CN110177758A - 纳米颗粒调配物 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及包括MYC蛋白的生物活性纳米颗粒调配物的方法和组合物。提供了制造所述纳米颗粒调配物的方法和使用所述纳米颗粒调配物进行治疗的方法。
Description
技术领域
本申请要求2016年12月2日提交的美国临时申请序列号62/429,466的优先权,其内容通过引用整体并入本文。
背景技术
多肽的四级结构可以极大地影响它们的物理化学和生物学特性。蛋白质聚集或非天然聚集是指蛋白质分子组装成由两种或两种以上蛋白质构成的稳定复合物的过程,其中单个蛋白质表示为单体。聚集体通常通过强非共价接触保持在一起,并且需要一定程度的构象变形(解折叠或错误折叠)以便呈现形成单体之间的强接触的关键氨基酸段。虽然聚集倾向于增加蛋白质的稳定性,但它通常以蛋白质的生物活性为代价,降低组合物的均匀性,并且在一些情况下可能增加蛋白质的免疫原性。这些性质对使用此些蛋白质作为生物剂进行治疗的能力产生不利影响。
发明内容
本技术涉及将含MYC多肽控制组装成具有确定尺寸范围的生物活性颗粒群。本文提供了用于产生保持生物活性的含MYC纳米颗粒的稳定制剂的方法。还提供了使用生物活性颗粒进行治疗的方法,包含治疗细胞的体外和体内方法。
本文公开了包括被配制成生物活性稳定纳米颗粒的含MYC多肽的组合物。在一些实施例中,含MYC多肽包括融合肽,其中融合肽包括:(i)蛋白转导结构域;(ii)MYC多肽序列,并且其中纳米颗粒表现出MYC的生物活性。在一些实施例中,融合肽包括SEQ ID NO:1。在一些实施例中,融合肽包括SEQ ID NO:10。
在某些实施例中,本文提供了包括生物活性纳米颗粒群的组合物,所述生物活性纳米颗粒群包括一或多种含MYC多肽。在一些实施例中,生物活性纳米颗粒的数均直径介于约80nm和约150nm之间。在一些实施例中,调配物的pH为至少约pH 6.0,但不大于约pH 8。在一些实施例中,相较于未与含MYC多肽的组合物接触的抗CD3或抗CD28活化的T细胞,在适合T细胞增殖的条件下使抗CD3或抗CD28活化的T细胞与含MYC多肽纳米颗粒组合物接触增强了T细胞的活化、存活或增殖中的一或多种。在一些实施例中,MYC多肽是乙酰化的。在一些实施例中,含MYC多肽包括MYC融合肽,其包括与MYC多肽连接的蛋白转导结构域。在一些实施例中,MYC融合肽进一步包括一或多个连接蛋白转导结构域和MYC多肽的分子。在一些实施例中,含MYC多肽包括具有以下一般结构的MYC融合肽:蛋白转导结构域-X-MYC序列,其中-X-是连接蛋白转导结构域和MYC序列的分子。在一些实施例中,蛋白转导结构域序列是TAT蛋白转导结构域序列。在一些实施例中,TAT蛋白转导结构域序列选自由以下组成的群组:TAT[48-57]和TAT[57-48]。在一些实施例中,MYC多肽是包括SEQ ID NO:1的MYC融合肽。在一些实施例中,MYC多肽是包括SEQ ID NO:10的MYC融合肽。在一些实施例中,纳米颗粒的数均直径介于约80nm和约150nm之间。在一些实施例中,纳米颗粒的数均直径介于约100nm和约110nm之间。在一些实施例中,组合物进一步包括药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中,组合物被配制用于局部施用、口服施用、肠胃外施用、鼻内施用、口腔施用、直肠施用或透皮施用。
在某些实施例中,本文还提供了通过施用治疗有效量的本文提供的组合物来在有需要的受试者中增加一或多种免疫细胞的活化、存活或增殖中的一或多种或增加免疫应答的方法,所述组合物包括生物活性纳米颗粒群,所述生物活性纳米颗粒群包括一或多种含MYC多肽。在一些实施例中,一或多种免疫细胞包括一或多种无能免疫细胞。在一些实施例中,一或多种免疫细胞是T细胞。在一些实施例中,T细胞选自由以下组成的群组:幼稚T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、记忆T细胞、活化T细胞、无能T细胞、耐受T细胞、嵌合B细胞和抗原特异性T细胞。在一些实施例中,一或多种免疫细胞是B细胞。在一些实施例中,B细胞选自由以下组成的群组:幼稚B细胞、血浆B细胞、活化B细胞、记忆B细胞、无能B细胞、耐受B细胞、嵌合B细胞和抗原特异性B细胞。
在某些实施例中,本文还提供了在造血干细胞移植(HSCT)之后引发造血干细胞以增强植入的方法,其包括在移植造血干细胞之前在体外使一或多种造血干细胞与本文提供的组合物接触,所述组合物包括生物活性纳米颗粒群,所述生物活性纳米颗粒群包括一或多种含MYC多肽。
在某些实施例中,本文还提供了制备包括一或多种含MYC多肽的生物活性纳米颗粒群的方法,所述方法包括:(a)使含MYC多肽溶解在包括某一浓度的变性剂的增溶溶液中增溶以提供增溶的含MYC多肽;(b)用第一重折叠缓冲液对增溶的含MYC多肽进行第一重折叠步骤至少约30到180分钟以提供第一多肽混合物,所述第一重折叠缓冲液包括约0.35到约0.65浓度的步骤(a)的变性剂和约100mM到约1M碱金属盐和/或碱性金属盐;(c)用第二重折叠缓冲对第一多肽混合物进行第二重折叠步骤至少约30到180分钟以提供第二多肽混合物,所述第二重折叠缓冲液包括约0.10到约0.30浓度的步骤(b)的变性剂和约100mM到1M碱金属盐和/或碱性金属盐;(e)用第三重折叠缓冲液对第二多肽混合物进行第三重折叠步骤至少约30到180分钟,所述第三重折叠缓冲液包括约100mM到1M碱金属盐和/或碱性金属盐;和(f)将含MYC多肽保持在第三重折叠缓冲液中一段时间,所述时间足以产生数均直径介于约80nm和约150nm之间的生物活性纳米颗粒,其中相较于未与生物活性纳米颗粒接触的抗CD3或抗CD28活化的T细胞,在适合T细胞增殖的条件下使抗CD3或抗CD28活化的T细胞与生物活性纳米颗粒接触增强了T细胞的活化、存活或增殖中的一或多种。在一些实施例中,第一重折叠步骤、第二重折叠步骤和/或第三重折叠步骤包括通过缓冲液更换来进行步骤。在一些实施例中,使用切向流过滤进行缓冲液更换。在一些实施例中,碱金属盐包括钠盐、锂盐和钾盐中的一或多种。在一些实施例中,碱金属盐包括氯化钠(NaCl)、溴化钠、硫酸氢钠、硫酸钠、碳酸氢钠、碳酸钠、氯化锂、溴化锂、硫酸氢锂、硫酸锂、碳酸氢锂、碳酸锂、氯化钾、溴化钾、硫酸氢钾、硫酸钾、碳酸氢钾和碳酸钾中的一或多种。在一些实施例中,碱性盐包括镁盐和钙盐中的一或多种。在一些实施例中,碱性金属盐包括氯化镁、溴化镁、硫酸氢镁、硫酸镁、碳酸氢镁、碳酸镁、氯化钙、溴化钙、硫酸氢钙、硫酸钙、碳酸氢钙和碳酸钙中的一或多种。在一些实施例中,碱金属盐包括氯化钠(NaCl)。在一些实施例中,第一、第二和/或第三重折叠缓冲液包括约500mM NaCl。在一些实施例中,步骤(a)中的变性剂的浓度为约1M到约10M。在一些实施例中,变性剂包括胍、盐酸胍、氯化胍、硫氰酸胍、尿素、硫脲、高氯酸锂、氯化镁、苯酚、甜菜碱、肌氨酸、氨基甲酰肌氨酸、牛磺酸、二甲亚砜(DMSO);醇,例如丙醇、丁醇和乙醇;洗涤剂,例如十二烷基硫酸钠(SDS)、N-月桂酰肌氨酸、两性洗涤剂、非洗涤剂磺基甜菜碱(NDSB)、TRITON X-100、NONIDETTMP-40、TWEENTM系列和BRIJTM系列;氢氧化物,例如氢氧化钠和氢氧化钾中的一或多种。在一些实施例中,第一重折叠缓冲液、第二重折叠缓冲液和/或第三重折叠缓冲液各自独立地包括缓冲剂。在一些实施例中,缓冲剂包括TRIS(三[羟甲基]氨基甲烷)、HEPPS(N-[2-羟乙基]哌嗪-N'-[3-丙烷-磺酸])、CAP SO(3-[环己基氨基]-2-羟基-1-丙磺酸)、AMP(2-氨基-2-甲基-1-丙醇)、CAPS(3-[环己基氨基]-1-丙磺酸)、CHES(2-[N-环己基氨基]乙磺酸)、精氨酸、赖氨酸和硼酸钠中的一或多种。在一些实施例中,缓冲剂独立地以约1mM到约1M的浓度存在。在一些实施例中,第一重折叠缓冲液、第二重折叠缓冲液和/或第三重折叠缓冲液各自独立地包括氧化剂和还原剂,其中氧化剂与还原剂的摩尔比为约2:1到约20:1。在一些实施例中,氧化剂包括半胱氨酸、二硫化谷胱甘肽(“氧化型谷胱甘肽”)或两者。在一些实施例中,氧化剂的包含浓度为约0.1mM到约10mM。在一些实施例中,还原剂包括β-巯基乙醇(BME)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、胱氨酸、半胱胺、巯基乙酸盐、谷胱甘肽和硼氢化钠中的一或多种。在一些实施例中,还原剂的包含浓度为约0.02mM到约2mM。在一些实施例中,变性剂包括尿素。在一些实施例中,变性剂包括6-8M尿素。在一些实施例中,第一、第二和/或第三重折叠缓冲液包括谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽。在一些实施例中,第一、第二和/或第三重折叠缓冲液包括5mM谷胱甘肽和/或1mM氧化型谷胱甘肽。在一些实施例中,第一、第二和/或第三重折叠缓冲液包括甘油。在一些实施例中,步骤(f)进行至少5小时。在一些实施例中,步骤(f)进行至少10小时。在一些实施例中,步骤(f)进行10-12小时。在一些实施例中,步骤(f)进一步包括以小于1000rpm的速度在第三重折叠缓冲液中搅拌含MYC多肽。
在一些实施例中,本文提供的方法进一步包括从微生物宿主细胞分离重组含MYC多肽。在一些实施例中,微生物宿主细胞是大肠杆菌。在一些实施例中,从微生物宿主细胞分离重组含MYC多肽包括从诱导型启动子表达含MYC多肽。在一些实施例中,从微生物宿主细胞分离重组含MYC多肽包括使用亲和色谱和/或阴离子交换色谱纯化含MYC多肽。在一些实施例中,含MYC多肽是乙酰化的。
在一些实施例中,本文提供的纳米颗粒组合物及其产生方法的含MYC多肽是重组多肽。在一些实施例中,本文提供的纳米颗粒组合物的含MYC多肽包括MYC融合肽,其包括与MYC多肽连接的蛋白转导结构域。在一些实施例中,MYC融合肽进一步包括一或多个连接蛋白转导结构域和MYC多肽的分子。在一些实施例中,含MYC多肽包括具有以下一般结构的MYC融合肽:蛋白转导结构域-X-MYC序列,其中-X-是连接蛋白转导结构域和MYC序列的分子。在一些实施例中,蛋白转导结构域序列是TAT蛋白转导结构域序列。在一些实施例中,TAT蛋白转导结构域序列选自由以下组成的群组:TAT[48-57]和TAT[57-48]。在一些实施例中,含MYC多肽是包括SEQ ID NO:1的MYC融合肽。在一些实施例中,含MYC多肽是包括SEQ ID NO:10的MYC融合肽。在一些实施例中,纳米颗粒的数均直径为约80nm和约150nm。在一些实施例中,纳米颗粒的数均直径为约100nm和约110nm。
在一个示例性实施例中,本文提供了一种制备包括一或多种含MYC多肽的生物活性纳米颗粒群的方法,所述方法包括:(a)使含MYC多肽在缓冲增溶溶液中变性以提供变性的含MYC多肽,所述缓冲增溶溶液包括6-8M尿素;(b)用第一重折叠缓冲液对变性的含MYC多肽进行第一重折叠步骤至少约120分钟以提供第一多肽混合物,所述第一重折叠缓冲液包括约3M尿素和约500mM NaCl;(c)用第二重折叠缓冲液通过缓冲液更换对第一多肽混合物进行第二重折叠步骤至少约120分钟以提供第二多肽混合物,所述第二重折叠缓冲液包括约1.5M尿素和约500mM NaCl;(d)用第三重折叠缓冲液通过缓冲液更换对第二多肽混合物进行第三重折叠步骤至少约120分钟,所述第三重折叠缓冲液包括约500mM NaCl;(f)将含MYC多肽保持在第三重折叠缓冲液中一段时间,所述时间足以产生数均直径介于约80nm和约150nm之间的生物活性纳米颗粒,其中相较于未与生物活性纳米颗粒接触的抗CD3或抗CD28活化的T细胞,在适合T细胞增殖的条件下使抗CD3或抗CD28活化的T细胞与生物活性纳米颗粒接触增强了T细胞的活化、存活或增殖中的一或多种。
附图说明
图1A和图1B示出了使用流式细胞术技术的含MYC纳米颗粒调配物C2A对抗CD3和抗CD28活化的T细胞的增殖的影响。图1A示出了缓冲液对照样品中T细胞的增殖。图1B示出了用含MYC纳米颗粒调配物C2A温育24小时的T细胞的增殖。
图2A和图2B示出了通过非对称流场流分离(AF4)和多角度激光散射(MALLS)分析的选择含MYC纳米颗粒调配物的色谱图。图2A和2B分别示出了从调配物F01和调配物F02的分析获得的色谱图。从在25℃下储存的样品获得迹线t1和t2。从在5℃下储存的样品获得迹线t2*和t4*。时间(t)以周为单位测量,并以t后的数值示出(即,t1=一周,t2=两周等)。
图3示出了通过使用串联Sepax SRT-C 2000和300柱通过尺寸排阻色谱(SEC)分离生物活性和非活性含MYC纳米颗粒调配物而得到的色谱图的比较。指示了示出生物活性纳米颗粒调配物C12和C13以及生物非活性调配物R147的分离的迹线。
图4A和图4B示出了使用尺寸排阻色谱的含MYC纳米颗粒调配物C2A的分析以及多角度光散射分析(SEC-MALS)。图4A示出了随折射率(左侧纵坐标,RV x RI)或分子尺寸(右侧纵坐标,RV x MW)而变化的保留体积(ml)。图4B示出了色谱图,其示出了生物活性含MYC纳米颗粒调配物和生物非活性调配物的分离。
图5A-D描绘了通过动态光散射(DLS)技术分析的选择调配物中含MYC纳米颗粒的尺寸分布。图5A描绘了通过DLS的含MYC纳米颗粒调配物C2A的尺寸分布。图5B描绘了以0.5mg/ml浓度测试的非生物活性含MYC纳米颗粒调配物R149的尺寸分布。图5C描绘了以0.5mg/ml浓度测试的生物活性含MYC纳米颗粒调配物C12的纳米颗粒尺寸分布。图5D示出了以0.5mg/ml浓度测试的生物活性含MYC纳米颗粒调配物C13的纳米颗粒尺寸分布。
图6A和图6B示出了使用纳米颗粒跟踪分析(NTA)技术的含MYC纳米颗粒调配物C2A的分析。图6A示出了从纳米颗粒调配物C2A的三份确定观察到的跟踪。图6B示出了从图6A中所示的C2A纳米颗粒调配物的分析得到的三份确定的共识跟踪。
图7示出了使用电子显微镜检查技术的含MYC纳米颗粒调配物C2B的分析。
图8示出了通过肽图谱分析技术的生物活性和非活性含MYC纳米颗粒调配物的Asp-N胞内蛋白酶消化物的比较。将生物活性含MYC纳米颗粒调配物C2B、C6和C7(“功能性”)与生物非活性含MYC纳米颗粒调配物C4、147和149(“非功能性”)进行比较。
图9示出了含MYC纳米颗粒调配物C13的代表性肽图谱,其中标识出了各个肽峰。
图10A-C示出了纳米颗粒调配物C13的RP-HPLC色谱图。图10A示出了完整的色谱图。图10B和图10C示出了图10A中的完整色谱图的两个不同的缩放视图。
图11示出了纳米颗粒调配物C13的远UV CD光谱分析的结果,其被描绘为随波长(nm)而变化的平均残基摩尔椭圆率(度·厘米2/分摩尔)。
图12示出了纳米颗粒调配物C13的近UV CD光谱分析的结果,其被描绘为随波长(nm)而变化的平均残基摩尔椭圆率(度·厘米2/分摩尔)。
图13示出了四个单独的纳米颗粒调配物C14样品与两个牛血清白蛋白(BSA)对照样品相比的归一化二阶导数傅里叶变换红外光谱(FTIR)。
图14示出了纳米颗粒调配物C13的分析超速离心(AUC)数据。
图15A和图15B分别示出了纳米颗粒调配物C13的非还原(NR)和还原(R)变性SEC色谱图。每个色谱图上的重叠迹线表示对于在2℃-8℃下储存的样品间隔大约1个月进行的测试。
图16A和图16B示出了TAT-MYC和TAT-3AMYC纳米颗粒调配物的变性SEC色谱图。图16B示出了TAT-MYC的色谱图。TAT-MYC蛋白复合物在6分钟和7分钟之间洗脱。较小的蛋白质多聚体和赋形剂在8分钟和15分钟之间洗脱。图16B示出了TAT-3AMYC与功能性TAT-MYC蛋白制剂相比的色谱图。大部分非功能性TAT-3AMYC蛋白制剂包含较小的蛋白质多聚体,并且可以看到在8分钟和17分钟之间洗脱的赋形剂峰。
图17示出了T细胞效力测定的结果。与未治疗(NT)相比,TAT-MYC表现出活T细胞群增加3倍。与未治疗(NT)相比,TAT-3AMYC表现出活T细胞群没有增加。
图18描绘了通过动态光散射(DLS)技术分析的绿猴TAT-MYC的选择调配物中含MYC纳米颗粒的尺寸分布。
图19示出了与人TAT-MYC相比的绿猴TAT-MYC的RP-HPLC色谱图。
