CN112368372A

CN112368372A - 转化细胞的制备方法

Info

Publication number: CN112368372A
Application number: CN201980040836.5A
Authority: CN
Inventors: 神野雅文; 加藤英政; 德泽佳美; 大西章仁; 明上纯子; 佐藤晋
Original assignee: Aijichuang Co ltd; Barr Industrial Co ltd; Ehime University NUC
Current assignee: Aijichuang Co ltd; Barr Industrial Co ltd; Pearl Kogyo Co Ltd; Ehime University NUC
Priority date: 2018-06-18
Filing date: 2019-06-18
Publication date: 2021-02-12
Also published as: EP3808839A1; JPWO2019244895A1; EP3808839A4; US20210269809A1; WO2019244895A1

Abstract

提供一种转化细胞的制备方法，包括使含有目标分子的导入液和靶细胞接触，向所述靶细胞导入所述目标分子的导入步骤，所述导入步骤中，所述目标分子通过细胞内吞作用被导入所述靶细胞，通过导入所述目标分子而赋予、删除或维持性状后，制备在已建立的细胞中不残留从外部添加的载体等目标分子的转化细胞。

Description

转化细胞的制备方法

技术领域

本发明涉及一种转化细胞的制备方法。

背景技术

作为在细胞内导入核酸或蛋白质等目标分子的方法，已知有使用病毒的生物学方法、电穿孔或显微注射等物理学方法、脂质体等化学方法、使用等离子体的方法(专利文献1：日本特开2013-255475号公报)等。近年来，为了再生医疗或基因治疗等尖端医疗，在细胞或组织中导入目标分子，建立获得了新性状的细胞，并使用这些细胞进行治疗等。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2013-255475号公报

发明内容

发明所要解决的课题

但是，已知使用电穿孔导入目标分子时，在细胞膜上打开细孔，因此具有较高细胞毒性，另外，受损的染色体在修复过程中容易吸收目标分子。由于会产生细胞内残留的目标分子损害细胞自身保持的性状，引起免疫异常或细胞癌化等问题，因此成为再生医疗或基因治疗等尖端医疗的实用化的障碍。即使在一般作为目标分子导入方法的使用病毒的导入方法中，能够导入的细胞种类也有限制，导入的核酸或用于导入遗传基因的病毒载体有时会被整合到染色体中。

因此，为了使采用例如induced pluripotent stem cells(iPS细胞)等被赋予新的性状的细胞的再生医疗或细胞医疗这样的尖端医疗成为能够实用化的医疗技术，希望确立使用不残留外来基因的导入方法的iPS细胞或分化细胞等转化细胞的简便制备方法。

因此，本发明的目的在于提供一种不残留从外部导入的目标分子的转化细胞的制备方法。

用于解决课题的手段

[1]一种转化细胞的制备方法，包括使含有目标分子的导入液和靶细胞接触，向所述靶细胞导入所述目标分子的导入步骤，

通过所述目标分子的导入，制备性状被赋予、删除或维持的转化细胞。

[2]如[1]中所述的制备方法，其中，目标分子选自核酸和蛋白质中的至少一种。

[3]如[2]中所述的制备方法，其中，核酸是载体。

[4]如[3]中所述的制备方法，其中，载体表达对细胞赋予、删除或维持性状的蛋白质。

[5]如[2]～[4]中的任一项所述的制备方法，其中，在转化细胞的80％以上的细胞中，核酸不插入染色体。

[6]如[1]～[5]中的任一项所述的制备方法，其中，在导入步骤中，目标分子通过细胞内吞作用被导入靶细胞。

[7]如[1]～[6]中的任一项所述的制备方法，其中，在导入步骤中，通过对靶细胞进行沿面放电或等离子体照射，从而导入目标分子。

[8]如[1]～[7]中的任一项所述的制备方法，其中，包括导入步骤后培养靶细胞的后培养步骤。

[9]如[8]所述的制备方法，其中，在后培养步骤中，靶细胞的培养基包括能够杀灭细胞的选择分子。

[10]如[1]～[9]中的任一项所述的制备方法，其中，目标分子包含对选择分子具有耐性的选择标记分子。

发明效果

根据本发明，能够提供一种不残留从外部导入的目标分子的转化细胞的制备方法。

附图说明

图1是说明用于目标分子导入的装置的一个例子的示意图。

图2是说明实施例1的用于目标分子导入的装置的一部分的概略侧视图以及俯视图。

图3是说明在试验例1中的目标分子向靶细胞导入的方法的流程图。

图4是示出试验例1中通过沿面放电将pCXLE-EGFP以及pmCherry-C1的质粒共转染后的HDF细胞的(A)GFP以及(B)mCherry的表达的荧光显微镜照片。

图5分别是(A)目标分子导入前的HDF细胞以及(B)导入后的iPS细胞的明亮视野显微镜照片。

图6是通过qPCR测定附加型载体的拷贝数的图表，表示设基因组DNA量为1的相对量。

图7是说明试验例3的示意图。

图8是在试验例3中，通过电穿孔导入pmCherry-C1质粒的L-929细胞的(A)示出mCherry的表达的荧光显微镜照片，(B)明亮视野显微镜照片。

图9是L-929-mCherry细胞的(A)示出mCherry的表达的荧光显微镜照片，(B)明亮视野显微镜照片。

图10是通过等离子体照射导入了psg RNA1-2质粒的L-929-mCherry细胞的(A)示出mCherry的表达的荧光显微镜照片，(B)明亮视野显微镜照片，(C)表示GFP的表达的荧光显微镜照片。

图11是将通过等离子体照射导入了psg RNA1-2质粒的L-929-mCherry细胞长期培养后的(A)示出GFP表达的荧光显微镜照片，(B)示出mCherry表达的荧光显微镜照片，(C)明亮视野显微镜照片，(D)这些的合成照片。图中圆形所示部分存在显示绿色荧光但不显示红色荧光的细胞。

