在一些实施方案中，聚合物中的E部分具有不同的结构。根据式(XVI)和式(XVII)的基团中的水增溶部分W可以是例如烷基铵盐、烷氧基铵盐、寡聚醚铵盐、烷基磺酸盐、烷氧基磺酸盐、寡聚醚磺酸盐、寡聚醚磺酰氨基、寡聚(乙二醇)或聚(乙二醇)。

连接部分L¹和L²可独立地是，但不限于共价键、C_1-8亚烷基、2至8元亚杂烷基。在一些实施方案中，接头是单原子、直链、支链、环状部分。在一些实施方案中，接头是长度为2至100个主链原子(例如碳原子)(例如长度为2至50个主链原子或长度为2至20个原子主链原子)的链。在某些情况下，接头主链的一个、两个、三个、四个或五个或更多个碳原子可任选地被硫、氮或氧替代。主链原子之间的键可以是饱和的或不饱和的；通常来说，在接头主链中将存在不多于一个、两个或三个不饱和键。接头可包含一个或更多个取代基(例如，烷基或芳基)。接头可包括但不限于寡聚(乙二醇)；醚；硫醚；叔胺；和亚烷基(即，二价烷基基团)，其可以是直链或支链。接头主链可包含环状基团，例如二价芳基基团、二价杂环基团或二价环烷基基团，其中环状基团的2个或更多个原子(例如2、3或4个原子)包含在主链中。

L¹可包含磺酰胺、亚磺酰胺、二磺酰胺、二亚磺酰胺、磺内酰胺、酰胺、仲胺、膦酰胺(phosphonamide)、次膦酰胺、膦酰胺酸酯(phosphonamidate)、硒酰胺或亚硒酰胺。在一些实施方案中，L¹包含磺酰胺、酰胺、仲胺或膦酰胺。在一些这样的实施方案中，L²包含直链或支链、饱和或不饱和的C_1-30亚烷基；其中C_1-30亚烷基中的一个或更多个碳原子任选且独立地被O、S、NR^a替代；其中C_1-30亚烷基中的两个或更多个相邻碳原子的基团任选地且独立地被-NR^a(CO)-或-(CO)NR^a-替代；并且其中每个R^a独立地选自H和C_1-6烷基。

聚合物可通过以下官能化：在第一步骤中将根据式(XVI)的增溶侧基中的L¹的内部位置与接头部分L²的第一末端共价键合，并随后在第二步骤中将染料或其他官能团或结合配偶体E与接头部分L²的第二末端共价键合。在一些实施方案中，使用在接头部分的第一末端具有合适离去基团的接头部分L²使L¹(例如，酰胺氮、磺酰胺氮或膦酰胺氮)中的氮原子烷基化。在一些实施方案中，例如，离去基团是卤素(例如，氯、溴或碘)。在一些实施方案中，离去基团是磺酸酯(即，-OS(O)₂R，其中R是烷基、卤代烷基、芳基或经取代的芳基)。合适的磺酸酯包括但不限于甲磺酸酯(甲烷磺酸酯)、三氟甲磺酸酯(三氟甲烷磺酸酯)、苯磺酸酯(苯-磺酸酯)、甲苯磺酸酯(对甲苯磺酸酯)和对溴苯磺酸酯(4-溴苯磺酸酯)。

在用基团E进行聚合物官能化期间，任何合适的溶剂均可用于烷基化步骤。合适的溶剂包括但不限于甲苯、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、四氢呋喃、苯、氯仿、二乙醚、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、石油醚、及其混合物。烷基化反应通常在约25℃至约100℃的温度下进行足以在聚合物中的一个或更多个侧基上安置连接部分L²或连接的官能团-L²-E的时间。根据反应中使用的聚合物和试剂，反应可进行几分钟至数小时或更长的时间段。例如，反应可在约40℃、或约50℃、或约60℃、或约70℃、或约80℃下进行约10分钟、或约30分钟、或约1小时、或约2小时、或约4小时、或约8小时、或约12小时。

连接部分L²的第二末端可包含官能团(例如胺或羧酸)，该官能团在第一步骤(例如，烷基化步骤)中以被保护形式使用，并随后在将染料或其他官能团或结合配偶体E与连接部分的第二末端共价键合之前使其去保护。胺保护基的一些实例包括但不限于苄基氧基羰基；9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)；叔丁氧基羰基(Boc)；烯丙基氧基羰基(Alloc)；对甲苯磺酰基(Tos)；2,2,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰基(Pmc)；2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)；2,4,6-三甲苯基-2-磺酰基(Mts)；4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯基磺酰基(Mtr)；乙酰胺基；苯二甲酰亚氨基(phthalimido)；等。可使用如例如由Green and Wuts(Protective Groups in Organic Synthesis,第4版2007,Wiley-Interscience,NewYork)描述的已知技术将胺、羧酸、醇和其他官能团的这些和其他保护基添加至本公开内容的聚合物和从本公开内容的聚合物中去保护。

添加染料、结合配偶体和官能团(例如，如猝灭部分)可使用任何合适的方法进行。例如，在羧酸盐/酯官能化的染料与L²的去保护的伯胺基团之间形成酰胺键。染料可以以经活化形式使用，例如，可使用E-C(O)X’作为试剂，其中X’是离去基团。活化的经羧酸官能化试剂包括但不限于：酸酐(包括对称的酸酐、混合的酸酐或环状的酸酐)、经活化酯(例如，对硝基苯基酯、五氟苯基酯、N-琥珀酰亚胺基酯等)、酰基唑(例如，使用羰基二咪唑制备的酰基咪唑等)、酰基叠氮化物和酰卤(例如，酰氯)。或者，可使用偶联剂以在经羧酸官能化的生色团E-C(O)OH与L²的去保护的伯胺基团之间形成键酰胺键联。偶联剂可用于在与聚合物胺基反应之前形成活化的染料试剂。可使用任何合适的偶联剂。在一些实施方案中，偶联剂是碳二亚胺、胍盐、盐或脲盐。碳二亚胺的一些实例包括但不限于，N,N′-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)等。盐的一些实例包括但不限于，例如，(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基六氟磷酸盐(PyBOP)、溴三(二甲基氨基)六氟磷酸盐(BroP)；等。胍盐/脲盐的一些实例包括但不限于，N,N,N’,N’-四甲基-O-(N-琥珀酰亚胺基)脲四氟硼酸盐(TSTU)；O-(苯并三唑-1-基)--N,N,N’,N’-四甲基-脲六氟磷酸盐(HBTU)；2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基-脲六氟磷酸盐(HATU)；1-[(1-(氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基-氨基氧基)二甲基氨基吗啉代)]脲六氟磷酸盐(COMU)；等。如上所述，溶剂、反应时间和其他反应条件可根据因素例如具体聚合物和染料/官能团的性质而变化。

例如，添加染料、结合配偶体、官能团和猝灭部分可包括将根据式(XVIIIa)的聚合物：

转化成根据式(XVIII)的聚合物：

其中：

每个A独立地是芳族共聚单体或杂芳族共聚单体；

每个L1^a独立地选自共价键、C_1-8亚烷基、C_1-8烷氧基、2至8元亚杂烷基、-NHC(O)L^a-、-C(O)NHL^a-和-C(O)L^a-；

L²选自共价键、C_1-8亚烷基、2至8元亚杂烷基、-L^bNHC(O)-、-L^bC(O)NH-、-L^bC(O)-、-C(O)NHL^b-和-C(O)L^b-；

L^a和L^b独立地选自C_1-8亚烷基和2至8元亚杂烷基；

W是水溶性部分；

每个E是独立选择的发色团、官能部分、猝灭部分或结合配偶体；

每个B独立地选自芳族共聚单体、杂芳族共聚单体、带隙改性单体、任选经取代的亚乙基、和亚乙炔基；

G¹和G²独立地选自未经修饰的聚合物末端和经修饰的聚合物末端；

R⁸选自如上所限定的R¹、H或胺保护基；

下标n和m独立地是1至10,000的整数，

下标p是1至10,000的整数，并且

下标n、m和p之和的范围为2至10,000；

下标q是1、2、3或4；

下标r是1、2、3或4；

下标s是0、1、2或3；

下标t是1或2；并且

A和B在荧光聚合物中随机或非随机分布。

将式(XVIIIa)的聚合物转化为根据式(XVIII)的聚合物可包括如上所述的一个或更多个烷基化步骤或者一个或更多个酰胺形成步骤。

在一些实施方案中，聚合物染料缀合物是根据式(XIX)的串联染料缀合物：

任何合适的发色团或荧光团可用于聚合物官能化。一般而言，合适的发色团和荧光团具有反应性基团(例如，羧酸酯/盐部分、氨基部分、卤代烷基部分等)，其可与增溶侧基共价键合(例如，通过如上所述的连接部分L²)。合适的发色团和荧光团的一些实例包括但不限于在美国专利

No.7,687,282；7,671,214；7,446,202；6,972,326；6,716,979；6,579,718；6,562,632；6,399,392；6,316,267；6,162,931；6,130,101；6,005,113；6,004,536；5,863,753；5,846,737；5,798,276；5,723,218；5,696,157；5,658,751；5,656,449；5,582,977；5,576,424；5,573,909；和5,187,288中描述的那些，这些专利通过引用整体并入本文。聚合物染料和单体也描述于美国2020/0190253中，其通过引用整体并入本文。

例如，E可以是FITC、CY3B、Cy55、Alexa 488、Texas red、Cy5、Cy7、Alexa 750或800CW。

例如，发色团E可以是具有以下结构的硼-二吡咯亚甲基部分：

其中

R^6a、R^6b、R^6c、R^6d、R^6e、R^6f和R^6g中的六个独立地选自H、卤素、C_1-6烷基、C_3-8环烷基、C_6-10芳基、C_7-16芳基烷基、C_1-6酰基和-SO₃H；并且其中R^6a、R^6b、R^6c、R^6d、R^6e、R^6f和R^6g中的一个是连接部分-L²-。R^6a和R^6c可独立地选自C_1-6烷基(例如，甲基或乙基)，并且R^6e、R^6f和R^6g中的一个是连接部分-L²-。在一些实施方案中，R^6a和R^6c是甲基并且R^6g是连接部分-L²。

发色团E可以是具有以下结构的菁部分：

其中：

R^6h和R⁶ⁱ独立地选自H、C_1-6烷基、(CH₂)_tCOOH、(CH₂)_tSO₃H和连接部分L²；

每个下标t独立地是1至10的整数；

R^6j和R^6k独立地选自H、卤素、C_1-6烷基、任选经取代的稠合C_6-10芳基(例如，任选经取代的苯并)、-SO₃H、-PO₃H₂、-OPO₃H₂、-COOH和连接部分L^2-；

每个Y独立地选自O、S、C(R^6l)₂、-CH＝CH-和NR^6l，其中每个R^6l独立地是H或C_1-6烷基；并且

下标n是1至6的整数，前提是R^6h、R⁶ⁱ、R^6j和R^6k中有且仅有一个是连接部分-L²-。

发色团E可以是具有以下结构的香豆素部分：

其中：

W是N或CR^6p；

Z是O、S、或NR^6q；并且

R^6m、R⁶ⁿ、R^6o、R^6p各自独立地选自H、卤素、C_1-6烷基、-CN、-CF₃、-COOR^3v、-CON(R^3V)₂、-OR^3v和连接部分-L²-；

R⁶ⁿ选自-OR^3v和-N(R^3v)₂

每个R^6q独立地选自H、C_1-6烷基和连接部分-L²-；前提是R^6m、R⁶ⁿ、R^6o、R^6p和R^6q中有且仅有一个是连接部分-L²-。

发色团E可以是具有以下结构的呫吨部分：

其中：

T选自O、S、C(R^6u)₂和NR^6u；U是O或N(R^6u)₂；

每个R^6r独立地选自H、卤素、C_1-6烷基、-SO₃H和连接部分-L²-；

R^6s选自H、-OH、-OR^6u、-N(R^6u)₂和连接部分-L²-；

R^6t选自H、C_1-6烷基、R^6v和连接部分-L²-；

每个R^6u独立地是H或C_1-6烷基；并且

R^6v选自：

其中：

每个R^6w独立地选自H和连接部分-L²-；

前提是R^6r、R^6s、R^6t和R^6v中有且仅有一个是连接部分-L²-。

呫吨部分可以是荧光素，其中T和U是O；R^6s是OH，并且R^6t是：

呫吨部分可以是曙红，其中T和U是O；R^6s是OH，每个R^6r是卤素(例如，溴)，并且R^6t是：

呫吨部分可以是罗丹明，其中T和U是O；U是N(R^6u)₂(例如，＝NH₂ ⁺)；R是-N(R^6u)₂(例如，-NH₂)，并且R^6t是：

呫吨部分可以是罗丹明，其具有以下结构：

其中R^6v选自：

一个R^6w为H，并且另一个R^6w是连接部分-L²-。

除生色团之外，其他官能部分也可使用本文中提供的方法附接至经官能化聚合物。例如，官能部分“E”可以是生物素、地高辛配基、肽标签(例如FLAG肽)、寡核苷酸或多核苷酸。本文中使用的术语“FLAG肽”是指包含氨基酸序列Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(即，DYKDDDDK)的寡肽或多肽。例如，在Hopp等人的美国专利No.4,703,004中描述了FLAG肽及其变体，该专利通过引用并入本文。可用于替代FLAG肽的另外的肽包括但不限于包含序列Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala的HA肽标签(即，YPYDVPDYA)、包含序列His-His-His-His-His-His的His₆肽标签(即，HHHHHH)、以及包含序列Glu-Gln-Lys-Leu-lle-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu的Myc肽标签(即，EQKLISEEDL)。肽标签可被抗体或其他结合部分识别，以与比色试剂、化学发光试剂等一起使用以便于确定和/或定量。核苷酸(例如，RNA、单链DNA或双链DNA)可被互补引物或其他互补核苷酸识别，如例如在WO 2016/019929(Navratil.，et al)中所述的，该出版物通过引用并入本文。本文中使用的术语“地高辛配基”是指3-[(3S，5R，8R，9S，10S，12R，13S，14S，17R)-3，12，14-三羟基-10，13-二甲基-1，2，3，4，5，6，7，8，9，11，12，15，16，17-十四氢环戊[a]-菲-17-基]-2H-呋喃-5-酮(CAS登记No.1672-46-4)及其经取代的类似物。本文中使用的术语“生物素”是指5-[(3aS，4S，6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基]戊酸(CAS登记No.58-85-5)及其经取代的类似物。

聚合物染料可与不同特异性的结合配偶体(例如，靶分析物特异性抗体)缀合，以合成结合配偶体-染料缀合物，例如CD19-SN v428、CD20-SN v605等。

本文中使用的“结合配偶体”是指能够与靶分析物特异性结合的任何分子或分子复合物。例如，结合配偶体可以是例如蛋白质(例如，抗体或抗原结合抗体片段)、有机小分子、碳水化合物(例如，多糖)、寡核苷酸、多核苷酸、脂质、亲和配体、适配体等。在一些实施方案中，结合配偶体是抗体或其片段。在一些实施方案中，结合配偶体是特异性结合靶分析物的抗体或其抗原结合片段。在本发明的上下文中，特异性结合是指在异质群体存在的情况下确定靶分析物存在的结合反应。因此，在某些测定条件下，特定结合配偶体与特定蛋白质或特定蛋白质的同种型优先结合，而不以显著的量与样品中存在的其他蛋白质或其他同种型结合。

在一些情况下，抗体包括静脉内免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin，IVIG)和/或来自IVIG(例如，从IVIG富集、从IVIG纯化，例如，从IVIG亲和纯化)的抗体。IVIG是血液制品，其包含从许多(例如，有时多于1,000至60,000个)正常和健康血液供体的血浆(例如，在一些情况下不含任何其他蛋白质)中合并的IgG(immunoglobulin G)(免疫球蛋白G)。IVIG是市售的。IVIG的一些方面描述于例如美国专利申请No.2010/0150942；2004/0101909；2013/0177574；2013/0108619；和2013/0011388中，所述申请通过引用并入本文。

当结合配偶体是抗体时，它们可以是单克隆或多克隆抗体。本文使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)分子的免疫活性部分，例如，其与靶分析物中的抗原特异性结合。这样的抗体包括但不限于多克隆、单克隆、单特异性多克隆抗体、抗体模拟物、嵌合抗体、单链抗体、Fab、Fab’和F(ab’)₂片段、Fv和Fab表达文库。在一些情况下，抗体是限定亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4、IgA、IgD、IgE、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM)的单克隆抗体。如果使用抗体的组合，抗体可来自相同的亚类或不同的亚类。例如，抗体可以是IgG1抗体。在一些实施方案中，单克隆抗体是人源化的。抗体片段可包含分子，例如Fab、scFv、F(ab’)₂和Fab’分子。抗体衍生物包括具有添加或替换的抗体或其片段，例如嵌合抗体。抗体可通过重组方法或本领域已知的任何其他方式来源于人或动物来源、来源于杂交瘤。

除抗体或靶分析物特异性抗体片段或衍生物之外的结合配偶体也可用于本系统和方法中。例如，结合配偶体可以是核酸或核酸类似物，例如寡核苷酸或PNA探针。在一个实施方案中，适配体可用作特异性结合配偶体。适配体是单链DNA或RNA(ssDNA或ssRNA)分子，其可以以高亲和力和特异性与预选择的靶标(包括蛋白质和肽)结合。也可使用可与靶分析物结合形成接纳体-配体对、酶-底物对、酶-抑制剂对和酶-辅因子对的其他结合配偶体。这样的结合配偶体对的一些具体实例包括碳水化合物和凝集素、生物素和亲和素或链霉亲和素、叶酸和叶酸结合蛋白、维生素B12和内因子、蛋白A和免疫球蛋白以及蛋白G和免疫球蛋白。还包括与靶分析物形成共价键的结合配偶体。