图20示出了与人TAT-MYC相比的绿猴TAT-MYC的SEC-HPLC色谱图。
图21示出了与人TAT-MYC相比的绿猴TAT-MYC的T细胞效力测定的结果。
具体实施方式
本公开不限于本申请中描述的特定实施例,其旨在作为本公开的各个方面的单个说明。本文将不描述本公开的所有各个实施例。在不脱离本公开的精神和范围的情况下,可以对本公开进行多种修改和变化,如本领域技术人员所显而易见。除了本文列举的那些之外,通过前面的描述,本公开范围内的功能等同的方法和设备对于本领域技术人员也是显而易见的。此些修改和变化旨在落入所附权利要求的范围内。本公开仅受所附权利要求以及此些权利要求所授权的等同物的全部范围的限制。
应当理解,本公开不限于特定用途、方法、试剂、化合物、组合物或生物系统,其当然可以有所不同。还应当理解,本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的,而不旨在是限制性的。
另外,在根据马库什群组描述本公开的特征或方面的情况下,本领域技术人员将认识到,本公开因此也根据马库什群组的任何单个成员或成员子群组来描述。
如本领域技术人员将理解,出于任何和所有目的,特别是在提供书面描述方面,本文公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围可以容易地被认识为充分描述并实现了相同的范围被分解成至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为一个非限制性实例,本文讨论的每个范围可以容易地被分解成下三分之一、中三分之一和上三分之一等。本领域技术人员还将理解,诸如“多达”、“至少”、“大于”、“小于”等的所有语言包含所述的数字并且是指可以随后被分解成如上所讨论的子范围的范围。最后,如本领域技术人员将理解,范围包含每个单独的成员。因此,例如,具有1-3个细胞的群组是指具有1个、2个或3个细胞的群组。类似地,具有1-5个细胞的群组是指具有1个、2个、3个、4个或5个细胞的群组等等。
除非另外定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
I.定义
本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的,并不旨在限制本公开。如本文使用,单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”旨在也包含复数形式,除非上下文另有明确说明。
如本文使用,术语“约”是指值可以变化+/-20%、+/-15%、+/-10%或+/-5%并且仍然在本公开的范围内。例如,“约200IU/mL的浓度”涵盖介于160IU/mL和240IU/mL之间的浓度。
如本文使用,术语“施用”药剂(向受试者)包含将药剂引入或递送至受试者以执行其预期功能的任何途径。施用可以通过任何合适的途径进行,包含静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下。施用包含自我施用和由其它人施用。
术语“氨基酸”是指天然存在的和非天然存在的氨基酸,以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码的氨基酸是20种常见的氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)和吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构的药剂,即α碳与氢、羧基基团、氨基基团和R基团结合,例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。此些类似物具有修饰的R基团(例如,正亮氨酸)或修饰的肽主链,但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。在一些实施例中,形成多肽的氨基酸为D形式。在一些实施例中,形成多肽的氨基酸为L形式。在一些实施例中,形成多肽的第一多个氨基酸为D形式,而第二多个氨基酸为L形式。
氨基酸在本文中通过它们通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来指代。同样,核苷酸通过它们普遍接受的单字母代码来指代。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用,指代氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及其中一或多个氨基酸残基是非天然存在的氨基酸(例如,氨基酸类似物)的氨基酸聚合物。所述术语涵盖任何长度的氨基酸链,包含全长蛋白质,其中氨基酸残基通过共价肽键连接。
如本文使用,“对照”是在实验中用于比较目的的替代样品。对照可以是“阳性的”或“阴性的”。例如,当实验的目的是确定治疗剂针对特定类型疾病的治疗功效的相关性时,通常使用阳性对照(已知表现出期望的治疗性效果的组合物)和阴性对照(未接受治疗或接受安慰剂的受试者或样品)。
如本文使用,术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以实现期望的治疗性效果的药剂的量。在治疗应用的背景下,向受试者施用的治疗性肽的量可能取决于感染的类型和严重度以及个体的特点,例如一般健康状况、年龄、性别、体重和对药物的耐受性。它还可能取决于疾病的程度、严重度和类型。技术人员将能够根据这些和其它因素确定合适的剂量。
如本文使用,术语“表达”是指多核苷酸转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸源自基因组DNA,则表达可以包含在真核细胞中的mRNA剪接。可以通过测量细胞或组织样品中mRNA或蛋白质的量来确定基因的表达水平。在一个方面,可以将来自一个样品的基因的表达水平直接与来自对照或参考样品的所述基因的表达水平进行比较。在另一个方面,可以将来自一个样品的基因的表达水平直接与施用本文公开的组合物后来自相同样品的所述基因的表达水平进行比较。术语“表达”还指一或多个以下事件:(1)在细胞内从DNA序列产生RNA模板(例如,通过转录);(2)在细胞内处理RNA转录物(例如,通过剪接、编辑、5'帽形成和/或3'末端形成);(3)在细胞内将RNA序列翻译成多肽或蛋白质;(4)在细胞内的多肽或蛋白质的翻译后修饰;(5)在细胞表面上呈递多肽或蛋白质;和(6)从细胞分泌或呈递或释放多肽或蛋白质。
术语“连接子”是指连接(connect/link)两个序列(例如,连接两个多肽结构域)的合成序列(例如,氨基酸序列)。在一些实施例中,连接子含有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸序列。
本文使用的术语“冻干(lyophilized/lyophilization)”等是指首先冷冻待干燥的材料(例如,纳米颗粒)然后通过在真空环境中升华去除冰或冷冻溶剂的工艺。赋形剂可以包含在预冻干调配物中以增强冻干产品在储存时的稳定性。冻干样品可以进一步含有另外的赋形剂。
如本文使用,术语免疫细胞是指在免疫应答中起作用的任何细胞。免疫细胞具有造血起源,并且包含淋巴细胞,例如B细胞和T细胞;自然杀伤细胞;骨髓细胞,例如单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。
术语“淋巴细胞”是指所有未成熟、成熟、未分化和分化的白色淋巴细胞群,包含组织特异性和特化变种。作为非限制性实例,它涵盖B细胞、T细胞、NKT细胞和NK细胞。在一些实施例中,淋巴细胞包含所有B细胞系,包含前B细胞、祖B细胞、早期原B细胞、晚期原B细胞、大前B细胞、小前B细胞、未成熟B细胞、成熟B细胞、血浆B细胞、记忆B细胞、B-1细胞、B-2细胞和无能AN1/T3细胞群。
如本文使用,术语T细胞包含幼稚T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、记忆T细胞、活化T细胞、无能T细胞、耐受T细胞、嵌合B细胞和抗原特异性T细胞。
作为非限制性实例,术语“B细胞(B cell/B cells)”是指前B细胞、祖B细胞、早期原B细胞、晚期原B细胞、大前B细胞、小前B细胞、未成熟B细胞、成熟B细胞、幼稚B细胞、血浆B细胞、活化B细胞、无能B细胞、耐受B细胞、嵌合B细胞、抗原特异性B细胞、记忆B细胞、B-1细胞、B-2细胞和无能AN1/T3细胞群。在一些实施例中,术语B细胞包含在其细胞表面上表达免疫球蛋白重链和/或轻链的B细胞。在一些实施例中,术语B细胞包含表达和分泌免疫球蛋白重链和/或轻链的B细胞。在一些实施例中,术语B细胞包含在其细胞表面上结合抗原的细胞。在本文公开的一些实施例中,B细胞或AN1/T3细胞用于所述工艺中。在某些实施例中,此些细胞任选地被适于表达、能够表达(例如,可诱导表达)或能够分化成适于表达抗体的细胞的任何动物细胞取代,包含例如造血干细胞、幼稚B细胞、B细胞、前B细胞、祖B细胞、早期原B细胞、晚期原B细胞、大前B细胞、小前B细胞、未成熟B细胞、成熟B细胞、血浆B细胞、记忆B细胞、B-1细胞、B-2细胞、无能B细胞或无能AN1/T3细胞。
术语“MYC”和“MYC基因”是同义词。它们是指编码MYC多肽的核酸序列。MYC基因包括至少120个核苷酸的核苷酸序列,其与NCBI登录号NM_002467.5的序列具有至少60%到100%的同一性或同源性,例如至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、90%、91%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或约70%到约100%的任何其它百分比的同一性。在一些实施例中,MYC基因是原癌基因。在某些情况下,在8号染色体上8q24.21处发现MYC基因。在某些情况下,MYC基因起始于磷酸三酯酶相关蛋白(pter)的128,816,862bp处,终止于磷酸三酯酶相关蛋白的128,822,856bp处。在某些情况下,MYC基因为约6kb。在某些情况下,MYC基因编码至少八个单独的mRNA序列——5个选择性剪接变体和3个未剪接变体。
术语“MYC蛋白”、“MYC多肽”和“MYC序列”是同义词,是指NCBI登录号NP_002458.2(下文提供)或UniProtKB/Swiss-Prot:P01106.1中公开的氨基酸残基聚合物,其是人myc同种型2及其功能同源物、变体、类似物或片段。本序列如下所示。
MDFFRVVENQQPPATMPLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTELLGGDMVNQSFICDPDDETFIKNIIIQDCMWSGFSAAAKLVSEKLASYQAARKDSGSPNPARGHSVCSTSSLYLQDLSAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCASQDSSAFSPSSDSLLSSTESSPQGSPEPLVLHEETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSESGSPSAGGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQISNNRKCTSPRSSDTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLRNSCA(SEQ ID NO:2)
在一些实施例中,MYC多肽是完整MYC多肽序列。在一些实施例中,MYC多肽是部分MYC多肽序列。在一些实施例中,MYC多肽是c-MYC。在一些实施例中,MYC多肽序列包括如下所示的序列:
MDFFRVVENQQPPATMPLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTELLGGDMVNQSFICDPDDETFIKNIIIQDCMWSGFSAAAKLVSEKLASYQAARKDSGSPNPARGHSVCSTSSLYLQDLSAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCASQDSSAFSPSSDSLLSSTESSPQGSPEPLVLHEETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSESGSPSAGGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQISNNRKCTSPRSSDTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLRKGELNSKLE(SEQ ID NO:3)。
在一些实施例中,MYC多肽序列包括如下所示的序列:
PLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTELLGGDMVNQSFICDPDDETFIKNIIIQDCMWSGFSAAAKLVSEKLASYQAARKDSGSPNPARGHSVCSTSSLYLQDLSAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCASQDSSAFSPSSDSLLSSTESSPQGSPEPLVLHEETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSESGSPSAGGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQISNNRKCTSPRSSDTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLR(SEQ ID NO:4)。
在一些实施例中,MYC多肽序列包括来自非人物种的MYC多肽序列。在一些实施例中,非人物种选自由以下组成的群组:猿、猴、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛和马物种。在一些实施例中,MYC多肽序列包括如下所示的序列,其来自绿猴(绿猴)(XP_007999715.1):
MPLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSPRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTELLGGDMVNQSFICDPDDETFIKNIIIQDCMWSGFSAAAKLVSEKLASYQAARKDSGSPNPARGHSVCSTSSLYLQDLSAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCASPDSSAFSPSSDSLLSSTESSPQASPEPLVLHEETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSESGSPSAGGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQISNNRKCTSPRSSDTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEKDLLRKRREQLKHKLEQLRNSCA
在一些实施例中,MYC多肽序列包括如下所示的序列:
PLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTELLGGDMVNQSFICDPDDETFIKNIIIQDCMWSGFSAAAKLVSEKLASYQAARKDSGSPNPARGHSVCSTSSLYLQDLSAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCASQDSSAFSPSSDSLLSSTESSPQASPEPLVLHEETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSESGSPSAGGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQISNNRKCTSPRSSDTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEKDLLRKRREQLKHKLEQLR(SEQ ID NO:9)。
