JPWO2019244895A1 - 形質転換細胞の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
前記目的分子の導入により形質が付与、欠失または維持された形質転換細胞を製造する、形質転換細胞の製造方法。
[2]目的分子は、核酸およびタンパク質からなる群より選ばれる少なくとも1つである、[1]に記載の製造方法。
[3]核酸はベクターである、[2]に記載の製造方法。
[4]ベクターは、細胞に形質を付与、欠失または維持させるタンパク質を発現する、[3]に記載の製造方法。
[5]形質転換細胞の80%以上の細胞において、核酸が染色体に挿入されない、[2]〜[4]のいずれかに記載の製造方法。
[6]導入工程では、目的分子はエンドサイトーシスを介して標的細胞に導入される、[1]〜[5]のいずれかに記載の製造方法。
[7]導入工程では、標的細胞への沿面放電またはプラズマ照射によって、目的分子を導入する、[1]〜[6]のいずれかに記載の製造方法。
[8]導入工程後に標的細胞を培養する後培養工程を含む、[1]〜[7]のいずれかに記載の製造方法。
[9]後培養工程では、標的細胞の培地は細胞を死滅させることができる選択分子を含む、[8]に記載の製造方法。
[10]目的分子は、選択分子に対して耐性となる選択マーカー分子を含む、[1]〜[9]のいずれかに記載の製造方法。
本発明の製造方法は、目的分子を含む導入液と標的細胞とを接触させて、標的細胞に目的分子を導入する導入工程を含み、目的分子の導入により形質が付与、欠失または維持された形質転換細胞を製造する。
本発明の製造方法において用いる標的細胞とは、目的分子を導入する標的となる細胞のことを示し、特定の種類の細胞に限定されるものではない。このような標的細胞の具体例としては、ヒトを含む動物細胞が挙げられる。動物細胞としては、例えば組織を作る細胞(線維芽細胞、表皮細胞、乳腺細胞、脂肪細胞、筋芽細胞、骨芽細胞、肝細胞、心筋細胞、血管内皮細胞またはそれらの前駆細胞等)、免疫系の細胞(B細胞、T細胞、単球系の細胞等)、神経細胞、幹細胞(多能性幹細胞、血球系幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞を含む)、腫瘍細胞等が挙げられる。細胞は接着細胞であってもよく、浮遊細胞であってもよい。標的細胞は、例えばATCC、JCRB、RIKEN BRCなどの保存機関または市販のメーカーから購入することによって得ることができる。標的細胞は、単一の種類を用いてもよいし、2種以上を混合して用いて、複数の標的細胞に同時に目的分子の導入を行うこともできる。
本発明において目的分子とは、標的細胞に導入する対象となる分子のことを示し、特に特定の種類の分子に限定されるものではないが、好ましくは(a)核酸および(b)タンパク質からなる群より選ばれる少なくとも1つである。
核酸の具体例としては、DNA、RNA、その他の核酸分子またはそれらの誘導体が挙げられる。DNAまたはRNAは、一本鎖または二本鎖であってもよく、また線状または環状であってもよい。核酸の分子量は特に限定されない。RNAには、メッセンジャーRNA(mRNA)、リボザイム、small interfering RNA(siRNA)、small hairpin RNA(shRNA)、ガイドRNA(gRNA)、アンチセンスRNA、その他のnon−coding RNAなどが含まれる。核酸としては、これらのRNAとして転写される核酸(DNA)を含んでいてもよい。また、核酸は、下記のタンパク質をコードする核酸(DNAまたはRNA)を含んでいてもよい。これらの核酸は、1つまたは2つ以上を組み合わせて導入してもよい。
タンパク質としては、ペプチド、ポリペプチドおよびその誘導体などのアミノ酸が重合した高分子化合物が挙げられる。タンパク質は、特に限定されないが公知の多様なタンパク質を含み、シグナル伝達物質、遺伝子発現制御因子(転写、翻訳、輸送を含む)、DNAメチル化調節因子、ヒストン修飾調節因子、ゲノム編集に用いられる因子、構造タンパク質、成長因子、ホルモン、酵素、リガンド、受容体、抗体または抗体のFab部分、経口投与ができないタンパク質医薬品などが含まれる。
目的分子を含む導入液は、特に限定されるものではないが、水、水溶液、培地などの適当な媒体に目的分子を懸濁させることが好ましい。該水溶液または懸濁液の溶媒または分散媒としては、たとえば生理食塩水やpH緩衝溶液などが挙げられる。
