WO2024048670A1 - 導入装置及びデリバリー方法 - Google Patents

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WO2024048670A1
WO2024048670A1 PCT/JP2023/031594 JP2023031594W WO2024048670A1 WO 2024048670 A1 WO2024048670 A1 WO 2024048670A1 JP 2023031594 W JP2023031594 W JP 2023031594W WO 2024048670 A1 WO2024048670 A1 WO 2024048670A1
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cells
tip
target substance
core material
cell
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PCT/JP2023/031594
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French (fr)
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臣耶 佐久間
陽子 山西
文敬 黄
笑 木村
茂夫 菅野
隼人 鈴木
Original Assignee
国立大学法人九州大学
国立研究開発法人産業技術総合研究所
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to an introduction device and a delivery method.
  • the present invention relates to an introduction device that can introduce bubbles into a liquid containing cells and a target substance, and can deliver a target substance into cells with high efficiency, and a delivery method using the same.
  • electroporation technology allows biological or artificial substances such as proteins, nucleic acids, their vectors, and sensor particles to pass through cell membranes and into cells, enabling genetic manipulation and cell sensing.
  • biological or artificial substances such as proteins, nucleic acids, their vectors, and sensor particles
  • synthetic antibodies, enzymes, cloning vectors, etc. that are artificially mass-produced by utilizing the living cell functions of substances introduced into cells have become available.
  • An injection device using a gas-liquid ejecting member comprising a bubble ejecting member including a gap formed between the tip of a solid core material and an outer shell formed outside the outer shell of the bubble ejecting member, and An injection method using this is known (see, for example, Patent Document 1).
  • a gas-liquid ejecting member that includes a bubble ejecting member and an outer shell, the outer shell and the bubble ejecting member being formed so as to be able to move relative to each other. (For example, see Patent Document 2).
  • An introduction device for introducing a polymer into the cell by perforating the surface of the cell by a physical impact including the collapse of air bubbles, the device comprising: a storage section for storing a solution containing the polymer; and the perforated cell. and a liquid feeding part for feeding the solution toward the surface of the cell and introducing the polymer into the cell, and when introducing the polymer into the cell, the solution containing the cell.
  • a storage section for storing a solution containing the polymer
  • a liquid feeding part for feeding the solution toward the surface of the cell and introducing the polymer into the cell, and when introducing the polymer into the cell, the solution containing the cell
  • the present invention was made in view of the above-mentioned circumstances, and its purpose is to be applicable to various types of cells and to deliver target substances containing large molecules to cells with high efficiency.
  • the purpose of the present invention is to provide an introduction device and a delivery method that enable this.
  • the present invention relates to an introduction device, the device including a bubble generating section, a counter electrode, and a power supply device connected to the bubble generating section and the counter electrode, respectively,
  • the generating part is composed of a core material made of a conductive material and forming an active electrode, and a tubular member made of an insulating material and extending along the core material and covering the periphery of the core material, The tip is substantially flush with the tip of the core, or the tip of the core extends beyond the tip of the tubular member; Bubbles are generated from the tip of the bubble generating section by applying a voltage to the active electrode from the power supply device while the tip and the counter electrode are in contact with a liquid containing cells and a target substance. It is composed of
  • the introduction device preferably further includes a control device that is connected to the power supply device and controls the voltage applied from the power supply device to the active electrode.
  • the present invention relates to a method for delivering a target substance to a cell, and the method includes the method of delivering a target substance to a cell by connecting the tip of the bubble generating part of the introduction device and the counter electrode to the cell and the target substance. and applying a voltage between the active electrode and the counter electrode to generate an electric field in the liquid to generate bubbles at the tip of the bubble generator.
  • the step of applying the voltage includes the step of applying a voltage pulse.
  • the delivery method preferably includes a step of adjusting the shear viscosity of the liquid containing the cells and the target substance to 10 ⁇ 2 Pa ⁇ s to 10 4 Pa ⁇ s before the contacting step.
  • the step of adjusting the viscosity includes the cells and the target substance by changing the cell concentration in the liquid containing the cells and the target substance and/or by adding a thickener.
  • the method includes a step of adjusting the viscosity of the liquid.
  • the cells include cells with cell walls, such as algae Chlamydomonas reinhardtii, stem cells (human mesenchymal stem cells), mouse fetal fibroblasts (NIH/3T3), and rat osteosarcoma cells. (UMR-106), human cervical cancer cells (HeLa).
  • algae Chlamydomonas reinhardtii stem cells (human mesenchymal stem cells), mouse fetal fibroblasts (NIH/3T3), and rat osteosarcoma cells.
  • UMR-106 human cervical cancer cells
  • HeLa human cervical cancer cells
  • the cells are floating cells and the liquid containing the cells and the target substance is a cell suspension.
  • the cells are adherent cells
  • the liquid containing the cells and the target substance is a droplet containing the adherent cells.
  • the target substance is preferably a nucleic acid, an amino acid, a protein, or a complex thereof.
  • the target substance is labeled dextran.
  • an introduction device and a delivery method that can improve the efficiency of delivering a target substance to cells.
  • This device and method can be applied to various types of cells, including cells to which target substances have traditionally been difficult to deliver, even when the target substance is a macromolecule of several thousand kilodaltons. , delivery is possible, so it is expected to be applied to bioengineering.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an introduction device in a first embodiment of the present invention.
  • FIGS. 2(a) and 2(b) are enlarged views of the distal end portion of the bubble generating portion in FIG. 1, showing a state in which the tubular member is partially cut away.
  • FIGS. 3A and 3B are conceptual diagrams illustrating the bubble generation mechanism by the bubble generation section.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an introduction device in a first embodiment of the present invention.
  • FIGS. 2(a) and 2(b) are enlarged views of the distal end portion of the bubble generating portion in FIG. 1, showing a state in which the tubular member is partially cut away.
  • FIGS. 3A and 3B are conceptual diagrams illustrating the bubble generation mechanism by the bubble generation section.
  • FIG. 4 is a micrograph showing an example of the morphological change of actin fibers of NIH/3T3 cells before and after the delivery method according to the present invention, and (a) shows a low-viscosity cell suspension (3.6 ⁇ 10 4 cells/ ⁇ L): untreated sample (Untreated) and sample exposed to electromechanical poration (12-W bubble), (b) high viscosity cell suspension (2.1 ⁇ 10 5 cells/ ⁇ L), stained images (Actin) and bright field microscopy images (Bright field) of a high viscosity sample (12-W bubble) subjected to pressure vibration due to bubble generation, and an untreated high viscosity sample (Untreated).
  • a low-viscosity cell suspension 3.6 ⁇ 10 4 cells/ ⁇ L
  • untreated sample untreated sample
  • high viscosity cell suspension 2.1 ⁇ 10 5 cells/ ⁇ L
  • stained images Actin
  • Bright field bright field microscopy images
  • FIG. 5A is an example of comparing the results of electromechanical poration when the voltage pulse output was varied from 4 to 15 W in the delivery method according to the present invention.
  • Fig. 3 is a micrograph of cells introduced by the method and cultured for 24 hours under 37°C and 5% CO2 conditions.
  • FIG. 5B is an example of comparing the results of electromechanical poration when the voltage pulse output was varied from 4 to 15 W in the delivery method according to the present invention, and shows that NIH/3T3 cells were injected with a GFP expression plasmid.
  • This is a graph showing the relationship between the output power (W) and the transfection efficiency [%] of the GFP expression plasmid after culturing for 24 hours at 37°C and 5% CO2 after introduction by the method. be.
  • FIG. 6A is a graph showing the relationship between shear velocity (1/s) and shear viscosity (Pa ⁇ s) depending on the cell concentration in the cell suspension.
  • Figure 6B shows the results of electromechanical poration when the cell concentration in the cell suspension was varied from 3.6X10 ⁇ 4 to 4.3X10 ⁇ 5 [cells/uL] in the delivery method according to the present invention.
  • FIG. 6C is an example of comparing the results of electromechanical poration when changing the cell concentration in the cell suspension in the delivery method according to the present invention. ) and the transfection efficiency (Transfection efficiency [%]) of the GFP expression plasmid.
  • the definitions of white circles, black circles, boxes, and bars in the graph are the same as in FIG. 5B.
  • Figure 7A shows the shear velocity ( 1 /s) and shear viscosity (Pa ⁇ s]).
  • Figure 7B shows that the plasmid (pEGFP-N1) and the thickener BMa-10002 were added to the sample that was not exposed to air bubbles (W/O bubble) and the delivery method according to the present invention (Bubble injection). This is an example of comparing the results of electromechanical poration by changing the type and concentration of the agent. After introducing a GFP expression plasmid into NIH/3T3 cells using this method, the cells were cultured at 37°C and 5% CO2 for 24 hours. This is a micrograph of the cells after.
  • FIG. 7C shows that the plasmid (pEGFP-N1) and the thickener BMa-10002 were added to the sample that was not exposed to air bubbles (W/O bubble) and the delivery method according to the present invention (Bubble injection). This is an example of comparing the results of electromechanical poration by changing the type and concentration of the agent. After introducing a GFP expression plasmid into NIH/3T3 cells using this method, the cells were cultured at 37°C and 5% CO2 for 24 hours.
  • FIG. 8A shows the results of comparing the delivery of a GFP expression plasmid to the rat osteosarcoma cell line UMR- 106 .
  • the fluorescence image (GFP) and bright field microscopy image (Bright field) for the suspension (2.1 ⁇ 10 5 cells/ ⁇ L) are shown, and the lower panel shows the rat osteosarcoma cell line UMR versus cell suspension concentration.
  • 2 is a graph showing the transfection efficiency [%] of GFP expression plasmid into -106.
  • Figure 8B shows the results of comparing the delivery of GFP expression plasmid to the rat osteosarcoma cell line UMR-106, the upper panel shows no thickener (w/o thickener) and 21% cellulose nanofiber (long). (v/w) (LCNF-21%), the fluorescence image (GFP) and the bright field microscope image (Bright field) are shown, and the lower panel shows the composition of the cell suspension in the rat osteosarcoma cell line UMR- 106 is a graph showing the transfection efficiency of a GFP expression plasmid into 106 cells.
  • Figure 8C shows the results of comparing the delivery of a GFP expression plasmid to human bone marrow-derived mesenchymal stem cells MSC, and the upper panel shows no thickener (w/o thickener) and cellulose nanofiber (long) 21%. (v/w) (LCNF-21%), fluorescence image (GFP) and bright field microscopy image (Bright field) are shown, and the lower panel shows human bone marrow-derived mesenchymal stem cells for the composition of cell suspension.
  • 1 is a graph showing the transfection efficiency of a GFP expression plasmid into (MSC).
  • Figure 8D shows the results of comparing the delivery of FITC-labeled dextran to Chlamydomonas; the upper panel shows the low and high concentration cell suspension (3 x 10 5 cells/ ⁇ L), and the lower panel shows the high concentration cell suspension (3 x 10 5 cells/ ⁇ L).
  • a fluorescence image (3-5K FITC-dextran) and a bright field microscope image (Bright field) are shown for 7.5 ⁇ 10 5 cells/ ⁇ L).
  • Figure 9A shows the possibility of delivering a 2000 kDa polymer compound (FITC-dextran, 2000 kDa) in a sample that was not exposed to bubbles (w/o bubble) and in the delivery method according to the present invention (Bubble injection). The results are a fluorescence image (FITC-dextran (2000 kDa)) and a bright field microscope image (Bright field).
  • Figure 9B shows the results of evaluating the delivery of a 15 kbp plasmid (pHRdSV40-NLS-dCas9-24xGCN4-NLS-P2A-BFP-dWPRE) to rat osteosarcoma cell line UMR-106 cells, 24 hours (24 h) after transfection.
  • FIG. 9C shows the results of comparing the delivery of GFP expression plasmids of different sizes using the delivery method according to the present invention, and the upper panel shows fluorescence images (GFP ), and bright field microscopy images (Bright field), and the lower panel is a graph showing transfection efficiency versus plasmid size.
  • the definitions of white circles, black circles, boxes, and bars in the graph are the same as in FIG. 5B.
  • Figure 9D shows the results of comparing the delivery of FITC-labeled dextran to Chlamydomonas, with the top panel showing no thickener (w/o thickener) and cellulose nanofibers (long) 21% (v/w) (LCNF). -21%), the fluorescence image (FITC-dextran (2000 kDa)) and the bright field microscopy image (Bright field) are shown, and the lower panel shows the transfection of FITC-labeled dextran into Chlamydomonas with respect to the composition of the cell suspension. It is a graph showing efficiency. The definitions of white circles, black circles, boxes, and bars in the graph are the same as in FIG. 5B.
  • FIG. 10A shows the results comparing the delivery of pCDH-GFP-RFP-PURO to the rat osteosarcoma cell line UMR-106 using either lipofection (Lipofectamine 3000) or electromechanical poration (Bubble injection).
  • a green fluorescence image (GFP), a bright field microscope image (Bright field), and a red fluorescence image (RFP) 24 hours after gene introduction are shown.
  • FIG. 10B shows the results of transfecting UMR-106 with pCDH-GFP-RFP-PURO, treating it with puromycin, and comparing the appearance of the cells after 48 hours of culture.
  • a bright field microscope image (Bright field) and a red fluorescence image (RFP) are shown.
  • FIG. 10C is a graph showing transfection efficiency versus time after transfection of pCDH-GFP-RFP-PURO into UMR-106 and puromycin treatment.
  • Figure 11 shows the results of comparing the delivery of pEGFP-N1 plasmid to the rat osteosarcoma cell line UMR-106 and human bone marrow-derived mesenchymal stem cell MSCs. Fluorescence images (GFP) and bright field microscopy images (Bright field) are shown when gene transfer is performed using either Lipofectamine 3000) or electromechanical poration (Bubble injection), and the right panel shows UMR-106.
  • GFP Fluorescence images
  • Bright field bright field microscopy images
  • the left panel of (b) shows fluorescence images (GFP) and bright field microscopy images (Bright field) of MSCs when gene transfer was performed using either lipofection (Lipofectamine 3000) or electromechanical poration (Bubble injection). ), and the right panel is a graph showing transfection efficiency versus transfection method for MSCs.
  • the definitions of white circles, black circles, boxes, and bars in the graph are the same as in FIG. 5B.
  • Figures 12(a) and (b) show that UMR-106 was quantified using electromechanical poration in droplets with 1 ng/ ⁇ L pEGFP-N1 plasmid and 60% thickener (v/w).
  • FIG. 12 A fluorescence image (GFP) is shown when gene introduction is performed with cells adhered to a culture substrate.
  • Figure 12 (a) is an image obtained as a result of gene transfer using the thickener AFa-1002 (Short), and (b) is an image of the gene transfer using the thickener BMa-1002 (Long). This is the resulting image.
  • Figure 13 shows the cell suspension containing a thickener (21% thickener, upper row) and the cell suspension containing no thickener (lower row) using bubble generators with different tip structures. This is a fluorescent photograph of cells 24 hours after transfection with a GFP expression plasmid, and the number at the top right of the image represents the length of extension from the tip of the tubular member to the tip of the core material.
  • FIG. 14 is a graph showing the transfection efficiency 48 hours after transfection of a GFP expression plasmid using bubble generators with different tip structures.
  • FIG. 15 is a graph showing the relative amount of artificial chromosome DNA in UMR-106 after transfection in an artificial chromosome delivery experiment.
  • the present invention relates to an introduction device.
  • the introduction device includes a bubble generating section, a counter electrode, and a power supply device connected to the bubble generating section and the counter electrode, respectively.
  • the introduction device is a device that can be used to deliver a target substance to cells and can introduce air bubbles into a liquid containing cells and a target substance. Therefore, the introduction device according to this embodiment can also be called a bubble injector.
  • the introduction device can generate an electric field in the liquid by bringing the tip of the bubble generating section into contact with the counter electrode and applying a voltage to the liquid containing cells and the target substance. bubbles can be generated at the tip of the As a result, each cell in the liquid is perforated, and the target substance is delivered to the cell.
  • the target cell is not particularly limited and may be any cell.
  • Animal cells which are examples of target cells, include stem cells isolated from tissues of human or non-human animals, skin cells, mucosal cells, hepatocytes, pancreatic islet cells, nerve cells, chondrocytes, endothelial cells, epithelial cells, and bone cells. , muscle cells, egg cells, etc. More specific examples of animal cells include mouse-derived cells, rat-derived cells, human cultured cells, and immortalized cultured cells. As mouse-derived cells, NIH/3T3 cells and the like can be used. As the rat-derived cells, UMR-106 and the like can be used.
  • mammalian-derived cultured cells and insect-derived cultured cells can be used, including MEF, HeLa, 293-T, CHO, Jurkat, MCF-7, Vero cells, YAC-1, and the like.
  • animal cells cells of living tissues such as sperm, spermatogonia, eggs or oogonia, primary culture cells, tumor cells, or cells derived from diseased tissues, which are generally known to be difficult to transform, may be used. can.
  • target cells include algal cells (e.g., petroleum-producing algae such as Chlamydomonas, Euglena, or Aurantiochytrium), which are generally known to be difficult to transform, and terrestrial cells.
  • Plants e.g., petroleum-producing algae such as Chlamydomonas, Euglena, or Aurantiochytrium
  • Plants can be used.
  • aspergillus or mushroom fungi, etc. for which there is no delivery system for the target substance in the prior art, can also be used.
  • mesophyll cells, hypocotyl cells, root cells derived from the algae and the plants, cells obtained from fungi, and the like can be used as protoplasts.
  • cells on biological tissues epidermal cells, mesophyll cells, shoot apical meristems, callus or somatic embryos on mature leaves, which are said to be particularly difficult to deliver target substances, can be used, as well as resting central cells, pollen or somatic embryos. Embryonic cells etc. can also be used.
  • cells to which it is difficult to deliver target substances include cells with cell walls such as algae cells, stem cells (human mesenchymal stem cells), mouse fetal fibroblasts (NIH/3T3), and rat osteosarcoma cells ( UMR-106), human cervical cancer cells (HeLa), and the like, but are not limited to these.
  • algae include, but are not limited to, Chlamydomonas reinhardtii.
  • the target substance is not particularly limited, regardless of whether it is a gas, solid, or liquid, as long as it can be dissolved and/or dispersed in a solution.
