CN117625546A - 一种提高t细胞效能的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高T细胞效能的方法。所述方法包括：向宿主T细胞中通过电转法导入外源序列，获得工程化T细胞并进行培养。本发明可以在供者T细胞自身状态的基础上，显著提高制备的T细胞的效能，使工程化T细胞体现出更强大、更持久的肿瘤杀伤功能。

Description

一种提高T细胞效能的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高T细胞效能的方法。

背景技术

CRISPR/Cas9系统是来源于古细菌和细菌的一种抵御质粒、噬菌体等外源DNA片段入侵的获得性免疫机制(Cell.2014,157(6):1262-78；Cell.2017,169(3):559)。该系统主要由CRISPR序列和编码Cas蛋白的基因座发挥功能，目前最常用的是Ⅱ型家族的Cas9核酸酶，这一系统只需要单一的效应蛋白就可发挥作用。当外源DNA入侵细菌时,Ⅱ型CRISPR系统首先将入侵DNA整合到CRISPR重复序列之间。随后，包含入侵DNA序列的CRISPR RNA(crRNA)被转录和加工出来。此后，反式激活crRNA(transactivating CRISPR RNA,tracrRNA)与crRNA结合,并最终与Cas9蛋白形成复合物。最后，Cas9蛋白通过其HNH和RuvC样结构域发挥核酸内切酶作用引发DNA双链断裂。DNA的双链断裂会引发损伤修复机制，在不同的条件下细胞会以不同的方式进行修复。在大多数情况下，细胞会发生不精确的非同源末端连接修复，由此可以实现基因的敲除。当有同源模板存在的情况下，细胞会发生精确的同源介导修复，从而可以实现外源序列的插入或替换。迄今，CRISPR/Cas9技术已经在很多领域得以成功应用，显示出广阔的前景。

嵌合抗原受体T细胞技术(Chimeric Antigen Receptor T-Cell,CAR-T)是近年来兴起的一种新型过继免疫疗法。它将患者T细胞在体外进行基因改造，经过一定扩增后回输至患者体内，从而实现肿瘤的靶向杀伤。CAR-T结构主要包括胞外特异性识别肿瘤特定抗原的单链抗体、跨膜结构域、胞内T细胞活化的串联信号结构域。自从2013年《科学》杂志将肿瘤免疫治疗技术评选为年度十大科技突破，该领域的研究得到了蓬勃发展。目前，已有六款CAR-T产品被美国食品药品监督管理局批准用于血液肿瘤的临床治疗，标志着CAR-T技术的巨大成功(N Engl J Med.2017Dec 28；377(26):2593-2596)。虽然包括CAR-T治疗在内的T细胞疗法显现出良好的应用前景，但目前依然存在很多问题，有着巨大的改进空间。其中一个主要问题在于治疗的有效性还有待进一步的提高。虽然在针对难治复发的末线血液肿瘤患者治疗中CAR-T疗法已经取得了不错的效果，但总体缓解率和响应维持时间还有待进一步的提高。而针对实体肿瘤的治疗，目前的CAR-T疗法尚未取得实质性的突破。因此，如何进一步提高CAR-T等T细胞疗法的有效性依然是本领域的一个重大科学问题，这对免疫细胞疗法的进一步发展和广泛应用都具有重要的意义。

目前CAR-T等T细胞疗法的细胞制备主要采用慢病毒感染的方式，该制备方法本身无法提高T细胞的效能，制备T细胞效能很大程度依赖于制备前供者T细胞自身的状态。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中工程化T细胞效能不高的缺陷，提供了一种提高T细胞效能的方法。本发明可以在供者T细胞自身状态的基础上，显著提高制备的T细胞的效能，使工程化T细胞体现出更强大、更持久的肿瘤杀伤功能。

本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。

本发明的第一方面提供一种提高T细胞效能的方法，所述方法包括：向宿主T细胞中通过电转法导入外源序列，获得工程化T细胞并进行培养。

本发明中，所述提高T细胞效能可通过一种或多种方式实现，例如选自提高记忆性T细胞比例、改变T细胞的表观遗传学调控、改变T细胞的代谢调控、改变T细胞作用的信号通路、上调重要的调控基因和下调重要的抑制基因中的一种或多种。

本发明一些实施方案中，所述提高T细胞效能通过提高记忆性T细胞比例实现，所述记忆性T细胞比例是指所述培养后分化的记忆性T细胞在工程化T细胞中的占比。

本发明中，通过提高记忆性T细胞的比例来提高T细胞的效能的可能原理是通过电转导入T细胞的外源序列能激活宿主T细胞的天然免疫信号通路，促使更多的T细胞向记忆性T细胞分化，从而提高了制备得到的细胞中记忆性T细胞的比例，维持并增强T细胞的应答能力。

