TWI837722B - 肺類器官的製造方法 - Google Patents
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Abstract
一種肺類器官的製造方法，透過刮下之該前部前腸內胚層細胞密度，調控肺類器官形成的大小及是否形成囊泡，達到最佳化的肺類器官製造效果，同時利用特殊的溫敏型培養基質凝膠，於不同溫度下的流體固體(凝膠態)之轉換，可達到調控該前部前腸內胚層細胞密度效果，同時該溫敏型培養基質凝膠具有良好的機械性質可提供肺類器官生長與形成囊泡的效果。
Description
一種類器官的製造方法，特別是一種肺類器官與調控其生成囊泡大小的方法。
肺臟為呼吸系統中的重要器官，使人體可透過不同肌肉協調作用下將細胞型呼吸作用所需之氧氣由支氣管，傳導至位於支氣管末梢且數以億計之肺泡內，隨即透過擴散方式使氧氣可進入循環系統；而體內代謝所產生之二也化碳也得以從血液中排除。隨近年文明與科技的進步迅速，伴隨所產生空氣污染問題、現代人生活習慣改變、與呼吸道傳染疾病盛行等因素，使得肺癌、肺炎、與慢性呼吸道疾病等發病機率高，儘管目前可仰賴藥物控制症狀與病程演進，患者於治療過程中必須接受嚴謹的醫療照護且死亡率仍舊偏高，使得肺部相關疾病目前依舊被認列為十大死因之一。肺臟功能性主要仰賴器官內複雜的細胞與細胞外基質所建構之精細結構所決定，且肺臟內具修復能力之前驅細胞含量有限，使其因疾病或損傷導致功能性受損後難以復原，且於器官內所形成之損害更可能進一步影響臟內細胞生長、特化、與細胞外基質重塑平衡，導致異常細胞分化與基質沈積並對於肺臟功能造成永久性損害。因此，透過細胞治療用以促進與調節肺組織再生已被認為是理想的醫療策略。然而，因肺臟內細胞類型多元且修復機制複雜，僅以單一種類細胞進行細胞治療難以供應適當療效，且常用之平面細胞培養技術也可能使得細胞於體外培養過程中失去效
用。因此，開發適當細胞培養技術用以提升細胞治療效用為此類型治療策略重點發展方向。
細胞培養技術是由一個或少量細胞經過大量培養成為簡單的單細胞或極少分化的多細胞的技術。細胞在體內環境中，由機體體液循環系統供給生存複製的能量和原料，當進行體外培養的時候，往往需要根據不同的細胞的生長特點配製具有針對性的營養基質。基於此基礎培養技術下，類器官(Organoids)的三維培養技術作為近來組織工程與再生醫學研究的新手段，體外三維培養技術下，在體外培養人的組織細胞，形成保留原器官組織結構和生物資訊的「微組織」。這種三維體外培養系統與傳統二維培養皿比較，可類比患者體內的組織或微環境相似，細胞形成類似器官的組織結構，很好地保留了細胞與細胞、細胞與細胞外基質之間的作用情況。該原代細胞培養的突破性技術，使得原代細胞可以高效率的形成模型。類器官技術也推動了精准醫療與再生醫學的發展。
現有技術中對於肺組織細胞的主要還是停留在普通二維培養技術，在二維培養過程中肺組織細胞難以或不能充分的表達出肺組織的特性，使得培養的肺組織細胞和活體的肺組織細胞有所差異，不利於研究的進行。而在3D培養中，缺少必要的適宜培養基情況下，肺組織細胞的培養分化同樣不利，難以充分類比出體內的肺組織結構的生理特性。
雖然多種組織在不同的培養條件下可在體外成功培養類器官，但目前暫無關於肺組織及肺癌組織類器官培養方法的研究及報導，尤其是具體的培養條件與培養基質配方尚無嘗試及相關研究。
為了改善目前類器官培養技術中缺乏對肺組織細胞的研究與發展，本發明提供一種肺類器官的製造方法，其步驟包含：將一誘導性多能幹細胞以一培養容器進行培養，並使該誘導性多能幹細胞分化為一定型內胚層，該培養容器中盛裝有適合該誘導性多能幹細胞生長與分化的一培養基質；該定型內胚層分化為一前部前腸內胚層，並培養該前部前腸內胚層使其逐漸分布於該培養容器的該培養基質上；以及將該培養基質上的該前部前腸內胚層細胞刮下，轉入另一培養容器培養形成一肺類器官。