具体实施方式

以下，参照附图对本发明的实施方式进行说明。

本发明的制备方法包括使含有目标分子的导入液和靶细胞接触，将目标分子导入靶细胞的导入步骤，通过上述目标分子的导入，制备性状被赋予、删除或维持的转化细胞。

在本发明中，转化细胞是指，由于目标分子的导入而性状被赋予、删除或维持的细胞，例如可举出基因表达变化的细胞、形态变化的细胞、酶活性变化的细胞、分子的局部变化的细胞等。转化细胞既可以伴随靶细胞基因组变异，也可以不伴随靶细胞基因组变异。也可以伴随DNA的甲基化、组蛋白的甲基化以及乙酰化等表观遗传学变异。被赋予新的性状的转化细胞包括例如表达特定的1或2个以上基因的细胞、干细胞(包括多能干细胞)、祖细胞、去分化细胞、分化诱导的细胞等。性状删除的细胞例如包括抑制了特定1或2个以上基因表达的细胞、从具有基因变异的细胞中删除变异基因的细胞等。另外，转化细胞还包括通过目标分子使性状发生变化的细胞原样维持性状的细胞、性状删除后被赋予性状的细胞等，例如还包括从遗传病患者的干细胞删除致病基因并导入正常基因的细胞。可以通过本领域技术人员熟知的显微镜观察形态、定量RNA或蛋白质表达量的方法、免疫染色等方法来判断是否为转化细胞。

在转化细胞中，所谓目标分子不残留，是指在目标分子导入后培养一定时间后，通过公知的方法测定的目标分子的量在检测限值以下或者在一定的检测值以下。其取决于靶细胞内的目标分子的浓度或稳定度，例如从导入后培养1周，优选培养2周以上后，进行细胞的克隆，确认目标分子的残留即可。使用核酸作为目标分子时，所谓目标分子不残留，是指例如导入的核酸未插入转化细胞染色体。所谓目标分子未插入转化细胞染色体，是指例如从制备的转化细胞中提取基因组DNA，进行以目标分子核酸序列为靶标的qPCR，设基因组DNA的拷贝数为1时，目标分子的相对量为0.1以下的情况。在所获得的转化细胞中，核酸未插入染色体的细胞比例优选为80％以上，更优选为90％以上，最优选为100％。

(靶细胞)

本发明的制备方法中使用的靶细胞是指作为导入目标分子的靶标的细胞，并不限定于特定种类的细胞。作为这样的靶细胞的具体例子，可以举出包含人类的动物细胞。作为动物细胞，例如可举出构成组织的细胞(成纤维细胞、表皮细胞、乳腺细胞、脂肪细胞、成肌细胞、成骨细胞、肝细胞、心肌细胞、血管内皮细胞或其祖细胞等)、免疫系统的细胞(B细胞、T细胞、单核细胞等)、神经细胞、干细胞(包括多能干细胞、血球系统干细胞、间叶系统干细胞、神经干细胞)、肿瘤细胞等。细胞可以是贴壁细胞，也可以是悬浮细胞。靶细胞可以通过例如从ATCC、JCRB、RIKEN BRC等保藏机构或从市售制造商购买而获得。靶细胞可以使用单一的种类，也可以混合使用2种以上而同时向多个靶细胞导入目标分子。

靶细胞包括从生物个体或组织采集的细胞，以及生物个体或组织内的细胞。从生物的个体或组织中采集的细胞包括不以返回至医药品的研究开发等所使用的生物个体为前提的细胞和以返回至再生医疗等所使用的生物个体为前提的细胞。从生物个体或组织采集的细胞中也包括从生物个体或组织采集的细胞所培养的细胞。

本发明所使用的靶细胞包括大肠杆菌、放线菌、枯草菌等原核细胞、酵母等微生物细胞、昆虫细胞、小鼠、兔子、大鼠、山羊、犬、猴子等哺乳类细胞、植物细胞等真核细胞。

另外，本发明中使用的靶细胞也可以是没有进行特别处理的细胞，但为了提高目标分子的导入效率，也可以是在导入基因时通常使用的、进行了感受态细胞的处理的细胞。作为具体的例子，可以举出用氯化钙进行处理而细胞膜的结构发生变化，使DNA分子易于透过的大肠菌的感受态细胞等。

在本发明中，靶细胞也包括作为导入目标分子的靶标的靶组织。本发明中的组织是指具有几种不同性质或功能的细胞以一定的方式集合的结构单元。靶组织不限于特定种类的组织。作为这样的靶组织的具体例子，有从生物体回收的组织、生物体内的组织、用于移植的来自供体的脏器、通过培养再构成的组织、通过愈伤组织培养构建的植物分化前的组织等。靶组织可以是例如胎生组织、胚胎组织、皮肤组织、骨组织、软骨组织、肌肉组织、脂肪组织、心肌组织、神经系统组织、肺组织、胰腺组织、肝脏组织、毛乳头组织、牙髓、肿瘤组织等组织。这些靶组织可以使用单一的种类，也可以将2种以上混合使用。使用组织作为靶细胞时，通过目标分子的导入，制备出性状被赋予或删除的组织。

(目标分子)

在本发明中，所谓目标分子，表示作为靶细胞导入对象的分子，并不特别限定于特定的种类的分子，优选是选自(a)核酸和(b)蛋白质中的至少一种。

(a)核酸

作为核酸的具体例子，可以举出DNA、RNA、其他核酸分子或其衍生物。DNA或RNA可以是单链或双链，也可以是线状或环状。核酸的分子量不作特别限定。RNA包括信使RNA(mRNA)、核酶、small interfering RNA(siRNA)、small hairpin RNA(shRNA)、导向RNA(gRNA)、反义RNA和其他non-coding RNA等。作为核酸，也可以包含作为这些的RNA而被转录的核酸(DNA)。另外，核酸也可以包括编码下述蛋白质的核酸(DNA或RNA)。这些核酸可以组合一种或两种以上进行导入。

核酸优选为载体。载体是用来扩增、维持、导入核酸的核酸分子介质。在本发明中，载体优选为表达载体，插入有表达目标RNA或蛋白质的核酸序列。作为表达载体，可以使用例如质粒载体、粘粒载体、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)和其他非质粒载体。表达载体具有高效表达RNA或蛋白质的结构(序列)。作为这样的序列，例如，包括启动子序列、Kozak序列、Shine-Dalgarno序列、内含子、间隔子序列、增强子序列、终止子序列、内部核糖体导入部位(IRES)等。

(b)蛋白质

作为蛋白质，列举了肽、聚肽及其衍生物等氨基酸聚合的高分子化合物。蛋白质包括但不限于公知的多种蛋白质，包括信号转导物质、基因表达调控因子(包括转录、翻译、输送)、DNA甲基化调节因子、组蛋白修饰调节因子、用于基因组编辑的因子、结构蛋白质、生长因子、激素、酶、配体、受体、抗体或抗体的Fab部分、不能经口给药的蛋白质医药品等。

