KR20140098739A - Ｓｉｒｎａ에 대한 나노 전달 시스템 - Google Patents

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KR20140098739A
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nanocarrier
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hydrophobic
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KR1020147009715A
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사이몬 베니타
오리트 암살렘
타헤르 나사르
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이슘 리서치 디벨롭먼트 컴퍼니 오브 더 히브루 유니버시티 오브 예루살렘, 엘티디.
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Abstract

본 발명은 반대 특성의 안정한 나노입자들로부터 소수성 또는 친수성인 활성제의 방출을 방지하거나 조절하기 위한 이중 나노-캡슐화의 독특한 방법의 사용을 제공한다. 활성제의 방지는 보호될 시제를 나노캐리어 안으로 로딩하고 차후에 서브-마이크론 나노입자 안으로 캡슐화됨으로써 달성된다. 서브-마이크론 나노입자 형성 과정은 신규한 나노분무 기술의 사용을 통해 성공적으로 달성되었다.

Description

ＳＩＲＮＡ에 대한 나노 전달 시스템{NANO DELIVERY SYSTEMS FOR SIRNA}
본 발명은 일반적으로 나노 전달 시스템에 관한 것이다.
RNA 간섭(RNAi)의 발견은 생물학과 약학의 완전히 새로운 분야의 길을 열어놓았다. 표적 유전자를 특이적으로 침묵시키는 RNAi의 능력은 기초적인 연구를 위한 새로운 도구일 뿐만 아니라 RNAi에 기반한 약들의 개발을 위한 구상을 불러일으키는 결과를 낳았다. RNAi는 서열 특이적 결합을 통해 mRNA를 표적화하여 표적 mRNA의 저하를 가져오거나 그의 번역을 억제하여서, 단백질 발현의 상실로 이어진다. 이는 소간섭 RNA(small interfering RNA)(siRNA)로 불리는 작은 19-21 bp dsRNA 분자의 도입을 통해 약학적으로 달성된다. 10년 전 이런 발견으로부터, siRNA는 암, 신경변성(neurodegenerative) 및 전염성 질병과 같은 다양한 질병의 치료에 대한 활용도에 대하여 시험관 내에서 광범위하게 연구되어왔다.
siRNA의 추가적인 개발에 대한 주된 장애는 큰 분자량(예, 13 kDa) 및 폴리음이온성 특징(예, 40 음전하의 포스페이트)에 의해 생체내에서 siRNA를 효과적으로 전달할 수 없는 것이었다. 나출(naked) siRNA는 세포막을 자유로이 통과할 수 없다. 게다가, 변형되지 않은 나출 siRNA들은, 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제에 의해 신속히 분해되기 때문에 혈액 및 혈청에서 상대적으로 불안정하며, 즉 짧은 생체 내 반감기를 가진다. 일반적으로, 유전자-침묵 활성에 부정적 영향을 미치지 않고 생물학적 안정도를 향상시키기 위해, 화학적 변형이 RNA 이중 구조에 행해질 수 있다. 대안적으로, 세포 섭취율을 향상시킬 뿐만 아니라 생물학적 안정도를 제공하는 전달 시스템으로 제형화될 수 있다. RNA의 백본(backbone), 염기 또는 당(sugar)에 대한 몇몇 화학적 변형은 siRNA 안정도 및 활성을 향상시키도록 이용되어왔다. 그러나, 전달 시스템은 세포 내 작용부위에 siRNA의 접근을 촉진시키는 것이 여전히 필요하다.
사실, 다양한 전달 시스템은 전신성 투여 후 표적 조직 안으로 siRNA의 섭취율을 향상시키도록 개발되어왔다. 이러한 것은 폴리머[1], 지질[2] 또는 나노입자[3,4]의 사용을 포함한다. 이러한 벡터들의 대부분은 음으로 하전된 siRNA 뉴클레오티드와 입자들 간의 효과적인 상호작용을 보장하고 그들의 세포 내로의 진입을 촉진하기 위해서 양이온성이다. 그러나, 이러한 양이온성 입자들의 전신성으로 siRNA를 전달하는 능력은 종종 나쁠 수 있는데, 그 이유는 세망내피계의(RES) 기관(reticuloendothelial organ)[5]에 의한 신속한 섭취에 의해 관심 부위로 이러한 입자들의 전달이 막힐 수 있기 때문이다. 이러한 문제를 극복하기 위하여, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 이것이 이러한 입자들의 RES 섭취를 감소시키기 때문에 제형화에서 널리 사용되어 왔다. 이런 페길화(PEGylation)는, "향상된 삼투 및 잔류" 현상[6]에 의한 종양과 같이 결함이 있는 맥관 구조가 존재하는 부위에서 입자들의 축적을 가능케 한다.
지질-계 전달 벡터에 있어서, 폴리뉴클레오티드-가득한 페길화된 입자들을 제형화히기 위한 다양한 방법은 현재까지 보고되어 왔으며, 상기 방법은 후-삽입[7], 역상 증발(reverse phase evaporation)[8], 세제 투석(detergent dialysis)[9] 및 에탄올 투석[10]을 포함한다. 그러나, 대부분의 이러한 방법들은 효과적이지만, 수성 상태에 부유된 결과 입자들을 사용하여 상대적으로 복잡하고 긴 제형화 과정을 필요로 한다. 이는 입자들의 응집 및/또는 융합, 지질의 가수분해, 및 수성 환경에서 siRNA 뉴클레오티드의 불안정성을 포함하는 장시간의 저장 문제를 불러일으킨다. 게다가, 이러한 제형들은 운송 과정에서 발생하는 스트레스, 예를 들어 교반 또는 온도 변화[11]에 의해 영향을 받는 경향이 있다. 알려진 제형화 과정을 사용하여 이러한 입자들을 대규모로 생산하기 위해서 요구되는 현저히 증가 되는 노력과 함께, 이러한 문제점들은 임상 의학에서 siRNA-함유 지질계 생산품의 일반적인 채택을 제한할 것이다. 명백하게도, 최종 생산물이 장시간 저장에 적합한 siRNA-로딩된(loaded) 나노캐리어를 제형화하기 위한 상대적으로 간단하고 효과적인 방법을 개발할 필요성이 있다.
지난 20년 동안, 1~1,000nm의 나노크기 입자들에 기초한 몇몇 치료법은 암, 통증 및 전염성 질병의 치료를 위해 성공적으로 소개되어왔다. 환경 조건(열, pH, 효소성 분해)에 대해 고민감성이고 나쁜 막 투과성을 보통 보이는 친수성 생-고분자(bio-macromolecules)(예, 펩티드 또는 siRNA)는, 나노캐리어에 의한 세포 내 전달을 위한 충분한 후보군으로 고려되었다. 이러한 나노캐리어는, 짧은 생리학적 반감기로부터 고통받는 이러한 고분자의 혈액 순환 시간을 연장시 킬 수 있고, 이어서 신속히 제거된다. 그러나, 이러한 목적으로 사용된 임상적으로 관련 있는 나노캐리어의 수는 부족하고, 주된 장애는 여전히 해결되기 위해 남아있으며, 특히 비경구적 경로의 투여를 통한 그들의 효과적인 전달에 대한 문제가 여전히 남아있다. siRNA는, 완전한 치료학적 잠재성을 이용하기 위해 적절한 나노캐리어의 응용이 가장 필요한 친수성 생-고분자 부류를 대표한다.
WO 2007/083316
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본 발명은 반대 특성들(소수성 또는 친수성)의 안정한 나노입자들로부터 소수성 또는 친수성 시제(agents)의 활성제, 예를 들어 siRNA(또는 콜레스테롤 표지된 siRNA와 같은 그의 다양한 화학적 유도체)의 방출을 방지하고 조절하기 위한 이중 나노캡슐화의 독특한 방법을 이용한다. 활성제의 방지는, 방지될 시제를 나노캐리어 안으로 로딩하고, 이후에 서브-마이크론(sub-micron) 나노입자로 캡슐화함으로써 달성된다. 서브-마이크론 나노입자(나노캡슐 또는 나노구) 형성물은 신규한 나노분무(nanospray) 기술의 사용에 의해 성공적으로 달성되어왔다.
본 발명의 전달 시스템은, 약물의 반감기, 생분배(biodistribution) 및 약물동력학을 개선하는 친수성 생-고분자(예, siRNA) 또는 소수성 생-고분자의 전신성 전달을 위한 플랫폼(platform)을 제공한다.
따라서, 본 발명은 이중-캡슐화된 활성제를 포함하는 약물 전달 시스템에 관한 것이며, 상기 이중-캡슐화된 활성제는 친수성 또는 소수성 활성제 중 어느 하나를 안정화시킬 수 있고 세포 안으로 표적화 전달을 가능하게 한다.
본 발명의 일 양태로서, 본 발명은 복수의 나노캐리어(하나 이상)를 캡슐화하는 나노입자를 제공하는데, 상기 복수의 나노캐리어 중 적어도 하나는 적어도 하나의 활성제를 함유하며, 상기 나노입자는 400 내지 950 nm의 평균 직경을 갖는다.
일부 실시예에서, 본 발명에 따른 나노입자를 형성하기 위한 활성제의 이중-캡슐화는 하기에서 구체적으로 설명되는 나노분무에 의해 수득될 수 있다. 나노분무의 공정은 나노분무 공정에 의해 수득된 나노입자를 건조하는 것을 더 포함할 수 있다. 건조는, 예를 들어 동결 건조, 열 건조, 감압, 용매 추출법 및 다른 기술을 사용하여 매질 용매를 증발시키는 것에 의해 달성될 수 있다.
추가적인 실시예로서, 나노입자는 하기로부터 선택된다:
i. 활성제가 소수성인 경우, 나노캐리어 재료는 소수성이고 나노입자 재료는 친수성이며;
ii. 활성제가 친수성인 경우, 나노캐리어 재료는 친수성이고 나노입자 재료는 소수성이며;
iii. 활성제가 소수성인 경우, 나노캐리어 재료는 소수성이고 나노입자 재료는 소수성이고;
iv. 활성제가 친수성인 경우, 나노캐리어 재료는 친수성이고 나노입자 재료는 친수성이다.
다른 실시예에서, 활성제는 siRNA이다. 일부 실시예에서, 활성제는 siRNA이며, 나노캐리어는 폴리양이온성 지질을 더 포함한다. 일부 실시예에서, 폴리양이온성 지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)이다.
당해 분야의 통상에 기술자에 의해 이해될 수 있지만, 용어 "재료"는 나노입자 또는 나노캐리어를 구성하는 재료를 지칭한다. 따라서, 용어 "나노캐리어 재료"는 나노캐리어를 구성하는 재료(들)를 지칭한다. 유사하게, "나노입자 재료"는 나노입자를 구성하는 재료이다. 복수의 나노캐리어는 상이한 재료로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 나노캐리어 재료(들)는 나노입자 재료와 상이하다.
일부 실시예에서, 나노캐리어는 금속성 재료로 구성될 수 있거나, 비-금속성 재료와 함께 금속성 재료를 함유할 수 있다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 금 나노구(gold nanosphere)이다.
재료의 소수성 또는 친수성은 물에 대한 재료의 고유한 습성에 의해 결정될 수 있으며, 또한 하기에서 더 논의되지만, 상기 재료를 가교하는 것, 재료의 유도체화, 상기 재료에 대한 전하 유도(재료가 양전하 또는 음전하를 띠도록), 상기 재료를 다른 재료와 혼합 또는 콘쥬게이션하는 것, 및 당해 분야에 달려진 임의의 다른 수단들 중 하나 이상에 의해 재료를 변형하는 것에 의해 달성(또는 조절)될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따르면, 재료의 선택은 재료 고유의 특성에 기초하거나, 더욱 또는 덜 소수성 또는 친수성이 되도록 전술한 것과 같은 변형을 겪는 재료의 능력에 기초한다.
일부 실시예에서, 나노입자 재료 및/또는 나노캐리어 재료는 재료의 소수성을 감소시키기 위하여(수성 매질에서의 용해도를 감소시킴) 가교될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 복수의 나노캐리어를 캡슐화하는 나노입자가 제공되며, 상기 복수의 나노캐리어 중 적어도 하나(하나 이상)는 적어도 하나의 활성제를 함유하며, 상기 나노입자는 본원에 정의된 나노분무에 의해 제조된다.
일부 실시예에서, 나노입자는 4 마이크론 미만의 평균 직경을 가진다. 다른 실시예에서, 나노입자는 2 마이크론 미만의 평균 직경을 가진다. 다른 실시예에서, 나노입자는 1 마이크론 미만의 평균 직경을 가진다. 추가적인 실시예에서, 상기 나노입자는 950 nm 미만의 평균 직경을 가진다. 일부 실시예에서, 형성된 나노입자는 400 내지 950 nm의 평균 직경을 가진다.
일부 실시예에서, 나노입자는 하기로부터 선택된다:
i. 활성제가 소수성인 경우, 나노캐리어 재료는 소수성이고 나노입자 재료는 친수성이며;
ii. 활성제가 친수성인 경우, 나노캐리어 재료는 친수성이고 나노입자 재료는 소수성이며;
iii. 활성제가 소수성인 경우, 나노캐리어 재료는 소수성이고 나노입자 재료는 소수성이며; 그리고
iv. 활성제가 친수성인 경우, 나노캐리어 재료는 친수성이고 나노입자 재료는 친수성이다.
추가적인 실시예에서, 나노입자 재료 및/또는 나노캐리어 재료는 재료의 친수성을 감소시키기 위하여(수성 매질에서의 용해도를 감소시킴) 가교될 수 있다.
다른 실시예에서, 활성제는 siRNA이다. 일부 실시예에서, 활성제는 siRNA이며, 나노캐리어는 폴리양이온성 지질을 더 포함한다. 일부 실시예에서, 폴리양이온성 지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판(DOTAP)이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 복수의(하나 이상의) 나노캐리어를 캡슐화하는 나노입자가 제공되며, 상기 복수의 나노캐리어 중 적어도 하나는 적어도 하나의 활성제를 함유하고, 이때:
활성제가 소수성인 경우, 나노캐리어 재료는 소수성이고, 나노입자 재료는 친수성이며; 나노입자 재료는 수성 매질에서의 용해도를 감소시키기 위하여 선택적으로 더 가교되거나; 또는
활성제가 친수성인 경우, 나노캐리어 재료는 친수성이고, 선택적으로 가교되고, 나노입자 재료는 소수성이다.
일부 실시예에서, 나노입자는 4 마이크론 미만의 평균 직경을 가진다. 다른 실시예에서, 나노입자는 2 마이크론 미만의 평균 직경을 가진다. 다른 실시예에서, 나노입자는 1 마이크론 미만의 평균 직경을 가진다. 추가적인 실시예에서, 상기 나노입자는 950 nm 미만의 평균 직경을 가진다. 또 추가적인 실시예에서, 나노입자는 400 내지 950 nm의 평균 직경을 가진다.
일부 실시예에서, 상기 나노입자는 나노분무-건조에 의해 형성된다.
다른 실시예에서, 활성제는 친수성이다. 일부 실시예에서, 활성제가 siRNA인 경우, 친수성 활성제는 siRNA이다. 이러한 실시예에서, 나노캐리어는 폴리양이온성 지질을 더 포함한다. 일부 실시예에서, 폴리양이온성 지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 복수(하나 이상)의 나노캐리어를 캡슐화하는 나노입자가 제공되는데, 상기 복수의 나노캐리어 중 적어도 하나는 적어도 하나의 활성제를 함유하며, 상기 나노입자는 400 내지 950 nm의 평균 직경을 가지며, 이때:
활성제가 소수성인 경우, 나노캐리어 재료는 소수성이고 나노입자 재료는 친구성이며; 나노입자 재료는 수성 매질에서의 용해도를 감소시키기 위해 선택적으로 더 가교되거나; 또는
활성제가 친수성인 경우, 나노캐리어 재료는 친수성이고, 선택적으로 가교되고, 나노입자 재료는 소수성이다.
일부 실시예에서, 상기 나노입자는 나노분무에 의해 형성된다.
다른 실시예에서, 활성제는 친수성이다. 일부 실시예에서, 활성제가 siRNA인 경우, 친수성 활성제는 siRNA이다. 이러한 실시예에서, 나노캐리어는 폴리양이온성 지질을 더 포함한다. 일부 실시예에서, 폴리양이온성 지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 복수의(하나 이상의) 나노캐리어를 캡슐화하는 나노입자를 제공하는데, 상기 복수의 나노캐리어 중 적어도 하나는 적어도 하나의 활성제를 함유하며, 상기 나노입자는 400 내지 950 nm의 평균 직경을 가지며, 이때:
활성제가 소수성인 경우, 나노캐리어 재료는 소수성이고 나노입자 재료는 친수성이며; 나노입자 재료는 임의적으로 더 가교되어 수성 매질에서의 그의 용해도를 감소시키거나; 또는
활성제가 친수성인 경우, 나노캐리어 재료는 친수성이며, 임의적으로 가교되고, 나노입자 재료는 소수성이며;
상기 나노입자는 나노분무에 의해 형성된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 복수의(하나 이상의) 나노캐리어를 캡슐화하는 나노입자를 제공하는데, 상기 복수의 나노캐리어 중 적어도 하나는 적어도 하나의 활성제를 함유하며, 상기 나노입자는 400 내지 950 nm의 평균 직경을 가지며, 하기 정의된 바와 같은 나노입자는 나노분무에 의해 제조된다.
일부 실시예에서, 나노입자는 하기로부터 선택된다:
i. 활성제가 소수성인 경우, 나노캐리어 재료는 소수성이고 나노입자 재료는 친수성이며;
ii. 활성제가 친수성인 경우, 나노캐리어 재료는 친수성이고 나노입자 재료는 소수성이며;
iii. 활성제가 소수성인 경우, 나노캐리어 재료는 소수성이고 나노입자 재료는 소수성이며; 그리고
iv. 활성제가 친수성인 경우, 나노캐리어 재료는 친수성이고 나노입자 재료는 친수성임.
추가적인 실시예에서, 나노입자 재료 및/또는 나노캐리어 재료는 재료의 친수성을 감소시키기 위하여(수성 매질에서의 용해도를 감소시킴) 가교될 수 있다.
다른 실시예에서, 활성제는 siRNA이다. 일부 실시예에서, 활성제가 siRNA인 경우, 나노캐리어는 폴리양이온성 지질을 더 포함한다. 일부 실시예에서, 폴리양이온성 지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)이다.
본 발명의 " 나노입자 "는 미립자의 캐리어, 나노캡슐(NC) 또는 나노구(NS)인데, 이들은 생적합성이며 화학물질 및/또는 물리적 파괴(physical destruction)에 충분한 저항력이 있어서, 나노입자의 충분한 양은 인간 또는 동물의 신체 안으로 투여된 후에 실질적으로 온전히 남아 있고, 소정의 표적 장기(조직)에 도달하기에 충분한 시간 동안 남아 있는다. 일반적으로, 나노입자는 구형이며, 다수의 나노입자들은 1 μm(마이크론) 미만의 평균 직경을 가지면서 최대 2 μm(마이크론)의 평균 직경을 갖는다.
앞서 말했듯이, 본 발명의 일부 양태 및 실시예에서, 나노입자는 1 마이크론 미만의 평균 직경을 가진다. 일부 양태 및 실시예에서, 나노입자는 약 400 내지 950 nm의 평균 직경을 가진다. 다른 실시예에서, 상기 나노입자의 평균 직경은 약 400 내지 900 nm이다. 일부 다른 실시예에서, 평균 직경은 약 400 내지 800 nm이다. 추가적인 실시예에서, 평균 직경은 약 400 내지 700 nm이다. 추가적인 양태 및 실시예에서, 나노입자는 400 내지 600 nm의 평균 직경을 가진다.
나노입자의 평균 직경은 당해 분야의 통상의 기술자에게 알려진 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다는 것을 알아야 할 것이다. 용어 " 평균 직경 "은 측정된 직경의 산술 평균을 지칭하는 것이며, 상기 직경들은 평균의 ±25%, ±15%, ±10%, 또는 ±5% 범위이다. 나노입자가 구형이 아닌 경우에, 상기 용어는 입자의 가장 큰 치수인 유효 평균 직경을 지칭한다.
본 발명의 나노입자는 복수의 나노캐리어를 보유할 수 있을 만큼 충분히 커야하며, 또한 이와 동시에 내부화(internalization)를 겪을 수 있도록 충분히 작아야 할 것이다.
본 발명의 나노입자 내에 함유되는 복수의(하나 이상의) " 나노캐리어 "는 그 자체가 미립자의 캐리어인데, 나노캐리어 각각은 300 nm 미만, 250 nm 미만, 또는 200 nm 미만의 평균 직경을 가진다. 나노캐리어는 나노캡슐(NC) 또는 나노구(NS)의 형태일 수 있다. 일반적으로, 나노캐리어는 구형이다. 나노캐리어의 형상이 구가 아닌경우, 직경은 입자의 가장 긴 치수로 언급뇌다.
본 발명에 따른 하나의 나노입자 내에 캡슐화되는 나노캐리어의 수는, 예를 들어, 나노캐리어의 크기 또는 나노캐리어와 나노입자의 상대적 크기에 따라 변화할 수 있다. 전형적으로, 각각의 나노입자는 1 내지 약간의(6~7) 십여개의 나노캐리어(복수의 나노캐리어)를 함유할 수 있다. 일부 실시예에서, 각각의 나노입자는 2 내지 50개의 나노캐리어를 포함한다. 일부 실시예에서, 각각의 나노입자는 2 내지 40개의 나노캐리어를 포함한다. 일부 실시예에서, 각각의 나노입자는 2 내지 30개의 나노캐리어를 포함한다. 일부 실시예에서, 각각의 나노입자는 2 내지 20개의 나노캐리어를 포함한다. 일부 실시예에서, 각각의 나노입자는 2 내지 10개의 나노캐리어를 포함한다.
일부 실시예에서, 각각의 나노입자는 2개를 초과하는 나노캐리어를 포함한다.
나노캐리어는 적어도 하나의 활성제를 " 함유 "하는 것이라고 한다. 하기에서 예시되는 바와 같이, 적어도 하나의 활성제는 상기 나노캐리어의 코어(core)에 함유될 수 있으며, 및/또는 나노캐리어를 구성하는 재료 매트릭스(material matrix)에 함유될 수 있으며, 및/또는 상기 나노캐리어의 표면 영역(하나 이상, 또는 전체 표면)과 관련될 수 있다.
일부 실시예에서, 나노캐리어가 금속성 입자, 예를 들어 금 나노구(gold nanosphere)인 경우에, 적어도 하나의 활성제는 상기 금속성 입자의 표면 영역(하나 이상, 또는 전체 표면)과 관련된다.
일부 실시예에서, 나노캐리어 그 자체는 하기 자세히 설명된 바와 같이 나노분무에 의해 제조된다.
일부 실시예에서, 나노캐리어의 평균 직경은 적어도 약 50 nm이다.
일부 실시예에서, 나노캐리어의 평균 직경은 약 100 내지 300 nm이다. 다른 실시예에서, 평균 직경은 약 200 내지 300 nm이다. 다른 실시예에서, 평균 직경은 약 50 내지 300 nm이다. 다른 실시예에서, 평균 직경은 약 50 내지 250 nm이다. 추가적인 실시예에서, 평균 직경은 약 50 내지 200 nm이다. 추가적인 실시예에서, 평균 직경은 약 50 내지 150 nm이다. 추가적인 실시예에서, 평균 직경은 약 50 내지 100 nm이다.
