CN109851553A

CN109851553A - 一种线粒体-核仁迁移型膜电位荧光探针及其合成和应用

Info

Publication number: CN109851553A
Application number: CN201811590278.3A
Authority: CN
Inventors: 林伟英; 孙洁; 田明刚
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2018-12-25
Filing date: 2018-12-25
Publication date: 2019-06-07

Abstract

本发明提供了一种线粒体‑核仁迁移型的膜电位探针及其应用，其化学名称为：2‑(4‑N,N‑二乙胺基‑苯乙烯基)‑N‑羟基乙基‑喹啉碘盐，通过以下步骤合成：2‑甲基喹啉与碘乙醇在乙醇溶液中加热首先合成1,2‑二甲基喹啉碘盐；以乙醇作溶剂、以四氢吡咯为催化剂，N‑甲基‑2‑羟基乙基‑喹啉碘盐和N,N‑二乙胺基苯甲醛在室温下缩合反应生成2‑(6‑甲氧基‑6‑萘乙烯基)‑N‑甲基‑喹啉碘盐。本发明还提供了一种该荧光探针在成像线粒体膜电位中的应用，具有很大的应用前景。

Description

一种线粒体-核仁迁移型膜电位荧光探针及其合成和应用

技术领域

本发明属于有机小分子荧光探针领域，具体涉及一种线粒体膜电位的荧光探针及其合成方法。

背景技术

线粒体三羧酸循环过程中，会将线粒体内部的质子主动运输到线粒体外，从而形成了达-160mV~-180mV的内负外正的线粒体膜电位。线粒体膜电位为有氧呼吸过程提供能量，催化其分解具有高稳定性的化合物。此外，线粒体膜电位与细胞状态息息相关，线粒体膜电位的水平可以精确反映细胞的健康状态。因此，实时观测线粒体膜电位的变化具有重要的生理学、病理学和药理学意义。

到目前为止，荧光成像是研究线粒体膜电位变化的最重要工具。线粒体体积微小，难以精准的嵌入电极，这限制了电化学方法在检测线粒体膜电位上的应用。相比之下，荧光成像法具有对生物样本低损伤、可进行原位、动态观测等优点，是用于研究线粒体膜电位的理想工具。目前，TMRM和JC-1是常用于研究线粒体膜电位的荧光探针。TMRM常用于计算线粒体膜电位的大小，然而计算过程繁琐，限制了其在生物研究中的应用。JC-1在高膜电位的线粒体中呈现J-聚集态，发射橘红色荧光；在低膜电位的线粒体中呈现单体态，发射黄色荧光；因此JC-1可以通过荧光颜色的变化反映线粒体膜电位的状态，是常用于生物研究的线粒体膜电位探针。

发明内容

针对目前线粒体膜电位探针种类单一这一现状，本发明提供一种新型的线粒体-核仁迁移型膜电位荧光探针，线粒体膜电位高时，探针着色线粒体；线粒体膜电位低时，探针着色核仁。

本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针的合成方法。

本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针检测膜电位上的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种线粒体-核仁迁移型膜电位荧光探针，化学名称为2-(4-N,N-二乙胺基-苯乙烯基)-N-羟基乙基-喹啉碘盐，结构式如式（）所示：

式（I）。

一种上述探针的合成方法，包括以下步骤：

（1）2-甲基喹啉与碘乙醇在乙醇中加热反应，冷却过滤、提纯得化合物1，即N-甲基-2-羟基乙基-喹啉碘盐；

（2）N-甲基-2-羟基乙基-喹啉碘盐（化合物1）与4-N,N-二乙胺基苯甲醛在四氢吡咯催化下于乙醇中在室温下反应，将析出固体过滤，分离、提纯得2-(4-N,N-二乙胺基-苯乙烯基)-N-羟基乙基-喹啉碘盐，即荧光探针DEQ。

步骤（1）中，所述2-甲基喹啉与碘乙醇的摩尔比为1:1-2；步骤（2）中，所述N-甲基-2-羟基乙基-喹啉碘盐与4-N,N-二乙胺基苯甲醛的摩尔比为1:0.8-1.5。

