TWI820420B - 用於細胞或組織培養的支架，與其製備方法及於組織工程和再生醫學的應用 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種用於細胞或組織培養並具有階梯式微結構的支架，其包含多層結構，每一層皆具有多個通孔，且每層的通孔皆與其相鄰層上所相對應的通孔連通。本發明亦提供一種培養細胞和組織再生的方法。

Description

用於細胞或組織培養的支架，與其製備方法及於組織工程和再生醫學的應用
本發明係關於細胞培養領域；較特別地，係關於一種可用於細胞或組織培養且具有階梯狀之微結構的支架，及一種利用該支架以進行組織工程和再生的方法。
現代醫學中，如何使受損或失去的組織再生是實現全器官再生的關鍵步驟，即使已有外科技術，修復失能的組織仍然相當困難，在組織工程的發展中，由於缺少合適的生物支架或欠缺血管形成的幫助，內部物質的傳遞極受擴散性的影響，這也限制了大型或複雜的生物組織的建構。
於傳統製備細胞培養支架的方法中，較難控制支架的精細結構，導致其產生過多的孔隙，而使可供細胞附著的表面積不足。因此，隨著支架日漸普及的應用於組織工程中，對於可供缺損的組織再生用，且具有高細胞附著力與高介質擴散能力的支架的需求十分的高，儘管已採用不同天然或聚合材料來生產各式形狀之框架以模擬多孔結構，但可供細胞接種與附著的表面積不足以及介質擴散作用偏低，仍是一懸而未決的問題。
聚(癸二酸甘油酯) (Poly(glycerol sebacate)，PGS)是一種同時具有生物相容性與生物可降解特性的新型低成本彈性聚合物，其組成分(甘油和癸二酸)皆為哺乳動物的生理代謝物，且經FDA核准用於生物醫學的相關應用，然而，傳統的PGS製成過程需於高溫低壓的環境下完成，也因此相對地限制了其在組織工程中的應用。
因此，對於如何開發用於組織工程和再生醫學領域的改良支架，依然有一定的需求。
於一方面，本發明提供一種用於培養細胞的支架，其不僅可促進細胞接種效率和培養基的介質擴散能力，亦可促進其植入後的傷口組織整合，該支架由一可光固化的生物可降解聚合物製成，如聚(癸二酸甘油酯)丙烯酸(Poly(glycerol sebacate) acrylate，PGSA)，其為一種經丙烯酸修飾的聚癸二酸甘油酯(PGS)，可透過光固化的技術生產，以避免製備PGS時所需的高溫低壓環境等條件。
因此，本發明提供一種用於細胞或組織培養並具有階梯狀微結構的支架，其包含： 第一層，包含多個為正多邊形的第一通孔；與 第二層，包含多個為正多邊形的第二通孔； 其中該第一層係以交錯的順序堆疊於該第二層上，並與該第二層相連，其中之一個該第一通孔係與其相對應的一個該第二通孔連通，且每一個該第一通孔的中心係分別與其所對應之該第二通孔的頂點對齊。
於一實施例中，該第一通孔的尺寸與該第二通孔的尺寸基本上相同。
於一實施例中，該第一通孔的方位係與該第二通孔的方位不同。
於一實施例中，該正多邊形為三角形、正方形、五邊形、六邊形，較佳係為六邊形。
於一實施例中，每個該第一通孔與該第二通孔進一步包含一連接桿。
於一實施例中，該連接桿係設置於其中之一個該第一通孔與其中之一個該第二通孔中，且該用於細胞或組織培養的支架可進一步包含一用於連接該連接桿的中心桿。
於一實施例中，該第一通孔與該第二通孔為封閉的通孔。
於另一較佳實施例中，該第一通孔的邊為不連續的片段，且每個第一通孔係由共6個片段以彼此不相連的方式間接圍成。
於一實施例中，該第一層的每個連接桿係與兩個該片段連接。
於一實施例中，該第一通孔係由多個片段所圍成，且片段之間彼此不相連。
於一實施例中，兩個相鄰的片段之間形成一間隙。
於一實施例中，每個片段包含至少兩個彼此相交的部分。
於一實施例中，每個該第二通孔為封閉的通孔，且每個該第一通孔是一由多個非連續的片段所圍成的空間。
於一實施例中，該用於細胞培養與組織再生的支架可進一步包含多套的該第一層與該第二層之副本。
於一較佳實施例中，該用於細胞培養與組織再生的支架可進一步包含另兩套的該第一層與該第二層之副本，其分別為具有多個第三通孔的第三層、具有多個第四通孔的第四層、具有多個第五通孔的第五層與具有多個第六通孔的第六層；其中，該第三層與該第五層基本上與該第一層相同，而該第四層與該第六層基本上與該第二層相同。