在一些实施例中,MYC多肽包括氨基酸序列,其与NCBI登录号NP002458.2(SEQ IDNO:2)的序列具有至少40%到100%的同一性,例如至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、90%、91%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或约40%到约100%的任何其它百分比的同一性。在一些实施例中,MYC多肽是指NP002458.2(SEQ ID NO:2)的420个、421个、422个、423个、424个、425个、426个、427个、428个、429个、430个、431个、432个、433个、434个、435个、436个、437个、438个、439个、440个、441个、442个、443个、444个、445个、446个、447个、448个、449个、450个、451个、452个、453个、454个连续氨基酸的聚合物。在一些实施例中,MYC多肽是指未经历任何翻译后修饰的NP002458.2(SEQ ID NO:2)的435个氨基酸的聚合物。在一些实施例中,MYC多肽是指经历翻译后修饰的NP002458.2(SEQ ID NO:2)的435个氨基酸的聚合物。在一些实施例中,MYC多肽是48,804kDa。在一些实施例中,MYC多肽含有碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链(bHLH/LZ)结构域。在一些实施例中,bHLH/LZ结构域包括序列ELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLR(SEQ ID NO:5)。在一些实施例中,MYC多肽是转录因子(例如,转录因子64)。在一些实施例中,MYC多肽含有E-box DNA结合结构域。在一些实施例中,MYC多肽结合到包括CACGTG的序列。在一些实施例中,MYC多肽促进细胞存活和/或增殖中的一或多种。在一些实施例中,MYC多肽包含上述那些中的一或多种,并且包含一或多种翻译后修饰(例如,乙酰化)。在一些实施例中,MYC多肽在多肽的N-末端或C-末端包括一或多个另外的氨基酸残基。在一些实施例中,MYC多肽是融合蛋白。在一些实施例中,MYC多肽与多肽的N-末端或C-末端处的一或多个另外的肽连接。
适用于本文所述方法的蛋白质还包含功能变体,包含相较于本文所述的任何蛋白质具有1到15个氨基酸变化(例如,1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸取代、缺失或添加)的蛋白质。在其它实施例中,改变的氨基酸序列与本文所述的任何蛋白质抑调配物的氨基酸序列具有至少75%的同一性,例如75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。此些序列变体蛋白适用于本文所述的方法,只要改变的氨基酸序列保留足够的生物活性以在本文所述的组合物和方法中起作用。在进行氨基酸取代的情况下,取代可以是保守氨基酸取代。例如,在常见的天然存在的氨基酸中,“保守氨基酸取代”通过以下各个群组内的氨基酸之间的取代来说明:(1)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸,(2)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸,(3)丝氨酸和苏氨酸,(4)天冬氨酸和谷氨酸,(5)谷氨酰胺和天冬酰胺,和(6)赖氨酸、精氨酸和组氨酸。BLOSUM62表是从蛋白质序列节段的约2,000个局部多重比对得到的氨基酸取代矩阵,表示超过500个群组的相关蛋白质的高度保守区域(亨尼科夫(Henikoff)等人,(1992年),美国国家科学院学报(Proc.Natl Acad.Sci.USA),89:10915-10919)。因此,使用BLOSUM62取代频率来限定保守氨基酸取代,其在一些实施例中被引入本文描述或公开的氨基酸序列中。尽管可以仅基于化学性质设计氨基酸取代(如上所讨论),但语言“保守氨基酸取代”优选地是指由大于-1的BLOSUM62值表示的取代。例如,如果取代的特征在于BLOSUM62值为0、1、2或3,则氨基酸取代是保守的。根据本体系,优选的保守氨基酸取代的特征在于BLOSUM62值为至少1(例如,1、2或3),而更优选的保守氨基酸取代的特征在于BLOSUM62值为至少2(例如,2或3)。
短语“E-box序列”和“增强子盒序列”在本文中可互换使用,并且是指核苷酸序列CANNTG,其中N是任何核苷酸。在某些情况下,E-box序列包括CACGTG。在某些情况下,由MYC编码的转录因子的碱性螺旋-环-螺旋结构域与E-box序列结合。在某些情况下,E-box序列位于基因的上游(例如,p21,Bc1-2或鸟氨酸脱羧酶)。在某些情况下,MYC多肽含有E-boxDNA结合结构域。在某些情况下,E-box DNA结合结构域包括序列KRRTHNVLERQRRN(SEQ IDNO:6)。在某些情况下,由MYC编码的转录因子与E-box序列的结合允许RNA聚合酶转录E-box序列下游的基因。
术语“MYC活性”或“MYC生物活性”或“生物活性MYC”包含增强或诱导细胞存活、细胞增殖和/或抗体产生中的一或多种。作为实例而非限制,MYC活性包含增强抗CD3和抗CD28活化的T细胞的扩增和/或增加长期自我更新的造血干细胞的增殖。MYC活性还包含进入细胞核、结合到核酸序列(例如,结合E-box序列)和/或诱导MYC靶基因的表达。
术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文中可互换使用,并且是指动物,通常是哺乳动物。在一个优选实施例中,患者、受试者或个体是哺乳动物。在一个特别优选实施例中,患者、受试者或个体是人。
术语“蛋白转导结构域(PTD)”或“转运子肽序列”(也被称为细胞渗透蛋白(CPP)或膜转位序列(MTS))在本文中可互换使用,是指能够不依赖于经典内吞作用将更大的分子运送到细胞中的小肽。在一些实施例中,可以在蛋白转导结构域内发现核定位信号,其介导分子进一步转位到细胞核中。
本文使用的术语“治疗(treating/treatment)”涉及受试者(例如,人)中的疾病的治疗,并且包含:(i)抑制疾病,即阻止其发展;(ii)缓解疾病,即导致疾病消退;(iii)减缓疾病的进展;和/或(iv)抑制、缓解或减缓疾病的一或多种症状的进展。
还应当理解,所描述的各种治疗或预防医学疾病和病状的方式旨在表示“大体上的”,其包含总治疗或预防,但也包含少于总治疗或预防,并且其中实现了一些生物学或医学相关结果。治疗可以是对慢性疾病的持续延长治疗,或者是用于治疗急性病状的单次或几次施用。
本文使用的术语“治疗性”是指治疗和/或预防。通过遏制、缓和或根除疾病状态获得治疗性效果。
II.包括纳米颗粒MYC肽的组合物
本文公开了包括被配制成生物活性稳定纳米颗粒的含MYC多肽的组合物以及制造和使用所述组合物的方法。在一些实施例中,含MYC多肽是MYC多肽和蛋白转导结构域的融合物,例如HIV TAT。在一些实施例中,MYC融合多肽还包含一或多种标签序列。在一些实施例中,MYC融合多肽包括SEQ ID NO:1。在一些实施例中,MYC融合多肽包括SEQ ID NO:10。
如下文更详细讨论并如实例中所示,本技术的生物活性含MYC多肽组合物在一些实施例中包含约90-140nm的纳米颗粒,分子质量为约104-106道尔顿。在一些实施例中,颗粒包含约200个含MYC多肽的分子。
在一些实施例中,生物活性纳米微粒组合物包含翻译后修饰的MYC蛋白。作为实例但不作为限制,在一些实施例中,蛋白质包含至少一个乙酰基。
A.含MYC多肽的表达和纯化
本文提供了用于产生用于提供的纳米颗粒组合物的含MYC多肽的方法。在本发明的方法中,含MYC多肽通过微生物发酵重组产生。在一些实施例中,微生物发酵在约1到约10,000升的发酵体积(例如,约10到约1000升的发酵体积)中进行。发酵可以利用任何合适的微生物宿主细胞和培养基。在示例性实施例中,大肠杆菌用作微生物宿主细胞。在替代实施例中,可以使用其它微生物,例如酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、乳酸杆菌、杆菌和曲霉菌。在一个示例性实施例中,微生物宿主细胞是BL-21StarTM大肠杆菌菌株(英杰公司(Invitrogen))。在一个示例性实施例中,微生物宿主细胞是BLR DE3大肠杆菌菌株。
在一些实施例中,修饰宿主细胞以提供稀有密码子的tRNA,其用于克服宿主微生物细胞密码子偏倚以改善表达的蛋白质的翻译。在示例性实施例中,用质粒(例如,pRARE(CamR))转化宿主细胞(例如,大肠杆菌),其表达AGG、AGA、AUA、CUA、CCC、GGA密码子的tRNA。另外,用于提供特定密码子的tRNA的合适的质粒或构建体是本领域已知的,并且可以用于所提供的方法中。
整合或自我复制载体可以用于将含MYC多肽表达盒引入所选宿主细胞中的目的。在表达盒中,含MYC多肽的编码序列与启动子(例如,诱导型启动子)可操作地连接。诱导型启动子是响应于培养条件的一些变化(例如,存在或不存在营养物或温度的变化)在其控制下启动DNA转录水平的增加的启动子。在一些实施例中,编码含MYC多肽的核酸经密码子优化用于细菌表达。
被各种潜在宿主细胞识别的示例性启动子是众所周知的。这些启动子可以通过以下来与含MYC多肽编码DNA可操作地连接:通过限制酶消化从源DNA去除启动子(如果存在)并将分离的启动子序列插入载体中。适合与微生物宿主一起使用的启动子包含但不限于β-内酰胺酶和乳糖启动子系统(常(Chang)等人,(1978年),自然(Nature),275:617-624;戈德尔(Goeddel)等人,(1979年),自然(Nature),281:544)、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统(戈德尔(1980年)核酸研究(Nucleic Acids Res.),8:4057;EP36,776)、和杂合启动子,例如tac启动子(德波尔(deBoer)等人,(1983年),美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),80:21-25)。可以使用适合由选择宿主细胞进行表达的任何启动子。公布了合适的核苷酸序列,从而使技术人员能够使用连接子或适配子提供任何所需的限制位点来可操作地将它们与编码含MYC多肽的DNA连接(参见例如西贝内特(Siebenlist)等人,(1980年),细胞(Cell)20:269)。在示例性实施例中,用于细菌系统的启动子可以含有与编码序列可操作连接到编码序列的塞恩-达尔加默(Shine-Dalgarno)(S.D.)序列。在一些实施例中,诱导型启动子是lacZ启动子,其用异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导,如本领域所熟知。启动子和表达盒也可以使用众所周知的合成目标DNA序列的技术从头合成。在一个示例性实施例中,在本文中用于表达含MYC多肽的表达载体是pET101/D-Topo(Invitrogen)。
为了表达含MYC多肽,含有编码含MYC多肽的表达载体的微生物宿主通常在发酵反应器中生长至高密度。在一些实施例中,反应器具有受控的葡萄糖进料。在一些实施例中,首先在补充有抗生素的培养基中培养发酵罐接种物(例如,过夜培养)。然后使用发酵罐接种物来接种发酵罐培养物以表达蛋白质。在发酵罐培养物的OD600为至少约15(通常至少约20、至少25、至少约30或更高)处,诱导重组蛋白的表达。在示例性实施例中,其中诱导型启动子是lacZ启动子,将IPTG加入到发酵培养基中以诱导含MYC多肽的表达。通常,在OD600表示对数生长期处,将IPTG加入到发酵罐培养物中。
在所提供的方法的某些实施例中,诱导的蛋白质表达在诱导后维持大致约2到大致约5小时,并且可以是大致约2到大致约3小时的诱导后表达。由于重组蛋白的降解,可能不期望更长的诱导期。诱导期间反应混合物的温度优选为约28℃到约37℃,通常为约30℃到约37℃。在特定实施例中,诱导在约37℃下。
含MYC多肽通常在微生物细胞中被表达为胞质包涵体。为了收获包涵体,在诱导后通过离心发酵培养物收集细胞团块,在-70℃或更低温度下冷冻,解冻并重悬于破碎缓冲液中。通过常规方法(例如,超声处理、均质化等)裂解细胞。然后将裂解物重悬于增溶缓冲液中,通常在存在有效增溶蛋白质的浓度(例如,约5M、6M、7M、8M、9M或更高)的尿素的条件下。重悬可能需要机械地将团块破碎并搅拌以实现均质性。在一些实施例中,将细胞团块直接重悬于尿素缓冲液中并混合至均质。在一些实施例中,重悬/增溶缓冲液是8M尿素、50mM磷酸盐pH 7.5,并使混悬液通过均质器。
在一些实施例中,均质的混悬液是磺酰化的。例如,在一些实施例中,将均质的混悬液调节至包含200mM亚硫酸钠和10mM连四硫酸钠。然后将溶液在室温下混合至均质。然后将混合的裂解物再混合一段时间以完成磺酰化(例如,在2-8℃下≥12小时)。然后将磺酰化的裂解物离心一小时。然后通过离心收集含有磺酰化含MYC多肽的上清液,弃去细胞团块。然后将上清液通过过滤器,例如0.22μm膜过滤器以澄清裂解物。
然后纯化增溶的蛋白质。纯化方法可以包含亲和色谱、反相色谱、凝胶排阻色谱等。在一些实施例中,使用亲和色谱。例如,使蛋白质具有表位标签或组氨酸6标签,以便于纯化。在本方法中,示例性含myc多肽包括组氨酸6标签,用于使用Ni-树脂利用Ni亲和色谱进行纯化。
在示例性实施例中,Ni-树脂柱在含有尿素的缓冲液中平衡。在一些实施例中,平衡缓冲液是6M尿素、50mM磷酸盐、500mM NaCl和10%甘油溶液。然后将包括含MYC多肽的磺酰化和澄清上清液上样到Ni-树脂柱上。然后用洗涤缓冲液(例如,6M尿素、50mM磷酸盐、10%甘油、500mM NaCl,pH 7.5)洗涤柱。然后用盐浓度递减的连续洗涤缓冲液洗涤柱。例如,示例性的后续洗涤可以包括6M尿素、50mM磷酸盐、10%甘油和2M NaCl,pH 7.5,接着是6M尿素、50mM磷酸盐、10%甘油、50mM NaCl和30mM咪唑,pH 7.5的另一次洗涤。
在连续施加洗涤缓冲液后,通过加入洗脱缓冲液(例如,6M尿素、50mM磷酸盐、10%甘油和50mM NaCl,pH 7.5,具有梯度为100到300mM的咪唑)并收集级分来从柱洗脱含MYC多肽。然后将待合并的含蛋白质级分通过0.22μm膜过滤。蛋白质得率的评估可以使用任何合适的方法测量,例如在UV波长280下的分光光度法。
在一些实施例中,可以使用一或多种另外的纯化方法来进一步纯化分离的含MYC多肽。在示例性实施例中,来自Ni-琼脂糖凝胶色谱步骤的合并级分使用Q-琼脂糖凝胶树脂通过阴离子交换色谱进一步纯化。在一些实施例中,通过用来自Ni琼脂糖凝胶色谱步骤的第二洗涤缓冲液(例如,6M尿素、50mM磷酸盐、10%甘油、2M NaCl,pH 7.5)将样品稀释至Q琼脂糖凝胶缓冲液的电导率(17.52+/-1mS/cm)来制备合并物(pool),以用于上样到Q-琼脂糖凝胶柱上。然后将稀释的合并物上样到Q-琼脂糖凝胶柱上,接着使用追加缓冲液(例如,6M尿素、50mM磷酸盐、300mM NaCl和10%甘油)进行两个追加步骤,其中进一步连续施加追加缓冲液直至UV迹线达到基线,表明蛋白质已从柱洗脱。(以下称“段落A”)
B.将含MYC多肽重折叠成纳米颗粒
本技术的组合物可以根据以下方法由分离的含MYC多肽制备。(以下称“段落B”)
在一些实施例中,含MYC多肽被重折叠以产生生物活性纳米颗粒。在一些实施例中,所述方法包括切向流过滤(TFF)或交叉流过滤。TFF是一种使用泵使样品跨容纳在多层结构(盒)中的膜的表面(即,与膜表面“相切”)循环的工艺。施加的跨膜压力作为将溶质和小分子转运通过膜的驱动力。膜表面上的液体交叉流动从表面扫除保留分子,使它们保持在循环流中。(以下称“段落C”)