作为目标分子导入的蛋白质或者从导入的核酸或载体中表达的蛋白质优选是赋予、删除或维持细胞性状的蛋白质，更优选的是通过暂时性表达，稳态地赋予、删除或维持细胞性状的蛋白质。作为这样的蛋白质，列举了转录调节因子(例如SOX2、KLF4、L-Myc、OCT3/4等)、翻译调节因子(例如Lin28等)、DNA甲基化调节因子(例如TET1等)、用于基因组编辑的因子(例如Cas9等)、增殖因子(例如Activin、BMP4等)。可以组合这些蛋白质1种或2种以上导入。

作为其他的目标分子，列举了糖、脂质、低分子生理活性物质、药剂候补品等，其中优选医药品等具有生理活性的低分子化合物(例如分子量在100kDa以下)，且为在其他的导入方法中，难以导入到组织内或细胞内的低分子化合物。所谓在其他的导入方法中，难以导入到组织内或细胞内的低分子化合物是指分子量在1000Da以上的低分子、膜渗透性低的分子等。上述各种目标分子可以使用单一种类，也可以混合2种以上使用。

作为目标分子，也可以使用基因组编辑系统。基因组编辑系统是指序列特异性地变换遗传信息的系统，其可以删除碱基序列、取代氨基酸序列、导入外来基因等。作为基因组编辑系统，例如，可以列举能够序列特异性地进行DNA切断的锌指核酸酶(Zinc-Finger，ZFN)、TALEN(TALEN)、CRISPR-Cas9(CRISPR/Cas9)、CRISPR-Cpf1(CRISPER/Cpf1)、归巢核酸内切酶(Meganuclease)、CAS9缺口酶和Target-AID等。

一般来说，采用将基因组编辑系统导入细胞内的方法是，将编码病毒所需基因的基因组编辑系统通过病毒的传染力导入到细胞，或者将编码质粒所需基因的基因组编辑系统通过电穿孔法导入到细胞等方法。

在使用病毒导入的方法中，虽然基因的导入效率较高，但存在(1)能够进行实验操作的设施受限；(2)病毒基因组被导入细胞内；(3)使用逆转录病毒等时，以病毒基因组为代表被导入的基因等被整合到染色体中；(4)被使用的病毒感染的细胞受限等问题。通过电穿孔法导入的方法中，存在(1)实施需要1×10⁶细胞这样大量的细胞，细胞的死亡比例高，很难直接导入到来自生物体的细胞或生物体；(2)由于质粒的大小(尺寸)，导入效率大幅降低；(3)导入的遗传基因等被染色体整合等问题。

另外，作为基因组编辑技术的最大问题点，有人指出靶基因以外的基因也会发生变异(脱靶)，这成为阻碍医疗等实用化的主要原因。脱靶的原因之一是，被导入的基因组编辑系统以及病毒基因组或载体的DNA等被整合到染色体中，在细胞内稳态持续地表达基因组编辑系统。

根据本发明，通过高效率地导入基因组编辑系统来编辑靶基因，在基因组编辑完成后，能够简便地获得基因组编辑系统不残留在细胞内的转化细胞。

(导入液)

含有目标分子的导入液虽然没有特别限定，但优选是在水、水溶液、培养基等适当介质中悬浮目标分子。作为该水溶液或悬浮液的溶剂或分散介质，可举出例如生理盐水或pH缓冲溶液等。

[导入步骤]

在本发明的导入步骤中，使含有目标分子的导入液和靶细胞接触，而向靶细胞导入目标分子。所谓向靶细胞中导入目标分子，是指例如，目标分子进入细胞质基质内或核内，成为能够发挥功能的状态。在导入步骤中，目标分子优选是通过细胞内吞导入到靶细胞中。细胞内吞是生物本来所具有的功能，因为它不会像电穿法那样损伤细胞膜或染色体基因，所以能够抑制细胞毒性或染色体基因的变性重组。在导入步骤中，至少包含使含有目标分子的导入液和靶细胞接触的步骤。

＜使含有目标分子的导入液和靶细胞接触的步骤＞

使含有目标分子的导入液和靶细胞接触的步骤优选包括对靶细胞进行预培养的步骤以及添加含有目标分子的导入液的步骤。

在对靶细胞进行预培养的步骤中，在适当的条件下培养靶细胞。对靶细胞进行预培养的方法没有特别限定，但可以举出在培养皿、培养板等细胞培养容器中培养贴壁细胞的方法，或在培养液中悬浮的状态下培养悬浮细胞的方法。用于培养的培养基，如果是通常用于靶细胞培养的培养基，则没有特别限定，例如，可以举出以琼脂培养基为代表的固体培养基或Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)、RPMI 1640Medium、Glasgow MinimumEssential Medium(GMEM)等液体培养基。另外，培养基可以包含公知的添加剂，也可以使用适合培养的饲养细胞。可以适当设置培养时间、培养温度及CO₂浓度等培养条件。

然后，去除预培养的液体培养基。若是贴壁细胞，用吸引器等去除培养基即可。若是悬浮细胞，通过离心分离或过滤等操作分离培养基中悬浮的靶细胞，从而去除培养基。

其次，进行添加含有目标分子的导入液的步骤。优选是以薄薄地覆盖靶细胞的方式添加导入液。另外，当使用靶组织代替靶细胞时，例如在切除的组织切片或组织上直接添加含有目标分子的微量的导入液。

另外，在使含有目标分子的导入液接触靶细胞时，可以使用例如在靶细胞中滴入含有目标分子的导入液的方法、将靶细胞和导入液混合的方法等。另外，作为其他方法，也可以使用向含有靶细胞的分散液或悬浮液等中添加含有目标分子的导入液的方法。

＜导入目标分子的步骤＞

接下来，进行导入目标分子的步骤。在本发明的导入步骤中，优选通过对靶细胞进行沿面放电或等离子体照射从而导入目标分子。这些方法由于不使用具有细胞毒性的试剂，因此能够抑制细胞死亡。另外，沿面放电或等离子体照射的导入方法即使在一般难以导入基因的大分子量的载体(例如5kDa以上、优选为10kDa以上)中也能够维持较高基因导入效率而且每个细胞的目标分子的导入数也能够增加，所以与以往的常用方法相比，能够更有效地获得转化细胞。而且，由于能够通过细胞内吞而在不损伤染色体的情况下导入目标分子，因此能够抑制目标分子被整合到染色体，从而能够得到在染色体中未插入外来基因的细胞。例如，在通过电穿孔进行了基因导入时，最终在40％～90％的目标转化的细胞中发生了到染色体的整合，而根据本方法，该比例能够显著地降低，优选在20％以下，更优选在10％以下。另外，即使通过沿面放电或等离子放电的导入方法，也不能防止自然发生的随机发生的染色体的重组、突变等，因此很少产生外来的目标分子被整合到染色体中的细胞。

