RU2653442C2 - Способ персонифицированного скрининга действия препаратов на лейкозные клетки ex vivo - Google Patents
Способ персонифицированного скрининга действия препаратов на лейкозные клетки ex vivo Download PDFInfo
- Publication number
- RU2653442C2 RU2653442C2 RU2015156455A RU2015156455A RU2653442C2 RU 2653442 C2 RU2653442 C2 RU 2653442C2 RU 2015156455 A RU2015156455 A RU 2015156455A RU 2015156455 A RU2015156455 A RU 2015156455A RU 2653442 C2 RU2653442 C2 RU 2653442C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- leukemia cells
- aggregates
- action
- leukemic cells
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 230000009471 action Effects 0.000 title claims abstract description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 6
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims abstract description 51
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 35
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 31
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 29
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 19
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 12
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 abstract description 7
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 abstract description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 5
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 abstract description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 115
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 description 11
- 229960005420 etoposide Drugs 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 6
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 230000000254 damaging effect Effects 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 229940126622 therapeutic monoclonal antibody Drugs 0.000 description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 4
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 230000005732 intercellular adhesion Effects 0.000 description 2
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 108010006533 ATP-Binding Cassette Transporters Proteins 0.000 description 1
- 102000005416 ATP-Binding Cassette Transporters Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 1
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000017455 cell-cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 229960000390 fludarabine Drugs 0.000 description 1
- GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N fludarabine phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC(F)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000017066 negative regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000816 toxic dose Toxicity 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009971 xenobiotic transport Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
- C12N5/0694—Cells of blood, e.g. leukemia cells, myeloma cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам скрининга чувствительности клеток лейкоза ex vivo к действию различных веществ, в частности препаратов и перспективных лекарственных субстанций, а также их сочетаний, что может быть использовано в медицине. Способ состоит в том, что из аспирата костного мозга больного выделяют лейкозные клетки, получают аутологичную сыворотку, формируют многоклеточные агрегаты путем культивирования полученных лейкозных клеток, используя питательную среду с добавлением указанной аутологичной сыворотки, и исследование действия препаратов выполняют в питательной среде с добавлением этой же аутологичной сыворотки. Изобретение позволяет приблизить условие in vitro к in situ, значительно усиливает лекарственную устойчивость лейкозных клеток, а также приближает специфическую реакцию лейкозных клеток к препаратам в условиях ex vivo к условиям in situ, что в свою очередь обеспечивает эффективную выработку стратегии терапевтического лечения с учетом специфических условий микроокружения лейкозных клеток in situ. 4 ил., 3 пр.
Description
Изобретение относится к области медицины, в частности к способам скрининга чувствительности клеток лейкоза ex vivo к действию различных веществ, в частности препаратов и перспективных лекарственных субстанция, их сочетаний, и направлено на приближение условий околоклеточного микроокружения лейкозных клеток при скрининге и, соответственно, лекарственной устойчивости этих клеток к условиям in situ.