  • the gas include air, nitrogen, helium, carbon dioxide, carbon monoxide, argon, oxygen, and the like.
  • the liquid include DMSO and parafluorodecalin.
  • Solids include biomolecules such as nucleic acids, amino acids, and proteins, medium molecules such as polyamides and cyclosporin, synthetic or natural, labeled or unlabeled high molecular compounds such as antibodies and saccharides, and low molecular compounds such as drugs. , or any combination thereof.
  • the polymer compound includes a compound having a molecular weight of about 10,000 or more.
  • An example of a polymer includes labeled dextran, and examples of a labeling substance include fluorescent substances, enzymes, beads, etc., but the labeling substance is not limited to a specific labeling substance.
  • nucleic acids are preferably used from the viewpoint of genetic engineering, and examples of the nucleic acids include DNA molecules, RNA molecules, artificial nucleic acids, or combinations thereof, and may also be plasmid vectors or viral vectors.
  • the substance disclosed in Patent Document 3, in which a biopolymer compound is encapsulated in a porous crystal, may also be used.
  • the combination of cells and target substance can be appropriately selected by those skilled in the art to suit the purpose and use of delivery of the target substance, and is not particularly limited.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an introduction device 100 in a first embodiment of the present invention.
  • the introduction device 100 includes a bubble generator 20, a counter electrode 40, and a power supply device 50, and optionally includes a liquid containing cells and a target substance.
  • a container 30 that accommodates a container 30 and a control device 60 are provided.
  • a cell suspension in which a target substance is dispersed or dissolved and floating cells are suspended is illustrated and explained as a liquid containing cells and a target substance.
  • the form of the liquid containing the target substance and the target substance is not limited to a cell suspension. Embodiments of liquids other than cell suspension will be described later.
  • FIGS. 2(a) and 2(b) are enlarged views of the tip portion of the bubble generating section 20, and show a state in which the tubular member 22 is partially cut away to explain the structure of the tip portion.
  • the bubble generating section 20 includes a core material 21 that forms an active electrode, and a tubular member 22 that extends along the core material 21 and covers the periphery of the core material 21 .
  • the tip of the bubble generating section 20 is formed into a cylindrical shape with a substantially constant diameter in the longitudinal direction, and the outer diameter of the tubular member 22 corresponds to the diameter of the tip of the bubble generating section 20 . Note that, as shown in FIG.
  • the tip of the core material 21 and the tip of the tubular member 22 are arranged substantially on the same plane, that is, the core material
  • the position of the tip of the tubular member 21 and the tip of the tubular member 22 are formed so as to substantially match.
  • the present invention is not limited to this, and for example, as shown in FIG. 2(b) as a bubble generating section 20A, the tip of the core material 21 may be extended more than the tip of the tubular member 22 in the longitudinal direction of the bubble generating section 20. It may also be configured such that an extended portion is formed in which the tip of the core material 21 extends by a length L beyond the tip of the tubular member 22. Note that in FIG. 2(b), the length of the extended portion of the core material 21 is exaggerated for clarity.
  • the bubble generating section 20 and the bubble generating section 20A will be collectively referred to as the bubble generating section 20.
  • the shape of the tip of the bubble generating part 20 is such that the tip of the tubular member 22 is extended more than the tip of the core material 21, and a minute gap is created between the tip of the core material 21 and the tip of the tubular member 22. It is also possible to configure However, if air exists in the gap between the tip of the core material 21 and the tip of the tubular member 22, the air acts as an insulator when voltage is applied to the core material 21 to generate bubbles, as described later. It will work. In this case, in order to generate the same amount of bubbles, it is necessary to apply a higher voltage than in the case of the bubble generating section 20 having a shape without voids as shown in FIGS. 2(a) and 2(b).
  • the bubble generating section 20 that does not have a gap at its tip can have a lower applied voltage than a bubble generator 20 that has a gap at its tip.
  • a cell suspension under a predetermined high viscosity condition described below may be used. High transfection efficiency can be achieved by delivery methods using
  • the core material 21 is formed from fine wires of a conductive material, and the tubular member 22 is formed from an insulating material.
  • the conductive material forming the core material 21 is not particularly limited as long as it conducts electricity; for example, metal materials such as gold, silver, copper, aluminum, tungsten, or tin, magnesium, chromium, nickel, etc. Examples include alloys containing small amounts of zirconium, iron, silicon, etc., graphite, and diamond.
  • the insulating material forming the tubular member 22 is preferably dielectric, but is not particularly limited as long as it insulates electricity.
  • inorganic insulating materials such as glass, mica, quartz, silicon nitride, silicon oxide, ceramic, alumina, rubber materials such as silicone rubber, ethylene propylene rubber, ethylene vinyl acetate copolymer resin, silane-modified olefin resin, epoxy resin, Polyester resin, vinyl chloride resin, acrylic resin, melamine resin, phenol resin, polyurethane resin, polystyrene resin, fluorine resin, silicone resin, polysulfide resin, polyamide resin, polyimide resin, polyethylene, polypropylene, cellulose resin, Examples include insulating resins such as UV-curable resins.
  • the core material 21 is inserted into the inside of the tubular member 22, and the tip of the core material 21 and the tip of the tubular member 22 are shaped to substantially match in the longitudinal direction, or the tip of the core material 21 is the tip of the tubular member 22 in the longitudinal direction.
  • the shape is more elongated.
  • the core material 21 is made to protrude from the base end on the opposite side from the tip of the tubular member 22 to form a connection part that can be electrically connected to the power supply device 50 via an electric wire. is formed.
  • a core material 21 having a desired diameter and a tubular member 22 having an inner diameter substantially the same as the diameter of the core material 21 are prepared.
  • the core material 21 for example, a tungsten wire having a diameter of 100 ⁇ m can be used, and as the tubular member 22, for example, a long and thin tube made of fluororesin and having an inner diameter of 100 ⁇ m and an outer diameter of 300 ⁇ m can be used.
  • the core material 21 for example, a tungsten wire having a diameter of 100 ⁇ m can be used, and as the tubular member 22, for example, a long and thin tube made of fluororesin and having an inner diameter of 100 ⁇ m and an outer diameter of 300 ⁇ m can be used.
  • Insert the core material 21 into the tubular member 22 Since the fluororesin that is the tubular member 22 has low friction, the core material 21 can be inserted into the tubular member 22 while sliding.
  • the tip portion of the core material 21 may be processed to become thinner by cutting or the like before insertion. Then, the core material 21 is inserted into the tubular member 22 from the tip of the thinly processed core material 21, and the tip of the core material 21 and the tip of the tubular member 22 are aligned. In this case, unlike the embodiments shown in FIGS. 2(a) and 2(b), a slight gap may occur between the core material 21 and the tubular member 22 at the tip portion of the bubble generating section 20.
  • the diameter of the core material 21 and the inner diameter of the tubular member 22 prepared in (1) of the example of the manufacturing method described above are not limited to be the same.
  • the core material 21 having a diameter slightly larger than the inner diameter of the tubular member 22 may be used.
  • a flexible rubber material such as silicone rubber or ethylene propylene rubber
  • a metal material such as tungsten
  • the core material of the metal material is It is possible to insert the material 21.
  • a core material 21 having a diameter slightly smaller than the inner diameter of the tubular member 22 may be used.
  • the core material 21 may be held by inserting the core material 21 into the tubular member 22 and fixing the proximal end of the tubular member 22 and the core material 21 using adhesive or the like, for example. Can be done.
  • the outer periphery of the core material 21 and the inner periphery of the annular member 22 may be in close contact with each other over the entire longitudinal direction, as long as the core material 21 can be held inside the tubular member 22, or may be in close contact with each other partially. Alternatively, a slight gap may exist between the outer periphery of the core material 21 and the inner periphery of the annular member 22.
  • the diameter (outer diameter) of the core material 21 can be, for example, about 10 to about 300 ⁇ m.
  • the inner diameter of the tubular member 22 can be, for example, about 10 to about 300 ⁇ m, depending on the diameter of the core material 21.
  • the outer diameter of the tubular member 22 can be larger than the inner diameter, for example, about 100 to about 500 ⁇ m.
  • the length L of the extending portion of the core material 21 from the tip of the bubble generating section 20 in the longitudinal direction of the bubble generating section 20 can be, for example, 0 to 100 ⁇ m, and may be, for example, 0 to 50 ⁇ m.
  • the tip of the core material 21 and the tip of the tubular member 22 are aligned as shown in FIG. 2(a).
  • the dimensions of the core material 21 and the tubular member 22 are not limited to these.
  • the materials and dimensions of the core material 21 and the tubular member 22 are determined after considering the ease of manufacturing the bubble generating part 20 due to the characteristics such as the coefficient of friction and flexibility of the materials, and the influence on cells and target substances. , are appropriately selected so that the tubular member 22 is arranged to extend along the core material 21.
  • the bubble generating section 20 can optionally be supported by a support section (not shown). Furthermore, the support section can be configured to be movable and/or positionable by an operation section (not shown). The supporting part and the operating part can be configured to move the tip of the bubble generating part 20 to a desired position within the cell suspension while keeping the position of the container 30 fixed. For example, a commercially available micromanipulator can be used as the operation unit. Therefore, the distance between the tip of the bubble generating section 20 and the counter electrode 40 and the distance between the tip of the bubble generating section 20 and the side or bottom surface of the container 30 can be adjusted as desired. Alternatively, as an option, the container 30 may be configured to be movable and/or positionable by a support section and an operation section (not shown).
  • the counter electrode 40 is an electrode made of a conductive material.
  • the counter electrode 40 may be in any form as long as it can come into contact with the cell suspension housed in the container 30, so that a voltage can be applied between it and the core material 21 of the bubble generating section 20, and an electric field can be formed. Any form is acceptable.
  • the conductive material forming the counter electrode 40 can be selected from the same choices as the conductive material forming the core material 21.
  • the counter electrode 40 may be a linear electrode having a diameter comparable to that of the bubble generating section 20, but its shape and dimensions are not limited as long as it can apply a voltage and form an electric field.
  • Another example (not shown) of the embodiment of the counter electrode is a container containing a cell suspension. By forming the container from a conductive material and electrically connecting it to the power supply 50, the container can also serve as a counter electrode.
  • the container 30 is a member that can contain the cell suspension or hold and support the cell suspension in the form of droplets.
  • the illustrated container is a microtube whose inner diameter becomes narrower toward the bottom, and such a centrifuge tube or the like can be used.
  • the shape of the container 30 is not limited to this, and may be a flat dish such as a Petri dish as long as it can accommodate a liquid containing cells and a target substance or support this liquid as droplets.
  • the member that supports the cell suspension or droplets may be a support base material such as a flat glass plate or a ceramic plate, and these are referred to as droplet support base materials.
  • the container 30 is not essential as a member constituting the introduction device according to this embodiment.
  • the introduction device according to this embodiment can access a cell suspension contained, supported, or held in any member.
  • the power supply device 50 includes a power supply (not shown), a non-inductive resistor, a voltage amplification circuit, a DIO (Digital Input-Output) port, etc., and can be connected to a control device 60 made of, for example, a personal computer via the DIO port. .
  • the power supply device 50 is connected to the core material 21 and the counter electrode 40 of the bubble generator 20 via electric wires, and is configured so that the bubble generator 20 and the counter electrode 40 form a circuit.
  • a voltage from the power supply device 50 is applied between the core material 21 of the bubble generator 20 and the counter electrode 40 .
  • the power supply device 50 is configured to control output current, voltage, and frequency based on signals from the control device 60.
  • the illustrated introduction device 100 includes only one set of the bubble generating section 20 and the counter electrode 40, the bubble generating section and the counter electrode may each independently include two or more.
  • the present invention relates to a method for delivering a target substance to cells. More specifically, the method for delivering a target substance to cells includes the following steps. (a) A step of bringing the tip of the bubble generating part and the counter electrode of the introduction device according to the first embodiment into contact with a liquid containing cells and a target substance (b) The active electrode and the counter electrode applying a voltage between them, thereby generating an electric field within the liquid, and generating bubbles at the tip of the bubble generating section;
  • the delivery method according to the second embodiment relates to a method of delivering a target substance to cells.
  • cells are physically perforated by the action of air bubbles and an electric field while the cells are kept alive, allowing the target substance to pass through the pores formed in the cell membrane and enter the inside of the cells. It can be in a state of As a result, the target substance can be delivered to cells. Note that cases in which delivery of the target substance to all cells contained in the liquid is not achieved or cases in which some cells die are also included in the delivery method according to the present embodiment.
  • a liquid containing cells and a target substance is prepared.
  • the selection of cells and target substances are as described above.
  • the liquid containing the cells and the target substance can be prepared in the form of a cell suspension.
  • the solvent constituting the cell suspension is not particularly limited as long as it provides an environment in which cells can survive.
  • the solvent may be a physiological buffer.
  • Physiological buffers include 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinylethanesulfonic acid (HEPES), 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS), and N?2?aminoethanesulfonic acid (ACES).
  • the solvent may be a medium, and commercial products such as Opti-MEM (registered trademark, manufactured by Thermo Fisher Scientific) and E-MEM can be used, but are not limited thereto.
  • a cell suspension can include one or more types of suspended cells.
  • the concentration of cells in the cell suspension is not particularly limited, and those skilled in the art can appropriately determine the cell concentration depending on the purpose and use.
  • the concentration is preferably as low as about 1 ⁇ 10 4 cells/ ⁇ L.
  • One or more target substances can be dispersed or dissolved in the cell suspension.
  • the concentration of the target substance in the cell suspension varies depending on the type and condition of the target substance, but may be a concentration commonly used in general electroporation techniques.
  • the concentration can be 1 ng/ ⁇ L to 1 ⁇ g/ ⁇ L, and preferably 0.5 to 1 ⁇ g/ ⁇ L.
  • the concentration can be 1 ⁇ g/ ⁇ L to 100 ⁇ g/ ⁇ L, preferably 50 to 80 ⁇ g/ ⁇ L.
  • the viscosity of the cell suspension is preferably adjusted in order to increase the transfection efficiency of the target substance.
  • the microbubbles generated in the bubble generating section 20 are oscillated, thereby vibrating the cell suspension and exposing the cells to vibration stress. This is to make drilling easier.
  • the viscosity of the cell suspension is 10 -2 to 10 4 Pa ⁇ s when measured at a temperature of 25°C and a shear rate of 10 -3 to 10 4 [1/s] using a parallel plate rheometer. It is preferable that
  • the cell concentration can be adjusted to give the cell suspension the desired viscosity.
  • the relationship between the cell concentration and the viscosity of the cell suspension for a specific cell can be determined as appropriate through preliminary experiments or the like.
  • a thickening agent can be added to the suspension to bring the cell suspension to the desired viscosity.
  • the thickener is not particularly limited as long as it does not adversely affect cells and target substances. Any thickener commonly used for medical and food purposes can be used, such as glycerol, cellulose nanofibers, CMC nanofibers, chitin nanofibers, chitosan nanofibers, etc. is not limited.
  • the relationship between the amount of a specific thickener added and the viscosity of the cell suspension can be determined as appropriate through preliminary experiments and the like.
  • the method for preparing the cell suspension may be a common method. For example, cells cultured in a culture dish or the like are collected into a microtube or the like, and the cells are precipitated using a centrifugal device. The supernatant medium is then removed and the target substance is added to the precipitated cells, optionally a thickening agent. Thereby, a cell suspension can be prepared.
  • the liquid containing the cells and the target substance contains the cells that are adhered to a flat plate, glass substrate, etc., and the target substance and solvent that are in contact with and around the cells. It can be composed of a liquid. Target substances and solvents can be selected from similar options as described for cell suspensions. Therefore, when the cells are adherent cells, the liquid containing the cells and the target substance may be composed of the cells adhered to the inner surface (inner bottom surface or inner surface) of the container and the liquid filled in this container. good.
  • the liquid containing cells and a target substance is a droplet composed of cells adhered to a container on a flat plate or a supporting substrate, and a liquid containing a target substance and a solvent that covers the cells. It's okay.
  • the latter liquid may be referred to herein as a cell-containing droplet.
  • the viscosity of the liquid containing the target substance and solvent is regarded as the viscosity of the liquid containing the cells and the target substance, and the viscosity of this liquid is adjusted using a thickener to adjust the viscosity within the preferred viscosity range. It is preferable to adjust to The choices of thickeners that can be used may be the same as for cell suspensions.
  • the quantitative relationship between the number of cells and the liquid containing the target substance and solvent is, for example, about 10 to 100 ⁇ L of the liquid for about 2.0 ⁇ 10 5 cells of adherent cells.
  • the concentration of the plasmid can be about 1 ng/ ⁇ L to 5 ⁇ g/ ⁇ L
  • the concentration of the thickener can be about 20 to 60% (v/w).
  • the method for preparing a liquid containing the cells and a target substance involves culturing the cells on a predetermined support substrate such as a flat plate, allowing them to adhere to the substrate, and then removing the medium. A liquid containing the target substance, a solvent, and optionally a thickener is then placed onto the adherent cells. Thereby, a liquid containing cells and a target substance, such as a cell-containing droplet, can be prepared.
  • the liquid containing the cells and the target substance is the tissue containing the cells and the liquid in which the target substance is dispersed or dissolved, which is in contact with the tissue and exists around the tissue. It can be configured by In this case as well, the concentration of the liquid in which the target substance is dispersed or dissolved is regarded as the concentration of the liquid containing cells and the target substance, and the concentration of the liquid in which the target substance is dispersed or dissolved is determined by using a thickener. It is preferable to adjust the viscosity to a desired range.
  • the amount of liquid containing cells and a target substance used in the delivery method according to the present embodiment is not particularly limited, and may be any amount that can immerse the tip of the bubble generating section 20 and bring it into contact with the counter electrode 40.
  • the solution may be, for example, about 1 ⁇ L to 1 mL contained in a microtube.
  • the droplets may have a volume of, for example, 10 to 100 ⁇ L.
  • Steps (a) and (b) can be performed using the introduction device described in the first embodiment. This will be explained below with reference to FIGS. 1 and 2.
  • step (a) the tip of the bubble generator 20 and the counter electrode 40 are brought into contact with a liquid containing cells and a target substance.