作为使用沿面放电的目标分子导入方法，可以适当使用日本特开2010-220517号公报中记载的方法，作为使用等离子体照射的目标分子导入方法，可以适当使用国际公开第2002/064767号、日本特开2013-255475号公报或日本特开2013-255474号公报中记载的方法等。

另外，在导入液中，也可以使用利用了细胞内吞的通用转染试剂(例如脂质转染试剂)。这种情况下，在目标分子的导入步骤中，可以并用沿面放电或者等离子体照射，也可以不并用。

[沿面放电]

以下对使用沿面放电的目标分子导入方法进行详细说明。使用沿面放电的目标分子导入方法包括使含有目标分子的导入液和靶细胞接触的上述步骤，以及使放电从与导入液分离设置的多个电极作用于靶细胞以及导入液的步骤。

＜使放电作用于靶细胞以及导入液的步骤＞

使放电作用于靶细胞以及导入液的步骤并不特别受限于电极的数量，而是使放电从与含有目标分子的导入液分离设置的多个电极作用于导入液。由此，例如，电流流入导入液或其表层，或电场产生。本步骤优选包括在能够对含有目标分子的导入液进行放电的区域内设置多个电极的步骤、在多个电极之间施加电压的步骤、以及在多个电极与含有目标分子的导入液之间产生放电的步骤。通过这些步骤，目标分子导入到靶细胞。

在设置电极的步骤中，优选地，在培养皿等细胞培养容器中保持靶细胞和含有目标分子的导入液的状态下，在能够使放电作用于导入液的区域设置多个电极。

其中，上述容器只要具有能够保持靶细胞和含有目标分子的导入液的结构即可，并没有特别限定，例如可以举出培养板、培养皿、管、试管、烧瓶等。

在多个电极之间施加(供给)电压的步骤中，优选在多个电极之间施加几kVpp到数十kVpp左右的电压，更优选为1kVpp～30kVpp，进一步优选为3kVpp～10kVpp。如果施加高于数十kVpp的电压，靶细胞的死亡率就会提高，另一方面，如果电压低于数kVpp，则无法获得提高目标分子导入率的效果。

从多个电极产生放电的步骤是通过在上述多个电极之间供给电压的步骤，大致同时实现的步骤。通过施加相关电压，而在与含有目标分子的导入液分离设置的电极和含有目标分子的导入液之间进行放电，从而可以实现目标分子的导入。

放电时间优选为0.1msec～100msec，更优选为0.5msec～20ms，进一步优选为1msec～5msec。如果电流流过时间比100msec长，则靶细胞的死亡率就会提高，另一方面，通电时间比0.1msec更短的情况下，则不能充分得到提高目标分子导入率的效果。

为了得到目标转化细胞，与通常的目标分子导入时相比，优选提高电压，延长放电时间。虽然靶细胞的细胞毒性增大，但由于能够增加导入目标分子的细胞数，并且能够增加每个细胞的目标分子的导入量，因此能够提高转化细胞的制备效率。

＜沿面放电用导入装置＞

沿面放电用的导入装置的一个例子如图1所示。导入装置包括2根针状电极1、电源(电压供给单元)2和容器3。利用该电源2，能够在2个电极间施加电压。另外，导入装置的结构并不限定于图1所示的结构。

图1中记载的导入装置所包括的多个电极1与含有目标分子的导入液5分开设置，通过在多个电极间施加电压而在该电极和含有目标分子的导入液之间进行放电，从而将目标分子导入细胞内。

另外，导入装置的特征在于，在本发明的目标分子的导入方法中，在与靶细胞4接触的含有目标分子的导入液5上分开设置有多个电极1。在图1中，电极1与含有目标分子的导入液5分开设置，电极1通过与含有目标分子的导入液5之间产生放电6，在电极间导入目标分子。电极1和含有目标分子的导入液5设置为两者之间的最短距离在10mm以下，且两者不接触。电极1与含有目标分子的导入液5之间的距离优选为0.1～5mm，更优选为0.5mm～1mm。这样，通过将电极1和含有目标分子的导入液5设置成相互不接触，从而进行适当的放电。

另外，在本发明中，为了避免直接在电极间产生等离子体放电，优选对多个电极间的距离或施加于电极间的电压进行调整。这是因为，电极间发生等离子放电时，大气压下的等离子体不稳定，因此对含有目标分子的导入液的架电也不稳定，目标分子的导入效率等也不稳定。另外，这样的多个电极间的距离或施加到电极间的电压的合适范围是受含有目标分子的导入液的电阻等影响的，不能一概决定，但当使用含有通常的目标分子的水溶液时，多个电极中任意2对电极间的距离优选为10～100mm，施加在任意2对电极间的电压优选为1～30kV。

向上述电极供给电压的电压供给单元并没有特别限定，例如可举出高压电源FP1000(PEARL工业株式会社制造)等的电源供给装置，其中，上述电压用以从上述电极向上述含有目标分子的导入液放电。供给电极的波形可以使用正弦波、半波整流、全波整流、脉冲中的任意一个。

本发明的导入装置中使用的电极的形状并没有特别限定，但是为了使从电极向含有目标分子的导入液放电不需要施加超过需要量的电压，优选具有以含有目标分子的导入液5侧为前端的针状等形状。另外，电极的材质并不特别限定，可举出钨、钼等，优选为不易腐蚀的材质、具有金、银、铂等杀菌效果的材质。

导入装置中使用的电极数不限于2个，电极数优选为2以上。通过将电极数设置为2以上，不需要旋转试料等操作就可以使导入均匀化，目标分子的导入率进一步提高，靶细胞的死亡率也降低。

另外，导入装置中使用的电极的数量可以是正电极和负电极的数量相同，也可以是正电极和负电极的数量不同。另外，在配置多个电极时，为了避免电流集中于特定电极而妨碍目标分子的均匀导入，优选在电源2和电极1之间设置电阻22，进而进行调整使电流均匀地流动。另外，可以使用线圈或电容器等代替电阻22。

另外，本导入装置的结构不限于本实施方式中说明的结构，例如电极的数量或设置方式如果能够获得与本实施方式相同的效果，则也可以是相互不同的其他形状。另外，优选电源2具有整流器。