Известно, что чувствительность клеток лейкозов разных типов к различным противоопухолевым препаратам отличается. По этой причине для лечения лейкозов разных типов используют различные препараты (Cancer Sci., 2015, 106(4):344-51; J Clin Med., 2015, 4(1): 127-49; Am J Hematol., 2015, 90(5):446-60; Curr Treat Options Oncol., 2014, 15(2): 187-209; Int J Clin Oncol., 2014, 19(1):10-5). Известно также, что клетки лейкозов способны приобретать резистентность к противоопухолевым препаратам в результате мутаций и элиминации чувствительных к химиотерапии клеток в процессе лечения. Известно, что чувствительность клеток к химиотерапии может зависеть от межклеточных взаимодействий. Например, лейкозные клетки in vitro становятся значительно устойчивее в агрегатах к действию препаратов и повреждающих субстанций, чем одиночные клетки, причем в разных типах лейкозных клеток этот эффект может существенно отличаться (Альманах клинической медицины, 2014, 31:11-16; Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2015, 32(2):125-134; Биофизика, 2015, 60(6):1146-1150). Аналогичное появление резистентности к препаратам обнаруживается при агрегации клеток солидных опухолей, например клеток, полученных из различных карцином, сарком. Механизм повышения лекарственной устойчивости в многоклеточных агрегатах остается неясным. Есть основания предполагать, что эффект многоклеточной лекарственной устойчивости определяется многими механизмами, включая активацию системы транспорта ксенобиотиков из клеток (система ABC транспортеров, включая PgP, белки MRP1-MRP5 и др.), повышение активности внутриклеточных сигнальных путей выживания клеток при различных повреждающих воздействиях (химиотерапевтические препараты, рецептор опосредованная гибель клеток, физические факторы), что могут включаться сразу несколько механизмов защиты клеток в агрегатах, причем в разных клетках этот набор может иметь свою специфику. Однако ясного понимания механизмов включения защиты клеток в многоклеточных структурах нет, тем более понимания специфичности этих механизмов для разных типов клеток. Для тестирования чувствительности опухолевых клеток к препаратам in vitro разрабатываются различные способы, в которых учитывается повышение клеточной резистентности в многоклеточных агрегатах (Neoplasia, 2015, 17(1):1-15; Adv Drug Deliv Rev., 2014, 79-80:50-67; Adv Drug Deliv Rev., 2014, 79-80:3-18; Adv Drug Deliv Rev., 2014, 69-70:29-41; Adv Drag Deliv Rev., 2014, 74:95-103). Создание эффективного способа оценки чувствительности лейкозных клеток к действию препаратов с учетом особенностей повышения их устойчивости в зависимости от микроокружения имеет важнейшее значение для правильного выбора стратегии терапевтического лечения больных.
Известен способ тестирования клеток к действию лекарств (Европейский Патент ЕР 2138844 В1), включающий получение клеток из первично изолированных тканей или из биологических жидкостей, последующее их культивирование в условиях с инертным матриксом, обеспечивающих формирование сфероидов, и последующее использование этих сфероидов для скрининга эффективности действия препаратов и субстанций на клетки в сфероидах. В конечном счете изобретение обеспечивает метод персонифицированного определения стратегии выбора лекарства для лечения заболевания.
Недостатком способа является то, что он предполагает создание сфероидов и исследование чувствительности клеток к действию препаратов в сфероидах, что применимо для многих типов клеток, полученных из солидных опухолей, например карциномы, саркомы, глиомы, но неприменимо для лейкозных клеток. Сфероиды представляют собой сферические агрегаты слипшихся клеток. Количество клеток в сфероидах варьируют, как правило, в диапазоне 5 тысяч и более, а размер сфероида составляет 0,05-2 мм в зависимости от вида клеток и их количества. Для образования сфероидов важное значение имеет способность клеток к сильной межклеточной адгезии (прилипанию), которая характерна для многих клеток солидных опухолей и не характерна для лейкозных клеток. Лейкозные клетки обладают слабой межклеточной адгезией, не способны формировать сфероиды, и поэтому такой способ не применим для изучения чувствительности клеток лейкоза к действию противоопухолевых препаратов.
Известен способ получения многоклеточных агрегатов сфероидов для последующего их применения в изучении роста, дифференцировки клеток, а также действия цитотоксических веществ на клетки с учетом межклеточных взаимодействий (заявка на патент US 2014/0221225 А1). Этот способ включает инъекцию клеточной суспензии в гель, изготовленный из молекул внеклеточного матрикса (коллаген, фибронектин, ламинин, матригель и др.). После инъекции клетки культивируют, обеспечивая возможность их миграции в многоклеточные агрегаты - сфероиды, которые затем используют для изучения клеточных функций и выживаемости клеток.
