CN116814528A - 一种培养基及多囊肾类器官培养方法与应用 - Google Patents
一种培养基及多囊肾类器官培养方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116814528A CN116814528A CN202310630098.8A CN202310630098A CN116814528A CN 116814528 A CN116814528 A CN 116814528A CN 202310630098 A CN202310630098 A CN 202310630098A CN 116814528 A CN116814528 A CN 116814528A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polycystic kidney
- culture
- organoids
- forskolin
- kidney disease
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 208000030761 polycystic kidney disease Diseases 0.000 title claims abstract description 132
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 title claims abstract description 80
- 208000026372 Congenital cystic kidney disease Diseases 0.000 title claims abstract description 61
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 title claims abstract description 26
- 238000012136 culture method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N FORSKOLIN Chemical compound O=C([C@@]12O)C[C@](C)(C=C)O[C@]1(C)[C@@H](OC(=O)C)[C@@H](O)[C@@H]1[C@]2(C)[C@@H](O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N 0.000 claims abstract description 53
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 31
- OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N colforsin Natural products OC12C(=O)CC(C)(C=C)OC1(C)C(OC(=O)C)C(O)C1C2(C)C(O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 26
- SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N Deoxycoleonol Natural products C12C(=O)CC(C)(C=C)OC2(C)C(OC(=O)C)C(O)C2C1(C)C(O)CCC2(C)C SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 25
- 208000010061 Autosomal Dominant Polycystic Kidney Diseases 0.000 claims abstract description 24
- 208000022185 autosomal dominant polycystic kidney disease Diseases 0.000 claims abstract description 24
- UIVOZBSCHXCGPS-UHFFFAOYSA-N 7-bromo-n-(1-phenylcyclopropyl)-3-[(4-piperidin-1-ylpiperidin-1-yl)methyl]-2-[3-(trifluoromethyl)phenyl]quinoline-4-carboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(C=2C(=C(C(=O)NC3(CC3)C=3C=CC=CC=3)C3=CC=C(Br)C=C3N=2)CN2CCC(CC2)N2CCCCC2)=C1 UIVOZBSCHXCGPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 12
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 13
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 13
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 12
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 10
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 7
- 239000012574 advanced DMEM Substances 0.000 claims description 6
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 claims description 6
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 claims description 6
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 claims description 6