根据本方法，由于不需要喷气等，靶细胞几乎不干燥，不需要添加多余的缓冲液等。另外，可以在短时间内进行处理，电极结构也不需要特别的结构，能够简化。

[等离子体照射]

以下详细说明使用等离子体照射的目标分子导入方法。使用等离子体照射的目标分子导入方法包括使含有目标分子的导入液和靶细胞接触的上述步骤以及使选自荷电粒子、激发原子以及激发分子中的一种或多种构成的集合体与导入液以及靶细胞接触的步骤。

＜使选自荷电粒子、激发原子以及激发分子中的一种或多种构成的集合体与导入液以及靶细胞接触的步骤＞

在本步骤中，例如从上部微电极向含有目标分子的导入液以及靶细胞照射集合体即等离子体。在本步骤中，首先将上部微电极的位置调整到导入液的所希望的位置。底面电极也可以夹住容纳靶细胞的容器并设置在上部微电极的相反一侧。接着，向上部微电极施加电压，产生等离子体。在使用中空管状且具有喷出口的上部微电极的情况下，也可以从喷出口面向导入液以及靶细胞喷出集合体前体。

集合体前体是指用于生成由选自荷电粒子、激发原子以及激发分子中的一种或多种构成的集合体的前体，例如可举出包含选自空气、氮气、氧气、二氧化碳气体、氦气、氖气、氩气、氪气、氙气中的1种以上的气体。气体的组合并不限定于此，另外，也可以将固体或液体包含在前体中。在集合体前体中，例如通过施加电压，生成选自电荷粒子、激励原子以及激发分子中的一种或多种作为构成要素的集合体。集合体只要是通过向集合体前体提供能量而生成的即可，提供能量的方法也可以不是电压施加。

集合体前体例如通过与中空管状的上部微电极的内孔连接的集合体前体供给装置，以规定流量向上部微电极的内孔供给集合体前体，并从喷出口喷出。上部微电极的外径优选为1mm以下，更优选为100μm以下。另外，优选每个上部微电极的所述集合体前体的喷出量为100sccm以下。

接着，通过在上部微电极和底面电极之间施加电压，由集合体前体(例如He气体)生成集合体。该集合体(选自荷电粒子、激发原子以及激发分子中的一种或多种构成的集合体)与导入液以及靶细胞接触，通过产生作用，将目标分子导入靶细胞。

在施加电压的步骤中，施加的电压优选为数kV到数十kV左右，更优选为2kV～30kV，进一步优选为5～20kV。如果以高于数十kV的电压流动电流，靶细胞的死亡率就会提高，相反，如果以低于数kV的电压流动电流，就无法得到提高目标分子导入率的效果。

集合体生成的步骤是通过施加上述电压，几乎同时实现的步骤。这样，通过集合体(选自荷电粒子、激发原子以及激发分子中的一种或多种构成的集合体)作用在含有目标分子的液体(导入液)以及靶细胞，能够显著地提高目标分子的导入率，大大降低靶细胞的死亡率。

施加电压的时间优选为0.1msec～100msec，更优选为0.5msec～50msec，进一步优选为1.0msec～20msec。如果施加电压时间长于100msec，靶细胞的死亡率就会提高，另一方面，如果施加电压时间短于0.1msec，则不能充分得到提高目标分子导入率的效果。

根据本导入方法，可以使目标蛋白质在细胞有效地表达并稳定地存在，由此可以有效地建立转化细胞，在基于细胞功能的改善的动物个体健康维持、体质改善、疾病预防等方面发挥效果。另外，本导入方法不限于本实施方式及实施例记载的用途，还能够用于赋予细胞功能的用途。

＜等离子体放电用导入装置＞

以下对等离子体放电用导入装置的一例进行说明，但导入装置的结构并不限定于此。通过等离子体放电的目标分子导入装置具有适合于上述目标分子导入方法的结构以及功能，优选地，包括容器、在该容器的开口部侧与导入液分离而设置的上部微电极、电压供给单元(电源)、和设置在容器的上部微电极相反一侧的底面电极。通过电压供给单元，能够在上部微电极和底面电极之间施加规定的电压。当使用中空管状的上部微电极时，优选包括喷出集合体前体的机构。

电压供给单元包括信号发生器、线性放大器、匹配电路以及升压变压器。作为电压供给单元，没有特别限定，例如可举出高压电源FP1000(PEARL工业株式会社制造)等的电源供给装置。提供给电极的波形可以使用正弦波、半波整流、全波整流、脉冲中的任意一个。

导入装置基本上包括电源(电压供给机构)、电极和连接电源和电极的导电线。另外，电源包括信号发生器、线性放大器、匹配电路、升压变压器等，由于它们与上部微电极或底面电极通过导电线相互电性连接，因此能够将电极间电压、电极距离、频率、脉冲周期(脉冲频率)、Duty等参数设置为各种条件。由此，可以生成各种性质的集合体。另外，优选在连接电源供给单元和电极(上部微电极或对置电极)的连接电路上具有整流器、电阻、线圈或电容器。

在导入装置中，可以根据靶细胞的种类以及目标分子的种类，改变上述电极间电压、电极距离、频率、脉冲周期、Duty等参数，以便能够改变照射靶细胞的集合体的条件。

上部微电极的形状优选为针状。上部微电极以及底面电极的材质并没有特别限定，可以举出钨、钼等，优选为不易腐蚀的材质、或者有金、银、铂等杀菌效果的材质。

在本发明中，通过使单个或多个上部微电极沿垂直方向上下移动，能够调节导入目标分子的靶细胞的范围。因此，优选地，上部微电极与导入液以及靶细胞的最短距离设置为5mm以下。

上部微电极的数量既可以为单个，也可以为多个。在包括多个上部微电极的情况下，可以向多个靶细胞同时导入目标分子。另外，通过多个上部微电极，能够对大范围的靶细胞导入目标分子。

另外，容纳导入液以及靶细胞的容器可以包括用于保持该靶细胞的单个或多个试料保持部，此时，在与该试料保持部对应的位置设置单个或多个上部微电极。

导入装置优选包含使上部微电极和容器相对地上下驱动的上下驱动机构。即，优选包括导入液的容纳容器的位置调节单元和/或上部微电极的位置调节单元。由此，可以优化上部微电极与导入液之间的距离。

[后培养步骤]

本发明的制备方法优选在上述导入步骤之后包括靶细胞的后培养步骤。在后培养步骤中，从导入目标分子的靶细胞的导入开始，例如在4小时以上且2个月内，优选在3天以上且1个月内进行培养。在这期间，优选每隔几天进行适当的培养基更换。可以适当设置培养温度及CO₂浓度等培养条件。