步骤（1）中，所述加热温度为40-60℃；反应时间为24-48h。步骤（2）中，所述反应时间为12-24h。

步骤（1）中，所述提纯步骤为反应完毕后，将所得固体用乙醇洗涤3次，即可获得纯净化合物1。

步骤（2）中，所述分离提纯步骤为将反应所得固体用乙醇洗涤三次后，在乙醇中重结晶。

上述荧光探针的合成路线如下：

。

一种上述探针在线粒体膜电位可逆检测中的应用。

所述应用中，单光子激发波长为561nm，荧光波段665-735nm；检测时间为作用30min后。

本发明的有益效果为：

本发明提供的荧光探针为阳离子盐型化合物，线粒体膜电位较高时，探针富集在线粒体上；线粒体膜电位降低时，探针从线粒体上脱落，迁移到核仁上。本发明的合成方法简单、收率高，对线粒体膜电位响应灵敏。

附图说明

图1是荧光探针DEQ的¹H NMR谱；

图2是荧光探针DEQ的¹³C NMR谱；

图3是荧光探针DEQ的高分辨质谱；

图4是荧光探针DEQ在活细胞中与线粒体深红(MTDR)染料的共定位实验；

图5是荧光探针DEQ着色CCCP处理不同时间以及CCCP洗去后不同时间的活细胞的荧光图片；

图6是荧光探针DEQ的细胞毒性测试。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 荧光探针的合成

（1）N-甲基-2-羟基乙基-喹啉碘盐（化合物1）的合成

向圆底烧瓶中加入7mL乙醇，然后加入1.1mL的2-甲基喹啉，加入0.5mL的碘乙醇溶液，加热至50℃反应36h，反应完毕后将反应体系冷却至室温，有固体析出，过滤并使用乙醇洗涤可得到1,2-二甲基-喹啉碘盐（化合物2），产率为93%。其核磁共振氢谱如图1所示。¹H NMR(400 MHz, DMSO-d ₆) δ 9.12 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 8.60 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 8.41(dd, J = 8.2, 1.6 Hz, 1H), 8.24 (ddd, J = 8.8, 7.0, 1.6 Hz, 1H), 8.14 (d, J =8.5 Hz, 1H), 8.00 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 4.45 (s, 3H), 3.09 (s, 3H).

（2）荧光探针DEQ的合成。

取化合物1（0.6g，2mmol）加入圆底烧瓶中，加入N,N-二乙胺基苯甲醛(0.35g，2mmol)，加入4滴四氢吡咯；加入5mL乙醇，室温搅拌反应18小时，有固体析出，过滤得到粗产品，在乙醇中重结晶可得纯净产物0.4g，为黄色固体，产率为68%。其核磁氢谱与碳谱如图2和图3所示，高分辨质谱如图4所示。

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ 8.80 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 8.54 (d, J = 9.3Hz, 1H), 8.44 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 8.34 – 8.17 (m, 2H), 8.05 (ddd, J = 8.9,7.0, 1.6 Hz, 1H), 7.91 – 7.73 (m, 3H), 7.62 (d, J = 15.4 Hz, 1H), 6.82 (d, J= 8.9 Hz, 2H), 5.25 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 5.15 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 4.03 (q, J= 5.4 Hz, 2H), 3.49 (q, J = 7.0 Hz, 4H), 1.16 (t, J = 7.0 Hz, 6H).

¹³C NMR (101 MHz, DMSO) δ 157.25, 151.12, 149.37, 142.48, 139.40, 134.41,132.76, 130.40, 128.34, 127.51, 122.47, 120.78, 119.54, 112.11, 111.97,59.74, 52.25, 44.54, 12.98.