聚合物染料缀合物可包含使用本领域技术人员已知的技术与结合配偶体缀合的任何已知聚合物染料。在一些实施方案中，可使用美国公开申请No.2020/0190253中描述的核心聚合物的直接改性方法将聚合物染料与结合配偶体缀合以形成聚合物染料缀合物，所述申请通过引用整体并入本文。

在一些情况下，可使用美国公开申请No.2019/0144601中描述的方法将聚合物染料与结合配偶体缀合以形成聚合物染料缀合物，所述申请通过引用整体并入本文。所述方法可描述如下：

靶分析物

本公开内容还涉及用于检测样品中的靶分析物的方法，其中靶分析物包括靶抗原，并且可以是物质(例如分子)，其丰度/浓度由一些分析操作确定。本发明旨在检测特定靶分析物的存在，并且在一些情况下检测靶分析物的数量。术语“靶分析物”是指包含生物样品中待检测靶抗原的靶分子，例如肽、蛋白质、多核苷酸、有机分子、糖和其他碳水化合物、脂质和小分子。本公开内容的一个重要方面是靶分析物包含在液体样品中，并且是可接近的，或者在某一点上是可接近的，以结合本发明的靶分析物特异性结合配偶体。靶分析物可存在于生物样品中，例如血液样品、细胞系发育样品、组织培养样品等。

靶分析物可以是例如核酸(DNA、RNA、mRNA、tRNA或rRNA)、肽、多肽、蛋白质、脂质、离子、单糖、寡糖、多糖、脂蛋白、糖蛋白、糖脂或其片段。靶分析物可以是蛋白质，并且可以是例如结构微丝、微管和中间丝蛋白、细胞器特异性标志物、蛋白酶体、跨膜蛋白、表面受体、核孔蛋白、蛋白质/肽移位酶、蛋白质折叠伴侣、信号传导支架、离子通道等。所述蛋白质可以是可活化的蛋白质或者在患病或异常细胞中差异表达或活化的蛋白质，包括但不限于转录因子、DNA结合和修饰蛋白质和/或RNA结合和修饰蛋白质、核输入和输出受体、凋亡或存活调节剂等。

靶分析物可在细胞表面上存在并可接近。有用的分析物的举例说明性的一些实例包括但不限于以下：1)特定的细胞表面大分子和抗原(包括激素、蛋白质复合体和由细胞受体识别的分子)和2)透化细胞中的细胞蛋白质、DNA或RNA，包括异常的DNA或RNA序列或异常量的某些信使RNA。这些分析物在包含在稀有细胞中和/或它们是稀有细胞的标识子的情况下，例如存在于多种癌症的早期的情况下，这些分析物的检测可以是特别有用的。

在一些实例中，靶分析物可以是CD2、CD3、CD4、CD8、CD10、CD11c、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD25、CD27、CD38、CD45、CD45RA、CD56、CD62L、CD64、CD95、CD103、HLA-DR、IFN-α、IFN-β、TNF-α或ZAP-70、或其他目的靶分析物。

聚合物染料的非荧光组分

根据本公开内容的组合物可包含聚合物染料的至少一种或至少两种非荧光组分。聚合物染料的非荧光组分可选自聚合物染料的单体组分、非荧光聚合物染料、光漂白的聚合物染料和包含猝灭部分的聚合物染料。在一些实施方案中，聚合物染料的非荧光组分不包含结合配偶体。

聚合物染料的单体组分

本文所述的组合物除其他组分外，还包含本文所述的聚合物染料的单体组分(本文也称“单体”，例如，单体A和/或单体B)。聚合物染料的单体组分可以是水溶性单体。

水溶性单体可以是单体单元，该单体单元包含芳基部分或杂芳基部分，各自任选地具有与其相连的水溶性部分。水溶性部分可以是一个或更多个聚(乙二醇)部分。

聚合物染料的单体组分可包含基于二氢菲(DHP)的单体、基于芴的单体和/或基于咔唑的单体。

例如，水溶性单体可以是包含芳基部分或杂芳基部分的单体单元，例如，本公开内容的具有根据(II)、(III)、(IV)、(Va)、(Vb)、(VIa)、(VIb)、(VIc)、(VIIa)、(VIIb)、(VIIc)、(VIId)、(XXII)和/或(VVIII)的结构的单体，例如，其中以波浪线表示的单体两个末端独立地或二者都是卤素原子、硼酸酯或硼酸、甲硅烷基、重氮盐、三氟甲磺酸盐/酯、乙酰基氧基、磺酸盐/酯或磷酸盐/酯，其可进行Pd或镍盐催化的聚合反应。本公开内容的DHP单体可如美国公开申请No.2019/0144601和美国公开申请No.2020/0190253中所教导的，二者均通过引用整体并入本文。聚合物染料的单体组分可以是基于二氢菲(DHP)的单体，其具有根据式(XXII)的化学结构：

其中：

每个G₁、G₂独立地选自卤素(F、Cl、Br、I)、C₁-C₆烷基和PEG；并且每个R²、R⁴、R⁵、Z、n和f都是本文中前面所限定的。

聚合物染料的单体组分可以是基于芴的单体或基于咔唑的单体，其具有根据式(XXIII)的化学结构：

其中：

每个G₁、G₂独立地选自卤素(F、Cl、Br、I)、C₁-C₆烷基和PEG；

每个X是C、N、或Si；并且

每个R²、R⁴、R⁵、Z、n和f都是本文中前面所限定的。

在一些实施方案中，f为1至50、2至40、或5至20。

在一些实施方案中，每个n为1至10、2至5、或3。

在一些实施方案中，每个m为11至12。

聚合物染料的单体组分的实例包括以下，其在本文中称为示例性“单体A”和示例性“单体B”。

多种单体A和B及其衍生物可通过本领域已知的任何合适的方法制备，例如，如美国公开申请No.2019/0144601或美国公开申请No.2020/0190253中所提供的方法，两个申请均通过引用整体并入全文。

例如，2,7-二溴-反-9,10-二氢菲-9,10-二醇(DHP-OH)可按如下制备。在锥形瓶(2000L)中，将约26g的NaBH₄添加至正在搅拌的水-乙醇混合物(120mL+780mL)中。向该溶液，分批但快速地(在5分钟内)添加约24g的2,7-二溴菲-9,10-二酮。允许反应混合物搅拌一天。到反应结束时，溶液的颜色从橙红色变为淡黄色再变为淡黄色。停止反应并用稀盐酸中和反应混合物。中和之后，过滤白色沉淀并用过量水洗涤。将获得的白色沉淀用非常冷(<-15℃)的乙醇(100mL)和甲醇(100mL)洗涤。

DHP-O-烷基-SO₃H可按如下制备。在2颈圆底烧瓶中，将DHP-OH(3.6g)和18C6(500mg)溶解于120mL的THF中。用氮气吹扫溶液(20分钟)，并在继续氮气吹扫的同时添加NaH(2g)。在10至15分钟内，溶液的颜色从无色变为淡粉色、深粉色、棕色和深绿色。在另一个RB中，将12g的1,3-丙烷磺酸内酯溶解于20mL的THF中，并用氮气吹扫。在20至30分钟时间内，将该磺酸内酯溶液通过加料漏斗添加至DHP-OH溶液。将反应在室温下搅拌4至5小时。蒸发溶剂，并将沉淀溶解在水中。添加丙酮以获得二钠盐形式的DPS的白色沉淀。过滤沉淀并重新溶解在水(少量)中，用HCl中和并再用丙酮沉淀。重复沉淀(2至3次)随后离心得到为白色固体的DPS。

DHP-O-烷基-SO₂Cl可按如下制备。将5g的DHP-O-烷基-SO₃H置于圆底烧瓶中，并与25mL的DMF混合。向其中逐滴添加约10mL的SOCl₂，并允许混合物搅拌过夜。次日早晨，将反应混合物倒入200mL水中，并过滤沉淀并干燥。

DHP-磺酰胺PEG可按如下制备。将DHP-O-烷基-SO₂Cl与2.2当量的PEG胺在二氯甲烷/TEA混合物中混合。在3小时声处理反应之后，将粗产物在二氯甲烷中萃取，然后进行柱色谱(硅胶，MeOH-CHCl₃)。

DHP-磺酰胺PEG的二硼酸酯可按如下制备。将二溴化合物与DMSO在氮气下混合，并向其中添加3当量的双频哪醇合二硼。使试剂与12当量的乙酸钾和4当量的Pd(dppf)Cl₂催化剂在80度下反应5小时。使反应混合物冷却，并用CHCl₃/水萃取。将有机层浓缩，并通过柱色谱(硅胶，MeOH-CHCl₃)进行纯化。

类似地，本公开内容的芴单体可按如下所述制备。例如，FL-O-烷基-SO₃H可按如下制备。在2颈圆底烧瓶中，将5g的芴与70的DMSO混合。将溶液用氮气吹扫(20分钟)，并在继续氮气吹扫的同时添加50％NaOH(12当量)。溶液的颜色从无色变为深褐色。对丙烷磺酸内酯(3当量)进行称重并将其溶解在DMSO中。在5分钟的时间内将其逐滴添加至芴反应混合物。反应在室温下搅拌4至5小时。蒸发溶剂，并将沉淀溶解在水中。添加丙酮以获得二钠盐形式的DPS的白色沉淀。将沉淀过滤并重新溶在水(少量)中，用HCl中和并再用丙酮沉淀。重复沉淀(2至3次)，然后离心，得到为白色固体的FL-OSO₃H。

FL-O-烷基-SO₂Cl可按如下制备。将5g的FL-O-烷基-SO₃H置于圆底烧瓶中，并与25mL的DMF混合。向其中逐滴添加10mL的SOCl₂，并允许混合物搅拌过夜。次日早晨，将反应混合物倒入200mL水中并过滤沉淀并干燥。

FL-磺酰胺PEG可按如下制备。将FL-O-烷基-SO₂C与2.2当量的PEG胺在二氯甲烷/TAE混合物中混合。在3小时声处理反应之后，将粗产物在二氯甲烷中萃取，然后进行柱色谱(硅胶，MeOH-CHCl₃)。

FL-磺酰胺PEG的二硼酸酯可按如下制备。将二溴化合物与DMSO在氮气下混合，并向其添加3当量的双频哪醇合二硼。使试剂与12当量的乙酸钾和4当量的Pd(dppf)Cl₂催化剂在80度下反应5小时。使反应混合物冷却并用CHCl₃/水萃取。将有机层浓缩，并通过柱色谱(硅胶，MeOH-CHCl₃)进行纯化。

发现将聚合物染料的单体组分(例如示例性单体A和/或示例性单体B)以100至400μg/次测试添加至包含生物缓冲剂和非离子表面活性剂的测试染色缓冲剂组合物对于降低聚合物染料缀合物之间的非特异性相互作用非常有效。本公开内容的染色缓冲剂组合物可包含10至500mg/mL、20至400mg/mL或30至300mg/mL的荧光染料的单体组分。工作浓度染色缓冲剂组合物(1×)可包含10至50mg/mL、20至40mg/mL、或约30mg/mL的荧光聚合物染料的单体组分。浓缩浓度(10×)染色缓冲剂组合物可包含100至500mg/mL、200至400mg/mL、或约300mg/mL的荧光聚合物染料的单体组分。本公开内容的组合物可包含足够量的荧光聚合物染料的单体组分，以供给100至400μg/次测试、200至400μg/次测试、或约300μg/次测试。

猝灭的聚合物染料

聚合物染料的非荧光组分可以是包含猝灭部分的聚合物染料，即猝灭的聚合物染料(“猝灭的聚合物”)。猝灭的聚合物可包含根据本公开内容的聚合物染料，所述聚合物染料包含一个或更多个、或许多猝灭部分，例如1至50、2至25或5至8个猝灭部分。在一些实施方案中，猝灭的聚合物表现出不大于0.1、或不大于0.06、或不大于0.056、或不大于0.05、不大于0.02、或不大于0.015Φ的量子产率(QY)。当用405nm的激光激发时，猝灭的聚合物可表现出小于50个AFU、小于40个AFU 30个AFU的荧光谱。在一些实施方案中，当在405nm下被激发时，与母体荧光聚合物相比，猝灭的聚合物染料可表现出>95％的原始最大发射强度的猝灭，>98％的原始最大发射强度的猝灭，最高至100％的猝灭。

在一些实施方案中，10微克/mL的猝灭的聚合物染料在450nm下发射<50个AFU(狭缝ex/em为6nm/4nm；1cm比色皿)。在一些实施方案中，在荧光计LS50B Perkin Elmer中，使用AFU狭缝ex/em 6nm/4nm，10μg/mL的猝灭的聚合物染料在用405nm激光激发时表现出<47个AFU。

猝灭部分可以是非荧光猝灭部分。非荧光猝灭部分可以是能够从荧光团吸收激发能量并作为热消散的暗猝灭剂。

例如，猝灭部分可选自DABCYL、DABSYL、DYQ425黑洞猝灭剂1(Black HoleQuencher1，BHQ1)、QSY7、QSY9、QSY35和TAMRA(羧基四甲基罗丹明)部分。例如，猝灭部分可作为如N-羟基琥珀酸亚胺活性酯(NHS酯)市售，其用于与聚合物染料缀合，例如，如，来自Thermo Scientific(例如，DYQ425；DyLight 425Q NHS酯)。例如，其他猝灭部分可作为活性酯如Dabcyl Q、Dabcyl plus、Anaspec 490Q、Dyomics 425Q、Dynomics 505Q等获得。优选地，猝灭部分能够猝灭约400至500nm、约480至约580nm或约500至约600nm的范围内的荧光发射。猝灭部分的实例可包括，例如：

例如，本公开内容的猝灭的聚合物可使用具有根据式(I)的结构的聚合物染料：

其中每个A独立地选自芳族共聚单体和杂芳族共聚单体；每个L是接头部分；每个M独立地选自芳族共聚单体、杂芳族共聚单体、带隙改性单体、任选经取代的亚乙基、和亚乙炔基；G¹和G²独立地选自未经修饰的聚合物末端和经修饰的聚合物末端；a、c、d独立地限定了结构内每个单元的mol％，每个单元可以是均匀或随机重复的，并且其中每个a的mol％为10％至100％，每个c的mol％为0至90％，并且每个d的mol％为0至25％；每个b独立地是0或1；并且m是1至约10,000的整数，其中猝灭的聚合物染料表现出不大于0.1、或不大于0.06、或不大于0.056的量子产率(QY)。

在一些实施方案中，猝灭的聚合物染料(I)表现出不大于0.1、或不大于0.06、或不大于0.056的量子产率(QY)；任选地，当用450nm激光激发时，荧光谱小于50个AFU、小于40个AFU或小于30个AFU。在一些实施方案中，当在405nm下被激发时，与母体荧光聚合物相比，猝灭的聚合物染料(I)可表现出>95％的原始最大发射强度的猝灭，>98％的原始最大发射强度的猝灭，最高至100％的猝灭。术语“母体荧光聚合物”是指不含猝灭部分的聚合物染料。

例如，本公开内容的猝灭的聚合物可使用二氢菲(DHP)、芴、咔唑以及DHP、咔唑和芴单体的组合，例如如式(VIII)中所示：

其中G¹、G²、R¹、R²、X、Y、M、L、a、b、c、d和m如本文先前所限定，其中聚合物表现出不大于0.1、或不大于0.06、或不大于0.056的量子产率(QY)。在一些实施方案中，当用405nm激光激发时，猝灭的聚合物染料(VIII)表现出小于90个AFU、小于50个AFU、小于40个AFU或小于30个AFU的荧光谱。在一些实施方案中，在405nm下被激发时，与母体荧光聚合物相比，猝灭的聚合物染料(VIII)可表现出>95％的原始最大发射强度的猝灭，>98％的原始最大发射强度的猝灭，最高至100％的猝灭。

根据式(VIII)的猝灭的聚合物可在R¹、R²、L、G¹或G²处包含1至50、2至25或5至8个猝灭部分。

猝灭的聚合物可包含根据式(XX)的结构，其中猝灭部分在L²处连接：

其中每个A、B、E、G¹、G²、L¹、L²、L³、W、n、m、p、q、r、s、t如本文先前所限定；并且

A和B随机或非随机分布在所缀合的聚合物中，其中聚合物表现出不大于0.1、或不大于0.06、或不大于0.056的量子产率(QY)。在一些实施方案中，当用405nm激光激发时，猝灭的聚合物染料(XX)表现出小于90个AFU、小于50个AFU、小于40个AFU或小于30个AFU的荧光谱。在一些实施方案中，当在405nm下被激发时，与母体荧光聚合物相比，猝灭的聚合物染料(XX)可表现出>95％的原始最大发射强度的猝灭，>98％的原始最大发射强度的猝灭，最高至100％的猝灭。

在一些实施方案中，每个E可以是独立选择的发色团、官能部分或猝灭部分，其中至少一个或更多个E或者至少两个或更多个E是猝灭部分。

在一些实施方案中，本公开内容的猝灭的聚合物染料可使用具有根据式(I)、(XVIII)至(XIV)、(XVIII)、(XIX)、(XX)和/或(XXIV)的结构的聚合物染料。

