WO2019244895A1 - 形質転換細胞の製造方法 - Google Patents

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WO2019244895A1
WO2019244895A1 PCT/JP2019/024134 JP2019024134W WO2019244895A1 WO 2019244895 A1 WO2019244895 A1 WO 2019244895A1 JP 2019024134 W JP2019024134 W JP 2019024134W WO 2019244895 A1 WO2019244895 A1 WO 2019244895A1
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cells
target
target molecule
cell
introduction
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雅文 神野
英政 加藤
佳美 徳澤
大西　章仁
純子 明上
佐藤　晋
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パール工業株式会社
株式会社ワイ’ズ
国立大学法人愛媛大学
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    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a transformed cell.
  • Methods for introducing target molecules such as nucleic acids and proteins into cells include biological techniques using viruses, physical techniques such as electroporation and microinjection, chemical techniques such as lipofection, and plasma.
  • a method Patent Document 1: Japanese Patent Application Laid-Open No. 2013-255475
  • target molecules have been introduced into cells and tissues for advanced medical treatments such as regenerative medicine and gene therapy, cells that have acquired new traits have been established, and treatments using those cells are being performed. .
  • the target molecule when the target molecule is introduced using electroporation, it has high cytotoxicity due to opening pores in the cell membrane, and damaged chromosomes are likely to take up the target molecule during the repair process.
  • the target molecule remaining in the cell causes problems such as impairing the traits held by the cell itself, causing immunological abnormalities and canceration of the cell, and thus hinders the practical application of advanced medicine such as regenerative medicine and gene therapy. I have.
  • Even in the case of a method using a virus which is generally used as a method for introducing a target molecule, there are limitations on the cell types that can be introduced, and the introduced nucleic acid or the viral vector used to introduce the gene is integrated into the chromosome. May be
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • an object of the present invention is to provide a method for producing a transformed cell that does not leave a target molecule introduced from the outside.
  • a method for producing a transformed cell comprising producing a transformed cell to which a trait has been imparted, deleted or maintained by introducing the target molecule.
  • the target molecule is at least one selected from the group consisting of nucleic acids and proteins.
  • the nucleic acid is a vector.
  • the vector expresses a protein that imparts, deletes, or maintains a trait in the cell.
  • [5] The production method according to any one of [2] to [4], wherein the nucleic acid is not inserted into the chromosome in 80% or more of the transformed cells.
  • [6] The production method according to any one of [1] to [5], wherein in the introduction step, the target molecule is introduced into the target cell via endocytosis.
  • the introduction step the target molecule is introduced by creeping discharge or plasma irradiation on the target cells.
  • the production method according to any one of [1] to [7] including a post-culture step of culturing the target cell after the introduction step.
  • the medium of the target cells contains a selection molecule capable of killing the cells.
  • the target molecule includes a selection marker molecule that becomes resistant to the selection molecule.
  • FIG. 3 is a schematic diagram illustrating an example of an apparatus used for introducing a target molecule.
  • FIG. 2 is a schematic side view and a top view illustrating a part of an apparatus used for introducing a target molecule in Example 1.
  • FIG. 4 is a flowchart illustrating a method of introducing a target molecule into a target cell in Test Example 1.
  • 5 is a fluorescence micrograph showing the expression of (A) GFP and (B) mCherry in HDF cells co-transfected with pCXLE-EGFP and pmCherry-C1 plasmids by creeping discharge in Test Example 1.
  • A Bright field micrographs of HDF cells before introduction of a target molecule and
  • Test Example 3 (A) a fluorescence micrograph showing the expression of mCherry and (B) a bright-field micrograph showing the expression of mCherry in L-929 cells into which the pmCherry-C1 plasmid was introduced by electroporation. (A) Fluorescence micrograph showing the expression of mCherry in L-929-mCherry cells, and (B) brightfield micrograph.
  • a fluorescence micrograph showing the expression of mCherry (B) a bright-field micrograph, and (C) a fluorescence micrograph showing the expression of GFP of L-929-mCherry cells into which the psgRNA1-2 plasmid was introduced by plasma irradiation. .
  • a Fluorescence micrograph showing the expression of GFP (B) fluorescence micrograph showing the expression of mCherry, and (C) light after long-term culture of L-929-mCherry cells transfected with psgRNA1-2 plasmid by plasma irradiation.
  • Field microscope photograph (D) These are composite photographs. In the part indicated by a circle in the figure, there are cells that show green fluorescence but do not show red fluorescence.
  • the production method of the present invention includes an introduction step of bringing a target molecule into contact with an introduction solution containing the target molecule and introducing the target molecule into the target cell, and the trait is imparted, deleted or maintained by the introduction of the target molecule. Produce transformed cells.
  • a transformed cell refers to a cell to which a trait has been imparted, deleted or maintained by the introduction of a target molecule, such as a cell having a changed gene expression, a cell having a changed form, a cell having a changed enzyme activity, Cells in which the localization of the molecule has changed are mentioned.
  • the transformed cell may or may not have a mutation in the genome of the target cell. It may be accompanied by epigenetic mutations such as DNA methylation, histone methylation and acetylation.
  • the transformed cells to which a new trait has been imparted include, for example, cells that have started to express one or more specific genes, stem cells (including pluripotent stem cells), progenitor cells, dedifferentiated cells, differentiation induction Cells and the like.
  • Cells in which the trait has been deleted include, for example, cells in which the expression of one or more specific genes has been suppressed, cells in which a mutant gene has been deleted from cells having a genetic mutation, and the like.
  • the transformed cells include cells in which the traits are changed as they are, in which the traits are maintained by the target molecule, and cells in which the traits have been added after the traits have been deleted.
  • a cell in which a causative gene has been deleted from a stem cell and a normal gene has been introduced is also included. Whether a cell is a transformed cell can be determined by methods known to those skilled in the art, such as morphological observation with a microscope, a method for quantifying the expression level of RNA or protein, and immunostaining.
  • the target molecule When the target molecule is not inserted into the chromosome of the transformed cell, for example, genomic DNA is extracted from the produced transformed cell, and qPCR targeting the nucleic acid sequence of the target molecule is performed to determine the copy number of the genomic DNA. It means that the relative amount of the target molecule is 0.1 or less when it is set to 1.
  • the proportion of cells in which no nucleic acid has been inserted into the chromosome is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 100%.
  • the target cell used in the production method of the present invention refers to a cell to which a target molecule is introduced, and is not limited to a specific type of cell.
  • Specific examples of such target cells include animal cells including humans.
  • Animal cells include, for example, cells forming tissues (fibroblasts, epidermal cells, mammary cells, adipocytes, myoblasts, osteoblasts, hepatocytes, cardiomyocytes, vascular endothelial cells or their precursor cells, etc.), immunity Lineage cells (B cells, T cells, monocyte cells, etc.), nerve cells, stem cells (including pluripotent stem cells, blood cell stem cells, mesenchymal stem cells, neural stem cells), tumor cells and the like.
  • the cells may be adherent cells or floating cells.
  • Target cells can be obtained, for example, by purchasing from a storage agency such as ATCC, JCRB, RIKEN BRC, or a commercial manufacturer.
  • a single type of target cell may be used, or a mixture of two or more types may be used to simultaneously introduce the target molecule into a plurality of target cells.
  • the target molecule refers to a molecule to be introduced into a target cell, and is not particularly limited to a specific type of molecule, but preferably comprises (a) a nucleic acid and (b) a protein. It is at least one selected from the group.
  • nucleic acid examples include DNA, RNA, other nucleic acid molecules, and derivatives thereof.
  • DNA or RNA may be single-stranded or double-stranded, and may be linear or circular.
  • the molecular weight of the nucleic acid is not particularly limited.
  • RNA includes messenger RNA (mRNA), ribozyme, small interfering RNA (siRNA), small hairpin RNA (shRNA), guide RNA (gRNA), antisense RNA, other non-coding RNA, and the like.
  • the nucleic acid may include a nucleic acid (DNA) transcribed as these RNAs. Further, the nucleic acid may include a nucleic acid (DNA or RNA) encoding the following protein. These nucleic acids may be introduced alone or in combination of two or more.
  • the nucleic acid is preferably a vector.
  • a vector is a medium for nucleic acid molecules for amplifying, maintaining, and introducing nucleic acids.
  • the vector is preferably an expression vector, into which a nucleic acid sequence expressing the target RNA or protein has been inserted.
  • expression vectors for example, plasmid vectors, cosmid vectors, bacterial artificial chromosomes (BAC), yeast artificial chromosomes (YAC) and other non-plasmid vectors can be used.
  • the expression vector has a structure (sequence) for efficiently expressing RNA or protein.
  • proteins include high molecular compounds in which amino acids such as peptides, polypeptides and derivatives thereof are polymerized.
  • the protein includes, but is not limited to, a variety of known proteins, and includes signal transducers, gene expression regulators (including transcription, translation, and transport), DNA methylation regulators, histone modification regulators, and factors used for genome editing. , Structural proteins, growth factors, hormones, enzymes, ligands, receptors, antibodies or Fab portions of antibodies, protein drugs that cannot be administered orally, and the like.
  • the protein introduced as the target molecule or the protein expressed from the introduced nucleic acid or vector is preferably a protein that imparts a trait to a cell, deleted or maintained, and more preferably a cell that is expressed by transient expression. Is a protein that imparts, deletes, or maintains a homeostatic trait.
  • Such proteins include transcription regulators (eg, SOX2, KLF4, L-Myc, OCT3 / 4, etc.), translation regulators (eg, Lin28, etc.), DNA methylation regulators (eg, TET1, etc.), and genome editing. (Eg, Cas9, etc.) and growth factors (eg, Activin, BMP4, etc.). These proteins may be introduced alone or in combination of two or more.
  • the genome editing system is a system for converting genetic information in a sequence-specific manner, and is capable of deleting a base sequence, replacing an amino acid sequence, introducing a foreign gene, and the like.
  • Examples of the genome editing system include, for example, zinc finger nuclease (Zinc-Finger, ZFN) capable of sequence-specific DNA cleavage, TALEN, Chrispar Cassine (CRISPR / Cas9), and Crisper CPF1 (CRISPER / Cpf1). ), Meganuclease, CAS9 nickase, Target-AID and the like.
  • a genome editing system encoding a gene necessary for a virus is introduced into a cell by infectivity of a virus, or a genome editing system encoding a gene required for a plasmid is used. Methods such as introducing the system into cells by electroporation have been used.
  • the gene transfer efficiency is high, but (1) facilities capable of performing experimental operations are limited, (2) a virus genome is introduced into cells, (3) retroviruses, etc. When used, there are problems such as the integration of the introduced gene and the virus genome into the chromosome, and (4) the cells that can be infected by the virus used are limited.
  • the target molecule is introduced into the target cell by contacting the target cell with an introduction solution containing the target molecule.
  • an introduction solution containing the target molecule means, for example, that the target molecule enters a cytoplasmic matrix or a nucleus and becomes capable of exerting a function.
  • the target molecule is preferably introduced into the target cell via endocytosis. Endocytosis is a function inherently possessed by living organisms, and does not damage cell membranes or chromosomal genes as in the electroporation method, so that cytotoxicity and denaturation / recombination of chromosomal genes can be suppressed.
  • the introduction step includes at least a step of contacting an introduction solution containing the target molecule with the target cells.
  • the target cells are cultured under appropriate conditions.
  • the method of pre-culturing the target cells is not particularly limited, and includes a method of culturing adherent cells in a cell culture vessel such as a petri dish or a plate, and a method of culturing floating cells in a state of being suspended in a culture solution.
  • the medium used for the culture is not particularly limited as long as it is a medium usually used for culturing target cells.
  • a solid medium such as an agar medium, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), RPMI 1640 Medium And a liquid medium such as Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM).
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • RPMI 1640 Medium a liquid medium
  • GMEM Glasgow Minimum Essential Medium
  • the culture medium can contain a known additive.
  • Feeder cells suitable for culture can also be used. Culture conditions such as culture time, culture temperature, and CO 2 concentration can be set as appropriate.
  • the medium may be removed with an aspirator or the like.
  • the target cells suspended in the medium are separated by centrifugation or filtration to remove the medium.
  • a method of dropping the target cell with the introduction solution containing the target molecule for example, a method of dropping the target cell with the introduction solution containing the target molecule, a method of mixing the target cell and the introduction solution, and the like can be used.