本発明の導入工程では、目的分子を含む導入液と標的細胞とを接触させて、標的細胞に目的分子を導入する。標的細胞に目的分子を導入するとは、例えば細胞質基質内または核内に目的分子が入り、機能を発揮できる状態になることをいう。導入工程では、目的分子はエンドサイトーシスを介して標的細胞に導入されることが好ましい。エンドサイトーシスは本来生物が保有する機能であり、エレクトロポレーション法のように細胞膜や染色体遺伝子を傷つけないため、細胞障害性や染色体遺伝子の変性・組換えを抑制することができるためである。導入工程では、目的分子を含む導入液と標的細胞とを接触させるステップを少なくとも含む。
目的分子を含む導入液と標的細胞とを接触させるステップは、標的細胞を前培養するステップおよび目的分子を含む導入液を添加するステップを含むことが好ましい。
続いて、目的分子を導入するステップを行う。本発明の導入工程では、標的細胞への沿面放電またはプラズマ照射によって目的分子を導入することが好ましい。これらの方法は、細胞障害性がある試薬を使わないために、細胞死を抑制することができる。また、沿面放電またはプラズマ照射による導入方法は、一般に遺伝子導入が困難な分子量の大きいベクター(例えば5kDa以上、好ましくは10kDa以上)でも高い遺伝子導入効率を維持することができると同時に、細胞あたりの目的分子の導入数も多くすることができるため、これまで一般に行われている方法よりも効率よく、形質転換細胞を得ることができる。さらに、エンドサイトーシスにより染色体を傷つけずに目的分子を導入できるため、目的分子が染色体に組み込まれることを抑制でき、染色体に外来遺伝子が挿入されていない細胞を得ることができる。例えばエレクトロポレーションによる遺伝子導入を行った場合、最終的に目的の形質転換された細胞の40〜90%で染色体への組み込みが起きているのに対し、本方法によればその割合を有意に下げることができ、好ましくは20%以下、より好ましくは10%以下にすることができる。なお、沿面放電またはプラズマ放電による導入方法によっても、自然発生的にランダムに起こる染色体の組み換え、突然変異等を防ぐことはできないため、外来の目的分子が染色体に組み込まれた細胞が稀に生じる。
沿面放電を用いた目的分子の導入方法について、以下詳細に説明する。沿面放電を用いた目的分子の導入方法は、目的分子を含む導入液と標的細胞とを接触させる上記のステップと、導入液から離間して設けられた複数の電極から標的細胞および導入液に放電を作用させるステップと、を備える。
標的細胞および導入液に放電を作用させるステップは、特に電極の本数に限定されるものではないが、目的分子を含む導入液から離間して設けられた複数の電極から導入液に放電を作用させる。これにより、例えば導入液またはその表層に電流が流れたり、電界が生じたりする。本ステップは、好ましくは目的分子を含む導入液へ放電を行うことができる領域に複数の電極を設置するステップ、複数の電極の間に電圧を印加するステップおよび複数の電極と目的分子を含む導入液との間で放電を発生させるステップを含む。これらのステップにより標的細胞に目的分子が導入される。
沿面放電用の導入装置の一例を図1に示す。導入装置は、2本の針状の電極1と電源(電圧供給手段)2と、容器3とを備えている。該電源2により、2本の電極間に電圧を印加することができる。なお、導入装置の構造は、図1に示す構造に限定されるものではない。
プラズマ照射を用いた目的分子の導入方法について、以下詳細に説明する。プラズマ照射を用いた目的分子の導入方法は、目的分子を含む導入液と標的細胞とを接触させる上記のステップと、荷電粒子、励起原子および励起分子からなる群から選択される一種または複数種からなる集合体を、導入液および標的細胞に接触させるステップと、を備える。
本ステップでは、例えば上部微細電極から、目的分子を含む導入液および標的細胞に集合体すなわちプラズマを照射する。本ステップでは、まず、導入液の所望の位置に、上部微細電極の位置を調節する。底面電極は、標的細胞を収容した容器を挟んで上部微細電極の反対側に設置してもよい。続いて、上部微細電極に電圧を印加し、プラズマを発生させる。中空パイプ状で噴出口を有する上部微細電極を用いる場合には、噴出口から導入液および標的細胞に向けて集合体前駆体を噴出してもよい。