進一步地，本發明也提供另一種較佳的肺類器官的製造方法，其步驟包含：將一誘導性多能幹細胞以一培養容器進行培養，並使該誘導性多能幹細胞分化為一定型內胚層，該培養容器中盛裝有適合該誘導性多能幹細胞生長與分化的一培養基質；該定型內胚層分化為一前部前腸內胚層，並培養該前部前腸內胚層使其逐漸分布於該培養容器的該培養基質上；於乾淨的該培養容器鋪設一模板，該模板具有一模板片與設置於該模板片上的數個模板孔；將一具有溫敏性的培養基質設置於該培養容器表面對應該數個模板孔位置；將該前部前腸內胚層細胞培養於對應該數個模板孔位置的該具有溫敏性的培養基質，使其分化並分布於該具有溫敏性的培養基質表面；
降低溫度使該具有溫敏性的培養基質液化，並均勻分布於該培養容器盤底，使分化的該前部前腸內胚層細胞懸浮於該具有溫敏性的培養基質表面並生長為該肺類器官。
進一步地，該具有溫敏性的培養基質於正常細胞培養溫度下呈現固體或凝膠體的狀態，而當溫度降低至0~5℃範圍時液態化具有流動性。
進一步地，該模板孔以6個長方形孔洞以2*3陣列方式排列於該模板片上。
其中，該具有溫敏性的培養基質包含層連結蛋白7.27g、膠原蛋白I型9.99g、膠原蛋白II型5.45g、膠原蛋白IV型11.81g、糖胺聚糖14.54g、成纖維細胞生長因子9.99g、乙型轉化生長因子10.90g、纖連蛋白12.72g、硫酸肝素蛋白多醣11.81g以及血管內皮生長因子1.81g。
藉由上述說明可知，本發明具有以下有益功效與優點：
1.本發明所提供的肺類器官製造方法中，可透過刮下之該前部前腸內胚層細胞密度，調控肺類器官形成的大小及是否形成囊泡，達到最佳化的肺類器官製造效果。
2.本發明利用特殊的溫敏型培養基質凝膠，於不同溫度下的流體固體(凝膠態)之轉換，可達到調控該前部前腸內胚層細胞密度效果，同時該溫敏型培養基質凝膠具有良好的機械性質可提供肺類器官生長與形成囊泡的效果。
10:誘導性多能幹細胞
11:定型內胚層
12:前部前腸內胚層
13:肺類器官
20、20’:培養容器
21、21’:培養基質
30:模板
31:模板片
32:模板孔
為了更清楚地說明本發明實施例的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單的介紹。顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些示例或實施例，對於本領域的普通技術人員來講，在不付出進步
性勞動的前提下，還可以根據這些附圖將本發明應用於其它類似情景。除非從語言環境中顯而易見或另做說明，圖中相同標號代表相同結構或操作。其中：圖1為本發明肺類器官的製造方法第一較佳實施例流程圖。
圖2為本發明肺類器官的製造方法第二較佳實施例流程示意圖。
圖3為本發明該溫敏型培養基質凝膠、對比例之各成分與比例長條圖。
圖4為本發明該溫敏型培養基質凝膠在不同溫度下(4℃與37℃)的基質染色與外觀表現。
圖5為本發明該溫敏型培養基質凝膠在37℃時的應力應變曲線。
圖6為本發明該溫敏型培養基質凝膠在不同溫度下(4℃與37℃)的黏彈性表現。
圖7為本發明該溫敏型培養基質凝膠(上半部)與對比例(下半部)進行肺類器官囊泡形成的結果。
圖8、9為對比例與本發明該溫敏型培養基質凝膠所培養的肺類器官與形成之囊泡螢光染色圖。
圖10為本發明以本發明的肺類器官(Organoids)、間葉幹細胞(MSC)與磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)進行實驗鼠肺纖維化治療切片結果。
圖11是低密度及高密度前部前腸內胚層所形成不同肺類器官與囊泡的結果。
圖12是數個不同密度前部前腸內胚層所形成不同肺類器官與囊泡的結果。
圖13為不同大小肺類器官囊泡的免疫螢光染色結果。
圖14為本發明所生產的肺類器官培養1、3、5及7天之血管內皮生長因子的表現量分析。
圖15為氣道上皮細胞及人肺成纖維細胞經巴拉刈試劑處理後，分別加入LO-Less、LO-more、iPSC及MSC處理之α-SMA表現量分析。