HRMS Calc. m/z = 347.2123; found 347.2126。

实施例2 荧光探针DEQ在活细胞中与线粒体深红(MTDR)染料的共定位试验

为了进一步确认探针DEQ在死、活细胞中的着色位置，我们用商用的线粒体染料线粒体深红(MTDR)与DEQ进行了共定位染色成像。

活细胞共定位实验中，先用200nM的MTDR染色细胞30min，再加入200nM的实施例1所得DEQ探针染色细胞15min，然后将细胞培养液吸走，用培养基冲洗细胞3次，进行细胞成像。用561nm为激发波长，收集665-735nm的荧光来采集DEQ的荧光信号；用633nm为激发波长，收集665-735nm的荧光来采集MTDR的荧光信号，得到荧光图片如图4所示。由图4可知，两种染料的复染率为92%，说明探针在活细胞中染色线粒体。

实施例3 荧光探针DEQ对膜电位的响应

将密度为3×10⁵个/mL的HepG2细胞接种到灭菌的35mm成像培养皿中，在CO₂培养箱（温度为37℃，5%CO₂）培养12小时以上使细胞贴壁。

首先用200nM的实施例1所得DEQ探针染色HepG2细胞15min，加入10μM的CCCP后细胞膜电位开始降低，每隔30s采集一次荧光图片，采集图片时激发波长为561nm，荧光收集波段为665-735nm。然后移除含有CCCP的培养基，加入新鲜的培养基，线粒体膜电位开始恢复，每隔30s采集一次荧光图片，采集图片时激发波长为561nm，荧光收集波段为665-735nm，荧光变化如图5所示。由图5可知，在线粒体膜电位降低时，探针从线粒体迁移到核仁中；在膜电位恢复后，从核仁迁移回线粒体中。因此，荧光探针DEQ可用于可逆检测线粒体膜电位的变化。

实施例4 荧光探针DEQ的细胞毒性测试

将细胞密度为8000个/mL的HeLa细胞接种到96孔板的部分孔内，剩余孔则用PBS缓冲液（pH为7.4）填充，并在不同的条件下在CO₂培养箱中孵育细胞。实验组为用含200nM的实施例1所得探针DEQ的培养基孵育2小时、12小时和24小时后的细胞样品；对照组为不加探针的含细胞样品；空白组为PBS缓冲液（pH为7.4）样品。待孵育完成后，用新鲜的培养基换掉细胞培养液，并在每个培养孔中加入10μL的MTT，再孵育细胞4小时。孵育完成后，移除培养基，每孔加入200μL的DMSO，并用摇床晃动10min以溶解甲瓒。使用酶标仪测试每个孔在570nm处的吸光度，细胞存活率可通过下述公式计算得到：

其中，A_sample为实验组吸光度，A_c为对照组吸光度，A_b为空白组的吸光度。细胞存活率如图6所示，细胞经荧光探针DEQ处理24小时后，细胞存活率仍高达95%，说明荧光探针DEQ的毒性很低。

Claims

1.一种线粒体-核仁迁移型膜电位的荧光探针，其结构式如式（I）所示：

式（I）。

2.一种如权利要求1所述的荧光探针的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

（2）N-甲基-2-羟基乙基-喹啉碘盐与4-N,N-二乙胺基苯甲醛在四氢吡咯催化下于乙醇中在室温下反应，将析出固体过滤，分离、提纯得2-(4-N,N-二乙胺基-苯乙烯基)-N-羟基乙基-喹啉碘盐，即荧光探针。

3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（1）中，所述2-甲基喹啉与碘乙醇的摩尔比为1:1-2；

步骤（2）中，所述N-甲基-2-羟基乙基-喹啉碘盐与4-N,N-二乙胺基苯甲醛的摩尔比为1:0.8-1.5。

4.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（1）中，所述加热温度为40-60℃；反应时间为24-48h；

步骤（2）中，所述反应时间为12-24h。

5.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（1）中，所述提纯步骤为反应完毕后，将所得固体用乙醇洗涤3次。

6.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（2）中，所述分离提纯步骤为将反应所得固体用乙醇洗涤三次后，在乙醇中重结晶。

7.一种如权利要求1所述的荧光探针在线粒体膜电位检测中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，单光子激发波长为561nm，荧光波段665-735nm；检测时间为作用30min后。