プラズマ放電用の導入装置の一例を以下に説明するが、導入装置の構造は、これに限定されるものではない。プラズマ放電による目的分子導入装置は、上述した目的分子導入方法に好適に用いられる構造および機能を有しており、好ましくは容器と、該容器の開口部側に、導入液から離間して設けられた上部微細電極と、電圧供給手段(電源)と、容器の上部微細電極とは反対側に設けられた底面電極とを備えている。電圧供給手段により、上部微細電極と底面電極との間に所定の電圧を印加することができる。中空パイプ状の上部微細電極を用いた場合、集合体前駆体を噴出する機構を備えていることが好ましい。
本発明の製造方法は、上記の導入工程の後に、標的細胞の後培養工程を含むことが好ましい。後培養工程では、目的分子が導入された標的細胞を導入から、例えば4時間以上2月以内、好ましくは3日以上1月以内培養を行う。この間、数日毎に適切な培地交換を行うことが好ましい。培養温度およびCO2濃度などの培養条件は適宜設定することができる。
本発明の製造方法は、好ましくは形質転換細胞の単離工程を含む。本工程では、目的分子が導入された標的細胞または後培養した細胞をクローン化する。単クローン化する方法としては、当業者に公知の方法を用いることができるが、例えば限外希釈法や単一コロニーのピックアップなどによって細胞をクローン化することができる。その形態によって目的の形質転換細胞を判断できる場合は、視覚的に判断した目的の細胞をピックアップすることができる。単離された細胞が目的の形質を得ているかは、公知の方法によって確認することができる。
iPS細胞等の形質転換細胞を効率よく樹立するには、10kbp以上(約700万Da以上)のエピゾーマルプラスミドの導入が望ましく、巨大分子の導入効率の低さがiPS細胞の製造効率の低さの一因となっている。そこで、沿面放電法を用いた巨大分子の導入効率について検証した。
ラミニンでコーティング処理された3.5cmプラスチックシャーレに2mLのD−MEM高グルコース培地(富士フィルム和光純薬株式会社:045−30285)を加え、ヒト皮膚線維芽細胞HDF細胞を約3.0×105cells/シャーレとなるように播種し、24時間CO2インキュベーターで培養した。培地をアスピレーターで吸引除去し、表1に記載のプラスミド溶液を120μL滴下した。5分間室温にて静置後、3.5cmプラスチックシャーレを沿面放電装置にセットし、3.9kVで2msec放電した。沿面放電装置は試験例1と同様の装置を用いた。その後、速やかに培養液を2mL加え、CO2インキュベーターに戻して24時間培養した。培養後の細胞を顕微鏡下で観察し、選択マーカーが導入されている細胞を確認し、その後、100〜1000μg/mLのG418を含むD−MEM高グルコース培地を2mL加え、24時間〜72時間培養した。
凍結保存時に剥がしたiPS細胞の一部をPBS(ナカライテスク株式会社、cat.No.14249−24)で洗浄し、遠心操作で細胞ペレットにした。PBSをアスピレーターで除去し、−80℃で保存した。
エピソーマルベクター(oriP)検出用(Yu et al,Science,324.2009)
pEP4−SF1:TTCCACGAGGGTAGTGAACC
pEP4−SR2:CAGGCGAAGATTCAGGAGAG
CFTR遺伝子の検出用(Uehara et al,Ann Clin Transl Neurol.,361−369.2014)
CFTRexon24−F:GGCAGTACGATTCCATCCAG
CFTRexon24−R:GAAAGAGCTTCACCCTGTCG
本発明で樹立されたヒトiPS細胞株について、エピソーマルベクター(目的分子)の残存確認を行った。qPCRは同一検体で2回実施した。染色体遺伝子であるCFTRに対するエピソーマルベクターの相対量を2倍して、コピー数を算出した。エピソーマルベクター/CFTR比が0.1コピー以下の細胞株を目的分子が細胞内に残存していない細胞とする。
図7に示す方法に従って、ゲノム編集システムを用いて標的遺伝子をノックアウトし、ゲノム編集が完了した後はゲノム編集システムが細胞内に残存しない形質転換細胞を製造した。この方法によれば、遺伝子のノックアウトやプラスミドの脱落を蛍光により確認することができる。
(1)エレクトロポレーション法によるmCherryタンパク質の恒常的発現細胞の樹立
L−929細胞(1×106cells)を90μLのOpti−MEMに懸濁し、10μLのpmCherry−C1プラスミド(1μg/μL)を加えて混合した。混合液をエレクトロポレーション用キュベットに移し、エレクトロポレーター(NEPA21、ネッパジーン株式会社)に装着して、表3の条件にて印加した。