本发明中，所述外源序列选自核苷酸序列和氨基酸序列。

本发明一些实施方案中，所述工程化T细胞为含有所述外源序列的工程化T细胞。

本发明一些实施方案中，所述外源序列携带编码目的蛋白的核酸信息或氨基酸序列。

本发明中，所述核酸信息为DNA或RNA。

本发明一些实施方案中，所述DNA选自环状双链DNA、环状单链DNA、线性双链DNA和线性单链DNA。

本发明一些具体实施方案中，所述RNA为mRNA。

本发明一些实施方案中，所述外源序列携带编码目的蛋白的核酸信息，所述工程化T细胞为表达所述目的蛋白的工程化T细胞。

本发明一些实施方案中，所述目的蛋白为人工改造蛋白。

本发明中，所述人工改造蛋白可为本领域常规，例如为来自非宿主T细胞的天然蛋白或非天然蛋白，或者来自宿主T细胞的具有表达位置和/或表达水平差异的天然蛋白。

本发明一些具体实施方案中，所述人工改造蛋白选自嵌合抗原受体和T细胞受体。

本发明一些实施方案中，所述外源序列通过包含其的重组表达载体导入所述宿主T细胞。

本发明一些具体实施方案中，所述重组表达载体为DNA重组表达载体。

本发明中，所述DNA重组表达载体可为本领域常规，例如质粒、微环DNA、噬菌体或病毒。

本发明中，所述DNA重组表达载体的形式可为环状双链DNA、环状单链DNA、线性双链DNA或线性单链DNA。

本发明另一些具体实施方案中，所述重组表达载体为RNA重组表达载体。

本发明中，所述RNA重组表达载体可为本领域常规，例如脂质体、纳米粒或病毒。

本发明一些实施方案中，所述方法还包括：将辅助工具通过电转法或慢病毒转染法导入所述宿主T细胞；

所述辅助工具为辅助所述外源序列导入宿主T细胞和/或整合入所述宿主T细胞基因组的工具。

本发明中，所述辅助工具可为本领域常规，例如辅助所述外源序列导入所述宿主T细胞和/或辅助所述外源序列中的核酸信息整合入所述宿主T细胞的基因组的工具。

本发明一些具体实施方案中，所述辅助工具选自基因编辑工具和转座系统。

当所述辅助工具为基因编辑工具时，所述基因编辑工具包括核酸酶和向导RNA。

本发明一些实施方案中，所述核酸酶为Cas蛋白；例如为Cas9。

当所述辅助工具为转座系统时，所述转座系统包括转座酶。

本发明的第二方面提供一种记忆T细胞，所述记忆T细胞通过培养如第一方面所述的方法制备得到的工程化T细胞获得。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明的方法能通过例如提高记忆性T细胞比例显著提高制备的T细胞效能，能有效增强T细胞的抗肿瘤功能，提升细胞产品的有效性。本发明一实施例表明，与同时电转Cas9蛋白和sgRNA相比，当电转体系中加入DNA模板(同时电转Cas9蛋白、sgRNA、DNA模板)后能有效提高制备细胞中记忆性T细胞的比例，从而提高T细胞的效能。

本发明可以在供者T细胞自身状态的基础上，显著提高制备T细胞的效能，使工程化T细胞体现出更强大、更持久的肿瘤杀伤功能。本发明能极大程度提高CAR-T等T细胞疗法的有效性，为肿瘤等临床治疗带来新的希望。

附图说明

图1为不同方法制备细胞的CAR阳性率示意图。

图2为单细胞测序细胞分群分析示意图；

图中：a为细胞分群tSNE图，b为T细胞标志物CD3D表达tSNE图，c为T细胞标志物TRAC表达tSNE图，d为CD4和CD8表达tSNE图。

图3为单细胞测序CD8阳性记忆性T细胞分群分析示意图；

图中：a为CD8记忆性细胞和无功能性细胞分群tSNE图，b为CD8记忆性细胞、无功能性细胞、细胞毒性细胞标志物表达热图，c为CD8记忆性细胞标志物表达tSNE图，d为CD8无功能性细胞和细胞毒性细胞标志物表达tSNE图。

图4为不同方法制备细胞的记忆性T细胞比例示意图；

图中：a为合并样品中记忆性T细胞的比例，b为单独样品中记忆性T细胞的比例，c为记忆性和无功能性T细胞分群tSNE图，d为合并样品中记忆性T细胞的比例，e为单独样品中记忆性T细胞的比例。

图5为不同方法制备CAR-T细胞对Raji细胞的杀伤效果示意图；

图中：a为小鼠活体成像，b为小鼠生存曲线。

图6为不同方法制备CAR-T细胞对过表达PDL1的Raji细胞的杀伤效果示意图；

图中：a为小鼠活体成像图，b为肿瘤细胞的荧光强度，c为小鼠生存曲线。

上述图中：未处理(Untreated)指未编辑的对照T细胞，PD1-19bbz为电转方法制备的PD1定点整合靶向CD19的CAR-T细胞；AAVS1-19bbz为电转方法制备的AAVS1定点整合靶向CD19的CAR-T细胞，LV-19bbz为慢病毒感染方法制备的靶向CD19的CAR-T细胞，LV-19bbz_PD1-KO为慢病毒感染后通过电转方法制备的PD1敲除的靶向CD19的CAR-T细胞。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例中的T细胞为来自B细胞非霍奇金淋巴瘤患者的T细胞。