在一些实施方案中，猝灭的聚合物可包含2至20、3至15或5至8个猝灭部分。在一些实施方案中，m＝2至20、3至15或5至8。

在一些实施方案中，猝灭部分可选自Dabcyl、Dabsyl、BHQ1、DYQ425、DYQ505、QSY7、QSY9、QSY35或TAMRA猝灭部分。

在一些实施方案中，猝灭的聚合物不包含结合配偶体。

可根据任何适当的方法制备猝灭的聚合物，例如，其中猝灭部分以活性酯的形式(例如NHS-酯)商购，并根据本公开内容的方法暴露于聚合物染料。

本公开内容的染色缓冲剂可包含0.2至15mg/mL、0.3至12mg/mL或0.5至10mg/mL的猝灭的聚合物。在一些实施方案中，本公开内容的工作浓度(1×)染色缓冲剂可包含0.2至2.0mg/mL、0.3至1.5mg/mL、0.5至1.2mg/mL、或约1mg/mL的猝灭的聚合物染料。在一些实施方案中，浓缩的染色缓冲剂组合物(10×)可包含3至15mg/mL、5至12mg/mL、或约10mg/mL的猝灭的聚合物。本公开内容的染色缓冲剂组合物可包含足够量的猝灭的聚合物染料，以供给2至20μg/次测试、3至15μg/次测试、或约10μg/次测试。

光漂白的聚合物染料

本文所述的组合物可包含至少一种具有根据本公开内容的结构的光漂白的聚合物染料。例如，光漂白的聚合物染料可包含根据任何根据本公开内容的式I、VIII至XIV、XVIII、XIX和/或XX的结构。这样的化合物在先前公开的PCT申请No.WO2017/180998和公开的美国申请No.2020/0190253A1中描述，所述申请通过引用并入，如同以其整体在本文中充分阐述一样。

术语“光漂白的染料”是指这样的染料，其最初包含荧光团，该荧光团已经受高强度照射使得不再发荧光或表现出不大于0.1的量子产率(QY)。在一些实施方案中，光漂白的聚合物表现出不大于0.1、不大于0.06、不大于0.056、不大于0.02或不大于0.015Φ的量子产率(QY)。在一些实施方案中，当被405nm激光激发时，光漂白的聚合物染料表现出小于约50个任意荧光单位(arbitrary unit of fluorescence，AFU)。在一些实施方案中，当在405nm下被激发时，与母体荧光聚合物相比，光漂白的聚合物染料可表现出>95％的原始最大发射强度的猝灭，>98％的原始最大发射强度的猝灭，最高至100％的猝灭。术语“母体荧光聚合物”是指光漂白之前的聚合物染料。

荧光团可重复地经历荧光过程。这意味着荧光团分子理论上可多次产生信号。事实上，在其激发态寿命期间荧光团的结构不稳定性可使其易受降解。高强度照射可导致荧光团改变其结构，使得其不再发荧光，并且这称为光漂白。

本文中使用的术语“光漂白的聚合物染料”通常是指聚合物染料，例如，紫色可激发聚合物染料，其在光漂白之后表现出不大于0.1、或不大于0.06或不大于0.056的量子产率(QY)。在一些实施方案中，光漂白的染料表现出小于约50个任意荧光单位(AFU)、小于约45个AFU、小于约40个AFU、小于约35个AFU、小于约30个AFU、小于约25个AFU、小于约20个AFU、小于约15个AFU、小于约10个AFU、小于约5个AFU、小于约1个AFU、约1个AFU至约50个AFU、约5个AFU至约25个AFU、约20个AFU至约40个AFU、约15个AFU至约30个AFU、约15个AFU至约40个AFU或约20个AFU至约36个AFU。

在一些实施方案中，10微克/mL的光漂白染料在450nm下发射≤50个AFU(狭缝ex/em为6nm/4nm；1cm比色皿)。在一些实施方案中，在荧光仪LS50B Perkin Elmer中，使用AFU狭缝6nm/4nm，当用405nm激光激发时，光漂白的聚合物染料在10μg/mL下表现出<47个AFU。例如，光漂白的聚合物染料可以是这样的紫色染料，其最初包含荧光团，该荧光团经受高强度UV照射使得不再发荧光，或者表现出不大于0.1、或不大于0.06、或不大于0.056的量子产率(QY)；当被405nm激光激发时，任选地小于约50个任意荧光单位(AFU)。在一些实施方案中，当在405nm下被激发时，与母体荧光聚合物相比，光漂白的聚合物染料可表现出>95％的原始最大发射强度的猝灭，>98％的原始最大发射强度的猝灭，最高至100％的猝灭。

例如，本公开内容的光漂白的聚合物染料可利用具有根据式(I)的结构的聚合物染料：

其中每个A独立地选自芳族共聚单体和杂芳族共聚单体；每个L是接头部分；每个M独立地选自芳族共聚单体、杂芳族共聚单体、带隙改性单体，任选经取代的亚乙基和亚乙炔基；G¹和G²独立地选自未经修饰的聚合物末端和经修饰的聚合物末端；a、c和d独立地限定结构内每个单元的mol％，所述单元各自可均匀地或随机地重复，并且其中每个a为10％至100％的mol％，每个c为0％至90％的mol％，并且每个d为0％至25％的mol％；每个b独立地是0或1；并且m是1至约10,000的整数，其中光漂白的聚合物染料是通过将根据式(I)的荧光聚合物染料暴露于UV光照射来制备的，使得其表现出不超过0.1、或不超过0.06、或不超过0.056的量子产率(QY)；任选地其中当由405nm激光激发时，其表现出小于约50个任意荧光单位(AFU)；和或任选地当在405nm下激发时，与母体荧光聚合物相比，表现出>95％的原始最大发射强度的猝灭，>98％的原始最大发射强度的猝灭，最高至100％的猝灭。

例如，本公开内容的光漂白的聚合物染料可利用二氢菲(DHP)、芴以及DHP和芴单体的组合，例如，如式(VIII)中所示：

其中G1、G2、R1、R2、X、Y、M、L、a、b、c、d和m是上文中所述，其中光漂白的聚合物染料是通过将根据式(VIII)的荧光聚合物染料暴露于UV光照射来制备的，使得其表现出不超过0.1、或不超过0.06、或不超过0.056的量子产率(QY)；任选地当其由405nm激光激发时，小于约50个任意荧光单位(AFU)；和或任选地当在405nm下激发时，与母体荧光聚合物相比，表现出>95％的原始最大发射强度的猝灭、>98％的原始最大发射强度的猝灭、最高至100％的猝灭。

例如，本公开内容的光漂白的聚合物染料可利用具有根据式(XX)的结构的聚合物染料：

其中每个A、B、E、G¹、G²、L¹、L²、L³、W、n、m、p、q、r、s、t如本文中先前所限定；以及

A和B随机或非随机分布在缀合的聚合物中，其中，光漂白的聚合物染料通过将根据式(XX)的荧光聚合物染料暴露于UV光照射来制备，使得其表现出不超过0.1、或不超过0.06、或不超过0.056的量子产率(QY)；任选地当其由405nm激光激发时，小于约50个任意荧光单位(AFU)。在一些实施方案中，当在405nm下激发时，与母体荧光聚合物相比，光漂白的聚合物染料可表现出>95％的原始最大发射强度的猝灭、>98％的原始最大发射强度的猝灭、最高至100％的猝灭。

例如，本公开内容的光漂白的聚合物染料可利用具有根据式(XVIII)的结构的聚合物染料，其中光漂白的聚合物染料通过将根据式(XVIII)的荧光聚合物染料暴露于UV光照射来制备，使得其表现出不超过0.1、或不超过0.06、或不超过0.056的量子产率(QY)，任选地当其由405nm激光激发时，表现出小于约50个任意荧光单位(AFU)；任选地当在405nm下激发时，与母体荧光聚合物相比，表现出>95％的原始最大发射强度的猝灭、>98％的原始最大发射强度的猝灭、最高至100％的猝灭。

例如，本公开内容的光漂白的聚合物染料可由荧光聚合物染料制备，所述荧光聚合物染料例如紫色可激发的荧光聚合物染料，例如，SuperNova^TM(“SN”)v428(BeckmanCoulter,Inc.)是任选地由紫色激光(405nm)激发的荧光聚合物染料，其中，光漂白的聚合物通过将根据式(I)的荧光聚合物染料暴露于UV光照射来制备，使得其表现出小于约50个任意荧光单位(AFU)。在一些实施方案中，光漂白的染料不包含结合配偶体。

本公开内容的组合物可包含工作浓度(1×)为约0.2至0.8mg/mL、0.3至0.7mg/mL、或约0.5mg/mL的光漂白的染料。本公开内容的组合物可包含约2至8mg/mL、3至7mg/mL、或约5mg/mL的浓缩组合物(10×)中的光漂白的染料。本公开内容的组合物可包含约0.1至约10mg/mL、0.2至8mg/mL、0.3至7mg/mL、或0.5至5mg/mL的光漂白的染料。本公开内容的组合物可包含足够量的光漂白的染料以供应2至8ug/次测试、3至7ug/次测试、或约5ug/次测试。

非离子表面活性剂

组合物可包含一种或更多种非离子表面活性剂。可包含足够量的非离子表面活性剂以阻止聚合物染料缀合物的聚集。非离子表面活性剂的一些非限制性实例包括泊洛沙姆表面活性剂(例如PLURONIC^TMF-68(PF-68))、聚山梨醇酯(包括20和80)、以及醚连接的非离子表面活性剂(例如如，聚氧乙二醇烷基醚(BRIJ)、聚氧乙二醇辛基苯酚醚(TRITON)、或聚氧乙烯壬基苯基醚(IGEPAL)表面活性剂)。在一些实施方案中，表面活性剂是泊洛沙姆非离子表面活性剂。

术语泊洛沙姆非离子表面活性剂是指聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷(PEG-PPG-PEG)非离子三嵌段共聚物。术语泊洛沙姆非离子表面活性剂涵盖非离子表面活性剂。表面活性剂的一些实例包括，例如F68、F77、F87、F98、F108、F127、P103、P104、P105和P123。

在一些实施方案中，表面活性剂是含有聚氧丙烯的表面活性剂，例如泊洛沙姆表面活性剂。泊洛沙姆表面活性剂包括非离子三嵌段共聚物，例如以侧翼为两个聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))亲水链的聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))中心疏水链为特征的聚氧乙烯氧化物-聚氧丙烯氧化物-聚氧乙烯氧化物(PEO-PPO-PEO)。一些示例性非离子三嵌段共聚物可包含根据式(XXI)的结构：

其中，每个a独立地是独立地在2至130范围内整数，并且b是15至67范围内的整数。在一些实施方案中，a在50至100的范围内且b在20至40的范围内。在一些实施方案中，a在70至90的范围内且b在25至30的范围内。非离子表面活性剂可以是泊洛沙姆188。泊洛沙姆的一些非限制性实例可包括泊洛沙姆188，也被称为Pluronic F-68或P188，例如具有a＝80且b＝27。另一些泊洛沙姆包括：泊洛沙姆338，也被称为Synperonic^TMPE/F108；泊洛沙姆407，也被称为Synperonic^TMPE/F127；泊洛沙姆331，也被称为Synperonic^TMPE/L101。

术语“F68”、“Pluronic F-68”、或“PF-68”，也被称为泊洛沙姆188，是指平均分子量(avg.Mn)为8350至8400的聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段聚(乙二醇)共聚物。

术语“F127”也称为泊洛沙姆407，是指由侧翼为两个聚乙二醇(PEG)亲水嵌段的聚丙二醇中心疏水嵌段组成的三嵌段共聚物。两个PEG嵌段的近似长度是101个重复单元，而丙二醇嵌段的近似长度是56个重复单元。这也以Croda商品名Synperonic PE/F 127而被已知，为平均12,600g/mol。

术语“F108”是指平均Mn约14,600的聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段聚(乙二醇)。

术语“P103”是指平均Mw约4,950的聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段聚(乙二醇)。

术语“P104”是指平均Mw约5,900的聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段聚(乙二醇)。

术语“P123”是指平均Mn约5,800的聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段聚(乙二醇)。

由于聚合物嵌段的长度可以定制，因此存在许多具有略微不同的特性的不同泊洛沙姆。泊洛沙姆共聚物通常以字母“P”(泊洛沙姆)后接三个数字命名：前两个数字×100得出聚氧丙烯核的近似分子量，以及最后一个数字×10得出聚氧乙烯含量百分比(例如，P407＝具有4,000g/mol的聚氧丙烯分子量和70％聚氧乙烯含量的泊洛沙姆)。对于Pluronic和Synperonic泊洛沙姆商品名，这些共聚物的编码以限定其在室温下的物理形式的字母(L＝液体、P＝糊剂、F＝薄片(固体))开始，后接两个或三个数字。数字名称中的第一位数字(三位数字中的前两位数字)乘以300表示疏水链的近似分子量；以及最后一位数字×10得出聚氧乙烯含量百分比(例如，F-68表示1,800g/mol的聚氧丙烯分子量和80％聚氧乙烯含量)。示例性泊洛沙姆表面活性剂包括但不限于Pluronic F-68。PF-68是非离子三嵌段共聚物聚氧乙烯氧化物-聚氧丙烯氧化物-聚氧乙烯氧化物(PEO-PPO-PEO)。使用的表面活性剂的浓度可以以经验确定(即，滴定使得缀合物不发生沉淀)。在一些实施方案中，染色缓冲剂组合物可包含非离子表面活性剂，例如泊洛沙姆表面活性剂。非离子表面活性剂可以是Pluronic F-68(泊洛沙姆188)。非离子表面活性剂可在以下工作浓度(1×)下存在于染色缓冲剂组合物中：0.01％至10％、0.02％至8％、0.05％至7％、0.1％至5％、0.2％至2％、0.1％至0.4％、或者约0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％(重量/体积)，或者之间的任意值。非离子表面活性剂可以以0.1％至40％、0.2％至30％、0.5％至25％、或10％至20％(重量/体积)存在于浓缩的染色缓冲剂组合物(10×)中。在一些实施方案中，本公开内容的染色缓冲剂组合物可包含0.01％至40％、0.01％至20％、0.02％至10％(重量/体积)的非离子表面活性剂。

生物缓冲剂

术语“生物缓冲剂”是指包含一种或更多种生物缓冲剂的生理相容的水溶液，其在无细胞系统中将pH维持在pH 6至8、6.5至8、或7至8的生物范围内。在某些实施方案中，生物缓冲剂可包括以下中的一种或更多种：N-(2-乙酰氨基)-氨基乙磺酸(ACES)、乙酸盐/酯、N-(2-乙酰氨基)-亚氨基二乙酸(ADA)、2-氨基乙磺酸(AES)、氨、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)、2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇(AMPD)、N-(1,1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(AMPSO)、N,N-双-(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、碳酸氢盐/酯、N,N’-双-(2-羟乙基)-甘氨酸、[双-(2-羟乙基)-亚氨基]-三-(羟甲基甲烷)(BIS-Tris)、1,3-双[三(羟甲基)-甲基氨基]丙烷(BIS-Tris-丙烷)、硼酸、二甲基胂酸、3-(环己基氨基)-丙磺酸(CAPS)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)、碳酸盐/酯、环己基氨基乙磺酸(CHES)、柠檬酸盐/酯、3-[N-双(羟乙基)氨基]-2-羟基丙烷磺酸(DIPSO)、甲酸盐/酯、甘氨酸、双甘氨肽、N-(2-羟乙基)-哌嗪-N’-乙磺酸(HEPES)、乳酸盐/酯、N-(2-羟乙基)-哌嗪-N’-3-丙磺酸(HEPPS、EPPS)、N-(2-羟乙基)-哌嗪-N’-2-羟基丙磺酸(HEPPSO)、咪唑、苹果酸盐/酯、马来酸盐/酯、2-(N-吗啉代)-乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉代)-丙磺酸(MOPS)、3-(N-吗啉代)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、磷酸盐/酯、哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸)(PIPES)、哌嗪-N,N’-双(2-羟基丙磺酸)(POPSO)、吡啶、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、琥珀酸盐/酯、3-{[三(羟甲基)-甲基]-氨基}-丙磺酸(TAPS)、3-[N-三(羟甲基)-甲基氨基]-2-羟基丙磺酸(TAPSO)、2-氨基乙磺酸、AES(牛磺酸)、海藻糖、三乙醇胺(TEA)、2-[三(羟甲基)-甲基氨基]-乙磺酸(TES)、N-[三(羟甲基)-甲基]-甘氨酸(tricine)、三(羟甲基)-氨基甲烷(Tris)、甘油醛、甘露糖、葡糖胺、甘露庚酮糖、山梨糖-6-磷酸盐/酯、海藻糖-6-磷酸盐/酯、碘乙酸盐/酯、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钠、酒石酸钠、琥珀酸钠、马来酸钠、乙酸镁、柠檬酸镁、磷酸钾、磷酸镁、乙酸铵、柠檬酸铵、磷酸铵，以及其他缓冲剂。代表性缓冲剂可包括以下的盐：有机酸盐，例如柠檬酸、抗坏血酸、葡糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸、或邻苯二甲酸；Tris氨丁三醇盐酸盐；或磷酸盐。常规生物缓冲剂的一些具体实例可包括磷酸缓冲盐水(phosphate-buffered saline，PBS)、N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-羟基丙磺酸(HEPES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、2-([2-羟基-1,1-双(羟甲基)乙基]氨基)乙磺酸(TES)、3-[N-三(羟基-甲基)乙基氨基]-2-羟乙基]-1-哌嗪丙磺酸(EPPS)、三[羟甲基]-氨基甲烷(THAM)、1,4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)和三[羟甲基]甲基氨基甲烷(TRIS)缓冲剂。常规生物缓冲剂可具有在生理范围内的pK，并且在该范围内功能最有效。生物缓冲剂可以以例如10至100mM、或5至25mM的浓度在水溶液中。

