RU2068563C1 - Способ оценки индивидуальной химиочувствительности опухолей у больных - Google Patents

Abstract

Использование: в медицине, в частности в онкологии. Сущность изобретения: на контрольные и опытные культуры опухолевых клеток in vitro действовали ³H-тимидином и, после экспозиции, проявления и окраски полученных параметров, светооптически подсчитывали индекс метки и вычисляли показатель индивидуальной химиочувствительности, при этом вместо переживающих срезов использовали первичные краткосрочные культуры опухолевых клеток в экспоненциальной фазе роста. Способ позволяет получить более достоверные результаты, сократить время исследования. 1 табл.

Description

Изобретение относится к медицине, разделу онкологии.

Существуют различные способы исследования индивидуальной химиочувствительности опухолей.

1. Исследование на основе культивирования кусочков опухолей в диффузионных камерах (ДК) in vivo (Шамаев В.И. Крутова Т.В. Дьячковская Р.Ф. Корман Д.Б. Предклиническая оценка чувствительности опухолей человека к противоопухолевым препаратам с помощью метода диффузионных камер, в кн. Актуальные проблемы экспериментальной химиотерапии опухолей, Черноголовка, 1980, с. 175 178; P. J.Selby and G.G.Stell "Use of the agar diffusion camber for the exposure of human tumor cells to drugs", Cancer Research, 1982, v. 42, N 11, p. 4758-62). В качестве животного-хозяина использовались мыши, в брюшную полость которым вводили ДК с эксплантатом опухоли. Культивирование осуществлялось в течение 6 дн. после чего в брюшную полость животным вводили различные тестируемые цитостатики, с которыми культивировали еще сут. За 1 ч до забоя животным внутрибрюшинно вводили ³H-тимидин, после чего забивали, камеры извлекали, фиксировали в спирте, разбирали. Миллипоровые фильтры с культурами опухолевых клеток наклеивали на предметные стекла, покрывали ядерной фотоэмульсией типа М и после 7-дневной экспозиции окрашивали гематоксилин-эозином. Светооптически подсчитывали ИМ (индекс метки). Степень подавления синтеза ДНК под влиянием цитостатика позволяла судить о химиочувствительности конкретной опухоли. Данный метод имеет существенные недостатки: 1) необходимость содержания экспериментальных животных; 2) захоронение биологических объектов после введение меченого тимидина in vivo представляет сложную проблему; 3) трудоемкость при общем сроке исследования 2 3 мес. В силу всего перечисленного в настоящее время данный метод оставлен как в нашей стране, так и за рубежом.

II. Исследование химиочувствительности путем культивирования гетеротрансплантатов опухолей у бестимусных мышей отличается высокой эффективность, но является чрезвычайно дорогим, доступным лишь отдельным, в основном зарубежным клиникам (J.R.Drago, R.E.Maurer, et al. The effect of S-fluorouracil and adriamycin on heterotransplatation of noble rat prostatic tumor in congenitally athymic (nude) mice, Cancer, 1979, v. 44, p. 424 430).

III). Исследование химиочувствительности при культивировании эксплантатов опухолей человека под капсулу почек экспериментальных животных, которых для подавления антигенной несовместимости предварительно облучают, что усложняет метод.

Все изложенное выше объясняет, почему исследование индивидуальности опухолей к цитостатикам на основе культуры опухолей in vivo не нашло применения в практическом здравоохранении.