  • a method of adding an introduction solution containing the target molecule to a dispersion or suspension containing the target cells can also be used.
  • a step of introducing a target molecule is performed.
  • the introduction step of the present invention it is preferable to introduce the target molecule by creeping discharge or plasma irradiation on the target cells. These methods can suppress cell death because a reagent having cytotoxicity is not used.
  • the method of introduction by creeping discharge or plasma irradiation can maintain high gene transfer efficiency even with a large molecular weight vector (for example, 5 kDa or more, preferably 10 kDa or more), which is generally difficult to introduce a gene. Since the number of molecules to be introduced can be increased, transformed cells can be obtained more efficiently than conventional methods.
  • a general-purpose transfection reagent for example, a lipofection reagent
  • endocytosis can also be used as the introducing solution.
  • creeping discharge or plasma irradiation may or may not be used in the step of introducing the target molecule.
  • the method for introducing a target molecule using creeping discharge includes the steps of contacting the target cell with the liquid containing the target molecule and discharging the target cell and the liquid from the plurality of electrodes provided separately from the liquid. To act.
  • a plurality of electrodes are installed in a region where discharge can be applied to the introduced solution while the target cell and the introduced solution containing the target molecule are held in a cell culture container such as a petri dish.
  • a cell culture container such as a petri dish.
  • the container is not particularly limited as long as it has a structure capable of holding the introduced solution containing the target cell and the target molecule, and examples thereof include a plate, a petri dish, a tube, a test tube, and a flask. .
  • a voltage of about several kVpp to several tens of kVpp between the plurality of electrodes it is preferable to apply a voltage of about several kVpp to several tens of kVpp between the plurality of electrodes, more preferably 1 kVpp to 30 kVpp, and still more preferably. Is 3 kVpp to 10 kVpp.
  • a voltage higher than several tens of kVpp is applied, the killing rate of the target cells is increased.
  • a voltage lower than several kVpp the effect of improving the introduction rate of the target molecule cannot be obtained.
  • the step of generating a discharge from the plurality of electrodes is a step which is achieved substantially simultaneously by supplying a voltage between the plurality of electrodes. By applying such a voltage, the introduction of the target molecule can be achieved by causing a discharge between the electrode provided separately from the introduction solution containing the target molecule and the introduction solution containing the target molecule.
  • the discharge time is preferably 0.1 msec to 100 msec, more preferably 0.5 msec to 20 ms, and further preferably 1 msec to 5 msec.
  • a current is passed for a time longer than 100 msec, the killing rate of the target cell is increased.
  • a current is passed for a time shorter than 0.1 msec, the effect of improving the introduction rate of the target molecule cannot be sufficiently obtained.
  • FIG. 1 shows an example of an introduction device for creeping discharge.
  • the introduction device includes two needle-like electrodes 1, a power supply (voltage supply means) 2, and a container 3.
  • the voltage can be applied between the two electrodes by the power supply 2.
  • the structure of the introduction device is not limited to the structure shown in FIG.
  • the plurality of electrodes 1 provided in the introduction device shown in FIG. 1 are provided separately from an introduction liquid 5 containing a target molecule, and the electrodes are connected to the target molecule by applying a voltage between the plurality of electrodes.
  • the target molecule is introduced into cells by causing a discharge with an introduction solution containing the target molecule.
  • the introduction device is characterized in that, in the method for introducing a target molecule of the present invention, a plurality of electrodes 1 are provided separately on an introduction solution 5 containing a target molecule in contact with a target cell 4.
  • the electrode 1 is provided separately from the introduction liquid 5 containing the target molecule, and the electrode 1 generates a discharge 6 between the introduction liquid 5 containing the target molecule and the target 1 between the electrodes.
  • a molecule is introduced.
  • the shortest distance between the electrode 1 and the introduction liquid 5 containing the target molecule is 10 mm or less, and the electrodes 1 and the introduction liquid 5 are arranged so that they do not come into contact with each other.
  • the number of electrodes used in the introduction device is not limited to two, and the number of electrodes is preferably two or more. By setting the number of electrodes to 2 or more, it becomes possible to make the introduction uniform without the necessity of operations such as sample rotation and the like, and the introduction rate of the target molecule is further improved, and the death rate of the target cells is reduced. .
  • the number of electrodes used in the introduction device may be the same as the number of positive electrodes and the number of negative electrodes, or the numbers of positive and negative electrodes may be different.
  • a resistor 22 is provided between the power supply 2 and the electrode 1 so that the current is concentrated on a specific electrode and uniform introduction of the target molecule is not hindered. It is preferable to make adjustments so as to flow uniformly. Note that a coil, a capacitor, or the like may be used instead of the resistor 22.
  • the structure of the introduction device is not limited to the structure described in the present embodiment.
  • the number and the arrangement of the electrodes may be mutually different as long as the same effects as in the present embodiment can be obtained.
  • Other different shapes may be used.
  • the power supply 2 includes a rectifier.
  • the target cells are hardly dried since no gas injection or the like is required, so that unnecessary addition of a buffer or the like is unnecessary.
  • processing can be performed in a short time, and the electrode configuration can be simplified without requiring a special configuration.
  • Step of contacting an aggregate consisting of one or more selected from the group consisting of charged particles, excited atoms and excited molecules with the introduced solution and target cells the aggregate, ie, plasma, is irradiated from the upper microelectrode to the introduction solution containing the target molecule and the target cells.
  • the position of the upper fine electrode is adjusted to a desired position of the introduction liquid.
  • the bottom electrode may be provided on the opposite side of the upper microelectrode across the container containing the target cells.
  • a voltage is applied to the upper fine electrode to generate plasma.
  • the aggregate precursor may be ejected from the ejection port toward the introduced liquid and the target cells.
  • the aggregate precursor is a precursor for generating an aggregate consisting of one or more selected from the group consisting of charged particles, excited atoms and excited molecules, for example, air, nitrogen gas, oxygen gas, and dioxide.
  • Examples include a gas containing at least one selected from the group consisting of carbon gas, helium gas, neon gas, argon gas, krypton gas, and xenon gas.
  • the combination of gases is not limited to these, and a solid or liquid may be included in the precursor.
  • a voltage is applied to the aggregate precursor, an aggregate including one or more members selected from the group consisting of charged particles, excited atoms, and excited molecules is generated.
  • the aggregate may be generated by applying energy to the aggregate precursor, and the method of applying energy may not be voltage application.
  • the aggregate precursor is supplied at a predetermined flow rate to the inner hole of the upper fine electrode, for example, by an aggregate precursor supply device connected to the inner hole of the hollow pipe-shaped upper fine electrode, and is discharged from the ejection port. It is gushing.
  • the outer diameter of the upper fine electrode is preferably 1 mm or less, more preferably 100 ⁇ m or less. Further, the ejection amount of the aggregate precursor for each upper fine electrode is preferably 100 sccm or less.
  • an aggregate is generated from the aggregate precursor (for example, He gas) by applying a voltage between the upper fine electrode and the bottom electrode.
  • the aggregate (one or more aggregates selected from the group consisting of charged particles, excited atoms, and excited molecules) comes into contact with the introduced solution and target cells, and acts to cause the target molecules to reach the target cells. be introduced.
  • the applied voltage is preferably about several kV to several tens kV, more preferably 2 kV to 30 kV, and further preferably 5 to 20 kV.
  • the kill rate of the target cell increases, and when a current is applied at a voltage lower than several tens of kV, the effect of improving the introduction rate of the target molecule is obtained. Can not.
  • the step of generating the aggregate is a step which is achieved almost simultaneously by the step of applying the voltage.
  • the aggregate one or more aggregates selected from the group consisting of charged particles, excited atoms and excited molecules
  • the introduction rate of the target molecule can be significantly improved, and the kill rate of the target cell can be significantly reduced.
  • the target protein can be efficiently expressed and stably present in the cells, whereby transformed cells can be efficiently established, and the animal cells can be efficiently improved by improving cell functions. It can exert its effects in maintaining health, improving constitution, and preventing diseases.
  • the present introduction method is not limited to the use described in the present embodiment and the examples, and can be used for the purpose of imparting functions to cells.
  • the target molecule introducing device by plasma discharge has a structure and a function suitably used in the above-described target molecule introducing method, and is preferably provided on a container and an opening side of the container at a distance from the introduced liquid. And a voltage supply means (power supply), and a bottom electrode provided on the opposite side of the container from the upper fine electrode.
  • a voltage supply means power supply
  • a bottom electrode provided on the opposite side of the container from the upper fine electrode.
  • the interelectrode voltage, the electrode distance, the frequency, and the pulse period are set so that the conditions of the aggregate irradiated to the target cell can be changed according to the type of the target cell and the type of the target molecule. , Duty, etc., can be changed.
  • the range of target cells into which the target molecule is introduced can be adjusted by vertically moving one or more upper fine electrodes up and down. For this reason, it is preferable that the shortest distance between the upper microelectrode, the introduced solution and the target cells is set to 5 mm or less.
  • the number of upper fine electrodes may be singular or plural.
  • a large number of upper microelectrodes are provided, it becomes possible to simultaneously introduce a target molecule into a large number of target cells.
  • a large number of upper microelectrodes allow introduction of a target molecule into a wide range of target cells.
  • the container containing the introduced solution and the target cells may have one or more sample holding portions for holding the target cells, and in this case, one or more sample holding portions may be provided at positions corresponding to the sample holding portions.
  • a plurality of upper fine electrodes are provided.
  • the introduction device includes an up-down drive mechanism that drives the upper fine electrode and the container relatively up and down. That is, it is preferable to include a position adjusting means for the container for the introduced liquid and / or a position adjusting means for the upper fine electrode. Thereby, the distance between the upper fine electrode and the introduction liquid can be optimized.
  • the production method of the present invention preferably includes a post-culture step of the target cell after the introduction step.
  • the culture is performed, for example, for 4 hours or more and 2 months or less, preferably 3 days or more and 1 month or less after the target cells into which the target molecule has been introduced. During this time, it is preferable to perform appropriate medium exchange every few days. Culture conditions such as culture temperature and CO 2 concentration can be appropriately set.
  • the medium of the target cells preferably contains the selection molecule.
  • the selection molecule is not particularly limited as long as it eliminates cells into which the target molecule has not been introduced by suppressing cell proliferation, killing, or inducing apoptosis. Thereby, only the cells into which the target molecule has been introduced can be selected and cultured, so that the production efficiency of the target transformed cells can be improved.
  • the selection molecule when the following antibiotic resistance gene is included as a target molecule, neomycin, neomycin analog G418, hygromycin, puromycin, blasticidin, and other antibiotics can be used as the selection molecule.
  • the concentration of the selected molecule and the culturing time vary depending on the cell.
  • the target molecule preferably contains a selectable marker molecule that is resistant to the selected molecule.
  • the selection marker molecule is a molecule for screening a target cell into which the target molecule has been introduced.
  • Examples of the selectable marker molecule include a neomycin resistance gene, a puromycin resistance gene, a blasticidin resistance gene, and the like.
  • the selectable marker molecule may be inserted on the same vector as the vector into which the gene for imparting, deleting or maintaining the trait to the target cell has been inserted. In this case, the target cells into which the target molecule has been introduced can be selected more accurately.
  • the production method of the present invention preferably includes a step of isolating transformed cells.
  • target cells into which the target molecule has been introduced or cells that have been post-cultured are cloned.
  • a method for the monocloning a method known to those skilled in the art can be used.
  • cells can be cloned by an ultra-dilution method, a single colony pickup, or the like.
  • the target transformed cells can be determined according to the morphology, the target cells visually determined can be picked up. Whether the isolated cells have obtained the desired trait can be confirmed by a known method.
  • Test Example 1 gene transfer was performed by creeping discharge using the transfer device shown in FIG. In plasma irradiation using the upper microelectrode, the discharge range was small and the number of cells into which the gene could be introduced was small. Therefore, in this test example, gene transfer to a large number of cells was attempted using surface discharge. A 3.5 cm plastic petri dish was used for the container of this test example, and human dermal fibroblast HDF cells were used as target cells. As shown in FIG. 2, in this test example, an introduction device in which two positive electrodes 11 and two negative electrodes 12 were arranged and a total of four electrodes were arranged was used. The distance between the positive and negative electrodes is about 27 mm.