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 5
- 102100031361 Fibroblast growth factor 20 Human genes 0.000 claims description 5
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 claims description 5
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 claims description 5
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 5
- 101000846532 Homo sapiens Fibroblast growth factor 20 Proteins 0.000 claims description 5
- QTENRWWVYAAPBI-YZTFXSNBSA-N Streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YZTFXSNBSA-N 0.000 claims description 5
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 claims description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 4
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims description 3
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims description 3
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 claims description 3
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 3
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 claims description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 2
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 abstract description 17
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 abstract description 4
- 238000012937 correction Methods 0.000 abstract description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 abstract description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 abstract 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 208000002814 Autosomal Recessive Polycystic Kidney Diseases 0.000 description 4
- 208000017354 Autosomal recessive polycystic kidney disease Diseases 0.000 description 4
- 101100029888 Homo sapiens PKD1 gene Proteins 0.000 description 4
- 101150056230 PKD1 gene Proteins 0.000 description 4
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 4
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 208000026292 Cystic Kidney disease Diseases 0.000 description 2
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 2
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 101001074444 Homo sapiens Polycystin-1 Proteins 0.000 description 2
- 101001074439 Homo sapiens Polycystin-2 Proteins 0.000 description 2
- 101001026882 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase D2 Proteins 0.000 description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 101100073918 Mus musculus Prkd1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 102100037310 Serine/threonine-protein kinase D1 Human genes 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 210000004957 autophagosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 238000001152 differential interference contrast microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000010339 dilation Effects 0.000 description 2