实施例1

1.电转T细胞

电转T细胞是实现T细胞基因编辑的技术方法，步骤参照Lonza公司P3 PrimaryCellX试剂盒说明书。

仪器与材料：

①Lonza 4D-Nucleofector^TMSystem细胞核转仪

②试剂盒为P3 Primary Cell 4D-Nucleofector^TMX Kit，(Lonza,V4XP-3024)

③CD3/CD28磁珠刺激后2-4天的T细胞

④商品化spCas9蛋白(5μg/μL)(TrueCut^TMCas9 Protein v2，Thermofisher)

⑤合成的sgRNA(将合成的sgRNA溶解于TE缓冲液中，稀释成终浓度10μg/μL)：AAVS1-sgRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)和PD1-sgRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)

AAVS1-sgRNA(SEQ ID NO:1)：

a*g*a*gcuagcacagacuagagGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*U*U*U

PD1-sgRNA(SEQ ID NO:2)：

c*g*a*cuggccagggcgccuguGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*U*U*U

下划线为2-OMe-RNA，*号为硫代修饰。

⑥含同源模板的线性化双链DNA

PD1 DNA模板序列(SEQ ID NO:3)：

CCCTGCCACCGCCCCAGCCCCCCCGTCAGGCTGTTGCAGGCATCACACGGTGGAAAGATCTGGAACTGTGGCCATGGTGTGAGGCCATCCACAAGGTGGAAGCTTTGAGGGGGAGCCGATTAGCCATGGACAGTTGTCATTCAGTAGGGTCACCTGTGCCCCAGCGAAGGGGGATGGGCCGGGAAGGCAGAGGCCAGGCACCTGCCCCCAGCAGGGGCAGAGGCTGTGGGCAGCCGGGAGGCTCCCAGAGGCTCCGACAGAATGGGAGTGGGGTTGAGCCCACCCCTCACTGCAGCCCAGGAACCTGAGCCCAGAGGGGGCCACCCACCTTCCCCAGGCAGGGAGGCCCGGCCCCCAGGGAGATGGGGGGGATGGGGGAGGAGAAGGGCCTGCCCCCACCCGGCAGCCTCAGGAGGGGCAGCTCGGGCGGGATATGGAAAGAGGCCACAGCAGTGAGCAGAGACACAGAGGAGGAAGGGGCCCTGAGCTGGGGAGACCCCCACGGGGTAGGGCGTGGGGGCCACGGGCCCACCTCCTCCCCATCTCCTCTGTCTCCCTGTCTCTGTCTCTCTCTCCCTCCCCCACCCTCTCCCCAGTCCTACCCCCTCCTCACCCCTCCTCCCCCAGCACTGCCTCTGTCACTCTCGCCCACGTGGATGTGGAGGAAGAGGGGGCGGGAGCAAGGGGCGGGCACCCTCCCTTCAACCTGACCTGGGACAGTTTCCCTTCCGCTCACCTCCGCCTGAGCAGTGGAGAAGGCGGCACTCTGGTGGGGCTGCTCCAGGCATGCAGATCCCACATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTGTCGAGGCCGCGGATCCTTCGAATTCTTAGCGAGGGGGCAGGGCCTGCATGTGAAGGGCGTCGTAGGTGTCCTTGGTGGCTGTACTGAGACCCTGGTAAAGGCCATCGTGCCCCTTGCCCCTCCGGCGCTCGCCTTTCATCCCAATCTCACTGTAGGCCTCCGCCATCTTATCTTTCTGCAGTTCATTGTACAGGCCTTCCTGAGGGTTCTTCCTTCTCGGCTTTCCCCCCATCTCAGGGTCCCGGCCACGTCTCTTGTCCAAAACATCGTACTCCTCTCTTCGTCCTAGATTGAGCTCGTTATAGAGCTGGTTCTGGCCCTGCTTGTACGCGGGGGCGTCTGCGCTCCTGCTGAACTTCACTCTCAGTTCACATCCTCCTTCTTCTTCTTCTGGAAATCGGCAGCTACAGCCATCTTCCTCTTGAGTAGTTTGTACTGGTCTCATAAATGGTTGTTTGAATATATACAGGAGTTTCTTTCTGCCCCGTTTGCAGTAAAGGGTGATAACCAGTGACAGGAGAAGGACCCCACAAGTCCCGGCCAAGGGCGCCCAGATGTAGATATCACAGGCGAAGTCCAGCCCCCTCGTGTGCACTGCGCCCCCCGCCGCTGGCCGGCACGCCTCTGGGCGCAGGGACAGGGGCTGCGACGCGATGGTGGGCGCCGGTGTTGGTGGTCGCGGCGCTGGCGTCGTGGTTGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCCTTGGCCCCAGTAGTCCATAGCATAGCTACCACCGTAGTAATAATGTTTGGCACAGTAGTAAATGGCTGTGTCATCAGTTTGCAGACTGTTCATTTTTAAGAAAACTTGGCTCTTGGAGTTGTCCTTGATGATGGTCAGTCTGGATTTGAGAGCTGAATTATAGTATGTGGTTTCACTACCCCATATTACTCCCAGCCACTCCAGACCCTTTCGTGGAGGCTGGCGAATCCAGCTTACACCATAGTCGGGTAATGAGACCCCTGAGACAGTGCATGTGACGGACAGGCTCTGTGAGGGCGCCACCAGGCCAGGTCCTGACTCCTGCAGTTTCACCTCAGATCCGCCGCCACCCGACCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCTGTGATCTCCAGCTTGGTCCCCCCTCCGAACGTGTACGGAAGCGTATTACCCTGTTGGCAAAAGTAAGTGGCAATATCTTCTTGCTCCAGGTTGCTAATGGTGAGAGAATAATCTGTTCCAGACCCACTGCCACTGAACCTTGATGGGACTCCTGAGTGTAATCTTGATGTATGGTAGATCAGGAGTTTAACAGTTCCATCTGGTTTCTGCTGATACCAATTTAAATATTTACTAATGTCCTGACTTGCCCTGCAACTGATGGTGACTCTGTCTCCCAGAGAGGCAGACAGGGAGGATGTAGTCTGTGTCATCTGGATGTCCGGCCTGGCGGCGTGGAGCAGCAAGGCCAGCGGCAGGAGCAAGGCGGTCACTGGTAAGGCCATGGTGGCTCTAGAGTAGGCGCCGGTCACAGCTTGGATCTGTAACGGCGCAGAACAGAAAACGAAACAAAGACGTAGAGTTGAGCAAGCAGGGTCAGGCAAAGCGTGGAGAGCCGGCTGAGTCTAGGTAGGCTCCAAGGGAGCGCCGGACAAAGGCCCGGTCTCGACCTGAGCTTTAAACTTACCTAGACGGCGGACGCAGTTCAGGAGGCACCACAGGCGGGAGGCGGCAGAACGCGACTCAACCGGCGTGGATGGCGGCCTCAGGTAGGGCGGCGGGCGCGTGAAGGAGAGATGCGAGCCCCTCGAAGCTTCAGCTGTGTTCTGGCGGCAAACCCGTTGCGAAAAAGAACGTTCACGGCGACTACTGCACTTATATACGGTTCTCCCCCACCCTCGGGAAAAAGGCGGAGCCAGTACACGACATCACTTTCCCAGTTTACCCCGCGCCACCTTCTCTAGGCACCCGTTCAATTGCCGACCCCTCCCCCCAACTTCTCGGGGACTGTGGGCGATGTGCGCTCTGCCCACTGACGGGCACCGGAGCGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGGTAGGTGGGGTCGGCGGTCAGGTGTCCCAGAGCCAGGGGTCTGGAGGGACCTTCCACCCTCAGTCCCTGGCAGGTCGGGGGGTGCTGAGGCGGGCCTGGCCCTGGCAGCCCAGGGGTCCCGGAGCGAGGGGTCTGGAGGGACCTTTCACTCTCAGTCCCTGGCAGGTCGGGGGGTGCTGTGGCAGGCCCAGCCTTGGCCCCCAGCTCTGCCCCTTACCCTGAGCTGTGTGGCTTTGGGCAGCTCGAACTCCTGGGTTCCTCTCTGGGCCCCAACTCCTCCCCTGGCCCAAGTCCCCTCTTTGCTCCTGGGCAGGCAGGACCTCTGTCCCCTCTCAGCCGGTCCTTGGGGCTGCGTGTTTCTGTAGAATGACGGGTCAGGCTGGCCAGAACCCCAAACCTTGGCCGTGGGGAGTCTGCGTGGCGGCTCTGCCTTGCCCAGGCATCCTTGGTCCTCACTCGAGTTTTCCTAAGGATGGGATGAGCCCCATGTGGGACTAACCTTGGCTTTACGACGTCAAAGTTTAGATGAGCTGGTGATATTTTTCTCATTATATCCAAAGTGTACCTGTTCGAGTGAGGACAGTTCTTCTGTCTCCAGGATCCCTCCTGGGTGGGGATTGTGCCCGCCTGGGTCTCTGCCCAGATTCCAGGGCTCTCCCCGAGCCCTGTTCAGACCATCCGTGGGGGAGGCCTTGGCCTCACTCTCCCGGATCGAGGAGAGAGGGAGCCTCTTCCTGG