  • FIG. 4A shows cells expressing GFP
  • FIG. 4B shows cells expressing mCherry.
  • large-sized plasmids are difficult to introduce into cells, but in the surface discharge method, large plasmids of about 10.9 kbp (7 million Da or more) can be reduced by reducing the amount of small plasmids of 4.7 kbp. It was found that the cells can be introduced into target cells with a certain degree of efficiency.
  • the same device as in Test Example 1 was used. Thereafter, 2 mL of the culture solution was promptly added, and the culture was returned to the CO 2 incubator and cultured for 24 hours. The cells after the culture are observed under a microscope to confirm the cells into which the selectable marker has been introduced. Then, 2 mL of a D-MEM high glucose medium containing 100 to 1000 ⁇ g / mL G418 is added, and the cells are cultured for 24 to 72 hours. did.
  • Genomic DNA extraction kit The genomic DNA of the cells was extracted using DNeasy Blood & Tissue kit (QIAGEN, cat. No. 69504) according to the protocol. Specifically, 20 ⁇ L of the attached protease K was added, and the mixture was gently mixed with a vortex mixer (Scientific Industries, Digital VORTEX-GENIE 2) and uniformly mixed. Spin down and let stand for 5 minutes at room temperature. 4 ⁇ L of RNase ⁇ A (QIAGEN, cat. No. 19101) (sold separately) was added, and the mixture was gently vortexed and mixed uniformly.
  • the mixture was spun down with a tabletop centrifuge (greiner bio-one, myFUGE mini centrifuge, C1008-B) and allowed to stand at room temperature for 2 to 5 minutes. 200 ⁇ L of Buffer # AL included in the kit was added, and the mixture was immediately intermittently applied to a vortex mixer for 15 seconds. Spin down and incubate in a heat block (ASTEC, Block Incubator BI-525) for 10 minutes at 56 ° C. Spin down, add 200 ⁇ L of 100% ethanol and immediately vortex mixer for 15 seconds intermittently. Spin down and transfer lysate to QIAamp ⁇ Mini ⁇ spin ⁇ column provided with kit.
  • the lysate was passed through the column by centrifugation (Thermo Scientific, Sorvall @ ST8FR) at 6000 g for 1 minute at room temperature.
  • the column was transferred to a new 2 mL collection tube attached to the kit, and 500 ⁇ L of Buffer AW1 was added.
  • the lysate was passed through the column.
  • the column was transferred to a new 2 mL collection tube attached to the kit, and 500 ⁇ L of Buffer AW2 was added.
  • the mixture was centrifuged at 20,000 g for 3 minutes at room temperature, and transferred to a new 2 mL tube (eppendorf, Safe-Lock @ Tubes).
  • the column was centrifuged at 20,000 g for 1 minute at room temperature, and the column was transferred to a new 1.5 mL tube (WATSON, 131-715C). 100 to 200 ⁇ L of Buffer @ AE was added and left at 60 ° C. for 10 minutes. Centrifugation was performed at 6,000 g for 1 minute to extract genomic DNA.
  • Genomic DNA was quantified with a microspectrophotometer (IMPLEN, NanoPhotometer P-Class) and diluted to 10 ng / ⁇ L with DDW.
  • QPCR was performed using 20 ng of genomic DNA per reaction.
  • As a qPCR reagent THUNDERBIRD SYBR qPCR mix (TOYOBO) was used.
  • TOYOBO THUNDERBIRD SYBR qPCR mix
  • 10 ⁇ L reaction system 2 ⁇ L of 10 ng / ⁇ L genomic DNA was used.
  • the reaction conditions were: 95 ° C.-60 seconds: 1 cycle, (95 ° C.-15 seconds, 60 ° C.-45 seconds): 40 cycles.
  • the analysis system used was a CFX96 real-time PCR analysis system (BIO-RAD).
  • pEP4-SF1 TTCCACGAGGGGTAGTGAACC
  • pEP4-SR2 CAGGCGAAGATTCAGGAGAG
  • CFTRexon24-F GGCAGTACGATTCCATCCAG
  • CFTRexon24-R GAAAGAGCTTCACCCTGTCG
  • the copy number was calculated by doubling the relative amount of the episomal vector relative to the chromosomal gene CFTR.
  • a cell line having an episomal vector / CFTR ratio of 0.1 copy or less is defined as a cell in which the target molecule does not remain in the cell.
  • the ratio of the cell line in which the vector remained in the cells was compared between the iPS cells produced by the introduction method of the present application and iPS cells established using the electroporator Nucleofector 2b (Lonza). As shown in Table 2, the residual ratio of the episomal vector of the iPS cell line established by creeping discharge showed a very low value as compared with the iPS cells established using the electroporator.
  • the remaining amount of episomal vector may depend on the length of the culture period. However, the residual amount of the episomal vector at the time of preparing the frozen cell stock was 0.1 copy or less in about 90% of the iPS cells produced using the present invention. This result indicates that the present invention is a technology that is less likely to cause chromosomal integration of a foreign gene and is safer than the conventional method.
  • the red fluorescent protein gene is integrated into the chromosome of the cell 101 that does not show fluorescence, and the cell (target cell) 102 that constantly shows red fluorescence is established.
  • a genome editing plasmid having a sequence for knocking out a red fluorescent protein and a green fluorescent protein gene sequence is constructed.
  • the constructed plasmid is introduced into the cells 102 that show red fluorescence.
  • Cells into which the plasmid has been introduced become cells 103 that exhibit red and green fluorescence.
  • the reaction solution containing the cells after the application was suspended in 4.9 mL of MEM medium containing serum, and 100 ⁇ L of each was seeded on a 96-well plate, and cultured at 37 ° C. for 48 hours in a CO 2 incubator.
  • the transfection efficiency of the pmCherry-C1 plasmid was 30%, and the cell viability was 65%.
  • the cells were collected from the wells and cultured in a 10 cm Petri dish for 10 months in a 10 mL serum-containing MEM medium (containing 200 ⁇ g / mL G-418).
  • FIG. 8A shows cells expressing mCherry and showing red fluorescence
  • FIG. 8B shows cells under a bright-field microscope.
  • plasmid psgRNA1-2 for genome editing L-929-mCherry cells (1.3 ⁇ 10 4 cells) were seeded on a 96-well plate, and cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours. After aspirating the medium from the wells, 5 ⁇ L of the psgRNA1-2 plasmid (1 ⁇ g / ⁇ L) was added, set in a plasma irradiation apparatus, and irradiated with plasma at 30 kV and 30 msec. As the plasma irradiation device, the same device as that described in JP-A-2013-255475 was used.