於一實施例中，該第三層係以交錯的順序堆疊於該第四層上，並與該第四層相連，該第三層也以交錯的順序堆疊於該第二層下，並與該第二層相連，且該第五層係以交錯的順序堆疊於該第六層上，並與該第六層相連，該第五層也以交錯的順序堆疊於該第四層下，並與該第四層相連，以形成一種具有六層堆疊的螺旋階梯狀支架。
於一實施例中，該第一通孔、第三通孔、第五通孔的邊皆為不連續之片段，且每個該第一通孔、第三通孔、第五通孔皆係由六個片段以彼此不相連的方式間接圍成。
於一實施例中，該第一層、第三層、第五層的每個連接桿係與兩個該片段連接。
於一實施例中，該第一通孔、第三通孔、第五通孔皆係由多個片段所圍成，且片段之間彼此不相連。
於一實施例中，兩個相鄰的片段之間形成一間隙。
於一實施例中，每個片段包含至少兩個彼此相交的部分。
於一實施例中，每個該第二通孔、第四通孔、第六通孔皆為封閉的通孔，而每個該第一通孔、第三通孔、第五通孔皆為一由多個非連續的片段所圍成的空間。
於一實施例中，該用於細胞培養與組織再生的支架係由具生物相容性的材料所製成，較佳地為聚(癸二酸甘油酯)丙烯酸(Poly(glycerol sebacate) acrylate，PGSA)。
另一方面，本公開亦提供一種培養細胞或培養血管化組織的方法，其包含使用如上述的支架培養一細胞。
於一實施例中，該細胞為胚胎幹細胞(embryonic stem cell)或血管前驅細胞(vascular progenitor cell)。
本發明提供一種增強幹細胞分化的方法，其包含使用上述的支架培養一幹細胞。
於一實施例中，該幹細胞為胚胎幹細胞(embryonic stem cell)。
又另一方面，本公開提供一種增強血管細胞分化的方法，其包含使用上述的支架培養一血管細胞。
於一實施例中，該血管細胞為血管前驅細胞(vascular progenitor cell)。
於另一方面，本公開提供一種用於增強傷口中血管形成的方法，其包含： 使用上述的支架培養一血管細胞，以產生一預血管內皮化的移植用支架； 將該預血管內皮化的移植用支架植入傷口。
於一實施例中，該血管細胞為血管前驅細胞。
再另一方面，本發明提供一種增強細胞移植的方法，其包含使用上述的支架培養該細胞。
於一實施例中，該細胞為胚胎細胞或血管前驅細胞。
在以下篇幅中將詳述本公開。本公開的其他特徵、目的和優點詳見於實施方式與專利範圍中。
藉由參考本公開以下的各種實施例、範例、化學圖、表及其相關敘述，可更容易的理解本公開，請知悉，除非於專利範圍中另有明確說明，否則本公開中的內容不限定於特定的製備方法、載體或配方，或將本公開中的內容製成用於局部、口服或非消化道給藥的產品或組合物等特定模式，因為本領域具通常知識者應當清楚的理解此為可置換的，另外，本文中所用的術語僅用於描述特定實施例的目的，並非旨於限定。
如本公開中所使用的以下術語，除非另有說明，否則應具有以下含意：
通常，範圍於本文中常以“大約”一特定值與/或至“大約”另一特定值的方式表示，當本文中表達這樣的範圍時，即如實施例中包括從一特定值與/或至另一特定值的範圍。同樣的，當值以近似值表示時，如透過使用“約”描述，應被理解為該特定值可形成另一種實施方式。可進一步理解為每一種範圍的端點，兩者間相對於彼此皆為獨立且重要的。
請注意，於說明書和所附的專利範圍中，除非上下文中另有明確指出，否則所用的單數型式如“一”與“該 ”，皆包含其複數型式，因此，除非文中另有定義，否則單數術語應包含其複數，而複數術語應包含其單數。
如本文中所記載，專利範圍中的術語“或”係用於表示“與/或”，除非明確指出其替代方案或替代方案為互斥的。
如本文中所記載，術語“第一”、“第二”等係指不同的單元(如第一層、第二層)，於此所使用這些術語並不一定同樣意味其排序，例如一個單元或事件發生或先於另一個單元或事件，而僅是用以提供一種區分特定單元的機制。實施範例
實施 例 1 、用於細胞培養與組織再生之具有六邊形微結構的支架構造
為了促進細胞接種效率、培養基的擴散能力，以及其移植至傷口後的組織整合能力，本發明提供一種可用於再生受損組織且具有高細胞附著度、高培養基擴散能力的細胞培養用支架。根據本發明之公開內容，可提供一種包含多層結構的細胞培養、組織再生用支架，其中每一層皆具有多個通孔，且每一層的通孔與相鄰層的相應通孔相通，較具體的，本發明用於細胞培養與組織再生的支架包含： 第一層，包含多個為正多邊形的第一通孔；與 第二層，包含多個為正多邊形的第二通孔； 其中該第一層係以交錯的順序堆疊於該第二層上，並與該第二層相連，其中之一個該第一通孔係與其相對應的一個該第二通孔連通，且每一個該第一通孔的中心係分別與其所對應之該第二通孔的頂點對齊。