Усовершенствование методов культивирования опухолей привело к тому, что некоторые из методов исследования химиочувствительности на основе культуры in vitro показали высокую корреляцию с клиническими данными. Это дает реальную перспективу внедрения их в клинику. Существуют разные методы исследования химиочувствительности опухолей на основе культивирования in vitro. 1) В пробирках с питательной средой (Иваницкая Л.Н. Макухо Л.В. О первичном отборе противоопухолевых антибиотиков, в кн. Проблемы химиотерапии злокачественных опухолей. Киев: 1974, с. 178 179; Яворская Н.П. Использование первично суспендированных культур опухолевых клеток для первичной оценки противоопухолевого действия новых препаратов, там же, с. 180 182; 2) во флаконах Карреля (Халеева Т.Г. Исследование действия противоопухолевых препаратов на культуры опухолей человека. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1960, N 1, с. 95 100; Щорс Т.А. Попытки контроля методом монослойных культур эффективности химиотерапии рака яичников, в сб. Культура тканей в онкологии. М: 1968, с. 321; 3) в последние годы за рубежом распространился метод исследования химиочувствительности опухолей путем колониеобразования суспендированных клеток в чашках Петри на питательной среде с подложкой. Оценка чувствительности к цитостатикам осуществляется по степени подавления колониеобразования под влиянием химиопрепаратов (Salmon S.E. and von Hoff D.D. In vitro evaluation of anticancer drugs with the human tumor stem cell assay, Semin. Oncol. 1981, v. 8, p. 377 385). Авторы продемонстрировали клиническую коррелюцию с уcтойчивостью к цитостатикам в 90% корреляцию с чувствительностью к ним в 40 70% К недостаткам данного метода относится: а) необходимость в обогащенных культуральных средах типа МеСоy-5A, которые в нашей стране не производятся, а также применения СO₂-инкубаторов; б) трудность интерпретации результатов колониеобразования, т.к. при суспендировании гетерогенной популяции опухолевых клеток, колониеобразование может идти за счет как паренхиматозных, так и стромальных клеток, а также за счет какой-то одной популяции опухолевых клеток, что при фазово-контрастной микроскопии не дифференцируется; в) большим ограничением данного метода является трудность получения жизнеспособных опухолевых клеток после травмы при механическом их суспендировании.

4) Были попытки исследования индивидуальной химиочувствительности путем опухолевой ткани на узких стеклах, которые помещали в пробирки с питательной средой (Акопьянц С.С. К возможности использования метода первичных культур для индивидуальной чувствительности опухолей больных к различным противоопухолевым препаратам, кн. Актуальные вопросы современной онкологии, вып. 6, 1980, изд-во МГУ) или при культивировании опухолевых клеток в плазменном сгустке на узком стекле (Терентьева Т.Г. Фомина И.Г. Навашин С.М. и Марточкина Г.А. Чувствительность рака почки человека в культуре к противоопухолевым препаратам, Вопросы онкологии, 1971, т. XVII, N 7, с. 67 70), однако в указанных работах отсутствуют количественные критерии оценки химиочувствительности, а выхода культур довольно низкий 45% (Акопьянц С.С. см. выше).

5) Ряд авторов предложили использовать краткосрочные культуры опухолевых клеток с оценкой химиочувствительности спектрофотометрическим или радиометрическим способом (Яворская Р.П. Использование первичных суспендированных культур опухолевых клеток для первичной оценки противоопухолевого действия новых препаратов, кн. Проблемы химиотерапии злокачественных опухолей, Москва-Киев, 1974, с. 180 192) использовала краткосрочные 18 20 ч суспендированные культуры из асцитической жидкости мышей с перевивной опухолью Эрлиха. В качестве критерия для определения роста культур и противоопухолевой активности химиопрепаратов был использован метод спектрофотометрического определения прироста суммы нуклеиновых кислот. Грантс З.А. Зитаре И.Я. Мурниеце Э.В. Берзиньш Ю.А. Прогнозирование химиотерапевтического эффекта как способ повышения эффективности лечения больных раком легкого, в кн. Возможности повышения эффективности химиотерапии злокачественных опухолей. Рига. Знание, 1981, с. 23) оценивают химиотерапевтический эффект при инкубации суспензии опухолевых клеток в течение трех ч в присутствии тестируемых цитостатиков. За час до окончания инкубации добавляли меченые по тритию предшественники нуклеиновых кислот и на жидкостном сцинцилляционном счетчике подсчитывали импульсы. Данные методы нельзя считать достаточно точными, т.к. синтез нуклеиновых кислот можно определять лишь в активно пролиферирующих клетках. Известно, что в условиях культивирования клеток in vitro пролиферация начинается через 1 2 сут (Гаврилюк Б.К. Рочев Ю.А. Николаева Т.И. Культура клеток и реконструкция ткани (на примере кожи). Пушкино, 1988).

К недостаткам данных методов следует отнести и использование чрезвычайно дорогостоящей аппаратуры.