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- HCZKYJDFEPMADG-UHFFFAOYSA-N nordihydroguaiaretic acid Chemical compound C=1C=C(O)C(O)=CC=1CC(C)C(C)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 HCZKYJDFEPMADG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 2-(diethylamino)ethyl 4-aminobenzoate;(2s,5r,6r)-3,3-dimethyl-7-oxo-6-[(2-phenylacetyl)amino]-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid;hydrate Chemical compound O.CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1.N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 0.000 description 1
- DVKQVRZMKBDMDH-UUOKFMHZSA-N 8-Br-cAMP Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1Br DVKQVRZMKBDMDH-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 102100037312 Serine/threonine-protein kinase D2 Human genes 0.000 description 1
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000004900 autophagic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 210000004081 cilia Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000037416 cystogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000000110 microvilli Anatomy 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 101150112863 pkd2 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 238000011808 rodent model Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- -1 small molecule compound Chemical class 0.000 description 1
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种培养基及多囊肾类器官培养方法与应用。本发明以ADPKD患者的肾脏病理囊壁组织为细胞来源，通过RGF培养基构建了多囊肾的3D类器官，该3D类器官具有更好的基因稳定性，能较好地模拟ADPKD在体内的病理特征。为了加强上述3D类器官的囊泡化状态，更好的模拟疾病组织的生理状态，本发明引入Forskolin，并将该类器官应用于药物筛选模型构建。经筛选，GSK2193874能够显著抑制多囊肾类器官的囊泡生长，提示其在制备多囊肾病治疗药物中的潜在应用。上述培养方式应用于ADPKD多囊肾类器官体外培养，有望用于疾病机制研究、药物筛选和矫正后应用临床细胞治疗等。
Description
技术领域
本发明属于多囊肾脏组织类器官培养技术领域，具体涉及Forskolin在多囊肾病疾病模型中的应用、一种培养基及多囊肾类器官培养方法与应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
多囊肾病(PKD)是全球发病率最高的单基因遗传病，包括常染色体隐性多囊肾病(ARPKD)和常染色体显性多囊肾病(ADPKD)。ARPKD占PKD的5％，在胚胎期发生存活率低，ADPKD占PKD的95％，在成年后发病，是一种导管器官囊肿形成为特征的全身性疾病。尽管遗传学研究表明ADPKD中85％来自于PKD1基因突变，15％来自于PKD2基因突变。但目前ADPKD的发病机制仍不明确，全球范围缺乏针对多囊肾病的特异性治疗药物，临床治疗机制研究和药物发现困境在于缺乏精准模拟ADPKD的良好模型。
目前，多囊肾的体外模型主要包括动物模型和类器官模型。动物模型以啮齿类动物模型常见，多囊肾的啮齿类动物模型主要包括：①自发遗传多囊肾模型如cpk、pcy、jck、bpk多囊肾小鼠模型及Han:SPRD-cy、PCK多囊肾大鼠模型等，此类模型与人类多囊肾发病机制本质上不同。②化学物质诱导的多囊肾模型，如DPT、NDGA等诱导的大鼠多囊肾模型等，此类模型通过药物诱发多囊表型，无法真实模拟ADPKD遗传疾病的本质特征。③PKD1和PKD2基因敲除多囊肾小鼠模型，但杂合子小鼠多囊肾病变进展缓慢，几乎所有的纯合子小鼠在婴幼儿期死亡无法进行机制研究。因此目前动物模型模拟多囊肾发病乏善可陈。模拟ADPKD的类器官目前主要集中于hiPSCs来源诱导模型。由多囊肾患者来源外周血单个核细胞经基因重编程诱导成保留疾病特性的hiPSCs或将普通hiPSCs通过基因编辑技术敲除PKD1或PKD2基因后得到。但是有以下缺点：(1)诱导分化效率不稳定，批次效应显著；(2)具有非肾脏细胞等脱靶性，有潜在畸胎瘤风险；(3)细胞未成熟更像ARPKD而非ADPKD，不适用于多囊肾等成年发病疾病的模拟。
针对上述研究现状，本发明认为，为了改善目前临床缺乏ADPKD特异性治疗药物的问题，有必要提供一种能够稳定维持ADPKD生理结构的类器官及其作为药筛模型的应用。
发明内容