术语“PBS”是指磷酸缓冲盐水，其是可包含氯化钠、磷酸氢二钠、氯化钾和/或磷酸二氢钾的水性缓冲剂。例如，PBS可包含milliQ水或去离子水和137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na₂HPO₄、1.8mM KH₂PO₄。pH可以是约pH 7.0至7.4。PBS可用或可不用叠氮化物(例如叠氮化钠)保存。PBS可以是等张溶液。缓冲剂可以是PBA缓冲剂。PBA缓冲剂可包含PBS、BSA和叠氮化钠。PBA缓冲剂可包含1×PBS、约2mg/mL BSA和约0.1％叠氮化钠。

另外的组分

本公开内容的组合物可用作染色缓冲剂组合物(例如，在流式细胞术样品分析中)，并且因此可包含另外的组分，包括但不限于任何合适的载体、稳定剂、盐、螯合剂(例如EDTA)、着色剂、或防腐剂中的一种或更多种。组合物还可包含另外的一种或更多种表面活性剂(例如，离子表面活性剂和两性离子表面活性剂)。

术语“蛋白质稳定剂”是指这样的蛋白质：用于降低非特异性结合，例如，用于降低细胞-细胞相互作用，或用于帮助阻止抗体与非靶分子之间的非特异性结合。根据本公开内容的组合物可包含蛋白质稳定剂。蛋白质稳定剂可选自以下中的一种或更多种：血清白蛋白，例如牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、或明胶。蛋白质稳定剂可以是BSA。在一些实施方案中，蛋白质稳定剂以0.1至100mg/mL、0.2至50mg/mL、1至20mg/mL、或1至10mg/mL存在。蛋白质稳定剂可以以0.1至10mg/mL、0.5至5mg/mL、1至3mg/mL、或约2mg/mL的浓度存在于本公开内容的工作组合物(1×)中。蛋白质稳定剂可以以1至100mg/mL、5至50mg/mL、10至30mg/mL、或约20mg/mL的浓度存在于本公开内容的浓缩组合物(10×)中。

载体可以是水溶液，例如水、盐水、乙醇或生物缓冲剂，例如PBS、Hank溶液、林格溶液(Ringer’s solution)或生理盐水缓冲剂。

载体可包括制剂，例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。

例如，染色缓冲剂组合物可包含载体例如水、或溶剂例如如作为增溶剂的DMSO。

组合物还可包含适当的生物缓冲剂和/或pH调节剂，并且通常缓冲剂是由有机酸或碱制备的盐。

本公开内容的组合物可包含任何合适的防腐剂。防腐剂可以是抗氧化剂、杀生物剂或抗微生物剂。防腐剂可以是无机盐。例如，防腐剂可以是叠氮化钠、2-氯乙酰胺、2-甲基异噻唑啉酮、水杨酸、ProClin^TM、Kathon^TMCG、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、或2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮。防腐剂可以以0.01％至0.5％、0.05％至0.3％、或约0.1％存在于本公开内容的组合物中。

本公开内容的组合物可包含另外的表面活性剂。可任选地根据本文中所述方法使用的合适的另外的表面活性剂可包括两性离子表面活性剂，例如甜菜碱，例如烷基甜菜碱、烷基酰胺甜菜碱、酰胺基偶氮甜菜碱、磺基甜菜碱(INCI磺基甜菜碱(Sultaine))以及磷酸甜菜碱。合适的两性离子表面活性剂的一些实例包括通式R^1′[CO-X(CH₂)_j]_g-N⁺(R^2′)(R^3′)-(CH₂)_r-[CH(OH)CH₂]_h-Y^-的表面活性剂，其中R^1’是饱和或不饱和的C_6-22烷基，例如C_8-18烷基、饱和的C_10-16烷基或饱和的C_12-14烷基；X是NH、NR^4’，其中R^4’是C_1-4烷基、O或S；j是1至10的整数，例如2至5和3；g是0或1；R^2’和R^3’各自独立地是C_1-4烷基，任选地羟基被羟乙基或甲基取代；f是1至4的整数，例如1、2或3；h是0或1；并且Y是COO、SO₃、OPO(OR^5’)O或P(O)(OR^5’)O，其中R^5’是H或C_1-4烷基。

合适的两性离子表面活性剂的一些实例包括烷基甜菜碱，例如下式的那些：

R^1′-N⁺(CH₃)₂-CH₂COO^-；

R^1′-CO-NH(CH₂)₃-N⁺(CH₃)₂-CH₂COO^-；

R^1′-N⁺(CH₃)₂-CH₂CH(OH)CH₂SO₃ ^-；和

R^1′-CO-NH-(CH₂)₃-N⁺(CH₃)₂-CH₂CH(OH)CH₂SO₃ ^-

以下是合适的甜菜碱和磺基甜菜碱的一些实例(根据INCI指定)：杏仁油酰胺丙基甜菜碱、野杏油酰胺丙基甜菜碱、鳄梨油酰胺丙基甜菜碱、巴巴苏油酰胺丙基甜菜碱、山嵛酰胺丙基甜菜碱、山嵛基甜菜碱、低芥酸菜子油酰胺丙基甜菜碱、辛酰基/癸基酰胺丙基甜菜碱、肉碱、鲸蜡基甜菜碱、椰油酰胺乙基甜菜碱、椰油酰胺丙基甜菜碱、椰油酰胺丙基羟基磺基甜菜碱、椰油甜菜碱、椰油羟基磺基甜菜碱、椰油/油酰胺丙基甜菜碱、椰油磺基甜菜碱、癸基甜菜碱、二羟乙基油基甘氨酸盐、二羟乙基大豆甘氨酸盐、二羟乙基硬脂基甘氨酸盐、二羟乙基牛油甘氨酸盐、二甲基硅氧烷丙基的PG-甜菜碱、芥酸酰胺丙基羟基磺基甜菜碱、氢化牛油甜菜碱、异硬脂酰胺丙基甜菜碱、月桂酰胺丙基甜菜碱、月桂基甜菜碱、月桂基羟基磺基甜菜碱、月桂基磺基甜菜碱、牛奶酰胺丙基甜菜碱、牛奶酰胺丙基甜菜碱、肉豆蔻酰胺丙基甜菜碱、肉豆蔻基甜菜碱、油酰胺丙基甜菜碱、油酰胺丙基羟磺基甜菜碱、油基甜菜碱、橄榄油酰胺丙基甜菜碱、棕榈油酰胺丙基甜菜碱、棕榈酰胺丙基甜菜碱、棕榈酰肉碱、棕榈仁油酰胺丙基甜菜碱、聚四氟乙烯乙酰氧丙基甜菜碱、蓖麻醇酰胺丙基甜菜碱、芝麻酰胺丙基甜菜碱、大豆酰胺丙基甜菜碱、硬脂酰胺丙基甜菜碱、硬脂基甜菜碱、牛油酰胺丙基甜菜碱、牛油酰胺丙基羟基磺基甜菜碱、牛油甜菜碱、牛油二羟乙基甜菜碱、十一碳酰胺丙基甜菜碱和小麦胚芽酰胺丙基甜菜碱。

例如，椰子油二甲基甜菜碱可以以商品名AMONYL 从Seppic商购；并且月桂基甜菜碱可以以商品名EMPIGEN 从Sigma-Aldrich商购。甜菜碱的另一个实例是可以以商品名MIRATAINE 从Rhodia商购的月桂基-亚氨基-二丙酸酯。染色缓冲剂组合物中任选的两性离子表面活性剂的存在可降低生物样品中的非特异性结合，例如，可降低与单核细胞的非特异性结合。任选的两性离子表面活性剂可以以0％至0.5％、0.05％至0.3％存在于组合物中。

组合物

提供了用于在生物样品中降低聚合物染料缀合物之间的聚合物-聚合物相互作用并降低染料缀合物沉淀的染色缓冲剂组合物。提供了用于降低包含两种或更多种聚合物染料缀合物的多色组中聚合物染料缀合物之间的聚合物-聚合物相互作用的染色缓冲剂组合物。

根据本公开内容的组合物在添加至生物样品之前、与其同时或之后可添加至包含一种或更多种、两种或更多种、或者三种或更多种聚合物染料缀合物的染料缀合物的混合物中，用于降低、显著降低和/或阻止染料缀合物之间的非特异性结合，例如聚合物-聚合物相互作用。染料缀合物的混合物可包含一种或更多种、两种或更多种、或者三种或更多种聚合物染料缀合物，并且任选地一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种常规荧光染料缀合物，例如如荧光素、香豆素、花青、罗丹明染料缀合物，例如FITC(异硫氰酸荧光素)、PE(藻红蛋白)、ECD(藻红蛋白-Texas-X)、PC5(藻红蛋白-花青5.5)、PC5.5(藻红蛋白-花青5.5)、PC7(藻红蛋白-花青7)、APC(别藻蓝蛋白)、AA700、AA750、PBE，Alexa488(AF488)，AF532，AF647，AF700，AF750，Atlantis Bioscience350染料，405S，405，405L，430，440，450，488A，514，AAT BioquestiFluor^TM 488，iFluor^TM 350，iFluor^TM 405，mFluor^TM Blue 570，mFluor^TM Blue 580，mFluor^TM Blue 590，mFluor^TM Blue 620，mFluor^TM Blue 630，mFluor^TM Blue 660，ThermoFisher Scientific NovaFluor Blue 510，NovaFluor Blue 530，NovaFluor Blue555，NovaFluor Blue 585，NovaFluor Blue610/30S，NovaFluor Blue 660/40S，NovaFluorBlue 660/120S，Kiravia Blue520^TM，KrO染料缀合物等。另一些染料或染料缀合物可包含Super Bright聚合物染料(Invitrogen、ThermoFisher Scientific)。SuperBright染料可由紫色激光(405nm)激发。Super Bright染料可以是Super Bright 436(激发最大值414nm，发射最大值436nm，450/50带通滤光片)、Super Bright 600(发射最大值600nm，610/20带通滤光片)、Super Bright 645(发射最大值645nm，660/20带通滤光片)或Super Bright 702(发射最大值702nm，710/50带通滤光片)。

本公开内容提供了包含第一聚合物染料的至少一种非荧光组分的组合物、和生物缓冲剂。组合物可包含第一聚合物染料的至少一种非荧光组分、生物缓冲剂、和非离子表面活性剂。非离子表面活性剂可以是泊洛沙姆非离子表面活性剂。例如，组合物可包含选自以下的第一聚合物染料的非荧光组分：聚合物染料的一种或更多种单体组分、光漂白的聚合物染料以及含有猝灭部分的聚合物染料。

提供了染色缓冲剂组合物，其包含聚合物染料的单体组分、光漂白的聚合物染料和生物缓冲剂。提供了染色缓冲剂组合物，其包含聚合物染料的单体组分、光漂白的聚合物染料、非离子表面活性剂和生物缓冲剂。在一些实施方案中，提供了染色缓冲剂组合物，其包含工作浓度(1×)的10至40mg/mL单体A、0.2至1.5mg/mL光漂白的染料、和生物缓冲剂，任选地具有蛋白质稳定剂和防腐剂。在一些实施方案中，提供了染色缓冲剂组合物，其包含工作浓度(1×)的10至40mg/mL单体A、0.2至1.5mg/mL光漂白的染料、0.01％至10％(重量/体积)非离子表面活性剂和生物缓冲剂，任选地具有蛋白质稳定剂和防腐剂。在一些实施方案中，提供了染色缓冲剂组合物，其包含工作浓度(1×)的20至40mg/mL单体A、0.2至0.8mg/mL光漂白的染料、0.01％至4％(重量/体积)非离子表面活性剂和生物缓冲剂，任选地具有蛋白质稳定剂和防腐剂。

提供了染色缓冲剂组合物，其包含聚合物染料的单体组分、非离子表面活性剂和生物缓冲剂。在一些实施方案中，提供了染色缓冲剂组合物，其包含工作浓度(1×)的10至40mg/mL的聚合物染料的单体组分、0.01％至4％(重量/体积)非离子表面活性剂和生物缓冲剂，任选地具有蛋白质稳定剂和防腐剂。

提供了染色缓冲剂组合物，其包含含有猝灭部分的聚合物染料、生物缓冲剂、和非离子表面活性剂。提供了染色缓冲剂组合物，其包含聚合物染料的单体组分、含有猝灭部分的聚合物染料、生物缓冲剂和非离子表面活性剂。任选地，组合物可包含蛋白质稳定剂。任选地，组合物可包含防腐剂。

在一些实施方案中，提供了染色缓冲剂组合物，其包含10至40mg/mL单体A、0.2至1.5mg/mL猝灭聚合物、0.01％至4％(重量/体积)非离子表面活性剂和生物缓冲剂，任选地具有蛋白质稳定剂和防腐剂。在一些实施方案中，提供了染色缓冲剂组合物，其包含20至40mg/mL单体A、0.5至1.5mg/mL猝灭聚合物、0.01％至1％(重量/体积)非离子表面活性剂和生物缓冲剂，任选地具有蛋白质稳定剂和防腐剂。

当与不存在组合物的荧光聚合物染料缀合物相比时，根据本公开内容的染色缓冲剂组合物降低、显著降低、或消除荧光聚合物染料缀合物之间的非特异性聚合物-聚合物相互作用。当与不存在组合物的至少一种荧光聚合物染料缀合物相比时，根据本公开内容的组合物降低、显著降低、或消除至少一种荧光聚合物染料缀合物的非特异性聚合物-聚合物相互作用。

方法

本公开内容还涉及用于检测样品中分析物的方法，其包括：使被怀疑包含分析物的样品与本文中所述的组合物接触。存在于例如本文中所述的聚合物染料缀合物中的结合配偶体能够与分析物相互作用以形成具有分析物的聚合物染料缀合复合物。将光源施加于样品，这可激发具有分析物的聚合物染料缀合复合物，并且检测从缀合的聚合物复合物发射的光。在一些实施方案中，本文中所述的聚合物染料缀合物可用波长在约340nm至约800nm、约340nm至约450nm(例如，约395nm至约415nm)的范围内的光激发。在一些实施方案中，发射的光通常为约400nm至约800nm(例如，约400nm至约500nm、或约415nm至约475nm)。或者，激发光的波长可以是约340nm至约370nm，并且发射的光可以是约390nm至约420nm。

本公开内容的方法中的样品可以是例如血液、骨髓、脾细胞、淋巴细胞、骨髓抽吸物(或从骨髓获得的任何细胞)、尿(灌洗液)、血清、唾液、脑脊液、尿、羊水、组织间液、粪便、黏液或组织(例如，肿瘤样品、分解的组织、分解的实体瘤)。样品可以是血液样品。血液样品可以是全血。可使用标准临床操作从对象获得全血。样品可以是全血的一种或更多种细胞的子集(例如，红细胞、白细胞、淋巴细胞(例如，T细胞、B细胞或NK细胞)、吞噬细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、血小板或具有一种或更多种可检测标志物的任何细胞)。全血样品可以是经过处理的全血样品。样品可来自细胞培养物。

对象可以是人(例如，患有疾病的患者)、商业上重要的哺乳动物，包括例如猴、牛或马。样品还可获自家庭宠物，包括例如狗或猫。对象可以是用作疾病动物模型或用于药物筛选的实验室动物，例如小鼠、大鼠、兔或豚鼠。

本文中使用的“分析物”是指其丰度/浓度通过一些分析程序来确定的物质，例如分子。例如，在本发明中，分析物可以是蛋白质、肽、核酸、脂质、碳水化合物或小分子。

利用结合配偶体和荧光标记来量化经结合分子的测定系统是公知的。这样的系统的一些实例包括流式细胞仪、扫描细胞仪、成像细胞仪、荧光显微镜和共聚焦荧光显微镜。

流式细胞仪用于检测荧光。适合于该用途的许多装置是可获得的，并且是本领域技术人员已知的。一些实例包括BCI Navios、Gallios、Aquios和CytoFLEX流式细胞仪。

所述测定可以是免疫测定。可用于本发明的免疫测定的一些实例包括但不限于荧光发光测定(fluoroluminescence assay，FLA)等。所述测定也可在蛋白质阵列上进行。

当结合配偶体是抗体时，也可使用抗体或多抗体夹心测定法。夹心测定是指使用连续的识别事件来建立多种结合配偶体和报道元素的层，以指示特定分析物的存在。夹心测定的一些实例公开于美国专利No.4,486,530和其中提到的参考文献中。

试剂盒

本公开内容提供了包含根据本公开内容的染色缓冲剂组合物的试剂盒。试剂盒可包含：一个或更多个容器，所述容器包含染色缓冲剂组合物、包含聚合物染料的一种或更多种非荧光组分、和生物缓冲剂；以及任选地一个或更多个单独的容器，所述容器包含一种或更多种荧光聚合物染料缀合物。试剂盒可包含在一个容器中的第一聚合物染料的非荧光组分中的一种或更多种和非离子表面活性剂，以及在单独的容器中的至少一种荧光聚合物染料缀合物。试剂盒可包含在一个容器中的第一聚合物染料的非荧光组分中的两种或更多种，以及在单独的容器中的至少一种荧光聚合物染料缀合物。试剂盒可包含含有根据本公开内容的染色缓冲剂的一个或更多个容器、以及各自包含不同的聚合物染料缀合物的多个单独的容器。

