CN111678900B - 基于酪氨酸酶催化的细胞膜和细胞壁荧光标记方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于酪氨酸酶催化的细胞膜和细胞壁的荧光标记方法及其应用。该标记方法包括两种方案：(1)酪氨酸酶及带苯酚基团的荧光分子，(2)酪氨酸酶、生物素基酪酰胺和荧光染料接枝的亲和素。这两种方案都能通过共价反应将荧光分子连接至哺乳动物细胞膜上，从而实现细胞膜的荧光标记。此外，该荧光标记策略还能够实现对真菌细胞壁以及斑马鱼胚胎表皮细胞膜的荧光成像。相比已有的细胞膜或细胞壁的荧光标记策略，本发明公开的方法具有染色效果好、修饰效率高、操作简单和生物安全性好等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于酪氨酸酶催化的细胞膜和细胞壁的荧光标记方法及其应用，属 于生物技术领域。
背景技术
利用荧光分子对细胞膜进行标记和示踪是揭示细胞膜各种微观结构和生理功能的 基本研究手段。目前，常用的细胞膜修饰策略主要包括静电吸附法、疏水插膜法、代谢标记法以及共价接枝法，其中共价接枝法由于其修饰效率高、修饰稳定和操作简单等优 点受到了广泛的关注。该技术利用细胞表面多种可反应的化学基团(如氨基和羧基)， 在生理环境下将修饰分子通过共价连接的方式引入到细胞膜上。例如，带有琥珀酰亚胺酯的修饰分子能够在pH 7.4的水溶液中与细胞膜蛋白上的氨基发生化学反应，从而实现 细胞膜的荧光标记(Cheng H,Kastrup CJ,Ramanathan R,Siegwart DJ,Ma M,Bogatyrev SR, Xu Q,Whitehead KA,Langer R,Anderson DG.Nanoparticulate cellular patches forcell-mediated tumoritropic delivery.ACS Nano 2010,4,2,625-631)。然而，琥珀酰亚 胺酯极易水解，为相关试剂的保存和实验操作带来了很大的不便。最近，有研究人员利 用三(2-羧乙基)膦对细胞膜进行处理，将细胞膜蛋白中的二硫键还原为巯基，然后通过 马来酰亚胺与巯基的反应将荧光分子标记在细胞膜上(Kim H,Shin K,Park OK,Choi D,Kim HD,Baik S,Lee SH,Kwon SH,Yarema KJ,Hong J,Hyeon T,Hwang NS.General and facilecoating of single cells via mild reduction.J.Am.Chem.Soc.2018,140,1199-1202)。然而，利用三(2-羧乙基)膦对细胞膜进行预处理可能带来潜在的细胞毒性或对细胞膜上蛋白结构及功能产生影响。因此，开发一种简单、高效、安全的新型细胞膜共价荧光标 记策略具有十分重要的意义。
发明内容
发明目的：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于酪氨酸酶催化的细胞膜 和细胞壁的荧光标记方法，并进一步提供了所述方法的应用。
技术方案：为了实现上述目的，本发明公开了一种针对细胞膜和细胞壁的荧光标记 方法，包括两种方案：(1)使用酪氨酸酶和含苯酚基团的荧光分子；(2)使用酪氨酸酶、生物素基酪酰胺和荧光染料接枝的亲和素。
优选的，所述的酪氨酸酶为来源于菌菇的多酚氧化酶。
优选的，所述的含苯酚基团的荧光分子包括Cy3-酪酰胺、Cy5-酪酰胺、Cy7-酪酰胺、 AlexaFluor 488-酪酰胺、AlexaFluor 555-酪酰胺和AlexaFluor 568-酪酰胺。
优选的，所述的荧光染料接枝的亲和素包括异硫氰酸荧光素-亲和素和罗丹明-亲和 素。