  • the tip of the bubble generating section 20 is inserted at least about 500 ⁇ m from the gas-liquid interface between the liquid containing the cells and the target substance and the surrounding atmosphere. This is to give the mechanical stimulation of the vibrating bubbles to more cells.
  • the distance between the tip of the bubble generating section 20 and the bottom of the container or droplet support member is about 100 ⁇ m to 1 mm. This distance is reasonable considering the size of the vibrating bubble ( ⁇ several hundred ⁇ m).
  • the distance between the tip of the counter electrode 40 and the bottom of the container or droplet support member is about 100 ⁇ m to 1 mm. It is necessary to put the tip of the counter electrode 40 into the liquid, and this can be determined by the volume of the sample and the height of the liquid level.
  • the distance between the tip of the bubble generating section 20 and the tip of the counter electrode 40 is not particularly limited as long as an electric field is formed, but may be, for example, about 1 mm or more, and about 2 mm or more. It is preferable. This is because if the distance is extremely reduced, there is a risk of short-circuiting between the electrodes and causing a large amount of cell death. It is preferable that the bubble generator 20 and the counter electrode 40 are fixed so that they do not move relative to the solution.
  • a voltage is applied between the active electrode and the counter electrode 40 of the bubble generating section 20.
  • a direct current voltage pulse is applied.
  • Conditions such as pulse waveform, voltage, pulse width, interval between pulses, and number of pulses can be appropriately determined depending on various conditions such as the conductivity of the liquid containing cells and the target substance.
  • the pulse waveform is a rectangular wave
  • the voltage can be 100 to 1000 V
  • the pulse width can be 1 to 100 ⁇ s
  • the interval between pulses can be 1 to 1000 ⁇ s
  • the number of pulses can be 100 to 100,000 times.
  • an electric field is generated within the liquid containing the cells and the target substance.
  • an electric field of about 100 V/mm is generated.
  • the voltage application be performed at a plurality of locations by moving the position of the tip of the bubble generating section 20 inside the liquid containing the cells and the target substance. This is because in the vicinity of the bubble generating section 20, the electrical stimulation caused by the electric field and the mechanical stimulation caused by the bubbles to cells, which will be described later, are large, so that the effect is obtained in the entire liquid.
  • the counter electrode 40 may be fixed or may be moved. Alternatively, the bubble generating section 20 and the counter electrode 40 may be fixed and the container 30 may be moved.
  • FIGS. 3(a) and 3(b) the bubble generation mechanism by the bubble generation section 20 will be explained using FIGS. 3(a) and 3(b).
  • a voltage pulse is applied to the core material 21 of the bubble generating section 20, that is, the active electrode, by the power supply device 50.
  • the applied voltage pulse generates an electric field E at the tip of the bubble generating section 20, and the generated electric field E generates minute bubbles B around the tip of the bubble generating section 20.
  • the bubbles B can be generated at high speed.
  • FIGS. 3(a) and 3(b) conceptually show the behavior of cells when the concentration of the cell suspension is high and low, respectively.
  • the bubbles B generated around the tip of the bubble generator 20 repeatedly expand and contract, causing vibrations o in the cell suspension. Conveyed.
  • Cells C in suspension are subjected to relatively large shear stress, ie, mechanical stimulation, due to such pressure vibrations o. Since the cell C also receives electrical stimulation from the electric field E, it receives electrical stimulation caused by the electric field and mechanical stimulation caused by the bubbles.
  • These stimuli form pores in the cell membrane, allowing the target substance (not shown) to pass through the cell membrane and enter the interior of the cell C. It is thought that when the electrical stimulation and mechanical stimulation are large, the pores open more easily and the efficiency with which the target substance passes through the cell membrane can be increased. Due to this effect, the delivery method of the present invention may be referred to as electromechanical poration in the following examples.
  • the core-shell structure bubble generator was constructed using a tungsten wire with a diameter of 100 ⁇ m, a Teflon (registered trademark) tube with an inner diameter of 100 ⁇ m and an outer diameter of 300 ⁇ m, and an intravenous indwelling catheter ( It was made using a long and thin stainless steel tube.
  • the tungsten wire was about 5 mm longer than the Teflon tube, and after being inserted into the Teflon tube, the proximal end of the tungsten wire was inserted into the tip of an intravenous indwelling catheter to serve as an active electrode.
  • the tip structure of the bubble generating part was made to have a flat tip structure except for the specially mentioned parts.
  • the counter electrode an electrode composed only of tungsten wire was used. When a single pulse with a peak voltage of 500 V was applied to the bubble generating part and the counter electrode, microbubbles were generated and grew to the maximum size (submillimeter) within 5 ⁇ s.
  • the introduction device used in the delivery method included a bubble generator, a counter electrode, a power source (Hyfrecator 2000, ConMed Corporation, USA), two micromanipulators (QP-2RLH-PC, Micro Support Co, Ltd., Japan), and It was constructed with a personal computer (PC) as a control device.
  • the power supply used bipolar (BI) mode, and the output was adjustable in the range of 0 to 35W.
  • a signal from the PC was used to trigger the power supply via the digital I/O unit.
  • the power supply was externally triggered once, and each trigger generated 600 pulses in approximately 0.018 seconds.
  • Each power supply unit was triggered 30 times.
  • An oscilloscope was used to monitor voltage and current during the experiment.
  • the position of the tip of the bubble generator was randomly changed within 500 ⁇ m in the xy plane by a micromanipulator after each trigger signal, and the time interval between signals was 2 seconds.
  • the distance from the bottom of the container to the tip of the bubble generator was approximately 0.5 mm.
  • NIH/3T3 and UMR-106 were prepared using high glucose Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (ATCC 30) containing 10% heat-inactivated fetal bovine serum (Austral Biologicals, USA) and 1% penicillin and streptomycin (Invitrogen). -2002, Manassas, Va., USA). MSCs were grown in mesenchymal stem cell growth medium (SCR, #0025) containing 5% fetal bovine serum (SCR, #0025), 1% growth supplement (SCR, #7552), and 1% penicillin and streptomycin (SCR, #0503). SCR, #7051).
  • SCR mesenchymal stem cell growth medium
  • NIH/3T3 and UMR-106 were maintained in a humidified environment at 37° C. under 5% CO 2 and cultured until confluent. Wild-type Chlamydomonas was cultured in 100 mm dishes using Tris acetate-phosphate (TAP) solid medium containing 1% agar. Chlamydomonas was cultured under continuous illumination (82 ⁇ mol photons/m 2 s) at 22°C.
  • TAP Tris acetate-phosphate
  • pEGFP-N1 plasmid DNA (4.7kbp) (Chlontech, #6085-1), pCDH-GFP-RFP-PURO (8.3kbp), MS2-P65-HSF1 (11kbp) (Addgene, #61423), pHRdSV40-NLS -dCas9-24xGCN4-NLS-P2A-BFP-dWPRE (15 kbp) (Addgene, #60910) was prepared using the plasmid Giga prep kit (QIAGEN). Plasmid concentrations were between 3 and 10 ⁇ g/ ⁇ L.
  • cell samples (2.1 ⁇ 10 5 cells/ ⁇ L) were transfected with 3.8 ⁇ g (0.54 ⁇ g/ ⁇ L) or 0.9 ⁇ g (0.13 ⁇ g/ ⁇ L) of plasmid. 15 ⁇ g of plasmid was added to each sample based on the maximum transfection efficiency obtained in experiments with different levels of plasmid. Thirty trigger exposures to microbubbles and electric fields at 12W did not cause plasmid damage.
  • Opti-MEM was then added to adjust the total volume to 7 ⁇ L. Hydrodynamic properties were evaluated using a parallel plate rheometer Physica MCR 301 (Anton Paar, Australia) to measure dynamic viscoelastic properties of samples with high cell concentrations. The CP25-0.5 measurement plate was used because it allows measurement with a small amount of cell suspension (approximately 50 ⁇ L). A constant temperature water bath with circulating water was used to maintain the temperature at 25°C.
  • pCDH-GFP-RFP-PURO 8.3 kbp
  • puromycin InvivoGen, USA
  • samples were observed and cells were harvested using 0.25% trypsin.
  • the percentage of cells expressing the plasmid was measured using Countess II FL.
  • Actin-stained cells were imaged in confocal mode using a TCS SP8 confocal laser microscope (Leica) and a 40 ⁇ /1.2 NA oil objective (Leica). Cells were photographed from bottom to top with a step size of 0.35 ⁇ m. Gain settings and exposure times were the same for all samples. The intensity of each cell in each image was calculated, and the maximum value was taken as the intracellular actin intensity.
  • Results were obtained from 4 to 6 independent experiments. Differences were examined using one-way repeated measures ANOVA based on the results of normality tests, and Tukey's test was used as a post hoc analysis method. Results were graphed using a box chart with boxes determined at the 25th and 75th percentiles. A p value of ⁇ 0.05 was considered statistically significant. Statistical analysis was performed using OriginPro2021.
  • FIG. 4 is an image showing an example of morphological changes in actin fibers of NIH/3T3 cells before and after implementation of the delivery method according to the present invention.
  • cell concentration was used to keep the viscosity of the cell suspension low.
  • FIG. 4(c) a dense actin cortical layer was observed under the cell membrane of the cell before it was subjected to pressure vibration due to bubble generation (Untreated). After applying pressure oscillations due to bubble generation, the actin layer under the cell membrane did not change in a low-viscosity cell suspension (3.6 ⁇ 10 4 cells/ ⁇ L) (Fig. 4(a), 12-W bubble).
  • 6B and 6C show that when the cell concentration is 2.1 ⁇ 10 5 cells/ ⁇ L and a high viscosity of 4.3 ⁇ 10 5 cells/ ⁇ L, the cell concentration is 3.6 ⁇ 10 4 cells/ ⁇ L and 1.1 In contrast to the low viscosity of ⁇ 10 5 cells/ ⁇ L, it is shown that a large number of NIH/3T3 cells were transfected with plasmid pEGFP-N1. These results demonstrate the influence of cell concentration on transfection efficiency.
  • thickeners which is another method to increase the viscosity of cell suspensions. Addition was evaluated. Thickeners have the advantage that the method of the present invention can be carried out even with cell suspensions at low concentrations, which expands the possibilities of application. Therefore, we added a thickener to a low-viscosity cell suspension (3.6 x 10 4 cells/ ⁇ L) to reconstruct a high-viscosity environment, and investigated transfection in a low-concentration cell suspension. . As thickeners, cellulose nanofibers (CNF) and carboxymethyl cellulose (CMC) were evaluated.
  • CNF cellulose nanofibers
  • CMC carboxymethyl cellulose
  • CNF is derived from wood fibers, it has high biocompatibility and biodegradability.
  • CMC has become established as an inexpensive material chemically synthesized from cellulose, and has higher biocompatibility than CNF. Although CMC has a lower thickening effect than CNF, it is already used as a food additive. Therefore, the effect of nanofibers in thickeners was evaluated using two types of CNF and CMC.
  • AFo-10002 short CNF, SCNF
  • BMa-10002 long CNF, LCNF
  • CMC fibrous CMC with a cross-sectional diameter of 10 ⁇ m
  • MSCs human bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • LCNF_21 v/w% was added to make a 7 ⁇ L suspension. This was the same condition used for the NIH/3T3 sample.
  • the transfection efficiency of MSCs supplemented with CNF was approximately 21%, which was significantly higher than the transfection efficiency of the sample supplemented with Opti-MEM and plasmid alone (approximately 12%) (FIG. 8C).
  • Chlamydomonas reinhardtii Chlamydomonas is a microalgae that has been suggested as a source of future renewable biofuels, but it is known to be difficult to genetically manipulate because of its hard cell walls. Cells that did not emit green fluorescence were observed in the sample when it was left standing. FITC-labeled dextran of 3-5 kDa was delivered to only a few cells in a concentrated cell suspension of 3 ⁇ 10 5 cells/ ⁇ L.
  • injection points were similarly set at approximately 500 ⁇ m intervals on a straight line that was perpendicular to this straight line and passed through the vicinity of the diameter of the droplet.
  • the distance from the bottom of the dish to the tip of the bubble generator was approximately 0.2 mm.
  • the remaining microbubbles were visible in the shape of a cross that marked the injection point.
  • GFP fluorescence was observed in a band shape with a width of approximately 250 ⁇ m along the injection point (photo not shown). From this experiment, transfection of the plasmid into not only floating cells in the cell suspension but also adherent cells was confirmed.
  • PBS containing 1 ng/ ⁇ L of plasmid and 60% (v/w) of thickener AFa-1002 (Short), BMa-1002 (Long), BiNFi-s
  • AFa-1002 Short
  • BMa-1002 Long
  • BiNFi-s thickener
  • pEGFP-N1, 4.7 kbp GFP expression plasmid
  • Culture was performed in a 96-well plate, and the volume of medium containing the plasmid at that time was 100 ⁇ L. GFP fluorescence was observed at the injection point.
  • FIGS. 12(a) and 12(b) show observed fluorescence photographs.
  • the bubble generating part (reservior_0) has a flat tip structure
  • the bubble generating part has a structure in which the tip of the core material 21 extends 45 ⁇ m from the tip of the tubular member 22.
  • a bubble generating section (reservior_-45) having a structure in which the tip of the tubular member 22 was extended by 45 ⁇ m from the tip of the core material 21 in FIG. 2(a) was prepared.
  • the reservoir_-45 has a cylindrical gap with a bottom formed by the distal end surface of the core material 21 and the inner wall surface of the tubular member 22, and this structure is similar to that disclosed in Patent Documents 1 to 3. This corresponds to the gap at the tip of the bubble generating member.
  • a cell suspension containing 0.25 ⁇ 10 6 cells/7 ⁇ L of HeLa cells was prepared.
  • Cell suspensions were prepared by suspending HeLa cells in Opti-MEM with or without 21% (v/w) thickener. The cell concentration was 0.25 ⁇ 10 6 cells/7 ⁇ L.
  • a GFP expression plasmid (pEGFP-N1, 4.7 kbp) was introduced into these cell suspensions using three types of bubble generators, with the output of the bubble generator being 12 W.
  • FIG. 13 shows cell suspensions containing a thickener (21% thickener, upper row) and cell suspensions without a thickener (lower row) 24 hours after transfection of the GFP expression plasmid. This is a fluorescent photograph of cells.
  • FIG. 14 is a graph showing the transfection efficiency 48 hours after transfection with the GFP expression plasmid. Transfection efficiency was evaluated in the same manner as in (5) above. From Figures 13 and 14, when the viscosity conditions of the cell suspension were the same, electromechanical poration was performed using a bubble generating part with a flat tip structure and a bubble generating part with a stretched core material.
  • the transfection efficiency of the GFP expression plasmid into HeLa cells was higher than that when electromechanical poration was performed using a bubble generator with an elongated tubular member structure. It was done. Among these, particularly high transfection efficiency was achieved when electromechanical poration was performed using a bubble generator with a flat tip structure in a cell suspension containing 21% (v/w) thickener. It could be confirmed.
  • genomic DNA was extracted by alkaline lysis from UMR-106 cell samples that had been cultured for 72 hours or more.
  • 50 ⁇ L of 50 mM NaOH was added and heated at 95° C. for 10 minutes.
  • 10 ⁇ L of 1M Tris-HCl (pH 8.0) was added and stirred by vortexing.
  • 60 ⁇ L of isopropanol was added to 45 ⁇ L of the supernatant, and the mixture was stirred by vortexing.
  • the mixture was centrifuged again (12,000 rpm, 5 minutes), the supernatant was removed, and the mixture was dried for 5 minutes.
  • the dried product was dissolved in 40 ⁇ L of TE buffer and used as a genomic DNA template for quantitative PCR.
  • StepOnePlus Real-Time PCR system (Applied Biosystems) was used for quantitative PCR.
  • the relative abundance of the artificial chromosome sequence (PCT tetO) to the UMR-106 cell-specific sequence (FGF23) was calculated by the standard curve method.
  • the FGF23 partial sequence was PCR amplified using primers of SEQ ID NOs: 1 and 2, and gel-purified and pBS-STD5 (a plasmid containing the PCT tetO sequence) was prepared. Dilution series of 1, 10, 100, 1,000, 10,000, 100,000, 1,000,000, and 10,000,000 times were prepared, respectively, and used as templates for preparing a calibration curve.
  • a reaction solution was prepared by mixing 5 ⁇ L of Power SYBR Green Master Mix (2x, Thermo Fisher Scientific), 4 ⁇ L of DNA template, and 1 ⁇ L of forward/reverse primer mix (5 ⁇ M each) of SEQ ID NO: 3 and 4 or SEQ ID NO: 5 and 6.
  • the sequences and sequence numbers of the primers are shown in Table 1.
  • the cycle conditions for quantitative PCR were a hold step of 2 minutes at 50°C and 2 minutes at 95°C, followed by an amplification step of 3 seconds at 95°C and 30 seconds at 60°C, repeated 40 times. Subsequent melt curve analysis was carried out at 95°C for 15 seconds, followed by cooling to 60°C with a gradient. Data analysis was performed according to the StepOnePlus manual, and the relative amount of DNA contained in each sample was calculated from the Ct value. The abundance of PCT tetO sequence was normalized by the abundance of FGF23 sequence. The ratio to the Control (with artificial chromosome, no electromechanical poration) sample was calculated and used as the final value.
  • Figure 15 shows the results of qPCR.
  • the amount of artificial chromosomes retained was increased compared to Untreated and Control. This confirmed the delivery of artificial chromosomes with large molecular weight to cells by the delivery method according to the present invention.
  • Introducing a huge 48 kbp nucleic acid into animal cell lines has been difficult using many conventional gene transfer techniques.
  • This example demonstrated the high performance of the delivery method by electromechanical poration using the introduction device according to the present invention.