圖16為氣道上皮細胞經巴拉刈試劑處理後，分別加入LO-Less、LO-more、iPSC及MSC處理之Col-I免疫螢光影像分析。
本發明使用的“系統”、“裝置”、“單元”和/或“模組”是用於區分不同級別的不同組件、元件、部件、部分或裝配的一種方法。然而，如果其他詞語可實現相同的目的，則可通過其他表達來替換所述詞語。
如本發明中所示，除非上下文明確提示例外情形，“一”、“一個”、“一種”和/或“該”等詞並非特指單數，也可包括複數。一般說來，術語“包括”與“包含”僅提示包括已明確標識的步驟和元素，而這些步驟和元素不構成一個排它性的羅列，方法或者設備也可能包含其它的步驟或元素。
本發明中使用了流程圖用來說明根據本發明的實施例的系統所執行的操作。應當理解的是，前面或後面操作不一定按照順序來精確地執行。相反，可以按照倒序或同時處理各個步驟。同時，也可以將其他操作添加到這些過程中，或從這些過程移除某一步或數步操作。
<肺類器官的製造方法第一較佳實施例>
請參考圖1，其為本發明肺類器官的製造方法第一較佳實施例流程圖，其步驟包含：步驟1)將一誘導性多能幹細胞10(Induced Pluripotent Stem Cell,iPSC)以一培養容器20進行培養，並使該誘導性多能幹細胞10分化為一定型內胚層11(Definitive Endoderm,DE)，該培養容器20中盛裝有適合該誘導性多能幹細胞10生長與分化的一培養基質21；步驟2)該定型內胚層11分化為一前部前腸內胚層12(Anterior Foregut Endoderm,AFE)，並培養該前部前腸內胚層12使其逐漸分布於該培養容器20的該培養基質21上；
步驟3)將該培養基質21上的該前部前腸內胚層12細胞刮下，轉入另一培養容器20’培養形成一肺類器官13。該培養容器20’較佳是一低貼附型的盤養盤，且其中同樣包含有適宜該前部前腸內胚層12生長轉化的一培養基質21’。
<肺類器官的製造方法第二較佳實施例>
進一步地，本發明的肺類器官的製造方法中，前述步驟3可透過調整該前部前腸內胚層12細胞密度，調控肺類器官形成的大小及是否形成囊泡。能否形成囊泡是形成有效肺類器官的關鍵，由於肺臟裡面的肺泡是個空腔，因此能形成空腔的肺類器官會近似肺泡的結構。請參考圖2，前述步驟3可透過刮下之該前部前腸內胚層12細胞密度，調控肺類器官形成的大小及是否形成囊泡的步驟包含：步驟3-1)於乾淨的該培養容器20’，較佳是該低貼附型的盤養盤，鋪設一模板30，該模板30如圖2所示具有一模板片31與設置於該模板片31上的數個模板孔32；步驟3-2)將該培養基質21’，較佳是一溫敏型培養基質凝膠塗敷於該模板30，使該培養基質21’僅設置於該培養容器20’表面對應該數個模板孔32位置；該溫敏型培養基質凝膠較佳是於正常細胞培養溫度下，例如室溫~人體體溫37℃呈現較為固體或凝膠體的狀態，而當溫度降低至0~5℃範圍時將液態化，具有流動性；該模板孔32於此實施例是以6個長方形孔洞以2*3陣列方式排列於該模板片31上；步驟3-3)將該前部前腸內胚層12細胞培養於對應該數個模板孔32位置的該培養基質21’，使其分化並分布於該培養基質21’表面；步驟3-4)降低溫度使該培養基質21’，即該溫敏型培養基質凝膠液化，並均勻分布於該培養容器20’盤底，使分化的該前部前腸內胚層12細胞懸浮於該培養基質21’表面並生長為該肺類器官13。
前述該模板片31上的數個模板孔32主要是可以用以調控該培養基質21’塗敷於該培養基質21’表面的表面積，繼而使該前部前腸內胚層12以預設的表面積進行生長分化，如此即可達到最佳化的該肺類器官13生長大小與是否形成肺囊泡的效果。
<溫敏型培養基質凝膠>
請參考圖3與以下表1，其為本發明該溫敏型培養基質凝膠各成分與比例，表1中所呈現各成分的比例單位可能是克(g)或也可呈現相對比例。
圖4為溫敏型培養基質凝膠在不同溫度下(4℃與37℃)的基質染色與外觀表現，可看出於低溫4℃時該溫敏型培養基質凝膠呈現較為流體液態狀態，溫度上升到37℃時則呈現較為固態的凝膠狀。