本發明所提供用於細胞培養與組織再生的支架，可提供培養需要附著的細胞所需的基質。為了擴增其培養能力，較優選的，可增加其表面積與體積的比率；於一方面，係減少第一通孔或第二通孔的大小。
本發明所提供用於細胞培養與組織再生的支架包含複數各層，此些層可相互連接或相互不連接，較優選的為相互連接。較優選的，每一層係與其相鄰之層連接。
雖然不受任何理論限制，但由於其中之一個第一通孔係與其中之一個其所對應的第二通孔連通，因此細胞培養用的培養基可於第一層與第二層間流通。
請參照圖1至圖3，該用於細胞培養與組織再生的支架包含一第一層11，其包含多個第一通孔111；與一第二層12，其包含多個第二通孔121，其中該第一層11係以交錯的順序堆疊於該第二層12上，並與該第二層12相連，且該第一通孔111的中心係分別與其所相對應的該第二通孔121的頂點對齊，其中之一的該第一通孔111係與其相對應的該第二通孔121連通。
較佳地，該第一通孔的大小與該第二通孔的大小基本上相同；該第一通孔或該第二通孔可為任意形狀，如三角形、正方形、五邊形、六邊形，較優選的為六邊形。另一方面，該第一通孔與該第二通孔的方位不同，其中該第一通孔的方位係較佳地相對於該第二通孔，順時鐘旋轉30°、60°、90°、120°、150°或180°，較優選的為120°。
請參照圖4至圖6，該用於細胞培養與組織再生的支架包含一連接桿212，該連接桿212係設置於其中之一個該第一通孔211與其中之一個該第二通孔221內。較優選的，該連接桿212係設置於整個的該第一通孔211與該第二通孔221內，且該支架可進一步包含一用於連接該連接桿的中心桿。
該第一通孔或該第二通孔可為封閉通孔或開放通孔，較優選的，該第一通孔或該第二通孔為封閉通孔；另一方面，該第一通孔為開放通孔，且該第二通孔為封閉通孔；於另一方面，該第一通孔為封閉通孔，且該第二通孔為開放通孔。雖然不受任何理論限制，開放的通孔可使細胞培養用的培養基於同一層的通孔之間流通。
實施例 2 、用於細胞培養和組織再生並具有六角階梯狀微結構的支架之構造
為了增加細胞接種的面積、物質傳遞與空間上的互聯性，本發明進一步提供一種包含6層結構的支架，其中該6層係由六邊形多孔通道以螺旋階梯式堆疊而成。
請參照圖7，該第一層31包含多個片段313，且每個該第一通孔311皆由6個該片段313以彼此不相連的方式間接圍而成，較優選的，該連接桿312係與兩個該片段313連接；其中之一個該第一通孔311係由多個片段313所圍成，且該多個片段313之間彼此不相連。於另一方面，兩個相鄰的片段之間形成一間隙315，每個片段313包含至少兩個彼此相交的部分，以限定該第一通孔311。
請參照圖8，該用於細胞培養與組織再生的支架包含一第一層41，其包含多個第一通孔411；一第二層42，其包含多個第二通孔421並相連於該第一層41；一第三層43，其包含多個第三通孔431；一第四層44，其包含多個第四通孔441；一第五層45，其包含多個第五通孔451；與一第六層46，其包含多個第六通孔461；其中，該第三層43係以交錯的順序堆疊與相連於該第四層44之上，且該第三層43也以交錯的順序相接於該第二層42之下，另，該第五層45亦以交錯的順序堆疊與相連於該第六層46之上，並同時以交錯的順序相接於該第四層44之下；其中，該第三層43、該第五層45與該第一層41基本相同，而該第四層44、該第六層46則與該第二層42基本相同，且其中之一的該第三通孔431係與其相對應的其中之一的該第二通孔421連通。於另一實施例中，其中之一的該第一通孔411則與其相對應之的其中之一的該第二通孔421、該第三通孔431、該第四通孔441、該第五通孔451與該第六通孔461。
較優選，該第一通孔411、該第三通孔431、該第五通孔451的配置與具有相同配置的該第二通孔421、該第四通孔441、該第六通孔461的配置不同；該第一通孔411、該第三通孔431、該第五通孔451的邊為不連續的片段，且每個該第一通孔411、該第三通孔431、該第五通孔451皆由6個片段以彼此不相連的方式間接圍成。另外，該第二通孔421、該第四通孔441、該第六通孔461則具有完整的邊。