  • transformed cells used for regenerative medicine or gene therapy eg, iPS cells, cells differentiated from iPS cells, etc.
  • vectors such as transgenes and viruses remaining, which are used for regenerative medicine or gene therapy.
  • a target molecule can be easily introduced, and as a result, cells to which a trait has been imparted or deleted can be easily produced.
  • the target cells such as foreign genes are not retained in the established cells, the possibility of causing the above-mentioned problems in practical use is extremely low.

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Abstract

目的分子を含む導入液と標的細胞とを接触させて、前記標的細胞に前記目的分子を導入する導入工程を含み、前記導入工程では、前記目的分子はエンドサイトーシスを介して前記標的細胞に導入され、前記目的分子の導入により形質が付与、欠失または維持された後に、外部から加えられたベクター等の目的分子が樹立された細胞に残存しない形質転換細胞を製造する方法を提供する。

Description

形質転換細胞の製造方法
　本発明は、形質転換細胞の製造方法に関する。
　細胞内に核酸やタンパク質などの目的分子を導入する手法としては、ウイルスを用いた生物学的手法、エレクトロポレーションやマイクロインジェクションなどの物理学的手法、リポフェクションなどの化学的手法、プラズマを用いた方法（特許文献１：特開２０１３－２５５４７５号公報）などが知られている。近年、再生医療や遺伝子治療などの先端医療のために細胞や組織に目的分子を導入して、新たな形質を獲得した細胞を樹立し、それらの細胞を用いた治療などが行われようとしている。
特開２０１３－２５５４７５号公報
　しかしながら、エレクトロポレーションを用いて目的分子を導入した場合、細胞膜に細孔を開けることから高い細胞障害性を有し、また、障害を受けた染色体は、修復過程で目的分子を取り込みやすいことが知られている。細胞内に残存した目的分子は細胞自身が保持する形質を損ねたり、免疫異常や細胞の癌化を引き起こすといった問題が生じるため、再生医療や遺伝子治療などの先端医療の実用化の妨げとなっている。一般に目的分子の導入方法として用いられているウイルスを用いた導入方法の場合でも、導入できる細胞種に制限があり、導入された核酸や、遺伝子を導入するために用いたウイルスベクターが染色体に組み込まれることがある。
　そのため、新たな形質が付与された細胞、例えばｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ（ｉＰＳ細胞）等を用いた再生医療や細胞医療のような先端医療を、実用化できる医療技術として確立するために、外来遺伝子が残存しない導入方法を用いたｉＰＳ細胞や分化細胞等の形質転換細胞の簡便な製造方法の確立が望まれている。
　そこで本発明は、外部から導入された目的分子を残存させない形質転換細胞の製造方法を提供することを目的とする。
［１］目的分子を含む導入液と標的細胞とを接触させて、前記標的細胞に前記目的分子を導入する導入工程を含み、
　前記目的分子の導入により形質が付与、欠失または維持された形質転換細胞を製造する、形質転換細胞の製造方法。
［２］目的分子は、核酸およびタンパク質からなる群より選ばれる少なくとも１つである、［１］に記載の製造方法。
［３］核酸はベクターである、［２］に記載の製造方法。
［４］ベクターは、細胞に形質を付与、欠失または維持させるタンパク質を発現する、［３］に記載の製造方法。
［５］形質転換細胞の８０％以上の細胞において、核酸が染色体に挿入されない、［２］～［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］導入工程では、目的分子はエンドサイトーシスを介して標的細胞に導入される、［１］～［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］導入工程では、標的細胞への沿面放電またはプラズマ照射によって、目的分子を導入する、［１］～［６］のいずれかに記載の製造方法。
［８］導入工程後に標的細胞を培養する後培養工程を含む、［１］～［７］のいずれかに記載の製造方法。
［９］後培養工程では、標的細胞の培地は細胞を死滅させることができる選択分子を含む、［８］に記載の製造方法。
［１０］目的分子は、選択分子に対して耐性となる選択マーカー分子を含む、［１］～［９］のいずれかに記載の製造方法。
　本発明によれば、外部から導入された目的分子を残存させない形質転換細胞の製造方法を提供することができる。
目的分子の導入に用いた装置の一例を説明する概略図である。 実施例１の目的分子の導入に用いた装置の一部を説明する概略側面図および上面図である。 試験例１における標的細胞への目的分子の導入方法を説明するフロー図である。 試験例１において、沿面放電によってｐＣＸＬＥ－ＥＧＦＰおよびｐｍＣｈｅｒｒｙ－Ｃ１のプラスミドを共トランスフェクションしたＨＤＦ細胞の（Ａ）ＧＦＰおよび（Ｂ）ｍＣｈｅｒｒｙの発現を示す蛍光顕微鏡写真である。 （Ａ）目的分子の導入前のＨＤＦ細胞および（Ｂ）導入後のｉＰＳ細胞の明視野顕微鏡写真である。 エピゾーマルベクターのコピー数をｑＰＣＲにより測定したグラフである。ゲノムＤＮＡ量を１とした相対量を示す。 試験例３を説明する概略図である。 試験例３において、ｐｍＣｈｅｒｒｙ－Ｃ１プラスミドをエレクトロポレーションにより導入したＬ－９２９細胞の（Ａ）ｍＣｈｅｒｒｙの発現を示す蛍光顕微鏡写真、（Ｂ）明視野顕微鏡写真である。 Ｌ－９２９－ｍＣｈｅｒｒｙ細胞の（Ａ）ｍＣｈｅｒｒｙの発現を示す蛍光顕微鏡写真、（Ｂ）明視野顕微鏡写真である。 プラズマ照射によってｐｓｇＲＮＡ１－２プラスミドを導入したＬ－９２９－ｍＣｈｅｒｒｙ細胞の（Ａ）ｍＣｈｅｒｒｙの発現を示す蛍光顕微鏡写真、（Ｂ）明視野顕微鏡写真、（Ｃ）ＧＦＰの発現を示す蛍光顕微鏡写真である。 プラズマ照射によってｐｓｇＲＮＡ１－２プラスミドを導入したＬ－９２９－ｍＣｈｅｒｒｙ細胞を長期培養した後の（Ａ）ＧＦＰの発現を示す蛍光顕微鏡写真、（Ｂ）ｍＣｈｅｒｒｙの発現を示す蛍光顕微鏡写真、（Ｃ）明視野顕微鏡写真、（Ｄ）これらの合成写真である。図中に丸で示した部分に、緑色蛍光を示すが、赤色蛍光を示さない細胞が存在する。
　以下、本発明の実施形態について、図面を参照して説明する。
　本発明の製造方法は、目的分子を含む導入液と標的細胞とを接触させて、標的細胞に目的分子を導入する導入工程を含み、目的分子の導入により形質が付与、欠失または維持された形質転換細胞を製造する。
　本発明において、形質転換細胞とは、目的分子の導入により形質が付与、欠失または維持される細胞をいい、例えば遺伝子発現が変化した細胞、形態が変化した細胞、酵素活性が変化した細胞、分子の局在が変化した細胞等が挙げられる。形質転換細胞は、標的細胞のゲノムに変異を伴ってもよいし、伴わなくてもよい。ＤＮＡのメチル化、ヒストンのメチル化およびアセチル化等のエピジェネティックな変異を伴ってもよい。新たな形質が付与された形質転換細胞には、例えば特定の１または２以上の遺伝子を発現するようになった細胞、幹細胞（多能性幹細胞を含む）、前駆細胞、脱分化細胞、分化誘導された細胞などが含まれる。形質が欠失された細胞には、例えば特定の１または２以上の遺伝子の発現が抑制された細胞、遺伝子変異をもつ細胞から変異遺伝子を欠失した細胞などが含まれる。また、形質転換細胞としては、そのままでは形質が変化してしまう細胞を目的分子により形質を維持させた細胞、形質を欠失後に形質を付与された細胞等も含まれ、例えば遺伝病の患者の幹細胞から原因遺伝子を欠失させ、正常遺伝子を導入した細胞も含まれる。形質転換細胞であるかは、顕微鏡による形態観察、ＲＮＡまたはタンパク質の発現量を定量する方法、免疫染色などの当業者に公知の方法によって判断することができる。
　形質転換細胞において、目的分子が残存しないとは、目的分子の導入から一定期間培養した後に、公知の方法により測定された目的分子の量が検出限界以下または一定の検出値以下であることをいう。標的細胞内の目的分子の濃度や安定度によるが、例えば導入から１週間、好ましくは２週間以上培養した後に、細胞のクローニングを行い、目的分子の残存確認を行うとよい。核酸を目的分子として用いた場合、目的分子が残存しないとは、例えば形質転換細胞の染色体に導入した核酸が挿入されていないことをいう。目的分子が形質転換細胞の染色体に挿入されていないとは、例えば製造された形質転換細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、目的分子の核酸配列を標的とするｑＰＣＲを行って、ゲノムＤＮＡのコピー数を１としたときの目的分子の相対量が０．１以下である場合をいう。得られた形質転換細胞のうち、染色体に核酸が挿入されていない細胞の割合は、好ましくは８０％以上であり、より好ましくは９０％以上であり、最も好ましくは１００％である。
　（標的細胞）
　本発明の製造方法において用いる標的細胞とは、目的分子を導入する標的となる細胞のことを示し、特定の種類の細胞に限定されるものではない。このような標的細胞の具体例としては、ヒトを含む動物細胞が挙げられる。動物細胞としては、例えば組織を作る細胞（線維芽細胞、表皮細胞、乳腺細胞、脂肪細胞、筋芽細胞、骨芽細胞、肝細胞、心筋細胞、血管内皮細胞またはそれらの前駆細胞等）、免疫系の細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球系の細胞等）、神経細胞、幹細胞（多能性幹細胞、血球系幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞を含む）、腫瘍細胞等が挙げられる。細胞は接着細胞であってもよく、浮遊細胞であってもよい。標的細胞は、例えばＡＴＣＣ、ＪＣＲＢ、ＲＩＫＥＮ　ＢＲＣなどの保存機関または市販のメーカーから購入することによって得ることができる。標的細胞は、単一の種類を用いてもよいし、２種以上を混合して用いて、複数の標的細胞に同時に目的分子の導入を行うこともできる。
　標的細胞には、生物の個体または組織から採取された細胞、および生物の個体または組織内の細胞が含まれる。生物の個体または組織から採取された細胞には、医薬品の研究開発などに用いられる生物の個体に戻すことを前提としない細胞と、再生医療などに用いられる生物の個体に戻すことを前提とする細胞とが含まれる。生物の個体または組織から採取された細胞には、生物の個体または組織から採取された細胞から培養された細胞も含まれる。
　本発明に用いる標的細胞には、大腸菌、放線菌、枯草菌などの原核細胞、酵母などの微生物細胞、昆虫細胞、マウス、ウサギ、ラット、ヤギ、イヌ、サルなどの哺乳類細胞、植物細胞などの真核細胞が含まれる。
　また、本発明に用いる標的細胞は、特に処理を施されていないものであってもよいが、目的分子の導入効率を向上するためには、遺伝子導入の際に一般的に用いられる、コンピテントセルとしての処理を施されたものであってもよい。具体例としては、塩化カルシウムで処理され、細胞膜の構造が変化してＤＮＡ分子を透過しやすくなった大腸菌のコンピテントセルなどが挙げられる。
　本発明において、標的細胞は、目的分子を導入する標的となる標的組織も含む。本発明における組織とは、何種類かの異なった性質や機能を有する細胞が一定の様式で集合した構造の単位である。標的組織としては、特定の種類の組織に限定されるものではない。このような標的組織の具体例としては、生体から回収した組織、生体内の組織、移植に用いられるドナーからの臓器、培養により再構成された組織、カルス培養で構築された植物の分化前の組織などが挙げられる。標的組織としては、例えば胎生組織、胚組織、皮膚組織、骨組織、軟骨組織、筋肉組織、脂肪組織、心筋組織、神経系組織、肺組織、膵臓組織、肝臓組織、毛乳頭組織、歯髄、腫瘍組織などの組織が例示できる。これらの標的組織は、単一の種類を用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。標的細胞として組織を用いた場合、目的分子の導入により、形質が付与または欠損された組織が製造される。
　（目的分子）
　本発明において目的分子とは、標的細胞に導入する対象となる分子のことを示し、特に特定の種類の分子に限定されるものではないが、好ましくは（ａ）核酸および（ｂ）タンパク質からなる群より選ばれる少なくとも１つである。
　（ａ）核酸
　核酸の具体例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、その他の核酸分子またはそれらの誘導体が挙げられる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、一本鎖または二本鎖であってもよく、また線状または環状であってもよい。核酸の分子量は特に限定されない。ＲＮＡには、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボザイム、ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｓｍａｌｌ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、その他のｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ　ＲＮＡなどが含まれる。核酸としては、これらのＲＮＡとして転写される核酸（ＤＮＡ）を含んでいてもよい。また、核酸は、下記のタンパク質をコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含んでいてもよい。これらの核酸は、１つまたは２つ以上を組み合わせて導入してもよい。