Основным недостатком этого способа является то, что он применим только для клеток, обладающих способностью мигрировать и образовывать прочно слипшиеся клеточные агрегаты (сфероиды), и неприменим для формирования многоклеточных агрегатов клетками лейкоза, которые обладают слабой миграционной активностью и слабой межклеточной адгезией. По этой причине такой способ не может быть использован для скрининга эффективности действия различных препаратов на клетки лейкоза в многоклеточных агрегатах.
Наиболее близким, принятым за прототип является способ тестирования лейкозных клеток, согласно которому многоклеточные агрегаты формируют путем культивирования клеток в многолуночном планшете в питательной среде с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки на слое геля, приготовленного на основе 1,5% агарозы, а после формирования многоклеточных агрегатов через 1 сутки после посева добавляют исследуемые вещества и через определенное время оценивают жизнеспособность клеток в культурах известными способами (Альманах клинической медицины, 2015, №31, с. 11-16). Формируемые агрегаты не являются сфероидами, клетки в них слабо связаны, и агрегаты могут распадаться на более мелкие даже при слабом движении среды около них.
Недостатком известного способа является то, что культивирование клеток лейкоза в среде с эмбриональной телячьей сывороткой является неадекватным набору сигнальных молекул в организме и тем самым способно значительно исказить чувствительность клеток лейкемии к повреждающим химическим субстанциям, препаратам в сравнении с условиями in situ и понизить ценность полученных результатов для практического применения.
Задачей настоящего изобретения является создание способа персонифицированного скрининга действия препаратов на клетки лейкоза ex vivo с учетом возможности повышения их лекарственной устойчивости в многоклеточных агрегатах, в котором сигнальное микроокружение клеток приближено к условиям in vivo.
Поставленная задача достигается тем, что в известном способе, включающем формирование многоклеточных агрегатов лейкозных клеток в многолуночных культуральных планшетах в питательной среде с добавлением сыворотки крови и последующий скрининг действия веществ на многоклеточные агрегаты лейкозных клеток, согласно предлагаемому изобретению из аспирата костного мозга больного получают аутологичную сыворотку, многоклеточные агрегаты формируют путем культивирования лейкозных клеток в питательной среде с добавлением указанной аутологичной сыворотки и исследование действия препаратов выполняют в питательной среде с добавлением этой же аутологичной сыворотки. В предпочтительном варианте для формирования агрегатов лейкозных клеток и для скрининга действия на них химических субстанций в среду добавляют 20% указанной аутологичной сыворотки без инактивации системы комплемента и формируют агрегаты, включающие 5000 клеток.
Применение аутологичной сыворотки, полученной из аспирата костного мозга, для тестирования чувствительности лейкозных клеток в агрегатах обеспечивает приближение микроокружения клеток по составу цитокинов и ростовых факторов к реальным условиям в костном мозге больного. Учитывая влияние этих цитокинов на резистентность клеток к препаратам, на возможности их дифференцировки, применение этой сыворотки является более адекватным приближением к условиям in situ в персонифицированном скрининге действия веществ на лейкозные клетки in vitro, чем использование гетерологической сыворотки крови или аутологичной сыворотки, полученной из периферической крови больного. Предлагаемое в данном изобретении решение основано на обнаруженных авторами фактах, согласно которым только применение не инактивированной по комплименту аутологичной сыворотки, полученной из аспирата костного мозга и используемой при скрининге чувствительности лейкозных клеток в многоклеточных агрегатах к действию таргетного препарата ритуксимаб, позволяет выявить его токсичность на эти клетки в агрегатах in vitro, что в присутствии этой аутологичной сыворотки лейкозные клетки более резистентны к действию химиотерапевтических препаратов и перспективных субстанций, чем в присутствии ксеногенной сыворотки, применяемой в способе, принятом за прототип.
Изобретение поясняется следующими примерами реализации предложенного способа персонифицированного скрининга действия препаратов на лейкозные клетки в культуре и его сравнения с прототипом.