請參照圖8，該第二通孔421、該第四通孔441、該第六通孔461為封閉的通孔，而該第一通孔411、該第三通孔431、該第五通孔451為由多個不連續的片段所圍成的空間。
較佳地，該用於細胞培養與組織再生的支架是由具生物相容性的材料所製成，更佳地為聚(癸二酸甘油酯)丙烯酸(Poly(glycerol sebacate) acrylate，PGSA)，PGSA的物理性質可透過調控聚(癸二酸甘油酯)(PGS)的丙烯酸酯化程度而改變，由於PGSA是一種可光固化和生物可降解的聚合物，因此可使用高解析度數位光處理器投影機(high-resolution digital photoprocessor projector)，將特定光源投射於PGSA材料上以固化各層，且各層可彼此堆疊而形成一三維結構，以便快速的定製生產各種尺寸的支架。
實施例 3 、評估胚胎幹細胞 (embryonic stem cell) 於不同基質上的分化情形
有鑑於細胞外基質在調節幹細胞的命運中扮演重要腳色，因此於本實施例係評估新型光固化與生物相容性之聚合材料PGSA對幹細胞分化的影響，將比較PGSA與各種材料對胚胎幹細胞(embryonic stem cells，ESCs)與血管前驅細胞(vascular progenitor cells，VPCs)分化的影響，並於培養基中去除白血病抑制因子(LIF)，來誘導自發性分化；一週後，再以RT2 Profiler PCR陣列分析其分化多能性(pluripotent)與早期分化標記基因表現。有趣的是，相比於明膠，PGSA上的胚胎幹細胞的內胚層標記(如GATA6與Sox17)、中胚層標記(如brachyury與Mixl1)、外胚層標記(FGF5)，皆呈現高度的表現量(圖9A)。為進一步驗證此現象，遂使用定量即時聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)，分析培養於PGSA或明膠上的胚胎幹細胞的分化多能性及三胚層標記表現量。結果顯示，與明膠上的胚胎幹細胞相比，PGSA上的胚胎幹細胞的多能性標記Oct4與Nanog顯著性的降低，而在自發性分化一週後，內胚層標記(如GATA4、GATA6與Sox17)、中胚層標記(如brachyury、Hand1、FoxA2)、外胚層標記(FGF5、Sox1)則呈現具有統計學意義的升高情形(圖9B)。
實施例 4 、比較血管前驅細胞 (vascular progenitor cell ，VPCs)於不同基質上的血管導向分化情形
血管前驅細胞(VPCs)是胚胎幹細胞分化成血管內皮細胞(endothelial cells，ECs)與血管平滑肌細胞(smooth muscle cells，SMCs)的中間細胞(intermediate cells)，先前的研究指出，可利用纖維接合素(fibronectin)與第四型膠原蛋白，來提供一個可支持血管內皮細胞維持或分化的環境。因此，本實例使用定量即時聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)，分析培養於纖維接合素、第四型膠原蛋白、PGSA上的血管前驅細胞，於早期的一週時間點(EC-1wk)時分化為血管內皮細胞的情形。結果顯示，所有組別的血管內皮細胞標記，如VE-cadherin、vWF、Flt1與PECAM-1，皆比未分化的血管前驅細胞高，尤其是PGSA組別的vWF、Flt1與PECAM-1表現量較纖維接合素、第四型膠原蛋白組別高(圖10A)。有趣的是，培養於PGSA上經4週血管內皮細胞誘導的期間，分化後細胞的型態已轉趨為管狀網絡，類似於血管網絡(圖10B)，表示培養於PGSA上可增加血管生成的潛力；另外，也以定量即時聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)分析比較，培養於PGSA、第四型膠原蛋白上之血管前驅細胞的長期血管內皮細胞分化情形，其中檢查了多種血管內皮細胞發育相關基因，如VE-cadherin、vWF、Flt1與PECAM-1，並發現於培養於PGSA上經4週血管內皮細胞誘導後，分化的血管前驅細胞的相關基因表現量顯著性的高於第四型膠原蛋白組別(圖10C)，類似的現象也見於培養於PGSA上的血管平滑肌細胞分化情形。可見，許多血管平滑肌細胞發育相關基因，例如SM α-actin、SM22α、鈣調節蛋白(calponin)、MRTF-A，其表現量皆顯著性地較第四型膠原蛋白組別高(圖10D)。上述的結果顯示，PGSA可促進胚胎幹細胞與血管前驅細胞的中胚層血管細胞分化。