试剂盒可包含适合于裂解细胞的一种或更多种组分。试剂盒的一种或更多种另外的组分在单独的容器(例如，单独的管、瓶、或者多孔条带或板中的孔)中提供。

试剂盒还可包含一种或更多种细胞固定试剂，例如多聚甲醛、戊二醛、甲醇、丙酮、福尔马林、或者其任何组合或缓冲剂。此外，试剂盒可包含细胞透化试剂，例如甲醇、丙酮或洗涤剂例如triton、NP-40、皂苷、吐温20、毛地黄皂苷、leucoperm、或者其任何组合或缓冲剂。

试剂盒可包含使用例如与聚合物染料缀合物的多色组缀合的本公开内容的染色缓冲剂组合物的说明。说明可以是印刷形式、试剂盒包装、包装插页或网站地址。

定义

本文中使用的缩写在化学和生物领域中具有其常规含义。

本文中使用的术语“铵”是指具有式NHR3+的阳离子，其中每个R基团独立地是氢或者经取代或未经取代的烷基、芳基、芳基烷基或烷氧基。优选地，每个R基团是氢。

本文中使用的“低聚醚”理解为意指包含具有醚官能度的结构重复单元的低聚物。本文中使用的“低聚物”理解为意指包含相同或不同式的一个或更多个可识别结构重复单元的分子。

本文中使用的术语“磺酸酯/盐官能团”或“磺酸酯/盐”是指游离磺酸根阴离子(-S(＝O)₂O-)及其盐二者。因此，术语磺酸酯/盐涵盖磺酸盐，例如磺酸钠、磺酸锂、磺酸钾和磺酸铵。

本文中使用的术语“磺酰胺基”是指式-SO₂NR-的基团，其中R是氢、烷基或芳基。

本文中使用的术语“烷基”是指具有所示碳原子数的直链或支链饱和脂族基团。例如，C₁-C₆烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基等。另一些烷基包括但不限于庚基、辛基、壬基、癸基等。烷基可包含任意数目的碳，例如1至2、1至3、1至4、1至5、1至6、1至7、1至8、1至9、1至10、2至3、2至4、2至5、2至6、3至4、3至5、3至6、4至5、4至6和5至6的碳。烷基通常是一价的，但也可以是二价的，例如当烷基将两个部分连接在一起时。

术语“共聚单体”或“共聚单体基团”是指聚合物的结构单元，其本身可以是聚合物的重复单元的一部分。

本文中使用的术语“环烷基”是指包含3至12个环原子的饱和或部分不饱和的单环、稠合双环或桥接多环环集合体，或者是指所示原子数单环环，包括例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环辛基。双环和多环环包括例如降冰片烷、十氢萘和金刚烷。例如，C_3-8环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环辛基和降冰片烷。

本文中使用的术语“卤代烷基”是指如上定义的烷基，其中一些或全部氢原子被卤素原子取代。卤素(halogen)(卤代(halo))优选表示氯代或氟代，但也可以是溴代或碘代。例如，卤代烷基包括三氟甲基、氟甲基、1,2,3,4,5-五氟-苯基等。术语“全氟”定义了具有被氟取代的至少两个可用氢的化合物或基团。例如，全氟苯基是指1,2,3,4,5-五氟苯基，全氟甲烷是指1,1,1-三氟甲基，以及全氟甲氧基是指1,1,1-三氟甲氧基。

本文中使用的术语“卤素”是指氟、氯、溴和碘。

本文中使用的术语“烷氧基”是指如上定义的烷基，其具有将烷基与连接点连接的氧原子。烷氧基包括例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、2-丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等。烷氧基可进一步被本文所述的多种取代基取代。例如，烷氧基可被卤素取代以形成“卤代-烷氧基”基团。

本文中使用的术语“烯烃”是指具有至少一个双键的直链或支链烃。烯基的一些实例包括但不限于乙烯基、丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、丁二烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、异戊烯基、1,3-戊二烯基、1,4-戊二烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1,3-己二烯基、1,4-己二烯基、1,5-己二烯基、2,4-己二烯基或1,3,5-己三烯基。烯基通常是一价的，但也可以是二价的，例如当烯基将两个部分连接在一起时。

本文中使用的术语“炔烃”是指具有至少一个三键的直链或支链烃。炔基的一些实例包括但不限于乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、异丁炔基、仲丁炔基、丁二炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、异戊炔基、1,3-戊二炔基、1,4-戊二炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、1,3-己二炔基、1,4-己二炔基、1,5-己二炔基、2,4-己二炔基或1,3,5-己三炔基。炔基通常是一价的，但也可以是二价的，例如当炔基将两个部分连接在一起时。

本文中使用的术语“芳基”或“芳族”是指包含6至16个环碳原子的单环或稠合双环、三环或更大的芳环集合体。例如，芳基可以是苯基、苄基、萘基、二氢菲基(dihydrophenanthrenyl，DHP)、9,10-二氢菲基或芴基。“亚芳基”意指来源于芳基的二价基团。芳基可被选自烷基、烷氧基、芳基、羟基、卤素、氰基、氨基、氨基-烷基、三氟甲基、亚烷基二氧基和氧-C₂-C₃-亚烷基中的一个、两个或三个基团单取代、二取代或三取代；所有这些任选地被进一步取代，例如如上文所限定的；或者芳基可以是1-或2-萘基；或者1-或2-菲基。亚烷基二氧基是与苯基的两个相邻碳原子连接的二价取代基，例如亚甲基二氧基或亚乙基二氧基。氧-C₂-C₃-亚烷基也是与苯基的两个相邻碳原子连接的二价取代基，例如氧亚乙基或氧亚丙基。氧-C₂-C₃-亚烷基-苯基的一个实例是2,3-二氢苯并呋喃-5-基。

优选的芳基是二氢菲基(DHP)、9,10-二氢菲基、萘基、苯基或者被烷氧基、苯基、卤素、烷基或三氟甲基单取代或二取代的苯基，尤其是苯基或者被烷氧基、卤素或三氟甲基单取代或二取代的苯基，并且特别是苯基。

本文中使用的术语“芳氧基”是指O-芳基，其中芳基如上定义。芳氧基可以是未经取代的或被一个或两个合适的取代基取代的。术语“苯氧基”是指芳氧基，其中芳基部分是苯环。本文中使用的术语“杂芳氧基”意指-O-杂芳基，其中杂芳基定义如下。术语“(杂)芳氧基”用于表示所述部分是芳氧基或杂芳氧基。

术语“AFU”是指任意荧光单位(arbitrary fluorescence unit)。

术语“AUF”是指任意荧光单位(arbitrary units of fluorescence)。

本文中使用的术语“聚乙二醇”或“PEG”是指基于乙二醇单体单元的生物相容性水溶性线性聚合物的家族。

本文中使用的术语“杂芳基”或“杂芳族”是指包含5至16个环原子的单环或稠合双环或三环杂芳族环集合体，其中1至4个环原子为杂原子，各自是N、O或S。例如，杂芳基包括吡啶基、吲哚基、吲唑基、喹喔啉基、喹啉基、异喹啉基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、咔唑基、呋喃基、吡咯基、噻唑基、苯并噻唑基、唑基、异唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、咪唑基、噻吩基或任何其他经取代的基团，尤其是被例如烷基、硝基或卤素单取代或双取代的基团。吡啶基表示2-、3-或4-吡啶基，有利地是2-或3-吡啶基。噻吩基表示2-或3-噻吩基。喹啉基优选地表示2-、3-或4-喹啉基。异喹啉基优选地表示1-、3-或4-异喹啉基。苯并吡喃基、苯并噻喃基(benzothiopyranyl)优选地分别表示3-苯并吡喃基或3-苯并噻喃基。噻唑基优选地表示2-或4-噻唑基，并且最优选地，4-噻唑基。三唑基优选地是1-、2-或5-(1,2,4-三唑基)。四唑基优选地是5-四唑基。

优选地，杂芳基是吡啶基、吲哚基、喹啉基、吡咯基、噻唑基、异唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、咪唑基、噻吩基、呋喃基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、异喹啉基、苯并噻吩基、唑基、吲唑基或任何经取代的基团，尤其是单取代的或双取代的基团。

类似地，芳基和杂芳基的取代基是不同的，并且选自：-卤素、-OR’、-OC(O)R’、-NR’R”、-SR’、-R’、-CN、-NO₂、-CO₂R’、-CONR’R”、-C(O)R’、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR”C(O)₂R’、NR’-C(O)NR”R”’、-NH-C(NH₂)═NH、-NR’C(NH₂)═NH、-NH-C(NH₂)═NR’、-S(O)R’、-S(O)₂R’、-S(O)₂NR’R”、-N₃、-CH(Ph)₂、全氟(C₁-C₄)烷氧基和全氟(C₁-C₄)烷基，其数目范围从零至芳环系统上的开放价总数；并且其中R’、R”和R”’独立地选自氢、(C₁-C₅)烷基和杂烷基、未经取代的芳基和杂芳基、(未经取代的芳基)-(C₁-C₄)烷基、和(未经取代的芳基)氧基-(C₁-C₄)烷基。

芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可任选地被式-T-C(O)-(CH₂)_q-U-的取代基替代，其中T和U独立地是-NH-、-O-、-CH₂-或单键，并且q是0至2的整数。或者，芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可任选地被式-A-(CH₂)_r-B-的取代基替代，其中A和B独立地是-CH₂-、-O-、-NH-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-、-S(O)₂NR’-或单键，并且r是1至3的整数。如此形成的新的环的单键之一可任选地被双键替代。或者，芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可任选地被式-(CH₂)_s-X-(CH₂)_t-的取代基替代，其中s和t独立地是0至3的整数，并且X是-O-、-NR’-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-或-S(O)₂NR’-。-NR’-和-S(O)₂NR’-中的取代基R’选自氢或未经取代的(C₁-C₆)烷基。

本文中使用的术语“(杂)芳氨基”是指被芳基取代的胺基(例如，-NH-芳基)。芳氨基也可以是被胺基取代的芳基(例如，-芳基-NH₂)。芳氨基可以是经取代的或未经取代的。

本文中使用的术语“胺”是指具有一个或更多个氨基的如本文所定义的烷基。氨基可以是伯、仲或叔氨基。烷基胺可进一步被羟基取代。可用于本发明的胺包括但不限于乙胺、丙胺、异丙胺、乙二胺和乙醇胺。氨基可将烷基胺与化合物的剩余部分(rest)的连接点连接，位于烷基的ω位置，或者将烷基的至少两个碳原子连接在一起。本领域技术人员将理解，其它烷基胺可用于本发明。

本文中使用的术语“氨基甲酸酯”是指具有结构-NR”CO₂R’的官能团，其中R’和R”独立地选自氢、(C₁-C₈)烷基和杂烷基、未经取代的芳基和杂芳基、(未经取代的芳基)-(C₁-C₄)烷基、和(未经取代的芳基)氧基-(C₁-C₄)烷基。氨基甲酸酯的一些实例包括t-Boc、Fmoc、苄氧基-羰基、alloc、氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、9-(2-磺基)芴基甲基氨基甲酸酯、9-(2,7-二溴)芴基甲基氨基甲酸酯、Tbfmoc、Climoc、Bimoc、DBD-Tmoc、Bsmoc、Troc、Teoc、2-苯乙基氨基甲酸酯、Adpoc、2-氯乙基氨基甲酸酯、1,1-二甲基-2-卤代乙基氨基甲酸酯、DB-t-BOC、TCBOC、Bpoc、t-Bumeoc、Pyoc、Bnpeoc、V-(2-新戊酰基氨基)-1,1-二甲基乙基氨基甲酸酯、NpSSPeoc。

本文中使用的术语“羧酸酯”是指羧酸的缀合碱，其通常可由式RCOO表示。例如，术语“羧酸镁”是指羧酸的镁盐。

本文中使用的术语“经活化酯”是指肽化学中用于促进羧基与氨基酸衍生物的游离氨基容易地缩合的羧基活化基团。这些羧基活化基团的描述可见于肽化学的普通教科书；例如K.D.Kopple,“Peptides and Amino Acids”,W.A.Benjamin,Inc.,New York,1966,第50至51页和E.Schroder and K.Lubke,“The Peptides”；Vol.1,Academic Press,NewYork,1965,第77至128页。

术语“肼”和“酰肼”是指包含单键合的氮的化合物，所述氮中的一个是伯胺官能团。

本文中使用的术语“醛”是指具有-CHO基团的化合物。

本文中使用的术语“硫醇”是指包含由硫-氢键构成的官能团的化合物。硫醇官能团的通用化学结构是R-SH，其中R表示烷基、烯烃、芳基或其它含碳的原子基团。

本文中使用的术语“甲硅烷基”是指Si(R^z)₃，其中每个R^z独立地是烷基芳基或其它含碳的原子基团。

本文中使用的术语“重氮盐”是指具有结构R-N₂ ⁺X^-的有机化合物的基团，其中R可以是任何有机残基(例如，烷基或芳基)，并且X是无机或有机阴离子(例如卤素)。

术语“三氟甲磺酸酯(triflate)”也称为三氟甲磺酸酯(trifluoromethanesulfonate)，是具有式CF₃SO₃的基团。

本文中使用的术语“硼酸”是指结构-B(OH)₂。本领域技术人员认识到，在猝灭剂合成的不同阶段，硼酸可作为硼酸酯存在。硼酸意指包括这样的酯。本文中使用的术语“硼酸酯(boronic ester)”或“硼酸酯(boronate ester)”是指包含-B(Z¹)(Z²)部分的化合物，其中Z¹和Z²一起形成一个部分，其中在每种情况下与硼连接的原子是氧原子。硼酸酯部分可以是5元环。硼酸酯部分可以是6元环。硼酸酯部分可以是5元环和6元环的混合物。

术语“DABCYL”是4-(二甲基氨基偶氮)苯-4-羧酸的首字母缩写。DABCYL可用作猝灭部分。DABCYL的吸收最大值为约474nm。

术语“DABSYL”是指4-(二甲基氨基偶氮)苯-4”-磺酰氯。DABSYL可用作猝灭部分。

术语“黑洞猝灭剂1”(Black Hole Quencher 1，BHQ-1)是指吸收最大值为约534nm的猝灭部分。

以范围形式表示的值应以灵活的方式解释，以不仅包括作为范围界限明确记载的数值，而且还包括涵盖在该范围内的所有单独的数值或子范围，如同每个数值和子范围都被明确记载一样。例如，“约0.1％至约5％”或“约0.1％至5％”的范围应解释为不仅包括约0.1％至约5％，而且还包括在所示范围内的单独的值(例如，1％、2％、3％和4％)和子范围(例如，0.1％至0.5％、1.1％至2.2％、3.3％至4.4％)。除非另有说明，否则陈述“约X至Y”具有与“约X至约Y”相同的含义。同样，除非另有说明，否则陈述“约X、Y或约Z”具有与“约X、约Y或约Z”相同的含义。

术语“CD”是指分化簇。

流式细胞术中的术语“补偿”是针对荧光溢出(多参数流式细胞术数据的谱重叠)校正的数学方法。例如，可通过从除了专用于测量任何给定荧光染料的检测器之外的所有检测器中除去所述染料的信号来进行补偿。由于荧光染料可具有宽范围的谱，它们可重叠，在数据分析期间造成不期望的混乱。

术语“MdFI”或“MDFI”是指中值荧光强度。

术语MFI＝平均荧光强度。

术语“％募集”是指相关群体的设门细胞的数目。

术语“多色染料缀合物组”或“多色抗体组”是指包含多种不同荧光染料缀合物(例如，CD4-FITC、CD8-PE、CD20-APC、CD3-PC5.5、CD16-FITC、CD25-PE、CD3-ECD、CD38-PC5.5、CD27-PC7、CD10-APC、CD14-APCA700、CD45-AA750、CD8-KRO、CD56-SNv428、CD20-SNv605、CD4-SNv786等)的混合物，其可直接用于染色血液并且在流式细胞术中对其进行分析。

术语“多重”在本文中是指可同时分析多种分析物的测定或其他分析方法。

聚合物染料中可包含水溶性部分以提供提高的水溶性。虽然溶解度的提高可变化，但在一些情况下，与不含水溶性部分的聚合物染料相比的提高可以是至少2倍或更多，例如，5倍、10倍、25倍、50倍、100倍或更多。

术语“水溶性部分”是指在水性环境中(例如，在生理条件下)充分溶剂化的基团，并且赋予其所连接的分子改善的水溶性。水溶性部分可以是在水性环境中充分溶剂化的任何适当的亲水性基团。在一些情况下，亲水性水溶性基团带电荷，例如带正电荷或带负电荷。在某些情况下，亲水性水溶性基团是中性亲水性基团。在一些实施方案中，水溶性部分是亲水性聚合物，例如，聚乙二醇、纤维素、壳聚糖、或其衍生物。水溶性部分可包括但不限于，羧酸盐/酯、膦酸盐/酯、磷酸盐/酯、磺酸盐/酯、硫酸盐/酯、亚磺酸盐/酯、锍、酯、聚乙二醇(PEG)和改性PEG、羟基、胺、铵、胍、吡啶多胺和锍、多元醇、直链或环状糖类、伯胺、仲胺、叔胺或季胺和多胺、膦酸酯基、次膦酸酯基、抗坏血酸基团、乙二醇。在一些实施方案中，水溶性部分是PEG。