Guide−it CRISPR/Cas9 System(Clontech社)を用い、キットに付属のマニュアルに従ってmCherryノックアウト用ベクターを構築した。キットに含まれるpGuide−itプラスミドベクターは、緑色の蛍光を示すZsGreen1遺伝子を有する。mCherry遺伝子をノックアウトするためのガイドRNA用のプライマー塩基配列は以下の通りである。
gRNA−1−Rev:AAACCCTTCAGCTTGGCGGTCTGGGT
上記ガイドRNA配列を含むmCherryノックアウト用ベクターの塩基配列を確認し、目的の配列を保持するゲノム編集用プラスミドpsgRNA1−2を得た。
L−929−mCherry細胞(1.3×104cells)を96wellプレートに播種し、CO2インキュベーターにて37℃で24時間培養した。ウェルから培地を吸引後、psgRNA1−2プラスミド(1μg/μL)を5μL加え、プラズマ照射装置にセットし、30kV、30msecの条件でプラズマを照射した。プラズマ照射装置は、特開2013−255475号公報に記載の装置と同様の装置を用いた。照射後、100μLの血清入りMEM培地を加え、CO2インキュベーターにて37℃で48時間培養した。L−929−mCherry細胞は恒常的に赤色蛍光を示す(図10(A)および(B))が、psgRNA1−2プラスミドが導入された細胞はさらに緑色蛍光も示した(図10(C))。
ウェルから細胞を回収し、10cmシャーレに播種して、CO2インキュベーターにて37℃で2週間培養した。その結果、赤色および緑色の蛍光を示していた細胞の一部は、psgRNA1−2プラスミドの導入によって赤色蛍光を示さなくなり、緑色蛍光のみを示すようになった(図11(A)〜(D)、丸で囲んだ部分)。一般的に、偶発的な遺伝子の変異が起こる頻度は1/105と低頻度であるため、一定数以上の細胞において赤色蛍光が見られなくなったことは、ゲノム編集システムにより、mCherry遺伝子がノックアウトされたことを示唆している。
限界希釈法によって緑色の蛍光を示す細胞のシングルコロニーを得た。得られたシングルコロニーを10cmシャーレに播種し、CO2インキュベーターにて37℃で約1ヶ月間培養すると、緑色蛍光を発していた細胞のほとんど全ての細胞は蛍光を示さない細胞となった。これは、ゲノム編集用プラスミドpsgRNA1−2が、ゲノムに組み込まれずに細胞増殖の途中で脱落または分解されたことを示唆している。
Claims (10)
- 目的分子を含む導入液と標的細胞とを接触させて、前記標的細胞に前記目的分子を導入する導入工程を含み、
前記目的分子の導入により形質が付与、欠失または維持された形質転換細胞を製造する、形質転換細胞の製造方法。 - 前記目的分子は、核酸およびタンパク質からなる群より選ばれる少なくとも1つである、請求項1に記載の製造方法。
- 前記核酸はベクターである、請求項2に記載の製造方法。
- 前記ベクターは、細胞に形質を付与、欠失または維持させるタンパク質を発現する、請求項3に記載の製造方法。
- 前記形質転換細胞の80%以上の細胞において、前記核酸が染色体に挿入されない、請求項2〜4のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記導入工程では、前記目的分子はエンドサイトーシスを介して前記標的細胞に導入される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記導入工程では、前記標的細胞への沿面放電またはプラズマ照射によって、前記目的分子を導入する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記導入工程後に前記標的細胞を培養する後培養工程を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記後培養工程では、前記標的細胞の培地は細胞を死滅させることができる選択分子を含む、請求項8に記載の製造方法。
- 前記目的分子は、選択分子に対して耐性となる選択マーカー分子を含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の製造方法。
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