在一些实施例中,含MYC多肽用变性剂(例如,尿素)变性。然后使用跨超滤/渗滤(UFDF)膜的多个TFF步骤并连续加入具有递减浓度的变性剂(例如,尿素)的重折叠缓冲液来重折叠含MYC多肽。在一些实施例中,连续重折叠缓冲液的尿素浓度从约3M尿素降至<0.001M或无尿素。在一些实施例中,连续重折叠缓冲液包括磷酸盐、NaCl、甘油、GSH(还原型谷胱甘肽)和GSSG(氧化型谷胱甘肽))。在一些实施例中,重折叠缓冲液包括约50mM磷酸盐。在一些实施例中,重折叠缓冲液包括碱土金属盐。在一些实施例中,碱土金属盐是钠(Na)、锂(Li)或钾(K)盐。在一些实施例中,重折叠缓冲液包括钠盐,例如NaCl。在一些实施例中,重折叠缓冲液包括约100mM到2M浓度的碱土金属盐。在一些实施例中,重折叠缓冲液包括约200mM到1M浓度的碱土金属盐。在一些实施例中,重折叠缓冲液包括约500mM到1M浓度的碱土金属盐。在一些实施例中,重折叠缓冲液包括约100mM到2M浓度的NaCl。在一些实施例中,重折叠缓冲液包括约200mM到1M浓度的NaCl。在一些实施例中,重折叠缓冲液包括约200mM到800mM浓度的NaCl。在特定实施例中,重折叠缓冲液包括约200-500mM NaCl。在一些实施例中,重折叠缓冲液包括约500mM NaCl。在一些实施例中,重折叠缓冲液的同渗容摩介于约300mOsm和1000mOsm之间。在一些实施例中,重折叠缓冲液包括约1到20%的甘油。在一些实施例中,重折叠缓冲液包括约10%甘油。在一些实施例中,重折叠缓冲液包括约0.1到50mMGSH(还原型谷胱甘肽)。在一些实施例中,重折叠缓冲液包括约5mM GSH(还原型谷胱甘肽)。在一些实施例中,重折叠缓冲液包括约0.1到50mM GSSG(氧化型谷胱甘肽))。在一些实施例中,重折叠缓冲液包括约1mM GSSG(氧化型谷胱甘肽))。在示例性实施例中,重折叠缓冲液包括50mM磷酸盐、500mM NaCl、10%甘油、5mM GSH(还原型谷胱甘肽)和1mM GSSG(氧化型谷胱甘肽))。在一些实施例中,重折叠缓冲液的pH值介于约5.0和8.0之间。在一些实施例中,重折叠缓冲液的pH值为7.5。
在一个示例性实施例中,使用跨超滤/渗滤(UFDF)膜的三个TTF步骤来重折叠含MYC多肽。在一个示例性实施例中,第一重折叠步骤涉及在整个约120分钟的过程中更换重折叠缓冲液1(例如,3M尿素、50mM磷酸盐、500mM NaCl、10%甘油、5mM GSH(还原型谷胱甘肽)、1mM GSSG(氧化型谷胱甘肽))。在一些实施例中,第二重折叠步骤涉及在大约120分钟的过程中更换重折叠缓冲液2(1.5M尿素、50mM磷酸盐、500mM NaCl、10%甘油、5mM GSH(还原型谷胱甘肽)、1mM GSSG(氧化型谷胱甘肽)),然后是约120分钟的再循环。在一些实施例中,第三重折叠步骤涉及在大约120分钟的过程中更换重折叠缓冲液3(50mM磷酸盐、500mMNaCl、10%甘油、5mM GSH(还原型谷胱甘肽)、1mM GSSG(氧化型谷胱甘肽)),然后是12小时的再循环。
在最终重折叠步骤完成后,可以通过0.2μm膜过滤最终重折叠溶液,并调节蛋白质浓度。
在重折叠之后,纳米颗粒调配物含有具有宽范围尺寸和稳定性的纳米颗粒。因此,在一些实施例中,在第三重折叠步骤之后进行温育步骤或平衡步骤。例如,在一些实施例中,将重折叠的含MYC多肽保持在第三重折叠缓冲液中一段时间,所述时间足以产生数均直径介于约80nm和约150nm之间的生物活性纳米颗粒。不受理论束缚,据信平衡步骤允许纳米颗粒调配物平衡成具有更窄尺寸范围和更多稳定性的稳定纳米颗粒。在一些实施例中,这些稳定的纳米颗粒的数均直径介于约80nm和约150nm之间。在一些实施例中,平衡步骤进行至少5、6、7、8、9、10、11或12小时或更长的时间长度。在示例性实施例中,平衡步骤进行至少或约10-12小时。在示例性实施例中,平衡步骤涉及在第三重折叠缓冲液中轻柔地搅拌重折叠的含MYC多肽的纳米颗粒调配物。在示例性实施例中,平衡步骤涉及以小于1000rpm的速度在第三重折叠缓冲液中搅拌含MYC多肽的调配物。
在一些实施例中,进行最终重折叠缓冲液3的另外的更换以将重折叠缓冲液更换为适于施用的调配物缓冲液(例如,适于注射的缓冲液)。在示例性实施例中,针对合适的调配物缓冲液透析重折叠缓冲液3中的重折叠的TAT-MYC。在示例性实施例中,使用跨超滤/渗滤(UFDF)膜的TFF透析重折叠缓冲液3中的重折叠的TAT-MYC。在示例性实施例中,调配物缓冲剂包括缓冲剂。在示例性实施例中,缓冲剂选自磷酸钠、磷酸钾、组氨酸和柠檬酸盐。
在示例性实施例中,重折叠的TAT-MYC在pH值介于5.5和8.0之间的调配物中是稳定的。在示例性实施例中,重折叠的TAT-MYC在pH值介于6.0和8.0之间的调配物中是稳定的。在示例性实施例中,重折叠的TAT-MYC在pH值为约6.0、约6.5、约7.0、约7.5或约8.0的调配物中是稳定的。在示例性实施例中,重折叠的TAT-MYC在pH值为约pH 7.5的调配物中是稳定的。在示例性实施例中,重折叠的TAT-MYC在约pH 7.5+/-pH 0.3的调配物中是稳定的。
在示例性实施例中,重折叠的TAT-MYC在同渗容摩大于300mOsm的调配物中是稳定的。在示例性实施例中,重折叠的TAT-MYC在同渗容摩大于400mOsm的调配物中是稳定的。在示例性实施例中,重折叠的TAT-MYC在同渗容摩介于300mOsm和1000mOsm之间(例如,介于400mOsm和800mOsm之间)的调配物中是稳定的。
在示例性实施例中,重折叠的TAT-MYC在包括大于100mM NaCl的调配物中是稳定的。在示例性实施例中,重折叠的TAT-MYC在包括大于150mM NaCl的调配物中是稳定的。在示例性实施例中,重折叠的TAT-MYC调配物的NaCl浓度为约150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mM或550mM NaCl。在示例性实施例中,重折叠的TAT-MYC调配物的NaCl浓度为约500mM+/-50mM NaCl。
在一些实施例中,重折叠的TAT-MYC可以储存至约1.2mg/mL的浓度。如本文使用,关于储存条件的“稳定性”是指相较于在储存之前的重折叠的TAT-MYC的MYC生物活性,重折叠的TAT-MYC在储存之后保留至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多的其MYC生物活性的能力。在一些实施例中,重折叠的TAT-MYC在-80℃下稳定长达2年。在一些实施例中,一旦解冻,重折叠的TAT-MYC在4℃下储存长达1个月时是稳定的。在示例性实施例中,一旦解冻,重折叠的TAT-MYC在4℃下储存长达2个月时是稳定的。在示例性实施例中,一旦解冻,重折叠的TAT-MYC在4℃下储存长达3个月时是稳定的。在示例性实施例中,一旦解冻,重折叠的TAT-MYC在4℃下储存长达4个月时是稳定的。在示例性实施例中,一旦解冻,重折叠的TAT-MYC在4℃下储存长达5个月时是稳定的。在示例性实施例中,一旦解冻,重折叠的TAT-MYC在4℃下储存长达6个月或更长时是稳定的。在示例性实施例中,一旦解冻,重折叠的TAT-MYC在4℃下储存长达100天或更长时是稳定的。因此,与野生型MYC多肽的稳定性相比,本文提供的重折叠的TAT-MYC的稳定性显著增加,所述野生型MYC多肽具有大约34分钟的半衰期(卡普丁(Kaptein)等人(1996年),JBC,271,18875-18884)。
C.纳米颗粒尺寸
本技术的纳米颗粒的尺寸和质量可以通过本领域熟知的方法确定。作为实例而非限制,此些方法包含尺寸排阻色谱、高效液相色谱、动态光散射、纳米颗粒跟踪分析和电子显微镜检查。
在一些实施例中,调配物中纳米颗粒的平均粒度介于约70nm和约140nm之间,例如介于70nm和140nm之间。在一些实施例中,调配物中纳米颗粒的平均粒度介于约80nm和约120nm之间,例如介于80nm和120nm之间。在一些实施例中,调配物中纳米颗粒的平均粒度介于约80nm和约110nm之间,例如介于80nm和110nm之间。在一些实施例中,调配物中纳米颗粒的平均粒度介于约80nm和约90nm之间,例如介于80nm和90nm之间。在一些实施例中,调配物中纳米颗粒的平均粒度为约84nm或84nm。在一些实施例中,调配物中纳米颗粒的平均粒度介于约100nm和约120nm之间,例如介于100nm和120nm之间。在一些实施例中,调配物中纳米颗粒的平均粒度为约111nm或111nm。
在一些实施例中,调配物中颗粒的平均分子量为约103-107道尔顿,例如103-107道尔顿。在一些实施例中,调配物中颗粒的平均分子量为约104-107道尔顿,例如104-107道尔顿。在一些实施例中,调配物中颗粒的平均分子量为约105-107道尔顿,例如105-107道尔顿。在一些实施例中,调配物中颗粒的平均分子量为约106-107道尔顿,例如106-107道尔顿。在一些实施例中,调配物中颗粒的平均分子量为约2x106或2x106道尔顿。
在一些实施例中,组合物中小于约0.01%或小于0.01%的纳米颗粒具有大于200nm、大于300nm、大于400nm、大于500nm、大于600nm、大于700nm或大于800nm的粒度。在一些实施例中,组合物中小于约0.001%的纳米颗粒具有大于200nm、大于300nm、大于400nm、大于500nm、大于600nm、大于700nm或大于800nm的粒度。在一些实施例中,组合物中小于约0.01%或小于0.01%的纳米颗粒具有大于800nm的粒度。在一些实施例中,组合物中小于约0.001%或小于0.001%的纳米颗粒具有大于800nm的粒度。
在一些实施例中,调配物中小于约0.01%或小于0.01%的纳米颗粒具有小于80nm、小于70nm、小于60nm、小于50nm、小于40nm、小于30nm、小于20nm或小于10nm的粒度。在一些实施例中,组合物中小于约0.001%或小于0.001%的纳米颗粒具有小于80nm、小于70nm、小于60nm、小于50nm、小于40nm、小于30nm、小于20nm或小于10nm的粒度。在一些实施例中,组合物中小于约0.01%或小于0.01%的纳米颗粒具有小于50nm的粒度。在一些实施例中,组合物中小于约0.001%或小于0.001%的纳米颗粒具有小于50nm的粒度。
D.MYC融合蛋白
在一些实施例中,含MYC多肽的生物活性纳米微粒组合物包括MYC融合蛋白。在一些实施例中,MYC融合蛋白包括蛋白转导结构域、促进细胞存活或增殖中的一或多种的MYC多肽、和任选的蛋白质标签结构域,例如有助于融合蛋白纯化的一或多种氨基酸序列。在一些实施例中,与MYC多肽(例如,本技术的纳米颗粒调配物)接触的细胞表现出增加的存活时间(例如,相较于未与MYC接触的相同类型的相同或相似的细胞),和/或或增加的增殖(例如,相较于未与MYC接触的相同类型的相同或相似的细胞)。
在一些实施例中,融合蛋白包括(a)蛋白转导结构域;(b)MYC多肽序列。在一些实施例中,融合肽是式(I)的肽:
蛋白转导结构域-MYC多肽序列。
在一些实施例中,本文公开的融合肽包括(a)蛋白转导结构域;(b)MYC多肽序列;(c)一或多个连接蛋白转导结构域和MYC多肽序列的分子。在一些实施例中,融合肽是式(II)的肽:
蛋白转导结构域-X-MYC多肽序列,
其中-X-是连接蛋白转导结构域和MYC多肽序列的分子。在一些实施例中,-X-是至少一个氨基酸。
在一些实施例中,本文公开的融合肽包括(a)蛋白转导结构域;(b)MYC多肽序列;(c)至少两个蛋白质标签;和(d)任选的连接子。在一些实施例中,融合肽是式(III-VI)的肽:
蛋白转导结构域-X-MYC多肽序列-X-蛋白质标签1-X-蛋白质标签2(式(III)),或
蛋白转导结构域-MYC多肽序列-X-蛋白质标签1-X-蛋白质标签2(式(IV)),或
蛋白转导结构域-MYC多肽序列-蛋白质标签1-X-蛋白质标签2(式(V)),或
蛋白转导结构域-MYC多肽序列-蛋白质标签1-蛋白质标签2(式(VI)),
其中-X-是连接子。在一些实施例中,-X-是一或多个氨基酸。
在一些实施例中,本文公开的融合肽包括(a)蛋白转导结构域;(b)MYC多肽序列;(c)6-组氨酸标签;(d)V5表位标签:和(e)任选的连接子。在一些实施例中,融合肽是式(VII-XIV)的肽:
蛋白转导结构域-X-MYC多肽序列-X-6-组氨酸标签-X-V5表位标签(式(VII)),或
蛋白转导结构域-MYC多肽序列-X-6-组氨酸标签-X-V5表位标签(式(VIII)),或
蛋白转导结构域-MYC多肽序列-6-组氨酸标签-X-V5表位标签(式(IX)),或
蛋白转导结构域-MYC多肽序列-6-组氨酸标签-V5表位标签(式(X)),
蛋白转导结构域-X-MYC多肽序列-X-V5表位标签-X-6-组氨酸标签(式(XI)),或
蛋白转导结构域-MYC多肽序列-X-V5表位标签-X-6-组氨酸标签(式(XII)),或
蛋白转导结构域-MYC多肽序列-V5表位标签-X-6-组氨酸标签(式(XIII)),或
蛋白转导结构域-MYC多肽序列-V5表位标签-6-组氨酸标签(式(XIV)),
其中-X-是连接子。在一些实施例中,-X-是一或多个氨基酸。
如上所述,在一些实施例中,MYC融合蛋白包括一或多个连接子序列。连接子序列可以用于连接融合蛋白的蛋白转导结构域、MYC多肽序列、V5表位标签和/或6-组氨酸标签。在一些实施例中,连接子包括一或多个氨基酸。在一些实施例中,连接子的氨基酸序列包括KGELNSKLE(SEQ ID NO:11)。在一些实施例中,连接子包括氨基酸序列RTG。
1.蛋白转导结构域(PTD)
在一些实施例中,MYC融合蛋白包含蛋白转导结构域。肽转运提供了将小分子、蛋白质或核酸跨细胞膜递送到细胞的细胞内区室的替代方案。一个非限制性实例和充分表征的蛋白转导结构域(PTD)是TAT衍生肽。弗兰克尔(Frankel)等人(参见例如美国专利第5,804,604号、美国专利第5,747,641号、美国专利第5,674,980号、美国专利第5,670,617号和美国专利第5,652,122号)证明了通过将含有TAT的氨基酸48-57的肽与货物蛋白质缀合来将货物蛋白质(β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶)转运到细胞中。在一些实施例中,TAT蛋白转导结构域包括氨基酸序列MRKKRRQRRR(SEQ ID NO:7)。
PTD的另一个非限制性实例是穿透蛋白(penetratin)。穿透蛋白可以跨细胞膜转运亲水性大分子(德罗西(Derossi)等人,细胞生物学趋势(Trends Cell Biol.),8:84–87(1998),其通过引用整体并入本文)。穿透蛋白是16个氨基酸的肽,其对应于触角足(其是由培养物中的细胞内化的果蝇转录因子)的同源域的氨基酸43-58。
PTD的另一个非限制性实例是VP22。VP22是来自单纯疱疹病毒1型(HSV-1)的皮层蛋白,具有跨细胞膜转运蛋白质和核酸的能力(埃利奥特(Elliot)等人,细胞(Cell),88:223–233,1997,其通过引用整体并入本文)。VP22的残基267-300是必需的,但可能不足以进行转运。因为尚未标识出负责转运功能的区域,所以通常使用整个VP22蛋白来跨细胞膜转运货物蛋白质和核酸(施瓦策(Schwarze)等人,药理学趋势(Trends Pharmacol Sci),21:45–48,2000)。
在一些实施例中,MYC融合多肽包含蛋白转导结构域。作为实例而非限制,在一些实施例中,蛋白转导结构域包括TAT、穿透蛋白、VP22、vpr、EPTD、R9、R15、VP16和触角足中的一或多种的蛋白转导结构域。在一些实施例中,蛋白转导结构域包括TAT、穿透蛋白、VP22、vpr和EPTD中的一或多种的蛋白转导结构域。在一些实施例中,蛋白转导结构域包括TAT、穿透蛋白、VP22、vpr、EPTD、R9、R15、VP16和触角足中的至少一种的蛋白转导结构域。在一些实施例中,蛋白转导结构域包括合成蛋白转导结构域(例如,聚精氨酸或PTD-5)。在特定实施例中,蛋白转导结构域包括TAT蛋白转导结构域。在一些实施例中,蛋白转导结构域与MYC多肽共价连接。在一些实施例中,蛋白转导结构域经由肽键与MYC多肽连接。在一些实施例中,蛋白转导结构域经由连接子序列与MYC多肽连接。在一些实施例中,连接子包括短氨基酸序列。作为实例而非限制,在一些实施例中,连接子序列的长度为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸。