术语“PEG”是指聚乙二醇或聚(乙二醇)，是基于由式-(CH₂-CH₂-O-)_n-或其衍生物描述的乙二醇单体单元的生物相容性水溶性线性聚合物家族。水溶性部分可以有赋予至少10mg/mL的水中溶解度的能力。PEG部分可以用作水溶性部分。在一些实施方案中，“n”是1000或更小、500或更小、200或更小、100或更小、50或更小、40或更小、30或更小、20或更小、15或更小，例如3至15或10至15。应当理解，PEG聚合基团可具有任何合适的长度，并且可包含多种端基和/或其他取代基，包括但不限于烷基、芳基、羟基、氨基、酰基、羧酸、羧酸酯、酰氧基和酰氨基端基和/或取代基。“PEG”之后的数字是指平均分子量，其中Mw是指重均分子量，并且Mn是指数均分子量。

术语“聚合物染料的非荧光组分”是指聚合物染料、光漂白的聚合物染料、包含猝灭部分的聚合物染料或非荧光聚合物染料的单体单元，其中聚合物染料的非荧光组分表现出在光激发之后几乎没有至没有重新发射光的能力。聚合物染料的非荧光组分可表现出不超过约0.1、0.06或0.056的量子产率。10微克/mL的聚合物染料的非荧光组分可在450nm处(狭缝ex/em为6nm/4nm；1cm比色皿)发射≤50AFU。当由405nm激光激发时，聚合物染料的非荧光组分可具有小于约50AFU。当在405nm下激发时，聚合物染料的非荧光组分与母体荧光聚合物相比可表现出>95％的原始最大发射强度的猝灭，>98％的原始最大发射强度的猝灭，最高至100％的猝灭。

术语“非荧光聚合物染料”是指根据式(I)的聚合物染料，其在没有光漂白的情况下表现出不超过约0.1、0.06或0.056的量子产率，并且不包含猝灭部分。当由405nm激光激发时，非荧光聚合物染料可具有小于约50AFU。当在405nm下激发时，非荧光聚合物染料与母体荧光聚合物相比可表现出>95％的原始最大发射强度的猝灭，>98％的原始最大发射强度的猝灭，最高至100％的猝灭。

本文中使用的术语“非特异性结合”通常是指不是由特异性结合引起的任何结合，并且更特别地是指聚合物染料缀合物通过除了结合配偶体与靶分析物的特异性结合之外的手段的结合。非特异性结合可由数个因素引起，所述因素包括聚合物的疏水性、免疫络合剂、带电荷的蛋白质、和抗体干扰蛋白，其可存在于染色缓冲剂或生物样品中)。非特异性结合的一种类型是可发生在一种或更多种、或者两种或更多种荧光聚合物染料缀合物之间的聚合物-聚合物相互作用。测试染色缓冲剂组合物中的非特异性结合可以通过以下来评估：例如，将生物样品中的多色荧光聚合物染料缀合物的混合物的FCA点图与同一样品中混合物的单独单色荧光聚合物染料缀合物的FCA点图进行比较，例如，根据本文中提供的方法。例如，如果溶液有效地阻止非特异性结合聚合物-聚合物相互作用，则相应的细胞群体将出现与单独使用单色缀合物获得的染色类似的良好补偿。相反，如果溶液的是低效的，则群体不会对齐并且将看起来倾斜。

用于测量根据本公开内容的用于降低非特异性结合(例如聚合物-聚合物相互作用)的染色缓冲剂组合物的效率的替代方法在缀合物被单独使用与混合使用时使用了缀合物的阴性和阳性群体的MFI。

术语“光漂白的染料”是指最初包含经受高强度照射使得其可不再发荧光的荧光团的染料。在一些实施方案中，光漂白的聚合物表现出不超过0.1、或不超过0.06、或不超过0.056、不超过0.05、不超过0.02、或不超过0.015Φ的量子产率(QY)。在一些实施方案中，当用405nm激光激发时，光漂白的聚合物表现出小于约50个任意荧光单位(AFU)。当在405nm下激发时，光漂白的染料与母体荧光聚合物相比可表现出>95％的原始最大发射强度的猝灭，>98％的原始最大发射强度的猝灭，最高至100％的猝灭。

荧光团可以重复经历荧光过程。这意味着荧光团分子理论上可以多次产生信号。实际上，荧光团在其激发寿命期间的结构不稳定性可使其易于降解。高强度照射可以导致荧光团改变其结构使得其可不再发荧光并且这被称为光漂白。

术语“量子产率”(QY)(Φ)或“荧光量子产率”是指发射的光子数与吸收的光子数之比。量子产率与仪器设置无关并描述了荧光团如何有效地将激发能转化成荧光。实验性地，相对荧光量子产率可以通过用与测试染料相同的实验参数(激发波长、狭缝宽度、光电倍增管电压等)测量已知量子产率的荧光团的荧光来确定。量子产率可通过本领域已知的任何方法来确定。例如，QY可以在选择的激发波长下在荧光分光光度计或荧光光谱仪中按照制造商的说明来确定。例如，量子产率(QY)可在Shimadzu Rf-6000荧光光谱仪上通过测量来自染色缓冲剂的经稀释PBS溶液的在428nm下的发射强度来确定，其中在405nm下的吸光度＝0.05(在405nm下激发，ex狭缝1.5，em狭缝3.0，1cm石英比色皿)。量子产率可例如通过在相同的实验条件下比较从样品中测量的强度和从NHS Pacific Blue(在PBS1×中QY＝0.78)溶液中测量的强度来计算。在一些实施方案中，可以确定QY，例如，Lawson-Wood etal.,Application Note-Fluorescence Spectroscopy,Determination of relativefluorescence quantum yield using the FL5600 fluorescence spectrometer,2018,PerkinElmer,Inc。所选激发波长可以是例如405nm。在一些实施方案中，猝灭聚合物或光漂白聚合物的QY可与不存在光漂白且不包含猝灭部分的母体荧光聚合物进行比较。

术语“荧光染料”是指包含可光激发的荧光团的染料，该荧光团可以在光激发之后重新发射光。术语“荧光染料”涵盖荧光聚合物染料和荧光非聚合物染料(包括荧光单体染料和其他传统荧光染料)二者。荧光聚合物染料可以是任何适当的荧光聚合物染料(例如，包含根据本公开内容的结构)。荧光聚合物染料也是可商购的。例如，SuperNova^TM(“SN”)v428(Beckman Coulter,Inc.)是这样的荧光聚合物染料：由激发最大值为414nm、发射峰为428nm的紫色激光(405nm)最佳激发，并且可使用450/50带通滤波器或等效物进行检测。SNv605和SN v786是来源于核心SN v428聚合物染料的串联聚合物染料。两者共用相同的吸光度特征，其中最大激发在414nm下。在SN v605和SN v786的发射峰分别在605nm和786nm下的情况下，使用流式细胞仪的610/2和780/60nm带通滤光片对其进行最佳检测。

术语“荧光团”是指在光激发之后可以重新发射光的荧光化合物。荧光团可通常含有数个组合的芳族基团，或具有数个p pi键的平面和环状分子。

术语“患者”、“对象”包括但不限于人，该术语还可涵盖其他哺乳动物、或者家养动物或外来动物，例如，狗、猫、雪貂、兔、猪、马、牛、鸟类或爬行动物。

除非另有说明，否则术语短语“室温”是指18℃至27℃。

除非另有说明，否则术语“百分比”或“％”是指重量百分比。

短语“即用型试剂”、“即用型试剂组合物”、“工作浓度试剂”和“工作浓度试剂组合物”是指以适合用于例如对用于流式细胞术分析(flow cytometry analysis，FCA)的生物样品进行染色的聚合物染料缀合物的混合物的约1×工作浓度产生的染色缓冲剂组合物。

短语“浓缩的染色缓冲剂”或“浓缩的染色缓冲剂组合物”是指以例如约10倍浓度系数(10×)产生的染色缓冲剂组合物，其用于稀释(例如，用稀释剂，例如生物缓冲剂或水)以提供工作浓度染色缓冲剂组合物，该工作浓度染色缓冲剂组合物在对用于流式细胞术分析的生物样品进行染色时可用于降低多色组中的非特异性聚合物相互作用。浓缩的染色缓冲剂组合物可以以是工作浓度染色缓冲剂组合物的1倍(1×)至至少10倍(10×)，或者至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍浓缩的浓度来制备并保持稳定。

在一些实施方案中，工作浓度染色缓冲剂组合物当在2℃至8℃(偏移至15℃至37℃)或在环境温度19℃至27℃范围内的温度下被储存在未开封的原始容器中时，自制备日期起至少3个月、至少6个月、至少9个月、至少12个月、至少18个月或至少24个月或更长时间是稳定的。在一些实施方案中，浓缩的染色缓冲剂组合物当在2℃至8℃(偏移至15℃至37℃)或在环境温度19℃至27℃范围内的温度下被储存在未开封的原始容器中时，自制备日期起至少3个月、6个月、9个月、12个月、18个月、24个月、30个月、或36个月或更长时间是稳定的。

首字母缩写“SN”是指SuperNova^TM。

首字母缩写“SSC”是指侧向散射(side scatter)。

术语“WBC”是指白细胞。

当提及可测量值(例如化合物的量、剂量、时间、温度等)时，术语“约”意指涵盖指定量的10％、5％、1％、0.5％或甚至0.1％的变化，以及用于测量该值的测试方法中的至少行业标准变化。

在本文件中，除非上下文另有明确规定，否则没有数量词修饰的名词用于包括一个/种或多于一个/种。除非另外指出，否则术语“或/或者”用于指非排他性的“或/或者”。另外，应当理解，本文中使用的并且没有另外限定的措辞或术语仅出于描述的目的而不是限制的目的。章节标题的任何使用均旨在帮助阅读本文件而不应被解释为限制。此外，与章节标题相关的信息可以出现在该特定章节之内或之外。此外，本文件中提及的所有出版物、专利和专利文件均通过引用以其整体并入本文，如同通过引用单独并入一样。如果本文件与如此通过引用并入的那些文件之间的用法不一致，则在并入的参考文献中的用法应被考虑为对本文件的用法的补充；对于相互矛盾的不一致情形，则以本文件中的用法为准。

本文中使用的“降低”或“消除”聚合物染料缀合物的非特异性结合可以是指当“阴性”(例如，阴性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞群)平均荧光强度(mean fluorescenceintensity，MFI)相对于不使用第一聚合物染料的非荧光组分时按％计降低至少约50％(例如，至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少99％或更多；约50％至约95％、约50％至约75％、约60％至约80％、或者约65％至约90％)。换言之，单核细胞、粒细胞和淋巴细胞背景染色中的至少一种的％降低相对于不使用表面活性剂时按％计降低至少约50％(例如，至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少99％或更多；约50％至约95％、约50％至约75％、约60％至约80％、或者约65％至约90％)。

在本文中所述的方法中，除了当明确记载时间或操作顺序时之外，可以在不脱离本发明原则的情况下以任何顺序进行步骤。此外，除非明确的要求语言陈述单独进行指定的步骤时，否则可以同时进行指定的步骤。例如，要求保护的进行X的步骤和要求保护的进行Y的步骤可以在单个操作中同时进行，并且所得方法将落入要求保护的方法的文字范围内。

设想上述每个实施方案都可适用于与本文中描述的其他实施方案的每个组合。例如，对应于式(I)的实施方案同样被设想为适用于式(VIII)-(XIV)、(XVIII)、(XIX)、(XX)。作为另一个实例，对应于式(VIII)-(XIV)、(XVIII)、(XIX)、(XX)中任一者的实施方案同样被设想为适用于式(I)。

本文中使用的术语“显著(substantially)”是指大多数或大部分，例如至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.99％、或至少约99.999％或更多。

本文中使用的术语“显著没有”或“显著不含”是指小于约1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.001％，或小于约0.0005％或更少，约0％、低于定量限、低于可检测限、或0％。

本领域的技术人员将理解，在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下，可对本文中所述的实施方案进行许多修改。因此，描述并非旨在也不应被解释为限于给出的实例，而是应被授予由所附权利要求书及其等同文件提供的全部保护范围。另外，可以使用本公开内容的一些特征而不相应地使用另一些特征。因此，提供以上描述或举例说明性实施方案的目的是为了举例说明本公开内容的原理而不是对其进行限制，并且可以包括对其的修改和其排列。

实施例

通过参考以举例说明的方式提供的以下实施例可更好地理解本发明。本发明不限于本文中给出的实施例。

实施例1：DHP聚合物染料的制备

方法1：在圆底烧瓶中，取二溴DHP和二硼DHP单体(1:1)二者到(DMF-水)混合物中，并用氮吹扫10分钟。在氮下，将约20当量的CsF和10％的Pd(OAc)₂混合，并在80摄氏度下加热。使用UV-Vis谱和SEC色谱来监测聚合。之后向反应混合物添加包含合适官能团的加帽剂(选自G1)，并在3小时之后添加第二加帽剂(选自G2)。在反应之后，将粗反应混合物蒸发出，并通过凝胶过滤柱以除去小有机分子和低MW低聚物。之后，将粗聚合物通过配备有100KMWCO膜的切向流过滤系统。使用20％乙醇洗涤，直至滤液的吸收减少。

方法2：或者，聚合可通过使DHP分子的溴硼酸酯自聚合来完成。在圆底烧瓶中，取DHP溴硼酸酯到(DMF-水)混合物中，并用氮吹扫10分钟。在氮下，将约10当量的CsF和5％的Pd(OAc)₂混合，并在80摄氏度下加热。使用UV-Vis谱和SEC色谱来监测聚合。之后向反应混合物添加包含合适官能团的加帽剂(选自G1)，并在3小时之后添加第二加帽剂(选自G2)。在反应之后，将粗反应混合物蒸发出，并通过凝胶过滤柱以除去小有机分子和低MW低聚物。之后，将粗聚合物通过配备有100K MWCO膜的切向流过滤系统。使用20％乙醇洗涤，直至滤液的吸收减少。

方法3：在圆底烧瓶中，取二溴二氢菲和二硼dihydrophanenthrene单体(1:1)二者并溶解在包含10当量的K₂CO₃和3％ Pd(PPh₃)₄的THF-水(4:1)混合物中。将反应混合物放在Schlenk线上，并用三次冷冻-泵-融化循环来脱气，并随后加热至80摄氏度。在氮下，在剧烈搅拌18小时的情况下。之后在过量氮压力下通过套管向反应混合物添加包含合适官能团的加帽剂(选自G1)，并在3小时之后添加第二加帽剂(选自G2)。在反应之后，将粗反应混合物蒸发出，并通过凝胶过滤柱以除去小有机分子和低MW低聚物。之后，将粗聚合物通过配备有100K MWCO膜的切向流过滤系统。使用20％乙醇洗涤，直至滤液的吸收减少。

方法4：或者，聚合可通过使二氢菲分子的溴硼酸酯自聚合来完成。在圆底烧瓶中，取二氢菲溴硼酸酯并溶解在包含10当量的K₂CO₃和3％Pd(PPh₃)₄的THF-水(4:1)混合物中。将反应混合物放在Schlenk线上，并用三次冷冻-泵-融化循环来脱气，并随后加热至80摄氏度。在氮下，在剧烈搅拌18小时的情况下。之后在过量氮压力下通过套管向反应混合物添加包含合适官能团的加帽剂(选自G1)，并在3小时之后添加第二加帽剂(选自G2)。在反应之后，将粗反应混合物蒸发出，并通过凝胶过滤柱以除去小有机分子和低MW低聚物。之后，将粗聚合物通过配备有100K MWCO膜的切向流过滤系统。使用20％乙醇洗涤，直至滤液的吸收减少。

实施例2：芴-DHP共聚物染料的制备

方法1：在圆底烧瓶中，取二溴DHP和二硼芴单体(1:1)二者到(DMF-水)混合物中，并用氮吹扫10分钟。在氮下，将约20当量的CsF和10％的Pd(OAc)₂混合，并在80摄氏度下加热。使用UV-Vis谱和SEC色谱来监测聚合。之后向反应混合物添加包含合适官能团的加帽剂(选自G1)，并在3小时之后添加第二加帽剂(选自G2)。在反应之后，将粗反应混合物蒸发出，并通过凝胶过滤柱以除去小有机分子和低MW低聚物。之后，将粗聚合物通过配备有100KMWCO膜的切向流过滤系统。使用20％乙醇洗涤，直至滤液的吸收减少。

方法2：在圆底烧瓶中，取二溴芴和二硼DHP单体(1:1)二者到(DMF-水)混合物中，并用氮吹扫10分钟。在氮下，将约20当量的CsF和10％的Pd(OAc)₂混合，并在80摄氏度下加热。使用UV-Vis谱和SEC色谱来监测聚合。之后向反应混合物添加包含合适官能团的加帽剂(选自G1)，并在3小时之后添加第二加帽剂(选自G2)。在反应之后，将粗反应混合物蒸发出，并通过凝胶过滤柱以除去小有机分子和低MW低聚物。之后，将粗聚合物通过配备有100KMWCO膜的切向流过滤系统。使用20％乙醇洗涤，直至滤液的吸收减少。

方法3：在圆底烧瓶中，取二溴二氢菲和二硼芴单体(1:1)二者并溶解在包含10当量K₂CO₃和3％ Pd(PPh₃)₄的THF-水(4:1)混合物中。将反应混合物放在Schlenk线上，并用三次冷冻-泵-融化循环来脱气，并随后加热至80摄氏度。在氮下，在剧烈搅拌18小时的情况下。之后在过量氮压力下通过套管向反应混合物添加包含合适官能团的加帽剂(选自G1)，并在3小时之后添加第二加帽剂(选自G2)。在反应之后，将粗反应混合物蒸发出，并通过凝胶过滤柱以除去小有机分子和低MW低聚物。之后，将粗聚合物通过配备有100K MWCO膜的切向流过滤系统。使用20％乙醇洗涤，直至滤液的吸收减少。

