CN104897597A - 核酸制剂的检测试剂及核酸制剂检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种核酸制剂的检测试剂及核酸制剂检测方法，其由水1-10份、水溶型有机溶剂20-80份和水不溶型有机溶剂2-20份制成。本发明的核酸制剂的定量检测方法，不需要添加任何设备，利用实验室常用的溶剂就可以完成操作，经济适用，不增加成本。

Description

核酸制剂的检测试剂及核酸制剂检测方法

技术领域

本发明涉及一种核酸制剂的定量检测方法，属于生物医学技术领域。

背景技术

核酸作为药物、在基因治疗和基因沉默的基础研究和临床应用日益广泛。核酸，包括DNA、RNA的应用应为其带有强的负电荷及不稳定性受到限制。因此，核酸的应用需要载体保护其不受酶的水解和携带其进入靶组织。纳米颗粒技术的发展，在很大程度上促进了核酸在研究及开发核酸药物的应用。而药理作用取决于核酸分子包裹程度。因此，核酸分子包裹量的测定变得尤其重要。因为核酸分子被酶水解的不稳定性，在颗粒表面的核酸分子，是可被水解，不能发生生物效应。只有在纳米颗粒内部的核酸才有可能到达靶组织和细胞，发挥效应，测定其剂量。核酸是易溶于水的物质，最常用的方法是将被包裹的核酸分子溶于水中，直接在紫外吸收光谱法UV260下测其光吸收。根据其消光系数，就可以直接计算出溶液中核酸含量。而在纳米颗粒中，由于纳米化合物的包裹或相互作用，有些纳米颗粒中的核酸不能溶出在水中，不能直接用光谱测量。目前常用的方法测量纳米颗粒尤其是脂质体包裹的核酸的方法有以下几种：第一种技术方案应用核酸染料，先利用Triton X-100将脂质体破碎，加入核酸结合荧光染料RiboGreen。然后在kex＝500nm,kem＝525nm下测定荧光的量，推算出核酸在纳米颗粒中的含量。此方案手续繁琐，需要荧光色谱仪和荧光染料，成本较高，且变量较大；第二种技术方案采用层析法：对于脂质体而言，可先利用层析柱将游离的和结合的核酸分子分开，然后将其溶于酒精，直利用光谱在260nm下测定核酸的量。这种方案需要层析柱，避免不了样品稀释，同时，如果纳米颗粒带有阳电荷，核酸分子将可能与其结合，不能完全游离，加上有些成分在酒精中溶解度较低，均会影响核酸的准确定量。其他技术方案还包括酶保护法、超速密度离心及毛细管电泳，上述方案均需要特殊技术或昂贵设备，且准确性也应手续复杂而打折扣。因此，为解决以上问题，亟待研发一种新的定量方法。

发明内容

(一)要解决的技术问题

为解决上述问题，本发明提出了一种核酸制剂的定量检测方法，简化了纳米颗粒中核酸的定量方法，比现有的方法更经济、快速、且保持了准确性、不需要特殊的设备。

(二)技术方案

本发明提供一种用于核酸的定量检测的CK介质，其由水1-10份、水溶型有机溶剂20-80份和水不溶型有机溶剂2-20份制成。

进一步地，其由水2-5份、水溶型有机溶剂25-40份和与水不溶型有机溶剂10-18份制成。

进一步地，其由水2份、水溶型有机溶剂30份和与水不溶型有机溶剂15份制成。

进一步地，水溶型有机溶剂选自乙醛、乙酸、丙酮、乙腈、1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、2-丁氧基乙醇、丁酸、二乙醇氨、二乙烯三胺、二甲基甲酰胺、乙二醇二甲醚、二甲亚砜、1,4-二氧六环、乙醇、乙胺、乙二醇、甲酸、糠醇、甘油、甲醇、甲基二乙醇氨、甲基异腈、1-丙醇、1,3-异丙醇、戊醇、2-丙醇、丙酸、丙二醇、吡啶、四氢呋喃、三乙二醇中的一种或两种以上的组合。

进一步地，水不溶型有机溶剂选自己烷,甲苯六氢化苯，乙酸乙酯、醋酸异丙酯、甲基异丁酮、正辛醇、三氯乙烯、全氯乙烯、二氯甲烷,、四氯化碳、氯仿、1,1,1-三氯乙烷、一氟二氯甲烷、氟三氯甲烷、四氟化碳中的一种或两种以上的组合。