實施例 5 、透過數位光處理積層製造系統 (Digital Light Processing-Additive Manufacturing System ， DLP-AM) 製備多個 PGSA 支架的三維結構
為了促進受損組織的再生，本實例遂利用DLP-AM製備具有六邊形空腔的支架。將六邊形的孔製成3種不同的尺寸，其每邊的長度分別為173、346、520 μm，且孔的高度統一為100 μm (圖11A)，隨著六邊形的邊的尺寸增加，結構的精準度與完整性也明顯的提升，因此也確立了當使用DLP-AM製備PGSA聚合物支架孔洞時，最好印製300 μm與以上的結構；接著，設計與印製六邊形的交錯孔，兩個相似的層以交錯的順序堆疊，形成類似於蜂窩的結構(圖11B)。為了在細胞培養的過程中，於保持培養基循環的同時兼顧提高細胞接種效率，於是設計了一種六邊形螺旋狀結構，共有六層的重複六邊形通孔，每層的中心有一根中心桿，藉由每根中心桿彼此垂直堆疊而成，且每層的中心桿皆逆時針旋轉30°，並可同時觀察到沿著中心桿外圍向下螺旋式旋轉的空心空間(圖11C)；雖然螺旋階梯式的結構可增加垂直方向的培養基循環，但同樣也需考量設計的通孔是否會因長時間培養，導致被細胞填滿，進而降低培養基循環效率，為此，進一步在此階梯式結構中增加了水平通道，以促進培養基的水平方向交換(圖11D)，螺旋階梯式結構與水平多通道，可有助於增加物質傳遞與空間互聯性。
使用所述的 PGSA 支架產生 預血管內皮化的移植用支架
考量三維支架中代謝物和營養物的滲透與細胞附著的功效，係使用SolidWords設計一種新穎的六邊形高通透性的階梯式結構，以生產三維的PGSA支架(圖12A)。為了證明此概念，採用DLP-AM結合PGSA製備可移植的組織支架，經三維列印後，可觀察到該新型的PGSA支架的巨觀和微觀結構(圖12B)。另外，為了長期培養，於血管內皮細胞分化過程中，使用transwell培養小室懸浮系統，於PGSA支架中填充血管前驅細胞，產生血管構建體(圖12C)。通過結合細胞面與支架面的策略，分化的血管內皮細胞與六邊形階梯式多通孔的三維印製支架的組合，可提供一種高通透性的預血管內皮化構建體。
比較不同結構的支架上的細胞接種和培養基擴散效率
於下表中列出了六種設計的有效表面積，此與支架上的細胞接種效率有直接關係。很明顯的，為了促進長期的細胞培養，並同時達到較高的細胞接種密度與保持高度的培養基擴散，扁平、六邊形階梯式、高通透性六邊形階梯式支架都是不錯的選擇，然而，顯然透過階梯式的三維結構，可觸發細胞的三維生長，也因此階梯式的三維結構為組織工程領域的首選(表1)。因此，新型的六邊形階梯式的微結構，可增加細胞接種的與材料接觸面積。 表1、不同結構的PGSA的細胞接種和培養基擴散效率
三維印製的支架的設計因素
設計 有效表面積 細胞接種效率 培養基擴散 細胞的 三 維生長
扁平 100% 高 中 +
六邊形孔 100% 高 低 +
六邊形交錯 38.42% 低 高 +
六邊形密封交錯 100% 中 低 ++
六邊形階梯式 73.73% 高 高 +++
高通透性六邊形階梯式 73.73% 高 高 +++
*: + 生物相容, ++ 生物相容與三維細胞生長, +++ 生物相容、三維細胞生長與長期細胞培養
預血管內皮化之移植用支架的體外與體內試驗
掃描式電子顯微鏡(scanning electron microscopy，SEM)照片證實，PGSA支架內有完整的高通透六邊形階梯式結構；細胞接種的實驗也證明，這種設計對三維結構內的細胞移植非常有效，並可促進長期懸浮培養所需的物質傳遞(圖13A)。H&E染色可顯示支架上的血管前驅細胞-血管內皮細胞的形態，並進一步進行組織化學染色，檢視於體外長期懸浮培養後的血管構建體中的血管內皮細胞標記：血小板與血管內皮細胞黏著分子1 (platelet and endothelial cell adhesion molecule 1，PECAM1)之表現量(圖13B)。裸鼠經皮下移植4週後，雷射散斑對比影像顯示移植部位的血液蓄積情形(圖13C)，為進一步證實此結果，採集移植部位的皮下組織進行驗證，透過檢視血管構建體的外觀與組織學分析，確認支架結構的移植痕跡，並且確認移植時有植入皮下組織區域，此外，亦可於血管構建體上發現PECAM1的表現(圖13D)，整體顯示出，其在體內可產生具有功能性血管內皮細胞的能力。