在后培养步骤中，优选的是靶细胞的培养基含有选择分子。选择分子如果是通过细胞增殖抑制、死亡、细胞凋亡诱导等来排除没有导入目标分子的细胞的分子，则无特别限定。由此，由于能够只选择以及培养导入了目标分子的细胞，因此能够提高目标转化细胞的制备效率。例如，当包含以下列举的抗生物质耐药基因作为目标分子时，作为选择分子，可以使用新霉素、新霉素类似物G418、潮霉素、嘌呤霉素、灭瘟素、其他抗生物质等。选择分子的浓度及培养时间因细胞不同而不同，例如对于人皮肤成纤维细胞HDF细胞，用G418进行选择培养时，优选以100～1000μg/mL的浓度进行1～3天的培养。如果长期添加选择分子，整合了目标分子的靶细胞染色体的细胞被选择的可能性就会增大。另外，当目标分子的导入效率超过80％时，也可以不进行选择分子存在下的培养。

目标分子优选包含对选择分子具有耐性的选择标记分子。选择标记分子是为了筛选导入了目标分子的靶细胞的分子。作为选择标记分子，例如可举出新霉素耐药基因、嘌呤霉素耐药基因、灭瘟素耐药基因等。选择标记分子也可以插入到与对靶细胞赋予、删除或维持性状的基因插入的载体相同的载体上。这种情况下，能够更准确地选择导入了目标分子的靶细胞。当选择标记分子被插入到与对靶细胞赋予、删除或维持性状的基因插入的载体不同的载体上时，通过对于插入了赋予、删除或维持性状的基因的载体，充分减少插入选择标记分子的载体的量(例如重量比10：1)而共同导入，从而可以筛选认为是导入了插入有对靶细胞赋予、删除或维持性状的基因的载体的靶细胞。

[转化细胞的分离步骤]

本发明的制备方法优选包括转化细胞的分离步骤。在本步骤中，对导入目标分子的靶细胞或后培养的细胞进行克隆化。作为单克隆化的方法，本领域的技术人员可以使用公知的方法，但是，例如可以通过有限稀释法或单菌落的拾取等克隆细胞。根据其形态，在能够判断目标转化细胞的情况下，能够从视觉上拾取判断出的目标细胞。分离后的细胞是否能获得目标性状，可以通过公知的方法进行确认。

实施例

以下，列举实施例对本发明进行更详细地说明，但本发明并不限定于此。

(试验例1：向细胞导入高分子)

为了有效地建立iPS细胞等的转化细胞，优选导入10kbp以上(约700万Da以上)的附加型质粒，大分子的导入效率低是iPS细胞制备效率低的原因之一。因此，对使用沿面放电法的大分子的导入效率进行验证。

在试验例1中，使用图1所示的导入装置，通过沿面放电进行了基因导入。在使用上部微电极的等离子体照射中，放电范围小，能够导入遗传基因的细胞数量少，因此在本试验例中，使用沿面放电尝试向大量的细胞导入遗传基因。本试验例的容器采用3.5cm的塑料培养皿，使用人皮肤成纤维细胞HDF细胞作为靶细胞。如图2所示，在本试验例中，分别配置2根正电极11、负电极12，使用了共配置4根电极的导入装置。正电极与负电极之间的距离约为27mm。

使用图3来说明本试验例的过程。首先，在使用层粘连蛋白进行了涂布处理的3.5cm塑料培养皿中加入2mL的D-MEM高葡萄糖培养基(富士薄膜和光纯药株式会社：045-30285)，以约3.0×10⁵cells/培养皿的方式播种人皮肤成纤维细胞HDF细胞，用CO₂培养箱培养24小时(图3的S101)。用吸引器吸除培养基，滴下含有120μg的pCXLE-EGFP(10.9kbp)和12μg的pmCherry-C1(4.7kbp)的120μL的导入液(盐分浓度为0.05质量％)(图3的S102)。滴下后在室温下放置5分钟(图3的S103)，将培养皿设置于沿面放电装置，进行放电(图3的S104)。施加电压为5.2kV(半波整流)，电源频率20kHz，电压施加时间为2msec×2次(间隔30秒)。之后，迅速加入2mL培养液，返回CO₂培养箱，培养24小时(图3的S105～106)。

用荧光显微镜观察导入24小时后的HDF细胞。图4(A)表示GFP表达的细胞，图4(B)表示mCherry表达的细胞。一般来说，尺寸大的质粒难以导入细胞，但通过沿面放电法，可知约10.9kbp(700万Da以上)的大质粒也可以通过减少4.7kbp的小质粒的量，以相同程度的效率导入靶细胞。

(试验例2：转化细胞的制备)

首先，在使用层粘连蛋白进行了涂布处理的3.5cm塑料培养皿中加入2mL的D-MEM高葡萄糖培养基(富士薄膜和光纯药株式会社：045-30285)，以约3.0×10⁵cells/培养皿的方式播种人皮肤成纤维细胞HDF细胞，用CO₂培养箱培养24小时。用吸引器吸除培养基，滴下表1中记载的质粒溶液120μL。在室温下静置5分钟后，3.5cm的塑料培养皿设置在沿面放电装置中，以3.9kV放电2msec。沿面放电装置使用了与试验例1相同的装置。之后，迅速加入2mL培养液，返回到CO₂培养箱，培养24小时。在显微镜下观察培养后的细胞，确认导入了选择标记的细胞，之后，加入2mL含有100～1000μg/mL的G418的D-MEM高葡萄糖培养基，培养24～72小时。

[表1]

表1质粒的种类和量

除去G418含有的D-MEM高葡萄糖培养基，加入2mL的Essential8培养基(ThermoFisher Scientific、Invitrogen:A1517001)，用CO₂培养箱培养。每2～3天更换培养基，持续培养3～4周。导入质粒前的HDF细胞如图5(A)所示。导入质粒3～4周后，出现了图5(B)所示的iPS样细胞。质粒导入后被初始化的细胞与原来的HDF细胞形态不同，显示出在iPS细胞中典型的形态(例如，在圆顶状的菌落中，菌落的边界面平滑，呈白色的发光形状等)。拾取出现的iPS细胞，通过用层粘连蛋白进行涂层处理的3.5cm的塑料培养皿进行继代，冷冻保存增殖的单菌落。