方法4：在圆底烧瓶中，取二溴芴和二硼二氢菲单体(1:1)并溶解在包含10当量K₂CO₃和3％ Pd(PPh₃)₄的THF-水(4:1)混合物中。将反应混合物放在Schlenk线上，并用三次冷冻-泵-融化循环来脱气，并随后加热至80摄氏度。在氮下，在剧烈搅拌18小时的情况下。之后，在过量氮压力下通过套管向反应混合物添加包含合适官能团的加帽剂(选自G1)，并在3小时之后添加第二加帽剂(选自G2)。在反应之后，将粗反应混合物蒸发出，并通过凝胶过滤柱以除去小有机分子和低MW低聚物。之后，将粗聚合物通过配备有100K MWCO膜的切向流过滤系统。使用20％乙醇洗涤，直至滤液的吸收减少。

实施例3：荧光发射谱的比较

对芴(Fl-Fl)、二氢菲(DHP-DHP)和芴-DHP(DHP-Fl)聚合物的荧光发射谱进行了比较。包含DHP的聚合物显示出在其426至428nm下的荧光最大值方面的显著差异，而基于芴的聚合物显示出421nm的最大值。

实施例4：吸收谱的比较

测量了芴(Fl-Fl)聚合物和二氢菲(DHP-DHP)聚合物二者的吸收谱。该图示出了，DHP-DHP聚合物(黑色曲线)在390和410nm下的吸收，而Fl-Fl(灰色曲线)聚合物显示出约400nm的最大值。样品是在不同浓度下测量的。

实施例5：CD4信噪比

对用经新的聚合物标记的抗人CD4和经Pacific Blue-标记的CD4染色的经裂解全血进行了流式细胞术分析。聚合物染料的阳性信号强度是Pacific Blue的近5倍高。

实施例6：在流式细胞术的样品制备中用伴随固定缓冲剂进行表面染色的程序

在该程序中，将根据本公开内容的染色缓冲剂添加到试管中，随后添加染料缀合物，以避免染料缀合物之间随时间可发生的任何可能的非特异性相互作用。固定是在用荧光抗体进行染色之后，使得白细胞制备物能够储存数小时而没有恶化的阶段。裂解溶液可用于在制备用于流式细胞术的生物样品中裂解红细胞。

1.通过将25μL未稀释的IOTest 3 10×固定溶液(AO7800,Beckman Coulter,Inc.)添加至1mLVersaLyse^TM裂解溶液(AO9777,Beckman Coulter,Inc.)来临时制备“固定和裂解”混合物。根据待裂解的生物测试样品的数目，制备足够体积的“固定和裂解”混合物(每管1mL混合物)。

2.在每个试管中添加10μL根据本公开内容的染色缓冲剂。不包含聚合物染料缀合物的混合物的试管不需要染色缓冲剂。

3.添加适当体积的染料缀合物。轻轻涡旋管。

4.向每个管中添加100μL测试样品。轻轻涡旋管。

5.在室温(18℃至25℃)下孵育15至20分钟，避光。然后进行红细胞的裂解：

6.添加1ml临时制备的“固定和裂解”混合物并立即涡旋一秒。

7.在室温下孵育10分钟，避光。

8.在室温下在150×g下离心5分钟。

9.通过抽吸去除上清液。

10.使用3mLPBS重悬细胞沉淀物。

11.在室温下在150×g下离心5分钟。

12.通过抽吸去除上清液。

13.使用0.5mLPBS加0.1％甲醛(0.1％甲醛PBS可通过将12.5μL的IOTest 3固定溶液(PN参见目录)以其10×浓度在1mL PBS中稀释来获得)重悬细胞沉淀物。

这些制备物可在2℃至8℃并避光下保持24小时，随后通过流式细胞术分析。

实施例7：光漂白聚合物染料的程序

如下制备了光漂白的聚合物染料。简言之，该过程包括解冻紫色聚合物染料428，在PBA/PF-68 0.02％中以1mg/mL稀释聚合物染料，将经稀释染料放到Roux玻璃烧瓶中，并且将烧瓶放到UV室(Bio-Link-BLX)中。将稀释的聚合物染料暴露于UV光直至达到荧光值低于或等于50AFU。光漂白的染料的剩余荧光通过荧光测定(荧光计LS50B，Perkin Elmer)来测量。10微克/mL的光漂白的染料在450nm(狭缝ex/em为6nm/4nm；1cm比色皿)下发射≤50AFU，以通过荧光测定标准。当在血液样品的FCA中在根据本公开内容的组合物中使用时，发现聚合物染料428需要进行有效的光漂白以避免出现非特异性染色。发现光漂白染料的剩余荧光对缀合物的溢出具有直接影响，因此对流式细胞术结果具有直接影响。图6示出了用聚合物染料缀合物CD56-SNv428/CD4-SN786处理的染色且裂解样品的两个FCA点图。左图示出了无效光漂白的聚合物染料的作用，其表现出不期望的缀合物溢出(箭头)。右图示出了两种聚合物染料缀合物CD56-SNv428/CD4-SN786的流式细胞术二维点图，其中样品用根据本公开内容的组合物制备，所述组合物包含当用405nm激光(AFU狭缝ex/em6nm/4nm、荧光计LS50B Perkin Elmer)激发时，在10ug/mL下表现出不超过QY 0.056和<47AFU的有效光漂白聚合物染料428。缀合物之间的溢出显著降低。

实施例8：包含聚合物染料的单体组分和光漂白的聚合物染料的染色缓冲剂组合物

设计染色缓冲剂组合物的初期努力涉及使用两种紫色聚合物染料缀合物的混合物在具有PF-68的PBS生物缓冲剂中测试单独的候选组分，并且获得FCA点图以评价性能。分别对示例性单体A(100至800ug/次测试)、马来酰亚胺紫色聚合物染料428(m428)(3.1至100ug/次测试)、羧基紫色聚合物染料428(3.1至100ug/次测试)、氨基聚合物染料428(3.1至100ug/次测试)、光漂白的马来酰亚胺428(m428)染料(含和不含半胱胺HCl)、光漂白的羧基428(c428)染料、光漂白的氨基聚合物染料428(a428)、PEG或Empigen两性离子表面活性剂进行了评价。分别发现示例性单体A和光漂白的染料有效降低染料缀合物之间的非特异性相互作用。

基于在单独的组分下的结果，使用示例性单体A和根据实施例7的光漂白的紫色染料428开发了测试染色缓冲剂组合物。

将PF-68洗涤剂临时添加到PBS/BSA/NaN₃中以达到0.02％的最终浓度。该混合物在室温下储存直至其用于配制缓冲剂。通过混合组分来配制组合物以获得表1中示出的组合物。

表1.染色缓冲剂组合物A

实施例9：包含聚合物染料的单体组分和光漂白的聚合物染料的测试染色缓冲剂组合物的性能

聚合物染料抗体缀合物是与聚合物染料缀合的抗体，当它们混合在一起时可非特异性地相互作用。设计了染色缓冲剂组合物以便降低、显著降低或消除非特异性聚合物染料缀合物相互作用，以允许客户使用其组(panel)中多于一种聚合物染料缀合物进行多色实验。

在本实施例中，与其他染色缓冲剂制造商不同，染料荧光的猝灭是根据本公开内容通过将染料暴露于UV光来进行的。简言之，光漂白是通过将染料暴露于UV光(365nm)来进行的。

光漂白的紫色染料428通过以下来制备：解冻马来酰亚胺紫色染料428，将其以1mg/mL在PBS/PF-68 0.02％中稀释，将稀释的染料放到Roux玻璃烧瓶中，将烧瓶放到UV室(Bio-Link-BLX)中，并且进行3个周期的10小时365nm UV暴露。光漂白染料表现出不超过0.056的量子产率(QY)。当用405nm激光(10ug/mL，AFU狭缝ex/em 6nm/4nm，荧光计LS50BPerkin Elmer)激发时，也通过荧光测定法测量了光漂白染料的剩余荧光为≤47AFU。

制备了测试染色缓冲剂组合物，其包含光漂白的紫色染料428、示例性单体A(染料428的亚基)、PF-68 0.02％、1×PBS/BSA2mg/mL/NaN₃0.1％。

图1中示出了在预添加或没有预添加测试染色缓冲剂的情况下，使用三种SuperNova(SNv)染料抗体缀合物CD56-SNv428、CD20-SNv605和CD4-SNv786的混合物的染色且裂解的全血样品的FCA点图的比较。对淋巴细胞(lymphocyte，LY)设门。用CytoFLEX LX流式细胞仪使用CytExpert采集软件进行采集。用Kaluza分析软件进行分析。如图1上部三幅图中所示，在不存在测试染色缓冲剂的情况下可发生异常染色并且数据可出现欠补偿。如下部三幅图中所示，在存在测试染色缓冲剂的情况下，表明了缀合物之间显著降低的溢出。

测试染色缓冲剂的效率可以通过将阳性群体的溢出中值与阴性群体的同一轴上的中值分开的FCA分析进行评价。图1上部图示出了显示指示聚合物染料缀合物之间非特异性相互作用的溢出的不含染色缓冲剂的混合物的FCA点图。相比之下，使用测试染色缓冲剂的图1下部三副图示出了表现出缓冲剂降低非特异性聚合物染料缀合物相互作用的效率的FCA点图。

在另一个实验中，如本文中所述，测试染色缓冲剂是通过将示例性单体A和光漂白染料428在PBS/BSA/NaN3/PF-68的溶液中混合来制备的(100次测试/瓶；10μL/次测试)。将聚合物染料缀合物添加在测试染色缓冲剂顶部，随后添加全血生物样品。使用了包含三种SuperNova聚合物染料缀合物的混合物的多色组，包括CD56-SNv428+CD19-SNv605+CD4-SNv786。图2A示出了使用不含染色缓冲剂的多色组的染色且裂解的全血样品的FCA点图。图2B示出了具有比较BD Horizon^TMBrilliant染色缓冲剂(BD Biosciences)的多色组以及染色且裂解的全血样品的FCA点图。图2C示出了具有测试染色缓冲剂的多色组和全血样品的FCA点图。与不含缓冲剂的多色组相比，比较和测试染色缓冲剂组合物表现出降低的溢出。当与现有技术比较缓冲剂相比时，测试染色缓冲剂组合物表现出稍微降低的溢出，表明降低的非特异性聚合物-聚合物相互作用。

实施例10：猝灭的聚合物

制备了包含多种猝灭部分的聚合物染料，并且研究了其在染色缓冲剂中阻止非特异性聚合物-聚合物相互作用的可能用途。将荧光聚合物染料与猝灭部分缀合，以便形成具有降低或消除的荧光的猝灭聚合物。发现将猝灭的聚合物添加至两种或更多种聚合物染料缀合物的混合物中降低或消除了非特异性聚合物-聚合物相互作用。

将多种紫色可激发荧光聚合物染料与多种猝灭剂部分缀合。通过类似于本公开内容的那些的方法，由紫色可激发荧光聚合物染料和约10至15倍摩尔过量的多种可商购猝灭剂部分制备了约15种不同的猝灭聚合物。包含根据本公开内容的结构的三种不同的紫色可激发荧光聚合物(聚合物1、聚合物2、聚合物3)选自80至150kDa、或90至120kDa的不同MW范围。可商购的猝灭部分包括Dabcyl Q、Dabcyl plus、Anaspec 490Q、Dylight 425Q、Dyomics425Q和Dyomics 505Q。具有量子产率的示例性猝灭聚合物在表2中示出。

表2.含或不含猝灭部分的聚合物的量子产率(QY)

*Q/P＝猝灭部分/聚合物

图3示出了以下猝灭聚合物的波长(nm)vs.AFU的荧光谱的图：聚合物1Dabcyl(QY0.01)、聚合物2Dabcyl(QY 0.005)、聚合物2DY425Q(QY 0.01)、聚合物3Dabcyl(QY 0.005)、聚合物3Dabcyl plus(QY 0.015)和聚合物3DY425Q(QY 0.009)。图3的插图示出了代表性母体荧光聚合物(聚合物3QY 0.54)在与猝灭部分缀合以获得猝灭的聚合物3之前和之后的图，所述猝灭的聚合物3在被405nm激光激发时表现出显著降低的荧光QY。QY是指量子产率。在405nm下激发时，与未猝灭聚合物3(QY 0.54)相比，表2中的猝灭聚合物各自表现出<0.02、≤0.015或≤0.01的量子产率(QY)。

实施例11：猝灭的聚合物的评价

表2的猝灭的聚合物在如下FCA测定中使用单一染料缀合物或染料缀合物组和全血样品进行评价。在100uL全血中添加10uL体积(500ug/mL)的猝灭的聚合物。

在包含PBS/BSA/NaN3/PF-68(如果需要的话)的缓冲剂中，对于1个缀合物使用5微克(5ug)的猝灭的聚合物，对于2个缀合物使用10微克(10ug)的猝灭的聚合物。将抗体缀合物(各1ug)添加在添加剂混合物顶部，随后添加全血。在孵育20分钟之后，添加1mLVersaFix，随后孵育15分钟。最后，用3mL的1×PBS进行洗涤。用0.5mL的1×PBS或1×PBS/0.1％ FA重悬沉淀物。

研究了猝灭的聚合物降低非特异性结合和减少群体扩散的能力。

图4示出了在没有染色缓冲剂添加剂猝灭的聚合物的情况下，当对淋巴细胞设门时，在用两种聚合物染料缀合物CD4-UV可激发聚合物染料(CD4-UVEPD)和CD20-紫色可激发聚合物染料(CD20-VEPD)(二者均为Beckman Coulter Life Sciences，左上图)的混合物、以及两种聚合物染料缀合物CD4-BUV395(BD Biosciences)和CD20-VEPD(Beckman CoulterLife Sciences，右上图)的混合物进行染色之后，染色且裂解的全血样品的FCA点图(上排，从左至右)。当两种不同的染料缀合物在没有猝灭的聚合物的情况下混合时，点图显示出非特异性相互作用和相关的溢出。在用CD4-UVEPD和CD20-VEPD(左下图)或BUV395-CD4和CD20-VEPD(右下图)进行染色期间，添加根据本公开内容的猝灭的聚合物(猝灭的聚合物2DYQ 425)降低了非特异性相互作用和溢出。

在使用包含猝灭的聚合物3DYQ425(10uL)的测试染色缓冲剂的情况下，显示出类似的改善的FCA结果。(数据未显示)。

图5示出了在没有染色缓冲剂添加剂猝灭的聚合物的情况下，当对淋巴细胞设门时，在没有缓冲剂的情况下用两种聚合物染料缀合物CD4-UV可激发聚合物染料(CD4-UVEPD)和CD20-紫色可激发聚合物染料(CD20-VEPD)(二者均为Beckman Coulter LifeSciences，左上图)的混合物、以及用两种聚合物染料缀合物CD4-BUV395(BD Biosciences)和CD20-VEPD(Beckman Coulter Life Sciences，右上图)的混合物进行染色之后，染色且裂解的全血样品的FCA点图。当两种不同染料缀合物的混合物各自在没有猝灭的聚合物的情况下混合时，点图显示出非特异性相互作用和相关的溢出。在用CD4-UVEPD和CD20-VEPD(左下图)或者BUV395-CD4和CD20-VEPD(右下图)进行染色期间，添加根据本公开内容的猝灭的聚合物(猝灭的聚合物2-Dabcyl)降低了非特异性相互作用和溢出。

在使用其他猝灭的聚合物：聚合物1-Dabcyl，Q/P 5.6(10uL)、聚合物3-Dabcyl，Q/P 7.14(10uL)和聚合物3-Dabcyl plus、Q/P 5.4(10uL)的情况下，显示出类似的改善的FCA结果。(数据未显示)。选择聚合物Dabcyl猝灭聚合物用于进一步开发，因为它们表现出非常好的降低聚合物染料缀合物中聚合物-聚合物相互作用、溢出的能力。

实施例12：包含猝灭的聚合物的示例性染色缓冲剂组合物

使用根据实施例10的猝灭的聚合物开发了染色缓冲剂组合物。如实施例10中所示，发现染色缓冲剂组合物B适合于降低多色聚合物染料缀合组中非特异性聚合物-聚合物相互作用、溢出。

将PF-68洗涤剂临时添加到PBS/BSA/NaN₃中以达到0.02％的最终浓度。该混合液在室温下储存直至其用于配制缓冲剂。通过将组分进行混合来配制组合物以获得表3中示出的组合物。

表3.染色缓冲剂组合物B

组分	最终工作浓度(1×)	浓缩的组合物(10×)	量/次测试
				猝灭的聚合物	0.3至1.5mg/mL	3至15mg/mL	3至15ug/次测试
PF-68	0.02％(重量/体积)	0.2％(重量/体积)	N/A
				PBS/BSA/NaN3	1X/2mg/mL/0.1％	N/A	N/A

实施例13：包含聚合物染料的单体组分和猝灭聚合物染料的示例性染色缓冲剂组合物

开发了包含示例性单体A(紫色428SuperNova染料的子组分)和聚Dabcyl串联染料的组合物。聚Dabcyl串联染料是通过将紫色428染料单体与Dabcyl分子缀合而制备的。Dabcyl是吸收由紫色428SuperNova染料在其被405nm激光激发时发射的荧光的猝灭剂分子。因此，聚Dabcyl串联染料不发射太多荧光。