进一步的，本发明还提供了该荧光标记方法中方案(1)的具体操作，包括以下步骤：
(1)清洗生物样本2～3次，将酪氨酸酶和带有苯酚基团的荧光分子加入到样本中，37℃或室温下孵育10～15分钟；
(2)孵育完成后，再清洗样本2次，除去酪氨酸酶和未接枝的荧光分子。
其中，步骤(1)中，酪氨酸酶和带有苯酚基团的荧光分子用于样本染色的浓度范围分别为10-500μg/mL和0.1-100μg/mL。
进一步的，本发明还提供了该荧光标记方法中方案(2)的具体操作，包括以下步骤：
(1)清洗生物样本2～3次，将酪氨酸酶和生物素基酪酰胺加入到样本中，37℃或室温下孵育10～15分钟；
(2)反应完成后，清洗样本3次，再加入荧光染料接枝的亲和素，37℃或室温下 孵育5～10分钟。
(3)继续清洗样本2次，除去未结合的荧光染料接枝的亲和素。
其中，步骤(1)中，酪氨酸酶和生物素基酪酰胺用于样本标记的浓度范围分别为10-500μg/mL和0.1-100μg/mL。
进一步的，本发明还提供了所述荧光标记方法用于哺乳动物细胞膜荧光成像的应用。
进一步的，本发明还提供了所述荧光标记方法用于真菌表面荧光成像的应用。
进一步的，本发明还提供了所述荧光标记方法用于斑马鱼胚胎表皮细胞膜荧光成像 的应用。
本发明所述的修饰策略中包括酪氨酸酶和带有苯酚基团的修饰分子。该策略利用酪 氨酸酶的催化特性，将修饰分子中的苯酚基团氧化为具有高度反应活性的邻苯醌式结构。 邻苯醌能够与细胞膜或细胞壁中的多种化学基团发生反应，从而将荧光分子或生物素分 子通过共价作用的方式引入到细胞表面，实现细胞膜或细胞壁的荧光标记。
技术效果：相对于现有技术，本发明具有以下优势：
(1)修饰效率高：该策略基于酪氨酸酶的催化反应，具有极高的反应效率，37℃ 下10分钟左右即可完成对细胞膜和细胞壁的荧光标记；
(2)操作简便：本发明所述的荧光标记无需对细胞进行预处理，操作简便，反应 条件温和，所用试剂便于在水溶液中长期保存；
(3)生物相容性好：该修饰策略具有良好的安全性，不会影响细胞活性。
附图说明
图1是本发明方法原理示意图；
图2是本发明所述的方法实现的对MCF-7(人乳腺癌细胞)细胞膜的荧光成像图片；
图3是本发明所述的方法实现的对ATII(人肺泡细胞)细胞膜的荧光成像图片；
图4是本发明所述的方法实现的对里氏木霉真菌细胞表面的荧光成像图片；
图5是本发明所述的方法实现的对斑马鱼胚胎表皮细胞膜的荧光成像图片。
具体实施方式
下面结合附图和具体实例，进一步阐明本发明。
以下实施例中所述荧光标记方法原理如图1所示，原料酪氨酸酶，Cy5-酪酰胺，生物素基酪酰胺，异硫氰酸荧光素-亲和素均为商品化试剂。
实施例1
所述的荧光标记方法用于癌细胞MCF-7的细胞膜荧光成像，具体步骤如下：
将MCF-7细胞按50000个/mL种入共聚焦培养板中，在37℃、5％CO2的条件下培养24小时。接下来，每孔用磷酸缓冲液清洗三次，加入酪氨酸酶溶液(终浓度10μg/mL) 及Cy5-酪酰胺溶液(终浓度100μg/mL)，37℃下反应15分钟。反应完成后，用磷酸缓 冲液清洗2遍，得到细胞膜上标记有荧光基团Cy5的MCF-7细胞。
上述方法所得细胞的共聚焦照片见图2。实验结果表明，该修饰策略能够对癌细胞的细胞膜进行标记，实现癌细胞膜荧光成像。
实施例2
将实施例1中的酪氨酸酶溶液(终浓度10μg/mL)变为酪氨酸酶溶液(终浓度 500μg/mL)，Cy5-酪酰胺溶液(终浓度100μg/mL)变为Cy3-酪酰胺溶液(终浓度0.1μg/mL)， 其他参数与实施例1保持一致。
实施例3
将实施例1中的酪氨酸酶溶液(终浓度10μg/mL)变为酪氨酸酶溶液(终浓度 100μg/mL)，Cy5-酪酰胺溶液(终浓度100μg/mL)变为AlexaFluor 488-酪酰胺溶液(终 浓度10μg/mL)，其他参数与实施例1保持一致。