本技术的MYC融合蛋白可以以任何期望顺序排列。例如,在一些实施例中,MYC融合蛋白可以按以下顺序排列:a)与MYC多肽框内连接的蛋白转导结构域,b)与V5结构域框内连接的MYC多肽,和c)与6-组氨酸表位标签框内连接的V5结构域。在一些实施例中,MYC融合蛋白具有以下顺序的组分:a)与蛋白转导结构域框内连接的MYC多肽,b)与V5结构域框内连接的蛋白转导结构域,和c)与6-组氨酸表位标签框内连接的V5结构域。在一些实施例中,可以在每个序列之间包含另外的氨基酸序列。在一些实施例中,可以在多肽序列的起始和/或末端处包含另外的氨基酸。
在一些实施例中,蛋白转导结构域是TAT蛋白转导结构域。在一些实施例中,蛋白转导结构域是TAT[48-57]。在一些实施例中,蛋白转导结构域是TAT[57-48]。
2.蛋白质标签结构域
在一些实施例中,MYC融合蛋白包括蛋白质标签结构域,其包括有助于融合蛋白纯化的一或多个氨基酸序列。在一些实施例中,蛋白质标签结构域包括多组氨酸标签和表位标签中的一或多种。作为实例而非限制,示例性标签包含V5、组氨酸标签(例如,6-组氨酸标签)、HA(血凝素)标签、FLAG标签、CBP(钙调蛋白结合肽)、CYD(共价但可解离的NorpD肽)、Strepll或HPC(蛋白C的重链)中的一或多种。在一些实施例中,蛋白质标签结构域包括约10到20个氨基酸的长度。在一些实施例中,蛋白质标签结构域包括2到40个氨基酸的长度,例如6-20个氨基酸的长度。在一些实施例中,以上列出的标签中的两个(例如,V5和his-标签)一起使用以形成蛋白质标签结构域。
在一些实施例中,组氨酸标签是6-组氨酸标签。在一些实施例中,组氨酸标签包括序列HHHHHH。在一些实施例中,本文公开的融合肽包括V5表位标签。在一些实施例中,V5标签包括氨基酸序列:GKPIPNPLLGLDST。在一些实施例中,V5标签包括氨基酸序列IPNPLLGLD。
可以通过任何合适的方法将蛋白质标签加入到本文公开的融合蛋白中。作为实例而非限制,在一些实施例中,将TAT-MYC多肽序列克隆到编码一或多种蛋白质标签(例如,多His-标签和/或V5标签)的表达载体中。在一些实施例中,通过PCR加入多组氨酸标签和/或V5标签(即,PCR引物包括多组氨酸序列和/或V5序列)。
C.MYC融合肽的构建
本文公开的MYC融合肽(例如,TAT-MYC融合肽)可以通过本领域熟知的方法构建。作为实例而非限制,可以通过PCR生成编码TAT-MYC融合肽的核苷酸序列。在一些实施例中,人MYC序列的正向引物包括TAT蛋白转导结构域的框内N-末端9-氨基酸序列(例如,RKKRRQRRR)。在一些实施例中,设计人MYC序列的反向引物以去除终止密码子。在一些实施例中,将PCR产物克隆到任何合适的表达载体中。在一些实施例中,表达载体包括多组氨酸标签和V5标签。
在一些实施例中,本文公开的融合肽包括(a)TAT和(b)c-MYC。在一些实施例中,本文公开的融合肽包括(a)TAT[48-57]和(b)c-MYC。在一些实施例中,本文公开的融合肽包括(a)TAT[57-48]和(b)c-MYC。
在一些实施例中,本文公开的融合肽包括(a)TAT,(b)c-MYC,(c)连接子,(d)V5标签和(e)6-组氨酸标签。在一些实施例中,本文公开的融合肽包括(a)TAT[48-57],(b)c-MYC,(c)连接子,(d)V5标签和(e)6-组氨酸标签。在一些实施例中,本文公开的融合肽包括(a)TAT[57-48],(b)c-MYC,(c)连接子,(d)V5标签和(e)6-组氨酸标签。
在一些实施例中,MYC融合肽的MYC部分包括如本文所述的任何MYC多肽。在一些实施例中,MYC融合肽的MYC部分包括MYC多肽序列,所述MYC多肽序列包括如下所示的序列:
PLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTELLGGDMVNQSFICDPDDETFIKNIIIQDCMWSGFSAAAKLVSEKLASYQAARKDSGSPNPARGHSVCSTSSLYLQDLSAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCASQDSSAFSPSSDSLLSSTESSPQGSPEPLVLHEETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSESGSPSAGGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQISNNRKCTSPRSSDTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLR(SEQ ID NO:4)。
在一些实施例中,MYC融合肽包括SEQ ID NO:1。在一些实施例中,MYC-融合肽是SEQ ID NO:1。
MRKKRRQRRRPLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTELLGGDMVNQSFICDPDDETFIKNIIIQDCMWSGFSAAAKLVSEKLASYQAARKDSGSPNPARGHSVCSTSSLYLQDLSAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCASQDSSAFSPSSDSLLSSTESSPQGSPEPLVLHEETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSESGSPSAGGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQISNNRKCTSPRSSDTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLRKGELNSKLEGKPIPNPLLGLDSTRTGHHHHHH(SEQ ID NO:1)。
在一些实施例中,MYC融合肽的MYC部分包括MYC多肽序列,所述MYC多肽序列包括如下所示的序列:
PLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTELLGGDMVNQSFICDPDDETFIKNIIIQDCMWSGFSAAAKLVSEKLASYQAARKDSGSPNPARGHSVCSTSSLYLQDLSAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCASQDSSAFSPSSDSLLSSTESSPQASPEPLVLHEETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSESGSPSAGGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQISNNRKCTSPRSSDTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEKDLLRKRREQLKHKLEQLR(SEQ ID NO:9)。
在一些实施例中,MYC融合肽包括SEQ ID NO:10;在一些实施例中,MYC-融合肽是SEQ ID NO:10。
MRKKRRQRRRPLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTELLGGDMVNQSFICDPDDETFIKNIIIQDCMWSGFSAAAKLVSEKLASYQAARKDSGSPNPARGHSVCSTSSLYLQDLSAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCASQDSSAFSPSSDSLLSSTESSPQASPEPLVLHEETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSESGSPSAGGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQISNNRKCTSPRSSDTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEKDLLRKRREQLKHKLEQLRKGELNSKLEGKPIPNPLLGLDSTRTGHHHHHH(SEQ ID NO:10)。
可以在合成期间或之后修饰融合蛋白以包含一或多个官能团。作为实例而非限制,可以修饰蛋白质以包含乙酰基、磷酸根、乙酸根、酰胺基、烷基和/或甲基基团中的一或多种。本列表不是详尽的,而仅是示例性的。在一些实施例中,蛋白质包含至少一个乙酰基基团。
III.使用本技术调配物的方法
本技术的组合物(例如,包括被配制成生物活性稳定纳米颗粒的含MYC多肽的组合物)提供MYC活性,因此可用于体内(例如,作为佐剂、免疫系统增强剂等)和体外(例如,刺激干细胞(例如,造血干细胞(HSC))的生长和增殖,以调节HSC以在造血干细胞移植后增强植入,诱导或增强免疫细胞的活化、生长、增殖、活力或存活,和/或增强由培养物中免疫细胞进行的抗体产生等)。
仅作为实例而非限制,本技术的含MYC纳米颗粒组合物可以用于引发用于移植的供体HSC(例如,患者的分离的HSC或第三方供体的HSC),例如用于患有免疫相关疾病或病症(例如但不限于严重联合免疫缺陷)的患者。
严重联合免疫缺陷(SCID)是一种危及生命的原发性免疫缺陷疾病,由损害T细胞和B细胞数量和功能的缺陷引起。患有SCID的婴儿受反复危及生命的感染之苦,其通常在三到六个月大之前进行诊断。如果未治疗,儿童会在2岁之前继续经历严重的危及生命的感染和死亡。目前使用被涉及成重建正常免疫系统的HSCT来治疗患有SCID的儿童。对于在患有严重感染之前进行移植的最年幼的婴儿(大多数这些婴儿或是先证者的兄弟姐妹或通过新生儿筛查程序标识出)和使用人白细胞抗原(HLA)匹配的家属供体的患者,这些移植的结果是最佳的。相比之下,对年龄较大的婴儿进行移植的结果和使用来自替代供体的细胞进行移植的结果不太有利。
在一些实施例中,对于使用技术的含MYC纳米微粒组合物的人,离体温育(“引发”)T细胞和B细胞耗尽的供体造血细胞(包含造血干细胞和祖细胞(HSPC))。温育后,洗涤引发的细胞并移植到患者体内。供体细胞与本技术的组合物一起温育增加了移植后长期自我更新的造血干细胞的增殖。
在一些实施例中,从患者分离供体造血细胞。在一些实施例中,将供体造血细胞与本技术的纳米颗粒含MYC组合物一起温育30分钟、60分钟、90分钟或120分钟。在一些实施例中,供体造血细胞与10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml或100μg/ml本技术的纳米颗粒含MYC组合物一起温育。在一些实施例中,将细胞与50μg/ml纳米颗粒含MYC组合物一起温育60分钟。在一些实施例中,组合物的纳米颗粒具有介于约80和150nm之间、介于约90和140nm之间、介于约100和120nm之间或介于约100和110nm之间的平均粒度,并且包括SEQ ID NO:1。在一些实施例中,组合物的纳米颗粒具有介于约80和150nm之间、介于约90和140nm之间、介于约100和120nm之间或介于约100和110nm之间的平均粒度,并且包括SEQ ID NO:10。
对于体内使用,在一些实施例中,包含本文所述的纳米颗粒含MYC蛋白和任选的一或多种另外的治疗性化合物和任选的一或多种药学上可接受的赋形剂的药物调配物以任何方式施用于个体,所述方式包含多种施用途径中的一或多种,例如,作为非限制性实例,口服、肠胃外(例如,静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内),鼻内、口腔、局部、直肠或透皮施用途径。本文所述的药物调配物包含但不限于水性液体分散体、自乳化分散体、固体溶液、脂质体分散体、气溶胶、固体剂型、粉末、速释调配物、控释调配物、快速熔融调配物、片剂、胶囊、丸剂、延释调配物、缓释调配物、脉冲释放调配物、多颗粒调配物以及混合速释和控释调配物。药物调配物的概述见于例如雷明顿:药学的科学与实践(Remington:The Science andPractice of Pharmacy),第十九版(伊斯顿,宾夕法尼亚州:麦克出版公司(MackPublishing Company),1995年);胡佛,约翰E.(Hoover,John E.),雷明顿药学(Remingtonis Pharmaceutical Sciences),麦克出版公司,伊斯顿,宾夕法尼亚州,1975年;利伯曼,H.A.(Liberman,H.A.)和拉赫曼,L.(Lachman,L.)编辑,药物剂型(Pharmaceutical DosageForms),马塞尔德克尔(Marcel Decker),纽约,纽约州,1980年;和药物剂型和药物递送系统(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems),第七版(利平科特威廉姆斯及威尔金斯(Lippincott Williams&Wilkins),1999年)中。
在一些实施例中,本文提供的纳米颗粒调配物包括合适的缓冲剂。示例性缓冲剂包含但不限于Tris、磷酸钠、磷酸钾、组氨酸或柠檬酸盐基缓冲剂。在一些实施例中,本文提供的调配物含有镁。在一些实施例中,本文提供的调配物含有一或多种表面活性剂。如本文使用,术语“表面活性剂”可以包含药学上可接受的赋形剂,其用于保护蛋白质调配物免受机械应力(如搅拌和剪切)的影响。药学上可接受的表面活性剂的实例包含聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯(Tween)、聚氧乙烯烷基醚(Brij)、烷基苯基聚氧乙烯醚(Triton-X)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(Poloxamer,Pluronic)和十二烷基硫酸钠(SDS)。合适的表面活性剂包含聚氧乙烯山梨糖醇酐-脂肪酸酯,例如聚山梨醇酯20(以商标Tween 销售)和聚山梨醇酯80(以商标Tween 销售)。合适的聚乙烯-聚丙烯共聚物是以名称F68或Poloxamer 销售的那些。合适的聚氧乙烯烷基醚是以商标销售的那些。合适的烷基酚聚氧乙烯醚以商品名Triton-X销售。当使用聚山梨醇酯20(Tween )和聚山梨醇酯80(Tween )时,它们通常以约0.001到约1%、约0.005到约0.2%和约0.01%到约0.1%w/v(重量/体积)的浓度范围使用。
在一些实施例中,本文提供的纳米颗粒调配物包括稳定剂。如本文使用,术语“稳定剂”可以包含药学上可接受的赋形剂,其在制造、储存和应用期间保护活性药物成分和/或调配物免受化学和/或物理降解的影响。克莱兰(Cleland)等人,治疗性药物载剂系统的总要评论(Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.),70(4):307-77(1993);王(Wang),国际药剂学杂志(Int.J.Pharm.),7S5(2):129-88(1999);王,国际药剂学杂志,203(1-2):1-60(2000);和迟等人,药物研究(Pharm.Res.),20(9):1325-36(2003)综述了蛋白质药物的化学和物理降解途径。稳定剂包含但不限于糖、氨基酸、多元醇、环糊精(例如,羟丙基-β-环糊精、磺丁基乙基-β-环糊精、β-环糊精)、聚乙二醇(例如,PEG 3000、PEG 3350、PEG4000、PEG6000)、白蛋白、人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、盐(例如,氯化钠、氯化镁、氯化钙)、螯合剂(例如,下文定义的EDTA)。如上文所述,稳定剂在调配物中的存在量可以为约10到约500mM,约10到约300mM或约100mM到约300mM。
在一些实施例中,包含本文所述的融合肽纳米颗粒的组合物的每日剂量为约0.001到1000.0mg/kg体重,例如约0.01到100.0mg/kg体重,例如约0.1到10.0mg/kg体重。上述范围仅仅是提示性的,因为关于个体治疗方案的变量的数量很大,并且与这些推荐值的极大偏差并不罕见。在一些实施例中,此些剂量任选地根据多个变量而改变,不限于所使用的本文所述的药剂或组合物的活性、待治疗的病症或病状、施用方式、个体受试者的要求、所治疗的病症或病状的严重度以及从业者的判断。