당해 분야의 통상의 기술자가 이해할 수 있지만, 재료의 " 친수성 "은 물에 대한 친화도를 보이는 재료의 특징이지만, " 소수성 " 재료는 물에 대해 반대 반응을 보유한다.
수성 매질에서 나노입자의 용해성 또는 불용해성은, 이러한 매질에서 최종 나노입자 용해성을 증가시키거나 감소시키기 위하여 최종 나노입자 재료 또는 나노캐리어를 가교함으로써 변화될 수 있다.
선택된 응용에 있어서, 나노입자 및/또는 나노캐리어는 폴리머 쉘(shell) 및 코어(core)를 가진 " 나노캡슐 "의 형태, 다시 말해 코어/쉘 구조를 가질 수 있는데, 상기 폴리머 쉘 및 코어는 비어있을 수 있거나 적어도 하나의 유상(oily phase) 또는 수상(aqueous phase)을 함유할 수 있다. 대안으로, 나노입자 및/또는 나노캐리어는 실질적으로 균일한 조성물, 즉 연속적인 재료로 이루어진 " 나노구( nanospheres ) "(NS)일 수 있으며, 뚜렷한 코어/쉘 구조를 특징으로 하지 않을 수 있다.
일부 실시예에서, 본 발명의 나노입자 및 나노입자 안에 함유된 복수의 나노캐리어는 나노캡슐의 형태이다. 다른 실시예에서, 나노입자 및 나노캐리어는 모두 나노구이다. 일부 다른 실시예에서, 나노입자는 나노캡슐의 형태일 수 있고, 나노캐리어는 나노구의 형태일 수 있다. 추가적인 실시예에서, 나노입자는 나노구의 형태일 수 있고, 나노캐리어는 나노캡슐의 형태일 수 있다.
용어 " 캡슐화 "(또는 임의의 구어적 변형)는 예를 들어 나노입자 내에 적어도 하나의 나노캐리어의 저장을 지칭하거나, 또는 나노캐리어(앞서 정의함) 내에 활성 재료의 저장을 지칭한다. 그러므로, 일부 실시예에 따르면, 나노입자는 하나 이상의 나노캐리어를 캡슐화하는 것이다.
일부 다른 실시예에서, 나노입자는 나노캡슐, 나노구 및 그의 혼합물로부터 선택되는 복수의 나노캐리어를 캡슐화한다. 나노캐리어(NS 및/또는 NC)의 극성의 형성에도 불구하고, 본 발명의 나노입자는 상이한 재료 및/또는 상이한 활성제의 복수의 나노캐리어를 캡슐화할 수 있다. 본 발명의 나노입자는, 예를 들어 동일한 폴리머 재료의 복수의 나노캐리어와 함께(따라서 동일한 친수성/소수성 특성을 가짐), 하나 이상의 상이한 활성제를 함유할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 나노입자는 상이한 폴리머 재료의 복수의 나노캐리어를 함유할 수 있지만, 각각의 나노입자는 동일한 활성제를 함유한다.
본 발명의 일부 양태에서, 본 발명의 나노입자의 혼합물이 제공되며, 상기 혼합물은 하나 이상의 유형의 나노입자를 포함하고, 상기 하나 이상의 나노입자 유형은 적어도 하기 중 어느 하나와 서로 다른 유형이다:
1. 나노캐리어 재료,
2. 나노입자 재료,
3. 활성제,
4. 나노입자/나노캐리어 형태(NS 또는 NC),
5. 나노입자/나노캐리어 크기.
전술한 바와 같이, 본 발명의 일부 양태 및 실시예에서, 나노입자는 나노분무에 의해 얻을 수 있다. 이 방법은 기결정된 크기(직경)의 하나 이상의 구멍(orifice)(홀, 개구, 펑크, 핀홀)을 가진 스크린(예, 메시(mesh))을 통과해서 콜로이드 조성물을 수송(예, 전달, 분무)하는 것을 포함하되, 상기 콜로이드 조성물은 액체 매질에서 복수의 나노캐리어 및 나노입자 재료, 예를 들어 폴리머 재료를 포함하며, 상기 복수의 나노캐리어는 적어도 하나의 활성제를 포함하고, 상기 나노입자 재료는 상기 액체 매질에 적어도 부분적으로 가용성이며, 상기 구멍의 크기는 나노입자의 (최대) 크기(직경)를 결정한다.
일부 실시예에서, 구멍들은 4 마이크론 미만, 또는 2 마이크론 미만, 또는 1 마이크론 미만, 또는 950 nm 미만, 또는 400 내지 950 nm, 또는 400 내지 900 nm, 또는 약 400 내지 800 nm, 또는 약 400 내지 700 nm, 400 내지 600 nm의 평균 직경을 갖는 나노입자의 제조를 가능하게 한다.
이러한 나노입자 크기를 가능하게 하기 위하여, 구멍 크기(홀 직경)는 7 마이크론 내지 1 마이크론의 범위로 선택된다. 일부 실시예에서, 스크린은 4 내지 6 마이크론 메시 크기를 가진다. 일부 실시예에서, 스크린은 4 마이크론 메시 크기를 가진다.
일부 실시예에서, 콜로이드 조성물은 액체 매질에서 복수의 나노캐리어를 나노입자 재료, 예를 들어 폴리머 재료와 혼합하여 제조된다.
일부 실시예에서, 나노분무 공정은 나노입자들을 건조하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시예에서, 나노캐리어는 나노분무에 의해 얻어진다.
본 발명의 나노입자는 주로 폴리머들로 구성된다. 용어 " 폴리머 "는 호모폴리머(homopolymer), 공폴리머(copolymer), 예를 들어 블록(block), 그래프트(graft), 랜덤(random) 및 교번(alternating) 공폴리머 뿐만 아니라 3량체폴리머(terpolymer)를 포함하며, 그들의 유도체, 조합 및 그들의 배합물들을 더 포함한다. 상기 외에도, 상기 용어는 선형, 블록, 그래프트, 랜덤, 교번, 분지형 구조 및 그의 조합을 포함하는 이러한 구조들의 모든 기하학적 배열들을 포함한다.
나노입자의 제작에 사용된 폴리머는 생분해성이며, 다시 말하면, 그들은 생체 내 사용 중에 분해한다. 일반적으로, 생분해능력에 기인한 분해는 생분해성 폴리머의 구성 서브유닛으로의 분해, 또는 예를 들어 효소에 의해 수행되는 생화학적 과정에 의한 폴리머의 더 작은 비-폴리머 서브유닛으로의 소화를 수반한다. 분해는 하기 중 하나 또는 둘 모두에서 수행될 수 있다: 폴리머 매트릭스 내의 결합의 분리를 수반하는 생분해(이 경우, 모노머 및 올리고머가 일반적으로 생성됨), 또는 측쇄의 안쪽 결합 또는 측쇄에서 폴리머 백본에 결합하는 결합의 분리를 수반하는 생분해. 일부 실시예에서, 생분해는 일반적인 유형의 생분해를 아우른다. 폴리머들은 게다가 생적합성이며, 다시 말하면, 그들은 실질적으로 비독성이거나, 그들이 접촉하게되는 생조직 또는 생물계에 해로운 영향을 주지 않는다.
본 발명의 나노입자들은 약물 전달 플랫폼으로 사용될 수 있으며, 이때 상기 플랫폼은 세포를 관통하고 표적화된 세포 또는 세포 기관 안으로 활성제의 방출을 가능하게 한다. 세포막 관통을 촉진하기 위하여, 본 발명의 나노입자는 상이한 표적화제(targeting agent)와 연관될 수 있다.
일부 실시예에서, 나노입자의 외부 표면은 적어도 하나의 표적화제와 연관된다. 이러한 실시예에서, 적어도 하나의 표적화제는 고형 종양에서 과발현된 GER-2 수용체을 인식하는 트라스투주맙(trastuzumab)(Herceptin®); H 페리틴을 인식하는 AMBLK8, EGFR 수용체를 인식하는 세툭시맙(cetuximab)(Erbitux®); CD20을 인식하는 리툭시맙(Rituximab)(MabThera®); 새로운 혈관 형성을 촉진하는 "혈관 내피 생성 인자"(VEGF)로 불리는 천연 단백질의 기능을 억제하는 베바시주맙(bevacizumab)(Avastin®); VEGF-A에 대한 강한 결합을 제공하는 라니비주맙(ranibizumab)(Lucentis®); 엽산 또는 엽산염과 같은 소분자; 히알루론산 또는 히알루로난(hyaluronan); 일반적으로 약 6~15 kDa인 종양 관통 펩티드; 표피 성장 인자(EGF); 트랜스페린; 페리틴; 아르기닌-글리신-아스파르트산(RGD) 펩티드; 상피 세포 접착 분자(EpCAM); 세포 간 접착 분자 1(ICAM-1); 암배아 항원(carcinoembryonic antigen)(CEA); 혈관활성장관폴리펩티드; CA 15-3 항원; MUC1 단백질; CD20, CD33; 인테그린; 림프 표적 모이어티(예, LyP-1); 앱타머, 예를 들어 PSMA 앱타머 또는 VEGF 앱타머; 올리고당 등과 같은 단일클론 항체로부터 선택된다.
일부 실시예에서, 표적화제는 베바시주맙(Avastin®) 또는 라니비주맙(Lucentis®)이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "연관" 또는 그의 구어적 변형물은 두 개의 독립체를 함께 붙드는 화학적 또는 물리적 상호작용을 지칭한다(예, 나노입자 및 표적화제, 링커 모이어티 또는 활성제와 나노캐리어 표면, 또는 이와 유사한 임의의 상호작용). 상호작용은 당해 분양의 통상의 기술자에가 알려진 화학적 또는 물리적 결합 상호작용의 임의의 유형일 수 있다. 이러한 상호작용(연관)의 제한되지 않는 예는 이온 결합, 공유 결합, 배위 결합, 착물화, 수소 결합, 반데르발스 결합, 소수성-친수성 상호작용 등을 포함한다. 일부 실시예에서, 연관은 공유 결합을 통해 이루어진다. 다른 실시예에서, 연관은 배위 결합을 통해 이루어진다. 일부 경우에서, 두 개의 원자 또는 두 개의 화학적 독립체 사이에 연관성 상호작용(assosiative interactions)은 하나 초과의 화학적 및/또는 물리적 상호작용을 수반할 수 있다고, 통상의 기술자에게 이해될 것이다.
일단 생세포가 생체 내 또는 시험관 내에 있으면, 활성제는 적절한 세포 기관에 전달되거나, 그렇지 않으면 엔도솜 또는 리소솜과 같은 세포 소기관으로의 구획화를 피하여야만 하고, 세포 간의 생물학적 이용이 가능하여야만 한다. 그러므로, 일부 실시예에서, 상기 적어도 하나의 나노캐리어는 양이온성 지질(예, DOTAP) 또는 펩티드에 양전하를 부여하는 아르기닌 또는 리신 잔기와 같은 다양한 아미노산을 함유하는 세포 관통성 펩티드를 가진다. 이러한 펩티드들은 세포를 관통하고 세포질에서 나노캐리어의 카고(cargo)를 방출할 수 있다. 이러한 펩티드는 HIV-TAT, 페네트라틴(penetratin), 그라미시딘 S(Gramicidin S), MSI-103, MSI-103-Arg, PGLa, PGLa-Arg, 마가이닌 2(magainin 2), 마가이닌-2-Arg, KIGAKI, BP100, MAP, MAP-Arg, SAP, PEP-1, 트랜스포탄(transportan), FP23 등으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시예에서, 양이온성 지질은 DOTAP이다.
전술한 바와 같이, 나노입자들은 적어도 하나의 나노캐리어를 포함할 수 있는데, 상기 나노캐리어는 친수성 매트릭스(재료)를 포함하는 나노구이며, 적어도 하나의 활성제는 친수성이어서 친수성 매트릭스 내에서 분포된다.
일부 실시예에서, 나노구 친수성 재료는 덱스트란, 히알루로네이트, 보통의 또는 가교된 인간 혈청 알부민(HSA), 보통의 또는 가교된 소 혈청 알부민(BSA), 키토산, 셸락(shellac), 콜라겐, 젤라틴, 검 아라빅, 폴리비닐알콜, 시클로덱스트린, 전술한 것들 홀로 또는 그들 중 하나 이상과 조합되는 것들로부터 선택된다. 다른 실시예에서, 친수성 재료는 인간 혈청 알부민(HSA), 소 혈청 알부민(BSA) 또는 히알루론산이다.
일부 실시예에서, 친수성 재료는 약 66,500 Da의 평균 분자량을 갖는 인간 혈청 알부민(HSA), 또는 20,000으로부터 최대 1,000,000 Da 크기의 평균 분자량 범위를 갖는 히알루론산이다.
이러한 실시예에 따르면, 친수성 활성제는 엑세나타이드(exenatide), 인슐린, 성장 호르몬, 트립토렐린 아세테이트(triptorelin acetate), 부세렐린(buserelin), 나파렐린(nafarelin)과 같은 치료적 단백질 또는 펩티드, 및 그 밖에 DNA, RNA, siRNA, tRNA 또는 그의 유도체 또는 단편으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시예에서, 친수성제(hydrophilic agent)는 siRNA이다.
다른 실시예에서, siRNA는 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12의 뉴클레오티드 서열을 가진다.
일부 실시예에서, 친수성 재료는 가교 되어서, 수성 매질에서 나노캐리어의 용해도를 낮춘다.
일부 실시예에서, 나노캐리어가 성질이 친수성인 경우에, 나노입자는 소수성 쉘을 포함하는 나노캡슐의 형태일 수 있다(즉, 친수성 나노캐리어를 캡슐화하는 소수성 나노입자). 이런 배치는 보통 안정화 및 전달에 문제가 있는 친수성제의 캡슐화와 안정화를 가능하도록 한다.
이러한 실시예에서, 소수성 쉘은 락트산, 폴리(D,L-락틱-코-글리콜산)(PLGA), 폴리(D,L-락트산)(PLA), 폴리(ε-카프롤락톤), 폴리(2-디메틸아미노-에틸메타크릴레이트)호모폴리머, 폴리(2-디메틸아미노-에틸메타크릴레이트)-b-폴리(에틸렌글리콜)-α-메톡시-ω-메타크릴레이트 코폴리머, 폴리시아노아크릴레이트, 폴리안히드리드 폴리머 및 그들의 조합으로부터 선택된 폴리머로 이루어진다.
일부 실시예에서, 소수성 쉘은 폴리머의 페길화된 유도체인데, 여기서 상기 폴리머는 락트산, 폴리(D,L-락틱-코-글리콜산)(PLGA), 폴리(D,L-락트산)(PLA), 폴리(ε-카프롤락톤), 폴리(2-디메틸아미노-에틸메타크릴레이트)호모폴리머, 폴리(2-디메틸아미노-에틸메타크릴레이트)-b-폴리(에틸렌글리콜)-α-메톡시-ω-메타크릴레이트 코폴리머, 폴리시아노아크릴레이트, 폴리안히드리드 폴리머 및 그들의 조합으로부터 선택된다.
다른 실시예에서, 소수성 쉘은 락트산, 폴리(D,L-락틱-코-글리콜산)(PLGA) 및 그의 조합으로부터 선택되며, 그들의 페길화된 유도체(그 자체 또는 조합들)도 포함한다. 이러한 실시예에서, PLGA는 약 4,000 내지 100,000 Da의 분자량을 가진다.
세포막 저지력을 감소시키기 위하여, 소수성 쉘은 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티와 연관된 외부 표면을 가질 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서, 나노입자는 적어도 하나의 나노캐리어를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 나노캐리어는 소수성 폴리머 매트릭스를 포함하는 나노구이며, 상기 나노구 내에 함유된 적어도 하나의 활성제도 소수성이다.
이러한 실시예에서, 소수성 폴리머 매트릭스는 락트산, 폴리(D,L-락틱-코-글리콜산)(PLGA), 폴리(D,L-락트산)(PLA), 폴리(ε-카프롤락톤), 폴리(2-디메틸아미노-에틸메타크릴레이트)호모폴리머, 폴리(2-디메틸아미노-에틸메타크릴레이트)-b-폴리(에틸렌글리콜)-α-메톡시-ω-메타크릴레이트 코폴리머, 폴리시아노아크릴레이트 및 그들의 조합, 및 그들의 페길화된 유도체로부터 선택될 수 있다.
다른 실시예에서, 소수성 폴리머 매트릭스는 락트산, 폴리(D,L-락틱-코-글리콜산)(PLGA) 및 그의 조합으로부터 선택되며, 그들의 페길화된 유도체와의 혼합물도 포함한다.
일부 다른 실시예에서, 상기 PLGA는 약 4,000 내지 100,000 Da의 분자량을 가진다.