本发明设计以ADPKD患者肾脏囊肿组织分离细胞为来源，通过体外培养将其诱导为能够稳定表达疾病形态、并且具有良好增殖能力的多囊肾疾病模型。
为了实现该目的，本发明首先提供了一种RGF培养基，用于将ADPKD患者肾脏囊肿组织分离细胞培养为多囊肾3D类器官；进一步的，本发明还设计对上述多囊肾3D类器官进一步诱导培养，通过引入Forskolin构建多囊肾病疾病模型，使其能够充分的呈现多囊肾病的囊肿形态，更加贴近体内病理组织的生理结构。
本发明以上述多囊肾病疾病模型作为药物筛选模型，通过对20种小分子进行筛选，发现GSK2193874在诸多小分子中具有显著的抑制囊泡扩张的效果。该筛选结果也证实了上述药筛模型的优越性，证实了Forskolin在多囊肾3D类器官模型培养中的可行性。
基于上述技术效果，本发明具体提供如下的技术方案：
第一方面，提供一种多囊肾3D类器官体外培养方法，所述方法包括如下步骤：将常染色体显性多囊肾病患者的肾脏病理囊壁组织分离为单体细胞，加入基质胶重悬，使单体细胞聚集成团进行培养，加入RGF培养基培养获得多囊肾3D类器官；所述RGF培养基以Advanced DMEM/F12型培养基作为基础，至少包括如下成分：抗生素、抗氧化剂、谷氨酰胺补充剂、ROCK激酶抑制剂、生长因子、血清替代物、TGF-β抑制剂及维甲酸。
上述培养方法中，所述单体细胞的分离方式可采用本领域常规方法，一种可行的实施方式如下：将所述囊壁组织清理后剪碎，加入含有透明质酸酶和胶原酶Ⅳ的DMEM/F12混合液置于培养箱中消化一段时间，加入DMEM/F12混合液终止消化；向终止消化后的细胞加入红细胞裂解液，水浴破红加入DMEM/F12混合液终止红细胞裂解得到所述单体细胞。
所述RGF培养基的成分如下：90～110units/ml Penicillin-90～110μg/mlStreptomycin Solution；HEPES缓冲液，9～11mM；GlutaMAX，1x；B27，1x；Primocin，0.09～0.11mg/ml；NAC，0.9～1.1mM；EGF，40～60ng/ml；Y27632，9～11μM；A83-01，4～6μM；R-spondin，90～110ng/ml；Retinoic Acid，1～3μM；GDNF，90～110ng/ml；FGF20，90～110ng/ml；各成分在Advanced DMEM/F12中稀释。
本发明验证的一种实施方式中，所述单体细胞加入基质胶重悬后以胶滴接种于培养板中，所述接种胶滴的直径为3～5mm，接种后的培养板依次正置、倒置培养一段时间，使接种细胞更接近球体；向倒置培养完成后的培养板中加入上述RGF培养基，置于CO2培养箱中培养，每隔2～4天更换培养基。
成体细胞具有更好的基因稳定性，上述培养方法以利用常染色体显性多囊肾病(ADPKD)患者的离体组织为来源，分离得到单体细胞培养为多囊肾3D类器官。该培养方式能够显著提高细胞活力，促进单体细胞生长、扩增并自组织为高度复杂的3D类器官结构，并且能够产生多囊空泡形态，很好的模拟了患者病理组织的生物活性，为疾病机制研究、药物筛选和矫正后临床细胞治疗等提供了广阔的应用前景。
为了进一步加速疾病进展，使囊泡变大，变得更加符合体内的多囊肾状态，成为一种多囊肾病疾病模型，增加其作为药筛模型的说服力，本发明向上述RGF培养基中引入cAMP激动剂，加强上述多囊肾3D类器官的囊泡化效果。依据本发明对cAMP激动剂的筛选结果，Forskolin具有对上述成体细胞的促进作用较为显著，可添加至RGF培养基中用于促进多囊肾类器官消化成单细胞后的协同生长以进行药物筛选。
第二方面，提供Forskolin在多囊肾病疾病模型培养中的应用。
上述应用中所称的Forskolin(毛喉素，FORSKOLIN，别名Coleonol)从毛喉鞘蕊花中提取的一种天然产物，CAS号：66575-29-9。
上述应用至少包括以下方式：
(1)将Forskolin用于制备多囊肾病疾病模型培养基；
(2)将Forskolin用于多囊肾3D类器官的体外培养，构建多囊肾病疾病模型。
上述(1)方面所称的培养基，包括上述RGF培养基，还包括一定剂量的Forskolin。
一种具体的实施方式中，所述培养基的成分如下：90～110units/ml Penicillin-90～110μg/ml Streptomycin Solution；HEPES缓冲液，9～11mM；GlutaMAX，1x；B27，1x；Primocin，0.09～0.11mg/ml；NAC，0.9～1.1mM；EGF，40～60ng/ml；Y27632，9～11μM；A83-01，4～6μM；R-spondin，90～110ng/ml；Retinoic Acid，1～3μM；GDNF，90～110ng/ml；FGF20，90～110ng/ml；Forskolin，10uM；各成分在Advanced DMEM/F12中稀释。
第三方面，提供一种多囊肾病疾病模型的构建方法，所述方法包括：将第一方面体外培养方法构建的多囊肾的3D类器官重新消化为单细胞，采用上述多囊肾病疾病模型培养基进行培养。
优选的方案中，所述培养时间为7天。
根据本发明验证，上述培养方法得到的多囊肾病疾病模型能够很好的模拟真实多囊肾病中囊肿组织的生理活性，可作为疾病模型应用于药物筛选领域。在验证上述多囊肾病疾病模型作为药物筛选模型可行性的过程中，本发明还筛选到GSK2193874，对多囊肾组织具有显著的抑制活性，有望应用于多囊肾的临床治疗及相应的药物开发。
第四方面，提供GSK2193874在制备多囊肾病治疗药物中的应用。
以上一个或多个技术方案的有益效果是：
1、考虑到成体细胞的基因稳定性，本发明设计采用分化成熟的多囊肾囊壁组织分离细胞为对象，诱导培养多囊肾的3D类器官；现有研究中，以成体细胞作为培养对象的类器官培养技术较为空白，可借鉴的研究内容很少。发明人在多囊肾3D类器官培养中设计引入cAMP激动剂以提高囊壁组织单体细胞的活力，经筛选，Forskolin能够提高囊肿组织单体细胞的活力，能显著促进PKD多囊肾类器官消化成单细胞后的细胞协同生长，以进行药物筛选。
2、本发明还采用了一种多囊肾3D类器官的体外培养基(RGF培养基)及体外培养方法，该培养基为低生长因子型培养基，生长因子含量较少并且不含有血清，有效降低培养组织污染风险，提高类器官组织应用的稳定性和安全性。