AAVS1 DNA模板序列(SEQ ID NO:4)：

CCCTCTCCTGAACCTGAGCCAGCTCCCATAGCTCAGTCTGGTCTATCTGCCTGGCCCTGGCCATTGTCACTTTGCGCTGCCCTCCTCTCGCCCCCGAGTGCCCTTGCTGTGCCGCCGGAACTCTGCCCTCTAACGCTGCCGTCTCTCTCCTGAGTCCGGACCACTTTGAGCTCTACTGGCTTCTGCGCCGCCTCTGGCCCACTGTTTCCCCTTCCCAGGCAGGTCCTGCTTTCTCTGACCTGCATTCTCTCCCCTGGGCCTGTGCCGCTTTCTGTCTGCAGCTTGTGGCCTGGGTCACCTCTACGGCTGGCCCAGATCCTTCCCTGCCGCCTCCTTCAGGTTCCGTCTTCCTCCACTCCCTCTTCCCCTTGCTCTCTGCTGTGTTGCTGCCCAAGGATGCTCTTTCCGGAGCACTTCCTTCTCGGCGCTGCACCACGTGATGTCCTCTGAGCGGATCCTCCCCGTGTCTGGGTCCTCTCCGGGCATCTCTCCTCCCTCACCCAACCCCATGCCGTCTTCACTCGCTGGGTTCCCTTTTCCTTCTCCTTCTGGGGCCTGTGCCATCTCTCGTTTCTTAGGATGGCCTTCTCCGACGGATGTCTCCCTTGCGTCCCGCCTCCCCTTCTTGTAGGCCTGCATCATCACCGTTTTTCTGGACAACCCCAAAGTACCCCGTCTCCCTGGCTTTAGCCACCTCTCCATCCTCTTGCTTTCTTTGCCTGGACACCCCGTTCTCCTGTGGATTCGGGTCACCTCTCACTCCTTTCATTTGGGCAGCTCCCCTACCCCCCTTACCTCTCTAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTGTCGAGGCCGCGGATCCTTCGAATTCTTAGCGAGGGGGCAGGGCCTGCATGTGAAGGGCGTCGTAGGTGTCCTTGGTGGCTGTACTGAGACCCTGGTAAAGGCCATCGTGCCCCTTGCCCCTCCGGCGCTCGCCTTTCATCCCAATCTCACTGTAGGCCTCCGCCATCTTATCTTTCTGCAGTTCATTGTACAGGCCTTCCTGAGGGTTCTTCCTTCTCGGCTTTCCCCCCATCTCAGGGTCCCGGCCACGTCTCTTGTCCAAAACATCGTACTCCTCTCTTCGTCCTAGATTGAGCTCGTTATAGAGCTGGTTCTGGCCCTGCTTGTACGCGGGGGCGTCTGCGCTCCTGCTGAACTTCACTCTCAGTTCACATCCTCCTTCTTCTTCTTCTGGAAATCGGCAGCTACAGCCATCTTCCTCTTGAGTAGTTTGTACTGGTCTCATAAATGGTTGTTTGAATATATACAGGAGTTTCTTTCTGCCCCGTTTGCAGTAAAGGGTGATAACCAGTGACAGGAGAAGGACCCCACAAGTCCCGGCCAAGGGCGCCCAGATGTAGATATCACAGGCGAAGTCCAGCCCCCTCGTGTGCACTGCGCCCCCCGCCGCTGGCCGGCACGCCTCTGGGCGCAGGGACAGGGGCTGCGACGCGATGGTGGGCGCCGGTGTTGGTGGTCGCGGCGCTGGCGTCGTGGTTGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCCTTGGCCCCAGTAGTCCATAGCATAGCTACCACCGTAGTAATAATGTTTGGCACAGTAGTAAATGGCTGTGTCATCAGTTTGCAGACTGTTCATTTTTAAGAAAACTTGGCTCTTGGAGTTGTCCTTGATGATGGTCAGTCTGGATTTGAGAGCTGAATTATAGTATGTGGTTTCACTACCCCATATTACTCCCAGCCACTCCAGACCCTTTCGTGGAGGCTGGCGAATCCAGCTTACACCATAGTCGGGTAATGAGACCCCTGAGACAGTGCATGTGACGGACAGGCTCTGTGAGGGCGCCACCAGGCCAGGTCCTGACTCCTGCAGTTTCACCTCAGATCCGCCGCCACCCGACCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCTGTGATCTCCAGCTTGGTCCCCCCTCCGAACGTGTACGGAAGCGTATTACCCTGTTGGCAAAAGTAAGTGGCAATATCTTCTTGCTCCAGGTTGCTAATGGTGAGAGAATAATCTGTTCCAGACCCACTGCCACTGAACCTTGATGGGACTCCTGAGTGTAATCTTGATGTATGGTAGATCAGGAGTTTAACAGTTCCATCTGGTTTCTGCTGATACCAATTTAAATATTTACTAATGTCCTGACTTGCCCTGCAACTGATGGTGACTCTGTCTCCCAGAGAGGCAGACAGGGAGGATGTAGTCTGTGTCATCTGGATGTCCGGCCTGGCGGCGTGGAGCAGCAAGGCCAGCGGCAGGAGCAAGGCGGTCACTGGTAAGGCCATGGTGGCTCTAGAGTAGGCGCCGGTCACAGCTTGGATCTGTAACGGCGCAGAACAGAAAACGAAACAAAGACGTAGAGTTGAGCAAGCAGGGTCAGGCAAAGCGTGGAGAGCCGGCTGAGTCTAGGTAGGCTCCAAGGGAGCGCCGGACAAAGGCCCGGTCTCGACCTGAGCTTTAAACTTACCTAGACGGCGGACGCAGTTCAGGAGGCACCACAGGCGGGAGGCGGCAGAACGCGACTCAACCGGCGTGGATGGCGGCCTCAGGTAGGGCGGCGGGCGCGTGAAGGAGAGATGCGAGCCCCTCGAAGCTTCAGCTGTGTTCTGGCGGCAAACCCGTTGCGAAAAAGAACGTTCACGGCGACTACTGCACTTATATACGGTTCTCCCCCACCCTCGGGAAAAAGGCGGAGCCAGTACACGACATCACTTTCCCAGTTTACCCCGCGCCACCTTCTCTAGGCACCCGTTCAATTGCCGACCCCTCCCCCCAACTTCTCGGGGACTGTGGGCGATGTGCGCTCTGCCCACTGACGGGCACCGGAGCTAGTCTGTGCTAGCTCTTCCAGCCCCCTGTCATGGCATCTTCCAGGGGTCCGAGAGCTCAGCTAGTCTTCTTCCTCCAACCCGGGCCCCTATGTCCACTTCAGGACAGCATGTTTGCTGCCTCCAGGGATCCTGTGTCCCCGAGCTGGGACCACCTTATATTCCCAGGGCCGGTTAATGTGGCTCTGGTTCTGGGTACTTTTATCTGTCCCCTCCACCCCACAGTGGGGCCACTAGGGACAGGATTGGTGACAGAAAAGCCCCATCCTTAGGCCTCCTCCTTCCTAGTCTCCTGATATTGGGTCTAACCCCCACCTCCTGTTAGGCAGATTCCTTATCTGGTGACACACCCCCATTTCCTGGAGCCATCTCTCTCCTTGCCAGAACCTCTAAGGTTTGCTTACGATGGAGCCAGAGAGGATCCTGGGAGGGAGAGCTTGGCAGGGGGTGGGAGGGAAGGGGGGGATGCGTGACCTGCCCGGTTCTCAGTGGCCACCCTGCGCTACCCTCTCCCAGAACCTGAGCTGCTCTGACGCGGCCGTCTGGTGCGTTTCACTGATCCTGGTGCTGCAGCTTCCTTACACTTCCCAAGAGGAGAAGCAGTTTGGAAAAACAAAATCAGAATAAGTTGGTCCTGAGTTCTAACTTTGGCTCTTCACCTTTCTAGTCCCCAATTTATATTGTTCCTCCGTGCGTCAGTTTTACCTGTGAGATAAGGCCAGTAGCCAGCCCCGTCCTGGCAGGGCTGTGGTGAGGAGGGGGGTGTCCGTGTGGAAAACTCCCTTTGTGAGAATGGTGCGT