다른 실시예에서, 소수성 활성제는 진통제 또는 항염증제 (예, 알록시프린(aloxiprin), 아우라노핀(auranofin), 아자프로파존(azapropazone), 베노릴레이트(benorylate), 디플루니살(diflunisal), 에토돌락(etodolac), 펜부펜(fenbufen), 페노프로펜(fenoprofen), 칼심(calcim), 플루비프로펜(flubiprofen), 이부프로펜(ibuprofen), 인도메타신(indomethacin), 케토프로펜(ketoprofen), 메클로페남산(meclofenamic acid), 메페남산(mefenamic acid), 나부메톤(nabumetone), 나프록센(naproxen), 옥시펜부타존(oxyphenbutazone), 페닐부타존(phenylbutazone), 피록시칸(piroxican), 또는 술린닥(sulindac)); 구충제(anthelmintic agent) (예, 알벤다졸(albendazole), 베페늄 히드록시나프토에이트(bephenium hydroxynaphthoate), 캄벤사졸(cambensazole), 디클로로펜(dichlorophen), 이버멕틴(ivermectin), 메벤다졸(mebendazole), 옥삼니퀸(oxamniquine), 옥세펜다졸(oxefendazole), 옥산텔 엠보에이트(oxantel embonate), 프라지퀀텔(praziquantel), 피란텔 엠보에이트(pyrantel embonate), 또는 티아벤다졸(thiabendazole)); 항부정맥제(anti-arrhythmic agent) (예, 아미오다론(amiodarone), 디소피라미드(disopyramide), 플레카이니드 아세테이트(flecainide acetate), 또는 퀴니딘 술페이트(quinidine sulphate)); 항세균제(anti-bacterial agent) (예, 베네타민 페니실린(benethamine penicillin), 시녹사신(cinoxacin), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 클라리트로마이신(clarithromycin), 클로파지민(clofazimine), 클록사실린(cloxacillin), 데메클로시클린(demeclocycline), 독시시클린(doxycycline), 에리트로마이신(erythromycin), 에티온아미드(ethionamide), 이미페넴(imipenem), 날리딕스산(nalidixic acid), 니트로푸란토인(nitrofurantoin), 리팜피신(rifampicin), 스피라마이신(spiramycin), 술파벤즈아미드(sulphabenzamide), 술파독신(sulphadoxine), 술파세타미드(sulphacetamide), 술파메라진(sulphamerazine), 술파디아진(sulphadiazine), 술파푸라졸(sulphafurazole), 술파메톡사졸(sulphamethoxazole), 술파피리딘(sulphapyridine), 테트라시클린(tetracycline), 또는 트리메토프림(trimethoprim)); 항응혈제 (예, 디코우마롤(dicoumarol), 디피리다몰(dipyridamole), 니코우말론(nicoumalone) 또는 페닌디온(phenindione)); 항우울제 (예. 아목사핀(amoxapine), 메프로틸린(meprotiline), 미안세린(mianserin), 노르트립틸린(nortriptyline), 트라조돈(trazodone), 또는 티리미프라민 말리에이트(tirimipramine maleate)); 항당뇨제(antidiabetic) (예, 아세토텍사미드(acetothexamide), 클로르프로파미드(chlorpropamide), 글리벤클라미드(glibenclamide), 글리클라지드(gliclazide), 글리피지드(glipizide), 톨라자미드(tolazamide), 또는 톨부트라미드(tolbutramide)); 항-간질제(anti-epileptic) (예, 베클라미드(beclamide), 카바마제핀(carbamazepine), 클로나제핀(clonazepine), 에토토인(ethotoin), 메토인(methoin), 메트숙시미드(methsuximide), 메틸페노바비톤(methylphenobarbitone), 옥스카바제핀(oxcarbazepine), 파라메타디온(paramethadione), 페나세미드(phenacemide), 페노바비톤(phenobarbitone), 페닐로인(phenyloin), 펜숙시이미(phensuximide), 프리미돈(primidone), 술티암(sulthiame), 또는 발프로산(valproic acid)); 항진균제(anti-fungal agent) (예, 암포테리신(amphotericin), 부토코나졸 니트레이트(butoconazole nitrate), 클로트리마졸(clotrimazole), 에코나졸 니트레이트(econazole nitrate), 플루코나졸(fluconazole), 플루시토신(flucytosine), 그리세오풀빈(griseofulvin), 이트라코나졸(itraconazole), 케토코나졸(ketoconazole), 미코나졸(miconazole), 나타마이신(natamycin), 니스타틴(nystatin), 술코나졸 니트레이트(sulconazole nitrate), 터비나핀(terbinafine), 터코나졸(terconazole), 티오코나졸(tioconazole) 또는 운데세노산(undecenoic acid)); 항통풍제(anti-gout agent) (예, 알로푸리놀(allopurinol), 프로베네시드(probenecid) 또는 술핀-피라존(sulphin-pyrazone)); 혈압강하제(anti-hypertensive agent) (예, 암로디핀(amlodipine), 베니디핀(benidipine), 다로디핀(darodipine), 딜리타젬(dilitazem), 디아족시드(diazoxide), 펠로디핀(felodipine), 구아나벤즈 아세테이트(guanabenz acetate), 이스라디핀(isradipine), 미녹시딜(minoxidil), 니카디핀(nicardipine), 니페디핀(nifedipine), 니모디핀(nimodipine), 페녹시벤즈아민(phenoxybenzamine), 프라조신(prazosin), 레세프린(reseprine) 또는 테라조신(terazosin)); 항말라리아제(anti-malarial agent) (예, 아모디아퀸(amodiaquine), 클로로퀸(chloroquine), 클로르프로구아닐(chlorproguanil), 할로판트린(halofantrine), 메플로퀸(mefloquine), 프로가닐(proganil), 피리메타민(pyrimethamine), 또는 퀴닌 술페이트(quinine sulphate)); 항-편두통제(anti-migraine agent) (예, 디히드로에르고타민 메실레이트(dihydroergotamine mesylate), 에르고타민 타르타레이트(ergotamine tartarate), 메티세르기드 말레이트(methysergide maleate), 피조티펜 말레이트(pizotifen maleate) 또는 수마트립탄 숙시네이트(sumatriptan succinate)); 항-무스카린제(anti-muscarinic agent) (예, 아트로핀(atropine), 벤즈헥솔(benzhexol), 비페리덴(biperiden), 에토프로파진(ethopropazine), 효스시아민(hyoscyamine), 메펜졸레이트 브로마이드(mepenzolate bromide), 옥시펜실시민(oxyphencylcimine), 또는 트로피카미드(tropicamide)); 항-신경가소성제(anti-neuroplastic agent) 또는 면역억제제(immunosuppressant) (예, 아미노글루테티이미드(aminoglutethimide), 암사크린(amsacrine), 아자티오프린(azathioprine), 부술판(busulphan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로스포린(cyclosporin), 다카바진(dacarbazine), 에스트라무스틴(estramustine), 에토포시드(etoposide), 로무스틴(lomustine), 멜팔란(melphalan), 머캅토퓨린(mercaptopurine), 메토트렉세이트(methotrexate), 미토마이신(mitomycin), 미토테인(mitotane), 미토잔트론(mitozantrone), 프로카바진(procarbazine), 타목시펜 시트레이트(tamoxifen citrate), 테스토락톤(testolactone), 타크롤리무스(tacrolimus), 또는 시롤리무스(sirolimus)); 항-원생동물제(anti-protazoal agent) (예, 벤즈니다졸(benznidazole), 클리오퀴놀(clioquinol), 데코퀴네이트(decoquinate), 디아이오도히드록시퀴놀린(diiodohydroxyquinoline), 디록사니드 푸로에이트(diloxanide furoate), 디니톨미드(dinitolmide), 푸르졸리돈(furzolidone), 메트로니다졸(metronidazole), 니모라졸(nimorazole), 니트로푸라존(nitrofurazone), 오르니다졸(ornidazole), 또는 티니다졸(tinidazole)); 항-갑상선제(anti-thyroid agent) (예, 카비마졸(carbimazole) 또는 프로필티오우라실(propylthiouracil)); 불안완화제(anxiolytic), 진정제(sedative), 수면제(hypnotic) 또는 신경이완제(neuroleptic agent) (예, 알파졸람(alparzolam), 아밀로바비톤(amylobarbitone), 바비톤(barbitone), 벤타제팜(bentazepam), 브로마제팜(bromazepam), 브롬페리돌(bromperidol), 브로티졸람(brotizolam), 부토바비톤(butobarbitone), 카브로말(carbromal), 클로르디아제폭시드(chlordiazepoxide), 클로르메티아졸(chlormethiazole), 클로르프로마진(chlorpromazine), 클로바잠(clobazam), 클로티아제팜(clotiazepam), 클로자핀(clozapine), 디아제팜(diazepam), 드로페리돌(droperidol), 에티나메이트(ethinamate), 플루나니손(flunanisone), 플루니트라제팜(flunitrazepam), 플루오프로마진(fluopromazine), 플루펜틱솔 데카노에이트(flupenthixol decanoate), 플루페나진 데카노에이트(fluphenazine decanoate), 플루라제팜(flurazepam), 발로페리돌(baloperidol), 로라제팜(lorazepam), 로메타제팜(lormetazepam), 메다제팜(medazepam), 메프로바메이트(meprobamate), 메타퀄론(methaqualone), 미다졸람(midazolam), 니트라제팜(nitrazepam), 옥사제팜(oxazepam), 펜토바비톤(pentobarbitone), 퍼페나진 프리모지드(perphenazine primozide), 프로클로페라진(prochlorperazine), 술피리드(sulpiride), 테마제팜(temazepam), 티오리다진(thioridazine), 트리아졸람(triazolam), 또는 조피클론(zopiclone)); 베타-차단제(beta-blocker) (예, 아세부톨롤(acebutolol), 알프레놀롤(alprenolol), 아테놀롤(atenolol), 라베탈롤(labetalol), 메토프롤롤(metoprolol), 나돌롤(nadolol), 옥스프레놀롤(oxprenolol), 핀돌롤(pindolol), 또는 프로파놀롤(propranolol)); 심근수축제(cardiac inotropic agent) (예, 암리논(amrinone), 디지톡신(digitoxin), 디곡신(digoxin), 에녹시몬(enoximone), 라나토시드 C(lanatoside C), 또는 메디곡신(medigoxin)); 코르티코스테로이드(corticosteroid) (예, 베클로메타손(beclomethasone), 베타메타손(betamethasone), 부데소니드(budesonide), 코르티손 아세테이트(cortisone acetate), 데스옥시메타손(desoxymethasone), 덱사메타손(dexamethasone), 플루드로코르티손 아세테이트(fludrocortisones acetate), 플루니솔리드(flunisolide), 플루코르톨론(flucortolone), 플루티카손 프로피오네이트(fluticasone propionate), 히드로코르티손(hydrocortisone), 메틸프레드니솔론(methylprednisolone), 프레드니솔론(prednisolone), 프레드니손(prednisone), 또는 트리암시놀론(triamcinolone)); 이뇨제(diuretic agent) (예, 아세트아졸아미드(acetazolamide), 아밀로리드(amiloride), 벤도플루아지드(bendofluazide), 부메타니드(bumetanide), 클로로티아지드(chlorothiazide), 클로르탈리돈(chlorthalidone), 에타크린산(ethacrynic acid), 프루세미드(frusemide), 메톨라존(metolazone), 스피로놀락톤(spironolactone), 또는 트리암테렌(triamterene)); 항-파키슨제(anti-Parkinsonian agent) (예, 브로모크립틴 메실레이트(bromocriptine mesylate) 또는 리수리드 말레이트(lysuride maleate)); 위장약(gastro-intestinal agent) (예, 비사코딜(bisacodyl), 시메티딘(cimetidine), 시사프리드(cisapride), 디페녹실레이트(diphenoxylate), 도페리돈(domperidone), 파모티딘(famotidine), 로페라미드(loperamide), 메살라진(mesalazine), 니자티딘(nizatidine), 오메프라졸(omeprazole), 온단세트론(ondansetron), 라니티딘(ranitidine), 또는 술파살라진(sulphasalazine)); 히스타민 H1-수용체 길항제(histamine H1-receptor antagonist) (예, 아크리바스틴(acrivastine), 아스테미졸(astemizole), 시나리진(cinnarizine), 시클리진(cyclizine), 시프로헵타딘(cyproheptadine), 디멘히드리네이트(dimenhydrinate), 플루나리진(flunarizine), 로라타딘(loratadine), 메클로진(meclozine), 옥사토미드(oxatomide) 또는 터페나딘(terfenadine)); 지질 조절제(lipid regulating agent) (예, 벤자피브레이트(bezafibrate), 클로피브레이트(clofibrate), 페노피브레이트(fenofibrate), 겜피브로질(gemfibrozil), 또는 프로부콜(probucol)); 니트레이트(nitrate) 또는 항-협심증제(anti-anginal agent) (예, 아밀 니트레이트(amyl nitrate), 글리세릴 트리니트레이트(glyceryl trinitrate), 이소소르비드 디니트레이트(isosorbide dinitrate), 이소소르비드 모노니트레이트(isosorbide mononitrate), 또는 펜타에리트리톨 테트라니트레이트(pentaerythritol tetranitrate)); 영양제(nutritional agent) (예, 베타카로텐(betacarotene), 비타민 A, 비타민 B2, 비타민 D, 비타민 E 또는 비타민 K); HIV 프로테아제 억제제(HIV protease inhibitor) (예, 넬피나비르(nelfinavir)); 오피오이드 진통제(opioid analgesic) (예, 코데인(codeine), 덱스트로프로피옥시펜(dextropropyoxyphene), 디아모르핀(diamorphine), 디히드로코데인(dihydrocodeine), 멥타지놀(meptazinol), 메타돈(methadone), 모르핀(morphine), 날부핀(nalbuphine), 또는 펜타조신(pentazocine)); 성호르몬(sex hormone) (예, 클로미펜 시트레이트(clomiphene citrate), 다나졸(danazol), 에티닐 에스트라디올(ethinyl estradiol), 메드록시프로게스테론 아세테이트(medroxyprogesterone acetate), 메스트라놀(mestranol), 메틸테스토스테론(methyltestosterone), 모레티스테론(morethisterone), 노르게스트렐(norgestrel), 에스트라디올(estradiol), 콘쥬게이션된 에스트로겐(conjugated oestrogens), 프로게스테론(progesterone), 스타노졸롤(stanozolol), 스틸베스트롤(stibestrol), 테스토스테론(testosterone), 또는 티볼론(tibolone)); 또는 흥분제(stimulant agent) (예, 아메페타민(amephetamine), 덱삼페타민(dexamphetamine), 덱스펜플루라민(dexfenfluramine), 펜플루라민(fenfluramine) 또는 마진돌(mazindol))로부터 선택된다.
일부 실시예에서, 나노캐리어가 소수성 성질을 갖는 경우에, 나노입자는 친수성 쉘을 포함하는 나노캡슐일 수 있다. 이러한 실시예에서, 친수성 쉘은 덱스트란, 히알루로네이트, 인간 혈청 알부민(HSA), 소 혈청 알부민(BSA), 키토산, 셸락, 콜라겐, 젤라틴, 검 아라빅, 폴리비닐알콜, 시클로덱스트린, 단독 또는 조합들로부터 선택될 수 있다. 필요에 따라, 상기 폴리머들 각각은 가교될 수 있다.
일부 실시예에 따르면, 친수성 재료는 인간 혈청 알부민(HSA), 소 혈청 알부민(BSA) 또는 히알루론산이다.
다른 실시예에 따르면, 친수성 매트릭스는 약 66,500 Da의 평균 분자량을 갖는 인간 혈청 알부민(HSA)이다.
본 발명의 약물 전달 시스템은 맞춤일 수 있고 그 시스템 내에 포함될 활성제(재료)에 기초하여 변형될 수 있다. 복수의 나노캐리어를 운송하는 나노입자는 하나 이상의 활성 재료를 운송하고 전달하는데에 사용될 수 있다. 예를 들어, 소수성 활성 재료는 소수성 나노캐리어(나노구 또는 나노캡슐)에서 캡슐화될 수 있고, 친수성 성질인 추가적인 활성 재료는 나노입자 재료의 친수성 재료 매트릭스 내에 갇힐 수 있다. 유사하게, 친수성 나노캐리어는 하나 초과의 친수성 활성 재료들을 캡슐화할 수 있고, 소수성 나노입자 재료는 하나 이상의 소수성 활성 재료를 수용할 수 있다.
최종 응용 및/또는 전달 시스템의 성질에 따라서, 활성제는 소수성 또는 친수성이며, 상기 활성제는 화학 결합(앞서 정의돈 바와 같이, 예, 극성, 이온, 반데르발스 결합 등)을 통해 일차 나노캐리어(소수성 또는 친수성임)에 연관될 수 있고, 폴리음이온성 고분자에 대해서는 "도움 지질"(예, DOTAP)의 첨가를 통해 연관될 수 있다. 나노캐리어 또는 나노입자들에 대한 활성제의 화학적 연관은 활성제의 누실을 방지하고, 캡슐화 공정의 효능은 유지되거나 보호된다(이런 접근법은 최종 응용 및/또는 특정 전달 시스템에 따라 유용할 수 있다).
복수의 나노캐리어 내에 또는 나노캐리어 및/또는 나노입자의 폴리머 매트릭스에 캡슐화될 " 활성제 "는 비타민, 단백질, 항산화제, 핵산, 단 또는 장 올리고뉴클레오티드(상이한 형태), siRNA 및 그의 화학적 유도체, 펩티드, 폴리펩티드, 지질, 탄수화물, 호르몬, 항체, 단일 클론 항체, 백신 및 다른 예방제, 약물, 진단제, 조영제(contrasting agent), 영양제(nutraceutical agents), 소분자(약 1,000 Da 미만 또는 약 500 Da 미만의 분자량), 전해질, 면역제 및 전술한 것의 임의의 조합으로부터 선택될 수 있다.
일부 추가적인 실시예에서, 본 발명에 따른 시스템 내에 캡슐화될 특정 시제는 엑세나타이드, 인슐린 등을 포함한다.
다른 실시예에서, 활성제는 siRNA이다.
추가적인 실시예에서, 캡슐화될 siRNA는 서열번호: 1 내지 12의 핵산 서열들 중 임의의 하나를 갖는 siRNA로부터 선택된다.
특정 활성 재료의 친수성/소수성을 변형하기 위하여, 재료는 음전하 또는 양전하가 부가되거나 친유성(소수성) 모이어티가 부가될 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 활성제는 음으로 하전되고 나노캐리어도 음으로 하전된다. 이런 실시예에서, 양이온성 지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP), 스테아릴아민, 및 올레일아민으로부터 선택된다.
일부 실시예에 따르면, 양이온성 지질은 DOTAP이다.
일부 실시예에서, 활성제가 적어도 나노캐리어 표면의 영역과 연관되는 경우에, 연관(앞서 일반적으로 정의됨)은 나노캐리어 입자의 표면상에 존재하는 화학기(chemical group)에 직결될 수 있거나, 활성 재료와 표면 영역이 화학적 또는 물리적으로 연관되는 하나 이상의 연결기를 통해 이루어질 수 있다. 연결기는 단일 원자 또는 원자들의 그룹일 수 있고, 티올, 히드록시드, 아민, 알킬기, 포스페이트, 카복실레이트, PEG 및 당해 분야에 알려진 다른 것들로부터 제한되지 않은 종류들에서 선택될 수 있다.
본 발명은 복수의 나노캐리어(하나 이상)를 캡슐화하는 나노입자를 제공하는데, 상기 복수의 나노캐래어 중 적어도 하나는 적어도 하나의 활성제를 함유하되, 상기 활성제는 siRNA이다.
일부 실시예에서, 나노캐리어는 폴리양이온성 지질을 더 포함하되, 상기 폴리양이온성 지질은 1,2-디올레일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)이다.
다른 실시예에서, 상기 나노입자는 400 내지 950 nm의 평균 직경을 가진다.
일부 다른 실시예에서, 나노입자 재료는 소수성이다. 이러한 실시예에서, 나노입자 재료는 PLA, PLGA 및 그의 혼합물로부터 선택된다.
그의 양태들 중 또 다른 하나로, 본 발명은 본워에 개시된 바와 같은 복수의 나노입자들을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시예에서, 조성물은 약학 조성물이며, 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함한다.
본원에서 설명된 " 약학적으로 허용가능한 담체 ", 예를 들어 비히클, 보조제(adjuvant), 부형제, 또는 희석제는 당해 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 것이고 일반적으로 손쉽게 구입가능하다. 약학적으로 허용가능한 담체는 활성 화합물에 대해 화학적으로 비활성이고, 사용 조건 하에서 해로운 부작용 또는 독성이 없는 것이 바람직하다.
담체의 선택은 특정 활성제에 의해 어느 정도 결정될 뿐만 아니라, 조성물을 투여하는데에 사용된 특정 방법에 의해서도 결정될 것이다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물의 적합한 제형의 광범위한 종류가 존재한다. 경구, 비경구, 정맥, 근육, 또는 복강 투여를 위한 하기 제형들은 단지 예시적인 것이고, 제한하기 위한 것은 아니다.
약학 조성물은 경구, 직장, 질(vaginal), 피하, 정맥 내, 근육 내, 폐, 국소 또는 표피, 점안액 및 비강 내를 포함하는 다양한 경로에 의한 투여에 적합할 수 있다. 이러한 약학 조성물은 약학 분야에서 잘 알려진 방식으로 제조된다. 본 발명의 약학 조성물을 제조하는 데에 있어서, 전술한 성분들은 보통 부형제와 혼합되거나, 부형제에 의해 희석되거나, 소정의 형태로 가공될 수 있는 담체 내에 밀폐된다. 특정 투여 방식에 기초하여, 약학 조성물은 정제, 환약, 캡슐, 샤셋(sachet), 과립, 분말, 츄잉검, 현탁물, 에멀젼, 크림, 연고, 무수 또는 수화 국소 제형 및 용액으로 제형화될 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체, 예를 들어, 비히클, 보조제, 부형제 또는 희석제는 당해 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있고 공중에서 용이하게 구입할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 활성 제형에 대해 화학적으로 비활성이고, 사용 조건 하에서 해로운 부작용 또는 독성이 없는 것이 바람직하다.
담체의 선택은 본 발명의 특정 제형에 의해 어느 정도 결정될 뿐만 아니라, 조성물을 투여하는데에 사용된 특정 방법에 의해서도 결정될 것이다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물의 적합한 제형의 광범위한 종류가 존재한다.
일부 실시예에서, 약학 조성물은 치료제를 경구적으로, 비경구적으로, 또는 정맥 내로 피검자의 순환계(심혈관계) 안으로 운반하기 위한 전달 시스템에 적합하다.
경구 투여에 적합한 제형은 (a) 액체 용액, 예를 들어 물, 식염수와 같은 희석제, 또는 주스(예, 오렌지주스)에 용해된 나노입자 또는 그 나노입자를 포함하는 조성물의 유효량; (b) 캡슐, 샤셋, 정제, 캔디(lozenge), 및 트로키제(troches), (각각은 고체 또는 과립으로 활성 성분의 기결정된 양을 함유함); (c) 파우더; (d) 적절한 액체 내의 현탁물; 및 (e) 적합한 에멀젼으로 구성될 수 있다. 액체 제형은, 약학적으로 허용가능한 계면활성제, 현탁제, 및 유화제의 첨가와 함께 또는 첨가 없이 물 및 알콜, 예를 들어 에탄올, 벤질알콜, 및 폴리에틸렌알콜과 같은 희석제들을 포함할 수 있다. 캡슐 형태는 보통 강도의 쉘 젤라틴 또는 부드러운 쉘 젤라틴 유형일 수 있으며, 상기 젤라틴 유형은 예를 들어, 계면활성제, 윤활제, 및 불활성 필러(예, 락토오스, 수크로오스, 칼슘포스페이트, 및 콘스타치)를 함유한다. 정제 형태는 하나 이상의 락토오스, 수크로오스, 만니톨, 콘스타치, 감자 전분, 알긴산, 미세결정질 셀룰로오스, 아카시아, 젤라틴, 구아검, 콜로이드성 실리콘 다이옥사이드, 활석, 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 아연 스테아레이트, 스테아르산, 및 다른 부형제, 착색제, 희석제, 완충제, 붕해제, 습윤제, 방부제, 착향제(flavoring agnet), 및 약학적으로 양립가능한 담체를 포함할 수 있다. 캔디 형태는 향미의 활성 성분, 보통 수크로오스 및 아카시아 또는 트라가칸드(tragacanth)를 포함할 수 있고, 뿐만 아니라 젤라틴, 글리세린과 같은 불활성 염기의 활성 제형을 포함하는 사탕형 알약(pastille)을 포함할 수 있고, 통상의 기술자에게 알려진 이러한 담체와 같은 활성 제형 이외에 수크로오스 및 아카시아, 에멀젼, 겔 등을 함유한다.
비경구 제형은 용액 내에 약 0.5% 내지 약 25 중량%의 활성 성분을 일반적으로 함유할 것이다. 적합한 방부제 및 완충제는 이러한 제형에서 사용될 수 있다. 주사 부위에서 과민증을 최소화하거나 없애기 위해서, 이러한 조성물들은 약 12 내지 약 17의 친수-친유기 평형(HLB)을 갖는 하나 이상의 비이온성 계면활성제를 함유할 수 있다. 이러한 제형에서 계면활성제의 양은 약 5 내지 약 15 중량%의 범위이다. 적합한 계면활성제는 프로필렌 옥사이드와 프로필렌 글리콜의 축합에 의해 형성된 폴리에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 예를 들어 소르비탄 모노올레이트 및 소수성 염기를 갖는 에틸렌 옥사이드의 고분자량 부가 생성물을 포함한다. 비경구 제형은 단위-용량 또는 다수-용량 포장된 용기인 앰플 및 바이알(vials)로 존재할 수 있고, 사용 직전에 주사를 위해서 물과 같은 멸균액 담체의 첨가만을 요구하는 동결-건조된(동결건조) 조건에서 저장될 수 있다. 임기 주사(extemporaneous injection) 용액 및 현탁물은 전술한 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.
본 발명의 화합물은 주사가능한 제형으로 만들어질 수 있다. 주사가능한 조성물에 대해 효과적인 약학적 담체에 대한 요건은 당해 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. Pharmaceutics and Pharmacy Practice , J.B. Lippincott Co., Philadelphia, Pa., Banker and Chalmers, eds., pages 238-250 (1982), and ASHP Handbook on Injectable Drugs , Toissel, 4th ed., pages 622-630 (1986) 참조.
일부 실시예에서, 전달 시스템은 치료학적 유효량의 활성제의 중개 표적화 치료학적 전달(facilitated targeted therapeutic delivery) 및 조절된 방출 투여에 적합할 수 있다.
알겠지만, 본원의 의도에서 " 유효량 "은 당해 분야에 알려진 고려 사항에 의해 결정될 수 있다. 그 양은 소정의 치료 효과를 달성하기에 유효하여야 하며, 그 중에서도 치료될 질병의 유형 및 중증도와 치료 요법에 의존한다. 유효량은 일반적으로 적절히 디자인된 임상 시험(투여량 범위 연구)에서 결정되고, 당해 분야에 정통한 기술자는 유효량을 결정하기 위하여 이러한 시험을 어떻게 적절히 수행하여야 하는지 알 것이다. 일반적으로 알려진 바에 따르면, 유효량은 수용체에 대한 리간드의 친화도, 신체 내에서 그의 분포 프로파일, 신체 내에서의 반감기와 같은 다양한 약리 파라미터를 포함하는 다양한 인자들, 원치 않는 부작용, 나이와 성별과 같은 인자 등에 의존한다.
본 발명에 따른 활성 재료(들)를 함유하는 나노입자는 적어도 하나의 효과, 예를 들어 " 치료적 효과 "를 유도하도록 사용될 수 있거나, 피검자의 원치 않는 질환 또는 질병의 치료 또는 예방을 통해서 적어도 하나의 효과 또는 부작용을 유도, 향상, 저지 또는 감소시키기 위한 적어도 하나의 다른 시제와 공동으로 연관될 수 있다. 적어도 하나의 다른 시제(물질, 분자, 요소, 화합물, 독립체, 또는 그의 조합)는 치료제 및 비-치료제 중에서 선택될 수 있는데, 여기서 상기 치료제는 치료적 유효량 투여되는 경우에 치료 효과를 유도하거나 조절할 수 있는 것이며, 상기 비-치료제는 그 자체가 치료적 효과를 유도하거나 조절할 수 없지만 선택된 특징을 나노입자에 부여할 수 있으며, 이에 대해서는 하기에서 더 설명될 것이다.
본 발명의 약학 조성물은 나노입자 내에 함유된 활성 재료에 따라 임의의 병리학 또는 질환을 치료, 예방 또는 진단하기 위해 선택될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 " 치료 " 또는 그의 임의의 구어적 변형은 본 발명의 조성물 또는 시스템의 치료적 양의 투여를 지칭하는데, 이런 치료는 질병과 연관된 원치 않은 증상을 개선하는데 효과적이거나, 증상이 발생하기 이전에 그 징후를 예방하는데 효과적이거나, 질병의 진행을 늦추는데에 효과적이거나, 증상의 악화를 늦추는데에 효과적이거나, 차도 기간의 개시를 향상시키는데에 효과적이거나, 질병의 진행 만성 단계에서 초래되는 비가역적 손상을 늦추는데에 효과적이거나, 상기 진행 단계의 개시를 늦추는데에 효과적이거나, 질병의 발병도 또는 치료를 줄이는데에 효과적이거나, 생존 확률을 높이거나 더 신속한 회복을 개선하는데에 효과적이거나, 전술한 것들의 발생 또는 그의 둘 이상의 조합으로부터 유래된 질병을 예방하는데에 효과적이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 또한 본원에서 설명된 본 발명의 조성물을 함유하는 키트 또는 상업적 패키지, 및 사용을 위한 설명서를 제공한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 또는 그로부터 유래된 일부는 키트 내의 분리된 구획 또는 바이알에 존재할 수 있다.