Материалы и методика скрининга
Для получения аутологичной сыворотки, аспират костного мозга больного острым миеломонобластным лейкозом центрифугировали при 400g в течение 10 минут при 4°C. Надосадочную жидкость собирали в вакуумные пробирки с активатором свертывания производства APEXLAB (Россия), инкубировали в течение 10 минут при 37°C при встряхивании. Затем пробирки с образовавшемся сгустком центрифугировали при 400g в течение 10 минут. Надосадочную жидкость (сыворотку) использовали для проведения скрининга.
Для получения клеток аспират костного мозга разводили 1:1 раствором Хенкса (Sigma-Aldrich, США) и проводили центрифугирование на градиенте Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich, США) при 800g в течение 30 минут. Далее клетки собирали стерильной серологической пипеткой на границе раздела Histopaque-1077 - плазма, ресуспендировали в среде IMDM (1:4) и центрифугировали при 400g в течение 5 минут. Оценку количества живых клеток после выделения проводили с помощью витального красителя трипанового синего. Процент живых клеток составлял не менее 95%. Полученные мононуклеарные клетки инкубировали 12 часов в полной ростовой среде (IMDM с добавлением 20% полученной аутологичной сыворотки) на культуральных чашках Петри при 37°C и 5% содержания CO2 в газовой фазе. Для скрининга использовали клетки, не прикрепившиеся к поверхности культурального флакона.
Для формирования многоклеточных агрегатов культуральные 96-луночные планшеты покрывали 1,5% раствором агарозы (Panreac, Испания). Для этого 1,5 грамма агарозы растворяли в 100 мл питательной среды IMDM при нагревании до 95°C в течение 5 минут. Затем раствор агарозы помещали в водяную баню при 60°C и выдерживали в течение 60 мин. Далее в каждую лунку культурального планшета добавляли по 75 микролитров 1,5% раствора агарозы и ставили в стерилизационную УФ-камеру на 2 часа. После этого проводили посев по 2×103, 5×103 и 10×103 клеток в лунку в 100 мкл полной инкубационной среды. Через 24 часа в каждой лунке формировался единичный агрегат клеток (Фиг. 1).
Для получения культуры одиночных клеток использовали питательную среду содержащую метилцеллюлозу. Для этого клетки инкубировали в течение 24 часов в 96-луночных планшетах, по 5×103 клеток в лунке в 100 мкл ростовой среды, указанной выше, с добавлением в нее 0,9% метилцеллюлозы (Sigma-Aldrich, США). Данная культуральная среда препятствует спонтанной агрегации клеток, которые в ней находятся в виде суспензии одиночных клеток.
Жизнеспособность клеток после инкубации с этопозидом оценивали по интенсивности восстановления метаболического индикатора AlamarBlue (Invitrogen, США). Для этого к клеткам через 24 часа после посева добавляли препараты, после 24 часа инкубации с препаратами добавляли индикатор AlamarBlue в концентрации 100 мкг/мл. Затем клетки инкубировали с индикатором в течение 4 часов при 37°C в условия 5% содержания CO2 в газовой фазе и после инкубации измеряли интенсивность флуоресценции при длине волны 595 нм с использованием планшетного спектрофлуориметра Infinity F 200 (Тесал, Австрия). Результаты измерения сравнивали относительно контроля. В качестве контроля для каждого из условий использовали культуры без добавления повреждающих агентов. Например, для культур одиночных клеток с добавлением этопозида контролем были культуры одиночных клеток без добавления этопозида, а для культур агрегатов по 5000 клеток каждом с добавлением к ним этопозида контролем были культуры в агрегатах по 5000 клеток без добавления этопозида и т.д.
Пример 1. Лейкозные клетки ex vivo в агрегатах многократно (на порядки) более резистентны к препарату этопозид, чем одиночные лейкозные клетки.
Проводили скрининг чувствительности первичных лейкозных клеток в агрегатах (по 5000 и по 2000 клеток в каждом) и чувствительности одиночных лейкозных клеток к препарату этопозид в среде с аутологичной сывороткой, полученной из аспирата костного мозга.