Для определения химиочувствительности получали фрагменты опухоли по 0,5 х 0,5 мм и инкубировали их во флаконах со средой 199 с добавлением бычьей сыворотки и антибиотиков при 37^oC в атмосфере, содержащей 7% СO₂ в течение 1, 3, 8, 48 и 144 ч (Лескова С.Г. Использование переживающих срезов опухолей для определения их чувствительности химиотерапевтическим препарата. - Дис. канд. мед. М. 1972). За 1 ч до окончания инкубации в пробирки добавляли ³H-тимидин, затем срезы фиксировали, заливали в парафин, депарафинированные срезы покрывали ядерной фотоэмульсией типа М. Проявленные через 15 сут радиоавтографы окрашивали гематоксилин-эозином и светооптическим подсчитывали индекс метки по числу гранул серебра над ядром. Из этого видно, что большая трудоемкость гистологической обработки исключает возможность практического применения этого метода в клинике. Однако правильность оценки степени подавления синтеза ДНК цитостатиками в переживающих срезах сомнительна, т.к. для этого нужны активно пролиферирующие клетки. При способе С.Г.Лесковой культура эпителиальных клеток не может образоваться, т.к. срезы опухолевой ткани свободно плавают во флаконах. Эпителиальные клетки без подлежащей опоры, к которой они прикреплены, не размножаются (Гаврилюк Б.К. Сафронов В.П. Органотипическое культивирование ткани. М. 1983).

Цель изобретения упрощение способа исследования индивидуальной химиочувствительности опухолей у больных при культивировании эксплантатов опухолей между стандартными предметными стеклами (положительное решение по заявке на изобретение Филипповой Л.А. Лавренова А.Л. Способ культивирования тканей in vitro N 4903898/13/006824 от 15.07.91). Сочетание этого способа с авторадиографией при высокой эффективности выхода культур объективные количественные критерии индивидуальной химиочувствительности при сокращении сроков исследования до двух недель.

Цель достигается тем, что кусочки оперативно удаленных опухолей по 1 - 1,5 см в Д брали в питательную среду Игла с добавлением антибиотиков (по 100 ЕД пенициллина + стрептомицина на 1 мм среды), в стерильных условиях механически измельчали на фрагменты по 1 1,5 мм, отмывали в трех порциях такой же среды, трипсинизировали 5 7 мин при 37^oC, после чего рассаживали по 1 фрагменту на стандартные предметные стекла, покрытые слоем желатина в качестве подложки, накрывали другими таким же предметным стеклом. Полученные пары стекол помещали вертикально в закрытые пластмассовые кассеты по 6 пар в каждую. Кассеты заполняли культуральной средой так, чтобы покрыть кусочки, хотя в капиллярном пространстве между стеклами среда поднимается еще выше и под действием силы поверхностного натяжения и заполняет его полностью.

Состав культуральной среды:
среда Игла 80 об.

сыворотка крови крупного рогатого скота 20 об.