키트는 활성 성분들의 용해, 그의 희석에 유용하거나 조성물의 제조에 일반적인 적어도 하나의 담체, 희석액 또는 용매를 더 포함할 수 있다. 조성물은 제공된 설명서 또는 최종 사용자의 경험 및/또는 연습에 의해 최종 사용자(소비자 또는 의사)에 의해 제조될 수 있다.
키트는 성분(활성 조성물 및/또는 담체) 각각의 중량, 부피 또는 농도를 측정하기 위한 측정 장비도 포함할 수 있다.
본 발명의 양태의 또 다른 것은, 본 발명은 본원에 설명된 바와 같은 본 발명의 나노입자를 얻기 위한 공정을 제공하며, 상기 공정은:
- 적어도 하나의 활성제를 포함하는 적어도 하나의 나노캐리어를 얻는 단계; 및
- 상기 적어도 하나의 나노캐리어를 나노입자 안으로 캡슐화하는 단계를 포함한다.
본 발명의 시스템 안에 함유될 활성제(재료) 또는 복수의 활성제의 성질에 따라서, 본 발명의 공정은 다양한 동등한 형태로 수행될 수 있다. 일반적으로, 상기 공정은:
- 활성제가 소수성인지 친수성인지에 따라 개별적으로 소수성 또는 친수성 특성을 갖는 폴리머를 선택하는 단계;
- 액체 매질 내에 폴리머 및 활성제를 용해하는 단계;
- 폴리머와 활성제를 포함하는 상기 액체 매질을 추가적인 액체(액체 매질은 유기성이고, 추가적인 액체는 수성이고, 역도 또한 같음)로 처리하는 단계; 및
- 상기 나노캐리어를 단리하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 활성제가 소수성인 경우, 나노캐리어 재료는 소수성이고, 나노입자 재료는 친구성이며, 본 발명의 나노입자를 제조하는 공정은:
- 유기상을 형성하기 위하여, 소수성 폴리머를 선택적으로 수-혼화성 유기 용매에 용해하는 단계로; 상기 유기 용매는 일부 실시예에 있어서 에탄올, 메탄올, 클로로포름 디클로로메탄(DCM), 디에틸에테르, 아세톤 및 아세토니트릴(ACN)으로부터 선택되며;
- 상기 나노캐리어를 얻기 위하여, 상기 유기상을 계면활성제를 임의적으로 포함하는 수성상과 접촉시키는 단계; 및
- 상기 나노캐리어의 표면의 적어도 일부와 상기 활성제가 연관되도록, 상기 나노캐리어를 상기 활성제의 용액과 함께 배양하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 유기 혼화성 용매는 에탄올, 메탄올, 클로로포름 디클로로메탄(DCM), 디에틸에테르, 아세톤 및 아세토니트릴(ACN)로부터 선택된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 " 접촉하는 " 또는 그의 임의의 구어적 변형은, 유기상과 수성상이 긴밀하게 접촉하도록 하는 방식으로 그들을 합치는 것을 지칭한다.
용어 " 용액 "은 한 성분이 액체 매질에 완전히 용해된 액체 상태, 다른 매질에서 전구체 용액의 하나 이상의 성분들의 에멀젼(나노- 또는 마이크로에멀젼)의 액체 상태; 및 다른 매질에서 전구체 용액의 하나 이상의 성분들의 분산액(나노- 또는 마이크로분산액)의 액체 상태를 아우르는 가장 광범위한 정의로 고려된다고 주의해야 할 것이다.
일부 실시예에서, 활성제가 친수성인 경우, 나노캐리어 재료는 친수성이고 나노입자 재료는 소수성이며, 공정은:
- 수성상을 형성하기 위하여, 활성제의 수성 용액에 친수성 폴리머를 용해하는 단계; 및
- 상기 나노캐리어의 형성을 가능하게 하는 pH 하에서, 수성상에 탈용매화제(desolvating agent)를 포함하는 유기상을 연속적으로 첨가하는 단계를 포함하되, 상기 활성제는 나노캐리어 내에 분포된다.
일부 실시예에서, 공정은 상기 친수성 폴리머 매트릭스를 가교하는 단계를 임의적으로 포함한다.
다른 실시예에서, 상기 pH는 6 내지 9이다. 일부 실시예에서, pH는 7이다.
추가적인 실시예에서, 탈용매화제는 아세톤 또는 에탄올, 및 아세토니트릴로부터 선택된다.
본 발명의 공정에서 사용된 유기상은 본원에서 정의된 바와 같은 양전하를 띠는 지질(양이온성 지질)을 더 포함한다.
본 발명의 나노입자를 제조하는 모든 공정에서, 복수의 나노캐리어 주변을 코팅하는 나노입자를 형성하는 최종 단계는, 나노입자는 폴리머 재료를 포함하는 용액 안으로 나노캐리어를 나노분무하는 것에 의해 달성될 수 있다. 다른 실시예에 따르면, 상기 나노입자는 나노-분무 건조기에서 수행된 캡슐화에 의해 얻어진다.
일부 실시예에서, 본 발명의 공정은 상기 나노입자의 외부 표면 중 적어도 일부분을 적어도 하나의 표적화 모이어티로 기능화하는 단계를 더 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 적어도 일부분은 나노입자의 전체 표면이다.
일부 실시예에서, 상기 적어도 하나의 표적화 모이어티는 PEG, 고형 종양에서 과발현된 GER-2 수용체을 인식하는 트라스투주맙(trastuzumab)(Herceptin®); H 페리틴을 인식하는 AMBLK8, EGFR 수용체를 인식하는 세툭시맙(cetuximab)(Erbitux®); CD20을 인식하는 리툭시맙(Rituximab)(MabThera®); 새로운 혈관 형성을 촉진하는 "혈관 내피 생성 인자"(VEGF)로 불리는 천연 단백질의 기능을 억제하는 베바시주맙(bevacizumab)(Avastin®); VEGF-A에 대한 강한 결합을 제공하는 라니비주맙(ranibizumab)(Lucentis®); 엽산 또는 엽산염과 같은 소분자; 히알루론산 또는 히알루로난(hyaluronan); 일반적으로 약 6~15 kDa인 종양 관통성 펩티드; 표피 성장 인자(EGF); 트랜스페린; 페리틴; 아르기닌-글리신-아스파르트산(RGD) 펩티드; 상피 세포 접착 분자(EpCAM); 세포 간 접착 분자 1(ICAM-1); 암배아 항원(carcinoembryonic antigen)(CEA); 혈관활성장관폴리펩티드; CA 15-3 항원; MUC1 단백질; CD20; CD33; 인테그린; 림프 표적 모이어티(예, LyP-1); 앱타머, 예를 들어 PSMA 앱타머 또는 VEGF 앱타머; 올리고당 등으로부터 선택된다.
일부 실시예에 따르면, 표적화제는 베바시주맙(Avastin®) 또는 라니비주맙(ranibizumab)(Lucentis®)이다.
개시내용을 이해하고 실행이 어떻게 수행될 수 있는지를 이해할 수 있도록, 실시예가 도면을 참조하여 비-제한적인 예를 통해 설명될 것이다.
도 1a-1b는 나노분무 건조기 작동 원리(도 1b) 및 그로부터 얻은 나노입자(도 1a)의 개략도이다.
도 2a-2b는 1 시간의 배양 후에 세척된 PLGA NS의 한외여과액에서 GFP-siRNA에 대한 겔지체분석법(gel retardation assay)(PAGE 8%)에 의한 무결성 평가이다. 도 2a: 제형 A 및 B로부터의 한외여과액 - 레인 No. 1 - 사다리(ladder), 레인 No. 2 대조군으로 100 ng의 GFP-siRNA을 사용했고, 레인 3, 4는 A1 및 A2 각각의 10 μl 한외여과액을 사용했다. 레인 5, 6은 A3 및 A4 각각의 4 μl 한외여과액을 사용했다. 레인 7, 8은 B1 및 B2 각각의 10 μl 한외여과액을 사용했다. 레인 9, 10은 B3 및 B4 각각의 4 μl 한외여과액을 사용했다. 도 2B: 제형들 D 및 C로부터의 한외여과액: 레인 No. 1 - 사다리, 레인 No. 2는 대조군으로 100 ng의 GFP-siRNA를 사용했다. 레인 3, 4는 C1 및 C2 각각의 16 μl 한외여과액을 사용했다. 레인 5, 6은 C3 및 C4 각각의 16 μl 한외여과액을 사용했다. 레인 7, 8은 D1 및 D2 각각의 16 μl 한외여과액을 사용했다. 레인 9, 10은 D3 및 D4 각각의 16 μl 한외여과액을 사용했다. 모든 샘플들에서, 번호 1, 2는 50 μg의 GFP-siRNA로 배양된 제형으로부터의 복제물을 나타내고, 번호 3, 4는 100 μg의 GFP-siRNA로 배양된 제형으로부터의 복제물을 나타낸다.
도 3a-3b는 고도로 희석된 가교된 HSA NS의 SEM 특성 평가이다(평균 크기 58±30 nm, ZP -38±9).
도 4a-4b는, siRNA를 캡슐화하는 DOTAP 0.03 mg과 고도로 희석된 가교된 HSA NS의 SEM 특성 평가이다(도 4a: Chol-GFP-siRNA를 갖는 NS, 도 4b: GFP-siRNA를 갖는 NP).
도 5는 pH 8에서 0.03 mg DOTAP 및 200 μg siRNA로 만들어진 가교된 HSA NS로부터 추출한 GFP-siRNA, 및 동일한 증감률로 로딩된 처리되지 않은 GFP-siRNA 대조군에 대한 HPLC 크로마토그램이다. 두꺼운 선은 260 nm에서의 흡광도를 나타내고, 얇은 선은 280 nm에서의 흡광도를 나타낸다. siRNA(단백질 또는 펩티드와 다름)에 대하여, 비율 A260/280은 1.8 내지 2의 범위에 있다. 약 7.5의 피크는 가교된 HSA NS로부터 추출된 GFP-siRNA의 존재에 기인한 것이다.
도 6은 pH 8에서 0.03 mg DOTAP 및 200 μg siRNA로 만들어진 가교된 HSA NS로부터 추출한 Chol-GFP-siRNA, 및 동일한 증감률로 로딩된 처리되지 않은 Chol-GFP-siRNA 대조군에 대한 HPLC 크로마토그램이다. 두꺼운 선은 260 nm에서의 흡광도를 나타내고, 얇은 선은 280 nm에서의 흡광도를 나타낸다. siRNA(단백질 또는 펩티드와 다름)에 대하여, 비율 A260/280은 1.8 내지 2의 범위에 있다. 약 25.0의 피크는 가교된 HSA NS로부터 추출된 Chol-GFP-siRNA의 존재에 기인한 것이다.
도 7a-7b는 PLGA NS을 캡슐화하는 덱스트란 NC의 SEM 현미경 사진이다. DDW(40 mg) 중의 0.4%(w/v)의 덱스트란 40의 분무 건조 공정에 의해 제조된 NC는 30 mg의 PLGA NS로 구성된다(~100 nm, -33 mV의 ZP).
도 8a-8h는 일차 PLGA NS를 캡슐화하는 HSA NC의 SEM 현미경 사진이다. DDW 중의 다양한 %(w/v)에서 HSA의 분무 건조 공정에 의해 제조된 NC는 PLGA NS로 구성된다(~100 nm). 도 8a-8b: PLGA의 음으로 하전된 NS(ZP -33 mV)의 30 mg을 캡슐화하는 1.6% HSA (200 mg). 도 8c-8d: PLGA의 양으로 하전된 NS(ZP +66 mV)의 15 mg을 캡슐화하는 0.75% HSA (56 mg). 도 8e-8f: PLGA의 음으로 하전된 NS(ZP -33 mV)의 14 mg을 캡슐화하는 0.5 % HSA (56 mg). 도 8g-8h: PLGA의 음으로 하전된 NS(ZP -33 mV)의 7 mg을 캡슐화하는 0.25 % HSA (28 mg).
도 9a-9b는 일차 가교된 HSA NS를 캡슐화하는 PEG-PLGA NC의 SEM 현미경 사진이다. 아세톤 중의 PEG-PLGA(10.5 mg)의 분무 건조 공정에 의해 제조된 NC는 1.6 mg HSA NS로 구성된다(~100nm, ZP -51 mV). 분무 공정 중에, 분무 해드 상의 딱딱한 층의 외관이 관찰되며, 이것은 NC의 융합으로 이어진다.
도 10a-10b는 일차 가교된 HSA NS를 캡슐화하는 PLGA NC의 SEM 현미경 사진이다. 아세톤 중의 PLGA(9.8 mg)의 분무 건조 공정에 의해 제조된 NC는 1.6 mg HSA NS로 구성된다(~100nm, ZP -51 mV).
도 11a-11b는 (a) 일차 가교된 HSA NP 1.6 mg을 캡슐화하는 PLGA NC의 SEM 현미경 사진 및 EDS(에너지 분산형 X-레이 분광학, Energy Dispersive X-ray spectroscopy)를 사용한 그의 원소 분석이고, (b) 일차 HSA NS 1.6 mg을 캡슐화하는 PEG-PLGA NC의 SEM 현미경 사진 및 EDS(에너지 분산형 X-레이 분광학)를 사용한 그의 원소 분석이다. 질소는 HSA NS로부터만 유래될 수 있다.
도 12는 일차 가교된 HSA NP를 캡슐화하는 폴리머 NC의 SEM 현미경 사진이다. 도 12a: PLGA NC, 도 12b: PEG-PLGA NC. 아세토니트릴 중의 폴리머(16 mg)의 분무 건조 공정에 의해 제조된 NC는 가교된 HSA NS 10 mg으로 구성된다(~100 nm, ZP -43 mV).
도 13a-13b는 샘플 AO-57의 크기 분포 및 SEM 현미경 사진이다: 일차 가교된 HSA NS를 캡슐화하는 PLGA (50 kDa) NC. 도 13c는 4일 후 물 중에 분산된 NC이다.
도 14a-14b는 샘플 AO-66의 크기 분포 및 SEM 현미경 사진이다: GFP-siRNA가 로딩된 일차 가교된 HSA NS를 캡슐화하는 PLGA (50 kDa) NC. 40 ml 아세토니트릴 중의 폴리머(42 mg)의 분무 건조 공정에 의해 제조된 NC는 12.6 mg 가교된 HSA NS로 구성된다(~100 nm, ZP -43 mV).
도 15a-15b는 샘플 AO-68의 크기 분포 및 SEM 현미경 사진이다: Chol-GFP-siRNA가 로딩된 일차 가교된 HSA NS를 캡슐화하는 PLGA (50 kDa) NC. 60 ml 아세토니트릴 중의 폴리머(64 mg)의 분무 건조 공정에 의해 제조된 NC는 15 mg 가교된 HSA NS로 구성된다(~100 nm, ZP -43 mV).
도 16a-16b는 다른 조건들에 노출된 후 자유 siRNA 무결성의 평가를 위한 겔지체분석법(PAGE 8%)이다. 무결성 평가는 GFP-siRNA(도 16a) 및 Chol-GFP-siRNA(도 16b)에 대해 이루어졌다. 레인 번호 1 - 사다리, 레인 번호 2, 3 - 각각 처리되지 않은 100 및 50 ng의 siRNA를 이용한 대조군. 레인 4, 6, 및 8은 각각 pH 7, 8 및 9에 노출된 siRNA를 이용했다. 레인 5, 7 및 9는 각각 글루타르알데히드(glutaraldehyde)의 존재하에서(0.014%(v/v)) pH 7, 8 및 9에 노출된 siRNA를 사용했다.
도 17a-17b는 추출된 siRNA의 평가를 위한 겔지체분석법(PAGE 8%)이다. 무결성 평가는 GFP-siRNA(도 17a) 및 Chol-GFP-siRNA(도 17b)에 대해 이루어졌다. 레인 번호 1 - 사다리, 레인 번호 2 - 처리되지 않은 100 ng의 siRNA를 이용한 대조군. 레인 3-8은 (다른 pH 조건에서 제조된) 일차 가교된 HSA NS로부터 추출된 siRNA를 이용했다. 레인 9 및 10은 일차 가교된 HSA가 로딩된 NC로부터 추출된 siRNA를 사용했다.
도 18a는 비바스핀 기술(Vivaspin technique)을 사용한 제조 및 세척에 따른 BSA NS의 SEM 사진이다. NS는 슬라이드 상의 실온에서 건조되었고, 이어서 분산액 한 방울을 확산시켰다; 도 18b는 비바스핀 기술을 사용한 제조 및 세척에 따른 BSA NS의 SEM 사진이다. NS는 슬라이드 상의 실온에서 건조되었고, 이어서 분산액 한 방울을 확산시켰다.
도 19a-19b는 CLSM을 사용하여 A-431 세포 내에 2% FITC-표지된 HSA NP의 섭취를 보여주었다. 37℃에서 4시간(도 19a) 및 22시간(도 19b)의 배양 후 섭취. NP 농도는 2 mg/ml이다(웰 당 1.5 ml).
본 발명에서, 이중 나노캡슐화는 siRNA와 같은 많은 친수성제 또는 소수성제의 방출을 보호하고 조절하기 위해 사용되는 것이다. 제1선의 보호는 siRNA를 일차 나노캐리어에 로딩하는 것에 의해 달성되면서, 제2선의 안정성은 일반적으로 나노입자의 표면에 고정된 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티를 갖는 서브-마이크론 나노입자 안으로 일차 나노캐리어를 캡슐화하는 것에 의해 얻어진다. 나노입자 형성(일반적으로 나노캡슐, 또는 NC)은 나노분무 건조 기술[16,23,24]를 사용하여 수행된다.
하기 두 유형의 나노입자가 본원에 설명된다:
(a) 나노캡슐에 로딩된 PLGA(폴리 D,L-락틱-코-글리콜산) NP은 친수성 코팅 폴리머를 사용하여 제조됨; 및
(b) 나노캡슐에 로딩된 HSA(인간 혈청 알부민) NP는 소수성 코팅 폴리머를 사용하여 제조됨.
두 경우 모두에 있어서, 음으로 하전된 siRNA를 효과적으로 로딩하고, NP 세포 내재화 후에 siRNA의 '엔도조말 탈출(endosomal escape)'을 더 촉진하기 위하여, 양이온성 지질, DOTAP(1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판)가 1차 NP에 첨가되었다. 모든 성분들이 FDA 승인을 받았기 때문에, 이러한 전달 시스템은 약물의 반감기, 생물학적 분해(biodistribution) 및 약물 동력학을 향상시키는 친수성 생-고분자(예, siRNA)의 전신성 전달을 위한 플랫폼을 제공한다.
약물 전달에서, 나노입자(NP)는, 약물 효능을 향상시키는 능력뿐만 아니라 그들이 정맥 내로 투여될 수 있기 때문에 선택된 약물의 약물 동력학 프로파일을 호의적으로 변형시키는 것 때문에 마이크로입자들보다 선호된다. 그 밖에도, 이러한 나노크기의 시스템은 그의 침투 성질 및 특정 세포 유형에 대한 표적화에 대해서 마이크로입자보다 우수하다[12]. NP의 표적화 효율 및 연장된 순환시간은 약물 전달을 위해 성공적인 응용을 위한 두 개의 가장 중요한 요인이다[13]. 표적화 NP는 (세포 표적 부위에서 수용체에 특이적인 리간드의 결합을 통해) 능동적이거나 수동적일 수 있다. 수동적 표적화에서, '향상된 침투 및 정체'(EPR) 효과로 알려진 현상에 의한 고형 종양에서의 작은 NP의 축적 경향이 활용된다[14]. NP의 세포 섭취는 NP의 크기, 기하학적 구조, 전하 및 세포 유형에 의존하는 것으로 밝혀졌다. 일반적으로, 1 μm 미만의 입자는 몇몇 세포 내 이입 경로를 통해 세포 내로 내재화될 수 있다[13]. 게다가, NP의 표면에 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 결합은 입체 장애를 초래해서, 응집 및 혈장 단백질 흡착(옵소닌작용)을 감소시킬 뿐만 아니라 혈액 순환 시간을 연장하면서 세망내피계(RES)에 의한 섭취의 감소로 이어진다[15]. 마지막으로, 수성상 분해를 방지하고 장시간의 저장을 위한 NP의 안정성을 보장하기 위하여, 건조된 분말형의 제형이 요구된다. 동결 방지용 부형제의 첨가가 보통 수반되는 동결건조(냉동 건조) 또는 분무 건조 공정은, 이러한 목적을 위해 적용되는 잘 알려진 두 개의 주요 과정이다.
분무 건조는 연속적인 단일 단계 공정에서 액체 또는 현탁물을 건조 분말로 전환하는 공정이다. 그러나, 이런 기술은 2 μm 미만의 미세 입자를 효과적으로 형성하고 수집하는데에 실패했다[16]. 최근에는, 실험실 수준의 분무 건조의 새로운 발생이 Buchi에 의해 개발되었으며, 이는 적은 샘플 양(소수 밀리그램 또는 밀리리터)에 대하여 높은 수율(>70%)로 300 nm 내지 5 μm의 크기를 갖는 입자의 생성을 가능하게 했다. 이런 기술은 분무 건조에 의해 NP의 형성을 가능하게 하여, 활성제를 함유하는 복수의 나노캐리어를 포함하는 나노입자인 도 1a에 도시된 일반적 구조를 갖는다. 도 1b에 개략적으로 도시된 이런 나노분무 건조기(NSD)는 미세 소적(droplets) 생성을 위한 진동 메시 기술(vibrating mesh technology)을 사용한다. 일반적으로 설명하자면, 압전 결정체 동력의 분무 헤드(piezoelectric crystal driven spray head)는 정밀한 마이크론-크기의 구멍들의 배열을 갖는 얇은 다공성 막(분무 메시)을 함유하는 작은 분무 캡을 구비하며, 진동에 의하여 수백만의 3-15 μm 크기(메시 크기에 따라서 5-7 μm의 일반적인 평균 크기)의 소적을 만들어낸다. 게다가, 난류로 작동하는 종래의 분무 건조기와 다르게, 이런 새로운 기술은 층류로 작동하고; 따라서 온화한 가열이 이루어질 수 있어서, 열-민감성 생약학적 산물에 친화적인 시스템이 만들어진다.