Представленные на фиг. 1 результаты показывают, что этопозид оказывает гораздо большее токсическое действие на одиночные лейкозные клетки, чем на эти же клетки в агрегатах. В частности, концентрация этопозида, при которой обнаруживали уменьшение количества живых клеток в 2 раза в сравнении с контролем (IC50), для культур одиночных клеток, посеянных по 5000 на лунку, составляла около 0,01 мкМ, для агрегатов по 2000 клеток на лунку - 0,1 мкМ (в 10 раз больше), а для агрегатов по 5000 - более 100 мкМ (в 10000 раз больше). Токсическое действие этопозида в агрегатах по 5000 и по 10000 клеток было одинаковым. Увеличение количества клеток в агрегатах нецелесообразно потому, что при количестве клеток в агрегате, большем чем 10000, наблюдается ухудшение условий околоклеточного микроокружения за счет диффузионных ограничений массопереноса и это приводит к торможению роста и к гибели клеток, а следовательно, к искажению результатов в контроле. Таким образом, токсические дозы этопозида для лейкозных клеток в агрегатах по 5000 клеток возросли в 10000 раз в сравнении с одиночными клетками. Учитывая тот факт, что костном мозге гемопоэтические, лимфоидные и лейкозные клетки достаточно плотно упакованы, находятся в агрегированном состоянии, представленные результаты указывают на то, что для корректного скрининга действия препаратов надо использовать лейкозные клетки в агрегатах, а не на первичные культуры одиночных клеток, в которых не включены механизмы защиты в такой степени, как в агрегатах.
Пример 2. Повышение резистентности лейкозных клеток ex vivo в агрегатах в присутствии аутологичной сыворотки, полученной из аспирата костного мозга больного
Выполняли скрининг действия препарата флудорабин на лейкозные клетки больного в агрегатах (5000 клеток) в присутствии аутологичной сыворотки, полученной из аспирата костного мозга, или в присутствии фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота (прототип). Обнаружили (фиг. 3), что лейкозные клетки человека в агрегатах более резистенты к препарату флударабин в присутствии 20% аутологичной сыворотки, полученной из аспирата костного мозга (IC50 составляет около 5 мкМ), чем в присутствии 20% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (IC50 составляет около 0,5 мкМ). Увеличение резистентности указывает на наличие в аутологичной сыворотке факторов, таких как интерлейкины (IL1, IL6 и др.), ростовые факторы (например, IGF-1), которые способны повышать резистентность лейкозных клеток. Реальный количественный эффект такого повышения резистентности (в десять раз), указывающий на целесообразность применения аутологичной сыворотки из аспирата костного мозга для персонифицированного скрининга действия препаратов на лейкозные клетки больного, можно оценить только на основе экспериментальных фактов, в частности представленного на фиг. 3. Возможно, для разных больных, для разных видов лейкоза этот эффект будет отличаться, но столь значительное увеличение резистентности указывает на необходимость использования аутологичной сыворотки из костного мозга для персонифицированного скрининга действия препаратов на лейкозные клетки больного.
Пример 3. Необходимость использования неинактивированной аутологичной сыворотки из аспирата костного мозга больного для скрининга действия терапевтических моноклональных антител
Выполняли скрининг токсического действия моноклонального антитела ритуксимаб на первичные лейкозные клетки в агрегатах (5000 клеток) в присутствии 20% неинактивированной аутологичной сыворотки из аспирата костного мозга или 20% фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Обнаружили (фиг.4), что в среде с добавлением 20% фетальной сыворотки крупного рогатого скота ритуксимаб не оказывал токсического действия на лейкозные клетки даже при концентрациях 200 мкг/мл, а в среде, содержащей 20% аутологичной сыворотки, ритуксимаб начинал оказывать повреждающее действие на лейкозные клетки уже при концентрациях 1 мкг/мл. Это указывает на участие системы комплимента в цитотоксическом действии терапевтического моноклонального антитела ритуксимаб на лейкозные клетки. С другой стороны, данные на фиг. 4 свидетельствуют, что ритуксимаб вызывает токсическое действие только у 60% лейкозных клеток, а 40% остаются нечувствительными к этому таргетному препарату, и, следовательно, необходимо искать дополнительные возможности индуцировать гибель всех лейкозных клеток. Представленные результаты показывают, что для правильной оценки действия терапевтических моноклональных антител на первичные лейкозные клетки необходимо использовать неинактивированную аутологичную сыворотку из аспирата костного мозга больного.