进一步地，所述CK介质的配制具体包括：水2份，酒精30份，氯仿15份混合。

进一步地，所述CK介质的配制具体包括：水2份，酒精30份，二氯甲烷15份混合。

进一步地，所述CK介质的配制具体包括：水2份，异丙醇30份，氯仿15份混合。

进一步地，所述CK介质的配制具体包括：水2份，异丙醇30份，二氯甲烷15份混合。

本发明还提供一种核酸制剂的定量检测方法，所述方法包括如下步骤：

步骤一：配制CK介质：取水1～10份、与水溶型有机溶剂20～80份和水不溶型有机溶剂2～20份混合；

步骤二：将纳米颗粒加入到配制好的CK介质中，得到混合溶液；

步骤三：取混合溶液，放置于紫外分光光度计下进行测量，测定纳米颗粒包裹的核酸的吸光值；

步骤四：重复步骤二及步骤三的操作，并完成三次测量；

步骤五：根据步骤四测量得到的三组吸光值，取平均值后，按照常规的计算方法，按照纳米颗粒包裹的核酸的消光系数，并计算得到纳米颗粒包裹的核酸的量。

进一步地，所述步骤二具体如下：将纳米颗粒的样品稀释至合适的浓度，得到样品液；各取2ml配制好的CK介质至2支比色皿中，调零；取x ul样品液放入测量的比色皿内，使该样品液完全溶解于CK介质，并混合均匀。

进一步地，所述步骤三具体如下：将紫外分光光度计开启预热后，进入调光度模式，并调节波长为260nm；取混合溶液于UV260nm的紫外分光光度计下进行吸光测定，并测量得吸光值。

进一步地，所述步骤一中的水溶型有机溶剂是酒精或异丙醇；和水不溶型有机溶剂是氯仿或二氯甲烷。

进一步地，所述CK介质的配制具体包括：水2份，酒精30份，氯仿15份混合。

进一步地，所述CK介质的配制具体包括：水2份，酒精30份，二氯甲烷15份混合。

进一步地，所述CK介质的配制具体包括：水2份，异丙醇30份，氯仿15份混合。

进一步地，所述CK介质的配制具体包括：水2份，异丙醇30份，二氯甲烷15份混合。

(三)有益效果

与现有技术相比，本发明的核酸制剂的定量检测方法，简化了纳米颗粒中核酸的定量方法，不需要添加任何设备，利用实验室常用的溶剂就可以完成操作，成本低，准确性较高。

附图说明

图1是本发明的定磷法标准曲线的示意图；

图2是本发明的超纯水稀释标准siRNA样品的配制方法的示意图；

图3是本发明的CK介质中标准siRNA样品的配制方法的示意图；

图4是本发明的标准品41110-Aga1h的色谱图；

图5是本发明的样品纳米制剂，批号R14032的色谱图；

图6是本发明的样品纳米制剂，批号R14061的色谱图；

图7是本发明的样品纳米制剂，批号R14079的色谱图；

图8是本发明的样品纳米制剂，批号R14133的色谱图；

图9是本发明的样品纳米制剂，批号R14134的色谱图；

图10是本发明的样品纳米制剂，批号R14135的色谱图；

具体实施方式

实施例1定磷法测定标准品未包裹的siRNA的含量

准确称取干燥标准siRNA(本实验室固相合成)样品A＝36mg，B＝24mg，C＝62mg，分别溶于1mL无菌水中。

制备标准磷溶液：将磷酸二氢钾于110℃烘至恒重(4小时)，准确称取0.8775g溶于少量蒸馏水中，转移至500ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。此溶液每1m1含磷400μg，稀释20倍(20μg/m1)。定磷试剂需要：17％硫酸、2.5％钼酸铵溶液及10％抗坏血酸溶液，上述三种溶液贮存于棕色瓶中，溶液呈淡黄色尚可使用，呈深黄甚至棕色即失效，临时制备定磷试剂时将上述三种溶液与水按如下比例混合：17％硫酸:2.5％钼酸铵溶液:10％抗坏血酸溶液:水＝1:1:1:2(V:V)。

取干燥试管7支，按0～6依次编号，根据表1所示加入试剂，加毕摇匀；在45℃水浴中保温10min，冷却，以零号管调零点，于660nm处测吸光度；如图1所示为以磷含量为横坐标，吸光度为纵坐标所作的定磷法标准曲线图；