在细胞培养物或实验动物中任选地确定此些治疗方案的毒性和治疗功效,包含但不限于LD50(对50%群体致死的剂量)和ED50(50%群体中治疗有效的剂量)的确定。毒性和治疗性效果之间的剂量比是治疗指数,其被表示为LD50和ED50之比。优选表现出高治疗指数的本文所述的药剂或组合物。从细胞培养测定和动物研究获得的数据任选地用于配制用于人的一系列剂量。此本文所述的药剂或组合物的剂量优选地在包含具有最小毒性的ED50的循环浓度范围内。剂量任选地在本范围内变化,这取决于所使用的剂型和所利用的施用途径。
VII.实例
以下实例仅用于说明目的,并且是非限制性实施例。鉴于上述教导,本公开的许多修改、等同物和变化是可能的,因此,应当理解,在所附权利要求的范围内,本公开可以不同于具体描述的方式实践。
实例1:本技术的TAT-MYC融合肽的构建
质粒pTAT-MYC-V5-6xHis是通过使用正向引物和反向引物进行人MYC的编码区域的PCR扩增来制造的,所述正向引物含有HIV-1的TAT蛋白转导结构域的框内N-末端10-氨基酸序列(MRKKRRQRRR(SEQ ID NO:7),并且所述反向引物去除终止密码子。将PCR产物克隆到pET101/D-Topo(Invitrogen)载体中,其包含C末端V5表位标签和6-组氨酸蛋白质标签。
A.用于蛋白质表达的细菌菌株
通过用从BL21Rosetta细胞(诺凡基(Novagen))分离的pRARE(CamR)转化BL-21StarTM大肠杆菌菌株(英杰公司)来建立BL-21RARE细胞,其表达AGG、AGA、AUA、CUA、CCC、GGA密码子的tRNA。
B.蛋白质诱导和纯化
为了制备发酵罐接种物,将TAT-MYC主细胞库(MCB)的小瓶解冻,并用其接种含有LB培养基且补充有抗生素(40μg/mL卡那霉素)的摇瓶,以用于选择。将细胞在定轨摇床/培养箱中扩增十四到十六小时。然后使用扩增的培养物来接种发酵罐培养物。当细胞处于对数生长期(OD为约4.0)时,通过向培养物中加入IPTG(~0.5-1mM)在37℃下诱导发酵。诱导细胞直至观察到DO(溶解氧)峰值,大约3-6个小时。诱导后,通过离心收获细胞糊(paste),并将其在-70℃或更低温度下储存直至进一步处理。包涵体中含有的大部分蛋白质是TAT-MYC。
将细胞糊重悬于8M尿素、50mM磷酸盐pH 7.5中。将混悬液在室温下混合直至均质。然后将混悬液通过均质器。然后调节经均质的混悬液以包含200mM亚硫酸钠和10mM连四硫酸钠。将溶液在室温下混合直至均质。将磺酰化的裂解物在2-8℃下混合≥12小时。然后将磺酰化的裂解物离心一小时。收集上清液并弃去团块。将上清液通过0.22μm膜过滤器。
使用Ni-树脂通过Ni亲和色谱纯化磺酰化的TAT-MYC溶液。将柱在6M尿素、50mM磷酸盐、500mM NaCl和10%甘油溶液中平衡。然后将磺酰化和澄清的TAT-MYC加载到柱上。用6M尿素、50mM磷酸盐、10%甘油、500mM NaCl(pH 7.5)洗涤柱。然后用6M尿素、50mM磷酸盐、10%甘油和2M NaCl(pH 7.5)洗涤柱,接着用6M尿素、50mM磷酸盐、10%甘油、50mM NaCl和30mM咪唑(pH 7.5)进行另一次洗涤。通过以100到300mM咪唑的梯度运行含有6M尿素、50mM磷酸盐、10%甘油和50mM NaCl(pH 7.5)的洗脱缓冲液并收集馏分来从柱洗脱产物。将待合并的含蛋白质馏分通过0.22μm膜过滤,并使用UV280测量蛋白质浓度。
来自Ni-琼脂糖凝胶色谱步骤的合并级分使用Q-琼脂糖凝胶树脂通过阴离子交换色谱进一步纯化。通过用来自Ni琼脂糖凝胶色谱步骤的第二洗涤缓冲液(6M尿素、50mM磷酸盐、10%甘油、2M NaCl,pH 7.5)稀释至Q琼脂糖凝胶缓冲液的电导率(17.52+/-1mS/cm)来制备合并物,以用于上样到柱上。然后将稀释的合并物上样到柱上,接着使用6M尿素、50mM磷酸盐、300mM NaCl和10%甘油进行两个追加步骤,并且进一步追加直至UV迹线达到基线。
实例2.纳米颗粒TAT-MYC组合物的制备
利用UFDF(超滤/渗滤)膜使用基于切向流过滤的重折叠方法完成来自实例1的Q-琼脂糖凝胶流通合并物中的TAT-MYC蛋白的重折叠。重折叠过程包含一系列三个重折叠步骤。第一重折叠步骤涉及在约120分钟的过程中更换重折叠缓冲液1(3M尿素、50mM磷酸盐、500mM NaCl、10%甘油、5mM GSH(还原型谷胱甘肽)、1mM GSSG(氧化型谷胱甘肽))。第二重折叠步骤涉及在大约120分钟的过程中更换重折叠缓冲液2(1.5M尿素、50mM磷酸盐、500mMNaCl、10%甘油、5mM GSH(还原型谷胱甘肽)、1mM GSSG(氧化型谷胱甘肽)),然后是约120分钟的再循环。第三重折叠步骤由在大约120分钟的过程中更换重折叠缓冲液3(50mM磷酸盐、500mM NaCl、10%甘油、5mM GSH(还原型谷胱甘肽)、1mM GSSG(氧化型谷胱甘肽))组成,然后是12小时的再循环。在第三重折叠步骤完成后,将重折叠3溶液通过0.2μm膜过滤,并调节蛋白质浓度。
与牛血清白蛋白的标准曲线相比,通过布拉德福德(Bradford)蛋白质测定(Sigma)测量SEQ ID NO:1的TAT-MYC融合体的蛋白质浓度。
根据所述方法制备几批重折叠的TAT-MYC。出于这些实例的目的,所提供的批次被称为“F01”、“C2A”、“C2B”、“C6”、“C7”、“C12”、“C13”和“C14”。每个测试的批次含有50mM磷酸盐、500mM NaCl、10%甘油、5mM GSH(还原型谷胱甘肽)、1mM GSSG(氧化型谷胱甘肽),其在用重折叠缓冲液3进行第三重折叠步骤之后获得,C2A调配物除外,其另外含有精氨酸。
重折叠的TAT-MYC对pH敏感,并且在pH 7.5+/-pH 0.3的调配物中是稳定的。重折叠的TAT-MYC还对NaCl浓度敏感,并且在约500mM+/-50mM NaCl下稳定。重折叠的TAT-MYC还稳定至浓度为1.2mg/mL。重折叠的TAT-MYC在-80℃下稳定长达或约2年。一旦解冻,它在4℃下储存时保持活性长达或约一个月。
实例3.纳米颗粒TAT-MYC组合物的功能分析
如下测试TAT-MYC组合物的活性。
从C57BL/6j(Jackson)小鼠收获脾脏,并通过金属丝网机械解离。去除红细胞,使用市售的分离工艺(Dynabead)分离CD4阳性T细胞,用1μg/ml抗CD3和抗CD28抗体活化T细胞。将细胞在1ml培养基中以每孔1.5x106个细胞接种于48孔簇培养皿中。24小时后,将TAT-MYC调配物加入细胞中(每孔总共12μg)并温育24小时。加入蛋白质24小时后,更换培养基并将细胞培养48小时。经由流式细胞术(正向x侧散射)在初始活化后96小时评估细胞的活力。C2A(根据实例2制备)的结果示出在图1中。
图1A(左图)示出了未治疗的活化T细胞的增殖(12.8)。图1B(右图)示出了用6μgTAT-MYC调配物C2A治疗24小时的活化T细胞的增殖。如图所示,C2A治疗的T细胞增殖不止翻倍。
出于这些实例的目的,TAT-MYC的活性制剂、组合物、调配物或级分是与对照T细胞相比提供至少2倍的T细胞增殖增加的那种。
表1
TAT-MYC样品 | 治疗:未治疗之比 |
阳性对照 | 2.0 |
R147 | 1.1 |
R149 | 1.5 |
C12 | 2.0 |
C13 | 2.7 |
实例4:纳米颗粒调配物的表征
如实例2中所述制备并如实例3所述测试生物活性的纳米颗粒TAT-MYC蛋白的组合物使用几种不同的技术表征,以证明(a)通过本技术的方法制备的TAT-MYC蛋白令人惊讶地并且意外地形成具有离散尺寸范围的纳米颗粒;(b)在本范围内只有一小部分纳米颗粒具有生物活性,例如具有MYC活性;(c)活性与粒度和一或多个翻译后修饰有关。
A.功能性调配物的稳定性
通过非对称流场流分离(AF4)和多角度激光散射(MALLS)在两个不同温度下评价两种不同的TAT-MYC蛋白调配物(被称为F01和F02),以提供关于样品中的所有组分的质量和尺寸分布的信息。根据实例2重折叠F01。如下所讨论制备F02。AF4-MALLS分析示出了F01主要包含具有离散尺寸范围的单个颗粒群,并且粒度随时间且在不同温度下是稳定的。
如上所述,根据实例2的方法制备F01。如实例1B中所述制备F02。重折叠后,将F02移至F01调配物,从50mM磷酸盐、500mM NaCl、10%甘油、5mM GSH(还原型谷胱甘肽)、1mMGSSG(氧化型谷胱甘肽),pH 7.5变为50mM磷酸盐、250mM NaCl、10%甘油,pH 7.0的最终调配物。
图2A示出了F01的结果。图2A中示出了四个不同的样品:呈现了在25℃下运行的2个F01样品和在5℃下运行的2个F01样品。如图2A种所示,对于所有样品,在两个温度下,在约24到约32分钟处观察到几乎相同的相对比例的单个主峰。这指示组合物包括稳定的具有离散尺寸的颗粒群。
图2B提供了F02的结果。同样,示出了四个不同的样品:在25℃下运行的2个F02样品和在5℃下运行的2个F02样品。与F01结果相反,在不同时间点标识出几个峰,所有峰的相对比例都不同。对于出现在10和20分钟之间的峰,顶部迹线和第三迹线表示在25℃下运行的样品的结果;第二和第四迹线表示在5℃下运行的样品。对于出现在24分钟和32分钟之间的峰,上面三条迹线包含两个5℃样品和25℃样品中的一个,而本时间范围中的最下面的迹线表示在25℃下运行的另一个样品。在40分钟时间点处的峰将5℃样品中的一个作为最下面的迹线示出,而将其余三条样品迹线在上面示出。
虽然F01在如实例3中所述的T细胞测定中表现出功能,但是F02没有。
因此,本技术的调配物包括稳定的具有离散尺寸的TAT-MYC颗粒,并具有生物学功能。
B.本技术的调配物的生物活性与粒度相关
1.尺寸排阻色谱和高效液相色谱证实离散粒度存在于生物活性TAT-MYC制剂中
为了验证TAT-MYC蛋白的功能与具有离散尺寸的纳米颗粒相关,评价了三种不同的TAT-MYC制剂。两种功能性制剂(被称为“C12”和“C13”)和一种非功能性制剂(“R147”)如下经由尺寸排阻色谱和随后的高效液相色谱来表征。
根据实例2中概述的程序制造功能性C12和C13。在运行期间生成R147,其中加速了TFF重折叠步骤以研究重折叠步骤耗费120分钟、120分钟和14小时的必要性,如实例1B中详述。相反,整个重折叠在60分钟内完成。
用于分析TAT-MYC的SEC-HPLC程序在Agilent 1100系列上进行。串联配置了3个柱。设置如下:保护柱-2000A-500A-300A。流动相为50mM磷酸钠、500mM NaCl pH 7.0,流速为1.0ml/min,每次运行的长度为40分钟,并且蛋白质以100μL注射体积被引入到柱上。
三个样品的迹线示出在图3中。SEC-HPLC允许高分辨率的粒度分布,并在约13和16分钟处示出了两个不同的峰。虽然13分钟处的峰具有活性颗粒,但24分钟处的峰包含活性颗粒。注意,在22-24分钟处观察到的峰是重折叠缓冲液中赋形剂的结果。
2.用于确定粒度的尺寸排阻色谱和多角度静态光散射分析
还使用SEC-多角度静态光散射(MALS)来分析相同的三个样品,以确认粒度(分子量)以控制并消除任何意外的与柱的分子相互作用。
结果示出在图4A和4B中。图4A是示出了在50mM磷酸盐、500mM NaCl、10%甘油、5mMGSH(还原型谷胱甘肽)、1mM GSSG(氧化型谷胱甘肽)、250mM Arg,pH 7.5中配制的样品C2A的折射率(影线)和分子量(实线)的图。图4B是C2A的SEC迹线,其示出了具有谷胱甘肽但没有Arg的C2A重折叠缓冲液(活性样品1)和具有Arg但没有谷胱甘肽的重折叠缓冲液(活性样品2)的相对信号。
图4A和4B中示出的结果证实了大多数活性颗粒具有约107-109道尔顿的分子质量(参见保留体积为约12.5mL的部分)。
3.用于验证粒度的动态光散射分析
测定生物活性调配物C2A和三种另外的调配物,C12、C13(二者皆为活性)和R149(非活性)以确定粒度。根据实例2中概述的程序制造功能性C12和C13。在类似于C12和C13的运行期间生成R149,但是TFF重折叠步骤由在6小时内进行的透析代替。根据段落A、段落B和段落C中概述的程序制造功能性C2A,但最终调配物缓冲液包含250mM Arg。
使用动态光散射(DLS)评价样品,动态光散射是一种可以用于确定混悬液中的小颗粒或溶液中的聚合物的尺寸分布曲线的技术。DLS测量在布朗运动下运动的颗粒的扩散,并使用斯托克斯-爱因斯坦关系将扩散系数转换为流体动力学直径:
其中Dh=流体动力学直径,kB=玻尔兹曼常数,η=动态粘度,D=平移扩散系数,T=热力学温度。
在Malvern Zetasizer Nano上分析样品和标准品。在分析之前,将测试样品和对照在调配物缓冲液中稀释至0.5mg/mL的浓度。分析样品,并通过强度、数量计数和体积分布评价尺寸。分析的报告值由强度Z-Ave(d.nm)值获得。
结果示出在图5A-5D中。图5A示出了C2A的DLS迹线;平均粒度(直径)为106.2nm。
图5B-5D分别示出了制剂R149(非活性)、C12(活性)和C13(活性)的DLS迹线数据。非活性制剂的平均粒度为63nm,而制剂C12和C13的平均粒度分别为106和103nm。
4.用于验证溶液中生物活性TAT-MYC颗粒的尺寸分布的纳米颗粒跟踪分析
纳米颗粒跟踪分析(NTA)是一种用于可视化和分析液体中的颗粒的方法,其使布朗运动的速率与粒度相关。移动速率仅与液体的粘度和温度相关;它不受颗粒密度或折射率的影响。NTA允许确定液体混悬液中直径大约为10-1000纳米(nm)的小颗粒的尺寸分布曲线。
纳米颗粒尺寸和浓度使用配备有488nm激光和NTA 2.3软件的NS300仪器(莫尔文,沃切斯特,英国)通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)来测量。在数据采集之前,将样品以1:200-1:400稀释,最终体积为400μL,并加载到流动池中。在室温下捕捉视频60秒。较小的尺寸检测限制由软件自动设定。
结果示出在图6A和6B中。用活性C2A制剂一式三份进行NTA分析。图6A指示了样品中的大部分颗粒的尺寸为约100nm。图6B示出了平均浓度和尺寸。下表中提供了样品中粒度的统计分析。
合并数据 | 粒度 | 均值+/-标准误差 | 粒度 |
均值 | 116.0nm | 均值 | 116.9+/-4.7nm |
方式 | 98.5nm | 方式 | 101.5+/-4.9nm |
SD | 48.7nm | SD | 48.5+/-3.5nm |
D10 | 71.7nm | D10 | 72.4+/-2.7nm |
D50 | 98.6nm | D50 | 100.1+/-4.1nm |
D90 | 171.2nm | D90 | 174.4+/-9.0nm |
5.用于视觉验证生物活性纳米颗粒TAT-MYC的均匀性和尺寸的电子显微镜检查
通过电子显微镜检查进一步证实了上述生化结果。在实例3的T细胞测定中测试如实例2中所述制备并被称为“C2B”的TAT-MYC调配物,以验证生物活性。如下经由电子显微镜检查使C2B可视化。
将五十微升滴注TAT-MYC纳米颗粒调配物点在石蜡膜上,然后吸收到辉光放电的碳和聚乙烯醇缩甲醛涂层铜透射电子显微镜(TEM)网格(G400铜;EM Science)。将网格在Kimwipe(Kimberly-Clark)上吸干,然后用乙酸双氧铀(2%[wt/vol])和TEM(PhilipsCM10)在80kV下染色。在x4,800放大倍数下观察颗粒。
结果示出在图7中。图7示出了100nm尺寸范围内的离散颗粒(黑球)。颗粒的形状是均匀的,虽然在显微照片中注意到一些尺寸变化,但是B-E部分中的数据证实了活性颗粒的尺寸范围与显微照片中示出的尺寸范围一致。
C.本技术的TAT-MYC调配物的生物学功能
为了进一步区分活性与非活性TAT-MYC制剂,进行了肽图谱分析。肽图谱,也被称为肽指纹图谱,是一种通过蛋白质的部分水解然后进行电泳和色谱(在纸上或凝胶上)形成肽的二维图案的技术。产生的肽图案(或指纹)是特定蛋白质的特性,并且可以使用所述技术来分离肽的混合物。