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Abstract

さまざまな種類の細胞に適用でき、大きな分子を含む標的物質であっても高い効率で細胞にデリバリーすることが可能な導入装置及びデリバリー方法を提供する。気泡発生部２０と、対向電極４０と、前記気泡発生部と前記対向電極にそれぞれ接続された電力供給装置５０とを備え、前記気泡発生部５０は、導電材料からなり、アクティブ電極を形成する芯材２１と、絶縁材料からなり、前記芯材に沿って延在し前記芯材の周囲を覆う管状部材２２とから構成され、前記管状部材２２の先端は前記芯材２１の先端と実質的に同一面上にあるか、または前記芯材２１の先端よりも延伸するように構成され、前記気泡発生部２０は、前記気泡発生部２０の先端と前記対向電極４０が、細胞と標的物質とを含む液体に接触した状態で、前記電力供給装置から前記アクティブ電極に電圧が印加されることにより、前記気泡発生部２０の先端から気泡を生成するように構成されている、導入装置、並びに当該導入装置を用いた標的物質の細胞へのデリバリー方法。

Description

導入装置及びデリバリー方法
　本発明は、導入装置及びデリバリー方法に関する。特には、細胞と標的物質を含む液体に気泡を導入することができ、標的物質を高い効率で細胞内にデリバリー可能な導入装置、及びこれを用いたデリバリー方法に関する。
　細胞内に物質をデリバリーする方法として種々の方法が知られている。中でも、エレクトロポレーション技術は、タンパク質、核酸、そのベクター、センサー粒子等の生物学的もしくは人工的な物質を、細胞膜を通過させて細胞内に送り込み、遺伝子操作や細胞のセンシングを可能にするため、さまざまな分野で広く採用されている。また、細胞内に導入された物質の生細胞機能を利用して、人工的に大量生産された合成抗体、酵素、クローンベクター等が利用できるようになってきている。
　導電材料で形成された中実な芯材と、中実な芯材を覆い、かつ前記中実な芯材の先端から延伸した部分を含む外郭部と、前記外郭部の延伸した部分及び前記中実な芯材の先端との間に形成された空隙を含む気泡噴出部材と、当該気泡噴出部材の外郭部の外側に形成した外側外郭部とを備える気液噴出部材を用いたインジェクション装置、並びにこれを用いたインジェクション方法が知られている（例えば、特許文献１を参照）。
　気泡噴出部材及び外側外郭部を含む気液噴出部材であって、前記外側外郭部と前記気泡噴出部材とが、相対移動が可能となるように形成されている気液噴出部材が知られている（例えば、特許文献２を参照）。
　気泡の圧潰を含む物理的衝撃により細胞の表面を穿孔させて、高分子を前記細胞内に導入する導入装置であって、前記高分子を含む溶液を貯留する貯留部と、前記穿孔した前記細胞の表面に向けて前記溶液を送液し、前記高分子を前記細胞内に導入するための送液部とを有し、前記高分子を前記細胞内に導入する際は、前記細胞を含む溶液を収納した容器内の底部に対して行う、導入装置が知られている（例えば、特許文献３を参照）。
国際公開ＷＯ２０１３／１２９６５７号 国際公開ＷＯ２０１６／０７２４０８号 国際公開ＷＯ２０２１／０５４４０７号
　エレクトロポレーション技術においては、細胞膜の特性に由来した孔サイズのばらつきに起因すると考えられる導入効率のばらつきが問題となっている。さらに、エレクトロポレーションによる膜孔の形成は最大で１００ｎｍ程度と言われている。そのため、高次構造を持つスーパーコイルプラスミドＤＮＡ等の数１０ｎｍ～２００ｎｍの排除体積が大ききい分子の細胞へのデリバリーは困難であった。より大きな膜孔を形成するために、より高い電圧を印可することが常用手法になり、細胞のバイアビリティの低下が問題となっている。
　近年、大量のゲノム情報に基づいて複雑なタンパク質を複製することができる大きな分子が注目されている。例えば、遺伝子編集の最も強力なツールの一つであるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムと組み合わせることで、細胞内のゲノムの任意の標的領域を操作することができる分子が知られており、その構成要素は一般的にＣａｓエンドヌクレアーゼによる大きな染色体外発現ベクター（１０ｋｂｐ以上）をコードしている。このように、大きな分子を用いたトランスフェクションは、遺伝子操作を加速し、生物学的発見とその応用につながる。
　本発明は、上記のような実状に鑑みてなされたものであって、その目的は、さまざまな種類の細胞に適用でき、大きな分子を含む標的物質であっても高い効率で細胞にデリバリーすることが可能な導入装置及びデリバリー方法を提供することにある。
　本発明は、一実施形態によれば、導入装置に関し、当該装置は、気泡発生部と、対向電極と、前記気泡発生部と前記対向電極にそれぞれ接続された電力供給装置とを備え、前記気泡発生部は、導電材料からなり、アクティブ電極を形成する芯材と、絶縁材料からなり、前記芯材に沿って延在し前記芯材の周囲を覆う管状部材とから構成され、前記管状部材の先端は前記芯材の先端と実質的に同一面上にあるか、または前記芯材の先端が前記管状部材の先端よりも延伸するように構成され、前記気泡発生部は、前記気泡発生部の先端と前記対向電極が、細胞と標的物質とを含む液体に接触した状態で、前記電力供給装置から前記アクティブ電極に電圧が印加されることにより、前記気泡発生部の先端から気泡を生成するように構成されている。
　前記導入装置において、前記電力供給装置に接続され、前記電力供給装置から前記アクティブ電極に印加される電圧を制御する制御装置をさらに備えることが好ましい。
　本発明は別の実施形態によれば、標的物質の細胞へのデリバリー方法に関し、当該方法は、前述の導入装置の、前記気泡発生部の先端と、前記対向電極とを、細胞と標的物質とを含む液体に接触させる工程と、前記アクティブ電極と前記対向電極間に電圧を印加し、これにより前記液体内に電界を生成し、前記気泡発生部の先端において気泡を生成する工程とを含む。
　前記デリバリー方法において、前記電圧を印加する工程が、電圧パルスを印加する工程を含むことが好ましい。
　前記デリバリー方法において、前記接触させる工程の前に、前記細胞と標的物質を含む液体のせん断粘度を、１０－２Ｐａ・ｓ～１０４Ｐａ・ｓに調整する工程を含むことが好ましい。
　前記デリバリー方法において、前記粘度を調整する工程が、前記細胞と標的物質を含む液体中の細胞濃度を変化させることにより、及び／または増粘剤を添加することにより、前記細胞と標的物質を含む液体の粘度を調整する工程を含むことが好ましい。
　前記デリバリー方法において、前記細胞が、細胞壁を持つ細胞、例えば藻類のクラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ　ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、幹細胞（ヒト間葉幹細胞Ｈｕｍａｎ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ）、マウス胎児線維芽細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３）、ラット骨肉腫細胞（ＵＭＲ－１０６）、ヒト子宮頚部癌細胞（ＨｅＬａ）から選択されることが好ましい。
　前記デリバリー方法において、前記細胞が浮遊細胞であり、前記細胞と標的物質を含む液体が細胞懸濁液であることが好ましい。
　前記デリバリー方法において、前記細胞が接着細胞であり、前記細胞と標的物質を含む液体が、接着細胞を含有する液滴であることが好ましい。
　前記デリバリー方法において、前記標的物質が、核酸、アミノ酸、タンパク質、またはこれらの複合体であることが好ましい。
　前記デリバリー方法において、前記標的物質が、標識されたデキストランであることが好ましい。
　本発明によれば、細胞への標的物質のデリバリーの効率を向上させることが可能な導入装置及びデリバリー方法を実現することができる。この装置及び方法は、従来、標的物質のデリバリーが困難であるとされてきた細胞を含め、さまざまな種類の細胞に適用でき、数千キロダルトンの巨大分子を標的物質とする場合であっても、デリバリーが可能となるため、バイオエンジニアリングへの応用が期待される。
図１は、本発明の第１実施形態における導入装置を示す概略図である。 図２（ａ）、（ｂ）は、図１の気泡発生部の先端部分の拡大図であり、管状部材を部分的に切り欠いた状態を示す。 図３（ａ）、（ｂ）は、気泡発生部による気泡発生メカニズムについて説明する概念図である。 図４は、本発明に係るデリバリー方法の前後でのＮＩＨ／３Ｔ３細胞のアクチン繊維の形態変化の一例を示す顕微鏡写真であり、（ａ）は低粘度の細胞懸濁液（３．６×１０４ｃｅｌｌｓ／μＬ）：未処理の試料（Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ）とエレクトロメカニカルポレーションにさらされた試料（１２－Ｗ　ｂｕｂｂｌｅ）、（ｂ）は高粘度の細胞懸濁液（２．１×１０５ｃｅｌｌｓ／μＬ）に対し、気泡発生による圧力振動を与えた高粘度の試料（１２－Ｗ　ｂｕｂｂｌｅ）、未処理の高粘度の試料（Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ）の染色イメージ（Ａｃｔｉｎ）及び明視野顕微鏡イメージ（Ｂｒｉｇｈｔ　ｆｉｅｌｄ）である。（ｃ）は３７℃、５％　ＣＯ２条件下で２４時間培養後の細胞の顕微鏡写真（Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ：未処理の試料、１２－Ｗ　ｂｕｂｂｌｅ：エレクトロメカニカルポレーションにさらされた試料、両方とも高濃度の試料）である。左パネルはアクチンタンパク質染色イメージ（Ａｃｔｉｎ）、中央パネルは明視野イメージ（Ｂｒｉｇｈｔ　ｆｉｅｌｄ）、右パネルは緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）イメージである。 図５Ａは、本発明に係るデリバリー方法において、電圧パルスの出力を４～１５Ｗに変化させた時の、エレクトロメカニカルポレーションの結果を比較した一例であり、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞にＧＦＰ発現プラスミドを本法により導入後、３７℃、５％　ＣＯ２条件下で２４時間培養後の細胞の顕微鏡写真である。上段は蛍光イメージ（ＧＦＰ）、中段は明視野顕微鏡イメージ（Ｂｒｉｇｈｔ　ｆｉｅｌｄ）、下段はこれらを重ね合わせたイメージ（Ｍｅｒｇｅ）である。左端は対照実験で、プラスミドを含まない培地Opti-MEMのみを用いたものである。 図５Ｂは、本発明に係るデリバリー方法において、電圧パルスの出力を４～１５Ｗに変化させた時の、エレクトロメカニカルポレーションの結果を比較した一例であり、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞にＧＦＰ発現プラスミドを本法により導入後、３７℃、５％　ＣＯ２条件下で２４時間培養後の出力（Ｏｕｔｐｕｔ　ｐｏｗｅｒ　（Ｗ））とＧＦＰ発現プラスミドのトランスフェクション効率（Ｔｒａｎｓｆｅｃｉｏｎ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ［％］）との関係を示すグラフである。図中、黒丸は測定して得られたデータを表し、白丸はデータの平均値を表す。ボックスは、全体の２５％～７５％までのデータを表す。したがって、ボックス下底は小さい方から２５％に相当するデータ、ボックス中の横線は中央値、ボックス上底は小さい方から７５％に相当するデータを表す。また、上部バーはデータの最大値、下部バーはデータの最小値を表す。 図５Ｃは、本発明に係るデリバリー方法において、電圧パルスの出力を４～１５Ｗに変化させた時の、エレクトロメカニカルポレーションを比較した結果であり、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞にＧＦＰ発現プラスミドを本法により導入後、３７℃、５％　ＣＯ２条件下で２４時間培養後の出力（Ｏｕｔｐｕｔ　ｐｏｗｅｒ　（Ｗ））と１回のトリガーで形質転換された細胞数（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ｐｅｒ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　［ｃｅｌｌｓ／ｔｒｉｇｇｅｒ］）を示すグラフである。グラフ中の白丸、黒丸、ボックス、及びバーの定義は、図５Ｂと同一である。 図６Ａは、細胞懸濁液中の細胞濃度による、せん断速度（Ｓｈｅａｒ　ｖｅｌｏｃｉｔｙ［１／ｓ］）と、せん断粘度（Ｓｈｅａｒ　ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ　［Ｐａ・ｓ］）との関係を示すグラフである。 図６Ｂは、本発明に係るデリバリー方法において、細胞懸濁液中の細胞濃度を３．６Ｘ１０＾４～４．３Ｘ１０＾５　［ｃｅｌｌｓ／ｕＬ］に変化させた時の、エレクトロメカニカルポレーションの結果を比較した一例であり、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞にＧＦＰ発現プラスミドを本法により導入後、３７℃、５％　ＣＯ２条件下で２４時間培養後の細胞の顕微鏡写真である。上段は蛍光イメージ（ＧＦＰ）、中段は明視野顕微鏡イメージ（Ｂｒｉｇｈｔ　ｆｉｅｌｄ）、下段はこれらを重ね合わせたイメージ（Ｍｅｒｇｅ）を示す。 図６Ｃは、本発明に係るデリバリー方法において、細胞懸濁液中の細胞濃度を変化させた時の、エレクトロメカニカルポレーションの結果を比較した一例であり、細胞濃度（Ｃｅｌｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　［ｃｅｌｌｓ／ｕＬ］）と、ＧＦＰ発現プラスミドのトランスフェクション効率（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ［％］）との関係を示すグラフである。グラフ中の白丸、黒丸、ボックス、及びバーの定義は、図５Ｂと同一である。 図７Ａは、低粘度の細胞懸濁液（３．６×１０４ｃｅｌｌｓ／μＬ）中の増粘剤濃度による、せん断速度（Ｓｈｅａｒ　ｖｅｌｏｃｉｔｙ［１／ｓ］）と、せん断粘度（Ｓｈｅａｒ　ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ　［Ｐａ・ｓ］）との関係を示すグラフである。 図７Ｂは、プラスミド（ｐＥＧＦＰ－Ｎ１）と増粘剤ＢＭａ－１０００２の添加があり、気泡にさらされなかったサンプル（Ｗ／Ｏ　ｂｕｂｂｌｅ）及び本発明に係るデリバリー方法（Ｂｕｂｂｌｅ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）において、増粘剤の種類と濃度を変化させ、エレクトロメカニカルポレーションの結果を比較した一例であり、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞にＧＦＰ発現プラスミドを本法により導入後、３７℃、５％　ＣＯ２条件下で２４時間培養後の細胞の顕微鏡写真である。上段は蛍光イメージ（ＧＦＰ）、下段は明視野顕微鏡イメージ（Ｂｒｉｇｈｔ　ｆｉｅｌｄ）である。 図７Ｃは、プラスミド（ｐＥＧＦＰ－Ｎ１）と増粘剤ＢＭａ－１０００２の添加があり、気泡にさらされなかったサンプル（Ｗ／Ｏ　ｂｕｂｂｌｅ）及び本発明に係るデリバリー方法（Ｂｕｂｂｌｅ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）において、増粘剤の種類と濃度を変化させ、エレクトロメカニカルポレーションの結果を比較した一例であり、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞にＧＦＰ発現プラスミドを本法により導入後、３７℃、５％　ＣＯ２条件下で２４時間培養後の、増粘剤の種類と濃度に対する、ＧＦＰ発現プラスミドのトランスフェクション効率（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ［％］）を示すグラフである。グラフ中の白丸、黒丸、ボックス、及びバーの定義は、図５Ｂと同一である。 図８Ａは、ラット骨肉腫細胞株ＵＭＲ－１０６へのＧＦＰ発現プラスミドのデリバリーを比較した結果であり、上パネルは低濃度細胞懸濁液（３．６×１０４細胞／μＬ）及び高濃度細胞懸濁液（２．１×１０５ｃｅｌｌｓ／μＬ）についての蛍光イメージ（ＧＦＰ）、及び明視野顕微鏡イメージ（Ｂｒｉｇｈｔ　ｆｉｅｌｄ）を示し、下パネルは細胞懸濁液濃度に対する、ラット骨肉腫細胞株ＵＭＲ－１０６へのＧＦＰ発現プラスミドのトランスフェクション効率（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ［％］）を示すグラフである。グラフ中の白丸、黒丸、ボックス、及びバーの定義は、図５Ｂと同一である。 図８Ｂは、ラット骨肉腫細胞株ＵＭＲ－１０６へのＧＦＰ発現プラスミドのデリバリーを比較した結果であり、上パネルは増粘剤の添加無し（ｗ／ｏ　ｔｈｉｃｋｅｎｅｒ）及びセルロースナノファイバー（長）２１％（ｖ／ｗ）（ＬＣＮＦ－２１％）についての、蛍光イメージ（ＧＦＰ）、及び明視野顕微鏡イメージ（Ｂｒｉｇｈｔ　ｆｉｅｌｄ）を示し、下パネルは細胞懸濁液の組成に対する、ラット骨肉腫細胞株ＵＭＲ－１０６へのＧＦＰ発現プラスミドのトランスフェクション効率を示すグラフである。グラフ中の白丸、黒丸、ボックス、及びバーの定義は、図５Ｂと同一である。 図８Ｃは、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞ＭＳＣへのＧＦＰ発現プラスミドのデリバリーを比較した結果であり、上パネルは増粘剤の添加無し（ｗ／ｏ　ｔｈｉｃｋｅｎｅｒ）及びセルロースナノファイバー（長）２１％（ｖ／ｗ）（ＬＣＮＦ－２１％）についての、蛍光イメージ（ＧＦＰ）、及び明視野顕微鏡イメージ（Ｂｒｉｇｈｔ　ｆｉｅｌｄ）を示し、下パネルは細胞懸濁液の組成に対する、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）へのＧＦＰ発現プラスミドのトランスフェクション効率を示すグラフである。