　核酸は、好ましくはベクターである。ベクターとは、核酸を増幅、維持、導入させるための核酸分子の媒体である。本発明において、ベクターは好ましくは発現ベクターであり、目的のＲＮＡまたはタンパク質を発現する核酸配列が挿入されている。発現ベクターとしては、例えばプラスミドベクター、コスミドベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）および他の非プラスミドベクターを使用できる。発現ベクターはＲＮＡまたはタンパク質を効率的に発現するための構造（配列）を有する。このような配列としては、例えばプロモーター配列、コザック配列、シャイン・ダルガノ配列、イントロン、スペーサー配列、エンハンサー配列、ターミネーター配列、内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）などが含まれる。
　（ｂ）タンパク質
　タンパク質としては、ペプチド、ポリペプチドおよびその誘導体などのアミノ酸が重合した高分子化合物が挙げられる。タンパク質は、特に限定されないが公知の多様なタンパク質を含み、シグナル伝達物質、遺伝子発現制御因子（転写、翻訳、輸送を含む）、ＤＮＡメチル化調節因子、ヒストン修飾調節因子、ゲノム編集に用いられる因子、構造タンパク質、成長因子、ホルモン、酵素、リガンド、受容体、抗体または抗体のＦａｂ部分、経口投与ができないタンパク質医薬品などが含まれる。
　目的分子として導入されたタンパク質、または、導入された核酸またはベクターから発現したタンパク質は、好ましくは細胞に形質を付与、欠失または維持させるタンパク質であり、より好ましくは一過的な発現によって、細胞に恒常的な形質を付与、欠失または維持させるタンパク質である。このようなタンパク質としては、転写調節因子（例えばＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌ－Ｍｙｃ、ＯＣＴ３／４等）、翻訳調節因子（例えばＬｉｎ２８等）、ＤＮＡメチル化調節因子（例えばＴＥＴ１等）、ゲノム編集に用いられる因子（例えばＣａｓ９等）、増殖因子（例えばＡｃｔｉｖｉｎ、ＢＭＰ４等）が挙げられる。これらのタンパク質は１つまたは２つ以上を組み合わせて導入してもよい。
　他の目的分子としては、糖、脂質、低分子生理活性物質、薬剤候補品などが挙げられ、これらの中でも医薬品などの生理活性な低分子化合物（例えば分子量が１００ｋＤａ以下）であって、他の導入方法では組織内あるいは細胞内に導入されづらい低分子化合物が好ましい。他の導入方法では組織内あるいは細胞内に導入されづらい低分子化合物とは、分子量が１０００Ｄａ以上の低分子、膜透過性の低い分子などである。上述の各種目的分子は、単一の種類を用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。
　目的分子として、ゲノム編集システムを用いてもよい。ゲノム編集システムとは、配列特異的に遺伝情報を変換するシステムであり、塩基配列の欠失、アミノ酸配列の置換、外来遺伝子の導入等が可能である。ゲノム編集システムとしては、例えば配列特異的なＤＮＡ切断が可能なジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｚｉｎｃ－Ｆｉｎｇｅｒ、ＺＦＮ）、ターレン（ＴＡＬＥＮ）、クリスパー・キャスナイン（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）、クリスパー・シーピーエフ１（ＣＲＩＳＰＥＲ／Ｃｐｆ１）、メガヌクレアーゼ（Ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＣＡＳ９ニッカーゼ及びＴａｒｇｅｔ－ＡＩＤ等が挙げられる。
　一般的に、ゲノム編集システムを細胞内に導入する方法としては、ウイルスに必要な遺伝子をコードしたゲノム編集システムをウイルスの感染力により細胞に導入させる、またはプラスミドに必要な遺伝子をコードしたゲノム編集システムをエレクトロポレーション法により細胞に導入させる、等の方法が用いられている。
　ウイルスを用いて導入する方法では、遺伝子の導入効率は良いが、（１）実験操作ができる施設が限定される、（２）ウイルスゲノムが細胞内に導入される、（３）レトロウイルス等を用いた場合にはウイルスゲノムをはじめ導入された遺伝子等が染色体にインテグレーションされる、（４）用いるウイルスによって感染できる細胞が限定される等の問題がある。エレクトロポレーション法によって導入する方法では、（１）実施には１×１０６細胞という大量の細胞が必要であり、細胞の死滅の割合が高く、生体由来の細胞や生体への直接導入は難しい、（２）プラスミドの大きさ（サイズ）によっては導入効率の大幅な低下が見られる、（３）導入された遺伝子等が染色体にインテグレーションされる等の問題がある。
　また、ゲノム編集技術の大きな問題点としては、標的とする遺伝子以外の遺伝子にも変異を起こすこと（オフターゲッティング）が指摘され、医療などへの実用化の阻害要因になっている。オフターゲットの原因の１つとして、導入されたゲノム編集システムおよびウイルスゲノムやベクターのＤＮＡ等が染色体にインテグレートされ、細胞内で恒常的にゲノム編集システムが発現し続けていることが挙げられる。
　本発明によれば、ゲノム編集システムを高効率に導入することにより標的遺伝子を編集し、ゲノム編集が完了した後はゲノム編集システムが細胞内に残存しない形質転換細胞を簡便に得ることができる。
　（導入液）
　目的分子を含む導入液は、特に限定されるものではないが、水、水溶液、培地などの適当な媒体に目的分子を懸濁させることが好ましい。該水溶液または懸濁液の溶媒または分散媒としては、たとえば生理食塩水やｐＨ緩衝溶液などが挙げられる。
　［導入工程］
　本発明の導入工程では、目的分子を含む導入液と標的細胞とを接触させて、標的細胞に目的分子を導入する。標的細胞に目的分子を導入するとは、例えば細胞質基質内または核内に目的分子が入り、機能を発揮できる状態になることをいう。導入工程では、目的分子はエンドサイトーシスを介して標的細胞に導入されることが好ましい。エンドサイトーシスは本来生物が保有する機能であり、エレクトロポレーション法のように細胞膜や染色体遺伝子を傷つけないため、細胞障害性や染色体遺伝子の変性・組換えを抑制することができるためである。導入工程では、目的分子を含む導入液と標的細胞とを接触させるステップを少なくとも含む。
　＜目的分子を含む導入液と標的細胞とを接触させるステップ＞
　目的分子を含む導入液と標的細胞とを接触させるステップは、標的細胞を前培養するステップおよび目的分子を含む導入液を添加するステップを含むことが好ましい。
　標的細胞を前培養するステップでは、標的細胞を適切な条件で培養する。標的細胞を前培養する方法は、特に限定されないが、シャーレ、プレートなどの細胞培養容器中で接着細胞を培養する方法や、培養液中に懸濁した状態で浮遊細胞を培養する方法が挙げられる。培養に用いる培地は、標的細胞の培養に通常用いられる培地であれば特に限定されるものではないが、たとえば寒天培地をはじめとする固体培地やＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ　１６４０　Ｍｅｄｉｕｍ、Ｇｌａｓｇｏｗ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＭＥＭ）などの液体培地が挙げられる。また、培地は公知の添加物を含むことができる。培養に適したフィーダー細胞を用いることもできる。培養時間、培養温度およびＣＯ２濃度等の培養条件は、適宜設定することができる。
　次に、前培養した液体培地を除去する。接着細胞の場合は、培地をアスピレーターなどで除けばよい。浮遊細胞の場合は、培地中に懸濁している標的細胞を遠心分離または濾過などの操作により分離して、培地を除去する。
　次に、目的分子を含む導入液を添加するステップを行う。導入液は標的細胞を薄く覆うように添加することが好ましい。なお、標的細胞の代わりに標的組織を用いる場合は、例えば切除してきた組織切片または組織上に直接目的分子を含む微量の導入液を添加する。
　なお、標的細胞に目的分子を含む導入液を接触させる際には、例えば標的細胞に目的分子を含む導入液を滴下する方法、標的細胞と導入液とを混合する方法などを用いることができる。また、別の方法としては、標的細胞を含む分散液または懸濁液等に目的分子を含む導入液を添加する方法も用いることができる。
　＜目的分子を導入するステップ＞
　続いて、目的分子を導入するステップを行う。本発明の導入工程では、標的細胞への沿面放電またはプラズマ照射によって目的分子を導入することが好ましい。これらの方法は、細胞障害性がある試薬を使わないために、細胞死を抑制することができる。また、沿面放電またはプラズマ照射による導入方法は、一般に遺伝子導入が困難な分子量の大きいベクター（例えば５ｋＤａ以上、好ましくは１０ｋＤａ以上）でも高い遺伝子導入効率を維持することができると同時に、細胞あたりの目的分子の導入数も多くすることができるため、これまで一般に行われている方法よりも効率よく、形質転換細胞を得ることができる。さらに、エンドサイトーシスにより染色体を傷つけずに目的分子を導入できるため、目的分子が染色体に組み込まれることを抑制でき、染色体に外来遺伝子が挿入されていない細胞を得ることができる。例えばエレクトロポレーションによる遺伝子導入を行った場合、最終的に目的の形質転換された細胞の４０～９０％で染色体への組み込みが起きているのに対し、本方法によればその割合を有意に下げることができ、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下にすることができる。なお、沿面放電またはプラズマ放電による導入方法によっても、自然発生的にランダムに起こる染色体の組み換え、突然変異等を防ぐことはできないため、外来の目的分子が染色体に組み込まれた細胞が稀に生じる。
　沿面放電を用いた目的分子の導入方法としては、特開２０１０－２２０５１７号公報に記載の方法を、プラズマ照射を用いた目的分子の導入方法としては、国際公開第２００２／０６４７６７号、特開２０１３－２５５４７５号公報または特開２０１３－２５５４７４号公報に記載の方法等を適宜用いることができる。
　なお、導入液には、エンドサイトーシスを利用した汎用のトランスフェクション試薬（例えばリポフェクション試薬）を用いることもできる。この場合は、目的分子の導入工程において、沿面放電またはプラズマ照射を併用することも可能であるし、併用しなくてもよい。
　［沿面放電］
　沿面放電を用いた目的分子の導入方法について、以下詳細に説明する。沿面放電を用いた目的分子の導入方法は、目的分子を含む導入液と標的細胞とを接触させる上記のステップと、導入液から離間して設けられた複数の電極から標的細胞および導入液に放電を作用させるステップと、を備える。
　＜標的細胞および導入液に放電を作用させるステップ＞
　標的細胞および導入液に放電を作用させるステップは、特に電極の本数に限定されるものではないが、目的分子を含む導入液から離間して設けられた複数の電極から導入液に放電を作用させる。これにより、例えば導入液またはその表層に電流が流れたり、電界が生じたりする。本ステップは、好ましくは目的分子を含む導入液へ放電を行うことができる領域に複数の電極を設置するステップ、複数の電極の間に電圧を印加するステップおよび複数の電極と目的分子を含む導入液との間で放電を発生させるステップを含む。これらのステップにより標的細胞に目的分子が導入される。
　電極を設置するステップにおいては、シャーレ等の細胞培養容器中に標的細胞と目的分子を含む導入液とが保持された状態で、導入液に放電を作用させることのできる領域に複数の電極が設置されることが好ましい。
　ここで、上記容器は、標的細胞と目的分子を含む導入液を保持することのできる構造であれば特に限定されるものではないが、たとえばプレート、シャーレ、チューブ、試験管、フラスコなどが挙げられる。
　複数の電極の間に電圧を印加（供給）するステップにおいては、複数の電極の間に数ｋＶｐｐ～数十ｋＶｐｐ程度の電圧を印加することが好ましく、より好ましくは１ｋＶｐｐ～３０ｋＶｐｐであり、さらに好ましくは３ｋＶｐｐ～１０ｋＶｐｐである。数十ｋＶｐｐよりも高い電圧を印加すると、標的細胞の死滅率が高くなってしまい、一方、数ｋＶｐｐよりも低い電圧では目的分子の導入率を向上させる効果を得ることができない。
　複数の電極から放電を発生させるステップは、上記複数の電極の間に電圧を供給するステップにより、ほぼ同時に達成されるステップである。かかる電圧の印加により、目的分子を含む導入液に離間して設けられた電極と目的分子を含む導入液との間で放電を行わせることで目的分子の導入が達成できる。
　放電時間は、好ましくは０．１ｍｓｅｃ～１００ｍｓｅｃであり、より好ましくは０．５ｍｓｅｃ～２０ｍｓであり、さらに好ましくは１ｍｓｅｃ～５ｍｓｅｃである。１００ｍｓｅｃよりも長い時間電流を流すと、標的細胞の死滅率が高くなってしまい、一方、０．１ｍｓｅｃよりも短い時間の通電では目的分子の導入率を向上させる効果を十分に得ることができない。
　目的の形質転換細胞を得るためには、通常の目的分子の導入を行う際よりも電圧を高くし、放電時間を長くすることが好ましい。標的細胞の細胞障害性は大きくなるが、目的分子が導入された細胞数を増やし、また１細胞あたりの目的分子の導入量を多くすることができるため、形質転換細胞の製造効率を上げることができる。
　＜沿面放電用の導入装置＞
　沿面放電用の導入装置の一例を図１に示す。導入装置は、２本の針状の電極１と電源（電圧供給手段）２と、容器３とを備えている。該電源２により、２本の電極間に電圧を印加することができる。なお、導入装置の構造は、図１に示す構造に限定されるものではない。
　図１に記載される導入装置に備えられた複数の電極１は、目的分子を含む導入液５に離間して設けられており、複数の電極間に電圧を印加することにより該電極と目的分子を含む導入液との間で放電を行わせることで、目的分子を細胞内に導入する。