圖5為溫敏型培養基質凝膠在37℃時的應力應變曲線，顯示本發明所使用的溫敏型培養基質凝膠具有良好的機械強度，適宜細胞生長提供支撐支持的效果。
請參考圖6，其為本發明所使用的溫敏型培養基質凝膠在不同溫度下(4℃與37℃)的黏彈性表現，可看出於低溫4℃時黏彈性下降，並隨溫度上升到37℃有顯著黏彈性。
圖7為以本發明溫敏型培養基質凝膠(上半部)與對比例(下半部)進行肺類器官囊泡形成的結果，圖12可看出本發明所提供的溫敏型培養基質凝膠具有較好的肺類器官囊泡形成效果。
圖8為本發明利用溫敏型培養基質凝膠所培養的肺類器官與囊泡形成的螢光染色圖，包含自圖8左起對細胞上的細胞角蛋白5(Cytokeratin 5,KRT5)、肌動蛋白絲(F-actin)、細胞核(Nuclei)以及最右列的各染色合併圖。其中本發明所形成的肺類器官與囊泡具有較多的細胞角蛋白5且細胞整體形狀完整體積較大。
圖9為本發明利用溫敏型培養基質凝膠所培養的肺類器官與囊泡的螢光染色圖，包含自圖9左起對細胞上的α-平滑肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、肌動蛋白絲(F-actin)、細胞核(Nuclei)以及最右列的各染色合併圖。其中本發明所形成的肺類器官與囊泡具有較多的α-平滑肌動蛋白且細胞整體形狀完整體積較大。
圖10為本發明將實驗鼠利用百草枯(Paraquat)致肺纖維化後，將實驗鼠開肺並施以本發明的肺類器官(圖10中Organoids)、間葉幹細胞(MSC)與磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)進行治療，並與未肺纖維化的正常實驗鼠肺細胞(圖10中Sham組別)進行比對，自蘇木素-伊紅染色法(HE,H&E染色，Hematoxylin and eosin stain,H&E stain)、馬森三色染色法(MT,Masson's trichrome stain)、天狼星紅染色(PSR,Picro-Sirius Red Stain)的肺部切片來看，本發明的治療效果趨近於肺部未纖維化的較為空洞(充滿氣體)的狀態，但以MSC與PBS處理的組別則維持肺部纖維化的緻密結構狀態。
<肺類器官生長確效性測試>
請參考圖11，透過前述肺類器官的製造方法第二實施例進行該前部前腸內胚層12細胞密度調控，其產生之肺類器官的結果。其中，圖11中上半部分為低密度該前部前腸內胚層12分別於第23天、第25天與第29天的肺類器官生長結果。圖11下半部則為高密度該前部前腸內胚層12分別於第23天、第25天與第29天的肺類器官生長結果。可顯示高密度的前部前腸內胚層12可以具有較好的肺類器官生長與囊泡形成的效果。
請參考圖12，在1*105/well、5*105/well、1*106/well及3*106/well細胞密度下形成肺類器官之結果。同樣可以看出高密度的前部前腸內胚層12可以具有較好的肺類器官生長與囊泡形成的效果。當細胞密度控制在1*106/well以上有80%的肺類器官可形成囊泡。若細胞密度低於1*105/well以下會生成10%以下有囊泡的肺類器官。
請參考圖13，從免疫螢光染色的結果可看出，尺寸較小的肺類器官(左起1及3)和尺寸較大的肺類器官(左起2及4)，以較大的肺類器官有較高的表面活性蛋白B(SFTPB)的表現量。此外，較大的肺類器官的上皮細胞黏附分子(EPCAM)、SOX-9轉錄因子(SR Y-Box Transcription Factor SOX-9)及甲狀腺轉錄因子(NKX2.1)皆有較高的表現量。
其中，前述的SFTPB是在肺表面活性物質中發現的必需脂質相關蛋白，若缺少SFTPB深呼吸後肺部將無法膨脹，SFTPB會重新排列肺內液體中的脂質分子，從而使肺中稱為肺泡的微小氣囊更容易膨脹。SOX-9轉錄因子在肺上皮中發揮多重作用，例如平衡增殖和分化與調節細胞外基質的功用。而甲狀腺轉錄因子在肺發生發育中具作用。此些分子皆是肺類器官具有高效能表現的指數之一。