지난 십년을 넘도록, 소 분자 약물 이외에, 생-고분자 전달, 이러한 siRNA는 NP/NC를 담체로서 사용하는 치료법으로 고려된다. siRNA(소 간섭 RNA), RNA 분자의 짧은 서열(19-30 bp 길이 이중나선)은 잘 알려진 기작으로 그의 상보적인 mRNA 상에 저하를 유도하여 특정 유전자의 발현을 침묵시키는데에 사용될 수 있다[17]. siRNA의 발견 이후에, 다양한 시도들이 siRNA에 기초한 약물들을 개발하기 위해 이루어졌다. 그러나, 중요한 장벽은 물리 화학적 성질에 의한 siRNA의 전달이었다. siRNA는 크고(~13 kDa), 친수성이며, 음으로 하전된 분자이며, 그렇기 때문에 세포막을 관통하고 세포기질로의 접근을 가능하게 하는 트랜스펙션 비히클이 요구된다. 게다가, 세포 침투 후에(보통 세포 내 섭취(endocytosis)에 의함), '엔도조말 탈출' 기작이 요구된다. 그 밖에도, 전신성 전달은 매우 짧은 혈중 반감기와 빠른 신장 청정(renal clearance)에 의해 제한된다. siRNA의 생체 내 전달에서의 이러한 단점을 극복하기 위해서, 다양한 화학적 변형은 siRNA 분자의 활성을 보존하면서 siRNA 분자에 행해지는데, 이에 의하여 RN아제(RNAses) 분열에 대한 내성을 개선하고 혈장 내 반감기를 증가시켰다[18]. 그 밖에도, 나출 또는 화학적으로 개질된 siRNA는, 양이온성 지질과의 콘쥬게이션을 포함하거나 포함하지 않고 비바이러스성 지질(콜레스테롤, 리포좀), 단백질 담체(융해성 또는 세포-침투성 펩티드), 시클로덱스트린 또는 생분해성 폴리락티드 코폴리머 나노입자에 기초한 다양한 전달 시스템에 포함된다.
이론에 속박되지 않고, 본 발명의 나노캐리어는 캡슐화된 친수성 생-고분자(즉, siRNA)에 대하여 보호, 생적합성, 개선된 안정성, 원하는 생분포 및 약물 동력학 프로파일을 제공하여, 개선된 치료학적 성질을 갖는 독특한 전달 시스템을 제공하였다.
재료 및 방법
재료
PLGA: 폴리(D,L-락틱-코-글리콜산) (50:50) (R504H) MW 48,000 Da, 및 PEG-PLGA (RGP50105) MW 5000+45,000 Da을 뵈링거(Boehringer)(잉겔하임, 독일)로부터 구입했다. 하기 재료들은 다음 회사로부터 구입하였고 하다사 병원(Hadassah hospital)으로부터 공급되었다: 덱스트란 40 (MW 40, 000 Da), 테바(Teva) (예루살렘, 이스라엘); 소듐 히알루로네이트 (HA), MW 200,000 Da, 바이오베리카(Bioberica) (바르셀로나, 스페인); DOTAP (1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판-클로라이드 염), MW 698.5 Da, 유지질 GmbH(Lipoid GmbH) (프리겐슈트르(Frigenstr), 독일); 정맥 내 주사용 상업적 인간 혈청 알부민(HSA) 20% 용액 (젠랩 20(Zenlab 20) 또는 바이오테스트(Biotest)), 카마다(Kamada) (베이트-카마, 이스라엘). BASF(루드빅스하펜, 독일)로부터 얻은 HAS, MW 66,500 Da, 마크로골 15 히드록시스테아레이트(Macrogol 15 hydroxystearate) (Solutol HS 15). 폴리에틸렌 글리콜(PEG) MW 4,000 Da, 폴리소르베이트 80(Tween 80), 글루테르알데히드 8% 수중 용액, 트립신 (돼지 췌장으로부터 유래함), RN아제(RNase) & DN아제(DNase) 비함유 초 순도의 물 및 식염수(PBS) (바이오리에젼트(Bioreagent), pH 7.4), 모두는 시그마(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 아세톤, 에탄올, 디클로로메탄, 클로로포름 및 아세토니트릴은 모두 HPLC 등급이다. 다른 화학물질 및 용매는 분석 시약 등급이고 추가적인 정제 없이 사용된다. siRNA로 수행되는 모든 실험에 대하여, 초 순도의 물만이 사용되며(시그마 또는 베이트-헤멕크(Beit-Haemek)), 모든 다른 블랭크 계(siRNA 없음)에 대해서는 이중-정제된 물(DDW)을 연구 동안 사용하였다.
siRNA :
대조군 목적으로, 항 EGFR(표피생장인자 수용체) siRNA (EGFR-siRNA) (21 bp, MW 13,400 Da) 및 스크램블된(scrambled) siRNA (21 bp, MW 13,821 Da)를 앰비온(Ambion) (Austin, Tx, USA)로부터 구입했다.
EGFR-siRNA:
S (5'->3') CAUAAAUGCUACGAAUAUtt (서열번호: 1)
AS (5'->3') AUAUUCGUAGCAUUUAUGGag (서열번호: 2)
스크램블된 siRNA:
S (5'->3') CCAUAAAUGCUACGAAUAUtt (서열번호: 3)
AS (5'->3') UUACGUCGUCGCGUCGUUATT (서열번호: 4)
상기 서열에서, 화학적 변형은 소수의 LNA 변형으로 구성되며; 소문자 = DNA 염기.
항 그린 형광 단백질 (GFP) siRNA (GFP-siRNA) (21 bp, MW 14,352 Da), 및 콜레스테롤 개질된 GFP-siRNA (Chol-GFP siRNA) (21 bp, MW 15,079 Da)는 Roche(Kulmbach, GmbH)에 의해 제공되었고, 대부분의 실험에서 사용되었다(특히 약물 로딩의 판단).
GFP-siRNA:
S (5'->3') AuAucAuGGccGAcAAGcAdTsdT (서열번호: 5)
AS (5'->3') UGCUUGUCGGCcAUGAuAUdTsdT (서열번호: 6)
Chol-GFP siRNA:
S (5'->3') (Chol)-링커-AuAucAuGGccGAcAAGcAdTsdT (서열번호: 7)
AS (5'->3') UGCUUGUCGGCcAUGAuAUdTsdT (서열번호: 8)
상기 서열에서, 화학적 변형: 소문자 = 2' O-메틸화된 뉴클레오시드, dT = 데스옥시-티아민, sdT = 데스옥시-티아민 포스포로티오에이트, 밑줄 = 오버행(overhang)
EGFR-siRNA를 사용하는 '인 하우스(in house)' 합성된 항-EGFR-siRNA
S* (5'->3') CCAUAAAUGCUACGAAUAUtt (서열번호: 9)
AS (5'->3') AU A UU C G U AG C AUU U A U GGtt (서열번호: 10)
및
S* (5'->3') CCAUAAAUGCUACGAAUAUtt (서열번호: 11)
AS (5'->3') A U A U U C G U AG C A U U U A U GGtt (서열번호: 12)
상기 서열에서, 화학적 변형: 밑줄 = 2' O-메틸화된 뉴클레오시드, 소문자 = DNA 염기, * 5' 위치에서 (Chol)-링커 또는 NIR 염료 분자의 첨가가 이루어질 것이다.
방법 및 실험 방법론
PLGA NS 제조
'폴리머 계면 증착' 방법에 기초하여 나노구의 제조를 수행했다[19]. 간략하게, 폴리머 PLGA 48kDa를 수-혼화성 유기 용매(아세톤)에 용해시켰다. 그 후에, 일반적으로 계면활성제(Solutol® HS 15)를 함유하는 수성상에 유기상을 신속하게 첨가하고 교반했다(~900 RPM). 수 상으로의 아세톤의 빠른 탈출이 발생하기 때문에, 소수성 폴리머는 구형의 음으로 하전된 나노 계측의(nanometric) 구형 입자(50~200 nm)를 자발적으로 형성한다.
양으로 하전된 PLGA NS의 형성을 위해서, DOTAP (1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판-클로라이드 염)을 아세톤 상에 상이한 비율로 첨가했다. 모든 아세톤 잔류물을 제거하기 위하여 제형을 증발시켰고(37℃ 에서), 5 ml 수성상의 최종 부피로 더 농축한 뒤, 4,000 RPM에서 10 분간 원심분리했고, TWEEN의 퍼센트를 감소시키기 위하여 VivaSpin 6(300kDa, Vivascience)를 사용하여 DDW로 세척했다(10회). 세척된 제형 중의 각 성분의 최종 퍼센트는 다음과 같다: 1.5%(w/v) PLGA 및 0%, 0.04%, 0.2% 또는 0.4%(w/v) DOTAP (개별적인 제형 A, B, D 및 C).
일차 NS의 크기, 크기 분포 및 제타 전위량
일차 NS(PLGA 또는 가교된 HSA로부터 제조)의 물리화학적 특성 평가를 Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments, Malvern, UK)를 사용하여 동적광산란법에 의해 측정했다. 모든 샘플들을 측정 전에 HPLC 등급 물(pH=5.5)에 1:100으로 희석했다. siRNA 로딩된 NS가 특징지어지면, 0.01% NaCl과 함께 RN아제 비함유 물이 사용된다(pH=5.5).
PLGA NS 내에 siRNA 의 로딩 효율
siRNA와 함께 배양하기 위하여, 전술한 방법과 동일한 방법으로 제형을 제조하되, 수성상으로 물(HPLC 등급)을 사용하는 대신에 RN아제 비함유 물(RNFW)을 제형화 및 세척 단계에서 사용했다. 간략하게, 0.1 ml의 세척된 PLGA NS를 각각의 제형으로부터 취했고(1.5 mg PLGA 함량), 상이한 양의 GFP-siRNA(50 μg, 100 μg)와 함께 1시간 동안 실온에서 온화하게 교반하면서 배양했다. 배양 후에, 각각의 제형을 RNFW(300 kDa의 Nanosep 원심분리 센트리콘을 사용, Pall)로 10회 세척했고, 모든 한외여과액을 수집하고, 동결 건조하고 500 μl RNFW를 사용하여 재용해(reconstituted)하였으며, 재용해물로부터의 150 μl를 HPLC에 주입했다. 한외여과액 중의 GFP-siRNA 함량을 역상 HPLC(RP-HPLC)에 의해 만든 검정곡선에 기초하여 계산했다.
고압 액체 크로마토그래피( HPLC )
선명도 3um 올리고-RP 컬럼 50X4.6mm(Phenomenex, USA)를 갖는 HPLC(Shimadzu LC-2010C)를 사용하여, 사용된 다른 siRNA들에 대한 검정곡선을 작성했다. 주입하기 전에 siRNA를 RNFW에 용해하거나 RNF 완충제(100 mM NaCl, 50 Mm Tris)에 용해시켰다. 이동상 : A-RN아제 비함유 완충제(100 mM TEAA), B-아세토니트릴. 긴 변화도( long gradient ) (콜레스테롤 개질된 siRNA): 40분 동안 B/A(10:90) 내지 (90:10), 그 후 또 다른 10분 동안 B/A(10:90). 짧은 변화도( short gradient ) (비콜레스테롤 개질된 siRNA): 15분 동안 B/A (10:90) 내지 (40:60), 그 후 또 다른 10분 동안 B/A(10:90). 유동률: 1 ml/분, UV-검출: 260 nm 및 280 nm.
폴리아크릴아미드 겔을 사용한 겔 전기 영동법( PAGE )
siRNA 무결성(안정성) 평가를 위하여, 8%(19:1) 천연 폴리아크릴아미드 겔(PAGE)을 사용했다. 런닝 완충액(running buffer)으로 트리스-보레이트-EDTE(TBE)를 사용하여 200V에서 50분 동안 전기 영동법을 수행했다. siRNA 염색을 위해서, 0.01% EtBr을 사용했다. UV 투조장치(transilluminator) 하에서 겔을 시각화했다.
PLGA NS 상에서 GFP - siRNA 의 로딩 효율의 평가를 위한 프로토콜
PLGA NS는 투명한 용액이 형성될 때까지 클로로포름에 용해시킨 뒤, 동일한 부피의 RNFW를 첨가했다. 샘플은 와류하고 원심분리된다(5분, 4,000 RPM). 상부 수성상(siRNA 비함유)을 수집했다. 이 과정을 2회 반복했다. 그 다음으로, 수집된 수성상을 동결건조했다. RNF 완충제에서 동결건조된 샘플을 재용해한 후, RP-HPLC에 의해 siRNA 함량의 확인을 평가했다. DOTAP 및 siRNA를 구비한 NS가 '이온-쌍'을 형성할 수 있기 때문에, 수성상에 대한 헤파린(고도로 음으로 하전된 분자)의 첨가를 조사한 뒤에, 모든 siRNA가 자유 형태로 방출되는 것을 보장하기 위하여 37℃의 온화한 교반 하에서 1시간 동안 배양했다.
일차 가교된 HSA NS 제조
사용 전에, 염과 모든 방부제 잔류물을 제거하기 위하여, 메디셀 인터네셔널(Liverpool road, London)로부터의 셀룰로오스 막(MWCO 14,000)을 사용하여 DDW에서 24시간 동안 판매용 HSA를 탈염했다. 나노 계측의 HSA NP를 제조하기 위하여, pH-코아세르베이션[20]의 알려진 방법(탈용매화 기술로도 알려져 있음)을 적용했다. 간략하게, 실온의 일정하고 빠른 교반 하에서(~960 RPM 또는 40 HZ), 탈용매화제를 연속적으로 첨가(~1 ml/분)하여 특정 pH로 조정된 HSA 용액을 나노구로 변형시켰다. 충분한 탁도가 보일 때까지 탈용매화제의 첨가를 이어간 뒤(보통 40 내지 80%(v/v)의 탈용매화제), 온화한 교반 하의 실온에서 적어도 2시간 동안 글루타르알데히드를 사용하여 가교 방법을 수행했다. 가교 후에, 탈용매화제를 증발시키고(37℃) 4,000 RPM에서 10분 동안 원심분리했다(침전물을 제거하고, 건조하고 중량 측정에 의해 결정했다). 비바스핀(vivaspin) 300kDa(Viva science)을 사용하는 원심분리법(4,000 RPM, 4℃)의 3개의 다른 주기에서, NS를 DDW로 10회 세척했다. 일부 경우에서, 아세톤 상은 DOTAP를 함유했다.
가교된 HSA NS 상에서 siRNA 의 로딩 효율
가교된 HSA NS 내부로의 siRNA의 캡슐화를 위하여, siRNA를 탈용매화 상의 첨가 이전에 HSA 용액에 첨가했다. DDW를 사용하는 것 대신에 RN아제 비함유 물(RNFW)가 사용되는 경우에, 나머지 과정은 전술한 바와 정확히 동일한 방법으로 행해졌다. 가교 후에, NS를 세척했고 총 한외여과액을 수집하고, 동결건조하고, 500μl RNFW에 재용해시켰으며, 그로부터 160 ul을 HPLC에 주입했다. 한외여과액 내에서 자유 siRNA의 부분적 저하가 관찰되기 때문에, NS 내의 siRNA 함량을 결정하기 위한 바람직한 방법은 한외여과액 내의 (비-캡슐화된) 자유 siRNA에 기초하지 않고, (소화 이후에) 입자 내의 siRNA 함량을 직접적으로 결정하는 것이다.
가교된 HSA NS 내의 siRNA 함량의 결정을 위한 프로토콜
(세척 후) 100 μl 현탁물 당 HSA의 총 중량을 중량 측정에 의해 정량했다. 그 후, siRNA를 캡슐화하는 세척된 HSA NP 1-2 mg을 RN아제 자유 PBS 완충액(pH=7.5로 조절됨, 0.5 M NaOH 용액을 사용함)을 사용하여 1 ml로 희석했고, 20 내지 150 μg 트립신을 사용하여 60분, 90분 또는 180분 동안 소화시켰으며, 이러한 과정은 어둡고 온화한 교반하의 37℃에서 진행하였고, 투명한 용액이 형성될 때까지 진행하였다. DOTAP를 함유하는 샘플의 경우에, 트립신을 첨가한 뒤 0 또는 60분 후에 헤파린(90 μg)을 수성상에 첨가했다. 트립신의 존재 또는 부재하에서, RP-HPLC를 사용하여 자유 siRNA의 양을 결정했다.
트립신 뿐만 아니라 소화된 HSA의 단편들은 (페놀/클로로포름)(1:1) 혼합물을 사용하는 침전법에 의해 제거될 수 있다.
나노분무 건조기를 사용하는, NC 안으로 PLGA NS의 캡슐화 - 수성 모드
시스템 안으로 공기가 통과할 수 있도록 하는 '오픈 루프(open loop)' 모드로 작동하는, 나노 분무 건조기 B-90(Buechi Labortechnik AG, Flawil, Switzerland) 상에서 분무 건조를 통해 NC를 제조했다. 모든 실험들에서, 가스 흐름은 약 120 l/분 이었다. 100% 분무 및 4 μm 메시 크기 막을 모든 실험에서 사용했다.
나노분무 건조기를 사용하는, NC 안으로 HSA NS의 캡슐화 - 유기 모드
공기 대신에 시스템 안으로 N2(g) 및 CO2(g)가 흘러들어가도록 하는 '폐쇄 루프(closed loop)' 모드에서 작동하는, NSD B-90 상에서 분무 건조를 통해 NC를 제조했다. 모든 실험들에서, 가스 흐름은 약 120 l/분 이었다. 휘발성 증기 및 습기를 포함한 공기는 건조 및 응결을 위해 제습기 유닛으로 전달된 후, 건조되어 순환 경로에서 시스템으로 돌아왔다. 4 μm의 메시 크기 막과 함께 저온(Tin = 30℃-60℃)에서 분무 건조를 수행했다.
siRNA 에 대한 융점 측정
샘플의 온도를 20℃에서 85℃로 1℃/분의 비율로 승온하면서 UV-가시광선 분광광도계(UV-visible spectrophotometer) 상에서 사용된 상이한 siRNA(21-mer)에 대하여 융점 측정을 수행했다. 모든 siRNA를 완충액(48 mM Tris, 96 mM NaCl, pH7.1)에 용해시켜서 4-10 ng/μl의 농도를 얻었다.
시차 주사 열량측정법( differential scanning calorimetry , DSC )에 의한 열 분석
폴리머들(PLGA 48 kDa 및 PEG-PLGA 50 kDa)에 대하여 DSC 측정을 했으며, 질소 분위기 하에서 Mettler DSC 1 Star System(In 표준에 대해 보정됨)을 사용하여 10℃/분의 승온속도로 -20℃ 내지 220℃의 온도 범위에서 수행했다.
SEM (주사형 전자 현미경) 및 EDS (에너지 분산형 X-선 분광학)
고 안정성 Schotty Field Emission Source(Sirion, model: Quanta 200 FEI, Germany), 5 kV를 갖는 고해상도 주사형 전자 현미경을 이용하여 분무-건조된 NC(및 캡슐화된 NS)의 기하학 구조, 크기 및 표면 형태를 관찰했다. 이미지화 전에, 탄소 접착 탭(carbon sticky tab) 상에 샘플들을 분포시킨 뒤, 금과 팔라듐 혼합물로 90~120초 동안 코팅했다. 수중 분산된 일차 NS의 경우에, 샘플들을 고도로 희석시켰고, 그 후에 유리 상에 뿌리고 밤새도록 증발하도록 방치했다. 5 kV의 저 전압을 사용하고 129 eV의 분광 해상도를 가지며 X-MAX20 SDD Inca 450 EDS LN2 자유 검출기(Oxford Instruments, UK)를 구비한 EDS(에너지 분산형 X-선 분광학)를 사용하여 견본의 원소 분석을 수행했다.
분무 건조된 NC에 대한 크기 분포의 평가 방법
일반적인 Zetasizer Nano ZS가 4μm 미만의 입자들의 측정에 대해 제한될 뿐만 아니라 비교적 균질한 분산체에 대해 제한되기 때문에, 분무 건조된 NC에 대한 충분한 입자 크기 분포는 Mastersizer 2000E(Malvern Instruments, UK)를 사용하여 레이저 회절분석의 방식으로만 만들어질 수 있다. 120 ml의 분산체에서 샘플을 분산시키기 위하여, 대략 4 mg의 샘플이 각각의 측정을 위해 필요했다.
스팬(Span) = (d90-d10)/d50
여기서, d50은 부피 중앙 크기(volume median size)이며; d90, 부피의 90%는 d90 미만의 크기를 가지며; d10, 부피의 10%는 d10 미만의 크기를 가진다.
작은 스팬 값은 좁은 크기 분포를 지시했다.
분무 건조 캡슐화 효율의 결정을 위한 프로토콜
상이한 NC 집단을 크기에 따라 분리하기 위하여, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 적용하였다. 그 후, 큰 PLGA NC의 특정 집단 안으로 캡슐화된 HSA NS의 함량을 결정하기 위하여, 클로로포름에서 PLGA NC의 최초 탈용매화가 이루어졌다. 그 후, 원심분리에 따라(10,000 RPM, 15 분), 일차 HSA NP를 침전물로서 분리하고, 단리하여, 그의 함량을 Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay 키트 또는 질소 함량(간단한 미량분석에 의해 검출함)에 대해 검사했다. 일차 PLGA NP를 캡슐화하는 HSA NC에 대하여, 트립신의 수성 용액(pH 7.5의 PBS 완충액, 37℃)으로 배양해서 알려진 중량의 NC를 분해시킨 뒤, HSA 함량을 BCA를 사용하여 정량하였고, 감산해서 PLGA 양을 추측했다. 일차 NS를 캡슐화하는 NC가 siRNA와 함께 로딩는 경우에, 단리된 siRNA의 총 함량을 결정했다(NC 분해 및 NS 소화 후).
EGFR - siRNA 의 시험관 내 방출 운동 프로파일 결정
일차 NS 및 이차적인 NC로부터 방출된 EGFR-siRNA에 대한 운동 프로파일은 Hagigit et al . [21]에서 상세히 설명된 것과 동일한 방식으로 시험과 내에서 결정될 것이다.
세포 배양
A-431 인간 편평상피 암종 세포(human epithelial squamous carcinoma cells) 및 다른 결장 암종 세포는, 10% 소태아혈청, 2 mM L-글루타민 및 10000 U/ml 페니실린 및 100 ug/ml 스트렙토마이신을 함유하는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)에서 유지될 것이다. 배지는 2일 마다 교체될 것이다. 세포는 CO2 인큐베이터 내의 6% CO2, 37℃에서 성장할 것이다. 합류 플라스크(Confluent flasks)는 0.25 ml 트립신 용액(Beit Haemek Afula, Israel)으로 배양물을 트립신처리한 후 1:10 비율로 분리될 것이다. 모든 실험들은 ISO7 요건(10000 입자들/m3)에 따른 깨끗한 방에서 수행될 것이다.
세포 배양 배지에서 NP 안정성
[22]에서 상세히 설명한 바와 동일한 방식으로 A-431 세포 배양 배지에서 여러 경우에서 배양한 후, Zetasizer Nano ZS를 사용하는 크기 측정이 NS에 대해 이루어질 것이다.
NC 안정성 평가
Mastersizer X를 사용하는 크기 측정, 및 SEM을 사용하는 형태 평가는 다른 조건 하에서(4℃ 및 37℃) 4주, 8주 및 12주 저장한 후에 최종 NC에 대해 이루어졌다.
A-431 세포들에서 NP의 세포독성
[21]에서 상세히 설명한 바와 동일한 방식으로, 세포 증식은 웰 당 5, 1, 0.1 및 0.01 mg/ml NP 농도의 존재하에서 144 시간에 걸쳐서 시험될 것이다.