用内切蛋白酶AspN消化六种不同的TAT-MYC调配物。根据实例2制备三个样品C2B、C6和C7,并且其在实例3的T细胞测定中表现出生物活性。如下制备三个样品C4、147和149。在类似于C12和C13的运行期间生成R149,但是TFF重折叠步骤由在6小时内进行的透析代替。在运行期间生成R147,其中加速了TFF重折叠步骤以研究重折叠步骤耗费120分钟、120分钟和14小时的必要性,如实例2中详述。相反,整个重折叠在60分钟内完成。虽然根据实例1B中概述的程序制造C4,但然后调节Q载荷的盐和电导率以使其流过,将本Q柱作为结合物运行并且然后在盐梯度上洗脱。这些样品中没有一个在实例3T细胞测定中表现出生物活性。
蛋白质消化如下进行。TAT-MYC被盐酸胍变性,被TCEP(三2-羧乙基膦)还原,被碘乙酰胺烷基化并被胞内蛋白酶Asp-N消化,其在天冬氨酸残基的N-末端进行切割。所得肽通过反相HPLC分离,并用215nm吸光度监测。通过质谱确定峰洗脱曲线中的肽同一性。对于常规蛋白质分析,可以通过样品与参考样品的UV色谱图中的峰曲线的视觉比较来建立同一性。
通过HPLC分析蛋白质片段。结果示出在图8中。图8的上面三条迹线表示生物活性样品。下面三条迹线表示非活性样品。如图12中所示,在所有三个活性样品中存在12和12.5分钟时间点之间的峰,紧邻标记为A1、A1-2的峰的右侧,但在非活性样品中不存在或最低限度可见。不希望受理论束缚,可能在活性样品中乙酰化一或多个天冬氨酸残基。
实例5:含MYC纳米颗粒调配物的结构表征
使用标准技术利用下表中概述的一系列生物化学、生物物理和功能表征技术来评价含MYC纳米颗粒调配物的一级、二级、三级和四级结构。
含MYC纳米颗粒结构和功能说明策略综述
纳米颗粒调配物C13用于本实例中呈现的大多数表征分析。在一些情况下,本文呈现了来自替代纳米颗粒调配物(C2B或C14)的数据。根据与纳米颗粒调配物C13所使用基本相同的工艺,还以类似的制造规模产生了纳米颗粒调配物C14。
A.通过液相色谱-质谱(LC/MS)进行肽谱分析
含myc纳米颗粒调配物如上表所述进行分析,加入了质谱、电喷雾离子化(ESI)和飞行时间(TOF)分析仪。因为在MS运行期间没有UV检测,所以进行MS总离子色谱图(TIC)和UV色谱图的视觉对准以将观察到的质量分配给相应的UV峰。
质谱分析基于预期的肽序列证实了100%的肽覆盖率。图9示出了标识出肽峰的MYC肽的代表性肽图谱。每个峰的肽的分配在下表中提供。
理论TAT-MYC Asp-N肽
B.反相高效液相色谱(RP-HPLC)
采用反相HPLC(RP-HPLC)方法来定量翻译后修饰和产物相关杂质。将测试样品在变性缓冲液(7.5M盐酸胍、0.0625M TrisHCl pH 7.3)中稀释,并使用Agilent AdvanceBioRP-mAb C4柱(2.1x 150mm,实芯磁珠3.5μm,)分离。将柱在50℃的温度下平衡。通过施加0.5mL/min的流速和100%H2O(洗脱液A)中0.1%TFA(w/v)和100%ACN(洗脱液B)中0.1%(w/v)TFA的线性梯度实现洗脱,如下表所示。检测在280nm处进行。
RP-HPLC梯度曲线
时间(分钟) | %洗脱液B |
0.00 | 23.0 |
15.00 | 37.0 |
35.00 | 45.0 |
36.00 | 70.0 |
37.00 | 70.0 |
38.00 | 23.0 |
45.00 | 23.0 |
纳米颗粒调配物C13的分析表明存在主峰和一些次峰,如图10中所示。在本特定实例中未进行杂质峰的标识。
C.圆二色性光谱
在“远UV”光谱区域(190-250nm)和“近UV”光谱区域(250-350nm)中使用圆二色性光谱(CD)来评价纳米颗粒调配物C13的结构。在远UV区域,发色团是肽键,当它位于规则的折叠环境中时产生信号。近UV区域可能对三级结构的某些方面敏感。在这些波长处,发色团是芳香族氨基酸和二硫键,它们产生的CD信号对蛋白质的整体三级结构敏感。
将纳米颗粒调配物C13稀释至近UV 280nm处0.75AU的吸光度以及远UV 195nm处1.1AU的吸光度。谷胱甘肽对UV中的样品吸光度有显著影响。因此,为了增加蛋白质的信号贡献,将样品缓冲液更换为还原型谷胱甘肽和谷胱甘肽游离缓冲液。样品的测试参数如下表所示。
通过CD光谱表征纳米颗粒调配物的测试参数
1对所有读数求平均以产生每个样品的报告光谱
对于远UV和近UV CD光谱,将平均光谱减去缓冲液并归一化至平均残基摩尔椭圆率(MRME)。使用加权光谱差(WSD)算法进行光谱相似性的定量分析。图11中提供的所得远UV光谱表明蛋白质二级结构主要由β-折叠组成。几乎没有证据表明存在α-螺旋结构。图12中提供的近UV光谱表明弱色氨酸、高酪氨酸和非常高的二硫键特征。本结果与分子中色氨酸、酪氨酸和二硫键残基的数量一致,如下表所示。
含MYC纳米颗粒调配物中的色氨酸、酪氨酸和二硫键
氨基酸残基 | 每分子的数量 |
色氨酸 | 2个 |
酪氨酸 | 12个 |
二硫键 | 4个(9个半胱氨酸) |
D.傅里叶变换红外光谱(FTIR)
波数1700-1500cm-1的傅里叶变换红外光谱(FTIR)光谱可以用于确定蛋白质的结构性质。在本光谱区域中的分析产生两个吸收带,通常被称为酰胺I和酰胺II,并且分别位于波数1700-1600cm-1和1600-1500cm-1之间。酰胺1带是由于肽键的C=O伸展振动,其由二级结构(α-螺旋、β-折叠等)调节。通过将测量光谱与具有已知二级结构的蛋白质获得的光谱进行比较,可以获得二级结构含量。使用Bruker Optics Vertex 70,利用MCT检测器和BioATR Cell II进行纳米颗粒调配物C14的FTIR光谱。在分析之前,样品不需要准备。分析的测试参数如下表所示。
FTIR测试参数
参数 | 值 |
温度 | 25℃ |
浓度 | 无溶剂 |
检测器 | MCT |
孔径设置 | 6mm |
分辨率 | 4cm<sup>-1</sup> |
分束器设置 | KBr |
高通滤波器 | 打开 |
低通滤波器 | 10kHz |
波数范围* | 6000–950cm<sup>-1</sup> |
扫描仪速度 | 20kHz |
扫描次数 | 128 |
*建议使用波数范围。减去缓冲液通常在2800-1000cm-1之间进行,二次结构光谱分析在1700-1600cm-1之间进行。
所得FTIR光谱减去缓冲液,min-max在1600到1700cm-1范围内归一化。应用九点平滑以最小化白噪声以确定二阶导数。使用加权光谱差(WSD)算法进行光谱相似性的定量分析。
纳米颗粒调配物C14表现出显著的β结构,包括折叠和转角。在1649-1655附近的峰是无规卷曲。这些光谱特征与远UV CD数据的定性分析一致:即主要是β结构和无规卷曲,并且存在很少甚至没有α-螺旋。
E.分析超速离心
通过沉降速度分析超速离心(SV-AUC),基于蛋白质在溶液中的沉降行为来研究纳米颗粒调配物C13的高序结构。SV-AUC测量分子响应离心力而沉降的速率。本沉降速率提供了关于样品中存在的分子的分子量的信息。
利用Beckman-Coulter XLI,使用吸光度光学器件进行SV-AUC。在分析之前,样品不需要另外的制备。测试参数如下表所示。利用如下表中所示的参数,使用SEDFIT 15.01b进行数据分析。AUC数据如图14中所示。
AUC测试参数
AUC数据分析参数
参数 | 值 |
弯月面 | 从样品侧峰值的max浮动 |
底部 | 7.2cm |
底部装配限制 | 6.7cm |
摩擦比 | 从2.2浮动 |
缓冲液密度 | 1.05507g/L |
缓冲液粘度 | 0.01628泊 |
部分比容 | 0.73 |
沉降系数范围 | 0.1<sup>1</sup>–500S |
正则化方法 | 吉洪诺夫-菲利普斯 |
时间独立性噪声 | 启用 |
径向独立性噪声 | 禁用 |
1使用了对数间隔的网格,因此所有值必须大于零
纳米颗粒调配物C13表现出大的分子量分布。使用已知的缓冲液性质确定近似分子量。分布在约4MDa(20.6S)处急剧开始,并且在约10MDa(40S)处具有顶点。主群分布延伸到约120MDa(185S)。少量较大的物种延伸超过400S,但是这些物种低于方法的定量限制,无法准确地定量。
F.变性尺寸排阻色谱-HPLC
通过变性尺寸排阻色谱-HPLC(dSEC-HPLC)分析纳米颗粒调配物C13。使用TSKgelG3000SWxl;5μm,在变性条件(还原和非还原条件)下运行样品;使用不锈钢7.8mm x 30cm柱来实现样品内单体与较大分子量物质的基于尺寸的分离。
为了在非还原条件下分析样品,使用7.5M Gdn HCl、0.01M乙酸钠pH 4.7作为流动相,以等度配置实现洗脱。将样品在流动相中稀释1/10并涡旋10秒以混合。然后将样品在37℃下温育30分钟,随后再在4℃下放入自动取样器中。
为了在还原条件下分析样品,使用7.5M Gdn HCl、0.0625M TrisHCl pH 7.3作为流动相,以等度配置实现洗脱。将样品在流动相中稀释1/10,并加入1mL TCEP,随后再涡旋10秒以混合。然后将样品在37℃下温育15分钟,随后再在4℃下放入自动取样器中。
使用荧光进行峰定量来进行还原和非还原条件的检测。使用多角度激光散射(MALLS)实现跨峰的尺寸分布的估计。
纳米颗粒调配物C13的SEC-HPLC分析的所得色谱图如图15中所示。每个色谱图上的重叠迹线表示对于储存在2-8℃下的样品,间隔大约1个月进行的测试,证明了所述方法在加速温度下储存时识别变化的能力。
G.电子显微镜检查
进行电子显微镜检查以收集纳米颗粒调配物C2B的三维结构的图像。将五十微升滴注纳米颗粒调配物(100ug/mL)点在石蜡膜上,然后吸收到辉光放电的碳和聚乙烯醇缩甲醛涂层铜透射电子显微镜(TEM)网格(G400铜;EM Science)。将网格在Kimwipe(Kimberly-Clark)上吸干,然后用乙酸双氧铀(2%[wt/vol])和TEM(Philips CM10)在80kV下染色。在x4,800放大倍速下成像大量100nm颗粒。所得图像确认了自组装球体的高度有序复合物,如图7中所示。
实例6:突变TAT-MYC肽调配物的表征
在本实例中,检查MYC在MYC功能中起作用的位点的点突变,以确定突变是否影响TAT-MYC纳米颗粒调配物的稳定性。如上所述,具有SEQ ID NO:1所示序列的TAT-MYC融合蛋白是将框架内融合的HIV-1TAT的蛋白转导结构域(PTD)与野生型人MYC蛋白组合的融合蛋白(c-MYC),后面是两个标签:V5和6xHis。TAT-3AMYC与TAT-MYC相同,只是它含有3个氨基酸取代:T358A、S373A和T400A。最初选择这三种氨基酸进行突变,因为已表明所有三个残基处的磷酸化通过阻断Max结合或直接干扰与DNA的结合来抑制MYC与DNA的缔合从而降低MYC功能(黄(Huang)等人,分子细胞生物学(Mol Cell Biol.),24(4):1582–1594(2004))。如下所述,TAT-3AMYC的点突变似乎使形成的复合物不稳定,使得融合蛋白制剂是非功能性的。
TAT-MYC和TAT-3AMYC融合蛋白的制备
如上文实例1和2中所述制备TAT-MYC和TAT-3AMYC蛋白。融合蛋白在变性条件下增溶,然后重折叠成含有盐、甘油和还原剂的最终调配物(即50mM磷酸盐、500mM NaCl、10%甘油、5mM GSH(还原型谷胱甘肽)、1mM GSSG(氧化型谷胱甘肽)。
尺寸排阻色谱HPLC(SEC-HPLC)
然后使用尺寸排阻色谱HPLC(SEC-HPLC)分析包括TAT-MYC和TAT-3AMYC的纳米颗粒调配物的分子量曲线。在尺寸排阻柱上用等度流动相(4M GdnHCl、10mM NaOAc,pH 4.65)分离尺寸变体,并在二极管阵列检测器上用280nM处的紫外(UV)检测进行监测。使用的参数如下:流速:0.75mL/min;最大压力限制:70.0巴;运行时间:30分钟;注射体积:20μL)。
图16A示出了TAT-MYC蛋白制剂的色谱图。蛋白质复合物在6分钟和7分钟之间洗脱。可以看到较小的蛋白质多聚体和赋形剂峰在8分钟和15分钟之间洗脱。图16B示出了TAT-3AMYC与TAT-MYC蛋白制剂相比的色谱图。TAT-3AMYC具有显著较少的蛋白质复合物,其在6分钟和7分钟之间洗脱。大部分蛋白质制剂包含较小的蛋白质多聚体,并且可以看到在8分钟和17分钟之间洗脱的赋形剂峰。这表明T358、S373和T400突变为丙氨酸足以破坏在SEC柱上在6分钟和7分钟之间洗脱的纳米颗粒复合物的形成。
效力测定
还通过测试它们拯救活化的CD4+T细胞免于凋亡,保持爆炸(blasting)表型和在抗原刺激后继续增殖的能力来评估TAT-MYC和TAT-3AMYC融合蛋白的效力。通过从小鼠收获脾脏和淋巴结获得用于测定的T细胞。通过网筛研磨脾和淋巴结以在C10培养基中生成单细胞混悬液。将细胞转移到锥形管中,并使细胞通过以1200RPM的速度离心5分钟形成团块。将细胞重悬于5ml无菌TAC缓冲液(135mM NH4Cl、17mM Tris pH 7.65)中,并使其在TAC缓冲液中静置1-2分钟以裂解红细胞。将细胞以1200RPM的速度离心5分钟,用10ml C10培养基洗涤,并重悬于4ml C10培养基中。
根据制造商的说明书(Invitrogen Cat#11445D),使用抗CD4Dynabeads从重悬的RBC耗尽的细胞混合物中分离T细胞。简而言之,将4ml重悬的细胞团块加入到具有50μl洗涤的CD4Dynabeads(x4)的弹扣盖管中,并在4℃下在360°章动器上温育1小时。温育后,将管置于Dynal磁体上,允许磁珠和细胞在管的侧面聚集两分钟。
去除上清液(CD4阴性细胞)。将磁珠和结合的细胞重悬于4ml C10培养基中,并放回磁体上以进行分离。重复本洗涤。洗涤后,将磁珠和结合的细胞重悬于4ml C10中,并向每个管中加入50μl CD4detachabead(Invitrogen Cat#12406D),并在22℃下在360°章动器上温育1小时。温育后,将管置于Dynal磁体上,允许磁珠在管的侧面聚集两分钟。将含有CD4+细胞的上清液收集在50ml锥形管中。将剩余的磁珠重悬于10ml C10培养基中,在Dynal磁体上分离并收集。然后重复本步骤并合并上清液。将合并的分离的CD4+细胞以1200rpm的速度离心5分钟。去除上清液,将细胞以大约1.5x106个细胞/ml重悬于20ml(5ml/小鼠)中。将20ul市售抗CD3(eBiosciences Cat#16-0031-86)和20ul抗-CD28抗体(克隆37N1)以1ul/ml加入管中以活化T细胞,并将细胞接种于24孔培养皿的20个孔中,每孔1ml培养基并在36℃下温育72小时。
在用抗CD3和抗CD28活化后72小时,使用培养基从24孔培养皿中的每个孔中去除培养基和细胞,以从每个孔的底部洗涤细胞。使细胞以1200rpm的速度形成团块五分钟,重悬于5ml C10培养基中并转移到15ml锥形管中。将5ml菲科-帕克(Ficoll-Paque)置于细胞下,并以1200rpm的速度旋转五分钟。使用4ml玻璃移液管去除血沉棕黄层并转移到新的15ml锥形管中。加入10ml C10培养基来洗涤细胞。使细胞以1200rpm的速度形成团块五分钟,以1x106个细胞/ml重悬,24孔板的每孔接种1ml。然后用TAT-MYC或TAT-3AMYC融合蛋白治疗细胞。在使用流式细胞术用融合蛋白治疗后48小时测定活力。
图17示出了活化的T细胞效力测定的图示,其评价了TAT-MYC和TAT-3AMYC在细胞因子戒断后拯救活化的T细胞免于凋亡的能力。与未治疗(NT)相比,TAT-MYC在细胞因子戒断后表现出活T细胞群增加了3倍。然而,与未治疗(NT)相比,TAT-3AMYC表现出活体群T细胞群没有增加。本结果与色谱数据一致,其示出了大多数TAT-3AMYC不形成类似于TAT-MYC的复合物,如图16B中所示。
总之,TAT-MYC形成纳米颗粒复合物,其可以通过SEC-HPLC测量并在6分钟和7分钟之间洗脱。TAT-3AMYC不形成与TAT-MYC相同的纳米颗粒复合物。T358、S373和T400突变为丙氨酸足以破坏在SEC柱上在6分钟和7分钟之间洗脱的复合物的形成。此外,在T细胞效力测定中观察到的TAT-MYC的功能似乎与本复合物的形成相关。