接著進一步使用對稱型的傷口癒合小鼠模型(symmetrical wound healing mouse model)進行移植，以驗證血管構建體的功能。在小鼠身上創造4個傷口後，分別以PBS處理(作為對照組)、或以僅移植支架、移植帶有血管前驅細胞-血管內皮細胞的圓盤(disc)、或移植帶有血管前驅細胞-血管內皮細胞的三維支架處理傷口10天，後續以雷射散斑對比影像分析。可觀察到，移植帶有血管前驅細胞-血管內皮細胞的支架的傷口處，有較高的血流強度(圖14A)，進行定量測量時，移植帶有血管前驅細胞-血管內皮細胞的傷口處的血流量平均值(blood flux mean)，也明顯優於其他組別(圖14B)；於移植血管構建體10天後，同樣採集移植部位進行驗證。透過組織化學染色，可見確實已將帶有血管前驅細胞-血管內皮細胞的支架移植至病變區域，且支架上的血管前驅細胞-血管內皮細胞具有生成功能性血管的能力，並且高度表現PECAM1(圖14C)。因此，該高通透性的預血管內皮化支架可應用於體外組織與器官工程所需的血管系統。
於本發明中，透過三維列印的技術發展新的三維血管結構，以提供一最適於氧氣與養分擴散的空間結構。如上述的結果所示，基於PGSA的三維列印可提供血管組織工程一種有潛力的技術。本發明使用具有生物相容性與生物可降解性的彈性體(elastomer)並以三維列印的方式，所快速製備的新型訂製之六邊旋轉階梯式支架，具有高表面積與高培養基擴散率。此種結合細胞的支架，在未來的組織模型(研究用途)與治療的應用(臨床用途)等方面，特別具有潛力。總而言之，本發明的支架將適用於多種組織工程領域。
本發明雖已藉由上面所闡述的特定實施例進行描述，但是對於本領域具通常知識者而言，許多替代方案及修改、變化都應屬於顯而易見的，因此，所有的替代方案、修改、變化都應被認定為落入本發明之申請專利的範圍內。
11:第一層 111:第一通孔 12:第二層 121:第二通孔 211:第一通孔 212:連接桿 221:第二通孔 31:第一層 311:第一通孔 312:連接桿 313:片段 315:間隙 41:第一層 411:第一通孔 42:第二層 421:第二通孔 43:第三層 431:第三通孔 44:第四層 441:第四通孔 45:第五層 451:第五通孔 46:第六層 461:第六通孔
圖1係顯示本發明之一實施例中用於細胞培養的支架的俯視圖。
圖2係顯示使用電子顯微鏡觀察本發明之一實施例中用於細胞培養的支架的視野。
圖3係顯示使用掃描電子顯微鏡觀察本發明之一實施例中用於細胞培養的支架的視野。
圖4係顯示本發明之一實施例中用於細胞培養的支架的三維示意圖。
圖5係顯示使用掃描電子顯微鏡觀察本發明之一實施例中用於細胞培養的支架的視野。
圖6係顯示使用掃描電子顯微鏡觀察本發明之另一實施例中用於細胞培養的支架的視野。
圖7係顯示本發明之一實施例中的一層的俯視圖。
圖8係顯示本發明之另一實施例中用於細胞培養的支架的三維示意圖。
圖9A-9B係顯示胚胎幹細胞(ESC)在不同基質上的自發性分化情形。圖9A為胚胎幹細胞於無白血病抑制因子(LIF)情況下培養於明膠與PGSA上一週後，以RT2 Profiler PCR陣列分析後的結果；圖9B為胚胎幹細胞於明膠或PGSA上自發性分化一週後，以特定胚層的標記進行定量即時聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)的分析。胚胎幹細胞的基因表現設為1，所有數值皆為三次試驗的平均值±標準差，*P ＜0.05。
圖10A-10D係顯示血管前驅細胞(VPC)在不同基質上的血管內皮細胞分化情形。圖10A為使用qRT-PCR測量血管內皮細胞分化一週後，於纖維接合素(fibronectin)、第四型膠原蛋白與PGSA上與血管內皮細胞相關的基因表現情形，不同字母的組別間具有顯著性差異，而相同字母的組別則無，*P ＜0.05，所有數值皆為三次試驗的平均值±標準差；圖10B為血管前驅細胞在PGSA基質上分化為血管內皮細胞的型態變化；圖10C為於第四型膠原蛋白與PGSA上誘導血管內皮細胞(EC)4週後，其基因轉錄水平之比較；圖10D為於第四型膠原蛋白與PGSA上誘導血管平滑肌細胞(SMC)2週後，其基因轉錄水平之比較；所有數值皆為三次試驗的平均值±標準差，*P ＜0.05。