A-431 세포들에서 FITC - 표지된 HSA NS의 섭취
2% FITC-표지된 HSA NS를 생산하기 위하여, 4 ml의 2% HSA 용액에 1.9 mg의 FITC-BSA(소혈청알부민)을 첨가했다. 단지 어둠 조건하에서, 전술한 방식과 동일한 방식으로 입자들을 만들었다. 그 후, 세척된 NS를 셀룰로오스 아세테이트 술포네이트 필터(0.2 um, Whitman)를 통해 여과했다. 다음으로, FITC-표지된 HSA NP의 부분 표본(61.2 μl 및 122.45 μl)를 DMEM 완충액에 희석하여 1.5 ml의 총부피를 만들었으며, 이를 통해 웰 당 각각 1 mg/ml 및 2 mg/ml의 농도를 제조했다. 세포 표지를 위하여, 150,000 A-431 세포들을 커버 슬라이드에 배치하고, 부착되도록 밤새도록 방치했다. 다음날, FITC-표지된 HSA NS의 부분 표본과 함께 부착 세포를 4시간 또는 22시간 동안 배양했으며, 이어서 인산완충액(PBS)로 3회 세척했다. 그 후에, 세포들을 4% 파라포름알데히드(Sigma-Aldrich)로 고정했고 PBS로 3회 세척했다. 음성 조절 실험에서, FITC-표지된 HSA NS 배양 단계는 생략하였지만 다른 단계들은 동일하게 유지되었다. 세포들을 Fluo View FV300 공초점 레이저 주사 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)에서 시험했다.
인-셀 NIR 모델을 사용하여 A-431 세포에서 항 EGFR - siRNA 침묵 효능의 평가
항 EGFR-siRNA 침묵 효능은 개발된 새로운 방법 및 Cohen et . al [23]에서 설명된 것에 기초하여 수행될 것이다. EGFR mRNA의 녹다운(knockdown) 효능은 관련 프라이머를 사용하는 RT-PCR(역전사 - 폴리머라제 연쇄 반응)에 의해 확인될 것이고, EGFR 단백질 수준은 웨스턴 블롯에 의해 정량될 것이다.
마우스에서 이종이식 종양 연구
A-431 종양 세포는 배양될 것이다. 하위융합성 세포(subconfluent cell)(70%~80%)는 0.25% 트립신으로 잠시 처리한 후에 채취되었고, 접종을 위한 HBSS(Hank's balanced salt solution)에 재현탁하였다. 종양 세포 현탁물(3-5 x 106 세포)은 각각의 마우스의 우측면 안으로 0.2 ml의 부피로 피하 주사될 것이다. 8 내지 10 마우스는 각각의 처치군에 무작위로 할당될 것이고, 처치는 최대 4주 동안 수행될 것이다. 이중의 나노비히클은 적절한 용량으로 경정맥에 주사될 것이다. 종양 측정은 수동 캘리퍼스(manual calipers)을 이용하여 주기적으로 이루어졌고(적어도 1주일에 한번), 종양 부피는 식: 0.52 x 길이 x 너비2을 사용하여 계산될 것이다. 연구의 끝에서, 종양은 절제되고 무게 재어질 것이며, 그 후 다른 연구를 위해 사용된다. 동시에, 종양은 NIR 표지된 EGF 프로브를 이용하여 비침습적으로 바이오이미지화(bioimaged) 될 것이다.
결과
유기상에서 PLGA NS 제조
음전하 또는 양전하의 NS를 생산하는 양이온성 지질(DOTAP)의 첨가와 함께 또는 첨가 없이 PLGA 48 kDa(폴리 D,L-락틱-코-글리콜산, 50:50)로부터 제1 유형의 일차 NS를 제조했다. '폴리머-계면 증착' 방법의 잘 알려진 기술을 사용하여 NS를 제조했다. 계면 상호작용(정전기적 & 소수성)을 통한 siRNA 로딩 효율을 시험하기 위하여, 4개의 상이한 블랭크 제제(black formulations)를 선택했다. 4개의 제제(표 1 참조)는 그들의 DOTAP 함량에 차이가 있다(제제 A, B, D 및 C, 각각 0%, 0.04%, 0.2%, 및 0.4%(w/v)의 DOTAP를 함유).
물리화학적 특성 평가
GFP-siRNA(50 및 100 μg)과 함께 배양(실온에서 1시간)하기 전과 후에 PLGA NS에 대한 물리화학적 특성 평가가 이루어졌다. 결과는 표 1에 구체적으로 개시된다.
이러한 결과에 기초하여, GFP-siRNA 흡착은 명백히 관찰되고, 이는 NS의 물리화학적 성질(ZP, PDI 및 크기)의 변화로 이어졌다. 음으로 하전된 NP(제형 A)에 대한 ZP가 음으로 유지되지만, 제형 B는 50 μg의 GFP-siRNA에도 불구하고 약한 양(positive)으로부터 음(negative)으로 변한다. 확연한 양전하를 갖는 NS에 대하여(제형 D 및 C - ZP 40 mV 초과), 우리는 ZP의 감소를 관찰했으며; 특히 제형 D에서 ZP의 감소를 관찰했다.
GFP-siRNA과 함께 배양(실온에서 1시간)하기 전과 후에
PLGA NS에 대한 물리화학적 특성 평가
제형 측정 조건 평균 직경
[ nm ] 		평균 ZP
[ mV ] 		PDI

A
 siRNA와 함께 배양 안함 68.8±22.1 -28.6±14.8 0.10
50 μg GFP-siRNA와 함께 배양한 후 세척 78.1±39.5 -25.8±10.7 0.21
100 μg GFP-siRNA와 함께 배양한 후 세척 88.9±44.5 -27.8±10.7 0.17

B
 siRNA와 함께 배양 안함 103.1±32.7 +11.2±9.9 0.09
50 μg GFP-siRNA와 함께 배양한 후 세척 124.0±56.7 +44.0±7.0 0.12
100 μg GFP-siRNA와 함께 배양한 후 세척 226.7±98.5 +2.2±4.0 0.34

C
 siRNA와 함께 배양 안함 119.9±46.7 +49.7±10.6 0.16
50 μg GFP-siRNA와 함께 배양한 후 세척 145.5±62.0 +45.8±7.0 0.16
100 μg GFP-siRNA와 함께 배양한 후 세척 204.7±114.2 +44.4±7.4 0.22
크기 분포의 다분산성(PDI)은, GFP-siRNA과 함께 배양하기 전후에 음으로 하전되거나 양으로 하전된 일차 PLGA NS의 유체 직경 및 제타 전위(ZP) N=3을 의미한다. 배양을 중복해서 수행했다.
일차 PLGA NS 상에 siRNA 의 효과적인 로딩
상이한 PLGA NS와 함께 배양한 후 siRNA의 로딩 효율을 결정하기 위하여, NS를 세척하고, 수집한 한외여과액 내에 결합하지 않은 siRNA의 함량을 RP-HPLC에 의해 정량했다(표 2). NS와 연관된 siRNA의 퍼센트를 한외여과액 내의 자유 siRNA에 대한 (배양을 위해 사용된) 총 siRNA의 차이로부터 계산했다.
표 2에 따르면, 0.2%(w/v)의 DOTAP를 함유하는 제형 및 그보다 많은 DOTAP를 함유하는 제형 (제형 C 및 D)에서, 완전한 siRNA 흡착이 발생한다. 이러한 결과는 PLGA NS 표면상에 약 50의 양의 제타 포텐셜이 1.5 mg NS 당 100 ng siRNA의 강하고 효율적인 흡착을 유도한다고 증명한다. 불충분한 로딩은 약간 양전하의 NS(제형 B)를 발생시키고, 중간의 값은 음전하의 NS(제형 A)에 대해 발생한다. 이러한 결과는, 자유 siRNA가 제형 C 및 D의 한외여과액에서 발견되지 않는다는 것(이와 대조적으로 자유 siRNA는 제형 A 및 B의 한외여과액에서 검출됨)을 보여주는 겔지체분석법(PAGE 8%)(도 2)에 의해 더 입증된다.
1.5 mg의 PLGA NS 상의 GFP-siRNA의 로딩 효율
제형 배양에 사용된 GFP-siRNA의 양 [μg] 총 한외여과액에서 자유 GFP-siRNA의 계산된 평균 PLGA NP상에 흡착된 GFP-siRNA의 계산된 평균
양 [μg] 퍼센트 [%] 양 [μg] 퍼센트 [%]
A 50 16.4±0.8 32.7±4.7 33.7±1.6 67.3±4.7
100 56.6±2.8 56.6±4.9 43.4±2.1 43.4±4.9
B 50 28.8±3.8 57.5±13.2 21.3±2.8 42.5±13.2
100 79.8±3.0 79.8±3.7 20.2±0.8 20.2±3.7
C 50 ND ND *50 *99 초과
100 ND ND *100 *99 초과
D 50 ND ND *50 *99 초과
100 ND ND *100 *99 초과
(* 검정곡선에 기초하여, RP-HPLC를 통한 검출에 필요한 siRNA의 최소량은 360 ng(50 μg의 0.7%)이어서, 연관된 siRNA의 퍼센트는 99.3% 정확도로만 결정될 수 있다. ND - 미검출)
제형 B가 좋지 않은 로딩 용량을 보이는 것에 대한 관찰은 그것의 낮은 안정성 및 응집 경향(ZP 값이 20 mV 미만인 입자에서 일반적임)에 의해 설명될 수 있다. 자유 siRNA의 단편화가 HPLC 크로마토그램 또는 겔지체분석법(PAGE 8%)에 의한 평가를 통해 관찰되지 않았다.(도 2 참조)
수성상에서 HSA NS 제조
가교된 HSA(소태아혈청)로부터 만들어진 일차 NS ~100 nm를 시험했다. 이 목적을 위해 pH-코아세르베이션의 방법을 적용했다. 상이한 파라미터들(pH, 사용된 탈용매화제(에탄올 또는 아세톤)의 유형 및 양, 용액 중의 %HSA, 및 교반 속도)을 변화시키는 것에 의해 형성된 NS의 크기를 조절할 수 있게 되었다. 아세톤이 탈용매화제로서 사용되는 경우에 2% HSA 용액에서 최고의 결과를 얻었다. 선택된 결과들은 표 3에 보여지고, 아세톤을 사용하고 pH 7 및 9에서 가장 작은 입자가 얻어진다고 지시된다.
HSA NP에 대한 물리화학적 특성 평가
샘플 pH 탈용매화제 첨가된 총 아세톤
[ml]		 평균 직경
[nm]		 평균 ZP
[mV]		 PDI
1* 7 에탄올 10 241±71 -35±5 0.07
2 8 에탄올 10 166±44 -35±8 0.05
3 9 에탄올 7 152±43 -51±8 0.06
4 7 아세톤 10 58±30 -38±9 0.24
5 8 아세톤 21 131±55 -36±7 0.14
6 9 아세톤 9 61±25 -54±10
(53%)		 0.13
-37±8
(25%)
(*거대한 침전물이 보임(64%(w/v), 다른 샘플들에서는 침전물이 보이지 않음)
물리화학적 특성 평가
가교된 HSA NS에 대한 물리화학적 특성 평가는, 작고, 구형이며, 음전하를 띤 NS가 형성되고, 그들의 크기 분포(40 내지 300 nm) 및 다분산성이 pH와 탈용매화제의 유형에 영향을 받는다고 보인다(표 3 및 도 3a-3b). 시험된 모든 pH에서, 아세톤은 에탄올에 비해 더 높은 PDI 값을 갖는 더 작은 NS를 제조했다.
크기 분포의 다분산성(PDI)는, 약 960 RPM으로 교반하고 탈용매화제로서 아세톤 또는 에탄올을 사용하고 상이한 pH에서 4 ml(2% HSA 용액)으로부터 제조된 일차 가교된 HSA NS의 유체 직경 및 제타 전위(ZP) N=3을 의미한다.
HSA의 등전점은 약 5.0이다. 수성 용액의 pH가 더 염기성이면, 우리는 그것의 표면상에 HSA 분자를 반발시키는 더 음으로 하전된 카복실기를 늘렸다. 이런 아이디어에 기초하여, 더 작은 입자(약 100 nm)가 pH 9에서 형성된다. 그러나, 전술한 방법을 사용함으로써, 원하는 크기의 HSA NS를 에탄올 대신에 아세톤을 사용하여 이미 pH 7에서 얻었다(표 3).
일차 HSA NS에 siRNA 의 효과적인 로딩
가교된 HSA NS 안으로 siRNA를 효과적으로 캡슐화하기 위하여, 스케일 다운 방법(scaling down process)을 수행했으며, 파라미터의 추가적인 조정이 필요하고; 4 ml의 2% HSA 용액 대신에 0.6 ml의 2% HSA 용액을 사용했다. 그 밖에, siRNA 캡슐화 효율을 높이기 위해서 양이온성 지질 DOTAP('엔도시토시스제(endocytosic agent)')를 첨가했다. 표 4에서 보여지는 블랭크 시스템(siRNA 없음)은, 일부 경우에서 거대한 침전물이 NS의 형성과 함께 보였다고 보여준다. 최고의 결과는 pH 8 및 9(샘플 5, 9 및 10)에서 얻었다 - 가장 적은 침전물 퍼센트와 함께 작은 NS가 형성되었다.
일차 HSA NS에 siRNA의 로딩
샘플 pH DOTAP 첨가된 총 아세톤 [ml] 평균 직경 [nm] 평균 ZP
[mV]		 PDI 침전물 %[w/w]
1 6.6 - 1.5 155±55 -36±9(78%) 0.12 90
0.7±4(18%)
2 6.6 + 0.5 276±156 -44±5 0.26 81
3 7.3 - 1.5 139±43 -41±8 0.08 54
4 7.3 + 1.5 129±55 -43±8 0.16 60
5 8 - 1.5 80±28 -43±10 0.13 21
6 8 + 1.5 90±36 -48±11 0.13 43
7 8 - 2.4 228±143 -19±5 0.24 <1
8 8 + 2.4 3587±330 -7±3 0.29 <1
9 9 - 1.5 135±62 -63±7(50%) 0.26 1
-36±9(50%)
10 9 + 1.5 79±43 -28±6 0.26 11
이러한 발견에 기초하여, 200μg siRNA의 캡슐화를 염기성 pH에서도 수행했다(표 5).
일차 HSA NS에 siRNA의 로딩, 200μg siRNA
샘플 pH DOTAP siRNA 유형 첨가된
총 아세톤
[ml]		 평균 직경
[nm]		 평균 ZP
[mV]		 PDI 침전물
%[w/w]
1 9 - GFP 1.5 107±31 -52±6(63%) 0.07 8
-31±8(37%)
2 9 - Chol-GFP 1.5 109±39 -34±8(68%) 0.13 15
-62±5(32%)
3 9 + GFP 1.5 88±30 -33±9(90%) 0.1 33
-28±5(10%)
4 9 + Chol-GFP 1.5 113±32 -42±9 0.07 <1
5 8 + GFP 1.5 81±32 -35±8 0.23 <1
6 8 + Chol-GFP 1.5 119±53 -37±7 0.34 <1
7 8 + GFP 2.4 171±90 -23±5 0.32 <1
8 8 + Chol-GFP 2.4 88±33 -19±6(40%) 0.14 <1
-48±7(40%)
9 7 + GFP 1.5 93±39 -43±6 0.14 0
10 7 + Chol-GFP 1.5 93±39 -23±8(70%) 0.13 0
-39±6(30%)
고 부피(70-80% (v/v))의 탈용매화제의 첨가는 HSA NS의 형성을 촉진하기 위해 이루어졌지만, 충분한 siRNA 캡슐화를 유도하기 위해서도 이루어졌다. 고 캡슐화를 얻기 위한 또 다른 전략은 GFP-siRNA의 친유성 유도체(5'-콜레스테릴-GFP-siRNA, 즉, Chol-GFP-siRNA)를 포함하는 것이다. 표 5에 상세히 기재된 결과들은, pH 8 및 7에서, DOTAP를 함유하는 샘플에 siRNA의 첨가(GFP 또는 Chol-GFP)가 (1.5 ml 아세톤의 첨가에 따른 블랭크 샘플에서 관찰되는 것과 같은 - 표 4) 침전물의 발생을 현저히 감소시키는 것을 나타낸다. pH 9에서, Chol-GFP-siRNA가 사용되는 경우에만 동일한 현상을 보였다.
크기 분포의 다분선성(PDI), 평균 유체 직경 및 제타 전위(ZP), N=3 및 침전물의 중량%는, 상이한 양의 아세톤과 상이한 pH에서 0.6 ml(2% HSA 용액)로부터 제조된 일차 가교된 HSA NS의 형성에 의해 발달되었다. (+/-)는 0.3 mg DOTAP를 갖는 아세톤 상 또는 DOTAP를 갖지 않는 아세톤 상(0.015 mg DOTAP를 갖는 a-아세톤 상)을 지칭한다.
일차 가교된 HSA NS의 물리화학적 특성 평가는 200 μg의 GFP-siRNA 또는 Chol-GFP-siRNA의 갭슐화에 의해 아세톤을 포함하도록 만들어진다. (+/-)는 0.03 mg DOTAP를 포함하거나 DOTAP를 포함하지 않는 아세톤 상을 지칭한다. DOTAP의 몰 비: siRNA는 3:1이다.
SEM 특성 평가는 (DOTAP 및 siRNA로 로딩된)새로운 가교된 HSA NS에 이루어진다(도 4a-4b). DOTAP의 첨가뿐만 아니라 siRNA(GFP 또는 Chol-GFP)의 캡슐화는 형성된 NP의 구형을 변화시키지 않으며, 이는 이미 블랭크 시스템에서 관찰되었다(도 3).
가교된 HSA NS에서 siRNA의 캡슐화 효율을 결정하기 위하여, 세척된 NS를 투명한 용액이 형성될 때까지 트립신으로 소화시켰고, 총 siRNA 함량을 RP-HPLC를 사용하여 검출하고, AUC에 기초하여 계산했다. 프로토콜에 따르면, 우리는 우리의 실험실에서 개발했으며(구체적인 것에 대해서, 섹션 E 참조), 정량화에서 이러한 방법의 신뢰도는 매우 효율적이다(도 5-6). 상이한 pH 조건에서 제조된 HSA NS에 대한 캡슐화 효율은 표 6에 요약되어 있다. 약간의 경향을 알 수 있는데; DOTAP의존재 하에서, 최고 캡슐화(~40%)는 약 염기성 pH(pH 8 및 7)에서 얻어졌다. pH9에서, NS로부터 DOTAP의 제거는 캡슐화 효율을 감소시켰다. 이런 효과는 비-콜레스테롤 개질 siRNA(GFP-siRNA)가 사용되는 경우에 더욱 그러했다.
pH DOTAP siRNA 유형 % 캡슐화 캡슐화된 siRNA(μg)
9 - GFP 9 18
9 + GFP 24 48
8 + GFP 42 84
7 + GFP 43 86
9 - Chol-GFP 16 32
9 + Chol-GFP 26 52
8 + Chol-GFP 40 80
7 + Chol-GFP 39 76
표 6: 200μg의 siRNA, HSA NS에 대한 캡슐화 효율 - 상이한 pH 조건(7, 8 또는 9)에서 200μg siRNA를 포함하고, 0.03 mg DOTAP를 포함하거나 포함하지 않도록 제조한 가교된 HSA NS에 대한 캡슐화 효율 요약. 실험은 중복해서 진행했고 평균 값을 도시했다. 확인은 RP-HPLC를 이용했다.
나노분무 접근법에 의해 NC 안으로 일차 NS의 나노캡슐화
친수성 코팅 폴리머를 사용한 PLGA NS 로딩된 나노캡슐 제제
온전한 외막을 갖고, 안정하고, 작은 구형 NC를 고 수율로 제조하기 위하여, 다양한 파라미터를 갖는 다양한 제형이 조사되었다:
(1) 덱트트란 40(MW = 40kDa), 소듐 히알루로네이트(HA, MW = 200kDa) 및 인간 혈청 알부민(HSA, MW = 66.5kDa)을 포함하는 수용성 폴리머 유형; (2) 수분산성 상에서 친수성 폴리머 및 PLGA NS의 %(w/v); (3) Tin(Tin은 주입 온도이며, 상기 온도는 연속적으로 흐르는 건조 공기/가스의 온도); 및 (4) 계면활성제(Tween 80)의 첨가. 가장 작은 서브마이크론 소적을 형성하기 위하여, 가장 작은 메시 크기 막(4μm)가 사용된다.
연구된 광범위한 제형의 전반적인 결과는 하기 관찰로 이어진다:
(1) HA를 이용한 분무 방법은 그것의 높은 점성 때문에 불충분하다(0.1%(w/v) 용액에서도 불충분함).
(2) 덱스트란을 사용하는 PLGA NS 캡슐화는 다공성 표면을 갖는 구형 NC를 생산했다(도 7).
(3) 최고의 결과는, HSA가 수성 상 중에 0.1% 내지 1.6% (w/v)의 농도 범위로 사용될 때에 얻어졌다.
(4) 안이 빈 HSA NC를 성공적으로 제조했을 뿐만 아니라, 다양한 양의 PLGA NS(양 및 음 하전됨)를 함유하는 HSA NC도 제조했다.
(5) SEM 측정은: (a) 모든 경우에서, 온전한 표면을 보이는 작고, 구형인 NC를 형성했고, (b) DDW 중에 HSA의 농도가 감소하는 경우에, 가장 작은 NC가 형성되었음을 확인했다(도 8a- 8h). 도 8a-8h로부터 추론하여 보면, HSA 농도의 1.6%에서 0.25% (w/v)로의 감소는 크기가 감소된 NC를 형성하는 결과를 가져온다. 구체적으로, 적은 양의 NC가 7μm에서 2μm로 감소했지만, 대부분의 NC 군집은 2μm에서 0.5μm로 각각 감소하였다.
나노캡슐화 방법의 최적화
분무 건조 방법에 대한 최적화는 하기 파라미터에 대해서만 이루어졌다:
(1) 표면 형태 - 상기 보고된 바와 같이, HSA가 사용되는 경우에 최고의 결과가 얻어졌다.
(2) 입자 크기 - 상기 보고된 바와 같이, 수성 상 중에 고체 농도의 감소에 따라서, 가장 작은 NC(0.3-2μm)가 형성되었다.
(3) 수율 - 0.06% (w/v)로 계면활성제(Tween 80)의 첨가는 방법에서 달성된 수율에 현저한 향상을 가져왔고, 일부 경우에서는 분무 속도를 개선했다(표 7).
*수성 용액 중에 HSA [% w/v] 수율 [% w/v] 분무 속도 [ml/분]
Tween 80 없음 0.06% Tween80 Tween 80 없음 0.06% Tween 80
0.1 - 96 - 0.05
0.25 11 77 0.02 0.03
0.5 30 98 0.02 0.16
0.75 21 90 0.03 0.05
표 7: 수성 모드에서 수행된 나노분무 건조 방법에 대핸 최적화
(*몰 비 4:1의 HSA:PLGA인 음으로 하전된 PLGA NS)
작동 온도 - 건조된 NC를 제조하기 위하여, 건조 공기(Tin)의 다양한 온도가 시험되었다(80, 100 및 120℃). 70℃에서 건조된 NC를 형성하기 위한 시도는 효과적이지 않았다. 우리는, siRNA가 포함되지 않는 경우에 분무 건조 온도 80℃가 우리의 제형에 꽤 효과적이라는 것을 발견했다.
siRNA 가닥의 50%가 변성되는 온도는 용융온도 또는 Tm으로 불렀다. 우리의 연구에서 사용된 다양한 siRNA(21머(21 mers))에 대한 Tm을 측정하였고, GFP-siRNA, Chol-GFP-siRNA 및 EGFR-siRNA 각각에 대하여 78, 77 및 72℃로 밝혀졌다. 모든 시험된 siRNA에 대하여, 분리의 시작은 60℃에서 이미 관찰되었다(데이터 미도시).