　なお、導入装置は、本発明の目的分子の導入方法において、標的細胞４と接触した目的分子を含む導入液５上に複数の電極１が離間して設置されていることを特徴としている。図１においては、電極１は目的分子を含む導入液５と離間して設けられており、電極１は目的分子を含む導入液５との間に放電６を生じさせることにより、電極間で目的分子が導入される。電極１と目的分子を含む導入液５とは、両者の間の最短距離が１０ｍｍ以下であり、かつ両者が接触しないように設置されている。電極１と目的分子を含む導入液５との間の距離は、好ましくは０．１～５ｍｍであり、さらに好ましくは０．５ｍｍ～１ｍｍである。このように、電極１と目的分子を含む導入液５とを互いに接触しないように設置することにより適切な放電が行われる。
　また、本発明においては、直接的に電極間でプラズマ放電が発生しないように複数の電極間の距離や電極間に印加される電圧が調整されることが好ましい。電極間でプラズマ放電が発生すると、大気圧でのプラズマが不安定であるために目的分子を含む導入液中への架電も不安定となり、目的分子の導入効率等も不安定となるためである。なお、このような複数の電極間の距離や電極間に印加される電圧の好適な範囲は、目的分子を含む導入液の電気抵抗などに影響されるものであり一概に決定することはできないが、通常の目的分子を含む水溶液を用いる場合、複数の電極のうち任意の２対の電極間の距離が１０～１００ｍｍであることが好ましく、任意の２対の電極間に印加される電圧は１～３０ｋＶであることが好ましい。
　上記電極から上記目的分子を含む導入液に放電させるための電圧を上記電極に供給する電圧供給手段は、特に限定されるものではないが、たとえば高圧電源ＦＰ１０００（パール工業株式会社製）などの電源供給装置が挙げられる。電極に供給される波形は、正弦波、半波整流、全波整流、パルスのいずれも用いることができる。
　本発明の導入装置に用いられる電極の形状は、特に限定されるものではないが、電極から目的分子を含む導入液に放電するために必要以上の電圧を印加する必要がないようにするために、目的分子を含む導入液５側を先端とする針形状等の形状であることが好ましい。また、電極の材質は、特に限定されるものではないが、タングステン、モリブデンなどが挙げられ、腐食しにくい材質や、金、銀、プラチナ等の殺菌効果のある材質であることが好ましい。
　導入装置に用いられる電極の数は２つであることに限定されることはなく、電極の数は２以上であることが好ましい。電極の数を２以上とすることにより、試料回転等の操作を必要とせずに導入を均一化することが可能となり、より目的分子の導入率が向上し、標的細胞の死滅率も低減される。
　また、導入装置に用いられる電極の数は、正電極と負電極の数が同じとなるようにしてもよく、正電極と負電極の数が異なるようにしてもよい。なお、複数の電極を配置する場合においては、特定の電極に電流が集中してしまい均一な目的分子の導入が妨げられないよう、電源２と電極１の間に抵抗２２を設けて、電流が均一に流れるように調整することが好ましい。なお、抵抗２２の代わりにコイルやコンデンサ等を使用してよい。
　なお、本導入装置の構造は、本実施の形態で説明した構造に限定されるものではなく、たとえば電極の数や設置形態は、本実施の形態と同様の効果が得られるのであれば、互いに異なる他の形状であってもよい。また、電源２は整流器を備えていることが好ましい。
　本方法によれば、ガスの噴きつけ等を必要としないため標的細胞がほとんど乾燥せず、余計な緩衝液等の添加が不要となる。また、短時間での処理が可能となり、電極構成も特別な構成を必要とせず簡素化することができる。
　［プラズマ照射］
　プラズマ照射を用いた目的分子の導入方法について、以下詳細に説明する。プラズマ照射を用いた目的分子の導入方法は、目的分子を含む導入液と標的細胞とを接触させる上記のステップと、荷電粒子、励起原子および励起分子からなる群から選択される一種または複数種からなる集合体を、導入液および標的細胞に接触させるステップと、を備える。
　＜荷電粒子、励起原子および励起分子からなる群から選択される一種または複数種からなる集合体を、導入液および標的細胞に接触させるステップ＞
　本ステップでは、例えば上部微細電極から、目的分子を含む導入液および標的細胞に集合体すなわちプラズマを照射する。本ステップでは、まず、導入液の所望の位置に、上部微細電極の位置を調節する。底面電極は、標的細胞を収容した容器を挟んで上部微細電極の反対側に設置してもよい。続いて、上部微細電極に電圧を印加し、プラズマを発生させる。中空パイプ状で噴出口を有する上部微細電極を用いる場合には、噴出口から導入液および標的細胞に向けて集合体前駆体を噴出してもよい。
　集合体前駆体とは、荷電粒子、励起原子および励起分子からなる群から選択される一種または複数種からなる集合体を生成させるための前駆体であり、例えば空気、窒素ガス、酸素ガス、二酸化炭素ガス、ヘリウムガス、ネオンガス、アルゴンガス、クリプトンガス、キセノンガスからなる群より選ばれる１種以上を含むガスが挙げられる。ガスの組み合わせはこれらに限定されるものではなく、また、固体や液体を前駆体に含んでもよい。集合体前駆体に、例えば電圧が印加されることにより、荷電粒子と励起原子および励起分子からなる群から選択される一種または複数種を構成要素とする集合体が生成される。集合体は、集合体前駆体にエネルギーが与えられることにより生成されたものであればよく、エネルギーを与える方法は電圧印加でなくてもよい。
　集合体前駆体は、例えば中空パイプ状の上部微細電極の内孔と接続された集合体前駆体供給装置により、上部微細電極の内孔に集合体前駆体が所定流量で供給され、噴出口から噴出される。上部微細電極の外径は、好ましくは１ｍｍ以下であり、より好ましくは１００μｍ以下である。また、上部微細電極ごとの前記集合体前駆体の噴出量は、１００ｓｃｃｍ以下であることが好ましい。
　次に、上部微細電極と底面電極との間に電圧を印加することにより、集合体前駆体(例えばＨｅガス)から集合体が生成する。この集合体（荷電粒子、励起原子および励起分子からなる群から選択される一種または複数種からなる集合体）が導入液および標的細胞に接触し、作用を及ぼすことにより、目的分子が標的細胞に導入される。
　電圧を印加するステップにおいては、印加される電圧は、数ｋＶ～数十ｋＶ程度であることが好ましく、より好ましくは２ｋＶ～３０ｋＶであり、さらに好ましくは５～２０ｋＶである。数十ｋＶよりも高い電圧で電流を流すと、標的細胞の死滅率が高くなってしまい、逆に、数ｋＶよりも低い電圧で電流を流すと目的分子の導入率を向上させる効果を得ることができない。
　集合体が生成するステップは、上記電圧を印加するステップにより、ほぼ同時に達成されるステップである。このようにして、目的分子を含む液体（導入液）および標的細胞に集合体（荷電粒子、励起原子および励起分子からなる群から選択される一種または複数種からなる集合体）が作用することにより、目的分子の導入率を著しく向上させ、標的細胞の死滅率を格段に低減することが可能となる。
　電圧を印加する時間は、好ましくは０．１ｍｓｅｃ～１００ｍｓｅｃであり、より好ましくは０．５ｍｓｅｃ～５０ｍｓｅｃであり、さらに好ましくは１．０ｍｓｅｃ～２０ｍｓｅｃである。１００ｍｓｅｃよりも長い時電圧を印加すると、標的細胞の死滅率が高くなってしまい、一方、０．１ｍｓｅｃよりも短い時間の印加では目的分子の導入率を向上させる効果を十分に得ることができない。
　本導入方法によれば、細胞に目的のタンパク質を効率的に発現かつ安定して存在させることができ、これにより形質転換細胞を効率的に樹立することができ、細胞機能の改善による動物個体の健康維持、体質改善、疾病の予防などにおいてその効果を発揮できる。また、本導入方法は、本実施形態および実施例に記載される用途に限られず、細胞に機能を付与する用途に用いることができる。
　＜プラズマ放電用の導入装置＞
　プラズマ放電用の導入装置の一例を以下に説明するが、導入装置の構造は、これに限定されるものではない。プラズマ放電による目的分子導入装置は、上述した目的分子導入方法に好適に用いられる構造および機能を有しており、好ましくは容器と、該容器の開口部側に、導入液から離間して設けられた上部微細電極と、電圧供給手段（電源）と、容器の上部微細電極とは反対側に設けられた底面電極とを備えている。電圧供給手段により、上部微細電極と底面電極との間に所定の電圧を印加することができる。中空パイプ状の上部微細電極を用いた場合、集合体前駆体を噴出する機構を備えていることが好ましい。
　電圧供給手段は、信号発生器、リニアアンプ、整合回路および昇圧トランスを備えている。電圧供給手段としては、特に限定されるものではないが、例えば高圧電源ＦＰ１０００（パール工業株式会社製）などの電源供給装置が挙げられる。電極に供給される波形は、正弦波、半波整流、全波整流、パルスのいずれも用いることができる。
　導入装置は、基本的に、電源（電圧供給機構）と、電極と、電源と電極を接続する導電線とを備えている。また、電源は、信号発生器、リニアアンプ、整合回路、昇圧トランスなどを備えており、それらと上部微細電極または底面電極とは導電線で互いに電気的に接続されているため、電極間電圧、電極距離、周波数、パルス周期（パルス周波数）、Ｄｕｔｙなどのパラメータを種々の条件に設定することができる。これにより、種々の性質の集合体を発生させることができる。なお、電源供給手段と電極（上部微細電極または対向電極）とを接続する接続回路に整流器、抵抗、コイルまたはコンデンサを有することが好ましい。
　導入装置においては、標的細胞の種類および目的分子の種類に応じて、標的細胞に照射される集合体の条件を変化させることができるように、上記の電極間電圧、電極距離、周波数、パルス周期、Ｄｕｔｙ等のパラメータを変化させることができる。
　上部微細電極の形状は、好ましくは針状である。上部微細電極および底面電極の材質は、特に限定されるものではないが、タングステン、モリブデンなどが挙げられ、腐食しにくい材質や、金、銀、プラチナ等の殺菌効果のある材質であることが好ましい。
　本発明においては、単数または複数の上部微細電極を鉛直方向に上下することで、目的分子が導入される標的細胞の範囲を調節することができる。このために、上部微細電極と、導入液および標的細胞との最短の距離は、５ｍｍ以下に設定されることが好ましい。
　上部微細電極の数は、単数であっても複数であってもよい。多数の上部微細電極を具備する場合、多数の標的細胞へ同時に目的分子の導入が可能となる。また、多数の上部微細電極により、広範囲の標的細胞に対して目的分子の導入が可能となる。
　また、導入液および標的細胞を収容する容器は、この標的細胞を保持するための単数または複数の試料保持部を有していてもよく、この場合、この試料保持部に対応する位置に単数または複数の上部微細電極が設置される。
　導入装置は、上部微細電極と容器とを相対的に上下に駆動させる上下駆動機構を含むことが好ましい。すなわち、導入液の収容容器の位置調節手段、および／または上部微細電極の位置調節手段を含んでいることが好ましい。これにより、上部微細電極と導入液との間の距離を最適化することができる。
　［後培養工程］
　本発明の製造方法は、上記の導入工程の後に、標的細胞の後培養工程を含むことが好ましい。後培養工程では、目的分子が導入された標的細胞を導入から、例えば４時間以上２月以内、好ましくは３日以上１月以内培養を行う。この間、数日毎に適切な培地交換を行うことが好ましい。培養温度およびＣＯ２濃度などの培養条件は適宜設定することができる。
　後培養工程では、標的細胞の培地は選択分子を含むことが好ましい。選択分子は、目的分子が導入されなかった細胞を、細胞増殖の抑制、死滅、アポトーシス誘導などにより排除する分子であれば特に限定されない。これにより、目的分子が導入された細胞のみを選択および培養することができるため、目的の形質転換細胞の製造効率を向上させることができる。例えば下記に挙げられる抗生物質耐性遺伝子を目的分子として含む場合、選択分子としては、ネオマイシン、ネオマイシン類似体Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイジン、その他の抗生物質等を用いることができる。選択分子の濃度および培養時間は細胞により異なるが、例えばヒト皮膚線維芽細胞ＨＤＦ細胞に対してＧ４１８で選択培養する場合、１００～１０００μｇ／ｍＬの濃度で１～３日間培養することが好ましい。選択分子を長期間にわたり添加すると、目的分子が標的細胞の染色体に組み込まれた細胞が選択される可能性が高くなるためである。なお、目的分子の導入効率が８０％を超す場合には、選択分子の存在下での培養は行わなくてもよい。
　目的分子は、選択分子に対して耐性となる選択マーカー分子を含むことが好ましい。選択マーカー分子は、目的分子が導入された標的細胞をスクリーニングするための分子である。選択マーカー分子としては、例えばネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子等が挙げられる。選択マーカー分子は、標的細胞に形質を付与、欠失または維持させる遺伝子が挿入されたベクターと同一のベクター上に挿入されていてもよい。この場合、目的分子が導入された標的細胞をより的確に選択することができる。標的細胞に形質を付与、欠失または維持させる遺伝子が挿入されたベクターとは異なるベクター上に選択マーカー分子が挿入されている場合、形質を付与、欠失または維持させる遺伝子が挿入されたベクターに対して、選択マーカー分子が挿入されたベクターの量を十分に少なくして（例えば重量比で１０：１）、共に導入することで、標的細胞に形質を付与、欠失または維持させる遺伝子が挿入されたベクターが導入されたと想定される標的細胞を選別することができる。
　［形質転換細胞の単離工程］
　本発明の製造方法は、好ましくは形質転換細胞の単離工程を含む。本工程では、目的分子が導入された標的細胞または後培養した細胞をクローン化する。単クローン化する方法としては、当業者に公知の方法を用いることができるが、例えば限外希釈法や単一コロニーのピックアップなどによって細胞をクローン化することができる。その形態によって目的の形質転換細胞を判断できる場合は、視覚的に判断した目的の細胞をピックアップすることができる。単離された細胞が目的の形質を得ているかは、公知の方法によって確認することができる。
　以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　（試験例１：細胞への高分子の導入）