＜通过qPCR确认目标分子残留的方法及结果＞

用PBS(Nacalai Tesque株式会社，cat.No.14249-24)清洗冷冻保存时剥离的iPS细胞的一部分，通过离心操作制作成细胞颗粒。用吸引器除去PBS，在-80℃下进行保存。

将冷冻的细胞颗粒悬浮在室温下的200μL的PBS中。按照协议采用基因组DNA提取试剂盒：DNeasy Blood&Tissue kit(QIAGEN，cat.No.69504)提取细胞基因组DNA。具体而言，加入20μL附带的protease K，轻轻地涡旋振荡(Scientific Industries，DigitalVORTEX-GENIE 2)，混合均匀。再进行旋降，在室温下静置5分钟。添加另外销售的4μL的RNase A(QIAGEN，cat.No.19101)，轻轻地涡旋振荡，混合均匀。用台式离心机(greinerbio-one、myFUGE mini centrifuge、C1008-B)旋降，在室温下静置2-5分钟。加入试剂盒附带的Buffer AL 200μL，马上断续地涡旋振荡15秒。旋降，用热块(ASTEC，Block IncubatorBI-525)在56℃下培养10分钟。旋降，加入200μL的100％乙醇，马上断续地涡旋振荡15秒。旋降，将裂解物转移到试剂盒附带的QIAamp Mini spin column。以6000g在室温下进行1分钟的离心操作(ThermoScientific、Sorvall ST8FR)，将裂解物通过柱。将柱转移到试剂盒附带的新的2mL collection tube中，添加500μL的Buffer AW1。以6000g在室温下进行1分钟的离心操作，将裂解物通过柱。将柱转移到试剂盒附带的新的2mL collection tube中，添加500μL的Buffer AW2。以20000g在室温下离心操作3分钟，移至新的2mL管(eppendorf，Safe-Lock Tubes)。以20000g在室温下进行1分钟的离心操作，将柱转移到新的1.5mL管(WATSON，131-715C)。添加100～200μL的Buffer AE，60℃下静置10分钟。以6000g进行1分钟的离心操作，提取出基因组DNA。

用微量分光光度计(IMPLEN，NanoPhotometer P-Class)对基因组DNA进行定量，用DDW稀释到了10ng/μL。每反应1次，使用20ng的基因组DNA，进行qPCR。qPCR试剂使用了THUNDERBIRD SYBR qPCR mix(TOYOBO)。在10μL的反应系统中，使用10ng/μL的基因组DNA 2μL。反应条件为95℃-60秒：1个周期，(95℃-15秒，60℃-45秒)：进行40个周期。解析系统使用CFX96实时PCR解析系统(BIO-RAD)。每个细胞株，用附加型载体检测用引物组和染色体基因CFTR基因检测用引物组进行qPCR。用CFTR基因(染色体基因)的Ct值来修正附加型载体的Cycle threshold(Ct)值。所使用的引物序列如下所示。

附加型载体(oriP)检测用(Yu et al,Science,324.2009)

pEP4-SF1:TTCCACGAGGGTAGTGAACC

pEP4-SR2:CAGGCGAAGATTCAGGAGAG

CFTR基因检测用(Uehara et al,Ann Clin Transl Neurol.,361-369.2014)

CFTRexon24-F:GGCAGTACGATTCCATCCAG

CFTRexon24-R:GAAAGAGCTTCACCCTGTCG

关于在本发明中建立的人iPS细胞株，进行了附加型载体(目标分子)的残留确认。qPCR在同一检体中实施了2次。将附加型载体对染色体基因CFTR的相对量加倍，计算出拷贝数。将附加型载体/CFTR比在0.1拷贝以下的细胞株作为目标分子未残留在细胞内的细胞。

结果如图6所示。研究的11株中有10株(90.9％)的附加型载体/CFTR比的拷贝数在0.1以下，可以认为载体序列没有被整合到基因组DNA。另外，对于检测出载体序列的株11，可以认为是通过低概率的随机整合而整合了载体。#58sub6是通过电穿孔导入了附加型载体的结果，是载体插入到基因组DNA中的细胞株，用作正控制。作为负控制，使用了用于建立iPS细胞的人皮肤成纤维细胞HDF细胞(Male HDF，P9)的基因组DNA。

另外，对于根据本申请的导入方法制备的iPS细胞和使用电穿孔装置Nucleofector 2b(Lonza)建立的iPS细胞，比较了细胞内残留了载体的细胞株的比例。如表2所示，通过沿面放电建立的iPS细胞株的附加型载体残留率与使用电穿孔装置建立的iPS细胞相比，显示出非常低的值。根据本申请的导入方法，有效得到了核酸未插入到染色体中的转化细胞。

附加型载体的残留量也有可能依赖于培养期间的时长。但是，用本发明制备的iPS细胞的约90％的细胞中，制作冷冻细胞团时的附加型载体残留量为0.1拷贝以下。该结果表明，与传统方法相比，本发明是一种不易引起外来基因染色体整合的安全技术。

[表2]

表2基因导入法不同造成的附加型载体残留率的比较

(试验例3：转化细胞的制备)

按照图7所示的方法，利用基因组编辑系统敲除靶基因，在基因组编辑完成后，制备出细胞内不残留基因组编辑系统的转化细胞。根据该方法，可以通过荧光确认基因的敲除或质粒的脱落。

(1)将红色荧光蛋白质基因整合到不显示荧光的细胞101的染色体上，建立稳态显示红色荧光的细胞(靶细胞)102。

(2)构建具有敲除红色荧光蛋白质的序列和绿色荧光蛋白质基因序列的基因组编辑用质粒(目标分子)。

(3)将构建的质粒导入到显示红色荧光的细胞102。导入质粒的细胞为显示红色及绿色荧光的细胞103。

(4)将导入质粒的细胞培养2周左右。红色荧光蛋白质基因被敲除后，红色荧光蛋白质逐渐被分解，产生只显示绿色荧光的细胞104。

(5)继续进一步培养。通过将导入细胞的质粒分解脱落，细胞不再显示绿色荧光，能够制备染色体上未插入核酸的转化细胞105。

以下详细说明实际进行的实验。

(1)通过电穿孔法建立mCherry蛋白质的稳态表达细胞

将L-929细胞(1×10⁶cells)悬浮在90μL的Opti-MEM中，加入10μL的pmCherry-C1质粒(1μg/μL)进行混合。将混合液转移到电穿孔用比色杯中，安装在电穿孔装置(NEPA21，NepaGene株式会社)上，按照表3的条件进行条件施加。