이러한 결과를 토대로, 60℃ 초과의 온도에 siRNA를 노출시키는 것이 권장되지 않는다는 결론에 도달했으며, 우리는 낮은 온도(≤60℃)에서 나노분무 건조 방법을 수행하는 것이 바람직하다는 것을 알았고, 휘발성 유기 용매를 사용하는 것이 보통 효율적이라는 결론에 도달했다.
소수성 코팅 폴리머를 사용하여 HSA NS 로딩된 나노캡슐의 제조
매끈한 계면 및 높은 수율을 갖는 소정의 구형 서브마이크론을 제조하기 위하여, 낮은 온도(≤60℃)에서 분무 건조하는 것과 함께 상이한 파라미터들을 변경하고 시험했다: (1) 유기 분산 상의 유형, (2) Tin, (3) 캡슐화에 사용된 소수성 폴리머의 유형 - PLGA 48 kDa 및 PEG-PLGA 50 kDa[PEG 5 kDa + PLGA 45 kDa], (4) 유기 분산 상 중에 소수성 폴리머 및 가교된 HSA NS의 %(w/v), (5) 계면활성제의 첨가(Tween 80 또는 PEG 4000) 및 (6) % 분무. 수성 모드에서 NSD B-90을 작동시키는 것을 통한 이전 실험을 토대로, 모든 실험에서 메시 크기 막(4μm)이 사용되었고, 상대적으로 적은 비율의 고체 - 0.07 내지 0.26%(w/v)가 유기상 중에 분산되었고, 그에 의하여 1μm 미만의 크기의 NC를 제조하였다.
(1) 대체 분산 상으로서 몇몇 휘발성 유기 용매를 시험했다(에탄올, 메탄올, 디클로로메탄, 디에틸에테르, 아세톤, 및 아세토니트릴). 아세톤과 아세토니트릴(ACN)에서 최고의 결과를 얻었고, 따라서 거의 대부분의 캡슐화 실험을 이런 용매를 가지고 진행했다.
(2) ACN이 사용되는 경우에 60℃ 또는 50℃의 온도에서 분무 건조를 수행하거나, 더 많은 휘발성 아세톤이 사용되는 경우에는 40℃ 또는 30℃에서 분무 건조를 수행했다.
(3) 모든 수행된 실험에서, 수율은 낮았고(최대 35%), 이는 분무 헤드 둘레로 "외피(crustification)"의 발생을 가져오는 용매의 휘발성 특성 때문일 것이다(고체 응집물 또는 결정의 발생). 이러한 침전물은 진동 막을 가로막고, 그 결과로, 낮은 수율 및 높은 다분산성을 갖는 나쁜 방법을 야기한다. 이러한 현상은 아세톤이 ACN 대신에 사용되는 경우에 더 두드러진다.
(4) 계면활성제의 첨가 : Tween 80(0.06% w/v), PEG 4000(0.03% w/v), Pluronic F-68(0.008% w/v)는 '외피'를 막거나 샘플의 높은 다분산성을 감소시키는데에 도움을 주지 못한다. 그들의 첨가에 따라서, 수율은 무시할 수 있을 정도이며, 특히 Tween이 사용되는 경우에 그러하고, 형성된 NC의 다분산성은 높았다.
(5) 낮은 파라미터 분무(100% 대신 60%)가 적용되는 경우에, 분무 헤드(의 온도(Th)는 Tin에 비해 12℃ 더 높아서, 도 9a-9b에 도시된 바와 같이 형성된 NC의 융합으로 이어질 수 있다. 100% 분무가 적용되는 경우에, Th는 Tin에 비해 단지 7-8℃ 더 높다.
(6) 모든 시험 샘플들에 구형 NC이 제조되는 PLGA와 달리(도 10), PEG-PLGA가 헤드 가열에 더 민감한 것으로 밝혀졌고, 따라서 일부 경우에서, 도 9a-9b에서 보여진 바와 같은 비결정질의 NC를 수득했다. DSC 측정에 의한 PLGA 및 PEG-PLGA 각각 46.5° 및 31℃의 유리 전이(Tg) 값은 이러한 가설을 뒷받침한다.
(7) 샘플 내에서 2배로 감소된 고체 함량(0.21%에서 0.13%로)은 수율을 2배 개선하기에 이르렀다(16%에서 35%로).
(8) 샘플 희석에 의해(10 ml의 아세톤 대신에 20 ml의 아세톤 사용), 우리는 분산된 HSA NS의 양을 수율(~20%)의 감소 없이 6배 증가시켰다(1.6 mg에서 10 mg으로).
유기 폴리머(PEG-PLGA & PLGA) 내에 일차 HSA NS의 캡슐화는 도 11에서 실례하는 바와 같이 EDS(에너지 분산형 X-레이 분광학)를 사용하여 증명된다.
분무 헤드 주변으로 거대한 외피 형성의 방지와 함께 분산된 가교형 HSA NS의 증가된 양은 분산 유기상으로서 ACN을 주로 사용하여 달성된다. 나아가, ACN이 사용되고 Tin이 60℃에서 50℃로 감소되는 경우에, 외피 형성이 발생하지 않고, PLGA 또는 PEG-PLGA가 적용되는 경우에 구형 서브-마이크론 NC의 형성을 가져오는 전체 분무 방법 동안 막은 투명했다(도 12). 그러나, 여전히 상대적으로 낮은 수율(~30 %)이 얻어진다. 이런 파라미터는 추가적으로 시험되어 최적화될 것이다.
로딩된 NC의 크기 분포
siRNA을 캡슐화하는 HSA NP로 로딩된 PLGA NC를 형성하는 ACN에서 0.1% 고체 함량을 갖는 두 개의 샘플들을 만들었다(샘플 AO-66 및 AO-68). 우리는 소정의 서브마이크론 NC의 알맞은 형성을 명백히 확인할 수 있다. 비어 있는 50 kDa PLGA NC의 1% 고체(샘플 AO-57)를 갖는 또 다른 샘플을 비교를 위해 제조했다.
모든 PLGA NC(비어 있는 또는 일차 HSA NP로 로딩됨)를 나노 분무 건조 B-90을 사용하여 만들었고, 유기상에서 작동시켰다(아세토니트릴, Tin 50℃). 건조된 특성 평가 이전에, NC를 4℃의 어두운 방에서 밀봉된 바이알 내에 보관했다.
Mastersizer 2000E를 사용하여 건조된 NC를 특성 평가하기 위하여, 각각의 샘플을 와동(vortex)을 사용하여 물(DDW, 2mg/ml) 중에 분산시킨 뒤, 탁한 균질한 분산액이 형성될 때까지 얼음조(ice bath)에서 밤새도록 (교반기에 의해) 교반되도록 방치하였다.
Mastersizer 2000E에서의 모든 측정은 능동 교반(초음파처리 또는 계면활성제의 첨가에서 불필요함)과 함께 스테인리스 강철 샘플 분산 유닛(120 ml 부피)에서 이루어졌다. 결과들(부피 또는 개수로 계산됨)을 건조된 샘플에 대해 사전에 이루어진 SEM 측정을 통해 얻은 이미지와 비교했다.
Mastersizer 2000E(Malvern)을 사용하는 레이저 회절 기술로 행해진 부피에 의한 크기 측정값에 따르면, AO-68에 있어서 80%의 NC 군집이 1μm 미만이고(56%는 0.724μm 미만임) 스팬 값은 1.472인 것을 발견했다. AO-66에 있어서, 더 나은 결과를 얻었다; 94%의 NC 군집은 1μm 미만이고(86%는 0.724μm 미만임) 스팬 값은 2.077이다. 낮은 스팬 값은 낮은 다분산성을 의미한다(도 13-15). 비교를 위해서, 1% 고체(PLGA) 함량을 갖는 샘플도 측정했으며(샘플 AO-57), 더 큰 NC의 형성을 보였다; 94%의 NC 군집은 2.5μm 미만이다(42%는 1μm 미만이고 4%만이 0.724μm 미만임). 이러한 결과는 희망을 갖게 하고, ~0.1% 고체 함량을 함유하는 고도로 희석된 제형을 만드는 나노캡슐화 기술에 대한 가능성을 보이는 것이다.
캡슐화된 siRNA 의 온전성 평가
HSA NS 내에 siRNA의 일차 캡슐화 공정 과정 중에, 염기성 pH 조건 및 핵산 염기들(구아닌, 아데닌 또는 시토신)에 존재하는 일차 아민과 상호작용할 수 있는 가교제(글루타르알데히드)의 존재와 같은 방해성 잠재물(distractive potential)에 물질들이 노출되었다. 따라서, siRNA 온전성 평가의 필요가 발생한다. 먼저, 자유 siRNA(GFP-siRNA 및 Chol GFP-siRNA)의 온전성 평가가 이루어졌다. 가교된 HSA NS의 제조에 사용된 조건과 동일한 조건에 siRNA를 노출시킨 뒤(글루타르알데히드의 존재 또는 부존재 하에서 pH 7, 8, 또는 9의 수성 용액에서 3시간 동안), HPLC(데이터 미도시) 및 겔지체분석법(PAGE 8%)를 사용하여 각각의 샘플로부터의 단편을 분석했다(도 16). 결과는 pH가 점점 염기성이 되면서 siRNA의 민감성 증가를 보이고, Chol-GFP-siRNA는 GFP-siRNA에 비해 염기성 pH(8 및 9)에 대해 개선된 내성을 보였다. 다른 한편으로는, siRNA의 두 가지 유형은 모든 pH 시험에서 가교제의 존재 하에서 고도의 민감성을 나타내는 것으로 보였고, 이는 겔에서 더 느리게 진행하는 '무거운' 종의 형성으로 이어진다 - 가능한 방해성 가교 공정이 siRNA에 발생될 수 있음을 시사함.
이후에, (상이한 pH 조건에서 제조된) 일차 가교된 HSA NS로부터 siRNA를 추출하고, 그들의 온전성을 HPLC 및 겔지체분석법(PAGE 8%)을 사용하여 평가했다(도 17). 나아가, 일차 가교된 HSA로 로딩된 NC로부터 추출된 siRNA의 안정성도 검사했는데(도 15 - 레인 번호 9 & 10), 그 이유는 2차 캡슐화 공정이 나노 분무 건조 기술을 사용하여 가열(Tin은 50℃임) 하에서 수행했기 때문이다. 도 17에서 제시되는 PAGE 결과를 토대로, 우리는 일차 또는 이차 NC에서 캡슐화된 siRNA(Chol-GFP- 또는 GFP)가 온전히 유지되고 처리되지 않은 siRNA와 같이 진행한다는 것(레인 번호 2)과 단편화가 발생하지 않았다는 것을 명백히 알았다. HPLC 결과를 토대로, 캡슐화된 siRNA의 정확한 양을 결정했다. 미래에, 추출된 siRNA의 활성은 '시험관 내'에서 확인될 필요가 있다.
프로토콜 1 - 나노구의 표면에 라니비주맙 ( ranibizumab )( 루센티스 ) 또는 베바시주맙( bevacizumab)(아바스틴)의 콘쥬게이션
MAb 세척 및 양 결정
LC-SMCC 스페이서와 상호작용할 수 있고 MAb 활성으로 방해받을 수 있는 히스티딘 또는 글리신과 같은 아미노산을 제거하기 위하여, 8.5 cm 투석 백(Medicell international, 12-14K)을 사용하여 라니비주맙 및 베바시주맙을 세척했다. 라니비주맙의 첨가 이전에 투석 백을 2 리터의 DDW로 세척했다. 그 후, pH 7.4에서 DDW 중에 희석된 마그네슘 및 칼슘 없이, 총 부피 3 리터의 10배 농축의 PBS로 약 500 μl의 Ab를 세척했다. 밤새도록 이어진 세척 후에, Ab 총 부피를 PBS에서 2 mg/ml의 Ab 농도를 달성하도록 조절했고, Ab를 4℃, 15분 동안 14,000 rpm로 원심분리하여 투석 백으로부터 글리세롤의 잔류물을 제거했다. 그 후, 280 nm의 파장에서 분광광도계를 사용하여 라니비주맙 농도를 결정했다.
스페이서 LC - SMCC 를 이용한 MAb 활성화
MAb 상의 아민기(NH2) 및 LC-SMCC 상의 에스테르기(-R-COO)를 반응시켜서 아미드 결합을 형성했고, 반응은 4℃에서 180rpm으로 회전시키면서 2시간 동안 진행되었다. MAb 대 LC-SMCC의 몰비는 1:100이고, 더 구체적으로는; DMSO 중에 50 μl의 스페이서 용액(1 mg/100 μl)을 2 mg의 MAb(1 ml)에 첨가했다. 최종 DMSO 농도는 5%를 초과하지 않았다. 필요하다면, 비-활성화된 MAb 확인을 위해, 0.5 mg의 잔류 MAb를 약 12.5 μl의 DMSO에 첨가하여 DMSO 대 MAb의 동일한 비율을 유지시켰고, 동일한 조건 하에서 배양하였다. 활성화 후에, 라니비주맙을 10분 동안 4℃ 14000 rpm에서 에펜도르프(effendorfs)에서 원심분리하였고, 상청액을 제거한 뒤, MAb와 반응하지 않은 LC-SMCC의 잔류물을 제거하기 위해 세척하였고, 이에 의하여 1 mg/ml Ab의 최종 농도를 달성하였다. 4℃에서 10~15분 동안, 4000 rpm 하에서30000 MWCO를 구비한 비바스핀(vivaspin)을 사용하여 PBSx2.5 (pH=7) 중에 15 ml의 총 부피로 2 mg(1 ml)을 세척했다. 비-활성화된 MAb에 대해서도 상기 공정을 수행했다.
NS 제조 공정
동일한 프로토콜에 따라 두 개의 제형을 제작했다. NP의 제조를 위해서, 75 mg의 Resomer 504H, 75 mg의 PLGA 50-50 45000 PEG 5000(50,000 KD), 10 mg의 OCA 링커를 25 ml 아세톤에 용해시켰다. 900 rpm의 속도의 교반 하에서 50 mg의 Solutol® RH를 함유하는 50 mg의 수성상을 유기상에 주입했다. 주입에 이어서, 동일한 조건 하에서 15분 동안 지속적으로 교반하였고, 그 후 약 1시간 동안 30 rpm의 교반 속도와 37℃에서 제형을 증발시켰다. 증발을 마친 경우에, NaOH 0.1N을 사용하여 pH를 6.8-7로 보정했고, HPLC용 물을 이용하여 최종 부피를 5 ml로 만들었다. 마지막으로, 4000 rpm, 실온에서 10분 동안 제형을 원심분리하여 폴리머 침전물을 제거했다.
라니비주맙 및 베바시주맙과 함께 NS 배양 - 나노 MAb 의 제조
OCA 링커 상의 티올기 및 스페이서 멜라이미드(melaimide)를 실온에서 밤새도록 반응시켰다. 2 mg MAb(1 mg MAb/ml의 용액 농도에서)와 2 ml 제형을 신틸레이션 병(scintillation bottle)에서 온화한 교반 하에서(500 rpm) 반응시켰다. 비-활성화된 MAb도 동일한 조건 하에서 NS와 함께 밤새도록 배양했다.
나노 MAbs 세척
다음날 아침에, 4℃, 4000 rpm에서 300,000 MWCO 비바스핀 상에서 샘플들을 HPLC용 물로 세척하여, NS와 반응하지 않은 MAb의 잔류물을 제거했다. 세척 부피는 제형 부피의 10배이다. 비-활성화된 나노MAbs 및 NS를 동일한 조건에서 세척했다. 잔류물들을 15 ml 폴리프로필렌 시험관에 수집했고, 동결-건조될 때까지 -80℃에서 보관하면서, 제형이 세척 전 제형의 원 부피를 도달하도록 농축했다.
NS 및 나노 MAb 특성 평가
각각의 제형으로부터의 100 μl를 HPLC용 물 1000 μl에 희석하고, 0.2 μm PVDF 필터를 통해 여과했고, Malvern Zetasizer(Malvern Instruments, Malvern UK)로 분석하여, 제타 전위 및 입자 직경 크기를 결정했다.
프로토콜 2 - 가교된 소혈청알부민(BSA)을 포함하는 나노캡슐화된 라니비주맙 및 베바시주맙
나노계측의 BSA NS를 제조하기 위하여, pH-코아세르베이션의 잘 알려진 방법(탈용매화 기술로도 알려짐)을 적용했다. 간략하게는, 실온에서 일정한 빠른 교반 하에서(~960 RPM 또는 40 HZ), 탈용매화제의 지속적인 첨가에 의해 특정 pH로 조절된 BSA 용액을 나노입자로 전환되었다. 탈용매화제의 첨가는 충분한 탁도가 보일 때까지 이어졌고(보통 40 내지 80%(v/v)의 탈용매화제), 그 후 온화한 교반 하에 실온에서 적어도 2 시간 동안 글루타르알데히드를 사용하여 가교 공정을 수행했다. 가교 후에, 탈용매화제를 증발시켰고(37℃) 4,000 RPM에서 10분 동안 원심분리했다(침전물을 제거하고, 건조한 뒤 중량을 결정함). 비바스핀 300kDa(Viva science)를 사용하는 세 번의 다른 사이클의 원심분리에서(4,000 RPM, 4℃), NS를 DDW로 10회 세척했다.
나노분무를 사용하는 비- 가교된 BSA NS 의 아바스틴 이중 나노-캡슐화
베바시주맙을 투석에 의해 폴리소르베이트 20 용액에 옮겼다(14 kDa 컷오프, 500 ml Tween-20(0.4 mg/ml)에서 2시간 3회, 실온). 이후에, 앞서 설명한 바와 같이 BSA로 Ab를 나노-캡슐화했다. 강한 와류 중에 BSA NS의 형성을 이끌어내기 위하여 펩티드와 알부민을 함유하는 수성 용액에 아세톤을 주입한 후, 0.75 ml의 현탁액의 앨리쿼트를 추출하고, 즉시 16 mg의 PLGA(50K)를 함유하는 24 ml의 아세토니트릴에 포함시키고 교반했다. 이후에, 이런 현탁액을 나노분무 건조를 사용하여 증발시켰다. 최종 용액: DDW 1.01%, 아세톤 2.02%, 아세토니트릴 96.97%. 고체 조성물: Ab 1.9%, 알부민 37.7%, PLGA 60.4%. 모든 용액에 대한 최종 고체 농도: 0.104%; 나노분무 조건: 4 μm 메시, 50℃.
나노분무 건조를 사용하는 BSA NS 의 캡슐화 - 유기상 모드
'폐쇄 루프' 모드로 작동하는 NSD B-90 상에서 분무 건조를 통해 NC를 제조하였고, 이후, N2(g) 및 CO2(g)를 공기 대신에 시스템 안에 흘려보냈다. 모든 실험에서, 가스 흐름은 약 120 l/분 이었다. 건도 및 응결을 위해서, 휘발성 증기 및 수분으로 젖은 공기를 제습 유닛에 옮겼고, 그 후 순환 경로에서 시스템 내로 건조시켜 돌려보냈다. 메시 크기 막 4 μm를 사용하여 저온에서(Tin=30℃~60℃) 분무 건조를 수행했다.
가교된 BSA NS 상으로 라니비주맙 및 베바시주맙의 로딩 효율
가교된 BSA NP 안으로 라니비주맙 또는 베바시주맙의 캡슐화를 위하여, 탈용매화 상의 첨가 이전에 라니비주맙 또는 베바시주맙을 BSA 용액에 첨가했다. 나머지 과정은 전술한 바와 동일하게 진행되었다. 가교 후에, NC를 세척했고, 총 한외여과액을 수집하고, 동결건조한 뒤, 500μl DDW에 재용해시켰다.
물리화학적 특성 평가
각각의 제형으로부터 100 μl를 HPLC용 물 1000 μl에 희석하고, 0.2 μm PVDF 필터를 통해 여과한 뒤, Malvern Zetasizer(Malvern Instruments, Malvern UK)를 사용하여 분석하여, 제타 전위 및 입자 직경 크기를 결정했다.
SEM 및 EDS
분무-건조된 NC(및 캡슐화된 NS)의 기하학적 구조, 크기 및 표면 형태를 고안정성 쇼트키 전계 방출원(Siron, 모델: Qianta 200 FEI, 독일), 5 kV을 구비한 고해상도 주사형 전자 현미경(HR-SEM)에 의해 관찰했다. 영상화 이전에, 탄소 접착 탭 상에 샘플들을 분포시킨 뒤, 금과 팔라듐 혼합물로 90~120초 동안 코팅했다. 수중 분산된 일차 NS의 경우에, 샘플들을 고도로 희석시켰고, 그 후에 유리 상에 뿌리고 밤새도록 증발하도록 방치했다. X-MAX20 SDD Inca 450 EDS LN2 자유 검출기를 구비한 EDS(에너지 분산형 X-선 분광학)를 사용하여 견본의 원소 분석을 수행했다.
EDS에 의해 검출된 아민기는 나노입자 안의 알부민 나노캐리어의 존재로부터만 유래될 수 있는데, 그 이유는 제형 내에 어떤 부형제도 아민기를 함유하고 있지 않기 때문이다.
표 8은 프로토콜-2에 의해 제조된 두 개의 제형(가교된 소혈청알부민(BSA)를 포함하는 나노캡슐화된 아바스틴)에 대한 물리화학적 프로파일을 요약하며; 표 9는 프로토콜-1에 의해 제조된 하나의 제형(나노구의 표면과 아바스틴의 콘쥬게이션)에 대한 물리화학적 프로파일을 요약한 것이다. 단백질이 없는 제형에 대한 블랭크 배치 상태(batch state), 단백질이 로딩된 제형에 대한 Ab 배치 상태.
제형 배치 Ab 존재 NS 의 직경( nm ) PDI 제타 전위( mV )
노바스틴-003 블랭크 97.12±1.097 0.251 45.8±1.52
Ab 177.4±3.161 0.083 47.9±0.416
노바스틴-006 블랭크 203.4±2.178 0.124 49.9±0.436
Ab 212.2±2.139 0.112 51.9±0.513
표 8: 비바스핀 세척 이후에 BSA-NP의 크기 및 제타 전위
제형 배치 NS 의 직경( nm ) PDI 제타 전위( mV ) Ab 농도 % 가교
노바스틴-005 69.62±0.333 0.121 56.5±6.43
70.09±0.769 0.14 48.7±0.208 8.486 95.8
표 9: 비바스핀 세척 이후에 INP의 크기 및 제타 전위
겔전기영동에 의해 BSA-NP 중에 자유 Ab의 평가(프로토콜-2)를 다음 파라미터를 사용하여 수행했다: NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gels(Invitrogen), 구배 4-12%, 변성 샘플(환원 안됨), MOPS 진행 완충액(running buffer), 쿠마씨 블루 G-250 염색(0.1 μg의 단백질 한계 검출). 배치 형성 과정에 이어서 전기영동을 15일 동안 적용했다.
결과로부터 증거에 따라서(결과는 미도시), 밴드 밀도를 정량하여 Ab 농도를 얻었다. 제형들 세척액에서 Ab가 발견되지 않았고, 이는 모든 Ab가 BSA-NP에 캡슐화되었다는 것을 지시한다. 캡슐화된 Ab의 매우 적은 방출만이 전기 영동 중에 얻어졌다. NP을 변성시키고 Ab를 해방시키기에 효과적인 과정은 아직까지 발견되지 않았다.
