CN115624553A - 氨茶碱在制备激活原始卵泡的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了氨茶碱在制备激活原始卵泡的药物中的应用，属于生物技术领域。本发明发现氨茶碱可促进原始卵泡激活，可作为治疗原发性卵巢功能不全患者的药物，具有良好的应用前景。

Description

氨茶碱在制备激活原始卵泡的药物中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及氨茶碱在制备激活原始卵泡的药物中的应用。
背景技术
女性卵巢内具有数量确定且不可再生的原始卵泡，其随着年龄的增长逐渐消耗，直到最后耗竭。抗癌药物、环境污染等对卵巢的影响很容易导致女性生育力下降。尽管辅助生殖技术得到了广泛的应用，但是由于对生殖生理机制的不完全明确，人类依然承受着众多的生殖障碍与疾病的困扰。其中，原发性卵巢功能不全(POI)是影响女性生育能力和健康的最普遍的卵巢疾病，POI的形成与原始卵泡激活关系密切。开展人原始卵泡维持与激活的分子机制研究，阐明原始卵泡激活及卵泡发育的分子机制是对于这些卵巢疾病的诊断和治疗至关重要的。
原始卵泡库在出生前后建立产生。原始卵泡形成后，大部分的原始卵泡都保持着静止状态，只有少部分原始卵泡被周期性招募进入生长卵泡阶段，最终发育成熟和排卵。原始卵泡的前颗粒细胞收到信号，哺乳动物雷帕霉素靶点1(mTORC1)信号通路被激活，促进颗粒细胞蛋白质翻译，KIT配体(KITL)表达分泌。KITL与卵母细胞表面的KIT相结合，卵母细胞内的磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)信号通路被激活，因磷酸化而活化的蛋白激酶B(AKT)磷酸化叉头基因盒子O3alpha(FOXO3a)，导致其出核，卵母细胞活化。肿瘤抑制基因结节性硬化复合物1(TSC1)和肿瘤抑制基因结节性硬化复合物2(TSC2)组成的异二聚体可以负调控mTORC1的活化，人第10号染色体缺失的磷酸酶基因(PTEN)可以将磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸酯(PIP3)去磷酸化为磷脂酰肌醇-4,5-双磷酸酯(PIP2)负调控PI3K信号通路。在小鼠中，颗粒细胞特异性敲除Tsc1和卵母细胞特异性敲除Pten都会导致原始卵泡过度激活，而抑制颗粒细胞mTORC1信号通路和卵母细胞PI3K信号通路会抑制原始卵泡的激活。而原始卵泡不激活就会导致POI。目前采用治疗这种POI的方法主要依靠捐赠卵母细胞或者原始卵泡体外激活后手术移植。这些方法受到很多限制，例如需要进行手术，且成功率低。目前还没有通过口服药物促进原始卵泡激活而恢复POI患者的生育力的治疗方案。
氨茶碱(化学式C16H24N10O4，CAS登录号：317-34-0)为茶碱与二乙胺复盐，其药理作用主要来自茶碱，乙二胺使其水溶性增强。其主要作用有：①松弛支气管平滑肌，也能松弛肠道、胆道等多种平滑肌，对支气管粘膜的充血、水肿也有缓解作用。②增加心排出量，扩张输出和输入肾小动脉，增加肾小球滤过率和肾血流量，抑制远端肾小管重吸收钠和氯离子。③增加离体骨骼肌的收缩力；在慢性阻塞性肺疾患情况下，改善肌收缩力。茶碱增加缺氧时通气功能不全被认为是因为它增加膈肌的收缩，而它在这一方面的作用超过呼吸中枢的作用结果。其中氨茶碱药物对支气管平滑肌的松弛作用是最强的，可使支气管扩张，肺活量增加，作用较为持久，尤其是对痉挛状态的支气管效果显著，另外氨茶碱还有扩张冠状动脉，增加心肌供血，加强心脏收缩力的作用。多用于马牛的肺气肿，以及犬因心力衰竭而引起的肺充血(心性喘息)的平喘。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供氨茶碱在制备激活原始卵泡的药物中的应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
氨茶碱在制备治疗原发性卵巢功能不全的药物中的应用。
进一步地，所述的应用为氨茶碱在制备激活原始卵泡的药物中的应用。
进一步地，所述的应用中，氨茶碱的剂量按个体体重计算，每50kg体重施用氨茶碱10mg～1000mg/天。
进一步地，所述的原始卵泡为哺乳动物的原始卵泡。
进一步地，所述的哺乳动物为小鼠或人。
进一步地，所述的药物的给药方式为口服或者静脉注射给药。
与现有技术相比，本发明具有如下优点及有益效果：
POI是临床上比较严重的卵巢疾病，该病呈现年轻化的趋势，发病率不断提高，严重影响女性生育能力和身体健康。为了确保雌性哺乳动物(包括人)在整个生育周期中有成熟卵子可用，其原始卵泡库中的原始卵泡激活必须受到精密的调控。POI患者体内往往残留有少量的原始卵泡，但是不能在生理情况下被激活。在本研究中我们发现哮喘药物氨茶碱具有促进新生小鼠卵巢原始卵泡激活的作用，加药处理组生长卵泡的数量显著上升。氨茶碱作为一种临床应用历史悠久的药物，可以用于口服，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为2dpp新生小鼠卵巢添加本发明氨茶碱培养4天的形态观察和卵泡计数结果图；其中，(A)为对照组和添加氨茶碱组之间的形态学比较；(B)为生长卵泡统计计数；(C)为原始卵泡统计计数；(D)为总卵泡统计计数(标尺：50μm)。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