グラフ中の白丸、黒丸、ボックス、及びバーの定義は、図５Ｂと同一である。 図８Ｄは、クラミドモナスへのＦＩＴＣ標識デキストランのデリバリーを比較した結果であり、上パネルは低高濃度細胞懸濁液（３×１０５ｃｅｌｌｓ／μＬ）について、下パネルは高濃度細胞懸濁液（７．５×１０５ｃｅｌｌｓ／μＬ）について、蛍光イメージ（３－５Ｋ　ＦＩＴＣ－ｄｅｘｔｒａｎ）、及び明視野顕微鏡イメージ（Ｂｒｉｇｈｔ　ｆｉｅｌｄ）を示す。 図９Ａは、気泡にさらされなかったサンプル（ｗ／ｏ　ｂｕｂｂｌｅ）及び本発明に係るデリバリー方法（Ｂｕｂｂｌｅ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）において、２０００ｋＤａの高分子化合物（ＦＩＴＣ－ｄｅｘｔｒａｎ，２０００ｋＤａ）のデリバリーの可能性を評価した結果であり、蛍光イメージ（ＦＩＴＣ－ｄｅｘｔｒａｎ（２０００ｋＤａ））、及び明視野顕微鏡イメージ（Ｂｒｉｇｈｔ　ｆｉｅｌｄ）を示す。 図９Ｂは、１５ｋｂｐプラスミド（ｐＨＲｄＳＶ４０－ＮＬＳ－ｄＣａｓ９－２４ｘＧＣＮ４－ＮＬＳ－Ｐ２Ａ－ＢＦＰ－ｄＷＰＲＥ）のラット骨肉腫細胞株ＵＭＲ－１０６細胞へのデリバリーを評価した結果であり、トランスフェクション後２４時間（２４ｈ）及び４８時間（４８ｈ）における、蛍光イメージ（ＢＦＰ）、明視野顕微鏡イメージ（Ｂｒｉｇｈｔ　ｆｉｅｌｄ）、及びこれらを重ね合わせたイメージ（Ｍｅｒｇｅ）を示す。 図９Ｃは、本発明に係るデリバリー方法による、サイズの異なるＧＦＰ発現プラスミドのデリバリーを比較した結果であり、上パネルは、４．７ｋｂｐ、８．３ｋｂｐ、及び１１ｋｂｐのプラスミドについての、蛍光イメージ（ＧＦＰ）、及び明視野顕微鏡イメージ（Ｂｒｉｇｈｔ　ｆｉｅｌｄ）を示し、下パネルはプラスミドのサイズに対するトランスフェクション効率を示すグラフである。グラフ中の白丸、黒丸、ボックス、及びバーの定義は、図５Ｂと同一である。 図９Ｄは、クラミドモナスへのＦＩＴＣ標識デキストランのデリバリーを比較した結果であり、上パネルは増粘剤の添加無し（ｗ／ｏ　ｔｈｉｃｋｅｎｅｒ）及びセルロースナノファイバー（長）２１％（ｖ／ｗ）（ＬＣＮＦ－２１％）についての、蛍光イメージ（ＦＩＴＣ－ｄｅｘｔｒａｎ（２０００ｋＤａ））、及び明視野顕微鏡イメージ（Ｂｒｉｇｈｔ　ｆｉｅｌｄ）を示し、下パネルは細胞懸濁液の組成に対する、クラミドモナスへのＦＩＴＣ標識デキストランのトランスフェクション効率を示すグラフである。グラフ中の白丸、黒丸、ボックス、及びバーの定義は、図５Ｂと同一である。 図１０Ａは、ラット骨肉腫細胞株ＵＭＲ－１０６へのｐＣＤＨ－ＧＦＰ－ＲＦＰ－ＰＵＲＯのデリバリーを比較した結果であり、リポフェクション（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３０００）またはエレクトロメカニカルポレーション（Ｂｕｂｂｌｅ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）のいずれかを用いて遺伝子導入を行った後の、２４時間後の緑色蛍光イメージ（ＧＦＰ）、明視野顕微鏡イメージ（Ｂｒｉｇｈｔ　ｆｉｅｌｄ）、及び赤色蛍光イメージ（ＲＦＰ）を示す。 図１０Ｂは、ＵＭＲ－１０６へのｐＣＤＨ－ＧＦＰ－ＲＦＰ－ＰＵＲＯのトランスフェクション後、ピューロマイシン処理を行って、４８時間培養後の細胞の様子を比較した結果であり、緑色蛍光イメージ（ＧＦＰ）、明視野顕微鏡イメージ（Ｂｒｉｇｈｔ　ｆｉｅｌｄ）、及び赤色蛍光イメージ（ＲＦＰ）を示す。 図１０Ｃは、ＵＭＲ－１０６へのｐＣＤＨ－ＧＦＰ－ＲＦＰ－ＰＵＲＯのトランスフェクション後、及びピューロマイシン処理後の経過時間に対するトランスフェクション効率を示すグラフである。 図１１は、ラット骨肉腫細胞株ＵＭＲ－１０６及びヒト骨髄由来間葉系幹細胞ＭＳＣへのｐＥＧＦＰ－Ｎ１プラスミドのデリバリーを比較した結果であり、（ａ）の左パネルはＵＭＲ－１０６について、リポフェクション（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３０００）またはエレクトロメカニカルポレーション（Ｂｕｂｂｌｅ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）のいずれかを用いて遺伝子導入を行った場合の蛍光イメージ（ＧＦＰ）、及び明視野顕微鏡イメージ（Ｂｒｉｇｈｔ　ｆｉｅｌｄ）を示し、右パネルはＵＭＲ－１０６について、トランスフェクション方法に対するトランスフェクション効率を示すグラフである。（ｂ）の左パネルはＭＳＣについて、リポフェクション（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３０００）またはエレクトロメカニカルポレーション（Ｂｕｂｂｌｅ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）のいずれかを用いて遺伝子導入を行った場合の蛍光イメージ（ＧＦＰ）、明視野顕微鏡イメージ（Ｂｒｉｇｈｔ　ｆｉｅｌｄ）を示し、右パネルはＭＳＣについて、トランスフェクション方法に対するトランスフェクション効率を示すグラフである。グラフ中の白丸、黒丸、ボックス、及びバーの定義は、図５Ｂと同一である。 図１２（ａ）、（ｂ）は、１ｎｇ／μＬのｐＥＧＦＰ－Ｎ１プラスミド、６０％の増粘剤（ｖ／ｗ）を添加した液滴中で、エレクトロメカニカルポレーションを用いて、ＵＭＲ－１０６細胞を培養基材に接着させた状態で遺伝子導入を行った場合の蛍光イメージ（ＧＦＰ）を示す。図１２（ａ）が、増粘剤ＡＦａ－１００２（Ｓｈｏｒｔ）を用いた遺伝子導入の結果、得られたイメージであり、（ｂ）が増粘剤ＢＭａ－１００２（Ｌｏｎｇ）を用いた遺伝子導入の結果、得られたイメージである。 図１３は、増粘剤を含む細胞懸濁液（２１％　ｔｈｉｃｋｅｎｅｒ、上段）、及び増粘剤を含まない細胞懸濁液（Ｎｏ　ｔｈｉｃｋｅｎｅｒ、下段）における、先端構造の異なる気泡発生部を用いたＧＦＰ発現プラスミドのトランスフェクション２４時間後の細胞の蛍光写真であり、イメージ右上の数値は、管状部材の先端からの芯材の先端までの延伸長さを表す。 図１４は、先端構造の異なる気泡発生部を用いたＧＦＰ発現プラスミドのトランスフェクション４８時間後のトランスフェクション効率を示すグラフである。 図１５は、人工染色体デリバリー実験における、トランスフェクション後のＵＭＲ－１０６中における、人工染色体のＤＮＡ相対量を示すグラフである。
　本発明は、第１実施形態によれば、導入装置に関する。本実施形態による導入装置は、気泡発生部と、対向電極と、前記気泡発生部と前記対向電極にそれぞれ接続された電力供給装置とを備える。
　本実施形態による導入装置とは、細胞に、標的物質をデリバリーするために用いることができる、細胞と標的物質を含む液体に気泡を導入可能な装置である。したがって、本実施形態による導入装置は、バブルインジェクターということもできる。特には、導入装置は、細胞と標的物質を含む液体に気泡発生部の先端と、対向電極とを接触させ、電圧を印加することで、液体中に電界を生成することができ、気泡発生部の先端において気泡を生成することができる。これにより、液体中の各細胞を穿孔し、標的物質が細胞にデリバリーされることとなる。標的細胞は、特に限定されず、任意の細胞であってよい。
　標的細胞の一例である動物細胞としては、ヒトまたは非ヒト動物の組織から単離した幹細胞、皮膚細胞、粘膜細胞、肝細胞、膵島細胞、神経細胞、軟骨細胞、内皮細胞、上皮細胞、骨細胞、筋細胞、卵細胞等が挙げられる。動物細胞のより具体的な例としては、例えばマウス由来細胞、ラット由来細胞、ヒト培養細胞等を用いることができ、不死化培養細胞を用いることができる。マウス由来細胞としては、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞等を用いることができる。ラット由来細胞としては、ＵＭＲ－１０６等を用いることができる。その他、哺乳類由来培養細胞、昆虫由来培養細胞を用いることができ、ＭＥＦ、ＨｅＬａ、２９３－Ｔ、ＣＨＯ、Ｊｕｒｋａｔ、ＭＣＦ－７、Ｖｅｒｏ　ｃｅｌｌｓ、ＹＡＣ－１等が考えられる。動物細胞は、一般的に形質転換が難しいことが知られている、精子、精原細胞、卵子もしくは卵原細胞、初代培養細胞、腫瘍細胞または疾患組織由来細胞等生体組織の細胞を用いることもできる。
　標的細胞の別の例である植物細胞としては、一般的に形質転換が難しいことが知られている、藻類細胞（例えば、クラミドモナス、ユーグレナ、またはオーランチオキトリウム等石油生産性藻類）、及び陸上植物（コムギ、オオムギ、オートムギ、ダイズもしくはトウモロコシといった穀類、トマト、ナス、カボチャ、ホウレンソウ、キヌアもしくはハクサイ等の果菜もしくは蔬菜、ワタ、アマ、スイッチグラス、ヒマワリ、カラマツ、パラゴムノキ、ウルシ、オウレンもしくはチョウセンニンジンといった薬用植物もしくは産業作物、または、ブドウ、モモ、バナナ、キウイフルーツ、カンキツ、カキといった果樹等）を用いることができる。また、標的物質のデリバリー系が先行技術では存在しない、麹菌またはキノコ菌類等も用いることができる。加えて、プロトプラストとして、前記藻類及び前記植物由来の葉肉細胞・胚軸細胞・根細胞、及び菌類から取得した細胞等を用いることができる。生物組織上の細胞として、特に標的物質のデリバリーが難しいとされる、成熟した葉上の表皮細胞、葉肉細胞、茎頂分裂組織、カルスまたは不定胚を用いることができ、静止中心細胞、花粉または胚細胞等も用いることができる。
　本発明に係る導入装置及びこれを用いるデリバリー方法によれば、従来、標的物質のデリバリーが困難な細胞として知られている細胞へのトランスフェクション効率が飛躍的に向上するといった利点が得られる。標的物質のデリバリーが困難な細胞は、例えば、藻類細胞等の細胞壁がある細胞、幹細胞（ヒト間葉幹細胞Ｈｕｍａｎ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ）、またはマウス胎児線維芽細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３）、ラット骨肉腫細胞（ＵＭＲ－１０６）、ヒト子宮頚部癌細胞（ＨｅＬａ）等が挙げられるが、これらには限定されない。藻類の例としては、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ　ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）が挙げられるが、これには限定されない。
　標的物質は、気体、固体、液体を問わず、溶液に溶解及び／または分散できる物質であれば特に限定されない。気体としては空気、窒素、ヘリウム、二酸化炭素、一酸化炭素、アルゴン、酸素等が挙げられる。液体としては、ＤＭＳＯ、パラフルオロデカリン等が挙げられる。固体としては、核酸、アミノ酸、タンパク質等の生体分子、ポリアミド、シクロスポリンのような中分子、抗体や糖類等の合成または天然の、標識されたまたは非標識の高分子化合物、薬剤等の低分子化合物、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。高分子化合物には、分子量が約１００００以上の化合物を含む。高分子の一例としては、例えば、標識されたデキストランが挙げられ、標識物質としては、蛍光物質、酵素、ビーズ等が挙げられるが、特定の標識物質には限定されない。中でも、核酸は、遺伝子工学的観点から好ましく用いられ、核酸としては、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、人工核酸、あるいはこれらの組み合わせが挙げられ、プラスミドベクターやウイルスベクターであってもよい。特許文献３に開示された、多孔性結晶に生体高分子化合物が封入された物質であってもよい。
　細胞と、標的物質の組み合わせは、標的物質のデリバリーの目的及び用途に適合するように当業者が適宜選択することができ、特に限定されるものではない。
　以下、本発明の第１実施形態による導入装置について、図面を参照して詳細に説明する。図１は、本発明の第１実施形態における導入装置１００を示す概略図である。図１に示すように、第１実施形態による導入装置１００は、気泡発生部２０と、対向電極４０と、電力供給装置５０とを備え、任意選択的な構成として、細胞と標的物質を含む液体を収容する容器３０と、制御装置６０とを備える。以下の、図１～３では、細胞と標的物質を含む液体として、標的物質が分散もしくは溶解され、かつ浮遊細胞が懸濁された細胞懸濁液を図示して説明するが、本発明において細胞と標的物質を含む液体の態様は、細胞懸濁液には限定されない。細胞懸濁液以外の液体の態様については、後述する。
　図２（ａ）、（ｂ）は、気泡発生部２０の先端部分の拡大図であり、先端部分の構造を説明するために管状部材２２を部分的に切り欠いた状態を示している。気泡発生部２０は、アクティブ電極を形成する芯材２１と、芯材２１に沿って延在し芯材２１の周囲を覆う管状部材２２とを有する。気泡発生部２０の先端部分は、長手方向において直径が略一定の円柱形状に形成されており、管状部材２２の外径が、気泡発生部２０の先端部分の直径に相当する。なお、図２（ａ）に示すように、芯材２１の先端と管状部材２２の先端は、実質的に同一面上に並ぶように配置され、すなわち、気泡発生部２０の長手方向において芯材２１の先端の位置と管状部材２２の先端の位置とが略一致するように形成される。ただし、これには限定されず、例えば、図２（ｂ）に気泡発生部２０Ａとして示すように、気泡発生部２０の長手方向において芯材２１の先端を管状部材２２の先端よりも延伸させるように構成し、管状部材２２の先端よりも芯材２１の先端が長さＬだけ延伸した延伸部分が形成された形状としてもよい。なお、図２（ｂ）においては、見やすくするために芯材２１の延伸部分の長さを誇張して表している。以降の説明においては、気泡発生部２０と気泡発生部２０Ａをまとめて気泡発生部２０と呼ぶ。
　なお、気泡発生部２０の先端の形状としては、芯材２１の先端よりも管状部材２２の先端を延伸させ、芯材２１の先端と管状部材２２の先端との間に微小な空隙を設けるように構成することも可能である。ただし、芯材２１の先端と管状部材２２の先端との間の空隙に空気が存在すると、後述するように気泡の生成のために芯材２１に電圧を印加した際に、空気が絶縁体として作用することになる。この場合、図２（ａ）、（ｂ）に示すように空隙が存在しない形状の気泡発生部２０に比べて、同等の気泡を発生させるためには印加する電圧を高くする必要がある。換言すると、先端に空隙が存在しない気泡発生部２０は、先端に空隙が存在する形状に比べて、印加電圧を低くすることができる。芯材２１の先端よりも管状部材２２の先端を延伸させた従来の構造の気泡発生部を備える導入装置を用いた場合であっても、例えば、後述する所定の高粘度条件の細胞懸濁液を用いたデリバリー方法によって、高いトランスフェクション効率を達成できる。
　芯材２１は、導電材料の微細細線から形成され、管状部材２２は、絶縁材料から形成される。芯材２１を形成する導電材料としては、電気を通すものであれば特に制限はなく、例えば、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン等の金属材料、またはこれらにスズ、マグネシウム、クロム、ニッケル、ジルコニウム、鉄、ケイ素等を少量加えた合金、グラファイトやダイヤモンド等が挙げられる。
　管状部材２２を形成する絶縁材料は、誘電体であることが好ましいが、電気を絶縁するものであれば特に限定されない。例えば、ガラス、マイカ、石英、窒化ケイ素、酸化ケイ素、セラミック、アルミナ等の無機系絶縁材料、シリコーンゴム、エチレンプロピレンゴム等ゴム材料、エチレン酢酸ビニル共重合体樹脂、シラン変性オレフィン樹脂、エポキシ樹脂、ポリエステル樹脂、塩化ビニル系樹脂、アクリル樹脂、メラミン樹脂、フェノール樹脂、ポリウレタン樹脂、ポリスチレン系樹脂、フッ素系樹脂、シリコーン系樹脂、ポリサルファイド系樹脂、ポリアミド樹脂、ポリイミド樹脂、ポリエチレン、ポリプロピレン、セルロース系樹脂、ＵＶ硬化樹脂等の絶縁性樹脂が挙げられる。
　つぎに、気泡発生部２０の作製方法について説明する。管状部材２２の内部に芯材２１を挿入して、芯材２１の先端と管状部材２２の先端とが長手方向において略一致した形状、もしくは長手方向において芯材２１の先端が管状部材２２の先端よりも延伸した形状とする。そして、管状部材２２の先端とは反対側の基端部から芯材２１を突出させて、電線を介して電力供給装置５０と電気的に接続可能な接続部とすることによって、気泡発生部２０が形成される。
　以下に、気泡発生部２０の作製方法の一例を説明する。まず、（１）所望の直径を有する芯材２１と、芯材２１の直径と実質的に同一寸法の内径を有する管状部材２２を用意する。芯材２１としては、例えば直径１００μｍのタングステン線を用い、管状部材２２としては例えば内径１００μｍ、外径３００μｍのフッ素系樹脂製の細長いチューブを用いることができる。（２）芯材２１を管状部材２２の内部に挿入する。管状部材２２であるフッ素系樹脂は低摩擦性であるので、芯材２１は管状部材２２に対して摺動しながら挿入されることができる。（３）顕微鏡下で芯材２１の先端と管状部材２２の先端の位置を確認しながら長手方向における延伸部分の所望の長さＬを実現するように位置合わせを行う。（４）位置合わせ後、接着剤等を用いて管状部材２２の先端とは反対側の基端部と芯材２１とを固定する。芯材２１の先端とは反対側の基端は、管状部材２２の基端部から突出し、上述した電線（例えば銅線等）が接続される接続部となる。なお、芯材２１と管状部材２２の材料および寸法は、上述したものには限定されない。
　なお、管状部材２２に対して芯材２１を挿入しやすくするために、切削加工等により、挿入前に芯材２１の先端部分が細くなるように加工してもよい。そして、細く加工した芯材２１の先端から芯材２１を管状部材２２に挿入し、芯材２１の先端と管状部材２２の先端の位置合わせを行う。この場合、図２（ａ）、（ｂ）に示した形態とは異なり、気泡発生部２０の先端部分において芯材２１と管状部材２２との間にわずかな隙間が生じ得る。