圖11A-11D係顯示PGSA支架的不同設計。圖11A為六邊形邊框支架；圖11B為交錯的六邊形支架；圖11C為六邊形階梯式支架；圖11D為高通透性的六邊形階梯式支架。
圖12A-12C係顯示，如何使用血管前驅細胞與高通透性的六邊形階梯式支架來產生血管構建體(vascular construct)。圖12A為新型之六層的旋轉六邊形與高通透性的階梯式支架之設計；圖12B為三維列印的PGSA支架的巨觀與微觀結構；圖12C為於4週的血管內皮細胞誘導下，transwell培養小室中的血管構建體示意圖。
圖13A-13D係顯示血管構建體的體外與體內測試。圖13A為高通透性六邊形階梯式PGSA支架與血管構建體的掃描電子顯微鏡照片；圖13B為於血管內皮細胞分化4週後，血管前驅細胞的組織學染色與血管構建體中的PECAM1表現量；圖13C為血管構建體經皮下植入小鼠4週後的雷射散斑對比影像(laser speckle contrast image)；圖13D為透過PECAM1的免疫組織學染色與H&E化學染色技術，檢視經皮下移植4週後的血管構建體的型態與功能。
圖14A-14C係顯示將血管構建體植入傷口癒合中小鼠的移植情況。圖14A為背部受傷的小鼠經移植對照組(PBS)、PGSA支架、帶有血管前驅細胞-血管內皮細胞的PGSA圓盤或血管構建體後第10天的代表影像，與小鼠病變部位於移植PBS、PGSA支架、帶有血管前驅細胞-血管內皮細胞的PGSA圓盤或血管構建體後第10天的雷射散斑對比影像；圖14B為藉由雷射散斑對比影像測量移植10天後的血流量的定量結果，數據皆以平均值±標準差表示，黑色實線代表其平均值，P ＜0.05；圖14C為經PBS、PGSA支架、帶有血管前驅細胞-血管內皮細胞的PGSA圓盤或血管構建體治療10天後的傷口縱切切片，以PECAM1免疫組織化學染色辨別其血管內皮細胞(棕色)，下圖分別為其上圖的局部放大圖。
11:第一層
111:第一通孔
12:第二層
121:第二通孔

Claims (25)

  1. 一種用於細胞培養或組織工程並具有階梯式微結構的支架，其包含：一第一層，包含多個為正多邊形的第一通孔；與一第二層，包含多個為正多邊形的第二通孔；其中該第一層係以交錯的順序堆疊於該第二層上，並與該第二層相連，其中之一個該第一通孔係與其相對應的一個該第二通孔連通，且每一個該第一通孔的中心係分別與其所對應之該第二通孔的頂點對齊；其中至少兩個該第二通孔與其中之一的該第一通孔連通。
  2. 一種用於細胞培養或組織工程並具有階梯式微結構的支架，其包含：一第一層，包含多個為正多邊形的第一通孔；與一第二層，包含多個為正多邊形的第二通孔；其中該第一層係以交錯的順序堆疊於該第二層上，並與該第二層相連，其中之一個該第一通孔係與其相對應的一個該第二通孔連通，且每一個該第一通孔的中心係分別與其所對應之該第二通孔的頂點對齊；其中該第一通孔的尺寸與該第二通孔的尺寸相同。
  3. 一種用於細胞培養或組織工程並具有階梯式微結構的支架，其包含：一第一層，包含多個為正多邊形的第一通孔；與一第二層，包含多個為正多邊形的第二通孔； 其中該第一層係以交錯的順序堆疊於該第二層上，並與該第二層相連，其中之一個該第一通孔係與其相對應的一個該第二通孔連通，且每一個該第一通孔的中心係分別與其所對應之該第二通孔的頂點對齊；其中該第一通孔的方位係與該第二通孔的方位不同。
  4. 一種用於細胞培養或組織工程並具有階梯式微結構的支架，其包含：一第一層，包含多個為正多邊形的第一通孔；與一第二層，包含多個為正多邊形的第二通孔；其中該第一層係以交錯的順序堆疊於該第二層上，並與該第二層相連，其中之一個該第一通孔係與其相對應的一個該第二通孔連通，且每一個該第一通孔的中心係分別與其所對應之該第二通孔的頂點對齊；其中該第一通孔與該第二通孔為封閉的通孔。