Вит. А 2 ЕД/мл
Вит. Е 1 мкг/мл
Вит. В₁₂ 0,2 мкг/мл
Вит. К 1 мкг/мл
Феррум-лек 0,006 мг/мл в пересчете на железо
Преднизолон 0,1 мкг/мл
Инсулин 0,1 ЕД/мл
Поливинилпирролидон 2 мг/мл
Пенициллин 100 ЕД/мл
Стрептомицин 100 ЕД/мл
Использование для выращивания культур капиллярного пространства между двумя предметными стеклами увеличивает площадь новообразованного монослоя клеток, способствует диффузии веществ из среды в клетки. Кассеты со сдвоенными стеклами в культуральной среде помещали в сухие стерильные банки объемом 0,5 л, которые сверх накрывали стерильными чашками Петри. Полученные культивационные камеры ставили в термостат при 37^oC для получения культуры ткани. Количество кассет определялось количеством испытуемых цитостатиков. Через двое сут после начала культивирования в каждую кассету, кроме контрольной, в стерильных условиях вводили по одному из цитостатиков (винбластин, винкристин, метотрексат, рубомицин, тиофосфамид, фторофур, 5-фторурацил, цис-платина) в дозах, адекватных терапевтическим в пересчете на 1 мл среды (Переводчикова Н.И. Противоопухолевая химиотерапия, 1986). На четвертые сут от начала культивирования во всех кассеты шприцем вводили раствор ³H-тимидина (1 мкк на мл среды), пары стекол предварительно вынимали из кассет, фильтровальной бумагой удаляли среду между стеклами, после чего снова погружали в среду, уже содержащую ³H-тимидин. В течение 1 ч при 37^oC продолжали инкубацию с ³H-тимидином, затем питательную среду из кассет удаляли, вместо нее в кассеты заливали 10% нейтральный формалин. Фиксация продолжалась 24 ч. Пары стекол разбирали, маркировали, в течение 10 мин обрабатывали раствором трихлоруксусной кислоты при 4^oC для удаление непрореагировавших остатков радионуклидов, ополаскивали дистиллированной водой, промывали проточной водой в течение 1 ч. Далее радиоавтографы культур покрывали ядерной фотоэмульсией типа М, проводили экспозицию в темноте при 4^oC в течение 7 дн, проявляли, фиксировали и окрашивали гематоксилин-эозином по общепринятой методике. Окрашенные радиоавтографы (по 10 12 на каждый цитостатик + контрольные) заключали в полистирол или бальзам и светооптическим методом при увеличении х 600 подсчитывали в каждой культуре не менее 1000 жизнеспособных опухолевых клеток, определяя при этом визуально сколько из них являются мечеными. Меченой считали клетку, над ядром которой содержалось не менее 5 гранул серебра, что служило доказательством включения в ДНК ядра радиоактивного тимидина. Клетки, содержащие над ядрами менее 5 гранул мечеными не считались, т.к. такое малое количество гранул может быть обусловлено действием естественного радиоактивного фона. (Епифанова О.Н. и Терских В.В. Метод радиоавтографии в изучении клеточных циклов. М: Наука, 1969). Исходя из полученных значений определяли индекс метки (ИМ) как отношение числа меченых клеток к общему числу подсчитанных в данной культуре, выраженное в процентах:
ИМ а/n х 100
где ИМ индекс метки (%), а число меченых клеток среди подсчитанных, n общее число подсчитанных клеток. Затем высчитывали средний индекс метки для каждой группы культур, на которую действовал тот или иной цитостатик, а также для контрольной группы. Полученные данные статистически обрабатывали, достоверность различий между значениями ИМ в контрольной и опытной группах оценивали с применением критерия Стьюдента. По степени снижения ИМ в опытных группах по сравнению с контролем можно было судить о влиянии цитостатиков на синтез ДНК и, следовательно, о чувствительности или устойчивости опухоли к тому или иному препарату. Опухоль считалась чувствительной к данному лекарственному препарату, если средний ИМ под его действием снижался более, чем на 50% по сравнению со средним ИМ в контрольной группе, который условно принимался за 100% Различие между средним Им в опытной и контрольной группах культур было статистически достоверным (р < 0,05). Опухоли, средний ИМ которых снижался под действием данного препарата менее чем на 50% даже при наличии статистической достоверности различий между значениями ИМ в опытной и контрольной группах, считались устойчивыми к нему (Кретова Т.В. Аксютина М. С. Липчина Л.П. Корман Д.Б. Авторадиографическое исследование скирра желудка человека при культивировании в диффузионных камерах, Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1975, 79, N 6, с. 83 85). Если действие химиопрепарата не приводило к статистически значимым различиям значений ИМ в опытной и контрольной группах (р > 0,05), данный цитостатик считался неэффективным.

Предложенный нами способ исследования индивидуальной химиочувствительности имеет существенные отличия от прототипа:
1. В способе, предложенном нами, эпителиальные клетки имеют опору в виде слоя желатины на предметном стекле. Оценка степени влияния цитостатиков на синтез ДНК проводится на живой монослойной культуре.

2. Поскольку синтез ДНК находится в прямой зависимости от пролиферации клеток, то в отличие от прототипа, цитостатики вводили в питательную среду не сразу, а через двое сут, когда закончится адаптация опухолевых клеток к новым условиям существования и они начнут активно размножаться.

3. В отличие от прототипа монослойная культура опухолевых клеток образовывалась сразу на предметных стеклах, поэтому такие этапы гистологической обработки, как проводка, заливка в парафин, приготовление срезов не требовались, что значительно упрощает способ.