1.1体外培养相关试剂配置
1.1.1药物溶液配置
每毫升DMSO中加入21.213mg氨茶碱配置成50mM氨茶碱溶液，待固体完全溶解之后，0.22μm滤器过滤，在超净台中操作，用封口膜封口并置于-20℃保存。
1.1.2DMEM/F12培养基(250ml)配置，如表1所示：
表1 DMEM-F12培养基
Figure BDA0003904098040000031
注:SP为买的商品化的青霉素和链霉素的双抗，添加到培养基用量为每100μL添加100mL培养基中。定容至250mL之后用0.22μm滤器过滤，在超净台中操作，用封口膜封口并在4℃保存。
1.1.3磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffered solution，PBS，1L，pH：7.2)配制，如表2所示：
表2 PBS缓冲液
Figure BDA0003904098040000032
用去离子水定容至1L，高压灭菌，4℃保存。
1.2小鼠卵巢的分离和体外培养
1.2.1小鼠卵巢的分离
1)所有的手术器械，玻璃平皿等都进行灭菌处理，细胞间打开紫外灯照射半个小时灭菌。
2)本实验以2天大ICR雌鼠作为材料，用颈椎脱臼的方法处死小鼠解剖，将小鼠的头腹部和带有双侧肾的尾部分离，并把尾部放到冷的PBS里。
3)在体视显微镜操作，把小鼠卵巢和卵巢膜一起取出，并用注射针把卵巢周围包裹的膜分离。
1.2.2小鼠卵巢的体外培养
1)在六孔板每个孔中加入3mL DMEM/F12培养基，再加入3μL提前配置好的药物溶液(此时培养基药物浓度比配置的药物溶液药物浓度小1000倍)，吹打混匀，每个孔上放入0.44μm培养膜，放在二氧化碳培养箱37℃孵育30分钟。
2)将分离好的卵巢放到培养膜上，置于37℃恒温二氧化碳培养箱中培养；
3)每两天换一次液，共培养4天。
1.2.3卵巢包埋、切片与苏木精染色
1)样品的固定：培养4天的小鼠卵巢在4％的多聚甲醛中4℃固定12-16小时；
2)酒精浓度梯度脱水和透明：70％酒精，80％酒精，95％酒精/伊红染液，95％酒精，无水酒精，无水乙醇/二甲苯(体积1：1)，二甲苯，每个梯度5分钟，最后的二甲苯用滤纸吸干。
3)浸蜡和包埋：将卵巢在隔绝水(封口膜)的60℃环境中浸蜡2小时后转移到石蜡盒中。
4)组织切片：切片一般厚度为5μm。
5)展片：蜡带在42℃水浴锅充分的伸展后用载玻片捞起。
6)烤片：42℃过夜。
1.2.4苏木精染色
1)脱蜡复水：将切好的片子依次经过二甲苯，二甲苯，无水酒精，无水酒精，95％酒精，80％酒精，70％酒精。每个梯度各5分钟，最后用去离子水冲洗。
2)染色：用苏木精染料染1分钟左右，用水冲洗。
3)脱水封片：依次经过70％酒精，80％酒精，95％酒精，无水酒精，无水酒精，二甲苯，二甲苯，每个梯度各3分钟，最后用中性树脂封片。
1.3卵巢卵泡计数
对染色的连续切片进行计数，每连续5张切片取一张进行计数，最终的统计结果是将计数结果相加后乘以5。根据卵泡的形态学特点可以区分为：原始卵泡：周围三到五个扁平的颗粒细胞和中间的一个卵母细胞；激活卵泡：周围一层立方状的颗粒细胞或者周围立方状的和扁平状混合的一层颗粒细胞和中间一个长大的卵母细胞。
1.4卵巢卵泡计数结果
结果如图1所示，其中：(A)为对照组和添加氨茶碱组之间的形态学比较。黑色箭头指向为激活的生长卵泡，标尺：50μm。(B)为生长卵泡统计计数。与对照组相比，50μM氨茶碱组可以极显著促进原始卵泡的激活(P<0.01)；(C)为原始卵泡统计计数。氨茶碱组和对照组原始卵泡数目没有显著差异；(D)为总卵泡统计计数。各实验组与对照组之间没有明显差异。
本发明对2dpp新生小鼠卵巢添加氨茶碱或不添加药物培养4天，观察其卵巢结构。连续切片统计分析表明，与对照组相比(388.3.1±27.5，数据表示每个卵巢中的原始卵泡激活数量)，50μM氨茶碱(636.7±20.2)可以显著促进原始卵泡的激活(P<0.01)。因氨茶碱的作用，生长卵泡的增多导致原始卵泡数目稍微下降但并不显著(P>0.05)，且小鼠卵巢总卵泡数没有影响，说明氨茶碱对原始卵泡的形成以及卵泡凋亡不产生影响。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.氨茶碱在制备治疗原发性卵巢功能不全的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述的应用为氨茶碱在制备激活原始卵泡的药物中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
在所述的应用中，氨茶碱的剂量按个体体重计算，每50kg体重施用氨茶碱10mg～1000mg/天。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
所述的原始卵泡为哺乳动物的原始卵泡。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
所述的哺乳动物为小鼠或人。
6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
所述的药物的给药方式为口服或静脉注射给药。
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