Таким образом, приведенные результаты показывают, что выполнение персонифицированного скрининга действия противоопухолевых препаратов на лейкозные клетки больного ex vivo необходимо проводить на многоклеточных агрегатах, предпочтительно содержащих по 5000 клеток, а также в присутствии 20% аутологичной неинактивированной сыворотки, полученной из аспирата костного мозга больного, поскольку в этих условиях, приближенных к in situ, проявляется многократное увеличение лекарственной устойчивости лейкозных клеток, а также реализуется специфическая чувствительность лейкозных клеток, например, к действию терапевтических моноклональных антител.
Claims (1)
- Способ персонифицированного скрининга действия препаратов на лейкозные клетки ex vivo, включающий формирование многоклеточных агрегатов лейкозных клеток в многолуночных культуральных планшетах в питательной среде с добавлением сыворотки крови и последующий скрининг действия препаратов на многоклеточные агрегаты лейкозных клеток, отличающийся тем, что из аспирата костного мозга больного получают аутологичную сыворотку, многоклеточные агрегаты формируют путем культивирования лейкозных клеток, полученных от этого же больного, используя питательную среду с добавлением указанной аутологичной сыворотки, и исследование действия препаратов выполняют в питательной среде с добавлением этой же аутологичной сыворотки.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015156455A RU2653442C2 (ru) | 2015-12-29 | 2015-12-29 | Способ персонифицированного скрининга действия препаратов на лейкозные клетки ex vivo |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015156455A RU2653442C2 (ru) | 2015-12-29 | 2015-12-29 | Способ персонифицированного скрининга действия препаратов на лейкозные клетки ex vivo |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2015156455A RU2015156455A (ru) | 2017-07-04 |
| RU2653442C2 true RU2653442C2 (ru) | 2018-05-08 |
Family
ID=59309463
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015156455A RU2653442C2 (ru) | 2015-12-29 | 2015-12-29 | Способ персонифицированного скрининга действия препаратов на лейкозные клетки ex vivo |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2653442C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2702657C1 (ru) * | 2019-06-03 | 2019-10-09 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Новосибирский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО НГМУ Минздрава России) | Способ прогнозирования эффективности лечения больных острыми миелобластными лейкозами противоопухолевыми препаратами даунорубицином и цитозин-арабинозидом |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2267532C1 (ru) * | 2004-06-25 | 2006-01-10 | Государственное учреждение Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН | Клеточная линия а4 т-лимфобластного лейкоза человека, используемая для скрининга противоопухолевых препаратов |
| EP2138844B1 (en) * | 2008-06-26 | 2012-04-25 | SpheroTec GmbH | Method for testing the response of cells to exposures with therapeutics |
| US20140221225A1 (en) * | 2011-03-29 | 2014-08-07 | Universiteit Leiden | Method for obtaining a multicellular spheroid |
-
2015
- 2015-12-29 RU RU2015156455A patent/RU2653442C2/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2267532C1 (ru) * | 2004-06-25 | 2006-01-10 | Государственное учреждение Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН | Клеточная линия а4 т-лимфобластного лейкоза человека, используемая для скрининга противоопухолевых препаратов |
| EP2138844B1 (en) * | 2008-06-26 | 2012-04-25 | SpheroTec GmbH | Method for testing the response of cells to exposures with therapeutics |