表1：标准曲线测定数据：

标准曲线：y＝0.483x+0.0024

标准品测定方法：取50毫升凯氏烧瓶2只，做平行样，分别取标准siRNA样品，置于各凯氏烧瓶内，分别加入6mol/L硫酸1.0mL置消化架用酒精灯加热消化15min，(溶液呈褐色甚至更深)，稍加冷却，加入2mol/L硝酸2滴，再继续加热5min(逸出白色烟雾，溶液无色透明，表示消化完成时为止)。待凯氏烧瓶冷却后，分别加入1.0mL蒸馏水，置沸水浴蒸煮5min，使焦磷酸分解。凯氏烧瓶从沸水浴中取出，待其冷却，将瓶内的消化液分别移入两只50ml容量瓶中，用少量蒸馏水洗涤凯氏烧瓶两次，并将洗涤液一并倒入容量瓶内，再各加蒸馏水稀释至刻度。

取试管5支，按7～11依次编号，7号管为空白对照。准确吸取蒸馏水3.0mL，置于7号管内；再分别准确吸取经过消化的核糖核酸样液3.0mL，置于8、9和10、11号管内，各管分别加入3.0ml定磷试剂，摇匀；在45℃水浴中保温10min，取出冷却；以7号管调零点，于660nm处测吸光度，算出平均A660nm值；取12、13号试管分别准确吸取未经消化的核酸溶液(8000RMP/min*10min离心后)0.020ml，分别加蒸馏水2.980ml，加定磷试剂3.0m1，摇匀。于45℃水浴中保温10min，取出后冷却以11000RMP/min*10min离心后，测得A660nm(此步骤与总磷测定同时做)；并从图1的定磷法标准曲线图上查出总磷微克数(X)及无机磷微克数(Y)。根据标准品A、B、C三组不同的标准siRNA样品的量重复该步骤，其结果如以下三个数据表所示：

表2  标准品A测定及结果： 

表3  标准品B测定及结果： 

表4  标准品C测定结果表： 

实施例2定磷法测定纳米颗粒包裹的核酸量

siRNA纳米颗粒的制备见专利ZL201180041450.X。测定方法见实施例一。把合成的未包裹的siRNA替代为脂质体包裹的siRNA增加一组纳米颗粒空壳(未包裹核酸的纳米颗粒)。测得的总磷量减去空壳的磷含量，即得到纳米颗粒的磷含量。然后根据与实施例一相同公式，推算出核酸的含量。

实施例3紫外吸收光谱法UV260siRNA含量

表5  紫外吸收光谱法UV260纯水中标准siRNA(如实施例1)样品消光系数的测定：

如图3所示在CK介质中标准siRNA样品的配制方法，根据图3中的配制方法，得到每个浓度2个平行样；置于波长为260nm的紫外分光光度计进行测定，如下表所示得到紫外吸收光谱法UV260CK介质中标准siRNA样品消光系数；并根据下表中的数据所示，得到siRNA在CK介质中的消光系数为30。

实施例4紫外吸收光谱法测定

核酸的紫外吸收光谱法测定通常是在水溶液中测定的，然后根据核酸的消光系数，计算核酸在溶液中的浓度。其公式为

$\mathrm{\ϵ}=\frac{A}{\mathrm{CL}}$

其中A为在UV260下的吸光度，ε为摩尔消光系数(L/mol/cm),C为浓度(mol/l)。

因为，介质的变化，CK介质含有有机溶剂，紫外吸收光谱法测定时，其消光系数不会与水中测定的消光系数一样。

CK介质中化学合成的未包裹的标准siRNA样品，

表6  紫外吸收光谱法UV260 CK介质中标准siRNA样品消光系数测定表：

将标准siRNA样品和纳米颗粒组分分别加入CK介质中，检测纳米颗粒成分对siRNA定量的影响，根据下表中的数据所示，标准siRNA样品与脂质体其他组份混合后的溶液，在CK介质中的消光系数也为30。

用经典的定磷的方法测量核酸的绝对量作为标准，用光谱UV260为实验室常用的核酸的定量方法为基础，为纳米颗粒核酸的测定的准确性提供参考。

实施例5

紫外吸收光谱法UV标准siRNA样品与脂质体其他组份混合后的溶液，在CK介质中的消光系数测定，UV260将siRNA标准品和纳米颗粒组分分别加入CK介质中，以检测纳米颗粒成分对siRNA定量的影响

表7  纳米颗粒成分对siRNA定量的影响 

如上数据所示，得到纯siRNA与脂质体其他组份混合后的溶液，在CK介质中的消光系数也为30。在纳米颗粒组分存在的情况下，测定核酸在CK介质中的定量不被干扰。消光系数不变。