　また、上述した作製方法の一例の（１）で用意する芯材２１の直径と管状部材２２の内径は、同一には限定されない。例えば、管状部材２２が柔軟性を有する材料から構成される場合は、管状部材２２の内径よりも若干大きな直径を有する芯材２１を用いてもよい。例えば、管状部材２２としてシリコーンゴムやエチレンプロピレンゴム等の柔軟性を有するゴム材料を用い、芯材２１としてタングステン等の金属材料を用いる場合、ゴム材料の管状部材２２を押し広げながら金属材料の芯材２１を挿入することが可能である。あるいは、管状部材２２の内径よりも若干小さな直径を有する芯材２１を用いてもよい。この場合、芯材２１を管状部材２２に挿入し、例えば、接着剤等を用いて管状部材２２の基端部と芯材２１とを固定することにより芯材２１を保持するように構成することができる。または、管状部材２２と芯材２１との隙間を、例えば細胞および標的物質に影響を与えない材料からなる接着剤等で封入して固定することも可能である。芯材２１の外周と環状部材２２の内周とは、芯材２１を管状部材２２の内部に保持することができれば、長手方向の全体にわたって密着していてもよいし、部分的に密着していてもよし、あるいは、芯材２１の外周と環状部材２２の内周との間にわずかな隙間が存在していてもよい。
　芯材２１の直径（外径）は、例えば、約１０～約３００μｍとすることができる。管状部材２２の内径は、芯材２１の直径に応じて、例えば約１０～約３００μｍとすることができる。管状部材２２の外径は、内径よりも大きく、例えば約１００～約５００μｍとすることができる。気泡発生部２０の長手方向における気泡発生部２０の先端からの芯材２１の延伸部分の長さＬは、例えば０～１００μｍとすることができ、例えば０～５０μｍとしてもよい。芯材２１の延伸部分の長さＬ＝０の場合、図２（ａ）に示すように芯材２１の先端と管状部材２２の先端とが揃った形状となる。なお、芯材２１および管状部材２２の寸法はこれらには限定されない。芯材２１と管状部材２２の材料および寸法は、材料の摩擦係数や柔軟性等の特性に起因する気泡発生部２０の作製のしやすさ、細胞および標的物質への影響等を考慮したうえで、芯材２１に沿って管状部材２２が延在して配置されるように適切に選択される。
　気泡発生部２０は、任意選択的に、図示しない支持部により支持することができる。また、支持部が図示しない操作部により、移動可能及び／または位置決め可能に構成することができる。支持部と操作部により、容器３０の位置を固定したまま、気泡発生部２０の先端を細胞懸濁液内の所望の位置に移動させるように構成することができる。操作部は、例えば市販のマイクロマニピュレーターを用いることができる。したがって、気泡発生部２０の先端と対向電極４０との距離や、気泡発生部２０の先端と容器３０の側面や底面との距離を任意に調整可能である。あるいは、任意選択的に、容器３０が図示しない支持部と操作部により、移動可能及び／または位置決め可能に構成されていてもよい。
　対向電極４０は、導電材料から形成される電極である。対向電極４０は、容器３０に収容した細胞懸濁液と接触可能な態様であればよく、これにより、気泡発生部２０の芯材２１との間に電圧を印加可能であり、電界を形成可能な態様であればよい。対向電極４０を形成する導電材料は、芯材２１を形成する導電材料と同じ選択肢から選択することができる。対向電極４０は、気泡発生部２０と同程度の直径を持つ線状の電極であってもよいが、電圧を印加し、電界を形成可能であれば、その形状や寸法は限定されない。対向電極の態様の図示しない別の例として、細胞懸濁液を収容する容器が挙げられる。容器を導電材料から形成し、電力供給装置５０に電気的に接続することにより、容器を対向電極とすることも可能である。
　容器３０は、細胞懸濁液を収容し、あるいは細胞懸濁液を液滴の状態に保持して支持可能な部材である。図示する容器は、底部に向かうに従って内径が狭くなるマイクロチューブであり、このような遠心管等を用いることができる。しかし、容器３０の形状はこれには限定されず、細胞と標的物質を含む液体を収容し、あるいはこの液体を液滴として支持することができれば、例えばペトリ皿のような平皿であってもよい。細胞懸濁液や液滴を支持する部材は、平面状のガラス板やセラミック板のような支持基材であってもよく、これらを液滴支持基材と指称する。なお、容器３０は、本実施形態による導入装置を構成する部材としては必須ではない。本実施形態による導入装置は、任意の部材に収容され、支持され、あるいは保持された細胞懸濁液にアクセス可能である。
　電力供給装置５０は、図示しない電源、無誘導抵抗、電圧増幅回路、及びＤＩＯ（Ｄｉｇｉｔａｌ　Ｉｎｐｕｔ－Ｏｕｔｐｕｔ）ポート等を含み、ＤＩＯポートを介して例えばパーソナルコンピュータからなる制御装置６０に接続することができる。電力供給装置５０は、電線を介して気泡発生部２０の芯材２１及び対向電極４０にそれぞれ接続され、気泡発生部２０と対向電極４０とで回路を形成するように構成されている。電力供給装置５０からの電圧は、気泡発生部２０の芯材２１と対向電極４０との間に印加される。電力供給装置５０は、制御装置６０からの信号によって、出力する電流、電圧、及び周波数を制御するように構成されている。
　なお、図示する導入装置１００は、気泡発生部２０及び対向電極４０を１組だけ備えているが、気泡発生部及び対向電極は、それぞれ独立して２以上含んでいてもよい。
　次に、本発明を方法の観点から説明する。本発明は、第２実施形態によれば、標的物質の細胞へのデリバリー方法に関する。より具体的には、標的物質を細胞にデリバリーする方法は、以下の工程を含む。
　（ａ）第１実施形態に記載の導入装置の、前記気泡発生部の先端と、前記対向電極とを、細胞と標的物質とを含む液体に接触させる工程
　（ｂ）前記アクティブ電極と前記対向電極間に電圧を印加し、これにより前記液体内に電界を生成し、前記気泡発生部の先端において気泡を生成する工程
　第２実施形態によるデリバリー方法とは、標的物質を細胞にデリバリーする方法に関する。当該方法によれば、細胞を生存状態に保持したまま、気泡及び電界の作用により細胞を物理的に穿孔し、標的物質が、細胞膜に形成された孔を通過して、細胞の内部に侵入可能な状態とすることができる。そして、結果として標的物質が細胞にデリバリー（送達）可能となる。なお、液体に含まれるすべての細胞に対する標的物質のデリバリーが達成されない場合や、一部の細胞が死滅する場合も、本実施形態によるデリバリー方法に含まれるものとする。
　デリバリー方法の実施に当たって、細胞と標的物質を含む液体を調製する。細胞及び標的物質の選択肢については先に記載したとおりである。
　細胞が浮遊細胞の場合には、細胞と標的物質を含む液体は、細胞懸濁液の形態で調製することができる。細胞懸濁液を構成する溶媒は、細胞が生存できる環境を提供するものであれば特には限定されない。例えば、溶媒は、生理的緩衝液であってもよい。生理的緩衝液としては、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニルエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３－モルフォリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ?２?アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、または２?（Ｎ?モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）等が挙げられ、エレクトロポレーション用の緩衝液として市販されている生理的緩衝液であってもよい。あるいは、溶媒は培地であってもよく、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ｅ－ＭＥＭ等の市販品を用いることもできるが、これらには限定されない。
　細胞懸濁液には、１種または２種以上の浮遊細胞を含めることができる。細胞懸濁液中の細胞の濃度は特に限定されず、目的と用途により当業者が適宜、細胞濃度を決定することができる。例えば、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の場合、約１×１０４ｃｅｌｌｓ／μＬ程度の低濃度とすることが好ましい。例えば、増粘剤を用いることなく、細胞濃度で粘度を調整する場合は、約１×１０６ｃｅｌｌｓ／μＬ程度の高濃度とすることが好ましい。
　細胞懸濁液には、１種または２種以上の標的物質を分散もしくは溶解することができる。標的物質の細胞懸濁液中における濃度は、標的物質の種類や状態によっても異なるが、一般的なエレクトロポレーション技術において通常用いられる濃度であってよい。例えば、標的物質が核酸（例えば、プラスミドｐＥＧＦＰ－Ｎ１）の場合は、１ｎｇ／μＬ～１μｇ／μＬとすることができ、０．５～１μｇ／μＬとすることが好ましい。標的物質が高分子化合物ＦＩＴＣ－ｄｅｘｔｒａｎの場合は、１μｇ／μＬ～１００μｇ／μＬとすることができ、５０～８０μｇ／μＬとすることが好ましい。
　細胞懸濁液は、標的物質のトランスフェクション効率を上げる目的で、粘度を調整することが好ましい。細胞懸濁液を比較的高粘度にすることで、気泡発生部２０で生成するマイクロバブルを振動（oscillating）させ、これにより、細胞懸濁液を振動させて、細胞を振動ストレスに曝すことで、穿孔しやすくするためである。細胞懸濁液の粘度は、２５℃の温度条件、パラレルプレートレオメーターのせん断速度が１０－３～１０４［１／ｓ］の条件で測定した場合に、１０－２～１０４Ｐａ・ｓであることが好ましい。
　細胞懸濁液を所望の粘度にするために、細胞濃度を調整することができる。特定の細胞についての、細胞濃度と、細胞懸濁液の粘度との関係は、事前実験等により適宜求めることが可能である。あるいは、細胞懸濁液を所望の粘度にするために、懸濁液に増粘剤を添加することができる。増粘剤としては、細胞及び標的物質に悪影響を及ぼさないものであれば特に限定されない。医療用、食品用に一般的に用いられる任意の増粘剤を用いることができ、例えば、グリセロール、セルロースナノファイバー、ＣＭＣナノファイバー、キチンナノファイバー、キトサンナノファイバー等であってよいが、これらには限定されない。特定の増粘剤についての、増粘剤添加量と、細胞懸濁液の粘度との関係は、事前実験等により適宜求めることが可能である。
　細胞懸濁液の調製方法は、一般的な方法であってよい。例えば、培養皿等で培養した細胞をマイクロチューブ等に採取し、遠心装置を用いて細胞を沈殿させる。次いで、上清の培地を取り除いて、沈殿した細胞に標的物質を添加し、任意選択的に増粘剤を添加する。これにより、細胞懸濁液を調製することができる。
　細胞が接着細胞の場合には、細胞と標的物質を含む液体は、平皿やガラス基板等に接着した状態の細胞と、当該細胞に接して当該細胞の周囲に存在する標的物質と溶媒を含有する液体とにより構成することができる。標的物質と、溶媒は、細胞懸濁液について説明したものと同様の選択肢から選択することができる。したがって、細胞が接着細胞の場合には、細胞と標的物質を含む液体は、容器の内面（内側底面または内側面）に接着した細胞と、この容器に充填された液体とから構成されていてもよい。あるいは、細胞と標的物質を含む液体は、平板上の容器もしくは支持基材に接着した細胞と、この細胞を覆うように存在する標的物質と溶媒を含有する液体とから構成される液滴であってもよい。本明細書において、後者の液体を、細胞含有液滴と指称する場合がある。
　細胞が接着細胞の場合には、標的物質と溶媒を含有する液体の粘度を、細胞と標的物質を含む液体の粘度とみなし、この液体の粘度を、増粘剤を用いて先の好ましい粘度範囲に調整することが好ましい。使用可能な増粘剤の選択肢は、細胞懸濁液の場合と同じであってよい。また、細胞が接着細胞の場合には、細胞数と標的物質と溶媒を含有する液体の量的関係は、例えば、２．０×１０５ｃｅｌｌｓ程度の接着細胞に対し、液体が１０～１００μＬ程度、プラスミドの濃度が１ｎｇ／μＬ～５μｇ／μＬ程度、増粘剤の濃度が約２０～６０％（ｖ／ｗ）程度とすることができる。
　細胞が接着細胞の場合の細胞と標的物質を含む液体の調製方法は、平皿等の所定の支持基材上で細胞を培養して基材上に接着させた後、培地を取り除く。次いで、標的物質と溶媒と任意選択的に増粘剤とを含む液体を接着細胞上に載置する。これにより、細胞含有液滴等の細胞と標的物質を含む液体を調製することができる。
　細胞が生体組織を形成している場合には、細胞と標的物質を含む液体は、細胞を含む組織と、当該組織に接して当該組織の周囲に存在する標的物質が分散もしくは溶解された液体とにより構成することができる。この場合も、標的物質が分散もしくは溶解された液体の濃度を、細胞と標的物質を含む液体の濃度とみなし、標的物質が分散もしくは溶解された液体の濃度を、増粘剤を用いて、先の所望の粘度範囲に調整することが好ましい。
　本実施形態によるデリバリー方法に用いる細胞と標的物質を含む液体の量は特に限定されず、気泡発生部２０の先端を浸漬することができ、対向電極４０に接触させることができる量であればよい。細胞懸濁液の場合、例えば、マイクロチューブに収容した１μＬ～１ｍＬ程度の溶液であってもよい。あるいは、細胞含有液滴の場合、例えば、１０～１００μＬの体積の液滴であってもよい。
　工程（ａ）、（ｂ）は、第１実施形態において説明した導入装置により実施することができる。以下、図１、２を参照して説明する。
　工程（ａ）では、気泡発生部２０の先端と、対向電極４０とを、細胞と標的物質を含む液体に接触させる。このとき、気泡発生部２０の先端は、細胞と標的物質を含む液体と周囲雰囲気との気液界面から、少なくとも約５００μｍ程度挿入されていることが好ましい。振動している気泡の力学刺激をより多くの細胞に与えるためである。また、気泡発生部２０の先端と、容器もしくは液滴支持部材の底部との距離が約１００μｍ～１ｍｍとすることが好ましい。振動する気泡のサイズ（～数百μｍ）を考えると、この距離は妥当である。また、対向電極４０の先端と、容器もしくは液滴支持部材の底部との距離が約１００μｍ～１ｍｍとすることが好ましい。対向電極４０の先端を液中に入れる必要があり、サンプルのボリュームと液面の高さで決めることができる。気泡発生部２０の先端と対向電極４０の先端との距離は、特には限定されず、電界が形成されればよいが、例えば、約１ｍｍ以上程度とすることができ、約２ｍｍ以上程度とすることが好ましい。極端に距離を縮小すると、電極間が短絡し、大量の細胞死を引き起こすおそれがあるためである。気泡発生部２０及び対向電極４０は、溶液に対して相対的に動かないように固定することが好ましい。
　工程（ｂ）では、気泡発生部２０の前記アクティブ電極と対向電極４０間に電圧を印加する。直流の電圧パルスを印加することが好ましい。パルス波形、電圧、パルス幅、パルス間の間隔、回数等の条件は、細胞と標的物質を含む液体の導電率等、種々の条件により適宜決定することができるが、例えば、パルス波形が矩形波の場合、電圧は１００～１０００Ｖ、パルス幅は１～１００μｓ、パルス間の間隔は１～１０００μｓ、パルス回数は、１００～１０００００回とすることができる。また、電圧を印加することにより、細胞と標的物質を含む液体内に電界を生成する。１００Ｖ／ｍｍ程度の電界を生成することが好ましい。そして、このような電圧の印加により、前記アクティブ電極の先端から連続的に気泡を生成することができる。
　電圧印加は、細胞と標的物質を含む液体内部における、気泡発生部２０の先端の位置を移動させて、複数の個所において行うことが好ましい。気泡発生部２０の近傍において、後述する細胞への電界起因の電気的刺激と気泡起因の機械的刺激が大きいため、液体全体において効果を得るためである。気泡発生部２０の先端の位置を移動させる場合、対向電極４０は固定してもよいし、移動させてもよい。あるいは、気泡発生部２０と対向電極４０を固定して、容器３０を移動させてもよい。
　次に、図３（ａ）、（ｂ）を用いて、気泡発生部２０による気泡発生メカニズムについて説明する。気泡発生部２０と対向電極４０とを容器３０に収容された細胞懸濁液に浸漬した状態で、電力供給装置５０によって気泡発生部２０の芯材２１、すなわちアクティブ電極に電圧パルスを印加する。印加された電圧パルスによって気泡発生部２０の先端に電界Ｅが生じ、発生した電界Ｅによって気泡発生部２０の先端の周囲に微小な気泡Ｂが生成される。気泡発生部２０の先端に電界Ｅを集中させることで、気泡Ｂを高速に生成することができる。
　図３（ａ）、（ｂ）は、それぞれ細胞懸濁液の濃度が高い場合と低い場合の細胞の挙動を概念的に示している。図３（ａ）に示すように、細胞懸濁液の濃度が高い場合、気泡発生部２０の先端の周囲に生成された気泡Ｂが膨張と収縮を繰り返し、細胞懸濁液中に振動ｏが伝わる。懸濁液中の細胞Ｃは、このような圧力振動ｏによって比較的大きなせん断応力、すなわち機械的な刺激を受ける。細胞Ｃは、電界Ｅからの電気的な刺激も受けるため、電界起因の電気的刺激と気泡起因の機械的刺激とを受ける。これらの刺激により、細胞膜に孔が形成され、標的物質（図示せず）が細胞膜を通過して細胞Ｃの内部に入り込むことが可能になる。電気的な刺激及び機械的な刺激が大きいと孔が開きやすくなり、標的物質が細胞膜を通過する効率を上昇させることができると考えられる。このような作用により、本発明のデリバリー方法を、以下の実施例においては、エレクトロメカニカルポレーションということがある。
　一方、図３（ｂ）に示すように、細胞懸濁液の濃度が低い場合は、気泡Ｂの膨張によって生成されるジェット水流によって気泡Ｂが連続的に放出され、容器３０内に対流ｃｆが発生する。細胞Ｃも対流ｃｆの一部として循環するため、細胞Ｃが受ける機械的刺激は比較的小さいと考えられる。
　以下に、本発明を、実施例を参照して説明する。しかし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
　Ａ．実験方法
　（１）コアシェル構造の気泡発生部と実験装置の構成