시험관 평가
일차 HSA NS 의 A-431 세포에서의 섭취
37℃에서 4시간 및 22시간 동안 A-431 세포(웰 당 1 mg/ml 및 2 ml/ml의 농도)와 함께 2% FITC-표지된 가교된 HSA NS를 배양했다. 공초점 레이저주사현미경(CLSM)에 근거하여, 4시간 후에 높은 수준의 섭취를 관찰했다(시험된 두 개의 농도에 대해 관찰함). 배양 22시간 후에, 세포 외부에서 NP의 점들이 검출되지 않았다(도 19a-19b).
이러한 관찰은 로딩된 약물(예, siRNA)을 표적 세포에 전달하는 HSA NS의 능력을 입증한다.
SEQUENCE LISTING <110> Yissum Research Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Ltd. <120> NANO DELIVERY SYSTEMS <130> 2171111 <150> US 61/537,241 <151> 2011-09-21 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR-siRNA S(5'3') <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> t is equal to DNA base <400> 1 ccauaaaugc uacgaauaut t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR-siRNA AS(5'3') <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> ag is equal to DNA base <400> 2 auauucguag cauuuaugga g 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scrambled siRNA S(5'3') <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> t is equal to DNA base <400> 3 uaacgacgcg acgacguaat t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scrambled siRNA AS(5'3') <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> t is equal to DNA base <400> 4 uuacgucguc gcgucguuat t 21 <210> 5 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Claims (95)

  1. 복수의 나노캐리어들을 캡슐화하는 나노입자에 있어서, 상기 복수의 나노캐리어들 중 하나 이상은 하나 이상의 활성제를 함유하고, 상기 나노입자는 400 nm 내지 950 nm의 평균 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 나노입자는 나노분무(nanospraying)에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  3. 제 1 항에 있어서,
    나노입자 및/또는 나노캐리어는 각각 가교된 것을 특징으로 하는 나노입자.
  4. 제 1 항에 있어서,
    활성제는 siRNA인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  5. 제 4 항에 있어서,
    나노캐리어는 1,2-디올레일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)의 폴리양이온성 지질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  6. 제 1 항에 있어서,
    나노캐리어는 나노분무에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    나노입자는 하기로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 나노입자:
    (i) 활성제가 소수성인 경우에, 나노캐리어 재료는 소수성이고 나노입자 재료는 친수성임;
    (ii) 활성제가 친수성인 경우에, 나노캐리어 재료는 친수성이고 나노입자 재료는 소수성임;
    (iii) 활성제가 소수성인 경우에, 나노캐리어 재료는 소수성이고 나노입자 재료는 소수성임; 및
    (iv) 활성제가 친수성인 경우에, 나노캐리어 재료는 친수성이고 나노입자 재료는 친수성임.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 나노입자의 평균 직경은 1 마이크론 미만인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 나노입자의 평균 직경은 950 nm 미만인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 나노입자의 평균 직경은 약 400 내지 950 nm인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 나노캐리어의 평균 직경은 약 300 nm 미만인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 나노캐리어의 평균 직경은 약 50 내지 300 nm인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 나노캐리어의 평균 직경은 약 50 내지 100 nm인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    나노캡슐 또는 나노구의 형태인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 나노캐리어는 나노캡슐, 나노구 또는 그의 혼합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  16. 제 15 항에 있어서,
    나노캐리어는 나노분무에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  17. 제 7 항에 있어서,
    활성제가 소수성인 경우에, 나노캐리어 재료는 소수성이고 나노입자 재료는 친수성인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  18. 제 7 항에 있어서,
    활성제가 친수성인 경우에, 나노캐리어 재료는 친수성이고 나노입자 재료는 소수성인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  19. 제 7 항에 있어서,
    활성제가 소수성인 경우에, 나노캐리어 재료는 소수성이고 나노입자 재료는 소수성인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  20. 제 7 항에 있어서,
    활성제가 친수성인 경우에, 나노캐리어 재료는 친수성이고 나노입자 재료는 친수성인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  21. 제 7 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 소수성 재료는 락트산, 폴리(D,L-락틱-코-글리콜산)(PLGA), 폴리(D,L-락트산)(PLA), 폴리(ε-카프롤락톤), 폴리(2-디메틸아미노-에틸메타크릴레이트)호모폴리머, 폴리(2-디메틸아미노-에틸메타크릴레이트)-b-폴리(에틸렌글리콜)-α-메톡시-ω-메타크릴레이트 코폴리머, 폴리시아노아크릴레이트, 폴리안히드리드 폴리머 및 그들의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  22. 제 21 항에 있어서,
    상기 소수성 재료는 락트산, 폴리(D,L-락틱-코-글리콜산)(PLGA), 및 그의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  23. 제 22 항에 있어서,
    상기 PLGA는 약 4,000 내지 100,000 Da의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  24. 제 1 항에 있어서,
    상기 나노입자 재료는 소수성이며, 상기 나노입자의 외부 표면은 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티와 연관되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  25. 제 7 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 친수성 재료는 덱스트란, 히알루로네이트, 보통의 인간 혈청 알부민(HSA) 또는 가교된 인간 혈청 알부민, 보통의 소 혈청 알부민(BSA) 또는 가교된 소 혈청 알부민, 키토산, 셸락(shellac), 콜라겐, 젤라틴, 검 아라빅, 폴리비닐알콜, 시클로덱스트린 및 그의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  26. 제 25 항에 있어서,
    친수성 재료는 인간 혈청 알부민(HSA), 소 혈청 알부민(BSA) 또는 히알루론산인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  27. 제 26 항에 있어서,
    상기 인간 혈청 알부민(HSA)는 약 66,500 Da의 평균 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  28. 제 26 항에 있어서,
    상기 히알루론산은 20,000에서 최대 1,000,000 Da의 평균 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  29. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 활성제는 비타민, 단백질, 항산화제, 핵산, 단(short) 또는 장(long) 올리고뉴클레오티드, siRNA 및 그의 화학적 유도체, 펩티드, 폴리펩티드, 지질, 탄수화물, 호르몬, 항체, 단일클론항체, 백신, 예방제, 약물, 진단제, 조영제, 영양제(nutraceutical agent), 소분자, 전해질, 면역제 및 그의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  30. 제 29 항에 있어서,
    활성제는 siRNA인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  31. 제 7 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
    나노캐리어는 하나 이상의 친수성 활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  32. 제 30 항에 있어서,
    상기 친수성 활성제는 치료용 펩티드 또는 단백질로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  33. 제 30 항에 있어서,
    상기 친수성 활성제는 엑세나타이드(exenatide), 인슐린, 성장 호르몬, 트립토렐린 아세테이트(triptorelin acetate), 부세렐린(buserelin), 및 나파렐린(nafarelin)으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  34. 제 7 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 나노캐리어는 하나 이상의 소수성 시제(agent)을 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  35. 제 34 항에 있어서,
    상기 소수성제는 진통제 또는 항염증제; 구충제(anthelmintic agent); 항부정맥제(anti-arrhythmic agent); 항세균제(anti-bacterial agent); 항응혈제; 항우울제; 항당뇨제(antidiabetic); 항-간질제(anti-epileptic); 항진균제(anti-fungal agent); 항통풍제(anti-gout agent); 혈압강하제(anti-hypertensive agent); 항말라리아제(anti-malarial agent); 항-편두통제(anti-migraine agent); 항-무스카린제(anti-muscarinic agent); 항-신경가소성제(anti-neuroplastic agent) 또는 면역억제제(immunosuppressant); 항-원생동물제(anti-protazoal agent); 항-갑상선제(anti-thyroid agent); 불안완화제(anxiolytic), 진정제(sedative), 수면제(hypnotic) 또는 신경이완제(neuroleptic agent); 베타-차단제(beta-blocker); 심근수축제(cardiac inotropic agent); 코르티코스테로이드(corticosteroid); 이뇨제(diuretic agent); 항-파키슨제(anti-Parkinsonian agent); 위장약(gatro-intestinal agent); 히스타민 H1-수용체 길항제(histamine H1-receptor antagonist); 지질 조절제(lipid regulating agent); 니트레이트(nitrate) 또는 항-협심증제(anti-anginal agent); 영양제(nutritional agent); HIV 프로테아제 억제제(HIV protease inhibitor); 오피오이드 진통제(opioid analgesic); 성 호르몬(sex hormone) 및 흥분제(stimulant agent)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  36. 제 1 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 표적화제와 연관된 외부 표면을 갖는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  37. 제 36 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 표적화제는 단일 클론 항체; 소분자; 히알루론산 또는 히알루로난; 종양 관통성 펩티드; 표피 성장 인자(EGF); 트랜스페린; 페리틴; 아르기닌-글리신-아스파르트산(RGD) 펩티드; 상피 세포 접착 분자(EpCAM); 세포 간 접착 분자 1(ICAM-1); 암배아 항원(carcinoembryonic antigen)(CEA); 혈관활성장관폴리펩티드; CA 15-3 항원; MUC1 단백질; CD20; CD33; 인테그린; 림프 표적 모이어티(예, LyP-1); 앱타머; 올리고당으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  38. 제 37 항에 있어서,
    상기 단일 클론 항체는 트라스투주맙(trastuzumab)(Herceptin®); AMBLK8; 세툭시맙(cetuximab)(Erbitux®); 리툭시맙(Rituximab)(MabThera®); 라니비주맙(ranibizumab)(Lucentis®); 및 베바시주맙(bevacizumab)(Avastin®)으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  39. 제 38 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 표적화제는 라니비주맙(Lucentis®) 및 및 베바시주맙(Avastin®)으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  40. 제 37 항에 있어서,
    상기 소분자는 엽산 및 엽산염으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  41. 제 1 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
    나노캐리어 각각은 폴리머 재료로 이루어지거나, 금속으로 이루어지거나, 또는 금속을 포함하는 비-금속 재료로 이루어지는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  42. 제 41 항에 있어서,
    상기 나노캐리어는 폴리머 재료로 이루어진 것을 특징으로 하는 나노입자.
  43. 제 41 항에 있어서,
    상기 나노캐리어는 금속으로 이루어진 것을 특징으로 하는 나노입자.
  44. 제 43 항에 있어서,
    상기 금속은 금인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  45. 제 1 항에 있어서,
    상기 활성제는 나노캐리어 내에 함유되거나 나노캐리어의 외부 표면의 영역에 연관되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  46. 제 42 항 또는 제 43 항에 있어서,
    상기 활성제는 나노캐리어 외부 표면의 영역과 연관되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  47. 제 46 항에 있어서,
    상기 연관은 직접적으로 또는 연결기를 거치는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  48. 제 1 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 나노캐리어는 하나 이상의 추가 표적화제와 연관된 외부 표면을 갖는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  49. 제 48 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 표적화제는 상기 하나 이상의 추가 표적화제와 동일한 것을 특징으로 하는 나노입자.
  50. 제 48 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 표적화제는 상기 하나 이상의 추가 표적화제와 상이한 것을 특징으로 하는 나노입자.
  51. 제 1 항 내지 제 50 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 활성제는 음으로 하전되거나 양으로 하전되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  52. 제 51 항에 있어서,
    상기 활성제는 음으로 하전되고, 나노캐리어는 양이온성 지질 또는 세포 관통 펩티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  53. 제 52 항에 있어서,
    상기 양이온성 지질은 1.2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP), 스테아릴아민, 및 올레일아민으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  54. 제 53 항에 있어서,
    상기 양이온성 지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  55. 제 52 항에 있어서,
    상기 세포 관통 펩티드는 HIV-TAT, 페네트라틴(penetratin), 그라미시딘 S(Gramicidin S), MSI-103, MSI-103-Arg, PGLa, PGLa-Arg, 마가이닌 2(magainin 2), 마가이닌-2-Arg, KIGAKI, BP100, MAP, MAP-Arg, SAP, PEP-1, 트랜스포탄(transportan), 및 FP23으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  56. 제 1 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 나노입자는 콜로이드성 조성물을 기결정된 크기의 하나 이상의 구멍을 구비한 스크린에 통과시키는 것을 포함하는 공정에 의해 제조되며, 상기 콜로이드성 조성물은 액체 매질 중에 복수의 나노캐리어 및 나노입자 재료를 포함하되, 상기 복수의 나노캐리어는 하나 이상의 활성제를 포함하고 상기 나노입자 재료는 상기 액체 매질에 적어도 부분적으로 용해되며, 상기 구멍의 크기는 나노입자의 크기를 결정하는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  57. 제 56 항에 있어서,
    콜로이드성 조성물은 액체 매질 중에 나노입자 재료와 함께 복수의 나노캐리어를 혼합하는 것에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  58. 제 56 항 또는 제 57 항에 있어서,
    나노입자를 건조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  59. 제 58 항에 있어서,
    건조하는 단계는 동결 건조, 건조, 감압, 또는 용매 추출법에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  60. 제 1 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 따른 복수의 나노입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  61. 제 60 항에 있어서,
    약학 조성물로서 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  62. 제 61 항에 있어서,
    정맥 내(i.v) 투여 또는 경구 투여에 적합한 것을 특징으로 하는 조성물.
  63. 제 60 항에 있어서,
    상기 나노입자는 동결 건조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  64. 약학 조성물의 제조를 위해서 제 1 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 따른 나노입자의 사용.
  65. 제 64 항에 있어서,
    약학 조성물은 치료제를 국부적으로, 경구적으로, 비경구적으로 또는 정맥 내로 피검자의 순환계 안으로 전달하기 위한 전달 시스템으로서 적합한 것을 특징으로 하는 사용.
  66. 제 64 항 또는 제 65 항에 있어서,
    전달 시스템은 활성제의 촉진 표적화 치료 전달(facilitated targeted therapeutic delivery) 및 방출 조절 투여(controlled release administration)에 적합한 것을 특징으로 하는 사용.
  67. 제 64 항 내지 제 66 항 중 어느 한 항에 따른 조성물 및 사용을 위한 설명서를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  68. 제 1 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 따른 복수의 나노입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 전달 시스템.
  69. 제 68 항에 있어서,
    상기 전달 시스템은 하나 이상의 활성제를 피검자의 순환계에 전달하기에 적합한 것을 특징으로 하는 전달 시스템.
  70. 제 1 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 따른 나노입자를 얻기 위한 공정에 있어서, 상기 공정은:
    (a) 하나 이상의 활성제를 포함하는 하나 이상의 나노캐리어를 얻는 단계; 및
    (b) 상기 하나 이상의 나노캐리어를 상기 나노입자 안으로 캡슐화하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
  71. 제 70 항에 있어서,
    상기 나노캐리어는 소수성 폴리머 매트릭스를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
  72. 제 71 항에 있어서,
    상기 나노캐리어는:
    - 유기 상을 형성하기 위해서 유기 용매에 소수성 폴리머를 용해시키는 단계;
    - 상기 유기 상을 수성 상과 접촉시키는 단계로, 상기 수성 상은 계면활성제를 선택적으로 포함하고, 이에 의해 상기 나노캐리어를 얻는 단계; 및
    - 상기 나노캐리어의 표면 중 적어도 일부와 활성제의 연관이 가능하도록, 상기 활성제의 용액과 함께 상기 나노캐리어를 배양하는 단계
    에 의해 얻는 것을 특징으로 하는 공정.
  73. 제 72 항에 있어서,
    상기 유기 용매는 수-혼용성(water-miscible)인 것을 특징으로 하는 공정.
  74. 제 73 항에 있어서,
    상기 유기 혼용성 용매는 아세톤, 에탄올, 메탄올, 클로로포름 디클로로메탄(DCM), 디에틸에테르, 아세톤 및 아세토니트릴(ACN)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 공정.
  75. 제 70 항에 있어서,
    상기 나노캐리어는 친수성 폴리머 매트릭스를 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
  76. 제 75 항에 있어서,
    상기 나노캐리어는:
    - 수성 상을 형성하기 위해서 활성제의 수성 용액에 친수성 폴리머를 용해시키는 단계;
    - 상기 나노캐리어의 형성을 가능하게 하는 pH 하에서, 탈용매화제를 포함하는 유기 상을 수성 상에 연속적으로 첨가하는 단계에 의해 얻어지며,
    활성제는 나노캐리어 내에 분포된 것을 특징으로 하는 공정.
  77. 제 76 항에 있어서,
    상기 친수성 폴리머 매트릭스를 가교하는 단계를 임의적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
  78. 제 76 항 또는 제 77 항에 있어서,
    상기 적합한 pH는 6 내지 9인 것을 특징으로 하는 공정.
  79. 제 76 항 내지 제 78 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 탈용매화제는 아세톤, 에탄올 및 아세토니트릴로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 공정.
  80. 제 76 항 내지 제 79 항 중 어느 한 항에 있어서,
    유기 상은 양이온성 지질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
  81. 제 70 항 내지 제 80 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 나노입자의 외부 표면 중 적어도 일부분을 하나 이상의 표적화 모이어티(targeting moiety)로 관능화(functionalizing)하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
  82. 제 81 항에 있어서,
    상기 적어도 일부분은 나노입자의 전체 표면인 것을 특징으로 하는 공정.
  83. 제 81 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 표적화 모이어티는 PEG, 트라스투주맙(trastuzumab)(Herceptin®), AMBLK8, 세툭시맙(cetuximab)(Erbitux®), 리툭시맙(Rituximab)(MabThera®), 베바시주맙(bevacizumab)(Avastin®), 라니비주맙(ranibizumab)(Lucentis®), 소분자, 히알루론산, 히알루로난(hyaluronan), 종양 관통성 펩티드, 표피 성장 인자(EGF), 트랜스페린, 페리틴, 아르기닌-글리신-아스파르트산(RGD) 펩티드, 상피 세포 접착 분자(EpCAM), 세포 간 접착 분자 1(ICAM-1), 암배아 항원(carcinoembryonic antigen)(CEA), 혈관활성장관폴리펩티드, CA 15-3 항원, MUC1 단백질, CD20, CD33, 인테그린, 림프 표적 모이어티, 앱타머 및 올리고당으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 공정.
  84. 제 70 항 내지 제 83 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 나노입자의 동결건조를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
  85. 제 1 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 따른 나노입자를 얻기 위한 나노분무 공정에 있어서, 상기 공정은 콜로이드성 조성물을 기결정된 크기의 하나 이상의 구멍을 구비한 스크린에 통과시키는 것을 포함하며, 상기 콜로이드성 조성물은 액체 매질 중에 복수의 나노캐리어 및 나노입자 재료를 포함하되, 상기 복수의 나노캐리어는 하나 이상의 활성제를 포함하고 상기 나노입자 재료는 상기 액체 매질에 적어도 부분적으로 용해되며, 상기 구멍의 크기는 나노입자의 크기를 결정하는 것을 특징으로 하는 나노분무 공정.
  86. 제 85 항에 있어서,
    콜로이드성 조성물은 액체 매질 중에 나노입자 재료와 함께 복수의 나노캐리어를 혼합하는 것에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 나노분무 공정.
  87. 제 85 항 또는 86 항에 있어서,
    나노입자를 건조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 나노분무 공정.
  88. 제 87 항에 있어서,
    건조하는 단계는 동결 건조, 건조, 감압, 또는 용매 추출법에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 나노분무 공정.
  89. 복수의 나노캐리어를 캡슐화하는 나노입자에 있어서, 상기 복수의 나노캐리어들 중 하나 이상은 하나 이상의 활성제를 함유하며, 상기 나노입자는 400 nm 내지 950 nm의 평균 직경을 가지며, 나노입자는 나노분무에 의해 얻어질 수 있는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  90. 복수의 나노캐리어를 캡슐화하는 나노입자에 있어서, 상기 복수의 나노캐리어들 중 하나 이상은 하나 이상의 활성제를 함유하며, 상기 나노입자는 400 nm 내지 950 nm의 평균 직경을 가지며, 나노입자는 나노분무에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  91. 복수의 나노캐리어를 캡슐화하는 나노입자에 있어서, 상기 복수의 나노캐리어들 중 하나 이상은 하나 이상의 활성제를 함유하며, 상기 나노입자는 400 nm 내지 950 nm의 평균 직경을 가지며, 나노입자 및/또는 나노캐리어는 가교된 것을 특징으로 하는 나노입자.
  92. 복수의 나노캐리어를 캡슐화하는 나노입자에 있어서, 상기 복수의 나노캐리어들 중 하나 이상은 하나 이상의 활성제를 함유하며, 상기 나노입자는 400 nm 내지 950 nm의 평균 직경을 가지며,
    상기 나노입자는 하기로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 나노입자:
    - 활성제가 소수성인 경우에, 나노캐리어 재료는 소수성이고 나노입자 재료는 친수성이며; 나노입자 재료는 수성 매질에서의 용해도를 감소시키기 위하여 임의적으로 더 가교되거나; 또는
    - 활성제가 친수성인 경우에, 나노캐리어 재료는 친수성이며, 임의적으로 가교되고, 나노입자 재료는 소수성임.
  93. 복수의 나노캐리어를 캡슐화하는 나노입자에 있어서, 상기 복수의 나노캐리어들 중 하나 이상은 하나 이상의 활성제를 함유하며, 상기 나노입자는 400 nm 내지 950 nm의 평균 직경을 가지며,
    상기 나노입자 및또는 나노캐리어는 각각 가교되고, 하기로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 나노입자:
    - 활성제가 소수성인 경우에, 나노캐리어 재료는 소수성이고 나노입자 재료는 친수성이며; 나노입자 재료는 수성 매질에서의 용해도를 감소시키기 위하여 임의적으로 더 가교되거나; 또는
    - 활성제가 친수성인 경우에, 나노캐리어 재료는 친수성이며, 임의적으로 가교되고, 나노입자 재료는 소수성임.
  94. 복수의 나노캐리어를 캡슐화하는 나노입자에 있어서, 상기 복수의 나노캐리어들 중 하나 이상은 하나 이상의 활성제를 함유하며, 상기 나노입자는 400 nm 내지 950 nm의 평균 직경을 가지며,
    상기 나노입자 및/또는 나노캐리어는 나노분무에 의해 얻어지고, 하기로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 나노입자:
    - 활성제가 소수성인 경우에, 나노캐리어 재료는 소수성이고 나노입자 재료는 친수성이며; 나노입자 재료는 수성 매질에서의 용해도를 감소시키기 위하여 임의적으로 더 가교되거나; 또는
    - 활성제가 친수성인 경우에, 나노캐리어 재료는 친수성이며, 임의적으로 가교되고, 나노입자 재료는 소수성임.
  95. 복수의 나노캐리어를 캡슐화하는 나노입자에 있어서, 상기 복수의 나노캐리어들 중 하나 이상은 하나 이상의 활성제를 함유하며, 상기 나노입자는 400 nm 내지 950 nm의 평균 직경을 가지며,
    상기 나노입자는 나노분무에 의해 얻어지며, 상기 나노입자 및/또는 나노캐리어는 가교되고, 하기로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 나노입자:
    - 활성제가 소수성인 경우에, 나노캐리어 재료는 소수성이고 나노입자 재료는 친수성이며; 나노입자 재료는 수성 매질에서의 용해도를 감소시키기 위하여 임의적으로 더 가교되거나; 또는
    - 활성제가 친수성인 경우에, 나노캐리어 재료는 친수성이며, 임의적으로 가교되고, 나노입자 재료는 소수성임.
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