实施例6：HPLC方法纳米制剂核酸方法的定量的比较：

对照品及样品溶液的制备：精取量取已知溶度的双链siRNA，用水精确稀释至100ug/ml左右；分别吸取对照品和供试品10ul进样在260nm波长的HPLC仪器下进行测定；并按外标法以峰面积计算，得到测量的色谱图如图6所示。

分别取样品批次R14032、R14061、R14079、R14133、R14134及R14135的样品进行测量，得到的色谱图如图7至图10所示；以下是取样品批次R14032、R14061、R14079、R14133、R14134及R14135的测量数据表；

表8  不同样品批次定磷法、HPLC和CK介质方法siRNA定量量数据比较：

不同批号的纳米制剂利用专利ZL201180041450.X中的方法制备。

上面所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的构思和范围进行限定。在不脱离本发明设计构思的前提下，本领域普通人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入到本发明的保护范围，本发明请求保护的技术内容，已经全部记载在权利要求书中。

Claims (10)

1.一种用于核酸的定量检测的CK介质，其特征在于，其由水1-10 份、水溶型有机溶剂20-80份和水不溶型有机溶剂2-20份制成。

2.根据权利要求1所述的CK介质，其特征在于，其由水2-5份、水溶型有机溶剂25-40份和与水不溶型有机溶剂10-18份制成。

3.根据权利要求1所述的CK介质，其特征在于，其由水2份、水溶型有机溶剂30份和与水不溶型有机溶剂15份制成。

4.根据权利要求1所述的CK介质，其特征在于，水溶型有机溶剂选自乙醛、乙酸、丙酮、乙腈、1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、2-丁氧基乙醇、丁酸、二乙醇氨、二乙烯三胺、二甲基甲酰胺、乙二醇二甲醚、二甲亚砜、1,4-二氧六环、乙醇、乙胺、乙二醇、甲酸、糠醇、甘油、甲醇、甲基二乙醇氨、甲基异腈、１-丙醇、1,３-异丙醇、戊醇、２-丙醇、 丙酸、丙二醇、吡啶、四氢呋喃、三乙二醇中的一种或两种以上的组合。

5.根据权利要求1所述的CK介质，其特征在于，水不溶型有机溶剂选自 己烷, 甲苯　六氢化苯，乙酸乙酯、醋酸异丙酯、甲基异丁酮、正辛醇　、三氯乙烯、 全氯乙烯、　二氯甲烷,、四氯化碳、氯仿 、1,1,1-三氯乙烷、一氟二氯甲烷、氟三氯甲烷、四氟化碳中的一种或两种以上的组合。

6.一种核酸制剂的定量检测方法，包括如下步骤：

步骤一：配制权利要求1-5所述CK介质：取水与水溶型有机溶剂和水不溶型有机溶剂混合；

步骤二：将包裹有核酸的纳米颗粒加入到配制好的权利要求1-5所述CK介质中，得到混合溶液；

步骤三：取混合溶液，测定纳米颗粒包裹的核酸的量。

7.一种核酸制剂的定量检测方法，所述的步骤三为采用紫外分光光度法、高效液相色谱法或凝胶电泳法测定。包括如下步骤：

步骤一：配制权利要求1-5所述CK介质：取水1~10份、与水溶型有机溶剂20-80份和水不溶型有机溶剂2-20份混合；

步骤二：将包裹有核酸的纳米颗粒加入到配制好的权利要求1-5所述CK介质中，得到混合溶液；

步骤三：取混合溶液，放置于紫外分光光度计下进行测量，测定纳米颗粒包裹的核酸的量；

步骤四：重复步骤二及步骤三的操作，并完成三次测量；

步骤五：根据步骤四测量得到的三组吸光值，取平均值后，计算纳米颗粒包裹的核酸的消光系数，并计算得到纳米颗粒包裹的核酸的量。

8.根据权利要求6所述核酸制剂的定量检测方法，其特征在于：所述步骤二具体如下：将纳米颗粒的样品稀释至合适的浓度，得到样品液；各取2ml配制好的CK介质至2支比色皿中，调零；取xμl样品液放入测量的比色皿内，记录相应的稀释倍数，使该样品液完全溶解于CK介质，并混合均匀。

9.根据权利要求1所述的核酸制剂的定量检测方法，其特征在于：所述步骤三具体如下：将紫外分光光度计开启预热后，进入调光度模式，并调节波长为260nm；取混合溶液于UV260nm的紫外分光光度计下进行吸光测定，并测量得吸光值。

10.根据权利要求1所述的核酸制剂的定量检测方法，其特征在于：所述步骤一中的水溶型有机溶剂是酒精或异丙醇；和水不溶型有机溶剂是氯仿或二氯甲烷。