　コアシェル構造の気泡発生部は、直径が１００μｍのタングステン線、内径１００μｍ、外径３００μｍのテフロン（登録商標）チューブ、静脈内留置カテーテル（細長いステンレス製のチューブ）を用いて作製した。タングステン線はテフロンチューブよりも約５ｍｍ長く、テフロンチューブに挿入した後、タングステン線の基端を静脈内留置カテーテルの先端に挿入してアクティブ電極とした。気泡発生部の先端構造は、特記した箇所を除き、先端が平坦な構造とした。対向電極は、タングステン線のみから構成される電極を用いた。気泡発生部と対向電極にピーク電圧５００Ｖのシングルパルスを印加すると、マイクロバブルが発生し、５μｓ以内に最大サイズ（サブミリ）まで成長した。デリバリー方法に使用した導入装置は、気泡発生部、対向電極、電源（Ｈｙｆｒｅｃａｔｏｒ　２０００，ＣｏｎＭｅｄ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）、２台のマイクロマニピュレーター（ＱＰ－２ＲＬＨ－ＰＣ，　Ｍｉｃｒｏ　Ｓｕｐｐｏｒｔ　Ｃｏ，Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）、及び制御装置としてのパーソナルコンピューター（ＰＣ）で構成した。電源は、バイポーラ（ＢＩ）モードを使用し、出力は０～３５Ｗの範囲で調整可能であった。ＰＣからの信号は、デジタルＩ／Ｏユニットを介して電源のトリガーとして使用された。電源を外部から１回トリガーすると、各トリガーで、約０．０１８秒で６００パルスが発生した。各電源ユニットは３０回トリガーされた。実験中の電圧と電流の監視にはオシロスコープを使用した。気泡発生部の先端の位置は、各トリガー信号の後、マイクロマニピュレーターによってｘ－ｙ平面内で、５００μｍ以内でランダムに変更し、信号間の時間間隔は２秒とした。気泡発生部の先端の、容器底部からの距離は約０．５ｍｍとした。
　（２）細胞培養とＦＩＴＣ標識デキストラン及びプラスミドの調製
　ＮＩＨ／３Ｔ３（ＣＲＬ－１６５８）、ＵＭＲ－１０６（ＣＲＬ－１６６１）、ＭＳＣ（ＰＣＳ－５００－０１２）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．，ＵＳＡ）から入手した。Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ　ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ　ＣＣ－１２５　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ　ｍｔ＋　１３７ｃは、埼玉大学の高橋拓子先生から供与を受け、形質転換に用いた。ＮＩＨ／３Ｔ３及びＵＭＲ－１０６は，１０％の熱不活化ウシ胎児血清（Ａｕｓｔｒａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ＵＳＡ）と１％のペニシリン及びストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む高グルコースのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＡＴＣＣ　３０－２００２，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．，ＵＳＡ）で培養した。ＭＳＣは、５％の牛胎児血清（ＳＣＲ，＃００２５）、１％の成長補助剤（ＳＣＲ，＃７５５２）、１％のペニシリンとストレプトマイシン（ＳＣＲ，＃０５０３）を含む間葉系幹細胞成長培地（ＳＣＲ，＃７０５１）で培養した。ＮＩＨ／３Ｔ３及びＵＭＲ－１０６は、５％ＣＯ２下、３７℃の加湿環境下で維持し、コンフルエントになるまで培養した。野生型クラミドモナスは、１％の寒天を含むトリス酢酸－リン酸（ＴＡＰ）固体培地を用いて、１００ｍｍディッシュで培養した。クラミドモナスは、２２℃の連続照明（８２μｍｏｌ　ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ２ｓ）下で培養した。
　（３）高分子のエレクトロメカニカルポレーションによるデリバリーの有効性評価
　３～５ｋＤａ及び２０００ｋＤａのＦＩＴＣ標識デキストラン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｊａｐａｎ）を用いて、ＵＭＲ－１０６及びクラミドモナスへの高分子のエレクトロメカニカルポレーションによるデリバリーの有効性を評価した。トランスフェクションのための細胞懸濁液の体積は７μＬであった。ＦＩＴＣ標識デキストランの最終濃度は約８５μｇ／μＬであった。ＮＩＨ／３Ｔ３，ＵＭＲ－１０６、ＭＳＣをトランスフェクションする実験では、プラスミドを用いた。ｐＥＧＦＰ－Ｎ１プラスミドＤＮＡ（４．７ｋｂｐ）（Ｃｈｌｏｎｔｅｃｈ，＃６０８５－１）、ｐＣＤＨ－ＧＦＰ－ＲＦＰ－ＰＵＲＯ（８．３ｋｂｐ）、ＭＳ２－Ｐ６５－ＨＳＦ１（１１ｋｂｐ）（Ａｄｄｇｅｎｅ，＃６１４２３）、ｐＨＲｄＳＶ４０－ＮＬＳ－ｄＣａｓ９－２４ｘＧＣＮ４－ＮＬＳ－Ｐ２Ａ－ＢＦＰ－ｄＷＰＲＥ（１５ｋｂｐ）（Ａｄｄｇｅｎｅ，＃６０９１０）は、プラスミドＧｉｇａ　ｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて調製した。プラスミド濃度は、３から１０μｇ／μＬとした。予備実験では、細胞サンプル（２．１×１０５ｃｅｌｌｓ／μＬ）に３．８μｇ（０．５４μｇ／μＬ）または０．９μｇ（０．１３μｇ／μＬ）のプラスミドを加えてトランスフェクトした。異なるレベルのプラスミドを用いた実験で得られた最大のトランスフェクション効率に基づいて、各サンプルに１５μｇのプラスミドを加えた。マイクロバブルと電界に３０トリガー曝露しても、１２Ｗでプラスミドの損傷は生じなかった。
　（４）サンプル調製と粘度測定
　１．５ｍＬマイクロチューブの底面に形成された細胞懸濁液サンプルを遠心分離により調製した。増粘剤ＢｉＮＦｉ－ｓは、スギノマシン株式会社（富山県）から購入した。セルロースナノファイバー（ＣＮＦ）またはカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を用いた増粘剤を使用した。ＢｉＮＦｉ－ｓセルロース・長（ＬＣＮＦｓ、ＢＭａ－１０００２）とＢｉＮＦｉ－ｓセルロース・短（ＳＣＮＦｓ、ＡＦｏ－１０００２）を使用した。また、増粘剤であるＣＭＣ（ＴＦｏ－１０００２）も使用した。細胞を遠心分離した後、上清を捨てた。所望の容量の増粘剤を細胞に加えた。その後、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭを加えて、総容量を７μＬに調整した。平行板型レオメーターＰｈｙｓｉｃａ　ＭＣＲ　３０１（オーストラリア、アントンパール社）を用いて流体力学的特性を評価し、細胞濃度が高いサンプルの動的粘弾性特性を測定した。ＣＰ２５－０．５の測定プレートを使用したのは、少量の細胞懸濁液（約５０μＬ程度）で測定可能であるためである。温度を２５℃に保つために、水を循環させた恒温水槽を使用した。
　（５）細胞トランスフェクションの評価
　プラスミドＤＮＡをトランスフェクションした細胞を、トランスフェクション後４８時間、蛍光顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ　Ｔｉ、株式会社ニコン）を用いて観察した。画像は、２０倍の拡大レンズ（Ｌ　Ｐｌａｎ，ＳＬＷＤ　２０×／０．３５，ＯＦＮ２５，ＷＤ　２４，Ｎｉｋｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて収集した。露光時間は、２日目の画像の飽和状態に基づいて６００ｍｓとした。トランスフェクション効率は、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ　ＩＩ　ＦＬ自動細胞計数器（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を用いて測定した。
　細胞選択実験のために、ＵＭＲ－１０６細胞にピューロマイシン耐性の遺伝子を持つプラスミドであるｐＣＤＨ－ＧＦＰ－ＲＦＰ－ＰＵＲＯ（８．３ｋｂｐ）をトランスフェクションした。ＵＭＲ－１０６の培養液には、２４時間後に、最終濃度が２０μｇ／ｍＬになるように、ピューロマイシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ＵＳＡ）を添加した。続いて４８時間、ピューロマイシンを添加した後、サンプルを観察し、０．２５％トリプシンを用いて細胞を回収した。Ｃｏｕｎｔｅｓｓ　ＩＩ　ＦＬを用いてプラスミドを発現している細胞の割合を測定した。
　（６）ファロイジンによる細胞染色と画像解析
　Ｃ．Ｊ．Ｃｈａｎ　ｅｔ　ａｌ．，（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　ｊｏｕｒｎａｌ　１０８，　１８５６－１８６９　（２０１５））に記載された方法を用いて、浮遊細胞のアクチンを染色した懸濁した細胞を予め温めておいたＰＢＳで洗浄し、懸濁した状態の細胞を４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液で、２０分間室温で固定した。続いて、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００で５分間インキュベートした。固定した細胞をファロイジン－Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ　５５５（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて暗所で２０分間インキュベートして細胞を染色した。次いで、ＰＢＳで３回洗浄した。２４時間培養した細胞のアクチンを同様のプロトコールで染色した。アクチンを染色した細胞は、ＴＣＳ　ＳＰ８共焦点レーザー顕微鏡（ライカ）と４０×／１．２ＮＡオイル対物レンズ（ライカ）を用いて、共焦点モードで撮影した。細胞は、０．３５μｍのステップサイズで下から上に向かって撮影した。ゲイン設定と露光時間は、すべてのサンプルで同じにした。各画像の各細胞の強度を計算し、その最大値を細胞内のアクチンの強度とした。
　（７）統計解析
　結果は、４～６回の独立した実験から得られたものである。差異は、正規性検定の結果に基づいて一元的反復測定ＡＮＯＶＡを用いて調べ、事後解析法としてＴｕｋｅｙ検定を用いた。結果は、２５パーセンタイルと７５パーセンタイルで決定されたボックスを有するボックスチャートを用いてグラフ化した。ｐ値が＜０．０５の場合、統計的に有意であるとみなした。統計解析は、ＯｒｉｇｉｎＰｒｏ２０２１を用いて行った。
　Ｂ．結果
　（１）アクチン繊維の形態変化
　図４は、本発明に係るデリバリー方法の実施前後のＮＩＨ／３Ｔ３細胞のアクチン繊維の形態変化の一例を示すイメージである。この実験では、細胞濃度を利用して細胞懸濁液の粘度を低く抑えた。図４（ｃ）を参照すると、気泡発生による圧力振動を受ける前（Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ）は、細胞の細胞膜下に緻密なアクチン皮質層が観察された。気泡発生による圧力振動を与えた後、低粘度の細胞懸濁液（３．６×１０４ｃｅｌｌｓ／μＬ）では、細胞膜下のアクチン層は変化しなかった（図４（ａ）、１２－Ｗ　ｂｕｂｂｌｅ）。一方、高粘度の細胞懸濁液（２．１×１０５ｃｅｌｌｓ／μＬ）では、皮質のアクチン構造はほとんど消失していた（図４（ｂ）、１２－Ｗ　ｂｕｂｂｌｅ）。さらに、２４時間後の培養では、アクチンストレスファイバーが再び観察された。これらの結果から、高粘度の細胞懸濁液のアクチン組織は、エレクトロメカニカルポレーションの影響を強く受けており、トランスフェクトした細胞は培養後にアクチンストレスファイバーを再生したことが明らかになった。浮遊細胞におけるアクチンネットワークの消失は細胞の軟化と相関していたことから、この結果は、エレクトロメカニカルマイクロバブルへの曝露によって細胞の機械的特性が向上し、エレクトロポレーションの効果が改善されたことを示唆している。理論により拘束される意図はないが、高粘度の細胞懸濁液において、機械的刺激が細胞の極性と膜貫通電圧を調節し、細胞膜を弱め、気泡発生部と対向電極間の電界によって誘発される孔の形成（エレクトロポレーション）をサポートすることを示唆している。
　（２）細胞濃度による懸濁液の粘度変化の影響
　細胞懸濁液の粘度を上げるには、一般的に細胞濃度を上げるか、増粘剤を加えるかの２つの選択肢がある。ここでは、細胞濃度を変化させて制御した細胞懸濁液の粘度の寄与を評価した。まず、本発明に係るデリバリー方法の有効性を実証するために、出力と細胞濃度を調べた。２．１×１０５個／μＬの細胞を含む細胞懸濁液を用いて、出力を４～１５Ｗに変化させ、エレクトロメカニカルポレーションを比較した。標的分子としてＧＦＰ発現プラスミド（ｐＥＧＦＰ－Ｎ１，４．７ｋｂｐ）を用い、トランスフェクションされた細胞を可視化した。図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃから、出力を１２Ｗにするとトランスフェクションされた細胞の数が増加し、さらに１５Ｗにするとトランスフェクションされた細胞の数が減少したことがわかる。さらに、１５Ｗでは細胞の損傷が激しく、サンプルを顕微鏡で観察すると、気泡の導入後に細胞数が減少している場合もあった。これらの結果から、エレクトロメカニカルポレーションでは、エレクトロポレーションと同様に、トランスフェクション効率と細胞生存率がトレードオフの関係にあり、試験した条件の中では、１２Ｗの出力が最も効果的に細胞を注入できることがわかった。
　（３）高粘度条件とトランスフェクション効率
　高粘度条件がストレス曝露に有効かどうかを調べる実験を行った。細胞濃度を３．６×１０４、１．１×１０５、２．１×１０５、４．３×１０５ｃｅｌｌｓ／μＬと変えたサンプルの粘度をレオメーターで評価した（図６Ａ）。細胞濃度が高いほど、せん断粘度も高くなった。２．１×１０５ｃｅｌｌｓ／μＬ及び４．３×１０５ｃｅｌｌｓ／μＬのサンプルのせん断粘度は、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭとプラスミドのみを含むコントロールのせん断粘度よりも高かった。次に、マイクロバブルの発生による流体的な挙動を観察した。細胞濃度が３．６×１０４ｃｅｌｌｓ／μＬと２．１×１０５ｃｅｌｌｓ／μＬの低粘度の細胞懸濁液と高粘度の細胞懸濁液の典型的な結果を撮影して動画を得た。いずれの場合も出力は１２Ｗであった。細胞濃度が低い場合は、気泡発生部によって自由な循環流が発生した。一方、細胞濃度が高い場合には、マイクロバブルが激しく振動し、細胞を含む自由な循環流が制限された。これらの結果は、気泡の挙動に粘性が影響していることを示しており、トランスフェクションのための機械的刺激を調整できることを示している。次に、ｐＥＧＦＰ－Ｎ１プラスミドを用いて、異なる濃度のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を用いたトランスフェクション実験を行った。図６Ｂ及び図６Ｃは、細胞濃度が２．１×１０５ｃｅｌｌｓ／μＬ及び４．３×１０５ｃｅｌｌｓ／μＬの高粘度の場合には、３．６×１０４ｃｅｌｌｓ／μＬ及び１．１×１０５ｃｅｌｌｓ／μＬの低粘度の場合とは対照的に、多数のＮＩＨ／３Ｔ３細胞に、プラスミドｐＥＧＦＰ－Ｎ１がトランスフェクションされたことを示している。これらの結果は、トランスフェクション効率に対する細胞濃度の影響を示している。
　（４）増粘剤による細胞変換の促進
　細胞懸濁液のせん断速度とトランスフェクション効率に相関があるという結果を受けて、細胞懸濁液の粘度を上げるもう一つの方法である増粘剤の添加を評価した。増粘剤は、低濃度の細胞懸濁液でも本発明の方法を実施できるという利点があり、応用の可能性が広がる。そこで、低粘度の細胞懸濁液（３．６×１０４ｃｅｌｌｓ／μＬ）に増粘剤を添加して高粘度の環境を再構築し、低濃度の細胞懸濁液におけるトランスフェクションを検討した。増粘剤としては、セルロースナノファイバー（ＣＮＦ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を評価した。細胞懸濁液に少量のＣＮＦを加えると、その高いアスペクト比と繊維間水素結合のために粘性のある懸濁液が得られる。また、ＣＮＦは木質繊維由来であるため、高い生体適合性と生分解性を有している。ＣＭＣは、セルロースから化学合成された安価な素材として定着しており、ＣＮＦよりもさらに高い生体適合性を持つ。ＣＭＣはＣＮＦよりも増粘効果が低いものの、既に食品添加物として使用されている。そこで、２種類のＣＮＦとＣＭＣを用いて、増粘剤におけるナノファイバーの効果を評価した。アスペクト比の異なるＣＮＦとしてＡＦｏ－１０００２（短いＣＮＦ、ＳＣＮＦ）とＢＭａ－１０００２（長いＣＮＦ、ＬＣＮＦ）を、ＣＭＣとしてＴＦｏ－１０００２（断面の直径が１０μｍの繊維状ＣＭＣ）を使用した。
　まず、増粘剤の添加による粘度の変化を評価した（図７Ａ）。増粘剤の添加により、いずれの場合も細胞懸濁液の粘度が上昇した。さらに、高アスペクト比の増粘剤を添加した場合、せん断粘度に対する増粘効果は、短いＣＮＦの場合よりも大きかった。濃度４５％（ｖ／ｗ）（ＣＭＣ＿４５％）のＣＭＣ（ＣＮＦなし）の粘度は、濃度７％（ｖ／ｗ）（ＬＣＮＦ＿７％）のＢＭＡ／１０００２セルロース（長）と同程度であった（図７Ｂ）。さらに、ＳＣＮＦ＿２１％、ＬＣＮＦ＿２１％、ＣＭＣ＿４５％では、それぞれ約１６．８％、約３６．１％、約９．１％までトランスフェクション効率が向上した（図７Ｃ）。いずれの場合も、トランスフェクション効率は向上し、粘度が高いほどトランスフェクション効率は高くなった。これらの結果から、マイクロバブルによる細胞のトランスフェクションを促進するには、細胞と標的物質を含む液体の粘度が重要な要素であることが示唆された。
　（５）細胞の種類依存性