  5. 一種用於細胞培養或組織工程並具有階梯式微結構的支架，其包含：一第一層，包含多個為正多邊形的第一通孔；與一第二層，包含多個為正多邊形的第二通孔；其中該第一層係以交錯的順序堆疊於該第二層上，並與該第二層相連，其中之一個該第一通孔係與其相對應的一個該第二通孔連通，且每一個該第一通孔的中心係分別與其所對應之該第二通孔的頂點對齊；其中每個該第一通孔與該第二通孔進一步包含一連接桿。
  6. 如請求項5所述的支架，其中該連接桿係設置於其中一個該第一通孔與其中一個該第二通孔內，且該用於細胞或組織培養的支架進一步包含一用於連接該連接桿的中心桿。
  7. 一種用於細胞培養或組織工程並具有階梯式微結構的支架，其包含：一第一層，包含多個為正多邊形的第一通孔；與一第二層，包含多個為正多邊形的第二通孔；其中該第一層係以交錯的順序堆疊於該第二層上，並與該第二層相連，其中之一個該第一通孔係與其相對應的一個該第二通孔連通，且每一個該第一通孔的中心係分別與其所對應之該第二通孔的頂點對齊；其中該第一通孔的邊為不連續的片段，且每個第一通孔係由共6個片段以彼此不相連的方式間接圍成。
  8. 如請求項7所述的支架，其中該第一層的每個連接桿係與兩個該片段連接。
  9. 如請求項7所述的支架，其中兩個相鄰的該片段之間形成一間隙。
  10. 如請求項7所述的支架，其中每個該片段包含至少兩個彼此相交的部分。
  11. 一種用於細胞培養或組織工程並具有階梯式微結構的支架，其包含：一第一層，包含多個為正多邊形的第一通孔；與一第二層，包含多個為正多邊形的第二通孔； 其中該第一層係以交錯的順序堆疊於該第二層上，並與該第二層相連，其中之一個該第一通孔係與其相對應的一個該第二通孔連通，且每一個該第一通孔的中心係分別與其所對應之該第二通孔的頂點對齊；其中該支架係由聚(癸二酸甘油酯)丙烯酸(Poly(glycerol sebacate)acrylate，PGSA)所製成。
  12. 如請求項7所述的支架，其中每個該第二通孔為封閉的通孔，且每個該第一通孔是一由多個非連續的片段所圍成的空間。
  13. 如請求項1-12其中之一所述的支架，其中該支架進一步包含多套的該第一層與該第二層之副本。
  14. 如請求項13所述的支架，其中的該多套的該第一層與該第二層之副本為兩套的該第一層與該第二層，其分別為一具有多個第三通孔的第三層、一具有多個第四通孔的第四層、一具有多個第五通孔的第五層與一具有多個第六通孔的第六層。
  15. 如請求項14所述的支架，其中該第三層與該第五層基本上為該第一層之副本，且該第四層與該第六層基本上為該第二層之副本。
  16. 如請求項14所述的支架，其中該第三層係以交錯的順序堆疊於該第四層上，並與該第四層相連，該第三層以交錯的順序堆疊於該第二層下，並與該第二層相連，且該第五層係以交錯的順序堆疊於該第六層上，並與該第六層相連，該第五層以交錯的順序堆疊於該第四層下，並與該第四層相連，以形成一種具有六層堆疊的螺旋階梯狀支架。
  17. 如請求項16所述的支架，其中每個該第二通孔、第四通孔、第六通孔皆為封閉的通孔，而每個該第一通孔、第三通孔、第五通孔皆為一由多個非連續的片段所圍成的空間。
  18. 一種培養一血管化組織的方法，其中包含使用如請求項1-12其中之一所述的支架培養一細胞。
  19. 如請求項18所述的方法，其中該細胞為胚胎幹細胞(embryonic stem cell)或血管前驅細胞(vascular progenitor cell)。
  20. 一種增強一幹細胞分化的方法，其中包含使用如請求項1-12其中之一所述的支架培養該幹細胞。
  21. 如請求項20所述的方法，其中該幹細胞為胚胎幹細胞(embryonic stem cell)。
  22. 一種增強一血管細胞分化的方法，其中包含使用如請求項1-12其中之一所述的支架培養該血管細胞。
  23. 如請求項22所述的方法，其中該血管細胞為血管前驅細胞(vascular progenitor cell)。
  24. 一種促進一傷口中血管形成的方法，其包含：使用如請求項1-12其中之一所述的支架培養一血管細胞，以產生一預血管內皮化的移植用支架；將該預血管內皮化的移植用支架植入該傷口。
  25. 如請求項24所述的方法，其中該血管細胞為血管前驅細胞(vascular progenitor cell)。
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