　ｉＰＳ細胞等の形質転換細胞を効率よく樹立するには、１０ｋｂｐ以上（約７００万Ｄａ以上）のエピゾーマルプラスミドの導入が望ましく、巨大分子の導入効率の低さがｉＰＳ細胞の製造効率の低さの一因となっている。そこで、沿面放電法を用いた巨大分子の導入効率について検証した。
　試験例１では、図１に示した導入装置を用いて沿面放電による遺伝子導入を行った。上部微細電極を用いたプラズマ照射では、放電範囲が小さく、遺伝子導入できる細胞の数が少ないため、本試験例では沿面放電を用いて大量の細胞への遺伝子導入を試みた。本試験例の容器には３．５ｃｍプラスチックシャーレを用い、標的細胞としてヒト皮膚線維芽細胞ＨＤＦ細胞を用いた。図２に示すように、本試験例では、正電極１１、負電極１２を２本ずつ配置し、計４本の電極を配置した導入装置を使用した。正電極と負電極間の距離は約２７ｍｍである。
　図３を用いて、本試験例の手順を説明する。まず、ラミニンでコーティング処理された３．５ｃｍプラスチックシャーレに２ｍＬのＤ－ＭＥＭ高グルコース培地（富士フィルム和光純薬株式会社：０４５－３０２８５）を加え、ヒト皮膚線維芽細胞ＨＤＦ細胞を約３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／シャーレとなるように播種し、２４時間ＣＯ２インキュベーターで培養した（図３のＳ１０１）。培地をアスピレーターで吸引除去し、１２０μｇのｐＣＸＬＥ－ＥＧＦＰ（１０．９ｋｂｐ）および１２μｇのｐｍＣｈｅｒｒｙ－Ｃ１（４．７ｋｂｐ）を含む１２０μＬの導入液（塩分濃度０．０５質量％）を滴下した（図３のＳ１０２）。滴下後５分間室温にて放置し（図３のＳ１０３）、シャーレを沿面放電装置にセット、放電した（図３のＳ１０４）。印加電圧は５．２ｋＶ（半波整流）、電源周波数２０ｋＨｚ、電圧印加時間は２ｍｓｅｃ×２回（インターバル３０秒）であった。その後、速やかに培養液を２ｍＬ加え、ＣＯ２インキュベーターに戻して２４時間培養した（図３のＳ１０５～１０６）。
　導入から２４時間後のＨＤＦ細胞を蛍光顕微鏡によって観察した。図４（Ａ）はＧＦＰが発現している細胞を、図４（Ｂ）はｍＣｈｅｒｒｙが発現している細胞を示す。一般に、サイズの大きなプラスミドは細胞への導入が困難であるが、沿面放電法では、約１０．９ｋｂｐ（７００万Ｄａ以上）の巨大プラスミドも、４．７ｋｂｐの小さなプラスミドの量を減らすことにより同程度の効率で標的細胞に導入できることがわかった。
　（試験例２：形質転換細胞の製造）
　ラミニンでコーティング処理された３．５ｃｍプラスチックシャーレに２ｍＬのＤ－ＭＥＭ高グルコース培地（富士フィルム和光純薬株式会社：０４５－３０２８５）を加え、ヒト皮膚線維芽細胞ＨＤＦ細胞を約３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／シャーレとなるように播種し、２４時間ＣＯ２インキュベーターで培養した。培地をアスピレーターで吸引除去し、表１に記載のプラスミド溶液を１２０μＬ滴下した。５分間室温にて静置後、３．５ｃｍプラスチックシャーレを沿面放電装置にセットし、３．９ｋＶで２ｍｓｅｃ放電した。沿面放電装置は試験例１と同様の装置を用いた。その後、速やかに培養液を２ｍＬ加え、ＣＯ２インキュベーターに戻して２４時間培養した。培養後の細胞を顕微鏡下で観察し、選択マーカーが導入されている細胞を確認し、その後、１００～１０００μｇ／ｍＬのＧ４１８を含むＤ－ＭＥＭ高グルコース培地を２ｍＬ加え、２４時間～７２時間培養した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　Ｇ４１８含有Ｄ－ＭＥＭ高グルコース培地を除去し、２ｍＬのＥｓｓｅｎｔｉａｌ８培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：Ａ１５１７００１）を加え、ＣＯ２インキュベーターで培養した。２～３日毎に培地を交換し、３～４週間培養を続けた。プラスミド導入前のＨＤＦ細胞を図５（Ａ）に示す。プラスミドを導入し３～４週間後に、図５（Ｂ）に示すｉＰＳ様細胞が出現した。プラスミド導入後初期化された細胞は、もとのＨＤＦ細胞とは形態が異なり、ｉＰＳ細胞に典型的にみられる形態(例えばドーム状のコロニーで、コロニーの境界面が滑らかで、白っぽく光る形状等)を示した。出現したｉＰＳ細胞をピックアップし、ラミニンでコーティング処理された３．５ｃｍプラスチックシャーレで継代を行ない、増殖した単一コロニーを凍結保存した。
　＜ｑＰＣＲによる目的分子の残存確認方法および結果＞
　凍結保存時に剥がしたｉＰＳ細胞の一部をＰＢＳ（ナカライテスク株式会社、ｃａｔ．Ｎｏ．１４２４９－２４）で洗浄し、遠心操作で細胞ペレットにした。ＰＢＳをアスピレーターで除去し、－８０℃で保存した。
　凍結した細胞ペレットを室温の２００μＬのＰＢＳに懸濁した。ゲノムＤＮＡ抽出キット：ＤＮｅａｓｙ　Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、ｃａｔ．Ｎｏ．６９５０４）を用いて、プロトコルに従って細胞のゲノムＤＮＡを抽出した。具体的には、付属のｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｋを２０μＬ加え、軽くボルテッックスミキサー（サイエンティフィックインダストリーズ、Ｄｉｇｉｔａｌ　ＶＯＲＴＥＸ－ＧＥＮＩＥ　２）にかけ、均一に混ぜた。スピンダウンして、室温で５分間静置した。別売の４μＬのＲＮａｓｅ　Ａ（ＱＩＡＧＥＮ、ｃａｔ．Ｎｏ．１９１０１）を加え、軽くボルテックスミキサーにかけ、均一に混ぜた。卓上遠心機（ｇｒｅｉｎｅｒ　ｂｉｏ－ｏｎｅ、ｍｙＦＵＧＥ　ｍｉｎｉ　ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ、Ｃ１００８－Ｂ）でスピンダウンして、室温で２－５分間静置した。キットに付属のＢｕｆｆｅｒ　ＡＬを２００μＬ加え、すぐにボルテックスミキサーに１５秒間、断続的にかけた。スピンダウンして、ヒートブロック（ＡＳＴＥＣ、Ｂｌｏｃｋ　Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ　ＢＩ－５２５）で、５６℃で１０分間、インキュベートした。スピンダウンして、２００μＬの１００％エタノールを加え、すぐに１５秒間、断続的にボルテックスミキサーにかけた。スピンダウンして、キットに付属のＱＩＡａｍｐ　Ｍｉｎｉ　ｓｐｉｎ　ｃｏｌｕｍｎにライセートを移した。６０００ｇ、室温で１分間の遠心操作（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｏｒｖａｌｌ　ＳＴ８ＦＲ）にかけて、ライセートをカラムに通した。キットに付属の新しい２ｍＬ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｔｕｂｅへカラムを移し、５００μＬのＢｕｆｆｅｒ　ＡＷ１を添加した。６０００ｇで１分間、室温の遠心操作にかけて、ライセートをカラムに通した。キットに付属の新しい２ｍＬ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｔｕｂｅへカラムを移し、５００μＬのＢｕｆｆｅｒ　ＡＷ２を添加した。２０，０００ｇ、３分間、室温で遠心操作を行い、新しい２ｍＬチューブ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｓａｆｅ－Ｌｏｃｋ　Ｔｕｂｅｓ）へ移した。２０，０００ｇで１分間、室温で遠心操作を行い、新しい１．５ｍＬチューブ（ＷＡＴＳＯＮ、１３１－７１５Ｃ）へカラムを移した。１００～２００μＬのＢｕｆｆｅｒ　ＡＥを添加し、６０℃で１０分間、静置した。６，０００ｇで１分間、遠心操作を行い、ゲノムＤＮＡを抽出した。
　微量分光光度計（ＩＭＰＬＥＮ、ＮａｎｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ　Ｐ－Ｃｌａｓｓ）で、ゲノムＤＮＡを定量し、ＤＤＷで１０ｎｇ／μＬに希釈した。１反応あたり、２０ｎｇのゲノムＤＮＡを用いて、ｑＰＣＲを行った。ｑＰＣＲ試薬は、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ　ＳＹＢＲ　ｑＰＣＲ　ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用した。１０μＬの反応系において、１０ｎｇ／μＬのゲノムＤＮＡを２μＬ使用した。反応条件は、９５℃－６０秒：１サイクル、（９５℃－１５秒、６０℃－４５秒）：４０サイクルで行った。解析システムはＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ解析システム（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いた。１細胞株ごとに、エピソーマルベクター検出用プライマーセットと染色体遺伝子ＣＦＴＲ遺伝子検出用プライマーセットでｑＰＣＲを行った。エピソーマルベクターのＣｙｃｌｅ　ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（Ｃｔ）値を、ＣＦＴＲ遺伝子（染色体遺伝子）のＣｔ値で補正した。使用したプライマー配列は以下の通りである。
エピソーマルベクター（ｏｒｉＰ）検出用（Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２４．２００９）
　ｐＥＰ４－ＳＦ１：ＴＴＣＣＡＣＧＡＧＧＧＴＡＧＴＧＡＡＣＣ
　ｐＥＰ４－ＳＲ２：ＣＡＧＧＣＧＡＡＧＡＴＴＣＡＧＧＡＧＡＧ
ＣＦＴＲ遺伝子の検出用（Ｕｅｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ，Ａｎｎ　Ｃｌｉｎ　Ｔｒａｎｓｌ　Ｎｅｕｒｏｌ．，３６１－３６９．２０１４）
　ＣＦＴＲｅｘｏｎ２４－Ｆ：ＧＧＣＡＧＴＡＣＧＡＴＴＣＣＡＴＣＣＡＧ
　ＣＦＴＲｅｘｏｎ２４－Ｒ：ＧＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＴＣＧ
　本発明で樹立されたヒトｉＰＳ細胞株について、エピソーマルベクター（目的分子）の残存確認を行った。ｑＰＣＲは同一検体で２回実施した。染色体遺伝子であるＣＦＴＲに対するエピソーマルベクターの相対量を２倍して、コピー数を算出した。エピソーマルベクター／ＣＦＴＲ比が０．１コピー以下の細胞株を目的分子が細胞内に残存していない細胞とする。
　結果を図６に示す。検討した１１株中、１０株（９０．９％）が、エピソーマルベクター／ＣＦＴＲ比が０．１以下のコピー数であり、ベクター配列がゲノムＤＮＡに組み込まれていないと考えられる。なお、ベクター配列が検出された株１１については、低確率でおこるランダムな組込みによってベクターが組み込まれたと考えられる。＃５８　ｓｕｂ６はエピソーマルベクターをエレクトロポレーションによって導入した結果、ベクターがゲノムＤＮＡに挿入された細胞株であり、ポジティブコントロールとして使用した。ネガティブコントロールとして、ｉＰＳ細胞の樹立に使用したヒト皮膚線維芽細胞ＨＤＦ細胞（Ｍａｌｅ　ＨＤＦ，Ｐ９）のゲノムＤＮＡを用いた。
　また、本願の導入方法によって製造したｉＰＳ細胞と、エレクトロポレーターのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ　２ｂ（Ｌｏｎｚａ）を用いて樹立したｉＰＳ細胞で、細胞内にベクターが残存した細胞株の割合を比較した。表２に示すように、沿面放電によって樹立したｉＰＳ細胞株のエピソーマルベクター残存率は、エレクトロポレーターを用いて樹立したｉＰＳ細胞と比較して、非常に低い値を示した。本願の導入方法によって染色体に核酸が挿入されていない形質転換細胞を効率よく得ることができた。
　エピソーマルベクターの残存量は、培養期間の長さに依存する可能性もある。しかし、凍結細胞ストックの作製時におけるエピソーマルベクター残存量は、本発明を用いて製造したｉＰＳ細胞の約９０％の細胞で０．１コピー以下であった。この結果は、本発明が外来遺伝子の染色体組込みを起こしにくい、従来法に比べて安全な技術であることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（試験例３：形質転換細胞の製造）
　図７に示す方法に従って、ゲノム編集システムを用いて標的遺伝子をノックアウトし、ゲノム編集が完了した後はゲノム編集システムが細胞内に残存しない形質転換細胞を製造した。この方法によれば、遺伝子のノックアウトやプラスミドの脱落を蛍光により確認することができる。
　（１）蛍光を示さない細胞１０１の染色体に赤色蛍光タンパク質遺伝子をインテグレーションし、恒常的に赤色蛍光を示す細胞（標的細胞）１０２を樹立する。
　（２）赤色蛍光タンパク質をノックアウトする配列と、緑色蛍光タンパク質遺伝子配列とを有するゲノム編集用プラスミド（目的分子）を構築する。
　（３）赤色蛍光を示す細胞１０２に、構築したプラスミドを導入する。プラスミドが導入された細胞は、赤色および緑色蛍光を示す細胞１０３となる。
　（４）プラスミドを導入した細胞を２週間程度培養する。赤色蛍光タンパク質遺伝子がノックアウトされると赤色蛍光タンパク質が徐々に分解され、緑色蛍光のみを示す細胞１０４が生じる。
　（５）さらに培養を継続する。細胞に導入したプラスミドが分解・脱落することより、細胞は緑色蛍光を示さなくなり、核酸が染色体に挿入されない形質転換細胞１０５を製造することができる。
　以下に実際に行った実験を詳細に説明する。
　（１）エレクトロポレーション法によるｍＣｈｅｒｒｙタンパク質の恒常的発現細胞の樹立