透過本發明所提供的肺類器官製造方法所生產的肺類器官，如圖14顯示隨著天數增加，肺類器官之血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)表現量增加。
進一步地，如圖15所示，將透過將氣道上皮細胞(Airway epithelial cell,AE)及人肺成纖維細胞(Human Pulmonary Fibroblasts,HPF)經巴拉刈(Paraquat,PQ)試劑處理，以建立肺纖維化模型，再分別加入LO-Less、LO-more、iPSC及MSC處理後，可見加入較多LO可更多降低纖維化marker α-SMA的表現量。再者，如圖16所示，氣道上皮細胞經巴拉刈試劑處理後，分別加入LO-Less、LO-more、iPSC及MSC處理後，從Col-I免疫螢光影像可見LO-Less、LO-more、iPSC及MSC皆有抑制纖維化marker Col-I的效果。
以上一些實施例中使用了描述成分、屬性數量的數字，應當理解的是，此類用於實施例描述的數字，在一些示例中使用了修飾詞“大約”、“近似”或“大體上”來修飾。除非另外說明，“大約”、“近似”或“大體上”表明所述數字允許有±20%的變化。相應地，在一些實施例中，說明書和請求項中使用的數值參數均為近似值，該近似值根據個別實施例所需特點可以發生改變。在一些實施例中，數值參數應考慮規定的有效數位並採用一般位數保留的方法。儘管本發明一些實施例中用於確認其範圍廣度的數值域和參數為近似值，在具體實施例中，此類數值的設定在可行範圍內盡可能精確。
最後，應當理解的是，本發明中所述實施例僅用以說明本發明實施例的原則。其他的變形也可能屬本發明的範圍。因此，作為示例而非限制，本發明實施例的替代配置可視為與本發明的教導一致。相應地，本發明的實施例不僅限於本發明明確介紹和描述的實施例。
10 誘導性多能幹細胞
11 定型內胚層
12 前部前腸內胚層
13 肺類器官
20、20’培養容器
21、21’培養基質
Claims (2)
- 一種肺類器官的製造方法，其步驟包含：將一誘導性多能幹細胞以一培養容器進行培養，並使該誘導性多能幹細胞分化為一定型內胚層，該培養容器中盛裝有適合該誘導性多能幹細胞生長與分化的一培養基質；該定型內胚層分化為一前部前腸內胚層，並培養該前部前腸內胚層使其逐漸分布於該培養容器的該培養基質上；於乾淨的該培養容器鋪設一模板，該模板具有一模板片與設置於該模板片上的數個模板孔；將一具有溫敏性的培養基質設置於該培養容器表面對應該數個模板孔位置；該具有溫敏性的培養基質於正常細胞培養溫度下呈現固體或凝膠體的狀態，而當溫度降低至0~5℃範圍時液態化具有流動性，其包含層連結蛋白7.27g、膠原蛋白I型9.99g、膠原蛋白II型5.45g、膠原蛋白IV型11.81g、糖胺聚糖14.54g、成纖維細胞生長因子9.99g、乙型轉化生長因子10.90g、纖連蛋白12.72g、硫酸肝素蛋白多醣11.81g以及血管內皮生長因子1.81g；將該前部前腸內胚層細胞培養於對應該數個模板孔位置的該具有溫敏性的培養基質，使其分化並分布於該具有溫敏性的培養基質表面；降低溫度使該具有溫敏性的培養基質液化，並均勻分布於該培養容器盤底，使分化的該前部前腸內胚層細胞懸浮於該具有溫敏性的培養基質表面並生長為該肺類器官。
- 如請求項1所述的肺類器官的製造方法，其中：該模板孔以6個長方形孔洞以2*3陣列方式排列於該模板片上。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 期刊 Christina E Barkauskas et al, "Lung organoids: current uses and future promise", Development. 2017 Mar 15; 144(6): 986-997. * |
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