| US20140221225A1 (en) * | 2011-03-29 | 2014-08-07 | Universiteit Leiden | Method for obtaining a multicellular spheroid |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ЗАХАРОВ С.Г. и др., Повышение лекарственной устойчивости клеток острого миелобластного лейкоза в многоклеточных агрегатах in vitro, 2014, т.31, стр.11-16. KARJALAINEN K. et al., Design, development, and validation of a high-throughput drug-screening assay for targeting of human leukemia, Cancer, 2014, v.120, is.4, p:589-602. HOURIGAN C.S. and KARP J.E., Personalized Therapy for Acute Myeloid Leukemia, Cancer Discov., 2013, v.3, is.12. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2702657C1 (ru) * | 2019-06-03 | 2019-10-09 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Новосибирский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО НГМУ Минздрава России) | Способ прогнозирования эффективности лечения больных острыми миелобластными лейкозами противоопухолевыми препаратами даунорубицином и цитозин-арабинозидом |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2015156455A (ru) | 2017-07-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pavesi et al. | A 3D microfluidic model for preclinical evaluation of TCR-engineered T cells against solid tumors | |
| Chramiec et al. | Integrated human organ-on-a-chip model for predictive studies of anti-tumor drug efficacy and cardiac safety | |
| Xiang et al. | Targeted activation of human Vγ9Vδ2-T cells controls epstein-barr virus-induced B cell lymphoproliferative disease | |
| CN102203290B (zh) | 肿瘤干细胞分子标记 | |
| US20090325216A1 (en) | Process for the Preparation of Multicellular Spheroids | |
| Chang et al. | Simulated microgravity alters the metastatic potential of a human lung adenocarcinoma cell line | |
| JPWO2018169007A1 (ja) | 腫瘍組織を用いた初代がん細胞の３次元培養 | |
| JP5881031B2 (ja) | 薬剤感受性試験用バイオチップ | |
| US20210238554A1 (en) | Method for culturing a subpopulation of circulating epithelial tumour cells from a body fluid | |
| CN102321158B (zh) | 阻止细胞dna合成抑制细胞增殖的多肽及用途 | |
| Silvestri et al. | Persistence of drug-resistant leukemic stem cells and impaired NK cell immunity in CML patients depend on MIR300 antiproliferative and PP2A-activating functions | |
| CA2896997A1 (en) | System and method for a biomimetic fluid processing | |
| Bruzauskaite et al. | Relevance of HCN2-expressing human mesenchymal stem cells for the generation of biological pacemakers | |
| He et al. | Metabolic reprogramming of NK cells by black phosphorus quantum dots potentiates cancer immunotherapy | |
| RU2653442C2 (ru) | Способ персонифицированного скрининга действия препаратов на лейкозные клетки ex vivo | |
| Liu et al. | Therapeutic potential of human adipose stem cells in a cancer stem cell-like gastric cancer cell model | |
| Higuera et al. | Spatiotemporal proliferation of human stromal cells adjusts to nutrient availability and leads to stanniocalcin-1 expression in vitro and in vivo | |
| Qiu et al. | Establishment of a 3D model of tumor-driven angiogenesis to study the effects of anti-angiogenic drugs on pericyte recruitment | |
| CN114191556A (zh) | 敲降rbms1的试剂在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用 | |
| Maini et al. | Monocyte and neutrophil isolation, migration, and phagocytosis assays | |
| Liu et al. | DNA origami assembled spheroid for evaluating cytotoxicity and infiltration of chimeric antigen receptor macrophage (CAR-M) | |
| Abolins-Thompson | 'I get by with a little help from my friends': The role of stromal cells in the breast cancer chemoresistance mechanism | |
| Haselager et al. | In vitro lymph node-mimicking 3D model displays long-term T cell-dependent CLL proliferation and survival | |
| Liu et al. | Breast tumor-on-chip: from the tumor microenvironment to medical applications | |
| WO2018148208A1 (en) | A high throughput 3d assay for immune cell and drug homing, migration and tumor cytotoxicity |