实例7:源自绿猴(绿猴)MYC蛋白的TAT-MYC融合肽的构建和表征
绿猴TAT-MYC的构建和纯化
通过PCR扩增绿猴(绿猴)MYC的编码区并用编码SEQ ID NO:8的绿猴MYC序列的一部分替换编码实例1的人TAT-MYC载体中人MYC序列的核酸来制造质粒pTAT-MYC(绿猴)-V5-6xHis,所述绿猴MYC序列与人MYC序列相差两个氨基酸。如实例1中所述进行蛋白质产生和纯化。如实例2中所述进行纳米颗粒TAT-MYC组合物的制备。
用于验证粒度的动态光散射(DLS)
如实例4(B)(3)所述,通过动态光散射(DLS)技术评估重折叠的纳米颗粒组合物的纳米颗粒尺寸分布。结果示出在图18中,其示出了绿猴TAT-MYC纳米颗粒组合物的DLS迹线。绿猴TAT-MYC的平均粒度(直径)为约80nm。
反相高效液相色谱(RP-HPLC)
采用反相HPLC(RP-HPLC)方法定量绿猴TAT-MYC纳米颗粒组合物中的翻译后修饰和产物相关杂质。将测试样品在变性缓冲液(7.5M盐酸胍、0.0625M TrisHCl pH 7.3)中稀释至1mg/ml。向样品中加入2μl 0.5M TCEP((三(2-羧乙基)膦),在37℃下温育30分钟,然后冷却至2-8℃。将样品在2-8℃下储存长达5天,随后再进行分析。将样品(50μl(约5μg)使用Agilent AdvanceBio RP-mAb C4柱分离(2.1x 150mm,实芯磁珠3.5μm,)。柱在50℃的温度下平衡。通过施加0.5mL/min的流速和100%H2O(洗脱液A)中0.1%TFA(w/v)和100%ACN(洗脱液B)中0.1%(w/v)TFA的线性梯度实现洗脱,如下表所示。检测在215nm处进行。与参考人TAT-MYC纳米颗粒组合物相比的绿猴TAT-MYC纳米颗粒组合物的结果示出在图19中。
尺寸排阻色谱和高效液相色谱(SEC-HPLC)
绿猴TAT-MYC纳米颗粒组合物也经由尺寸排阻色谱和随后的高效液相色谱表征。使用TSKgel G3000SWxl;5μm,在变性非还原条件下运行样品;使用不锈钢7.8mm x30cm柱来实现样品内单体与较大分子量物质的基于尺寸的分离。使用4M Gdn HCl、0.1M乙酸钠pH4.65作为流动相,以等度配置实现洗脱。将样品在流动相中稀释1/10并涡旋10秒以混合。然后将样品在37℃下温育30分钟,随后再在4℃下放入自动取样器中。
与参考人TAT-MYC纳米颗粒组合物相比的绿猴TAT-MYC纳米颗粒组合物的SEC-HPLC分析的所得色谱图示出在图20中。
效力测定
还通过测试它们拯救活化的CD4+T细胞免于凋亡,保持爆炸表型和在抗原刺激后继续增殖的能力来评估绿猴TAT-MYC纳米颗粒组合物和参考人TAT-MYC纳米颗粒组合物的效力。根据实例6中描述的效力测定来测定组合物的生物活性。
图21示出了活化的T细胞效力测定的图示,其评价了不同剂量的绿猴TAT-MYC和人TAT-MYC相较于未治疗对照增加具有爆破表型的活化T细胞的量的能力。
尽管本文已经示出并描述了本公开的优选实施例,但是对于本领域技术人员显而易见的是,此些实施例仅作为实例提供。在不脱离本公开的情况下,本领域技术人员现在将想到多种变化、改变和替换。应当理解,可以在实践本公开时采用本文描述的本公开的实施例的各种替代方案。本文旨在表示,以下权利要求限定本公开的范围,并且因此涵盖这些权利要求及其等同物的范围内的方法和结构。
本文提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物均通过引用整体并入,包含所有附图和表格,只要它们与本说明书的明确教导不矛盾。
在以下权利要求中阐述了其它实施例。
Claims (60)
1.一种包括生物活性纳米颗粒群的组合物,所述生物活性纳米颗粒群包括一或多种含MYC多肽,其中:
a.所述生物活性纳米颗粒的平均直径介于约80nm和约150nm之间;
b.调配物的pH为至少约pH 6.0,且不大于约pH 8;和
c.相较于未与所述含MYC多肽的组合物接触的抗CD3或抗CD28活化的T细胞,在适合T细胞增殖的条件下使抗CD3或抗CD28活化的T细胞与所述含MYC多肽的纳米颗粒组合物接触增强了所述T细胞的活化、存活或增殖中的一或多种。
2.根据权利要求1所述的组合物,其中所述MYC多肽经乙酰化。
3.根据权利要求1所述的组合物,其中所述含MYC多肽包括MYC融合肽,其包括与MYC多肽连接的蛋白转导结构域。
4.根据权利要求3所述的组合物,其中所述MYC融合肽进一步包括一或多个连接所述蛋白转导结构域和所述MYC多肽的分子。
5.根据权利要求1所述的组合物,其中所述含MYC多肽包括具有以下一般结构的MYC融合肽:
蛋白转导结构域-X-MYC序列,
其中-X-是连接所述蛋白转导结构域和所述MYC序列的分子。
6.根据权利要求3或权利要求5所述的组合物,其中所述蛋白转导结构域序列是TAT蛋白转导结构域序列。
7.根据权利要求6所述的组合物,其中所述TAT蛋白转导结构域序列选自由以下组成的群组:TAT[48-57]和TAT[57-48]。
8.根据权利要求1所述的组合物,其中所述MYC多肽是包括SEQ ID NO:1或10的MYC融合肽。
9.根据权利要求1所述的组合物,其中所述纳米颗粒的平均直径介于约100nm和约110nm之间。
10.根据权利要求1到9中任一权利要求所述的组合物,其进一步包括药学上可接受的赋形剂。
11.根据权利要求1到10中任一权利要求所述的组合物,其被调配用于局部施用、口服施用、肠胃外施用、鼻内施用、口腔施用、直肠施用或透皮施用。
12.一种通过施用治疗有效量的根据权利要求1所述的调配物来在有需要的受试者中增加一或多种免疫细胞的活化、存活或增殖中的一或多种或增加免疫应答的方法。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述一或多种免疫细胞包括一或多种无能免疫细胞。
14.根据权利要求13所述的方法,其中所述一或多种免疫细胞是T细胞。
15.根据权利要求14所述的方法,其中所述T细胞选自由以下组成的群组:幼稚T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、记忆T细胞、活化T细胞、无能T细胞、耐受T细胞、嵌合B细胞和抗原特异性T细胞。
16.根据权利要求15所述的方法,其中所述一或多种免疫细胞是B细胞。
17.根据权利要求16所述的方法,其中所述B细胞选自由以下组成的群组:幼稚B细胞、血浆B细胞、活化B细胞、记忆B细胞、无能B细胞、耐受B细胞、嵌合B细胞和抗原特异性B细胞。
18.一种在造血干细胞移植HSCT之后引发造血干细胞以增强植入的方法,其包括在移植所述造血干细胞之前在体外使一或多种造血干细胞与根据权利要求1所述的组合物接触。
19.一种制备包括一或多种含MYC多肽的生物活性纳米颗粒群的方法,所述方法包括:
(a)使含MYC多肽在包括某一浓度的变性剂的增溶溶液中增溶以提供增溶的含MYC多肽;
(b)用第一重折叠缓冲液对所述增溶的含MYC多肽进行第一重折叠步骤至少约30到180分钟以提供第一多肽混合物,所述第一重折叠缓冲液包括约0.35到约0.65浓度的步骤(a)的所述变性剂和约100mM到约1M碱金属盐和/或碱性金属盐;
(c)用第二重折叠缓冲液对所述第一多肽混合物进行第二重折叠步骤至少约30到180分钟以提供第二多肽混合物,所述第二重折叠缓冲液包括约0.10到约0.30浓度的步骤(b)的所述变性剂和约100mM到1M碱金属盐和/或碱性金属盐;和
(e)用第三重折叠缓冲液对所述第二多肽混合物进行第三重折叠步骤至少约30到180分钟,所述第三重折叠缓冲液包括约100mM到1M碱金属盐和/或碱性金属盐;
(f)将所述含MYC多肽保持在所述第三重折叠缓冲液中一段时间,所述时间足以产生数均直径介于约80nm和约150nm之间的生物活性纳米颗粒,
其中相较于未与所述生物活性纳米颗粒接触的抗CD3或抗CD28活化的T细胞,在适合T细胞增殖的条件下使抗CD3或抗CD28活化的T细胞与所述生物活性纳米颗粒接触增强了所述T细胞的活化、存活或增殖中的一或多种。
20.根据权利要求19所述的方法,其中所述第一重折叠步骤、第二重折叠步骤和/或第三重折叠步骤包括通过缓冲液更换来进行所述步骤。
21.根据权利要求20所述的方法,其中使用切向流过滤进行缓冲液更换。
22.根据权利要求19到21中任一权利要求所述的方法,其中所述碱金属盐包括钠盐、锂盐和钾盐中的一或多种。
23.根据权利要求19到22中任一权利要求所述的方法,其中所述碱金属盐包括氯化钠(NaCl)、溴化钠、硫酸氢钠、硫酸钠、碳酸氢钠、碳酸钠、氯化锂、溴化锂、硫酸氢锂、硫酸锂、碳酸氢锂、碳酸锂、氯化钾、溴化钾、硫酸氢钾、硫酸钾、碳酸氢钾和碳酸钾中的一或多种。
24.根据权利要求19到23中任一权利要求所述的方法,其中所述碱性盐包括镁盐和钙盐中的一或多种。
25.根据权利要求19到24中任一权利要求所述的方法,其中所述碱性金属盐包括氯化镁、溴化镁、硫酸氢镁、硫酸镁、碳酸氢镁、碳酸镁、氯化钙、溴化钙、硫酸氢钙、硫酸钙、碳酸氢钙和碳酸钙中的一或多种。
26.根据权利要求19到25中任一权利要求所述的方法,其中所述碱金属盐包括氯化钠(NaCl)。
27.根据权利要求19到26中任一权利要求所述的方法,其中所述第一、第二和/或第三重折叠缓冲液包括约500mM NaCl。
28.根据权利要求19到27中任一权利要求所述的方法,其中步骤(a)中的变性剂的浓度为约1M到约10M。
29.根据权利要求19到28中任一权利要求所述的方法,其中所述变性剂包括胍、盐酸胍、氯化胍、硫氰酸胍、尿素、硫脲、高氯酸锂、氯化镁、苯酚、甜菜碱、肌氨酸、氨基甲酰肌氨酸、牛磺酸、二甲亚砜(DMSO);醇,例如丙醇、丁醇和乙醇;洗涤剂,例如十二烷基硫酸钠(SDS)、N-月桂酰肌氨酸、两性洗涤剂、非洗涤剂磺基甜菜碱(NDSB)、TRITON X-100、NONIDETTM P-40、TWEENTM系列和BRIJTM系列;氢氧化物,例如氢氧化钠和氢氧化钾中的一或多种。
30.根据权利要求19到29中任一权利要求所述的方法,其中所述第一重折叠缓冲液、所述第二重折叠缓冲液和/或第三重折叠缓冲液各自独立地包括缓冲剂。
31.根据权利要求30所述的方法,其中所述缓冲剂包括TRIS(三[羟甲基]氨基甲烷)、HEPPS(N-[2-羟乙基]哌嗪-N'-[3-丙烷-磺酸])、CAP SO(3-[环己基氨基]-2-羟基-1-丙磺酸)、AMP(2-氨基-2-甲基-1-丙醇)、CAPS(3-[环己基氨基]-1-丙磺酸)、CHES(2-[N-环己基氨基]乙磺酸)、精氨酸、赖氨酸和硼酸钠中的一或多种。
32.根据权利要求30或权利要求31所述的方法,其中每种缓冲剂独立地以约1mM到约1M的浓度存在。
33.根据权利要求19到32中任一权利要求所述的方法,其中所述第一重折叠缓冲液、第二重折叠缓冲液和/或第三重折叠缓冲液各自独立地包括氧化剂和还原剂,其中氧化剂与还原剂的摩尔比为约2:1到约20:1。
34.根据权利要求33所述的方法,其中所述氧化剂包括半胱氨酸、二硫化谷胱甘肽(“氧化型谷胱甘肽”)或两者。
35.根据权利要求33或权利要求34所述的方法,其中所述氧化剂是以约0.1mM到约10mM的浓度包括在内。
36.根据权利要求33到35中任一权利要求所述的方法,其中所述还原剂包括β-巯基乙醇(BME)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、胱氨酸、半胱胺、巯基乙酸盐、谷胱甘肽和硼氢化钠中的一或多种。
37.根据权利要求36所述的方法,其中所述还原剂是以约0.02mM到约2mM的浓度包括在内。
38.根据权利要求19到37中任一权利要求所述的方法,其中所述变性剂包括尿素。
39.根据权利要求19到38中任一权利要求所述的方法,其中所述变性剂包括6-8M尿素。
40.根据权利要求19到39中任一权利要求所述的方法,其中所述第一、第二和/或第三重折叠缓冲液包括谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽。
41.根据权利要求19到40中任一权利要求所述的方法,其中所述第一、第二和/或第三重折叠缓冲液包括5mM谷胱甘肽和/或1mM氧化型谷胱甘肽。
42.根据权利要求19到41中任一权利要求所述的方法,其中所述第一、第二和/或第三重折叠缓冲液包括甘油。
43.根据权利要求19到42中任一权利要求所述的方法,其中步骤(f)进行至少5小时。
44.根据权利要求19到42中任一权利要求所述的方法,其中步骤(f)进行至少10小时。
45.根据权利要求19到42中任一权利要求所述的方法,其中步骤(f)进行10-12小时。
46.根据权利要求19到45中任一权利要求所述的方法,其中步骤(f)进一步包括以小于1000rpm搅拌所述第三重折叠缓冲液中的所述含MYC多肽。
47.根据权利要求19到46中任一权利要求所述的方法,其中含MYC多肽是重组多肽。
48.根据权利要求47所述的方法,其中所述方法进一步包括从微生物宿主细胞分离重组含MYC多肽。
49.根据权利要求48所述的方法,其中所述微生物宿主细胞是大肠杆菌。
50.根据权利要求48或权利要求49所述的方法,其中从微生物宿主细胞分离重组含MYC多肽包括从诱导型启动子表达所述含MYC多肽。
51.根据权利要求48到50中任一权利要求所述的方法,其中从微生物宿主细胞分离重组含MYC多肽包括使用亲和色谱和/或阴离子交换色谱纯化所述含MYC多肽。
52.根据权利要求19到51中任一权利要求所述的方法,其中所述含MYC多肽经乙酰化。
53.根据权利要求19到52中任一权利要求所述的方法,其中所述含MYC多肽包括MYC融合肽,其包括与MYC多肽连接的蛋白转导结构域。
54.根据权利要求53所述的方法,其中所述MYC融合肽进一步包括一或多个连接所述蛋白转导结构域和所述MYC多肽的分子。
55.根据权利要求19到54中任一权利要求所述的方法,其中所述含MYC多肽包括具有以下一般结构的MYC融合肽:
蛋白转导结构域-X-MYC序列,
其中-X-是连接所述蛋白转导结构域和所述MYC序列的分子。
56.根据权利要求53到55中任一权利要求所述的方法,其中所述蛋白转导结构域序列是TAT蛋白转导结构域序列。
57.根据权利要求56所述的方法,其中所述TAT蛋白转导结构域序列选自由以下组成的群组:TAT[48-57]和TAT[57-48]。
58.根据权利要求19到57中任一权利要求所述的方法,其中所述含MYC多肽是包括SEQID NO:1或10的MYC融合肽。
59.根据权利要求19到58中任一权利要求所述的组合物,其中所述纳米颗粒的平均直径为从约100nm和约110nm。
60.一种制备包括一或多种含MYC多肽的生物活性纳米颗粒群的方法,所述方法包括:
(a)使含MYC多肽在缓冲增溶溶液中变性以提供变性的含MYC多肽,所述缓冲增溶溶液包括6-8M尿素;
(b)用第一重折叠缓冲液对所述变性的含MYC多肽进行第一重折叠步骤至少约120分钟以提供第一多肽混合物,所述第一重折叠缓冲液包括约3M尿素和约500mM NaCl;
(c)用第二重折叠缓冲液通过缓冲液更换对所述第一多肽混合物进行第二重折叠步骤至少约120分钟以提供第二多肽混合物,所述第二重折叠缓冲液包括约1.5M尿素和约500mMNaCl;
(d)用第三重折叠缓冲液通过缓冲液更换对所述第二多肽混合物进行第三重折叠步骤至少约120分钟,所述第三重折叠缓冲液包括约500mM NaCl;和
(f)将所述含MYC多肽保持在所述第三重折叠缓冲液中一段时间,所述时间足以产生数均直径介于约80nm和约150nm之间的生物活性纳米颗粒,
其中相较于未与所述生物活性纳米颗粒接触的抗CD3或抗CD28活化的T细胞,在适合T细胞增殖的条件下使抗CD3或抗CD28活化的T细胞与所述生物活性纳米颗粒接触增强了所述T细胞的活化、存活或增殖中的一或多种。
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REG | Reference to a national code |
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GR01 | Patent grant | ||
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