　Ｌ－９２９細胞（１×１０６ｃｅｌｌｓ）を９０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭに懸濁し、１０μＬのｐｍＣｈｅｒｒｙ－Ｃ１プラスミド（１μｇ／μＬ）を加えて混合した。混合液をエレクトロポレーション用キュベットに移し、エレクトロポレーター（ＮＥＰＡ２１、ネッパジーン株式会社）に装着して、表３の条件にて印加した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　印加後の細胞が含まれる反応液を４．９ｍＬの血清入りＭＥＭ培地に懸濁して、９６ｗｅｌｌプレートに１００μＬずつ播種し、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で４８時間培養した。ｐｍＣｈｅｒｒｙ－Ｃ１プラスミドの導入効率は３０％、細胞生存率は６５％であった。ウェルから細胞を回収し、１０ｃｍシャーレにて１０ｍＬの血清入りＭＥＭ培地（２００μｇ／ｍＬのＧ－４１８を含む）で１ヶ月培養した。図８（Ａ）に、ｍＣｈｅｒｒｙが発現して赤色蛍光を示す細胞を、図８（Ｂ）に明視野顕微鏡下での細胞を示す。その後、９６ｗｅｌｌプレートを用いた限界希釈法により、ｐｍＣｈｅｒｒｙ－Ｃ１プラスミドが導入されたＬ－９２９細胞のシングルコロニーを得た。得られたシングルコロニーを２ｍＬの血清入りＭＥＭ培地に懸濁し、３．５ｃｍシャーレに播種して、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で継続的に１ヶ月間培養した。得られたコロニーからホワイトクローン（ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子が脱落したクローン）が出現しないこと（０．０１％以下）を確認し、恒常的ｍＣｈｅｒｒｙ発現細胞（Ｌ－９２９－ｍＣｈｅｒｒｙ細胞）とした（図９（Ａ）および（Ｂ））。Ｌ－９２９－ｍＣｈｅｒｒｙ細胞は、ゲノムにｐｍＣｈｅｒｒｙ－Ｃ１プラスミドが挿入されていると考えられる。
　（２）ゲノム編集用ベクターの構築
　Ｇｕｉｄｅ－ｉｔ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用い、キットに付属のマニュアルに従ってｍＣｈｅｒｒｙノックアウト用ベクターを構築した。キットに含まれるｐＧｕｉｄｅ－ｉｔプラスミドベクターは、緑色の蛍光を示すＺｓＧｒｅｅｎ１遺伝子を有する。ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子をノックアウトするためのガイドＲＮＡ用のプライマー塩基配列は以下の通りである。
　ｇＲＮＡ－１－Ｆｗｄ：ＣＣＧＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＧＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＧＧ
　ｇＲＮＡ－１－Ｒｅｖ：ＡＡＡＣＣＣＴＴＣＡＧＣＴＴＧＧＣＧＧＴＣＴＧＧＧＴ
　上記ガイドＲＮＡ配列を含むｍＣｈｅｒｒｙノックアウト用ベクターの塩基配列を確認し、目的の配列を保持するゲノム編集用プラスミドｐｓｇＲＮＡ１－２を得た。
　（３）ゲノム編集用プラスミドｐｓｇＲＮＡ１－２の導入
　Ｌ－９２９－ｍＣｈｅｒｒｙ細胞（１．３×１０４ｃｅｌｌｓ）を９６ｗｅｌｌプレートに播種し、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で２４時間培養した。ウェルから培地を吸引後、ｐｓｇＲＮＡ１－２プラスミド（１μｇ／μＬ）を５μＬ加え、プラズマ照射装置にセットし、３０ｋＶ、３０ｍｓｅｃの条件でプラズマを照射した。プラズマ照射装置は、特開２０１３－２５５４７５号公報に記載の装置と同様の装置を用いた。照射後、１００μＬの血清入りＭＥＭ培地を加え、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で４８時間培養した。Ｌ－９２９－ｍＣｈｅｒｒｙ細胞は恒常的に赤色蛍光を示す（図１０（Ａ）および（Ｂ））が、ｐｓｇＲＮＡ１－２プラスミドが導入された細胞はさらに緑色蛍光も示した（図１０（Ｃ））。
　（４）ｐｓｇＲＮＡ１－２プラスミドの導入によるｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子のノックアウト
　ウェルから細胞を回収し、１０ｃｍシャーレに播種して、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で２週間培養した。その結果、赤色および緑色の蛍光を示していた細胞の一部は、ｐｓｇＲＮＡ１－２プラスミドの導入によって赤色蛍光を示さなくなり、緑色蛍光のみを示すようになった（図１１（Ａ）～（Ｄ）、丸で囲んだ部分）。一般的に、偶発的な遺伝子の変異が起こる頻度は１／１０５と低頻度であるため、一定数以上の細胞において赤色蛍光が見られなくなったことは、ゲノム編集システムにより、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子がノックアウトされたことを示唆している。
　（５）ｐｓｇＲＮＡ１－２導入細胞の継続培養
　限界希釈法によって緑色の蛍光を示す細胞のシングルコロニーを得た。得られたシングルコロニーを１０ｃｍシャーレに播種し、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で約１ヶ月間培養すると、緑色蛍光を発していた細胞のほとんど全ての細胞は蛍光を示さない細胞となった。これは、ゲノム編集用プラスミドｐｓｇＲＮＡ１－２が、ゲノムに組み込まれずに細胞増殖の途中で脱落または分解されたことを示唆している。
　今回開示された実施形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて請求の範囲によって示され、請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
　これまで、再生医療や遺伝子治療に用いる形質転換された細胞（例えばｉＰＳ細胞、ｉＰＳ細胞から分化した細胞など）には導入遺伝子やウイルスなどのベクターが残存しており、それらが再生医療や遺伝子治療の実用化の妨げになっていた。また、それらの形質転換された細胞を取得するために高いレベルのバイオハザード実験室での実施や高度に熟練した研究者が必要とされていた。本発明によれば、簡便に目的分子を導入することができ、その結果、形質が付与あるいは欠失した細胞を容易に製造できる。更に、樹立された細胞には外来遺伝子などの目的分子が保持されることがないので、実用に際しこれまでのような問題が生ずる可能性が限りなく低い。これにより、特定の分子の生体内での働きを解析する研究や、医療、農業および環境を含む広い分野での応用が可能となる。医療分野では、例えば再生医療、細胞医療および遺伝子治療などに、農業分野や環境分野では、例えば育種や品種改良などに用いることができる。
　１　電極、１１　正電極、１２　負電極、２　電源、２２　抵抗、３　容器、４　標的細胞、５　目的分子を含む導入液、６　放電、１０１　蛍光を示さない細胞、１０２　赤色蛍光を示す細胞、１０３　赤色および緑色蛍光を示す細胞、１０４　緑色蛍光を示す細胞、１０５　形質転換細胞。

Claims (10)

  1. 　目的分子を含む導入液と標的細胞とを接触させて、前記標的細胞に前記目的分子を導入する導入工程を含み、
    　前記目的分子の導入により形質が付与、欠失または維持された形質転換細胞を製造する、形質転換細胞の製造方法。
  2. 　前記目的分子は、核酸およびタンパク質からなる群より選ばれる少なくとも１つである、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記核酸はベクターである、請求項２に記載の製造方法。
  4. 　前記ベクターは、細胞に形質を付与、欠失または維持させるタンパク質を発現する、請求項３に記載の製造方法。
  5. 　前記形質転換細胞の８０％以上の細胞において、前記核酸が染色体に挿入されない、請求項２～４のいずれか１項に記載の製造方法。
  6. 　前記導入工程では、前記目的分子はエンドサイトーシスを介して前記標的細胞に導入される、請求項１～５のいずれか１項に記載の製造方法。
  7. 　前記導入工程では、前記標的細胞への沿面放電またはプラズマ照射によって、前記目的分子を導入する、請求項１～６のいずれか１項に記載の製造方法。
  8. 　前記導入工程後に前記標的細胞を培養する後培養工程を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の製造方法。
  9. 　前記後培養工程では、前記標的細胞の培地は細胞を死滅させることができる選択分子を含む、請求項８に記載の製造方法。
  10. 　前記目的分子は、選択分子に対して耐性となる選択マーカー分子を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の製造方法。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002064767A1 (fr) 2001-02-09 2002-08-22 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Procede de transfert de molecules selectionnees
JP2010220517A (ja) 2009-03-23 2010-10-07 Pearl Kogyo Co Ltd 標的細胞または標的組織内への選定分子導入方法、それに用いる導入装置、標的細胞の細胞融合方法およびそれに用いる細胞融合装置
JP2013255475A (ja) 2012-06-14 2013-12-26 Pearl Kogyo Co Ltd 標的細胞への選定分子の導入方法およびそれに用いる選定分子導入装置
JP2013255474A (ja) 2012-06-14 2013-12-26 Pearl Kogyo Co Ltd 標的細胞への選定分子の導入方法およびそれに用いる選定分子導入装置
WO2014208425A1 (ja) * 2013-06-26 2014-12-31 国立大学法人東北大学 遺伝子導入装置および遺伝子導入方法
WO2017123789A1 (en) * 2016-01-12 2017-07-20 Lonza Walkersville, Inc. Methods and vectors to produce vector free induced pluripotent stem cells
JP2017189158A (ja) * 2016-04-11 2017-10-19 パール工業株式会社 細胞・組織への目的分子導入方法およびそれに用いる目的分子導入装置

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2004015101A1 (ja) * 2002-08-08 2005-12-02 アステラス製薬株式会社 標的細胞への選定分子の導入方法、標的細胞の細胞融合方法およびそれらの方法に用いるプラズマ照射装置

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002064767A1 (fr) 2001-02-09 2002-08-22 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Procede de transfert de molecules selectionnees
JP2010220517A (ja) 2009-03-23 2010-10-07 Pearl Kogyo Co Ltd 標的細胞または標的組織内への選定分子導入方法、それに用いる導入装置、標的細胞の細胞融合方法およびそれに用いる細胞融合装置
JP2013255475A (ja) 2012-06-14 2013-12-26 Pearl Kogyo Co Ltd 標的細胞への選定分子の導入方法およびそれに用いる選定分子導入装置
JP2013255474A (ja) 2012-06-14 2013-12-26 Pearl Kogyo Co Ltd 標的細胞への選定分子の導入方法およびそれに用いる選定分子導入装置
WO2014208425A1 (ja) * 2013-06-26 2014-12-31 国立大学法人東北大学 遺伝子導入装置および遺伝子導入方法
WO2017123789A1 (en) * 2016-01-12 2017-07-20 Lonza Walkersville, Inc. Methods and vectors to produce vector free induced pluripotent stem cells
JP2017189158A (ja) * 2016-04-11 2017-10-19 パール工業株式会社 細胞・組織への目的分子導入方法およびそれに用いる目的分子導入装置

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KANEKO, TOSHIRO; SHOTA, SASAKI; HIDEAKI, KONISHI; HIROYASU, ISHIDA; MAKOTO, KANZAKI: "29p-B7-4 Generation of hydroxyl radical controlled plasma and its application to gene transfection", 60TH JSAP SPRING MEETING; JAPAN SOCIETY OF APPLIED PHYSICS, KANAGAWA (JAPAN), 27-30 MARCH 2013, vol. 60, 27 March 2013 (2013-03-27), pages 08-128, XP009525335 *
SATO, SUSUMU: "30p-L-5: Practical Application of plasma technology in Molecular Biology - Research and Development of New molecular Delivery System", 56TH CONFERENCE OF THE JAPAN SOCIETY OF APPLIED PHYSICS AND THE RELATED SOCIETIES; 56 (TSUKUBA) : 2009.03.30-04.01, 30 March 2009 (2009-03-30), pages 25, XP009525334 *
See also references of EP3808839A4
UEHARA ET AL., ANN CLIN TRANSL NEUROL., 2014, pages 361 - 369
YU ET AL., SCIENCE, 2009, pages 324

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