3、本发明通过提取多囊肾患者囊壁组织进行基于成体组织的类器官培养，建立了首个患者来源、高度模拟成体发病过程的ADPKD肾脏类器官模型，为疾病发展和多囊肾药物筛选提供了可能，是国际首例基于多囊肾病人的肾脏成体组织来源的类器官模型。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例中PKD类器官培养基的活性成分筛选结果；
图1A为不同梯度浓度的cAMP激动剂培养后生成囊泡直径变化统计结果；
图1B为相同浓度的cAMP激动剂培养后生成囊泡直径变化统计结果；
图2为实施例中两例不同患者的多囊肾类器官培养产物的基因测序鉴定结果模式图；
图3为实施例中多囊肾类器官与正常肾脏类器官生长形态明场对比图；
图3A从左到右依次为正常肾脏类器官培养0-4天的效果图；
图3B从左到右依次为多囊肾类器官培养0-4天的效果图；
图4为实施例中培养产物与体内PKD组织的形态对比图；
图4A为此例多囊肾患者的核磁共振成像；
图4B为大体病理图；
图4C为HE染色图；
图4D为第二次传代后的多囊肾类器官微分干涉差显微镜下图；
图4E为第四次传代后的多囊肾类器官微分干涉差显微镜下图；
图4F为此多囊肾类器官HE染色图；
图5为培养产物透射电镜图；
图5A为PKD类器官透射电子显微镜代表性图像(Scale bars，1μm)；
图5B为PKD类器官透射电子显微镜代表性图像局部放大图；
图5C为UB类器官透射电子显微镜代表性图像(Scale bars，1μm)；
图5D为UB类器官透射电子显微镜代表性图像局部放大图；
N,nucleus细胞核；TJ,tight junction紧密连接；BB,brush border刷状缘；Mi,mitochondria线粒体；BM,basal membrane基底膜；ER,endoplasmic reticulum内质网；Ci,cilia纤毛；red arrows mark autophagosome红色箭头标记自噬体；
图6为本发明中成体组织来源PKD类器官与人PKD组织，小鼠PKD组织及胚胎和PKD细胞的Upset图；
图7为实施例中的药筛策略图；
图8为20种小分子作用于PKD类器官囊泡扩张的抑制效果图；
图9为GSK2193874对PKD类器官囊泡扩张的抑制效果图；
图9A为GSK2193874干预PKD类器官的光镜变化图；
图9B为GSK2193874对PKD类器官囊泡扩张抑制效果时间变化曲线。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
本实施例中提供一种用于多囊肾病类器官培养的RGF培养基及培养方法，从多囊肾病患者的离体组织中分离得到单细胞，采用RGF培养基进培养，所述RGF培养基成分如下：100units/ml Penicillin-100μg/ml Streptomycin Solution；HEPES缓冲液，10mM；GlutaMAX，1×；B27，1×；Primocin，0.1mg/ml；NAC，1mM；EGF，50ng/ml；Y27632，10μM；A83-01，5μM；R-spondin，100ng/ml；Retinoic Acid，2μM；GDNF，100ng/ml；FGF20，100ng/ml；各成分在Advanced DMEM/F12中稀释。
所述单细胞分离步骤如下：取ADPKD患者手术切除多囊肾囊壁组织置于60×16mm培养皿中，用经灭菌消毒后的手术剪尽量去掉多余的血管和结缔组织，用5ml DMEM/F12混合液洗涤三次，吸掉DMEM/F12混合液，剪碎组织，加入5ml DMEM/F12混合液、50ul透明质酸酶和50ul胶原酶Ⅳ，吹打混匀，置于37℃、5％CO2培养箱消化60min，每5-10min充分吹打一次消化物；加入5ml DMEM/F12混合液终止消化，用70um滤网将细胞过滤到50ml离心管中，离心(900r，4℃，5min)，去除上清，加入5ml红细胞裂解液，吹打混匀，置于37℃水浴锅破红10min，加入5ml DMEM/F12混合液终止红细胞裂解，吹打混匀，将细胞转移至15ml离心管，离心(900rpm，4℃，5min)，弃上清；加入3-4ml DMEM/F12混合液重悬细胞，吹打混匀，离心，弃上清，重复2-3次；将DMEM/F12混合液与Matrigel按1：3比例混合，重悬细胞沉淀，调整细胞浓度，吹打混匀，将细胞混合物以圆形胶滴样滴在细胞悬浮培养6孔板中，胶滴直径为4mm左右，胶滴之间间隔距离适当即可；将细胞孔板正置于37℃、5％ CO2培养箱中5min，倒置于37℃、5％ CO2培养箱中40min，每孔加入2ml的RGF培养基，置于37℃、5％ CO2培养箱中培养；每隔2-4天更换一次培养基。
为了验证上述培养方式获得产物能否模拟真实多囊肾类器官，本实施例针对上述培养产物进行了测序比对、形态比对。其中，测序比对结果如图2、图6所示，ADPKD主要是由于PKD1基因突变导致，通过对多囊肾类器官DNA测序，鉴定类器官中的突变。图2培养产物测序鉴定图表明两例多囊肾患者分别存在PKD1基因的1号外显子和PKD1基因18号外显子存在杂合点突变。图6中将正常肾脏组织、多囊肾组织和多囊肾类器官测序对比，通过RNA测序，表明多囊肾类器官在一定程度上较能模拟多囊肾组织，而与正常肾脏组织有差别。
在微分干涉差显微镜下可以看出，本实施例培养的多囊肾类器官有囊肿生成(图3)，培养产物的典型形态与多囊肾组织相似度较高(图4)。根据培养产物的透射电镜图(图5)，与正常肾脏UB类器官相比，PKD类器官显示出线粒体结构紊乱和自噬增加，同时通过Upset图(图6)对GEO数据库中的人PKD组织，小鼠PKD组织，本发明的成体来源的PKD类器官，IPS性质细胞来源PKD类器官等比较说明，本发明的成体来源的PKD类器官与人PKD组织最为近似，可作为人类PKD发病的可靠模型。
实施例2
本实施例设计将上述实施例1中培养得到的类器官组织用于药物筛选，为了获得一种生长状况更佳的药物模型，本实施例针对促进PKD类器官培养的活性成分进行筛选，由于cAMP激动剂能够促进PKD类器官的单细胞生长，本实施例中筛选了布环磷腺苷(Bucladesine)、Forskolin、8-溴-环腺苷酸(8-Br-cAMP)三种cAMP激动剂对培养效果进行测试。
首先将上述实施例1中培养得到的多囊肾类器官消化成单细胞后，分别向细胞培养环境添加不同浓度的上述激动剂，在cAMP激动剂中，各浓度下Forskolin和其他化合物对PKD类器官单细胞生长的作用效果如图1所示，与cAMP依赖性囊肿生成一致，在RGF培养基成分中添加cAMP激动剂促进了PKD类器官的单细胞生长，其中10uM Forskolin最有效。