实施例4
所述的荧光标记方法用于正常细胞ATII的细胞膜荧光成像，具体步骤如下：
将AT II细胞按50000个/mL种入共聚焦培养板中，在37℃、5％CO2的条件下培养24小时。接下来，每孔用磷酸缓冲液清洗三次，加入酪氨酸酶溶液(终浓度20μg/mL)及 生物素-酪酰胺溶液(终浓度10mg/mL)，37℃下反应15分钟。反应完成后，用磷酸缓 冲液清洗细胞2～3次，然后加入异硫氰酸荧光素-亲和素(终浓度10μg/mL)，继续孵 育10分钟。最后，用磷酸缓冲液清洗细胞2遍，得到细胞膜上标记有异硫氰酸荧光素 的ATII细胞。
上述方法所得细胞的共聚焦照片见图3。实验结果表明，该修饰策略能够对正常组织细胞的细胞膜进行标记并实现荧光成像。
实施例5
将实施例4中的异硫氰酸荧光素-亲和素变为罗丹明-亲和素，其他参数与实施例4保持一致。
实施例6
所述的修饰方法用于里氏木霉真菌的荧光标记：
取1mL里氏木霉菌液，用磷酸缓冲液清洗3次后加入酪氨酸酶溶液(终浓度20 μg/mL)及Cy5-酪酰胺溶液(1μg/mL)，37℃下反应15分钟。反应完成后，用磷酸缓 冲液清洗2遍，得到Cy5标记的里氏木霉。
上述方法所得细胞的共聚焦照片见图4。实验结果表明，该修饰策略能够对真菌表面(细胞壁)进行荧光标记，实现真菌的荧光成像。
实施例7
将实施例6中的Cy5-酪酰胺变为AlexaFluor 555-酪酰胺，其他参数与实施例6保持 一致。
实施例8
所述的修饰方法用于斑马鱼胚胎表皮细胞膜的荧光标记：
向斑马鱼胚胎的培养液中加入酪氨酸酶溶液(终浓度20μg/mL)及Cy5-酪酰胺溶液(终浓度1μg/mL)，室温下孵育15分钟。反应完成后，用新鲜的培养液清洗斑马鱼胚 胎2遍，得到Cy5标记的斑马鱼胚胎。
上述方法所得斑马鱼的共聚焦照片见图5。实验结果表明，该修饰策略能够对斑马鱼胚胎表皮细胞膜进行标记，实现斑马鱼的荧光成像。
实施例9
将实施例8中的Cy5-酪酰胺变为Cy7-酪酰胺，其他参数与实施例8保持一致。
Claims (5)
1.一种基于酪氨酸酶催化的细胞膜和细胞壁荧光标记方法，其特征在于，所述方法包括两种方案；第一种方案为使用酪氨酸酶和含苯酚基团的荧光分子，包括以下步骤：（1）取待标记生物样本，清洗2～3次，将酪氨酸酶和带有苯酚基团的荧光分子加入到样本中，37℃或室温孵育10～15分钟；（2）孵育完成后，清洗样本除去酪氨酸酶和未接枝的荧光分子；第二种方案为使用酪氨酸酶、生物素基酪酰胺和荧光染料接枝的亲和素，包括以下步骤：（1）取待标记生物样本，清洗2～3次，将酪氨酸酶和生物素基酪酰胺加入到样本中，37℃或室温孵育10～15分钟；（2）反应完成后，清洗样本，再加入荧光染料接枝的亲和素，37℃或室温下孵育5～10分钟；（3）继续清洗样本除去未结合的荧光染料接枝的亲和素；上述两种方法中所述酪氨酸酶为来源于菌菇的多酚氧化酶，所述含苯酚基团的荧光分子包括Cy3-酪酰胺、Cy5-酪酰胺、Cy7-酪酰胺、AlexaFluor 488-酪酰胺、AlexaFluor 555-酪酰胺和AlexaFluor568-酪酰胺；所述荧光染料接枝的亲和素包括异硫氰酸荧光素-亲和素和罗丹明-亲和素。
2.权利要求1所述荧光标记方法在细胞膜和细胞壁荧光成像中的应用。
3.权利要求1所述荧光标记方法在哺乳动物细胞膜的荧光成像中的应用。
4.权利要求1所述荧光标记方法在真菌细胞壁的荧光成像中的应用。
5.权利要求1所述荧光标记方法在在活体斑马鱼胚胎表皮细胞膜的荧光成像中的应用。
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