一般聚dabcyl串联染料具有根据式(XXIV)的结构。每个聚合物主链中存在约5至8个dabcyl染料。

将两种SuperNova聚合物染料缀合物(CD3-SN428和CD19-SN605)分别与示例性单体A+聚-Dabcyl添加剂进行预配制或不进行预配制，随后添加在生物样品上。缓冲剂和方案在其它方面类似于实施例10。图7示出了CD3-SN428/CD19-SN605在没有添加剂的情况下(左图)和在有示例性单体A+聚Dabcyl添加剂的情况下(右图)的二维FCA点图。在存在添加剂的情况下，发现聚合物染料缀合物的非特异性相互作用显著降低。

发现聚-Dabcyl紫色聚合物-dabcyl串联(XXIV)猝灭聚合物在降低不同聚合物染料之间的非特异性相互作用方面是有效的。

将PF-68洗涤剂临时添加到PBS/BSA/NaN₃中以达到0.02％的最终浓度。该混合液在室温下储存直至其用于配制缓冲剂。通过将组分混合来配制染色缓冲剂组合物C以获得表4中示出的组合物。

表4.染色缓冲剂组合物C

组分	最终工作浓度(1×)	浓缩的组合物(10×)	量/次测试
				示例性单体A	20至40mg/mL	200至400mg/mL	200至400ug/次测试
猝灭的聚合物	0.5至1.5mg/mL	5至15mg/mL	5至15ug/次测试
				PF-68	0.01％至0.05％	0.1％至0.5％	N/A
PBS/BSA/NaN3	1X/2mg/mL/0.1％	N/A	N/A

实施例14：具有蛋白质稳定剂和非离子表面活性剂的猝灭的聚合物组合物的性能

评价了与商业BD Horizon^TMBrilliant染色缓冲剂Plus相比，在存在和不存在非离子表面活性剂Pluronic F-68(1％)的情况下，包含猝灭紫色聚合物2-Dabcyl的猝灭聚合物染料组合物的性能。使用染料缀合物SuperNova SN v428-CD19(Beckman Coulter LifeSciences)和BV650-CD4(Brilliant紫色650^TM抗人CD4抗体，BioLegend，Inc.)的混合物在来自供体A的经处理血液样品中进行来自供体A的染色和溶解的血液样品的FCA。

图8示出了在没有猝灭的聚合物(左上)、有1％ PF-68(右上)、有10ug猝灭的聚合物2-Dabcyl(左下)、有10ug猝灭的聚合物2-Dabcyl和1％ PF-68非离子表面活性剂(右下)的情况下，血液样品中染料缀合物SuperNova SN v428-CD19和BV650-CD4的混合物的FCA点图。与没有缓冲剂的对照样品(MFI 7804)相比，有10ug猝灭聚合物2-Dabcyl(MFI 2172)和1％ PF-68(MFI 2400)的测试样品组合物表现出降低的非特异性结合。与对照样品相比，有10ug猝灭聚合物2-Dabcyl和1％ PF-68(MFI 1327)的测试样品组合物表现出改善的MFI降低、改善的非特异性结合降低和改善的聚合物-聚合物相互作用降低。

实施例15.单独的非离子表面活性剂在两种不同聚合物染料缀合物的混合物中的流式细胞术性能

发现非离子表面活性剂是用于降低染色缓冲剂组合物中非特异性聚合物染料缀合物相互作用的期望添加剂。评价了不同浓度的单独的非离子表面活性剂对使用两种不同聚合物染料缀合物的混合物的染色且裂解的血细胞的FCA的作用。图9示出了在没有缓冲剂(上图)、有0.1％ PF-68(左下图)、0.5％ PF-68(中下图)和1％ PF-68(重量/体积)(右下图)的情况下，用CD4-BV650(BD Biosciences)和CD19-SNv428(Beckman Coulter LifeSciences)的混合物的染色且裂解的细胞的FCA点图。PF-68浓度提高(0.1％至1％重量/体积)的存在与混合物中降低的非特异性相互作用相关，如通过与没有PF-68相比改善的分离所证明的。

实施例16.用于染色缓冲剂组合物的非荧光聚合物

如本公开内容中所表明的，在染色的生物样品的FCA中，包含聚合物染料的非荧光组分(包括光漂白的聚合物染料、猝灭的聚合物染料、和或聚合物染料的单体组分)的染色缓冲剂组合物已显示出有效地降低两种或更多种聚合物染料缀合物的多色组中的非特异性聚合物-聚合物相互作用和溢出。

在该实施例中，制备了QY不超过0.1的非荧光聚合物染料，测量了发射谱和QY，并在染色缓冲剂组合物中进行测试。图10示出了两种非荧光聚合物染料在415至700nm内的发射谱和量子产率的图。还示出了DHP-吡咯聚合物(QY 0.043)和DHP-硝基加帽聚合物(QY0.092)的结构。在使用至少两种聚合物染料缀合物的裂解和染色的细胞的FCA研究中，发现DHP-吡咯聚合物和DHP-硝基加帽聚合物对降低溢出是有效的。(数据未显示)。发现表现出量子产率(QY)不超过0.1、或不超过0.06、或不超过0.056的非荧光聚合物染料可用于降低FCA分析中染色缓冲剂组合物中的非特异性相互作用和溢出。

Claims (42)

1.组合物，其用于与至少一种荧光聚合物染料一起使用以用于对生物样品染色，所述至少一种荧光聚合物染料与结合配偶体缀合，所述组合物包含：

第一聚合物染料的至少一种非荧光组分；

非离子表面活性剂；和

生物缓冲剂；

其中所述组合物与不存在所述组合物的情况下的至少一种荧光聚合物染料缀合物相比，降低了所述至少一种荧光聚合物染料缀合物的非特异性结合。

2.权利要求1所述的组合物，其中所述第一聚合物染料的非荧光组分表现出以下中的至少一者：

量子产率(QY)不大于0.1、不大于0.06或不大于0.056；

当被405nm激光激发时，小于约50个任意荧光单位(AFU)；以及

当在405nm下被激发时，与母体荧光聚合物相比，>95％的原始最大发射强度的猝灭。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述第一聚合物染料的非荧光组分选自聚合物染料的单体组分、光漂白的聚合物染料、包含猝灭部分的聚合物染料和非荧光聚合物染料。

4.根据权利要求3所述的组合物，其包含聚合物染料的单体组分和光漂白的聚合物染料。

5.根据权利要求3所述的组合物，其包含聚合物染料的单体组分和包含猝灭部分的聚合物染料。

6.根据权利要求1至5所述的组合物，其中所述非离子表面活性剂是泊洛沙姆非离子表面活性剂。

7.根据权利要求1至5中所述的组合物，其中所述至少一种聚合物染料包含两种或更多种聚合物染料，每种聚合物染料与结合配偶体缀合。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述两种或更多种聚合物染料缀合物包含不同的聚合物染料或包含相同的聚合物染料。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述至少一种荧光聚合物染料是具有根据式(I)的结构的聚合物：

其中：

每个A独立地选自芳族共聚单体和杂芳族共聚单体；

每个L是接头部分；

每个M独立地选自芳族共聚单体、杂芳族共聚单体、带隙改性单体、任选经取代的亚乙基、和亚乙炔基；

G¹和G²独立地选自未经修饰的聚合物末端和经修饰的聚合物末端；

a、c和d独立地限定所述结构内每个单元的mol％，所述单元各自可以是均匀或随机重复的，并且其中每个a为10％至100％的mol％，每个c为0至90％的mol％，并且每个d为0至25％的mol％；

每个b独立地是0或1；并且

m是1至约10,000的整数。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述至少一种荧光聚合物染料是具有根据式(XX)的结构的聚合物：

其中：

每个A独立地选自芳族共聚单体和杂芳族共聚单体；

每个B独立地选自芳族共聚单体、杂芳族共聚单体、带隙改性单体、任选经取代的亚乙基、和亚乙炔基；

每个E是独立选择的发色团、官能部分或结合配偶体；

G¹和G²独立地选自未经修饰的聚合物末端和经修饰的聚合物末端；

L¹、L²和L³是接头部分；

W是水溶性部分；

下标n和m独立地是1至10,000的整数，

下标p是0至10,000的整数，并且

下标n、m和p之和的范围为2至10,000；

下标q是1、2、3或4；

下标r是1、2、3或4；

下标s是0、1、2或3；

下标t是1或2

下标r和s之和的范围为1至4；并且

A和B随机或非随机地分布在所缀合的聚合物中。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中L¹选自磺酰胺、磺酰胺、磺内酰胺、二亚磺酰胺、酰胺、膦酰胺、膦酰胺酸酯、次膦酰胺和仲胺。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述与所述至少一种聚合物染料缀合的结合配偶体是能够与靶分析物特异性结合的分子或分子复合物。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中所述与所述至少一种聚合物染料缀合的结合配偶体选自蛋白质、亲和配体、抗体、抗体片段和寡核苷酸。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述结合配偶体是单克隆或多克隆抗体。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述结合配偶体是免疫球蛋白或免疫球蛋白的免疫活性部分。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，其中所述结合配偶体是单链抗体、Fab、Fab’和F(ab’)2片段、Fv或Fab表达文库。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中至少一种聚合物染料的单体组分包含选自二氢菲(DHP)部分和芴部分的部分。

18.根据权利要求3至17中任一项所述的组合物，其中所述至少一种聚合物染料的单体组分包含具有根据式(XXII)的化学结构的基于二氢菲(DHP)的水溶性单体：

其中：

每个G₁、G₂独立地选自卤素(F、Cl、Br、I)、C₁-C₆烷基和PEG；

每个R²独立地选自水溶性部分、烯烃、炔烃、环烷基、卤代烷基、(杂)芳基氧基、(杂)芳基氨基、磺酰胺-PEG、膦酰胺-PEG、烷基铵盐、烷基氧基铵盐、寡聚醚铵盐、烷基磺酸盐、烷氧基磺酸盐、寡聚醚磺酸盐、磺酰胺基寡聚醚、磺酰胺、亚磺酰胺、膦酰胺酸酯、次膦酰胺、

每个R³是水溶性部分；

每个R⁴独立地选自H、烷基、PEG、水溶性部分、接头部分、发色团、羧酸胺、胺、氨基甲酸盐/酯、羧酸、羧酸酯、马来酰亚胺、经活化酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔烃、醛、或硫醇、或其被保护基团；

每个R⁵独立地选自H、羟基、C₁-C₁₂烷基、C₂-C₁₂烯烃、C₂-C₁₂炔烃、C₃-C₁₂环烷基、C₁-C₁₂卤代烷基、C₁-C₁₂烷氧基、C₂-C₁₈(杂)芳基氧基、C₂-C₁₈(杂)芳基氨基、C₂-C₁₂羧酸和C₂-C₁₂羧酸酯；

每个Q独立地是键、NR⁴或-CH₂；

每个Z独立地是CH₂、O或NR⁴；

每个f独立地是0至50的整数；并且

每个n独立地是1至20的整数。

19.根据权利要求18所述的组合物，其中G₁和G₂各自是卤素；每个Z是O；每个R₂是H；每个n独立地是2至4；并且每个f独立地是5至20；任选地其中每个n是3。

20.根据权利要求3至19中任一项所述的组合物，其中所述至少一种聚合物染料的单体组分是具有根据式(XXIII)的化学结构的基于芴或基于咔唑的水溶性单体：

其中：

每个G1、G2独立地选自卤素(F、Cl、Br、I)、C₁-C₆烷基和PEG；

每个X是C、N或Si；

每个R⁴独立地选自H、烷基、PEG、水溶性部分、接头部分、发色团、羧酸胺、胺、氨基甲酸盐/酯、羧酸、羧酸酯、马来酰亚胺、经活化酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔烃、醛、或硫醇、或其被保护基团；

每个R5独立地选自H、羟基、C₁-C₁₂烷基、C₂-C₁₂烯烃、C₂-C₁₂炔烃、C₃-C₁₂环烷基、C₁-C₁₂卤代烷基、C₁-C₁₂烷氧基、C₂-C₁₈(杂)芳基氧基、C₂-C₁₈(杂)芳基氨基、C₂-C₁₂羧酸、C₂-C₁₂羧酸酯和C₁-C₁₂烷氧基；

每个Z独立地是CH₂、O或NR⁴；

每个f独立地是0至50的整数；并且

每个n独立地是1至20的整数。

21.根据权利要求20所述的组合物，其中G₁和G₂各自是卤素；每个Z是O；每个R₂是H；每个n独立地是2至4；并且每个f独立地是5至20；任选地其中每个n是3。

22.根据权利要求3至21中任一项所述的组合物，其中所述光漂白的聚合物染料是通过将根据式(I)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIII)、(XIV)、(XVIII)、(XIX)或(XX)的荧光聚合物染料暴露于紫外光照射使得其表现出以下中的至少一者来制备的：

量子产率(QY)不大于0.1、不大于0.06或不大于0.056；

任选地当用405nm激光激发时，小于约50个任意荧光单位(AFU)；以及

当在405nm下被激发时，与母体荧光聚合物相比，>95％的原始最大发射强度的猝灭。

23.根据权利要求3至22中任一项所述的组合物，其中所述包含猝灭部分的聚合物染料包含根据式(XX)的结构：

其中：

每个A独立地选自芳族共聚单体和杂芳族共聚单体；

每个B独立地选自芳族共聚单体、杂芳族共聚单体、带隙改性单体、任选经取代的亚乙基、和亚乙炔基；

每个E是独立选择的发色团、官能部分或猝灭部分，其中至少一个或更多个E是猝灭部分；

G¹和G²独立地选自未经修饰的聚合物末端和经修饰的聚合物末端；

L¹、L²和L³是接头部分；

W是水溶性部分；

下标n是1至10,000的整数，

下标m是1至25的整数，

下标p是0至10,000的整数，并且

下标n、m和p之和的范围为2至10,000；

下标q是1、2、3或4；

下标r是1、2、3或4；

下标s是0、1、2或3；

下标t是1或2

下标r和s之和的范围为1至4；

A和B在所缀合的聚合物中随机或非随机分布；并且

E是猝灭部分；任选地

其中所述包含猝灭部分的聚合物染料表现出不大于0.1的量子产率；进一步任选地，其中所述包含猝灭部分的聚合物染料表现出小于50个AFU的荧光谱。

24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述猝灭部分选自Dabcyl、Dabsyl、DYQ425、DYQ505、BHQ1、QSY7、QSY9、QSY35和TAMRA猝灭部分，并且任选地其中m＝2至20、3至15或5至8。

25.根据权利要求5至24中任一项所述的组合物，其中所述非离子表面活性剂是聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物。

26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述非离子表面活性剂包含根据式(XXI)的结构：

其中每个a独立地为2至130，并且b为15至67。

27.根据权利要求1至26中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含多种荧光聚合物染料缀合物，并且所述组合物显著降低了所述多种荧光聚合物染料缀合物之间的非特异性结合。

28.权利要求1至27中任一项所述的组合物，其还包含两性离子表面活性剂。

29.用于检测样品中分析物的方法，其包括：

将至少一种聚合物染料缀合物添加至根据权利要求1至28中任一项所述的组合物以形成聚合物染料缀合物组合物；

使怀疑包含分析物的生物样品与所述聚合物染料缀合物组合物接触以与所述分析物形成荧光聚合物染料缀合物复合物；

将可激发至少一种荧光聚合物染料缀合物复合物的光源施加于所述样品；以及

检测从所述荧光聚合物染料缀合物复合物发射的光。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述生物样品选自血液、骨髓、脾细胞、淋巴细胞、骨髓吸出物、尿液、血清、唾液、脑脊液、尿液、羊水、间质液、粪便、黏液或组织。

31.根据权利要求29或30所述的方法，其中所述生物样品是血液样品。

32.根据权利要求29至31中任一项所述的方法，其中所述生物样品是全血。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述生物样品包含全血的一种或更多种细胞。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述全血的一种或更多种细胞是红细胞、白细胞、淋巴细胞、吞噬细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、血小板或者具有一种或更多种可检测标志物的任何细胞。

35.根据权利要求29至34中任一项所述的方法，其中所述生物样品来自细胞培养物。

36.根据权利要求29至35中任一项所述的方法，其中来自所述光源的光的波长为约340nm至约800nm、或约340nm至约450nm。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所发射的光的波长为约400nm至约800nm。

38.根据权利要求29至37中任一项所述的方法，其中所述检测光还包括通过流式细胞术进行分析以获得第一流式细胞术图；

其中当与包括使所述生物样品与不含所述非离子表面活性剂并且不含所述第一聚合物染料的非荧光组分的组合物接触而获得的第二流式细胞术图相比时，所述第一流式细胞术图表现出由以下组成的组中的一者或更多者：

聚合物染料缀合物的非特异性相互作用降低；和

聚合物染料缀合物的聚集减少。

39.试剂盒，其包含根据权利要求1至28中任一项所述的组合物，其中所述试剂盒包含单独的容器，所述单独的容器包含所述第一聚合物染料的一种或更多种非荧光组分；和所述至少一种荧光聚合物染料缀合物。

40.根据权利要求39所述的试剂盒，其还在所述包含所述一种或更多种非荧光组分的容器中包含非离子表面活性剂。

41.试剂盒，其包含根据权利要求1至28中任一项所述的组合物，其中所述试剂盒包含在一个容器中的所述第一聚合物染料的非荧光组分中的一种或更多种和所述非离子表面活性剂；以及在单独的容器中的所述至少一种荧光聚合物染料缀合物。

42.试剂盒，其包含根据权利要求1至28中任一项所述的组合物，其中所述试剂盒包含在一个容器中的所述第一聚合物染料的非荧光组分中的两种或更多种；以及在单独容器中的所述至少一种荧光聚合物染料缀合物。