具体操作步骤(适用于100μL规格的电转杯)：

(1)按照82μL Solution+18μL supplement/每个电转杯，按电转总数，配置一个电转液混合液，混匀，放室温。

(2)将Cas9蛋白和sgRNA进行共孵育，室温放置10min，形成RNP。

(3)RNP中加入线性化的同源模板双链DNA，室温孵育2min。

所述同源模板双链DNA包含CAR序列的DNA，所述CAR序列包括靶向CD19的胞外结构域，选自CD8α的跨膜区以及选自CD3ζ和CD137的胞内信号传导结构域。

(4)收集CD3/CD28磁珠刺激后处于激活状态的T细胞，计数为5×10⁶进行一个电转反应。

(5)将上述T细胞与上述RNP和同源模板双链DNA充分混合重悬，加入电转杯。

(6)打开电转仪，将电转杯放入槽孔，选择相应程序EO115进行电转。

(7)将细胞加入已预热的细胞培养基X-VIVO+2％人AB血清中，于细胞培养箱中培养。

2.慢病毒感染T细胞

(1)取CD3/CD28磁珠刺激后激活培养2-4天的T细胞进行计数，以感染2×10⁶的T细胞为例，根据计数结果取所需体积的T细胞。

200×G离心4min后弃上清，加入细胞培养基X-VIVO+2％人AB血清重悬细胞。

(2)设置感染复数MOI＝3:1，根据病毒滴度结果，取所需体积的病毒浓缩液(辅助载体为psPAX2及pMD2.G，目的序列质粒以pCDH为载体骨架，感染的外源序列跟电转的DNA模板相同)滴加至细胞中，最后添加2μL Polybrene试剂(1000×)，混合均匀。