[表3]

表3电穿孔装置的施加条件

	电压(V)	脉冲宽(ms)	脉冲间隔(ms)	次数	衰减率	极性
							穿孔脉冲	180	1	50	2	10	+
传输脉冲	30	50	50	5	40	+/-

将施加后的细胞所含有的反应液悬浮于含有4.9mL血清的MEM培养基中，在96孔培养板上逐一播种100μL，用CO₂培养箱在37℃培养48小时。pmCherry-C1质粒的导入效率为30％，细胞生存率为65％。从孔中回收细胞，用10cm培养皿在含有10mL血清的MEM培养基(含200μg/mL的G-418)培养1个月。图8(A)表示mCherry表达显示红色荧光的细胞，图8(B)表示明亮视野显微镜下的细胞。之后，通过使用96孔板的有限稀释法，得到了导入pmCherry-C1质粒的L-929细胞的单菌落。将得到的单菌落悬浮于含有2mL血清的MEM培养基中，播种到3.5cm培养皿中，用CO₂培养箱在37℃下持续培养1个月。确认从得到的菌落中不出现白克隆(mCherry基因脱落的克隆)(0.01％以下)，作为稳态mCherry表达细胞(L-929-mCherry细胞)(图9(A)和(B))。可认为L-929-mCherry细胞的基因组中插入了pmCherry-C1质粒。

(2)基因组编辑用载体的构建

使用Guide-it CRISPR/Cas9 System(Clontech公司)，按照试剂盒附带的指南构建mCherry基因敲除用载体。试剂盒中的pGuide-it质粒载体具有显示绿色荧光的ZsGreen1基因。用于敲除mCherry基因的导向RNA用的引物碱基序列如下。

gRNA-1-Fwd:CCGGACCCAGACCGCCAAGCTGAAGG

gRNA-1-Rev:AAACCCTTCAGCTTGGCGGTCTGGGT

确认含有上述导向RNA序列的mCherry基因敲除用载体的碱基序列，得到了保持目标序列的基因组编辑用质粒psg RNA1-2。

(3)基因组编辑用质粒psg RNA1-2的导入

L-929-mCherry细胞(1.3×10⁴cells)播种到96孔培养板上，用CO₂培养箱在37℃下培养24小时。从孔中吸入培养基后，加入psg RNA1-2质粒(1μg/μL)5μL，设置等离子体照射装置，在30kV、30msec的条件下照射等离子体。等离子体照射装置采用了与日本特开2013-255475号公报中记载的装置相同的装置。照射后，加入100μL含有血清的MEM培养基，用CO₂培养箱在37℃培养48小时。L-929-mCherry细胞稳态地显示红色荧光(图10(A)和(B))，但是导入了psg RNA1-2质粒的细胞也进一步显示了绿色荧光(图10(C))。

(4)利用psg RNA1-2质粒导入的mCherry基因的敲除

从孔中回收细胞，播种到10cm的培养皿中，用CO₂培养箱在37℃下培养2周。其结果，显示红色及绿色荧光的一部分细胞由于psg RNA1-2质粒的导入，不再显示红色荧光，只显示绿色荧光(图11(A)～(D)，圆圈部分)。一般来说，偶发性的遗传基因发生变异的频率为1/10⁵，频率较低，因此，在一定数量以上的细胞中没有出现红色荧光表明mCherry基因通过基因组编辑系统被敲除。

(5)psg RNA1-2导入细胞的持续培养

通过有限稀释法得到了显示绿色荧光的细胞的单菌落。将得到的单菌落播种到10cm培养皿中，用CO₂培养箱在37℃下培养约1个月后，发出绿色荧光的细胞中几乎所有的细胞都变成了不显示荧光的细胞。这表明，基因组编辑用质粒psg RNA1-2未整合到基因组，在细胞增殖过程中被脱落或分解。

应理解，此次公开的实施方式以及实施例在所有方面都是例示而不是限制性的。本发明的范围由权利要求书表示，而不是由上述说明来表示，其意图包括与权利要求书同等的含义以及范围内的所有变更。

产业实用性

以往，在用于再生医疗或基因治疗的转化细胞(例如，iPS细胞、由iPS细胞分化的细胞等)中，残留着导入基因或病毒等载体，这些载体妨碍了再生医疗或基因治疗的实用化。另外，为了获得这些转化细胞，需要在高水平的生物危害实验室进行实施或需要高度熟练的研究人员。根据本发明，能够简便地导入目标分子，从而能够容易地制备赋予了性状或删除了性状的细胞。而且，在被确立的细胞中，由于没有保留外来基因等目标分子，因此在实际应用时，产生以往问题的可能性无限低。由此使得分析特定分子在生物体内的作用的研究或在包括医疗、农业以及环境在内的广泛领域的应用成为可能。在医疗领域，例如可以应用于再生医疗、细胞医疗以及基因治疗等，在农业领域或环境领域，例如可以应用于育种或品种改良等。

符号的说明

1电极、11正电极、12负电极、2电源、22电阻、3容器、4靶细胞、5含有目标分子的导入液、6放电、101不显示荧光的细胞、102显示红色荧光的细胞、103显示红色及绿色荧光的细胞、104显示绿色荧光的细胞、105转化细胞。

Claims

1.一种转化细胞的制备方法，包括使含有目标分子的导入液和靶细胞接触，向所述靶细胞导入所述目标分子的导入步骤，

2.如权利要求1所述的制备方法，所述目标分子选自核酸和蛋白质中的至少一种。

3.如权利要求2所述的制备方法，所述核酸是载体。

4.如权利要求3所述的制备方法，所述载体表达对细胞赋予、删除或维持性状的蛋白质。

5.如权利要求2至4中任一项所述的制备方法，在所述转化细胞的80％以上的细胞中，所述核酸不插入染色体。

6.如权利要求1至5中任一项所述的制备方法，在所述导入步骤中，所述目标分子通过细胞内吞作用被导入到所述靶细胞。

7.如权利要求1至6中任一项所述的制备方法，在所述导入步骤中，通过对所述靶细胞进行沿面放电或等离子体照射，从而导入所述目标分子。

8.如权利要求1至7中任一项所述的制备方法，包括在所述导入步骤后培养所述靶细胞的后培养步骤。

9.如权利要求8所述的制备方法，在所述后培养步骤中，所述靶细胞的培养基包括能够杀灭细胞的选择分子。

10.如权利要求1至9中任一项所述的制备方法，所述目标分子包含对选择分子具有耐性的选择标记分子。