Пример. Больному С. 64 лет, произведена операция нефрэктомия по поводу рака левой почки. После визуального исследования удаленной опухоли стерильным скальпелем в операционной исследовали 1 2 кусочка опухолевой ткани 1 х 1 х 0,5 см, помещали в стерильный флакон с питательной средой Игла с добавлением антибиотиков (по 100 ЕД на 1 мл пенициллина + стрептомицина). Флакон закрывали резиновой пробкой и доставляли в лабораторию. Все дальнейшие работы производили в стерильных условиях: в боксе кусочки опухоли в чашке Петри с небольшим количеством культуральной среды измельчали на фрагменты по 1 2 мм, трижды промывали культуральной средой, затем в течение 5 мин обрабатывали 0,25 раствором трипсина при 37^oC для лучшего разъединения клеток. Затем по 1 кусочку опухоли высаживали на предметные стекла, покрытые 10 раствором желатина в качестве подложки. Каждое стекло с фрагментом опухоли накрывали другим сухим стерильным стеклом и погружали в кассету с культуральной средой, в которую, кроме питательной среды Игла, входили сыворотка крупного рогатого скота, стимуляторы роста (витамины, кортикостероиды, инсулин, феррум-лек, антибиотики, а также поливинилпирролидон).

Приводим состав культуральной среды:
среда Игла 80 об.

сыворотка крупного рогатого скота 20 об.

Вит. А 2 ЕД/мл
Вит. Е 1 мкг/мл
Вит. В₁₂ 0,2 мкг/мл
Вит. К 1 мкг/мл
Феррум-лек 0,006 мг/мл в пересчете на железо
Преднизолон 0,1 мкг/мл
Инсулин 0,1 ЕД/мл
Поливинилпирролидон 2 мг/мл
Пенициллин 100 ЕД/мл
Стрептомицин 100 ЕД/мл
Кассету вкладывали в сухую стерильную банку 0,5 л, которую накрывали стерильной чашкой Петри, что вместе составляло культивационную камеру. Количество кассет соответствовало числу цитостатиков (в данном примере 5) + контроль. Количество среды в кассетах определялось уровнем расположения эксплантатов, которые должны быть погружены в среду. В нашем примере в каждую кассету заливали 20 мл культуральной среды. Через 2 сут после начала культивирования в каждую кассету, кроме контрольной, в стерильных условиях вводили по одному из цитостатиков (винбластин 0,00027 мг/мл; метотрексат - 0,00015 мг/мл; рубомицин 0,00325 мг/мл; тиофосфамид 0,0004 мг/мл; цис-платина 0,001 мг/мл). В пересчете на 20 мл среды в кассете это составило: винбластин 0,0054 мг, метотрексат 0,003 мг, рубомицин 0,065 мг, тиофосфамид 0,008 мг, цисплатина 0,02 мг). На 4 сут от начала культивирования во все кассеты шприцем вводили раствор ³H-тимидина (1 мкк на 1 мл среды), пары стекол предварительно вынимали из кассет, фильтровальной бумагой удаляли среду между стеклами, после чего снова погружали в среду, уже содержащую ³H-тимидин. В течение 1 ч при 37^oC продолжали инкубацию с ³H-тимидином, затем питательную среду из кассет удаляли, вместо нее заливали 10 нейтральный формалин. Фиксация продолжалась 24 ч, затем пары стекол разбирали, маркировали, в течение 10 мин обрабатывали раствором трихлоруксусной кислоты при 4^oC для удаления непрореагировавших остатков радионуклидов, споласкивали дистиллированной водой, промывали проточной водой в течение 1 ч. Далее радиоавтографы культур покрывали ядерной фотоэмульсией типа М, проводили экспозицию в темноте при 4^oC в течение 7 дн, проявляли, фиксировали и окрашивали гематоксилин-эозином. Окрашенные радиоавтографы заключали в полистирол или бальзам и светооптическим методом при увеличении х 600 подсчитывали индекс метки (ИМ). После статистической обработки в приведенном примере были получены результаты, представленные в таблице.

Вывод: опухоль чувствительна к винбластину, рубомицину, устойчива к действию метотрексата, тиофосфамида, цис-платины. Различия между контрольной и опытными группами статистически достоверны. Данный способ сокращает сроки исследования, технически прост, позволяет получить гистологические препараты культур хорошего качества, отличается высокой эффективностью культивирования.

Claims (1)

1. Способ оценки индивидуальной химиочувствительности опухолей у больных, включающий воздействие на контрольные и опытные культуры опухолевых клеток in vitro ³Н-тимидином, экспозицию, проявление и окраску полученных препаратов с последующим светооптическим подсчетом индекса метки и вычислением показателей индивидуальной химиочувствительности, отличающийся тем, что воздействие проводят на первичные краткосрочные культуры опухолевых клеток в экспоненциальной фазе роста.

Images