(3)将细胞放到细胞培养箱中培养12-24h。

(4)取出细胞，吹匀并吸取细胞至15ml离心管中，200×G离心4min后弃上清

(5)使用PBS清洗细胞两次，然后用新鲜的培养基X-VIVO+2％人AB血清重悬细胞，置于细胞培养箱中继续培养。

3.慢病毒感染和电转T细胞

(1)取CD3/CD28磁珠刺激后第3天处于激活状态的T细胞进行计数，以感染2×10⁶的T细胞为例，根据计数结果取所需体积的T细胞。

200×G离心4min后弃上清，加入细胞培养基X-VIVO+2％人AB血清重悬细胞。

(2)设置感染复数MOI＝3:1，根据病毒滴度结果，取所需体积的病毒浓缩液(辅助载体为psPAX2及pMD2.G，目的序列质粒以pCDH为载体骨架，感染的外源序列跟电转的DNA模板相同)滴加至细胞中，最后添加2μL Polybrene试剂(1000×)，混合均匀。

(3)将细胞放到细胞培养箱中培养12-24h。

(4)取出细胞，吹匀并吸取细胞至15ml离心管中，200×G离心4min后弃上清。

(5)使用PBS清洗细胞两次，然后用新鲜的培养基X-VIVO+2％人AB血清重悬细胞，置于细胞培养箱中继续培养。

(6)培养24小时后进行细胞计数，参照Lonza公司P3 Primary CellX试剂盒说明书进行电转，按5×10⁶进行一个电转反应。

仪器与材料：

①Lonza 4D-Nucleofector^TMSystem细胞核转仪

②试剂盒为P3 Primary Cell 4D-Nucleofector^TMX Kit，(Lonza,V4XP-3024)

③CD3/CD28磁珠刺激后2-4天的T细胞

④商品化spCas9蛋白(5μg/μL)(TrueCut^TMCas9 Protein v2，Thermofisher)

⑤合成的sgRNA(将合成的sgRNA溶解于TE缓冲液中，稀释成终浓度10μg/μL)：AAVS1-sgRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)和PD1-sgRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)

具体操作步骤(适用于100μL规格的电转杯)：

(1)按照82μL Solution+18μL supplement/每个电转杯，按电转总数，配置一个电转液混合液，混匀，放室温。

(2)将Cas9蛋白和sgRNA进行共孵育，室温放置10min，形成RNP。

(3)将上述T细胞与上述RNP充分混合重悬，加入电转杯。

(4)打开电转仪，将电转杯放入槽孔，选择相应程序EO115进行电转。

(5)将细胞加入已预热的细胞培养基X-VIVO+2％人AB血清中，于细胞培养箱中培养。

4.CAR阳性率检测

1)取1×10⁶细胞于1.5mL离心管中，300×G离心5min后弃上清；

2)向细胞沉淀中加入流式缓冲液(含2％血清的PBS)清洗细胞；

3)置于室温离心机中，300×G离心5min后尽量吸尽上清；

4)与检测抗体或蛋白进行共孵育，冰上孵育30分钟；

5)用流式缓冲液清洗细胞两次，300×G离心5min后尽量吸尽上清；

6)用合适体积流式缓冲液重悬细胞，进行流式上机分析。

5.单细胞测序分析

(1)将上述1和2制备的CAR-T细胞的每个样品取3×10⁶活细胞样品送单细胞测序，保证细胞活率>80％，细胞直径<40μm，细胞结团率<10％，细胞中无杂质和碎片。

(2)通过质控后的细胞进行单细胞分析，根据不同类型细胞标志物，对细胞样品进行分类。

(3)选择CD8阳性T细胞进行进一步分析。

(4)选择记忆性细胞和无功能性细胞标志物对CD8阳性T细胞进行分类。

(5)统计各细胞样品中记忆性细胞的比例。

6.结论

本实施例在电转步骤中加入DNA模板，与Cas9蛋白、sgRNA共同电转能显著提高制备细胞的记忆性T细胞比例，从而提高CAR-T细胞的抗肿瘤功能。

使用本发明的制备方法，我们在T细胞中电转Cas9蛋白、靶向AAVS1位点的sgRNA、含CAR序列的DNA模板，制备了AAVS1定点整合靶向CD19的CAR-T细胞。并在T细胞中电转了Cas9蛋白、靶向PD1位点的sgRNA、含CAR序列的DNA模板，制备了PD1定点整合靶向CD19的CAR-T细胞。为了比较不同制备方法对细胞的影响，我们同时采用其他方法制备了不同的CAR-T细胞，包括采用传统慢病毒感染方法制备的靶向CD19的CAR-T细胞、在慢病毒感染整合CAR序列后电转入Cas9蛋白、sgRNA制备的PD1基因敲除的靶向CD19的CAR-T细胞。另外，我们设置未编辑的T细胞作为对照样品。

如图1所示，流式检测结果显示各制备方法都能有效实现CAR蛋白的稳定表达。

如图2所示，对各细胞样品开展单细胞转录组测序，总细胞分群结果显示大多数细胞为T细胞，都表达CD3D和TRAC这两个T细胞的表面标志物。接着，我们对CD8阳性T细胞中的记忆性细胞比例进行了检测。通过诸如SELL、LEF1、IL7R等记忆性细胞标志物来定义记忆性细胞群。通过诸如LAG3、TIGIT等无功能性细胞标志物和诸如IFNG等细胞毒性细胞标志物，来定义无功能性细胞群(如图3所示)。

分析结果显示CD8阳性T细胞可以按这种方式清晰地区分为两群细胞。之后，我们对不同细胞样品中CD8阳性T细胞的记忆性细胞比例进行了统计(如图4所示)。结果显示与未编辑的T细胞对照相比，慢病毒感染制备的CAR-T细胞的记忆性T细胞比例并未显著改变。在慢病毒感染结合电转方法制备的PD1基因敲除的CAR-T细胞中，记忆性T细胞比例与未编辑的T细胞对照相比略有升高。在两个加入DNA模板的电转制备的CAR-T细胞中，记忆性T细胞的比例与未编辑的T细胞对照相比明显提高。AAVS1定点整合的CAR-T细胞和PD1定点整合的CAR-T细胞中的记忆性T细胞的比例无显著差异，表明目的序列的改变不影响制备方法对记忆性T细胞比例的提高。另外，AAVS1和PD1定点整合CAR-T细胞中记忆性T细胞的比例与CAR是否表达无关，进一步地说明了这种记忆性T细胞比例提高的效果是制备方法本身而非CAR表达带来的。

实施例2

1.体内Raji细胞杀伤实验

(1)选用6-9周龄NCG雌鼠，尾静脉注射2×10⁵荧光素酶稳定表达的Raji肿瘤细胞。

(2)注射肿瘤细胞5天后，尾静脉注射2×10⁶CAR-T细胞。

(3)使用IVIS小动物活体成像仪监测肿瘤负荷的变化。

2.体内PDL1过表达Raji细胞杀伤实验

(1)选用6-9周龄NCG雌鼠，尾静脉注射5×10⁵荧光素酶和PDL1稳定表达的Raji肿瘤细胞。

(2)注射肿瘤细胞5天后，尾静脉注射1×10⁶CAR-T细胞。

(3)使用IVIS小动物活体成像仪监测肿瘤负荷的变化。

3.结论

在此基础上，我们通过小鼠体内肿瘤杀伤模型，进一步比较了不同方法制备的CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。实验结果显示相比于传统慢病毒感染的CAR-T细胞，采用本发明方法制备的AAVS1定点整合CAR-T细胞能更有效地杀伤CD19阳性的Raji细胞，注射了该CAR-T细胞的小鼠能存活更长的时间(如图5所示)。另外，我们也对CAR-T细胞杀伤PDL1过表达Raji细胞的能力进行了检测。结果显示在PD1基因都敲除的情况下，采用本发明方法制备的PD1定点整合CAR-T细胞相比于慢病毒感染结合电转方法制备的PD1敲除CAR-T细胞具有更强的肿瘤杀伤能力(如图6所示)。

综上所述，本发明的制备方法能有效提高制备T细胞的效能，能有效增强T细胞的抗肿瘤功能，提升细胞产品的有效性。这为进一步优化现有T细胞产品的制备方法提供了新的思路，为进一步提高T细胞疗法在肿瘤治疗等方面的疗效提供了新的可能，为进一步拓展T细胞疗法在肿瘤治疗等方面的临床应用提供了有力的帮助。

Claims (10)

1.一种提高T细胞效能的方法，其特征在于，所述方法包括：向宿主T细胞中通过电转法导入外源序列，获得工程化T细胞并进行培养。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提高T细胞效能通过提高记忆性T细胞比例实现，所述记忆性T细胞比例是指所述培养后分化的记忆性T细胞在工程化T细胞中的占比；

和/或，所述外源序列携带编码目的蛋白的核酸信息或氨基酸信息；

和/或，所述工程化T细胞为含有所述外源序列或表达外源序列所携带的核酸信息编码的目的蛋白的工程化T细胞。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述外源序列通过包含其的重组表达载体导入所述宿主T细胞；

较佳地，所述重组表达载体为DNA重组表达载体或RNA重组表达载体。

4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述核酸信息为DNA或RNA；

较佳地，所述DNA选自环状双链DNA、环状单链DNA、线性双链DNA和线性单链DNA；或者，所述RNA为mRNA。

5.如权利要求2～4任一项所述的方法，其特征在于，所述目的蛋白为人工改造蛋白；

较佳地，所述人工改造蛋白选自嵌合抗原受体和T细胞受体。

6.如权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：将辅助工具通过电转法或慢病毒转染法导入所述宿主T细胞；

所述辅助工具为辅助所述外源序列导入宿主T细胞和/或整合入所述宿主T细胞基因组的工具；

较佳地，所述辅助工具选自基因编辑工具和转座系统。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述基因编辑工具包括核酸酶和向导RNA。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述核酸酶为Cas蛋白；

较佳地，所述Cas蛋白为Cas9。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述转座系统包括转座酶。

10.一种记忆T细胞，所述记忆T细胞通过培养如权利要求1～9任一项所述的方法制备得到的工程化T细胞获得。