基于上述研究结论，本实施例中，提供又一种PKD疾病模型培养基及培养方法，可作为基于PKD类器官的药筛策略(图7)，具体步骤如下：将实施例1中培养得到PKD类器官消化成单细胞后，重新接种到96孔板中，用RGF培养基+10uM Forskolin培养7天，充分促进囊泡扩张，模拟PKD疾病进展状态，然后实施药筛策略。通过将参与PKD发病机制相关通路及文献报道小分子药物进行汇总，制定了一个包含20种小分子的小规模小分子化合物库，应用到PKD类器官中进行药物筛选(图8)。
采用上述药物筛选方式，本实施例提供了GSK2193874作为多囊肾病抑制剂的应用。GSK2193874对PKD类器官的抑制效果如图9所示，可以看出，随着GSK2193874浓度的升高及培养时间的延长，PKD类器官囊泡直接出现了明显的缩小，一方面证实了将PKD类器官应用于药筛策略的可行性，还证实了GSK2193874对多囊肾病的抑制活性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种多囊肾3D类器官体外培养方法，其特征在于，包括如下步骤：将常染色体显性多囊肾病患者的肾脏病理囊壁组织分离为单体细胞，加入基质胶重悬，使单体细胞聚集成团进行培养，加入RGF培养基培养获得多囊肾3D类器官；所述RGF培养基的成分如下：90～110units/ml Penicillin-90～110μg/ml Streptomycin Solution；HEPES缓冲液，9～11mM；GlutaMAX，1x；B27，1x；Primocin，0.09～0.11mg/ml；NAC，0.9～1.1mM；EGF，40～60ng/ml；Y27632，9～11μM；A83-01，4～6μM；R-spondin，90～110ng/ml；Retinoic Acid，1～3μM；GDNF，90～110ng/ml；FGF20，90～110ng/ml；各成分在Advanced DMEM/F12中稀释。
2.如权利要求1所述多囊肾3D类器官体外培养方法，其特征在于，所述单体细胞的分离方式如下：将所述囊壁组织清理后剪碎，加入含有透明质酸酶和胶原酶Ⅳ的DMEM/F12混合液置于培养箱中消化一段时间，加入DMEM/F12混合液终止消化；向终止消化后的细胞加入红细胞裂解液，水浴破红加入DMEM/F12混合液终止红细胞裂解得到所述单体细胞。
3.如权利要求1所述多囊肾3D类器官体外培养方法，其特征在于，所述单体细胞加入基质胶重悬后以胶滴接种于培养板中，所述接种胶滴的直径为3～5mm，接种后的培养板依次正置、倒置培养一段时间，使接种细胞更接近球体；向倒置培养完成后的培养板中加入上述RGF培养基，置于CO2培养箱中培养，每隔2～4天更换培养基。
4.Forskolin在多囊肾病疾病模型培养中的应用。
5.如权利要求4所述Forskolin在多囊肾病疾病模型培养中的应用，其特征在于，所述应用至少包括以下方式：
(1)将Forskolin用于制备多囊肾病疾病模型培养基；
(2)将Forskolin用于多囊肾3D类器官的体外培养，获得多囊肾病疾病模型。
6.如权利要求5所述Forskolin在多囊肾病疾病模型培养中的应用，其特征在于，(1)方面所称的培养基，包括权利要求1所述的RGF培养基，还包括Forskolin。
7.如权利要求6所述Forskolin在多囊肾病疾病模型培养中的应用，其特征在于，所述培养基的成分如下：90～110units/ml Penicillin-90～110μg/ml StreptomycinSolution；HEPES缓冲液，9～11mM；GlutaMAX，1x；B27，1x；Primocin，0.09～0.11mg/ml；NAC，0.9～1.1mM；EGF，40～60ng/ml；Y27632，9～11μM；A83-01，4～6μM；R-spondin，90～110ng/ml；Retinoic Acid，1～3μM；GDNF，90～110ng/ml；FGF20，90～110ng/ml；Forskolin，10uM；各成分在Advanced DMEM/F12中稀释。
8.一种多囊肾病疾病模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1-3任一项所述体外培养方法构建的多囊肾的3D类器官重新消化为单细胞，采用权利要求6或7中所述的培养基进行培养。
9.如权利要求8所述多囊肾病疾病模型的构建方法，其特征在于，所述培养时间为7天。
10.GSK2193874在制备多囊肾病治疗药物中的潜在应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310630098.8A CN116814528A (zh) | 2023-05-29 | 2023-05-29 | 一种培养基及多囊肾类器官培养方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310630098.8A CN116814528A (zh) | 2023-05-29 | 2023-05-29 | 一种培养基及多囊肾类器官培养方法与应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116814528A true CN116814528A (zh) | 2023-09-29 |
Family
ID=88119458
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310630098.8A Pending CN116814528A (zh) | 2023-05-29 | 2023-05-29 | 一种培养基及多囊肾类器官培养方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116814528A (zh) |
-
2023
- 2023-05-29 CN CN202310630098.8A patent/CN116814528A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ishikawa et al. | Formation of arrowhead complexes with heavy meromyosin in a variety of cell types | |