　ラット骨肉腫細胞株ＵＭＲ－１０６を用いて、ＣＮＦの濃度を変えたり、ＣＮＦを加えたりした実験を行った。ＵＭＲ－１０６は、骨再生とビタミンＤシグナルを再現する骨形成細胞と骨再形成細胞のモデルとして使用されている。ｐＥＧＦＰ－Ｎ１は、トランスフェクションの標的分子である。高濃度の細胞懸濁液（２．１×１０５ｃｅｌｌｓ／μＬ）と増粘剤（ＬＣＮＦ＿２１％（ｖ／ｗ））を添加した２種類の高粘度の細胞懸濁液を使用した。コントロールとしては、３．６×１０４細胞／μＬの低粘度の細胞懸濁液を用いた。高濃度の細胞懸濁液を用いた場合のトランスフェクション効率は約４５％であり（図８Ａ）、低濃度の細胞懸濁液を用いた場合よりも高かった。また、増粘剤を添加したサンプルでは、トランスフェクション効率が約３６％にまで上昇した（図８Ｂ）。
　次に、トランスフェクションが困難な細胞であるヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を調べた。ＭＳＣは特定の条件下で他の細胞系列に分化し、移植することができるため、大きな分子をＭＳＣに送達することは、医療分野において膨大な数の応用が可能である。総細胞数は１．０×１０６ｃｅｌｌｓで、ＬＣＮＦ＿２１（ｖ／ｗ）％を加えて７μＬの懸濁液とした。これはＮＩＨ／３Ｔ３サンプルに用いた条件と同じであった。ＣＮＦを添加したＭＳＣのトランスフェクション効率は約２１％で、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭとプラスミドのみを添加したサンプルのトランスフェクション効率（約１２％）よりも有意に高かった（図８Ｃ）。
　これらの結果から、エレクトロメカニカルポレーションは、さまざまな幹細胞のトランスフェクションに利用できる可能性があると考えられる。エレクトロメカニカルポレーションの汎用性を示すために、クラミドモナス・レインハルディを用いた実験を行った。クラミドモナスは、将来の再生可能なバイオ燃料の供給源として示唆されている微細藻類であるが、細胞壁が硬いため、遺伝子を操作することは困難であることが知られている。静置した状態のサンプルでは、緑色の蛍光を発しない細胞が観察された。３～５ｋＤａのＦＩＴＣ標識デキストランは、３×１０５細胞／μＬの濃縮細胞懸濁液では、わずかな細胞にしかデリバリーされなかった。７．５×１０５細胞／μＬでは、ＦＩＴＣ標識デキストランのトランスフェクション効率は８０％以上にまで上昇した（図８Ｄ）。このように、本システムは、細胞壁を持つ細胞への高分子のデリバリーに適用可能であり、植物細胞であってもトランスフェクションには試料の粘度が重要なパラメータとなることが示された。ＦＩＴＣ標識デキストランは、トランスフェクションのための細胞膜の透過性を評価するために使用されており、今回の結果は、開発したエレクトロメカニカルポレーションがマイクロバブル曝露後に孔の形成を誘発したことを直接示すものである。
　（６）ポアサイズと大型プラスミドのデリバリー
　大型プラスミドのデリバリーの可能性を評価した。分子量２０００ｋＤａのＦＩＴＣ標識デキストラン（推定流体力学的直径：５４．４ｎｍ）は、ＵＭＲ－１０６細胞に約９０％の効率でデリバリーされた（図９Ａ）。１５ｋｂｐプラスミド（ｐＨＲｄＳＶ４０－ＮＬＳ－ｄＣａｓ９－２４ｘＧＣＮ４－ＮＬＳ－Ｐ２Ａ－ＢＦＰ－ｄＷＰＲＥ）のＵＭＲ－１０６細胞へのデリバリーの結果も確認され、大容量のゲノム情報を含む大型カーゴモデルとして、１５ｋｂｐまでの異なるサイズのプラスミドをＵＭＲ－１０６細胞にトランスフェクトすることに成功した（図９Ｂ）。また、１１ｋｂｐのプラスミドのＵＭＲ－１０６細胞へのトランスフェクション効率は、エレクトロメカニカルポレーションシステムを用いた場合、約８％であった（図９Ｃ）。さらに、２０００ｋＤａのＦＩＴＣ標識デキストランをクラミドモナスにデリバリーするために、濃度７．５×１０５ｃｅｌｌｓ／μＬの細胞懸濁液を用いた。細胞懸濁液に増粘剤を加えると、２０００ｋＤａのＦＩＴＣ標識デキストランがロードされた細胞の割合が顕著に向上した（図９Ｄ）。この結果は、細胞懸濁液の粘性を利用して、大分子の細胞へのトランスフェクション効率を高めることもできることを示唆している。
　振動するマイクロバブルに曝露された細胞が増殖するかどうかを調べた。ＧＦＰとＲＦＰ－２Ａ－ＰＵＲＯの両方の発現カセットを持つベクターを用いてプラスミドのデリバリー後、細胞選択実験を行った。エレクトロメカニカルポレーション法を用いてトランスフェクションを行ったところ、２４時間後にはＧＦＰとＲＦＰの両方を発現した細胞が観察された（図１０Ａ）。本発明に係る方法の有効性を評価するために、細胞に分子をトランスフェクションする際に広く用いられているリポフェクションを用いた。ＵＭＲ－１０６細胞は、リポフェクションまたはエレクトロメカニカルポレーションのいずれかを用いて遺伝子送達を行った後、コンフルエントになるまで成長した。ピューロマイシンで４８時間処理するとＧＦＰまたはＲＦＰを発現する細胞の数が増加したことから、トランスフェクションを受けた細胞が増殖し、その子孫もピューロマイシン耐性遺伝子を発現したと考えられる（図１０Ｂ）。一方、非トランスフェクション細胞は、ピューロマイシン処理により死滅した。ピューロマイシン処理から４８時間後には、リポフェクタミンまたはエレクトロメカニカルポレーション法を用いてトランスフェクトした両サンプルの約９９％にＧＦＰが発現した（図１０Ｃ）。注目すべきは、エレクトロメカニカルポレーション法を用いたＵＭＲ－１０６の及びＭＳＣのトランスフェクション効率は、リポフェクション法を用いた場合よりも高かったことである（図１１（ａ）、（ｂ））。これらの結果から、エレクトロメカニカルポレーション法で抗生物質耐性カセットをトランスフェクトした細胞は、従来法でトランスフェクトされた細胞と同様に抗生物質に反応して増殖状態を示すことが確認された。
　（７）接着細胞へのデリバリー
　ディッシュの底部に接着したＵＭＲ－１０６上に、１μｇ／μＬのｐＥＧＦＰ－Ｎ１プラスミド、および、２１％（ｖ／ｗ）の増粘剤（ＢＭａ－１０００２，ＢｉＮＦｉ－ｓ社）を添加したＯｐｔｉ－ＭＥＭの１００μＬの液滴を作成した。２４時間培養後に、ＵＭＲ－１０６細胞にＧＦＰ発現プラスミド（ｐＥＧＦＰ－Ｎ１，４．７ｋｂｐ）を導入した。液滴は、平面視した場合の直径が約１２ｍｍの略円形状で、ディッシュの底部から液滴の頂部までの高さが約１ｍｍであった。この液滴の直径付近を通る直線上に、約５００μｍおきに２５箇所のインジェクションポイントを設定した。また、この直線に直交し、液滴の直径付近を通る直線上に、同様に約５００μｍおきに１５箇所のインジェクションポイントを設定した。気泡発生部先端のディッシュの底部からの距離は約０．２ｍｍとした。方法の終了後に液滴を観察すると、残存したマイクロバブルがインジェクションポイントを設定したクロス形状に視認できた。また、インジェクションポイントに沿って、幅約２５０μｍの帯状にＧＦＰの蛍光が観察された（写真は示さず）。この実験から、細胞懸濁液中の浮遊細胞のみならず、接着細胞へのプラスミドのトランスフェクションも確認された。
　また、同様に、１ｎｇ／μＬのプラスミド、６０％（ｖ／ｗ）の増粘剤（ＡＦａ－１００２（Ｓｈｏｒｔ）、ＢＭａ－１００２（Ｌｏｎｇ）、ＢｉＮＦｉ－ｓ社）を添加したＰＢＳを作製した。２４時間培養後に、ＨｅＬａ細胞にＧＦＰ発現プラスミド（ｐＥＧＦＰ－Ｎ１，４．７ｋｂｐ）を導入した。培養は９６ウェルプレートにて行い、その際のプラスミドを含む培地量は１００μＬであった。インジェクションポイントにおいて、ＧＦＰの蛍光が観察された。図１２（ａ）、（ｂ）は、観察された蛍光写真を示す。
　（８）気泡発生部の先端構造の検討
　気泡発生部の先端構造の相違によるトランスフェクション効率への影響を検討した。図２（ａ）に示すように先端が平坦な構造の気泡発生部（ｒｅｓｅｒｖｉｏｒ＿０）、図２（ｂ）に示すように芯材２１の先端を管状部材２２の先端から４５μｍ延伸した構造の気泡発生部（ｒｅｓｅｒｖｉｏｒ＿＋４５）、及び図２（ａ）において、管状部材２２の先端を芯材２１の先端から４５μｍ延伸した構造の気泡発生部（ｒｅｓｅｒｖｉｏｒ＿－４５）を準備した。ｒｅｓｅｒｖｉｏｒ＿－４５には、芯材２１の先端面と管状部材２２の内壁面とで形成される、有底円筒状の空隙が存在しており、この構造は、特許文献１～３に開示された気泡発生部材の先端部空隙に相当する。
　０．２５×１０６ｃｅｌｌｓ／７μＬのＨｅＬａ細胞を含む細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液は、２１％（ｖ／ｗ）の増粘剤を添加した、または添加しないＯｐｔｉ－ＭＥＭにＨｅＬａ細胞を懸濁させて、細胞懸濁液を調製した。細胞濃度は、０．２５×１０６ｃｅｌｌｓ／７μＬとした。これらの細胞懸濁液に、気泡発生部の出力を１２Ｗとし、３種の気泡発生部を用いて、ＧＦＰ発現プラスミド（ｐＥＧＦＰ－Ｎ１，４．７ｋｂｐ）を導入した。
　図１３は、増粘剤を含む細胞懸濁液（２１％　ｔｈｉｃｋｅｎｅｒ、上段）、及び増粘剤を含まない細胞懸濁液（Ｎｏ　ｔｈｉｃｋｅｎｅｒ、下段）における、ＧＦＰ発現プラスミドのトランスフェクション２４時間後の細胞の蛍光写真である。図１４は、ＧＦＰ発現プラスミドのトランスフェクション４８時間後のトランスフェクション効率を示すグラフである。トランスフェクション効率は、上記（５）と同様に評価した。図１３、１４から、細胞懸濁液の粘度条件が同一の場合においては、先端が平坦な構造の気泡発生部及び芯材が延伸した構造の気泡発生部を用いてエレクトロメカニカルポレーションを行った場合のＧＦＰ発現プラスミドのＨｅＬａ細胞へのトランスフェクション効率は、管状部材が延伸した構造の気泡発生部を用いてエレクトロメカニカルポレーションを行った場合のトランスフェクション効率と比較して、より高いことが確認された。これらの中でも、２１％（ｖ／ｗ）の増粘剤を含む細胞懸濁液において、先端が平坦な構造の気泡発生部を用いてエレクトロメカニカルポレーションを行った場合、特に高いトランスフェクション効率が確認できた。
　（９）人工染色体の導入
　本発明に係る方法で、従来の遺伝子導入法では困難であった巨大サイズの人工染色体（ＰＣＴ１６、４８ｋｂｐのアルフォイドＤＮＡ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　Ｖｏｌｕｍｅ　４３，　Ｉｓｓｕｅ　１０，　２６　Ｍａｙ　２０１５，　Ｐａｇｅｓ　４９０９-４９２２）をＵＭＲ－１０６細胞にデリバリーすることができるかを確認した。２１％（ｖ／ｗ）の増粘剤を含む、細胞濃度が０．２５×１０６ｃｅｌｌｓ／７μＬの細胞懸濁液を調製した。前記（８）において使用した先端が平坦な構造の気泡発生部を備える導入装置を用い、４種類の条件で実験を行った。具体的には、１）人工染色体ＰＣＴ１６を細胞懸濁液に含めず、エレクトロメカニカルポレーションも行わない「Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ」、２）人工染色体ＰＣＴ１６を細胞懸濁液に含めるがエレクトロメカニカルポレーションは行わない「Ｃｏｎｔｒｏｌ」、３）人工染色体ＰＣＴ１６をを細胞懸濁液に含め、１２Ｗの出力でエレクトロメカニカルポレーションを実施した「ＰＣＴ１６＋１２Ｗ」、４）人工染色体ＰＣＴ１６を細胞懸濁液に含め、１２Ｗの出力でエレクトロメカニカルポレーション後にＧ４１８処理を実施した「ＰＣＴ１６＋１２Ｗ＋Ｇ４１８」という４つの条件である。エレクトロメカニカルポレーションは、３反復、実施した。ＰＣＴ１６の細胞へのデリバリーが達成されると、当該細胞が薬剤Ｇ４１８に耐性となるため、Ｇ４１８処理を実施しない実験区（条件３）と実施した実験区（条件４）を準備した。
　条件１）～４）の実験後、培養７２時間以上経過したＵＭＲ－１０６細胞サンプルから、ゲノムＤＮＡをアルカリ溶解法で抽出した。各条件由来の細胞について５０μＬの５０ｍＭ　ＮａＯＨを添加し９５℃で１０分加熱した。１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　（ｐＨ８．０）１０μＬを添加し、ボルテックスで攪拌した。遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分）後、上清４５μＬにイソプロパノール６０μＬを添加しボルテックスで攪拌した。再度遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分）し、上清を除去して５分間乾燥させた。乾燥物を４０μＬのＴＥ　ｂｕｆｆｅｒで溶解し、定量ＰＣＲ用のゲノムＤＮＡテンプレートとした。
　定量ＰＣＲにはＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。ＵＭＲ－１０６細胞特異的配列（ＦＧＦ２３）に対する人工染色体配列（ＰＣＴ　ｔｅｔＯ）の相対的な存在量は検量線法により算出した。ＦＧＦ２３部分配列を配列番号１及び２のプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、ゲル精製したものとｐＢＳ－ＳＴＤ５（ＰＣＴ　ｔｅｔＯ配列を含むプラスミド）を用意した。それぞれ１、１０、１００、１，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００、及び、１０，０００，０００倍の希釈系列を用意し、検量線作製用テンプレートとした。Ｐｏｗｅｒ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　（２ｘ，　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）５μＬとＤＮＡテンプレート４μＬ、配列番号３及び４、または配列番号５及び６のフォワード・リバースプライマーミックス（５μＭずつ）１μＬを混合し反応液とした。プライマーの配列及び配列番号を、表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　定量ＰＣＲのサイクル条件は、５０℃で２分、９５℃で２分のホールドステップに続いて、９５℃で３秒と６０℃で３０秒のアンプリフィケーションステップを４０回繰り返した。その後の、メルトカーブ解析として９５℃で１５秒、グラジエントで６０℃まで冷却した。データ解析はＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓのマニュアルに従って実施し、Ｃｔ値から各サンプル中に含まれるＤＮＡの相対量を算出した。ＰＣＴ　ｔｅｔＯ配列の存在量はＦＧＦ２３配列の存在量によってノーマライズした。Ｃｏｎｔｒｏｌ（人工染色体あり、エレクトロメカニカルポレーションなし）サンプルに対する比率を算出し最終的な値とした。
　図１５は、ｑＰＣＲの結果を示す。エレクトロメカニカルポレーションを実施した実験区では、いずれもＵｎｔｒｅａｔｅｄとＣｏｎｔｒｏｌと比較して、人工染色体の保持量が増加していた。これにより、本発明に係るデリバリー方法による、分子量が大きい人工染色体の細胞へのデリバリーが確認された。４８ｋｂｐという巨大な核酸の動物細胞株への導入は、従来の多くの遺伝子導入技術においては困難であった。本実施例により、本発明に係る導入装置を用いた、エレクトロメカニカルポレーションによるデリバリー方法の性能の高さが示された。
　２０　気泡発生部
　２１　芯材
　２２　管状部材
　３０　容器
　４０　対向電極
　５０　電力供給装置
　６０　制御装置
　１００　導入装置

Claims (10)

  1. 　気泡発生部と、
    　対向電極と、
    　前記気泡発生部と前記対向電極にそれぞれ接続された電力供給装置と
    　を備え、
    　前記気泡発生部は、
    　　導電材料からなり、アクティブ電極を形成する芯材と、
    　　絶縁材料からなり、前記芯材に沿って延在し前記芯材の周囲を覆う管状部材とから構成され、
    　　前記気泡発生部の長手方向において前記管状部材の先端の位置は前記芯材の先端の位置と略一致するか、または前記気泡発生部の長手方向において前記芯材の先端が前記管状部材の先端よりも延伸するように構成され、
    　前記気泡発生部は、前記気泡発生部の先端と前記対向電極が、細胞と標的物質とを含む液体に接触した状態で、前記電力供給装置から前記アクティブ電極に電圧が印加されることにより、前記気泡発生部の先端から気泡を生成するように構成されている、導入装置。
  2. 　前記電力供給装置に接続され、前記電力供給装置から前記アクティブ電極に印加される電圧を制御する制御装置をさらに備える、請求項１に記載の導入装置。
  3. 　標的物質の細胞へのデリバリー方法であって、
    　請求項１または２に記載の導入装置の、前記気泡発生部の先端と、前記対向電極とを、細胞と標的物質とを含む液体に接触させる工程と、
    　前記アクティブ電極と前記対向電極間に電圧を印加し、これにより前記液体内に電界を生成し、前記気泡発生部の先端において気泡を生成する工程と
    を含む、方法。
  4. 　前記電圧を印加する工程が、電圧パルスを印加する工程を含む、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記接触させる工程の前に、前記細胞と標的物質を含む液体のせん断粘度を、１０－２Ｐａ・ｓ～１０４Ｐａ・ｓに調整する工程を含む、請求項３に記載の方法。
  6. 　前記粘度を調整する工程が、前記細胞と標的物質を含む液体中の細胞濃度を変化させることにより、及び／または増粘剤を添加することにより、前記細胞と標的物質を含む液体の粘度を調整する工程を含む、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記細胞が、細胞壁を持つ細胞、ヒト間葉幹細胞、マウス胎児線維芽細胞、ラット骨肉腫細胞、ヒト子宮頚部癌細胞から選択される、請求項３に記載の方法。
  8. 　前記細胞が浮遊細胞であり、前記細胞と標的物質を含む液体が細胞懸濁液である、請求項３に記載の方法。
  9. 　前記細胞が接着細胞であり、前記細胞と標的物質を含む液体が、接着細胞を含有する液滴である、請求項３に記載の方法。
  10. 　前記標的物質が、核酸、アミノ酸、タンパク質、またはこれらの複合体である、請求項３に記載の方法。
     
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