| US5753505A (en) | Neuronal progenitor cells and uses thereof | |
| CN104212760B (zh) | 肌肉干细胞体外培养方法及其应用 | |
| CN108883137A (zh) | 神经类器官组合物及使用方法 | |
| US20050014255A1 (en) | Stem cells for clinical and commercial uses | |
| US20230212525A1 (en) | Cardiac organoid, manufacturing method therefor, and method for evaluating drug toxicity by using same | |
| Guo et al. | In chronic hypoxia, glucose availability and hypoxic severity dictate the balance between HIF‐1 and HIF‐2 in astrocytes | |
| CN115011560A (zh) | 一种脑胶质瘤类器官、培养基及培养方法 | |
| Pereiro et al. | Effects of adult Müller cells and their conditioned media on the survival of stem cell-derived retinal ganglion cells | |
| US20200188402A1 (en) | Compounds and methods for treatment of diamond blackfan anemia | |
| Kelly et al. | Striatal graft projections are influenced by donor cell type and not the immunogenic background | |
| Liu et al. | Zishen Huoxue recipe protecting mitochondrial function of hypoxic/reoxygenated myocardial cells through mTORC1 signaling pathway | |
| CN112410301A (zh) | 一种体外构建的精准预测卵巢癌患者用药的方法 | |
| BR112019009995A2 (pt) | método para induzir a diferenciação de célula tronco em hepatócito, célula, composição, método para tratar um distúrbio, doença, ou malformação, método para produzir hepatócitos diferenciados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas e método para produzir células endodermas a partir de células-tronco pluripotentes induzidas | |
| CN116814528A (zh) | 一种培养基及多囊肾类器官培养方法与应用 | |
| Gradišnik et al. | Neurosurgical approaches to brain tissue harvesting for the establishment of cell cultures in neural experimental cell models | |
| CN114958756B (zh) | 一种用于前列腺癌类器官培养的培养液及其制备方法 | |
| Thonabulsombat et al. | Implanted embryonic sensory neurons project axons toward adult auditory brainstem neurons in roller drum and Stoppini co-cultures | |
| CN106148284A (zh) | 小分子定向组织和器官再生的多能人类干细胞技术、方法和产品 | |
| Silberberg et al. | Studies of aging in cultured nervous system tissue | |
| Nandy et al. | Effects of dihydroergotoxine mesylate on aging neurons in vitro | |
| CN110478374B (zh) | 海参磷脂在制备神经元细胞保护药物中的应用 | |
| CN112410286B (zh) | 一种利用诱导多能干细胞构建妊娠期致流产药物筛查模型的方法及应用 | |
| BR112019009997A2 (pt) | método para induzir diferenciação de células-tronco em células betas pancreáticas secretoras de insulina sensíveis a glicose, célula, composição para tratar a doença, distúrbio ou malformação, método para tratar doença, distúrbio, ou malformação e método para produzir as células betas pancreáticas secretoras de insulina sensíveis à glicose induzidas | |
| WO2024155068A1 (ko) | 육종 튜머로이드 제조 방법 및 그의 용도 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |