ES2434799T3 - Cromosomas artificiales, sus usos y métodos para preparar cromosomas artificiales - Google Patents

Abstract

Un cromosoma artificial en base a ADN satélite sustancialmente puro, aislado, que contiene másheterocromatina que eucromatina y que está compuesto principalmente por unidades de ADN de repetición quecomprenden: bloques en tándem de ADN satélite flanqueado por ADN no satélite, un sitio de replicación primario, e incluye ADNheterólogo; en donde las unidades de repetición son de aproximadamente 7 a aproximadamente 20 Mb.

Description

Cromosomas artificiales, sus usos y métodos para preparar cromosomas artificiales

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para preparar líneas celulares que contienen cromosomas artificiales, métodos para el aislamiento de los cromosomas artificiales, inserción dirigida de ADN heterólogo en los cromosomas, administración de los cromosomas a las células y tejidos seleccionados y métodos para el aislamiento y producción a gran escala de los cromosomas. También se describen líneas celulares para su uso en los métodos, y líneas celulares y cromosomas producidos por los métodos. Además se describen métodos en base a células para la producción de proteínas heterólogas, métodos de terapia génica y métodos para generar animales transgénicos, particularmente animales transgénicos no humanos, que usan cromosomas artificiales.

Antecedentes de la invención

Se han desarrollado varios sistemas de administración de vectores virales, no virales y físicos para la terapia génica y expresión recombinante de ácidos nucleicos heterólogos [ver, por ejemplo, Mitani et al. (1993) Trends Biotech. 11: 162-166]. Sin embargo, los sistemas disponibles actualmente presentan numerosas limitaciones, particularmente donde se requiere una expresión de genes persistente, estable y controlada. Estas limitaciones incluyen: (1) limitaciones de tamaño debido a que existe un límite, generalmente en el orden de aproximadamente diez kilobases [kB], a lo sumo, para el tamaño del inserto de ADN [gen] que puede ser aceptado por vectores virales, mientras un número de genes de mamíferos de posible importancia terapéutica se encuentran bien por encima de este límite, especialmente si se incluyen todos los elementos de control; (2) la incapacidad para el direccionamiento específico a una integración de modo que produce una integración aleatoria que conlleva un riesgo de interrumpir genes vitales o genes supresores de cáncer; (3) la expresión de genes terapéuticos integrados aleatoriamente puede verse afectada por la compartimentalización funcional en el núcleo y se ve afectada por efectos de posición en base a cromatina; (4) no puede controlarse el número de copia y, en consecuencia, la expresión de un gen dado para integrarlo en el genoma. Por lo tanto, se necesitan mejoras en la administración de genes y sistemas de expresión estables [ver, por ejemplo, Mulligan (1993) Science 260:926-932].

Además, los vectores seguros y efectivos y métodos de terapia génica deberían tener numerosas características que no están aseguradas por los sistemas disponibles actualmente. Por ejemplo, un vector seguro no debería contener elementos de ADN que puedan promover cambios no deseados por la recombinación o mutación en el material genético huésped, no debería tener el potencial para iniciar efectos nocivos en células, tejidos u organismos que portan el vector y no debería interferir en las funciones genómicas. Además, sería ventajoso para el vector ser no integrador o estar diseñado para una integración específica de sitio. Asimismo, el número de copia de genes terapéuticos portados por el vector debería ser controlado y estable, el vector debería asegurar la función independiente y controlada de los genes introducidos; y el vector debería aceptar insertos grandes (hasta un tamaño Mb) y asegurar la estabilidad funcional del inserto.

Sin embargo, las limitaciones de tecnologías de administración de genes existentes, abogan por el desarrollo de sistemas de vectores alternativos adecuados para transferir genes y complejos de genes grandes [hasta el tamaño Mb o mayores] junto con elementos reguladores que proporcionen una expresión segura, controlada y persistente del material genético terapéutico.

Actualmente, ninguno de los vectores disponibles cumple con estos requisitos. Sin embargo, los cromosomas presentan la mayoría de estas características. Por lo tanto, un cromosoma artificial tendría un vector ideal para terapia génica, así como para una producción estable, de alto nivel, controlada de productos génicos que requieren coordinación de expresión de numerosos genes o que están codificados por genes grandes y otros usos. Se encuentran disponibles cromosomas artificiales para la expresión de genes heterólogos en levadura pero aun no se ha alcanzado la construcción de cromosomas artificiales de mamífero definidos. Dicha construcción ha sido impedida por la falta de un centrómero aislado, funcional de mamífero y la incertidumbre con respecto a los requisitos para su producción y replicación estable. A diferencia de la levadura, no hay genes seleccionables en proximidad cercana a un centrómero de mamífero y la presencia de tramos largos de ADN heterocromático pericéntrico altamente repetitivo hace virtualmente imposible el aislamiento de un centrómero de mamífero utilizando métodos disponibles presentes, tales como desplazamiento sobre el cromosoma. Se requieren otras estrategias para la producción de cromosomas artificiales de mamífero y algunas se han desarrollado. Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5.288.625 proporciona una línea celular que contiene un cromosoma artificial, un minicromosoma, que es de aproximadamente 20 a 30 megabases. Sin embargo, los métodos proporcionados para el aislamiento de estos cromosomas proporcionan preparaciones de sólo aproximadamente 10-20% de pureza. Por lo tanto, se requieren el desarrollo de cromosomas artificiales alternativos y la perfección de los métodos de aislamiento y purificación así como el desarrollo de cromosomas más versátiles y la caracterización adicional de los minicromosomas para producir el potencial de esta tecnología.

Por lo tanto, es un objeto de la presente proporcionar cromosomas artificiales de mamífero y métodos para la introducción de ADN ajeno en dichos cromosomas. Es también un objeto en la presente proporcionar métodos de

aislamiento y purificación de los cromosomas. Es también un objeto en la presente proporcionar métodos para la introducción del cromosoma artificial de mamífero en células seleccionadas y proporcionar las células resultantes, así como animales no humanos, aves, peces y plantas transgénicos que contienen los cromosomas artificiales. Es también un objeto en la presente proporcionar métodos para terapia génica y expresión de productos génicos utilizando cromosomas artificiales. Es un objeto adicional en la presente proporcionar métodos para construir cromosomas artificiales específicos para la especie de novo. Otro objeto en la presente es proporcionar métodos para generar cromosomas artificiales de mamífero de novo.

Compendio de la invención

La presente invención proporciona un cromosoma artificial en base a ADN satélite sustancialmente puro, aislado, que contiene más heterocromatina que eucromatina y está compuesto principalmente por unidades de ADN de repetición que comprenden: bloques en tándem de ADN satélite flanqueado por ADN no satélite, un sitio de replicación primario, e incluye ADN heterólogo; en donde las unidades de repetición son de aproximadamente 7 a aproximadamente 20 Mb.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir un cromosoma artificial en base a ADN satélite que comprende: introducir uno o más fragmentos de ADN heterólogo en una célula, en donde el fragmento o fragmentos de ADN comprenden un marcador seleccionable; cultivar la célula en condiciones selectivas para producir células que tienen incorporado un fragmento o fragmentos de ADN heterólogo en su ADN genómico; identificar entre las células resultantes aquellas que incluyen cromosomas con más de un centrómero y/o fragmentos de dichos cromosomas; seleccionar una célula o células entre las células identificadas y cultivar la célula o células en condiciones por las cuales se producen células que contienen cromosomas con unidades de ADN de repetición que comprenden bloques en tándem de ADN satélite flanqueado por ADN no satélite, un sitio de replicación primario e incluyen ADN heterólogo, en donde las unidades de ADN de repetición son de aproximadamente 7 a aproximadamente 20 Mb; subclonar células que contienen cromosomas con dichas unidades de ADN de repetición y cultivar las células en condiciones selectivas hasta que se produce una célula o células que contienen un cromosoma artificial en base a ADN satélite, que contiene dichas unidades de ADN de repetición; y seleccionar una célula que comprende un cromosoma artificial en base a ADN satélite que contiene más heterocromatina que eucromatina y está compuesto principalmente por unidades de ADN de repetición que comprenden bloques en serie de ADN satélite flanqueado por ADN no satélite, un sitio de replicación primario e incluye ADN heterólogo, en donde las unidades de ADN de repetición son de aproximadamente 7 a aproximadamente 20 Mb, en donde la célula no es una célula madre embrionaria humana.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula aislada que comprende un cromosoma artificial en base a ADN satélite como se describió, en donde la célula no es una célula madre embrionaria humana.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una célula que contiene ácido nucleico heterólogo que comprende: introducir un cromosoma artificial en base a ADN satélite como se describe en la célula, en donde la célula no es una célula madre embrionaria humana.

En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de un cromosoma artificial en base a ADN satélite como se describió para la preparación de una composición útil para la terapia génica.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende un cromosoma artificial en base a ADN satélite como se describió para su uso en medicina.

Los MAC que no sean los SATAC reivindicados, que se mencionan en toda la descripción, no forman parte de la presente invención.

Se describen cromosomas artificiales de mamífero [MAC]. También se describen cromosomas artificiales para otras especies eucariotas superiores, tales como insectos, aves, aves de corral y peces, producidos utilizando los MAC y métodos descritos en la presente. Se describen métodos para generar y aislar dichos cromosomas. También se describen métodos que utilizan los MAC para construir cromosomas artificiales de otras especies, tales como especies de insectos, aves, aves de corral y peces. Los cromosomas artificiales son cromosomas estables completamente funcionales. Se describen dos tipos de cromosomas artificiales. Un tipo, denominado en la presente SATAC [cromosomas artificiales satélite o cromosomas artificiales en base a ADN satélite (los términos se utilizan de manera intercambiable en la presente)] son cromosomas heterocromáticos estables y el otro tipo son minicromosomas en base a una amplificación de eucromatina.

Los cromosomas artificiales proporcionan un locus extra-genómico para la integración dirigida de fragmentos de ADN de tamaño de pares de megabases [Mb] que contienen un solo gen o múltiples genes, incluyendo múltiples copias de un solo gen unidas operativamente a un promotor o cada copia o varias copias unidas a promotores separados. Por lo tanto, también se describen métodos que utilizan los MAC para introducir los genes en células, tejidos y animales, así como especies tales como aves, aves de corral, peces y plantas. Los cromosomas artificiales con ADN heterólogo integrado pueden utilizarse en métodos de terapia génica, en métodos de producción de productos génicos, particularmente productos que requieren la expresión de vías biosintéticas multigénicas, y que también se pretenden para la administración en los núcleos de células de línea germinal, tales como células madre

derivadas de embriones [células ES], para la producción de animales no humanos, aves, aves de corral y peces transgénicos. También se describen en la presente plantas transgénicas, incluyendo monocotiledóneas y dicotiledóneas.

Los cromosomas artificiales de mamífero proporcionan sitios de integración específicos extra-genómicos para la introducción de genes que codifican proteínas de interés y permiten una integración de ADN de tamaño de megabases de modo que, por ejemplo, los genes que codifican una vía metabólica entera o un gen muy grande, tal como el gen de ADN genómico de fibrosis quística [CF; ~250 kb], varios genes, tales como genes múltiples que codifican una serie de antígenos para la preparación de una vacuna multivalente, puedan introducirse de manera estable en una célula. También se describen vectores para la introducción dirigida de dichos genes, incluyendo los genes supresores de tumores, tales como p53, el ADNc regulador de la transmembrana de fibrosis quística [CFTR] y los genes para las ribozimas anti-VIH, tales como un gen de ribozima gag anti-VIH, en los cromosomas artificiales.

Los cromosomas descritos en la presente son generados mediante la introducción de ADN heterólogo que incluye ADN que codifica uno o múltiples marcadores seleccionables en células, preferiblemente una línea celular estable, que cultiva las células en condiciones selectivas, e identifica entre los clones resultantes aquellos que incluyen cromosomas con más de un centrómero y/o fragmentos del mismo. La amplificación que produce el centrómero o centrómeros adicionales se produce en células que contienen cromosomas en los cuales el ADN heterólogo se ha integrado cerca del centrómero en la región pericéntrica del cromosoma. Las células clonales seleccionadas se utilizan entonces para generar cromosomas artificiales.

Aunque la introducción no dirigida de ADN, que resulta en cierta frecuencia de integración en locus apropiados, es preferida la introducción dirigida. Por lo tanto, el ADN con el marcador seleccionable que se introduce en células para iniciar la generación de cromosomas artificiales incluye secuencias que se dirigen a una región amplificable, tal como la región pericéntrica, heterocromatina y particularmente ADNr del cromosoma. Por ejemplo, se describen vectores, tales como pTEMPUD y pHASPUD [descritos en la presente], que incluyen dicho ADN específico para ADN satélite de ratón y ADN satélite humano, respectivamente. El plásmido pHASPUD es un derivado de pTEMPUD que contiene secuencias de ADN satélite humano que se dirigen específicamente a cromosomas humanos. Secuencias dirigidas preferidas, incluyen secuencias de genes de ARN ribosómico de mamífero (ARNr) (denominado en la presente ADNr) que se dirige al ADN heterólogo para integrarse en la región de ADNr de aquellos cromosomas que contienen ADNr. Por ejemplo, se describen vectores, tales como pTERPUD, que incluyen ADNr de ratón. Tras la integración en cromosomas existentes en las células, estos vectores pueden inducir la amplificación que resulta en la generación de centrómeros adicionales.

Los cromosomas artificiales se generan mediante el cultivo de células con los cromosomas multicéntricos, típicamente dicéntricos en condiciones por las cuales el cromosoma se rompe para formar un minicromosoma y cromosoma anteriormente dicéntrico. Entre los MAC descritos en la presente están los SATAC, que están compuestos principalmente por unidades de repetición de ADN satélite corto y son casi completamente heterocromáticos, de modo que sin la inserción de ADN heterólogo o ajeno, los cromosomas preferiblemente no contienen información genética o contienen sólo secuencias de genes que no codifican proteínas tales como secuencias ADNr. Pueden por lo tanto utilizarse como vectores "seguros" para la administración de ADN a huéspedes mamíferos debido a que no contienen ningún gen potencialmente perjudicial. Los SATAC se generan, no a partir del fragmento de minicromosoma como, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No 5.288.625, sino a partir del fragmento del cromosoma anteriormente dicéntrico.

Además, también se describen en la presente métodos para generar minicromosomas eucromáticos y el uso de los mismos. Se describen métodos para generar un tipo de MAC, el minicromosoma, descrito previamente en la Patente de los Estados Unidos No. 5.288.625, y el uso del mismo para la expresión ADN heterólogo. En un método particular para generar un MAC, tal como minicromosoma, se introduce ADN heterólogo que incluye ADNr de mamífero y uno

o más genes marcadores seleccionables en las células que luego se cultivan en condiciones selectivas. Las células resultantes que contienen cromosomas con más de un centrómero se seleccionan y cultivan en condiciones por las cuales el cromosoma se rompe para formar un minicromosoma y un cromosoma anteriormente multicéntrico (típicamente dicéntrico) a partir del cual se liberó el minicromosoma.

También se describen líneas celulares que contienen el minicromosoma y su uso para la fusión celular. Puede utilizarse una línea celular que contiene el minicromosoma de mamífero como célula receptora para ADN donante que codifica un gen seleccionado o múltiples genes. Para facilitar la integración del ADN donante en el minicromosoma, la línea celular receptora preferiblemente contiene el minicromosoma pero no contiene el cromosoma anteriormente dicéntrico. Esto puede lograrse mediante métodos divulgados en la presente tales como fusión celular y selección de células que contienen un minicromosoma y ningún cromosoma anteriormente dicéntrico. El ADN donante está unido a un segundo marcador seleccionable y está dirigido al minicromosoma e integrado en el mismo. El cromosoma resultante se transfiere por fusión celular en una línea celular receptora apropiada, tal como una línea celular de hámster chino [CHO]. Después de la producción a gran escala de las células que portan el cromosoma manipulado, el cromosoma se aísla. En particular, se obtienen los cromosomas metafase, por ejemplo mediante adición de colchicina, y se purifican a partir del lisado celular. Estos cromosomas se utilizan para clonar, secuenciar y para administrar el ADN heterólogo en células.

También se describen SATAC de varios tamaños que se forman mediante cultivo repetido en condiciones selectivas y subclonación de células que contienen cromosomas producidos a partir de los cromosomas anteriormente dicéntricos. Los SATAC ejemplificados están basados en unidades de ADN de repetición que son de aproximadamente 15 Mb [dos bloques de ~ 7,5 Mb]. La unidad de ADN de repetición de SATAC formada de otras especies y otros cromosomas puede variar, pero estará típicamente en el orden de aproximadamente 7 a aproximadamente 20 Mb. Las unidades de ADN de repetición se denominan en la presente megarreplicones, los cuales en los SATAC ejemplificados contienen bloques en tándem de ADN satélite flanqueados por ADN no satélite, incluyendo ADN heterólogo y ADN no satélite. La amplificación produce un arreglo de segmentos de cromosomas [cada uno llamado amplicón] que contienen dos megarreplicones invertidos delimitados por ADN heterólogo ["ajeno"]. La fusión celular repetida, crecimiento en medio selectivo y/o tratamiento con BrdU [5-bromodesoxiuridina] u otro tratamiento con otro reactivo o agente de desestabilización de genoma, tal como radiación ionizante, incluyendo rayos X y subclonación, resulta en líneas celulares que portan cromosomas heterocromáticos o parcialmente heterocromáticos estables, incluyendo un cromosoma "salchicha" de 150-200 Mb, un gigacromosoma de 500-1000 Mb, un megacromosoma estable de 250-400 Mb y varios cromosomas estables más pequeños derivados de los mismos. Estos cromosomas están basados en estas unidades de repetición y pueden incluir ADN heterólogo que se expresa.

Por lo tanto, se describen métodos para producir MAC de ambos tipos (es decir, SATAC y minicromosomas). Estos métodos son aplicables a la producción de cromosomas artificiales que contienen centrómeros derivados de cualquier célula eucariota superior, incluyendo mamíferos, aves, aves de corral, peces, insectos y plantas.

Los cromosomas resultantes pueden purificarse mediante métodos descritos en la presente para proporcionar vectores para la introducción de ADN heterólogo en células seleccionadas para la producción de los productos génicos codificados por el ADN heterólogo, para la producción de animales no humanos, aves, aves de corral, peces y plantas transgénicos o para la terapia génica.

Además, se describen métodos y vectores para fragmentar los minicromosomas y SATAC. Dichos métodos y vectores pueden utilizarse para una generación in vivo de cromosomas artificiales estables más pequeños. Los vectores para la fragmentación de cromosomas se utilizan para producir un cromosoma artificial que contiene un megarreplicón, un centrómero y dos telómeros y serán de entre aproximadamente 7,5 Mb y aproximadamente 60 Mb, preferiblemente entre aproximadamente 10 Mb-15 Mb y 30-50 Mb. Como se ejemplifica en la presente, el rango preferido es de entre aproximadamente 7,5 Mb y 50 Mb. Dichos cromosomas artificiales también pueden producirse mediante otros métodos.

El aislamiento del multímero de 15 Mb [o amplicón de 30 Mb que contiene dos repeticiones invertidas de 15 Mb] o de 30 Mb o mayor, tal como de 60 Mb, del mismo debería proporcionar un vector cromosómico estable que puede manipularse in vitro. También se describen métodos para reducir el tamaño de los MAC para generar cromosomas artificiales auto-replicantes estables más pequeños.

También se describen en la presente métodos para producir cromosomas artificiales de mamífero, incluyendo aquellos descritos en la presente in vitro y los cromosomas resultantes. Los métodos implican un ensamblaje in vitro de los elementos estructurales y funcionales para proporcionar un cromosoma artificial estable. Dichos elementos incluyen un centrómero, dos telómeros, al menos un origen de replicación y heterocromatina de relleno, por ejemplo, ADN satélite. Generalmente también se incluye un marcador seleccionable para la posterior selección. Estos elementos de ADN específico pueden obtenerse de cromosomas artificiales descritos en la presente tales como aquellos que se han generado mediante la introducción de ADN heterólogo en células y la posterior amplificación que conduce al cromosoma artificial, particularmente los SATAC.

Las secuencias de centrómeros para su uso en la construcción in vitro de cromosomas artificiales también puede obtenerse mediante el empleo de métodos de clonación de centrómeros descritos en la presente.

Las secuencias que proporcionan el origen de replicación, en particular, el megarreplicador, pueden derivarse de ADNr. Estas secuencias preferiblemente incluyen el origen de replicación y las secuencias promotoras de amplificación de ADNr.

También se describen métodos y vectores para dirigirse a ADN heterólogo en los cromosomas artificiales así como también se describen métodos y vectores para fragmentar los cromosomas para producir cromosomas artificiales más pequeños pero estables y auto-replicantes.

Los cromosomas se introducen en células para producir líneas celulares o células transformadas estables, dependiendo de la fuente de las células. La introducción se realiza mediante cualquier método adecuado incluyendo, a modo no taxativo, electroporación, captación directa, tal como mediante precipitación de fosfato de calcio, captación de cromosomas aislados mediante lipofección, mediante fusión de microcélulas, mediante sistemas portadores mediados por lípidos u otro método adecuado. Las células resultantes pueden utilizarse para la producción de proteínas en las células. Los cromosomas pueden aislarse y utilizarse para la administración de genes. Se describen métodos para el aislamiento de los cromosomas en base al contenido de ADN de los

cromosomas, que difiere en los MAC con respecto a los cromosomas auténticos. También se describen métodos que se basan en el contenido, particularmente la densidad y tamaño de los MAC.

Estos cromosomas artificiales pueden utilizarse en la terapia génica, los sistemas de producción de productos génicos, producción de órganos de animales humanizados genéticamente transformados, producción de plantas y animales (no humanos) transgénicos, incluyendo mamíferos, aves, aves de corral, peces, invertebrados, vertebrados, reptiles e insectos, cualquier organismo o dispositivo que emplearía elementos cromosómicos como vehículos de almacenamiento de información y también para el análisis y estudio de la función de centrómeros, para la producción de vectores de cromosomas artificiales que pueden construirse in vitro, y para la preparación de cromosomas artificiales específicos para la especie. Los cromosomas artificiales pueden introducirse en células utilizando microinyección, fusión celular, fusión de microcélulas, electroporación, transferencia nuclear, electrofusión, bombardeo de proyectiles, transferencia nuclear, precipitación de fosfato de calcio, sistemas de transferencia mediados por lípidos y otros métodos. Las células particularmente adecuadas para su uso con los cromosomas artificiales incluyen, a modo no taxativo, células de plantas, particularmente tomate, arabidopsis y otros, células de insecto, incluyendo células de gusano de seda, larvas de insectos, peces, reptiles, anfibios, arácnidos, células de mamíferos, células aviares, células madre embrionarias, células madre hematopoyéticas, embriones y células para su uso en métodos de terapia génica, tales como linfocitos que se utilizan en métodos de inmunoterapia adoptiva y células nerviosas o neuronales. Por lo tanto se describen métodos para producir productos génicos y animales no humanos y plantas transgénicos. También se describen los animales y plantas transgénicos resultantes.

También se describen líneas celulares ejemplares que contienen estos cromosomas.

También se describen métodos para preparar cromosomas artificiales para especies particulares y para clonar centrómeros. Por ejemplo, a continuación se presentan dos métodos ejemplares descritos para generar cromosomas artificiales para su uso en especies diferentes. Primero, los métodos en la presente pueden aplicarse a especies diferentes. Segundo, se describen medios para generar cromosomas artificiales específicos para la especie y para clonar centrómeros. En particular, se describe un método para clonar un centrómero de un animal o planta mediante la preparación de una biblioteca de fragmentos de ADN que contiene el genoma de la planta o animal e introduce cada uno de los fragmentos en un cromosoma artificial satélite de mamífero [SATAC] que contiene un centrómero de una especie, generalmente un mamífero, diferente de la planta o animal seleccionados, generalmente no mamífero y un marcador seleccionable. La planta o animal seleccionado es uno en el cual el centrómero de especies mamíferas no funciona. Cada uno de los SATAC se introduce en las células, que se cultivan en condiciones selectivas y se identifican las células con SATAC. Dichos SATAC deben contener un centrómero codificado por el ADN de la biblioteca o deben contener los elementos necesarios para una replicación en las especies seleccionadas.

También se describen bibliotecas en las cuales los fragmentos relativamente grandes de ADN están contenidos en cromosomas artificiales.

También se describen animales no humanos, invertebrados y vertebrados, plantas e insectos, peces, reptiles, anfibios, arácnidos, aves, aves de corral y mamíferos transgénicos. Son de particular interés los animales (no humanos) y plantas transgénicos que expresan genes que confieren resistencia o reducen la susceptibilidad a enfermedades. Por ejemplo, el transgén puede codificar una proteína que es tóxica para un patógeno, tal como un virus, bacteria o plaga, pero que no es tóxica para el huésped transgénico. Más aun, debido a que múltiples genes pueden introducirse en un MAC, una serie de genes que codifican un antígeno pueden introducirse, lo cual tras la expresión servirán para inmunizar [de modo similar a una vacuna multivalente] al animal huésped contra las enfermedades para lo cual la exposición a los antígenos proporciona inmunidad o cierta protección.

También son de interés los animales no humanos transgénicos que sirven como modelos de ciertas enfermedades y trastornos para su uso en el estudio de la enfermedad y desarrollo de tratamientos terapéuticos y curas de la misma. Dichos modelos de animales de enfermedad expresan genes [típicamente que portan una mutación asociada con la enfermedad], que se introducen en el animal en un MAC y que inducen la enfermedad o trastorno en el animal. Similarmente, los MAC que portan genes que codifican ARN antisentido pueden introducirse en células animales para generar animales no humanos transgénicos "knock-out" condicionales. En dichos animales, la expresión del ARN antisentido resulta en una eliminación reducida o completa de los productos de genes que corresponden al ARN antisentido. Son de interés adicional los mamíferos transgénicos que alojan genes portados por MAC que codifican proteínas terapéuticas que se expresan en la leche del animal. Los animales no humanos transgénicos para su uso en xenotransplante, que expresan genes portados por MAC que sirven para humanizar los órganos de los animales también son de interés. Los genes que podrían utilizarse en órganos de animales humanizados incluyen aquellos que codifican antígenos superficiales humanos.

También se describen métodos para clonar centrómeros, tales como centrómeros de mamífero. En particular, una biblioteca compuesta por fragmentos de SATAC se clona en YAC [cromosomas artificiales de levadura] que incluyen un marcador detectable, tal como ADN que codifica tirosinasa y luego se introducen en células de mamíferos, tales como embriones de ratón albino. Los ratones producidos a partir de embriones que contienen dichos YAC que incluyen un centrómero que funciona en mamíferos expresarán el marcador detectable. Por lo tanto, si los ratones

se producen de embriones de ratón albino en los cuales se introdujo un centrómero de mamífero funcional, los ratones estarán pigmentados o tendrán regiones de pigmentación.

Se describe un método para producir arreglos en tándem repetidos de ADN. Este método, ejemplificado en la presente utilizando ADN telomérico es aplicable a cualquier secuencia de repetición y en particular, a repeticiones de baja complejidad. El método descrito en la presente para la síntesis de arreglos de repeticiones de ADN en tándem se basa en una serie de etapas de extensión en las cuales las duplicaciones sucesivas de una secuencia de repeticiones resultan en una expansión exponencial del arreglo de repeticiones en tándem. Un ejemplo del método para sintetizar fragmentos de ADN que contiene repeticiones en tándem puede describirse generalmente de la siguiente manera. Se utilizan dos oligonucleótidos como materiales de partida. El oligonucleótido 1 tiene una longitud k de secuencia repetida (cuyos flancos no son relevantes) y contiene un tramo relativamente corto (60-90 nucleótidos) de la secuencia repetida, flanqueado con sitios de restricción elegidos apropiadamente:

5'-S1 > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > S2_-3' donde S1 es el sitio de restricción 1 escindido por E1, S2 es un segundo sitio de restricción escindido por E2, > representa una unidad de repetición simple y '_' denota una secuencia de flanqueo de nucleótidos corta (8-10) complementaria al nucleótido 2:

3'-___S3-5'

donde S3 es un tercer sitio de restricción para la enzima E3 y que está presente en el vector a utilizar durante la construcción. El método implica las siguientes etapas: (1) los oligonucleótidos 1 y 2 se aparean; (2) los oligonucleótidos apareados se rellenan para producir una secuencia de doble hebra (dh); (3) el ADN de doble hebra se escinde con las enzimas de restricción E1 y E3 y se liga posteriormente en un vector (por ejemplo, pUC19 o un vector de levadura) que se ha escindido con las mismas enzimas E1 y E3; (4) el inserto se aísla de una primera porción del plásmido mediante la digestión con las enzimas de restricción E1 y E3, y una segunda porción del plásmido se corta con las enzimas E2 (tratadas para eliminar la saliente 3') y E3, y el fragmento grande (plásmido de ADN más el inserto) se aísla; (5) los dos fragmentos de ADN (el fragmento de inserto S1-S3 y el vector más el inserto) se ligan; y (6) las etapas 4 y 5 se repiten tantas veces como sea necesario para alcanzar el tamaño de secuencia de repetición deseado. En cada ciclo de extensión, el tamaño de la secuencia de repetición se duplica, es decir, si m es el número de ciclos de extensión, el tamaño de la secuencia de repetición será de k x 2m nucleótidos.

Descripción de los dibujos

La Figura 1 es un dibujo esquemático que representa la formación del cromosoma MMCneo [el minicromosoma] y no forma parte de la invención reivindicada. A-G representa los eventos sucesivos coherentes con los datos observados que conducirían a la formación y estabilización del minicromosoma.

La Figura 2 muestra un resumen esquemático del modo en el cual los cromosomas nuevos observados se formarían, y las relaciones entre los diferentes cromosomas formados de novo. En particular, esta figura muestra un dibujo esquemático de la formación de cromosomas de novo iniciada en la región centromérica del cromosoma 7 de ratón. (A) Una amplificación tipo E única en la región centromérica del cromosoma 7 genera un neo-centrómero unido al ADN "ajeno" integrado y forma un cromosoma dicéntrico. La amplificación tipo E múltiple forma el neocromosoma λ que se separa del resto del cromosoma 7 de ratón a través de una rotura específica entre los centrómeros del cromosoma dicéntrico y que se estabilizó en una línea celular híbrida de ratón-hámster; (B) La rotura específica entre los centrómeros de un cromosoma 7 dicéntrico genera un fragmento de cromosoma con el neo-centrómero y un cromosoma 7 con trazas de ADN heterólogo en el extremo; (C) La duplicación invertida del fragmento que porta el neo-centrómero resulta en la formación de un neo-minicromosoma estable; (D) La integración de ADN exógeno en la región de ADN heterólogo del cromosoma 7 anteriormente dicéntrico inicia una amplificación tipo H, y la formación de un brazo heterocromático. Mediante la captura de un segmento terminal eucromático, este nuevo brazo del cromosoma se estabiliza en la forma del cromosoma "salchicha"; (E) El tratamiento con BrdU [5bromodesoxiuridina] y/o selección de fármaco inducen una amplificación tipo H adicional, lo que resulta en la formación de un gigacromosoma inestable: (F) Los tratamientos con BrdU repetidos y/o selección de fármaco inducen una amplificación tipo H adicional que incluye una duplicación de centrómero, que conduce a la formación de otro brazo del cromosoma heterocromático. Se divide del cromosoma 7 mediante rotura de cromosoma y, mediante la adquisición de un segmento terminal, se forma el megacromosoma estable.

La Figura 3 es un diagrama esquemático de la estructura de replicón y un esquema mediante el cual podría producirse un megacromosoma.

La Figura 4 establece la relación entre algunas de las líneas celulares ejemplares descritas en la presente.

La Figura 5 es un diagrama del plásmido pTEMPUD.

Descripción detallada

Definiciones

A menos que se definan de otra forma, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen los mismos significados tal como se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la cual corresponde esta invención.

Tal como se utiliza en la presente, un cromosoma artificial de mamífero [MAC] es una pieza de ADN que se puede replicar establemente y segregar junto con cromosomas endógenos. Tiene la capacidad de albergar y expresar genes heterólogos insertados en el mismo. Se denomina cromosoma artificial de mamífero debido a que incluye centrómeros de mamífero activos. Los cromosomas artificiales de plantas, cromosomas artificiales de insectos y cromosomas artificiales de aves se denominan cromosomas que incluyen centrómeros de plantas e insectos, respectivamente. Un cromosoma artificial humano [HAC] se refiere a cromosomas que incluyen centrómeros humanos, BUGAC se refiere a cromosomas artificiales de insectos y AVAC se refiere a cromosomas artificiales de aves. Entre los MAC descritos en la presente hay SATAC, minicromosomas y cromosomas artificiales sintetizados in vitro. En la presente se describen métodos para la construcción de cada tipo.

Tal como se utiliza en la presente, los cromosomas artificiales sintetizados in vitro son cromosomas artificiales que se producen mediante la unión de los componentes esenciales (al menos el centrómero y los orígenes de replicación) in vitro.

Tal como se utiliza en la presente, los cromosomas endógenos se refieren a cromosomas genómicos tal como se encuentran en la célula antes de la generación o introducción de un MAC.

Tal como se utiliza en la presente, el mantenimiento estable de cromosomas ocurre cuando al menos aproximadamente 85%, preferiblemente 90%, más preferiblemente 95%, de las células retiene el cromosoma. La estabilidad se mide en presencia de un agente selectivo. Preferiblemente estos cromosomas también se mantienen en ausencia de un agente selectivo. Los cromosomas estables también retienen su estructura durante el cultivo de células, sin padecer rearreglos intracromosómicos ni intercromosómicos.

Tal como se utiliza en la presente, el crecimiento en condiciones selectivas significa el crecimiento de una célula en condiciones que requieren la expresión de un marcador seleccionable para la supervivencia.

Tal como se utiliza en la presente, un agente que desestabiliza un cromosoma es cualquier agente que los expertos en la técnica conocen que mejora los eventos de amplificación, mutaciones. Dichos agentes, que incluyen BrdU son bien conocidos por los expertos en la técnica.

Tal como se utiliza en la presente, de novo con referencia a un centrómero se refiere a la generación de un centrómero en exceso como resultado de la incorporación de un fragmento de ADN heterólogo utilizando los métodos en la presente.

Tal como se utiliza en la presente, eucromatina y heterocromatina tienen sus significados reconocidos, la eucromatina se refiere a la cromatina que tiñe difusamente y que típicamente contiene genes y la heterocromatina se refiere a la cromatina que se mantiene inusualmente condensada y que se cree es transcripcionalmente inactiva. Las secuencias de ADN altamente repetitivas [ADN satélite], al menos con respecto a células de mamífero, están usualmente ubicadas en regiones de la heterocromatina que rodea el centrómero [heterocromatina pericéntrica]. Heterocromatina constitutiva se refiere a la heterocromatina que contiene el ADN altamente repetitivo que está constitutivamente condensado y genéticamente inactivo.

Tal como se utiliza en la presente, BrdU se refiere a 5-bromodesoxiuridina, que se inserta durante la replicación en lugar de timidina. BrdU se utiliza como un mutagén; también inhibe la condensación de los cromosomas metafase durante la división celular.

Tal como se utiliza en la presente, un cromosoma dicéntrico es un cromosoma que contiene dos centrómeros. Un cromosoma multicéntrico contiene más de dos centrómeros.

Tal como se utiliza en la presente, un cromosoma anteriormente dicéntrico es un cromosoma que se produce cuando un cromosoma dicéntrico se fragmenta y adquiere nuevos telómeros de modo que se producen dos cromosomas, que tiene cada uno a uno de los centrómeros. Cada uno de los fragmentos son cromosomas replicables. Si uno de los cromosomas se somete a amplificación de ADN eucromático para producir un cromosoma completamente funcional que contiene al ADN heterólogo recientemente introducido y principalmente [al menos más del 50%] eucromatina, es un minicromosoma. El cromosoma restante es un cromosoma anteriormente dicéntrico. Si uno de los cromosomas se somete a amplificación, mediante la cual la heterocromatina [ADN satélite] se amplifica y una porción eucromática [o brazo] se mantiene, se le denomina un cromosoma salchicha. Un cromosoma que es sustancialmente todo heterocromatina, excepto para porciones de ADN heterólogo, se denomina un SATAC. Dichos cromosomas [SATAC] pueden producirse a partir de cromosomas salchicha mediante el cultivo de la célula que contiene el cromosoma salchicha en condiciones, tales como tratamiento con BrdU y/o crecimiento en condiciones selectivas que desestabilizan al cromosoma de modo que se produce un cromosoma artificial satélite [SATAC]. A efectos de la presente, se comprende que los SATAC pueden producirse no necesariamente en múltiples etapas, sino que pueden aparecer después de la introducción inicial del ADN heterólogo y crecimiento en condiciones

selectivas o pueden aparecer después de varios ciclos de crecimiento en condiciones selectivas y tratamiento con BrdU.

Tal como se utiliza en la presente, un SATAC se refiere a un cromosoma que es sustancialmente todo heterocromatina, excepto por porciones de ADN heterólogo. Típicamente, los SATAC son cromosomas artificiales en base a ADN satélite, pero el término abarca cualquier cromosoma hecho mediante los métodos en la presente que contiene más heterocromatina que eucromatina.

Tal como se utiliza en la presente, amplificable, cuando se utiliza en referencia a un cromosoma, particularmente el método para generar SATAC proporcionado en la presente, se refiere a una región de un cromosoma que es propensa a la amplificación. La amplificación típicamente se produce durante la replicación y otros eventos celulares que implican recombinación. Dichas regiones son típicamente regiones del cromosoma que incluyen repeticiones en tándem, tales como ADN satélite, ADNr y otras secuencias.

Tal como se utiliza en la presente, amplificación, con referencia a ADN, es un proceso en el cual los segmentos de ADN se duplican para proporcionar dos o múltiples copias de segmentos de ADN idénticos o casi idénticos que están típicamente unidos como repeticiones sustancialmente en tándem o sucesivas o repeticiones invertidas.

Tal como se utiliza en la presente un amplicón es una unidad de amplificación de ADN repetida que contiene un conjunto de repeticiones invertidas del megarreplicón. Un megarreplicón representa una unidad de replicación de orden superior. Por ejemplo, con referencia a los SATAC, el megarreplicón contiene un conjunto de bloques de ADN en tándem que contienen cada uno ADN satélite flanqueado por ADN no satélite. Contenido dentro del megarreplicón hay un sitio de replicación primario, denominado el megarreplicador, que puede participar en la organización y facilitación de la replicación de la heterocromatina pericéntrica y posiblemente los centrómeros. Dentro del megarreplicón puede haber replicones secundarios más pequeños [por ejemplo, 50-300 kb en algunas células de mamífero]. En los SATAC ejemplificados, el megarreplicón se define mediante dos bloques de ADN en tándem de ~ 7,5 Mb [ver, por ejemplo, Fig. 3]. Dentro de cada cromosoma artificial [AC] o entre una población de las mismas, cada amplicón tiene la misma estructura bruta pero puede contener variaciones en la secuencia. Dichas variaciones surgirán como resultado del movimiento de elementos genéticos móviles, eliminaciones o inserciones o mutaciones que surgen, particularmente en cultivo. Dicha variación no afecta el uso de los AC o su estructura general como se describe en la presente.

Tal como se utiliza en la presente, el ARN ribosómico [ARNr] es el ARN especializado que forma parte de la estructura de un ribosoma y participa en la síntesis de proteínas. El ARN ribosómico se produce mediante la transcripción de genes que están presentes en células eucariotas en múltiples copias. En células humanas, las aproximadamente 250 copias de genes de ARNr por genoma haploide se esparcen en agrupamientos en al menos cinco cromosomas diferentes (cromosomas 13, 14, 15, 21 y 22). En células de ratones, la presencia de ADN ribosómico [ADNr] ha sido verificada en al menos 11 pares de 20 cromosomas de ratón [cromosomas 5, 6, 9, 11, 12, 15, 16, 17, 18, 19 y X] [ver, por ejemplo, Rowe et al. (1996) Mamm. Genome 7:886-889 y Johnson et al. (1993) Mamm. Genome 4:49-52]. En células eucariotas, las múltiples copias de los genes de ARNr altamente conservados se ubican en series arregladas en tándem de unidades de ADNr, que tienen generalmente de aproximadamente 4045 kb de longitud y que contienen una región transcripta y una región no transcripta conocida como ADN espaciador (es decir, espaciador intergénico) que puede variar en longitud y secuencia. En el humano y el ratón, estos arreglos en tándem de unidades de ADNr se ubican adyacentes a las secuencias de ADN satélite pericéntricas (heterocromatina). Las regiones de estos cromosomas en los cuales se ubica el ADNr se denominan regiones de organización nucleolar (NOR) que crean un bucle en el nucléolo, el sitio de producción de ribosomas dentro del núcleo de la célula.

Tal como se utiliza en la presente, el minicromosoma se refiere a un cromosoma derivado de un cromosoma multicéntrico, típicamente dicéntrico [ver, por ejemplo, FIG. 1] que contiene ADN más eucromático que heterocromático.

Tal como se utiliza en la presente, un megacromosoma se refiere a un cromosoma que, excepto por ADN heterólogo introducido, está sustancialmente compuesto por heterocromatina. Los megacromosomas están hechos de un arreglo de amplicones repetidos que contienen dos megarreplicones invertidos delimitados por ADN heterólogo introducido [ver, por ejemplo, Figura 3 para un dibujo esquemático de un megacromosoma]. A efectos de la presente, un megacromosoma es de aproximadamente 50 a 400 Mb, generalmente de aproximadamente 250-400 Mb. Las variantes más cortas también se denominan megacromosomas truncados [aproximadamente 90 a 120 o 150 Mb], megacromosomas y líneas celulares enanos [~ 150-200 Mb], y un micro-megacromosoma [~ 50-90 Mb, típicamente 50-60 Mb]. A efectos de la presente, el término megacromosoma se refiere a la estructura general repetida en base a un arreglo de segmentos cromosómicos repetidos [amplicones] que contienen dos megarreplicones invertidos delimitados por cualquier ADN heterólogo insertado. El tamaño se especificará.

Tal como se utiliza en la presente, la terapia génica participa en la transferencia o inserción de ADN heterólogo en ciertas células, células objetivo, para producir productos génicos específicos que participan en la corrección o modulación de enfermedades. El ADN se introduce en las células objetivo seleccionadas de un modo tal que se expresa el ADN heterólogo y se produce un producto codificado del mismo. Alternativamente, el ADN heterólogo

puede de algún modo mediar la expresión de ADN que codifica el producto terapéutico. Puede codificar un producto, tal como un péptido o ARN, que de algún modo media, directamente o indirectamente, la expresión de un producto terapéutico. La terapia génica también puede utilizarse para introducir compuestos terapéuticos, tales como TNF, que no se producen normalmente en el huésped o que no se producen en cantidades terapéuticamente efectivas o en un tiempo terapéuticamente útil. La expresión del ADN heterólogo por las células objetivo dentro de un organismo afectado por la enfermedad permite de este modo la modulación de la enfermedad. El ADN heterólogo que codifica el producto heterólogo puede modificarse antes de la introducción en las células del huésped afectado para mejorar

o de otro modo alterar el producto o expresión del mismo.

Tal como se utiliza en la presente, el ADN y ARN heterólogos o ajenos se utilizan de forma intercambiable y se refieren al ADN o ARN que no se producen naturalmente como parte del genoma en el cual están presentes o que se encuentran en una ubicación o ubicaciones en el genoma que difieren de aquellas en las que se encuentran en la naturaleza. Es el ADN o ARN que no es endógeno a la célula y ha sido exógenamente introducido en la célula. Ejemplos de ADN heterólogo incluyen, a modo no taxativo, ADN que codifica un producto génico o productos génicos de interés, introducidos a los efectos de terapia génica o para la producción de una proteína codificada. Otros ejemplos de ADN heterólogo incluyen, a modo no taxativo, ADN que codifica proteínas marcadoras rastreables, tales como una proteína que confiere resistencia a fármaco, ADN que codifica sustancias terapéuticamente efectivas, tales como agentes anticáncer, enzimas y hormonas, y ADN que codifica otros tipos de proteínas, tales como anticuerpos. Los anticuerpos que se codifican mediante ADN heterólogo pueden secretarse o expresarse en la superficie de la célula en la cual el ADN heterólogo ha sido introducido.

Tal como se utiliza en la presente, un producto terapéuticamente efectivo es un producto que se codifica mediante ADN heterólogo que, tras la introducción del ADN en un huésped, se expresa un producto que alivia o elimina de manera efectiva los síntomas, manifestaciones de una enfermedad heredada o adquirida o que cura dicha enfermedad.

Tal como se utiliza en la presente, plantas transgénicas se refiere a plantas en las cuales se expresa el ADN heterólogo o ajeno o en las cuales la expresión de un gen presente naturalmente en la planta ha sido alterado.

Tal como se utiliza en la presente, unión operativa de ADN heterólogo a secuencias reguladoras y efectoras de nucleótidos, tales como promotores, potenciadores, sitios de finalización transcripcional y translacional y otras secuencias de señal se refiere la relación entre dicho ADN y dichas secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, unión operativa de ADN heterólogo a un promotor se refiere a la relación física entre el ADN y el promotor de modo que la transcripción de dicho ADN se inicia desde el promotor por una polimerasa de ARN que específicamente reconoce, se une a y transcribe el ADN en marco de lectura. Los promotores preferidos, incluyen promotores específicos de tejido, tales como promotores específicos de glándulas mamarias, promotores virales, tales como TK, CMV, promotores de adenovirus y otros promotores conocidos en la técnica.

Tal como se utiliza en la presente, ADN aislado sustancialmente puro se refiere a fragmentos de ADN purificados de acuerdo con técnicas estándar empleadas por expertos en la técnica, tal como la encontrada en Maniatis et al. [(1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY].

Tal como se utiliza en la presente, expresión se refiere al proceso por el cual el ácido nucleico se transcribe en ARNm y se traduce en péptidos, polipéptidos o proteínas. Si el ácido nucleico se deriva de ADN genómico, la expresión puede incluir, si se selecciona una célula huésped u organismo eucariota apropiados, el empalme del ARNm.

Tal como se utiliza en la presente, vector o plásmido se refiere a elementos discretos que se utilizan para introducir ADN heterólogo en células para la expresión del ADN heterólogo o para la replicación del ADN heterólogo clonado. La selección y uso de dichos vectores y plásmidos son bien conocidos por los expertos en la técnica.

Tal como se utiliza en la presente, transformación/transfección se refiere al proceso por el cual el ADN o ARN se introduce en las células. Transfección se refiere a la captación de ácido nucleico exógeno, por ejemplo, un vector de expresión, por una célula huésped se exprese o no de hecho cualquier secuencia de codificación. Numerosos métodos de transfección son conocidos por el experto en la técnica, por ejemplo, mediante captación directa utilizando fosfato de calcio [CaPO4; ver, por ejemplo, Wigler et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76:13731376], captación de ADN mediada por polietilenglicol [PEG], electroporación, lipofección [ver, por ejemplo, Strauss (1996) Meth. Mol. Biol. 54:307-327], fusión de microcélulas [ver, ejemplos, ver también Lambert (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:5907-5911; Patente de los Estados Unidos No. 5.396.767, Sawford et al. (1987) Somatic Cell Mol. Genet. 13:279-284; Dhar et al. (1984) Somatic Cell Mol. Genet. 10:547-559; y McNeill-Killary et al. (1995) Meth. Enzymol. 254:133-152], sistemas portadores mediados por lípidos [ver, por ejemplo, Teifel et al. (1995) Biotechniques 19:79-80; Albrecht et al. (1996) Ann. Hematol. 72:73-79; Holmen et al. (1995) In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 31:347-351; REmy et al. (1994) Bioconjug. Chem. 5:647-654; Le Bolch et al. (1995) Tetrahedron Lett. 36:6681-6684; Loeffler et al. (1993) Meth. Enzymol. 217:599-618] u otro método adecuado. La transfección exitosa se reconoce generalmente mediante la detección de la presencia del ácido nucleico heterólogo en la célula transfectada, tal como cualquier indicación de la operación de un vector dentro de la célula huésped. Transformación

significa introducir ADN en un organismo de modo que el ADN es replicable, ya sea como un elemento extracromosómico o mediante integración cromosómica.

Tal como se utiliza en la presente, inyectado se refiere a la microinyección [uso de una jeringa pequeña] de ADN en una célula.

Tal como se utiliza en la presente, ADN sustancialmente homólogo se refiere a ADN que incluye una secuencia de nucleótidos que es suficientemente similar a otra secuencia para formar híbridos estables en condiciones específicas.

Los expertos en la técnica conocen bien que los fragmentos de ácido nucleico con diferentes secuencias pueden, en las mismas condiciones, hibridarse de manera detectable al mismo ácido nucleico "objetivo". Dos fragmentos de ácido nucleico se hibridan de manera detectable, en condiciones rigurosas durante un período de hibridación suficientemente largo, debido a que un fragmento contiene un segmento de al menos aproximadamente 14 nucleótidos en una secuencia que es complementaria [o casi complementaria] a la secuencia de al menos un segmento en el otro fragmento de ácido nucleico. Si el tiempo durante el cual se deja producir la hibridación se mantiene constante, a un valor durante el cual, en condiciones de rigurosidad preseleccionadas, dos fragmentos de ácido nucleico con segmentos de apareamiento de bases exactamente complementarios se hibridan detectablemente entre sí, el alejamiento de la complementariedad exacta puede introducirse en los segmentos de apareamiento de bases y el apareamiento de bases se producirá no obstante hasta un punto suficiente para hacer la hibridación detectable. Mientras el alejamiento de la complementariedad entre los segmentos de apareamiento de bases de dos ácidos nucleicos aumenta, y mientras las condiciones de la hibridación se vuelven más rigurosas, la probabilidad de que los dos segmentos se hibriden detectablemente entre sí disminuye.

Dos segmentos de ácido nucleico de doble hebra tienen "sustancialmente la misma secuencia" dentro del significado de la presente memoria descriptiva, si (a) ambos forman un dúplex con bases apareadas con el mismo segmento, y

(b) las temperaturas de fusión de dichos dos dúplex en una solución de 0,5 X SSPE difieren en menos de 10°C. Si los segmentos que se están comparando tienen el mismo número de bases, entonces si tienen "sustancialmente la misma secuencia", típicamente diferirán en sus secuencias en menos de 1 base en 10. Métodos para determinar las temperaturas de fusión de dúplex de ácido nucleico son bien conocidos [ver, por ejemplo, Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284 y las referencias citadas en el mismo].

Tal como se utiliza en la presente, una sonda de ácido nucleico es un fragmento de ADN o ARN que incluye un número suficiente de nucleótidos para hibridarse específicamente a ADN o ARN que incluye secuencias idénticas o estrechamente relacionadas de nucleótidos. Una sonda puede contener cualquier número de nucleótidos, desde apenas 10 y hasta cientos de miles de nucleótidos. Las condiciones y protocolos para dichas reacciones de hibridación son bien conocidas por los expertos en la técnica así como los efectos del tamaño de la sonda, temperatura, grado de no coincidencia, concentración de sal y otros parámetros en la reacción de hibridación. Por ejemplo, cuanto más baja la temperatura y más alta la concentración de sal a la cual se lleva a cabo la reacción de hibridación, mayor el grado de no coincidencia que estará presente en las moléculas híbridas.

Para utilizar como una sonda de hibridación, el ácido nucleico se vuelve generalmente detectable mediante etiquetado con un resto o etiqueta detectable, tal como 32P, 3H y 14C, o mediante otros medios, incluyendo etiquetado químico, tal como mediante traducción por mella en presencia de desoxiuridilato biotinilado en la posición 5' del resto uracilo. La sonda resultante incluye el uridilato biotinilado en lugar de residuos de timidilato y puede detectarse [a través de restos de biotina] mediante cualquiera de una cantidad de sistemas de detección comercialmente disponibles en base a la unión de estreptavidina a la biotina. Dichos sistemas de detección comercialmente disponibles pueden obtenerse, por ejemplo, de Enzo Biochemicals, Inc. [Nueva York, NY]. Cualquier otra etiqueta conocida por los expertos en la técnica, incluyendo etiquetas no radioactivas, pueden utilizarse siempre que vuelvan a las sondas suficientemente detectables, lo cual depende de la sensibilidad del ensayo, la disponibilidad del tiempo [para cultivar células, extraer ADN], la cantidad de ADN o ARN disponible como una fuente de la sonda, la etiqueta particular y los medios utilizados para detectar la etiqueta.

Una vez que se identifican las secuencias con un grado suficientemente alto de homología con la sonda, las mismas pueden aislarse fácilmente mediante técnicas estándar, que se describen, por ejemplo, en Maniatis et al. ((1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Tal como se utiliza en la presente, las condiciones en las cuales las moléculas de ADN forman híbridos estables y son consideradas sustancialmente homólogas son tales que las moléculas de ADN con al menos aproximadamente 60% de complementariedad forman híbridos estables. Dichos fragmentos de ADN se consideran en la presente "sustancialmente homólogos". Por ejemplo, el ADN que codifica una proteína particular es sustancialmente homólogo a otro fragmento de ADN si el ADN forma híbridos estables de modo que las secuencias de los fragmentos son al menos aproximadamente 60% complementarias y si una proteína codificada por el ADN retiene su actividad.

A efectos de la presente, se definen las siguientes condiciones de rigurosidad:

1) alta rigurosidad: 0,1 x SSPE, 0,1% SDS, 65ºC

2) rigurosidad media: 0,2 x SSPE, 0,1 % SDS, 50ºC

3) rigurosidad baja: 1,0 x SSPE, 0,1 % SDS, 50ºC

o cualquier combinación de sal y temperatura y otros reactivos que resulte en la selección del mismo grado de no coincidencia o equivalencia.

Tal como se utiliza en la presente, inmunoprotector se refiere a la capacidad de una vacuna o exposición a un antígeno o agente que induce inmunidad, de conferir a un huésped al cual se administra o induce la vacuna o antígeno, la capacidad de resistir la infección por un patógeno que causa enfermedad o de tener síntomas reducidos. El antígeno seleccionado es típicamente un antígeno que se presenta por el patógeno.

Tal como se utiliza en la presente, todos los ensayos y procedimientos, tales como reacciones de hibridación y reacciones de anticuerpo-antígeno, a menos que se especifique lo contrario, se llevan a cabo en condiciones reconocidas por los expertos en la técnica como condiciones estándar.

A. Preparación de líneas celulares que contienen MAC

1. El megarreplicón

Los métodos, células y MAC descritos en la presente se producen en virtud del descubrimiento de la existencia de una unidad de replicación de orden superior [megarreplicón] de la región centromérica. Este megarreplicón está delimitado por un sitio de iniciación de replicación primaria [megarreplicador] y parece facilitar la replicación de la heterocromatina centromérica y muy probablemente centrómeros. La integración de ADN heterólogo en la región del megarreplicador o en proximidad cercana a la misma, inicia una amplificación a gran escala de los segmentos cromosómicos de tamaño de megabases, que conduce a una formación de cromosomas de novo en células vivas.

Las secuencias de ADN que proporcionan un megarreplicador preferido son las unidades de ADNr que dan lugar a ARN ribosómico (ARNr). En mamíferos, particularmente ratones y humanos, estas unidades de ADNr contienen elementos especializados, tales como el origen de replicación (u origen de replicación bidireccional, es decir, OBR, en ratón) y amplificación que promueve las secuencias (APS) y elementos testigo de amplificación (ACE) (ver, por ejemplo, (Gogel et al. (1996) Chromosoma 104:511-518; Coffman et al. (1993) Exp. Cell. Res. 209:123-132; Little et al. (1993) Mol. Cell. Biol. 13:6600-6613; Yoon et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15:2482-2489; Gonzalez y Sylvester (1995) Genomics 27:320-328; Miesfeld y Arnheim (1982) Nuc. Acids Res. 10:3933-3949]); Maden et al. (1987) Biochem. J. 246:519-527).

Tal como se describe en la presente, sin estar sujeto a ninguna teoría, estos elementos especializados pueden facilitar la replicación y/o amplificación de los segmentos cromosómicos de tamaño de megabases en la formación de novo de los cromosomas, tales como aquellos descritos en la presente, en células. Estos elementos especializados están típicamente ubicados en la región espaciadora intergénica no transcripta corriente arriba de la región transcripta de ADNr. La región espaciadora intergénica puede contener en sí secuencias repetidas internamente que pueden clasificarse como bloques repetidos en tándem y bloques que no están en tándem (ver por ejemplo, Gonzalez y Sylvester (1995) Genomics 27:320-328). En el ADNr de ratón, un origen de replicación bidireccional puede encontrarse dentro de una zona de iniciación de 3 kb centrada aproximadamente 1,6 kb corriente arriba del sitio de inicio de la transcripción (ver, por ejemplo Gogel et al. (1996) Chromosoma 104:511-518). Las secuencias de estos elementos especializados tienden a tener una estructura de cromatina alterada, que puede detectarse, por ejemplo, mediante hipersensibilidad a nucleasa o la presencia de regiones ricas en AT que pueden dar lugar a estructuras de ADN curvadas. Se muestra una secuencia ejemplar que abarca un origen de replicación en la SEQ ID NO. 16 y en el No. de acceso GENBANK X82564 en aproximadamente las posiciones 2430-5435. Secuencias ejemplares que abarcan las secuencias de amplificación-promoción incluyen los nucleótidos 690-1060 y 1105-1530 de la SEQ ID NO. 16.

En el ADNr humano, un sitio de iniciación de replicación primaria puede encontrarse en unos pocos pares de kilobases corriente arriba de la región transcripta y los sitios de iniciación secundarios pueden encontrarse en toda la región espaciadora intergénica no transcripta (ver, por ejemplo, Yoon et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15:2482-2489). Una unidad de repetición de ADNr humana completa se presenta en el No. de acceso de GENBANK U13369 y se establece en la SEQ. ID NO. 17 en la presente. Otra secuencia ejemplar que abarca un sitio de iniciación de replicación puede encontrarse dentro de la secuencia de nucleótidos 35355-42486 en la SEQ. ID NO. 17 particularmente dentro de la secuencia de nucleótidos 37912-42486 y más particularmente dentro de la secuencia de nucleótidos 37912-39288 de la SEQ. ID NO.17 (ver Coffman et al. (1993) Exp. Cell. Res. 209:123-132).

Las líneas celulares que contienen MAC pueden prepararse mediante la transformación de células, preferiblemente una línea celular estable, con un fragmento de ADN heterólogo que codifica un marcador seleccionable, el cultivo en condiciones selectivas y la identificación de células que tienen un cromosoma multicéntrico, típicamente dicéntrico. Estas células pueden manipularse entonces según se describe en la presente para producir los SATAC heterocromáticos, según se describe en la presente.

El desarrollo de un cromosoma multicéntrico, particularmente dicéntrico se realiza típicamente a través de la integración del ADN heterólogo en la heterocromatina pericéntrica, preferiblemente en las regiones centroméricas de cromosomas que portan secuencias de ADNr. Por lo tanto, la frecuencia de incorporación puede aumentarse mediante el direccionamiento a estas regiones, tales como mediante la inclusión de ADN, incluyendo, a modo no taxativo, ADNr o ADN satélite, en el fragmento heterólogo que codifica al marcador seleccionable. Entre las secuencias de direccionamiento preferidas para dirigir al ADN heterólogo a la heterocromatina pericentromérica se encuentran secuencias de ADNr que se dirigen a regiones centroméricas de cromosomas que portan genes de ARNr. Dichas secuencias incluyen, a modo no taxativo, el ADN de la SEQ. ID NO. 16 y No. de acceso de GENBANK X82564 y porciones del mismo, el ADN de la SEQ ID NO. 17 y No. de acceso de GENBANK U13369 y porciones del mismo y el ADN de las SEQ ID NOS. 18-24. Un vector particular que incorpora ADN de la SEQ. ID NO. 16 para su uso en dirigir la integración del ADN heterólogo en ADNr cromosómico es pTERPUD (ver el Ejemplo 12). Las secuencias de ADN satélite también pueden utilizarse para dirigir el ADN heterólogo para integrarlo en la heterocromatina pericéntrica. Por ejemplo, los vectores pTEMPUD y pHASPUD, que contienen ADN satélite de ratón y humano, respectivamente, se proporcionan en la presente (ver Ejemplo 12) como vectores ejemplares para la introducción de ADN heterólogo en células para la formación de cromosomas artificiales de novo.

Las líneas celulares resultantes pueden tratarse entonces como las células ejemplificadas en la presente para producir células en las cuales se ha fragmentado el cromosoma dicéntrico. Las células pueden utilizarse entonces para introducir marcadores selectivos adicionales en el cromosoma dicéntrico fragmentado (es decir, cromosoma anteriormente dicéntrico), con los cuales la amplificación de la heterocromatina pericéntrica producirá los cromosomas heterocromáticos.

La siguiente descripción describe este proceso con referencia a la línea EC3/7 y las células resultantes. Los mismos procedimientos pueden aplicarse a cualquier otra célula, particularmente líneas celulares para crear SATAC.

2. Formación de cromosomas de novo

Se muestra la formación de centrómeros de novo en una línea celular de fibroblastos LMTK de ratón transformado [EC3/7] después de la co-integración de constructos λ [λCM8 y λgtWESneo] que portan ADN humano y bacteriano [Hadlaczky et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A. 88:8106-8110 y Solicitud de los Estados Unidos No. de Serie 08/375.271]. La integración del ADN bacteriano y bacteriófago, humano, manipulado, "heterólogo" y la amplificación posterior de ADN de ratón y heterólogo que condujo a la formación de un cromosoma dicéntrico, se produjo en la región centromérica del brazo corto de un cromosoma de ratón. Mediante bandeo cromosómico G, este cromosoma se identificó como cromosoma de ratón 7. Debido a la presencia de dos centrómeros funcionalmente activos en el mismo cromosoma, se producen roturas regulares entre los centrómeros. Dichas roturas de cromosomas específicas dieron lugar a la aparición [en aproximadamente 10% de las células] de un fragmento de cromosoma que porta el neo-centrómero. Se seleccionaron de la línea celular EC3/7 [ver Patente de los Estados Unidos No. 5.288.625, depositada en la Colección Europea de Cultivo de Células de Animales (denominada en adelante ECACC) con el No. de acceso 90051001; ver también Hadlaczky et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:8106-8110 y Solicitud de los Estados Unidos No. de serie 08/375.271 y la correspondiente solicitud europea publicada EP 0 473 253, dos sublíneas [EC3/7C5 y EC3/7C6] mediante clonación de una única célula repetida. En estas líneas celulares, el neocentrómero se encontró exclusivamente en un minicromosoma [neo-minicromosoma], mientras que el cromosoma anteriormente dicéntrico tenía trazas de ADN "heterólogo".

Ahora se ha descubierto que la integración de ADN que codifica un marcador seleccionable en la región heterocromática del centrómero condujo a la formación del cromosoma dicéntrico.

3. El neo-minicromosoma

La rotura del cromosoma en las células EC3/7, que separa el neo-centrómero del cromosoma de ratón, se produjo en la región de ADN "heterólogo" positiva de bandeo cromosómico G. Esto se confirma por la observación de trazas de secuencias de ADN de λ y humano en el extremo fragmentado del cromosoma anteriormente dicéntrico. Comparando el patrón de bandeo cromosómico G del fragmento de cromosoma que porta el neo-centrómero con el del neo-minicromosoma estable, es evidente que el neo-cromosoma es un duplicado invertido del fragmento de cromosoma que comprende el neo-centrómero. Esto se confirma por la observación de que aunque el neominicromosoma sólo porta un centrómero funcional, ambos extremos del minicromosoma son heterocromáticos y las secuencias de ADN satélite de ratón se encontraron en estas regiones heterocromáticas mediante hibridación in situ.

Las células de ratón que contienen el minicromosoma que contiene múltiples repeticiones del ADN heterólogo, que en la realización ejemplificada es ADN de λ y el gen de resistencia a la neomicina, pueden utilizarse como células receptoras en la transformación celular. El ADN donante, tal como el ADN heterólogo seleccionado que contiene ADN de λ unido a un segundo marcador seleccionable, tal como el gen que codifica fosfotransferasa de higromicina que confiere resistencia a la higromicina [hyg], puede introducirse en las células de ratón e integrarse en los minicromosomas mediante combinación homóloga de ADN de λ en el ADN donante con el que se encuentra en los minicromosomas. La integración se verifica mediante hibridación in situ y análisis Southern Blot. La transcripción y traducción del ADN heterólogo se confirma mediante extensión del cebador y análisis de inmunotransferencia.

Por ejemplo, el ADN ha sido dirigido en el neo-minicromosoma en células EC3/7C5 utilizando un constructo que contiene ADN de λ [pNem1ruc] que también contiene ADN que codifica resistencia a la higromicina y el gen de luciferasa de Renilla unido a un promotor, tal como el promotor temprano de citomegalovirus [CMV] y el ADN que codifica resistencia a la neomicina bacteriana. La integración del ADN donante en el cromosoma en células seleccionadas [designadas PHN4] se confirmó mediante amplificación de ácido nucleico [PCR] e hibridación in situ. Los eventos que producirían un neo-minicromosoma se representan en la Figura 1, aunque los minicromosomas no forman parte de la invención reivindicada.

El minicromosoma manipulado resultante que contiene el ADN heterólogo puede entonces transferirse mediante fusión celular en una línea celular receptora, tal como células de ovario de hámster chino [CHO] y puede verificarse una expresión correcta del ADN heterólogo. Luego de la producción de las células, se obtienen los cromosomas metafase, tal como mediante la adición de colchicina y los cromosomas purificados mediante la adición de tintes específicos de AT y GC en un clasificador celular en base a rayo láser dual (ver Ejemplo 10 B para una descripción de los métodos para aislar cromosomas artificiales). Pueden obtenerse cantidades preparativas de cromosomas [5 x 104 - 5 x 107 cromosomas/ml] a una pureza de 95% o mayor. Los cromosomas resultantes se utilizan para la administración a células mediante métodos tales como microinyección y transferencia mediada por liposomas.

Por lo tanto, el neo-minicromosoma se mantiene de manera estable en células, se replica de manera autónoma y permite la expresión a largo plazo persistente del neo gen en condiciones de cultivo no selectivas. También contiene megabases de ADN conocido heterólogo [ADN de λ en las realizaciones ejemplificadas] que sirve como sitios objetivo para la recombinación homóloga e integración de ADN de interés. El neo-minicromosoma es, por lo tanto, un vector para la ingeniería genética de células. Se ha introducido en ratones SCID y ha demostrado que se replica del mismo modo que los cromosomas endógenos.

Los métodos en la presente proporcionan medios para inducir los eventos que conducen a la formación del neominicromosoma mediante la introducción de ADN heterólogo con un marcador selectivo [preferiblemente un marcador seleccionable dominante] en células y el cultivo de células en condiciones selectivas. Como resultado, se producen células que contienen un cromosoma multicéntrico, por ejemplo, dicéntrico, o fragmentos del mismo, generado mediante amplificación. Las células con el cromosoma dicéntrico pueden tratarse entonces con agentes para desestabilizar los cromosomas con agentes, tales como BrdU y/o cultivo en condiciones selectivas, resultando en células en las cuales el cromosoma dicéntrico formó dos cromosomas, uno llamado minicromosoma y un cromosoma anteriormente dicéntrico que se ha sometido típicamente a amplificación en la heterocromatina donde el ADN heterólogo se ha integrado para producir un SATAC o un cromosoma salchicha [que se describe más adelante]. Estas células pueden fusionarse con otras células para separar el minicromosoma del cromosoma anteriormente dicéntrico en células diferentes de modo que cada tipo de MAC puede manipularse por separado.

4. Preparación de SATAC

Un protocolo ejemplar para la preparación de SATAC se ilustra en la Figura 2 [particularmente D, E y F] y Figura 3 [ver también los ejemplos, particularmente Ejemplos 4-7].

Para separar un SATAC, los materiales de partida son células, preferiblemente una línea celular estable, tal como una línea celular de fibroblastos y un fragmento de ADN que incluye ADN que codifica un marcador selectivo. El fragmento de ADN se introduce en la célula mediante métodos de transferencia de ADN, incluyendo a modo no taxativo, captación directa utilizando fosfato de calcio, electroporación y transferencia mediada por lípidos. Para asegurar la integración del fragmento de ADN en la heterocromatina, es preferible comenzar con el ADN que será dirigido a la región heterocromática pericéntrica del cromosoma, tal como λCM8 y vectores proporcionados en la presente, tal como pTEMPUD [Figura 5] y pHASPUD (ver Ejemplo 12) que incluyen ADN satélite o específicamente en ADNr en las regiones centroméricas de cromosomas que contienen secuencias de ADNr. Después de la introducción del ADN, las células se cultivan en condiciones selectivas. Las células resultantes se examinan y se selecciona cualquiera que tenga cromosomas multicéntricos, particularmente dicéntricos [o cromosomas heterocromáticos o cromosomas salchicha u otra estructura similar; ver, Figura 2D, 2E y 2F].

En particular, si se selecciona una célula con un cromosoma dicéntrico, puede cultivarse en condiciones selectivas o preferiblemente se introduce ADN adicional que codifica un segundo marcador seleccionable y las células cultivadas en condiciones selectivas para el segundo marcador. Las células resultantes deberían incluir cromosomas que tienen estructuras similares a las descritas en las Figuras 2D, 2E, 2F. Las células con una estructura, tal como el cromosoma salchicha, Figura 2D, pueden seleccionarse y fusionarse con una segunda línea celular para eliminar otros cromosomas que no son de interés. Si se desea, las células con otros cromosomas pueden seleccionarse y tratarse según se describe en la presente. Si se selecciona una célula con un cromosoma salchicha, puede tratarse con un agente, tal como BrdU, que desestabiliza al cromosoma de modo que el brazo heterocromático forma un cromosoma que es sustancialmente heterocromático [es decir, un megacromosoma, ver, Figura 2F]. También se observarán estructuras tales como el gigacromosoma en el cual se ha amplificado el brazo heterocromático pero no se ha desprendido del brazo eucromático. El megacromosoma es un cromosoma estable. Una manipulación adicional, tal como fusiones y crecimiento en condiciones selectivas y/o tratamiento con BrdU u otro tratamiento, puede conducir a la fragmentación del megacromosoma para formar cromosomas más pequeños que tienen el amplicón como la unidad de repetición básica.

El megacromosoma puede fragmentarse además in vivo utilizando un vector de fragmentación de cromosoma, tal como pTEMPUD [ver, Figura 5 y Ejemplo 12], pHASPUD o pTERPUD (ver Ejemplo 12) para producir finalmente un cromosoma que comprende una unidad replicable estable más pequeña, de aproximadamente 15 Mb - 60 Mb que contiene uno a cuatro megarreplicones.

Por lo tanto, se han analizado los cromosomas estables formados de novo que se originan del brazo corto del cromosoma de ratón 7. Esta región del cromosoma muestra una capacidad para la amplificación de segmentos de cromosomas grandes y promueve la formación de cromosomas de novo. La amplificación a gran escala en la misma región de cromosomas conduce a la formación de cromosomas dicéntricos y multicéntricos, un minicromosoma, el neo-cromosoma λ de tamaño 150-200 Mb, el cromosoma "salchicha", el gigacromosoma de 500-1000 Mb y el megacromosoma de 250-400 Mb estable.

Se observa una segmentación clara a lo largo de los brazos del megacromosoma y los análisis muestran que las unidades de construcción de este cromosoma son amplicones de ~ 30 Mb compuestos por ADN satélite mayor de ratón con las secuencias de ADN "ajeno" integradas en ambos extremos. Los amplicones de ~ 30 Mb están compuestos por dos dobletes invertidos de ~15 Mb de bloques de ADN satélite mayor de ratón de ~ 7,5 Mb, que están separados entre sí por una banda estrecha de secuencias no satélite [ver, por ejemplo, Figura 3]. Las regiones no satélite más amplias en los bordes del amplicón contienen ADN integrado exógeno [heterólogo], mientras que las bandas estrechas de secuencias de ADN no satélite dentro de los amplicones son partes integrales de la heterocromatina pericéntrica de cromosomas de ratón. Estos resultados indican que los bloques de ~ 7,5 Mb flanqueados por ADN no satélite son las unidades de construcción de la heterocromatina pericéntrica de cromosomas de ratón y las regiones pericéntricas de tamaño ~ 15 Mb de cromosomas de ratón contienen dos unidades de ~ 7,5 Mb.

Aparte de los segmentos terminales eucromáticos, el megacromosoma entero es heterocromático y tiene homogeneidad estructural. Por lo tanto, este cromosoma grande ofrece una posibilidad única para obtener información sobre el proceso de amplificación y para analizar algunas características básicas de la heterocromatina constitutiva pericéntrica como un vector para ADN heterólogo y como un objetivo para una fragmentación adicional.

Tal como se muestra en la presente, este fenómeno puede generalizarse y puede observarse con otros cromosomas. Asimismo, aunque estos segmentos de cromosomas y cromosomas formados de novo parecen diferentes, hay similitudes que indican que un mecanismo de amplificación similar juega un papel en su formación: (i) en cada caso, la amplificación se inicia en la región centromérica de los cromosomas de ratón y se forman amplicones grandes (tamaño Mb); (ii) las secuencias de ADN satélite mayor de ratón son constituyentes constantes de los amplicones, ya sea proporcionando la mayoría de los amplicones heterocromáticos [amplificación tipo H] o delimitando los amplicones aeucromáticos [amplificación tipo E]; (iii) la formación de segmentos invertidos puede demostrarse en el neo-cromosoma λ y megacromosoma; (iv) los brazos del cromosoma y cromosomas formados mediante la amplificación son estables y funcionales.

La presencia de segmentos de cromosomas invertidos parecen ser un fenómeno común en los cromosomas formados de novo en la región centromérica del cromosoma de ratón 7. Durante la formación del neo-cromosoma, el evento que conduce a la estabilización del segmento distal del cromosoma 7 de ratón que porta el neo-centrómero puede haber sido la formación de su duplicado invertido. Los amplicones del megacromosoma son dobletes invertidos de bloques de ADN satélite mayor de ratón de ~ 7,5 Mb.

5. Líneas celulares

Líneas celulares que contienen los MAC, tal como el minicromosoma, el neocromosoma λ y los SATAC se proporcionan en la presente o pueden producirse mediante los métodos en la presente. Dichas líneas celulares proporcionan una fuente conveniente de estos cromosomas y pueden manipularse, tal como mediante fusión celular

o producción de microcélulas para la fusión con líneas celulares seleccionadas, para administrar el cromosoma de interés en líneas celulares híbridas. En la presente se describen líneas celulares ejemplares y algunas se han depositado en la ECACC.

a.

EC3/7C5 y EC3/7C6

Las líneas celulares EC3/7C5 y EC3/7C6 se produjeron mediante clonación de una única célula de EC3/7. A los efectos ejemplares EC3/7C5 se ha depositado en la ECACC. Estas líneas celulares contienen un minicromosoma y el cromosoma anteriormente dicéntrico de EC3/7. Los minicromosomas estables en las líneas celulares EC3/7C5 y EC3/7C6 parecen ser los mismos y parecen ser derivados duplicados del fragmento "desprendido" de ~ 10-15 Mb del cromosoma dicéntrico. Su tamaño similar en estas líneas celulares generadas de manera independiente puede indicar que ~ 20-30 Mb es el tamaño físico mínimo o cercano al mínimo para un minicromosoma estable.

b. TF1004G19

La introducción de ADN heterólogo adicional, incluyendo ADN que codifica un segundo marcador seleccionable, fosfotransferasa de higromicina, es decir, el gen de resistencia a la higromicina y también un marcador detectable βgalactosidasa (es decir, codificado por el gen lacZ), en la línea celular EC3/7C5 y crecimiento en condiciones

selectivas produjeron células designadas TF1004G19. En particular, esta línea celular se produjo a partir de la línea celular EC3/7C5 mediante cotransfección con plásmidos pH 132, que contiene un ribozima anti-VIH y un gen de resistencia a la higromicina, pCH110 [codifica β-galactosidasa] y ADN de bacteriófago λ [λcl 875 Sam 7] y selección con higromicina B.

El análisis detallado de la línea celular TF1004G19 mediante hibridación in situ con bacteriófago λ y secuencias de ADN plásmido reveló la formación del cromosoma salchicha. El cromosoma anteriormente dicéntrico de la línea celular EC3/7C5 se desplazó al extremo de otro cromosoma acrocéntrico. El ADN heterólogo se integró en la heterocromatina pericéntrica del cromosoma anteriormente dicéntrico y se amplificó varias veces con megabases de secuencias de ADN satélite heterocromático pericéntrico de ratón [Fig. 2D] que forman el cromosoma "salchicha". Posteriormente se sustituyó el cromosoma de ratón acrocéntrico por un telómero eucromático.

La hibridación in situ con subfragmentos etiquetados con biotina de los genes de resistencia a la higromicina y de βgalactosidasa resultó en una señal de hibridación sólo en el brazo heterocromático del cromosoma salchicha, indicando que en las células transformantes TF1004G19 estos genes están localizados en la heterocromatina pericéntrica.

Sin embargo se detectó un alto nivel de expresión de genes. En general, la heterocromatina tiene un efecto silenciador en Drosophila, levadura y en el gen HSV-tk introducido en el ADN satélite en el centrómero de ratón. Por lo tanto, era de interés estudiar la línea celular transformada TF1004G19 para confirmar que los genes ubicados en la heterocromatina en efecto se expresaron, contrario al dogma reconocido.

A estos efectos, los subclones de TF1004G19 que contienen un cromosoma salchicha diferente [ver Figura 2D], se establecieron mediante clonación de una única célula. La hibridación Southern de ADN aislada de los subclones con subfragmentos de fosfotransferasa de higromicina y genes lacZ mostró una correlación estrecha entre la intensidad de la hibridación y la longitud del cromosoma salchicha. Este hallazgo confirma la conclusión de que estos genes están localizados en el brazo heterocromático del cromosoma salchicha.

(1)

TF1004G-19C5

TF1004G-19C5 es una línea celular de fibroblastos LMTK- de ratón que contiene neo-minicromosomas y cromosomas "salchicha" estables. Es un subclón de TF1004G19 y se generó mediante clonación de una única célula de la línea celular TF1004G19. Se ha depositado en la ECACC como una línea celular ejemplar y fuente ejemplar de un cromosoma salchicha. La fusión posterior de esta línea celular con células CHO K20 y selección con higromicina y G418 y HAT (medio de hipoxantina, aminopterina y timidina; ver Szybalski et al. (1962) Proc. Natl. Acad. Sci. 48:2026) resultó en células híbridas (designadas 19C5xHa4) que portan el cromosoma salchicha y el neocromosoma. El tratamiento con BrdU de las células híbridas, con posterior clonación de una única célula y selección con G418 y/o higromicina produjo varias células que portan cromosomas de interés, incluyendo GB43 y G3D5.

(2)

otros subclones

Las líneas celulares GB43 y G3D5 se obtuvieron mediante el tratamiento de células 19C5xHa4 con BrdU con posterior crecimiento en medio selectivo que contenía G418 y retratamiento con BrdU. Las dos líneas celulares se aislaron mediante clonación de una única célula de las células seleccionadas. Las células GB43 contienen solamente el neo-minicromosoma. G3D5, que ha sido depositado en la ECACC, porta el neo-minicromosoma y el megacromosoma. La clonación de una única célula de esta línea celular seguida por el crecimiento de los subclones en un medio que contiene G418 e higromicina proporcionó subclones tales como la línea celular GHB42 que porta el neo-minicromosoma y el megacromosoma. H1D3 es una línea celular híbrida de ratón-hámster que porta el megacromosoma, pero ningún neo-minicromosoma, y se generó mediante el tratamiento de células 19C5xHa4 con BrdU seguido por el crecimiento en medio selectivo que contiene higromicina y subclonación de una única célula de células seleccionadas. La fusión de esta línea celular con la línea celular CD4+ HeLa que también porta ADN que codifica un gen de selección adicional, el gen de resistencia a la neomicina, produjo células [designadas células H1xHE41] que portan el megacromosoma así como un cromosoma humano que porta CD4neo. Un tratamiento con BrdU adicional y clonación de una única célula produjo líneas celulares, tal como 1B3, que incluye células con un megacromosoma truncado.

5. Constructos de ADN utilizados para transformar las células

El ADN heterólogo puede introducirse en las células mediante la transfección u otro método adecuado en cualquier etapa durante la preparación del cromosoma [ver, por ejemplo, FIG. 4]. En general, la incorporación de dicho ADN en los MAC se asegura a través de la integración dirigida al sitio, tal como puede lograrse mediante la inclusión de ADN de λ en el ADN heterólogo (para los cromosomas ejemplificados) y también un gen marcador selectivo adicional. Por ejemplo, células que contienen un SATAC, pueden cotransfectarse con un plásmido que porta el ADN heterólogo deseado, tal como ADN que codifica un ribozima VIH, el gen de fibrosis quística y ADN que codifica un segundo marcador seleccionable, tal como resistencia a la higromicina. La presión selectiva se aplica entonces a las células mediante su exposición a un agente que es dañino para las células que no expresan el nuevo marcador seleccionable, De este modo, se identifican las células que incluyen el ADN heterólogo en el SATAC. La fusión con

una segunda línea celular puede proporcionar un medio para producir líneas celulares que contienen un tipo particular de estructura cromosómica o SATAC.

A estos efectos se proporcionan en la presente varios vectores [ver, Ejemplos] y otros pueden construirse fácilmente. Los vectores preferiblemente incluyen ADN que es homólogo al ADN contenido dentro de un SATAC para dirigir el ADN al SATAC para la integración en el mismo. Los vectores también incluyen un gen marcador seleccionable y el gen heterólogo seleccionado de interés. En base a la divulgación en la presente y el conocimiento del experto en la técnica, un experto en la técnica puede construir dichos vectores.

Es de particular interés de la presente el vector pTEMPUD y derivados del mismo que pueden dirigirse al ADN en la región heterocromática de cromosomas seleccionados. Estos vectores también pueden servir como vectores de fragmentación [ver, por ejemplo, Ejemplo 12].

Los genes heterólogos de interés incluyen cualquier gen que codifica un producto terapéutico y ADN que codifica productos génicos de interés. Estos genes y ADN incluyen, a modo no taxativo: el gen de fibrosis quística (CF), gen regulador de la transmembrana quística (CFTR) [ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No.

5.240.846 ; Rosenfeld et al. (1992) Cell 68:143-155; Hyde et al. (1993) Nature 362: 250-255; Kerem et al. (1989) Science 245:1073-1080; Riordan et al. (1989) Science 245:1066-1072; Rommens et al. (1989) Science 245:10591065; Osborne et al. (1991) Am. J. Hum. Genetics 48:6089-6122; White et al. (1990) Nature 344:665-667; Dean et al. (1990) Cell 61:863-870; Erlich et al. (1991) Science 252:1643 y Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.453.357, 5.449.604, 5.434.086 y 5.240.846, que proporciona un vector retroviral que codifica el gen CFTR normal].

B. Aislamiento de cromosomas artificiales

Los SATAC proporcionados en la presente pueden aislarse mediante cualquier método adecuado conocido por los expertos en la técnica. Asimismo, en la presente se proporcionan métodos para efectuar una purificación sustancial de los SATAC. Los SATAC se han aislado mediante clasificación celular activada por fluorescencia [FACS]. Este método aprovecha el contenido de base de nucleótido de los SATAC, que, en virtud de su alto contenido de ADN heterocromático, diferirá de cualquier otro cromosoma en una célula. En una realización particular los cromosomas metafase están aislados y teñidos con tintes específicos de base, tales como Hoechst 33258 y cromomicina A3. La clasificación celular activada por fluorescencia separará los SATAC de los cromosomas endógenos. Un clasificador celular en base a rayo láser dual [FACS Vantage Becton Dickinson Immunocytometry Systems] en el cual dos láseres estaban configurados para excitar los tintes separadamente, permitió un análisis bivariante de los cromosomas mediante composición de pares de bases y tamaño. Las células que contienen dichos SATAC pueden clasificarse de manera similar.

Los métodos adicionales proporcionados en la presente para el aislamiento de cromosomas artificiales de cromosomas endógenos incluyen procedimientos que son particularmente adecuados para el aislamiento a gran escala de cromosomas artificiales tales como los SATAC. En estos métodos, las diferencias de tamaño y densidad entre los SATAC y cromosomas endógenos se explotan para efectuar una separación de estos dos tipos de cromosomas. Dichos métodos implican técnicas tales como centrifugación de cesto giratorio, centrifugación de rotor zonal y sedimentación de velocidad. También se proporcionan en la presente métodos basados en la afinidad, particularmente inmunoafinidad, para la separación de cromosomas artificiales de endógenos Por ejemplo, los SATAC, que son predominantemente heterocromatina, pueden separarse de cromosomas endógenos a través de procedimientos de inmunoafinidad que implican anticuerpos que reconocen específicamente la heterocromatina y/o las proteínas asociadas con las mismas, cuando los cromosomas endógenos contienen relativamente poca heterocromatina, tal como en células de hámster.

C. Construcción in vitro de cromosomas artificiales

Los cromosomas artificiales pueden construirse in vitro mediante el ensamblaje de elementos estructurales y funcionales para contribuir a un cromosoma completo capaz de replicación estable y segregación junto con cromosomas endógenos en células. La identificación de los elementos discretos que en combinación proporcionan un cromosoma funcional ha conseguido la generación in vitro de cromosomas artificiales. El proceso de construcción in vitro de cromosomas artificiales, que puede controlarse rígidamente, proporciona ventajas que pueden ser deseadas en la generación de cromosomas que, por ejemplo, se requieren en grandes cantidades o que se pretenden para su uso específico en sistemas animales transgénicos.

Por ejemplo, la construcción in vitro puede ser ventajosa cuando la eficiencia del tiempo y escala son consideraciones importantes en la preparación de cromosomas artificiales. Debido a que los métodos de construcción in vitro no implican procedimientos de cultivo de células extensos, pueden utilizarse cuando el tiempo y trabajo requeridos para transformar, alimentar, cultivar y cosechar células utilizadas en sistemas de producción en base a células in vivo no están disponibles.

La construcción in vitro también puede controlarse rigurosamente con respecto al modo exacto en el cual los elementos del cromosoma artificial deseado se combinan y en qué secuencia y proporciones se ensamblan para proporcionar un cromosoma de especificaciones precisas. Estos aspectos pueden ser de importancia en la

producción de cromosomas artificiales que se utilizarán en animales vivos cuando es deseable asegurarse de que se introducen en el animal huésped sólo las secuencias de ADN específico y muy puro en cantidades específicas.

A continuación se describen los procesos que dan lugar a la construcción de cromosomas artificiales in vitro, utilizando un megacromosoma como material de partida ejemplar.

1. Identificación y aislamiento de los componentes del cromosoma artificial

Los SATAC son cromosomas elegantemente simples para su uso en la identificación y aislamiento de componentes a ser utilizados en la construcción in vitro de cromosomas artificiales. La capacidad de purificar SATAC a un nivel muy alto de pureza, según se describe en la presente, facilita su uso a estos efectos. Por ejemplo, el megacromosoma, particularmente formas truncadas del mismo [es decir, líneas celulares, tales como 1B3 y mM2C1, que derivan de H1D3 (depositadas en la Colección Europea de Cultivo de Células de Animales (ECACC) con el No. de acceso 96040929, ver ejemplos a continuación) sirven como materiales de partida.

Por ejemplo, la línea celular mM2C1 contiene un micro-megacromosoma (~ 50-60 kB), que contiene de manera ventajosa sólo un centrómero, dos regiones de ADN heterólogo integrado con secuencias ADNr adyacentes, siendo el resto del ADN cromosómico ADN satélite mayor de ratón. Otros megacromosomas truncados pueden servir como una fuente de telómeros o pueden proporcionarse telómeros (ver, Ejemplos a continuación con respecto a la construcción de plásmidos que contienen secuencias teloméricas repetidas en tándem). El centrómero de la línea celular mM2C1 contiene ADN satélite menor de ratón, que proporciona una etiqueta útil para el aislamiento del ADN centromérico.

Las características adicionales de SATAC particulares proporcionados en la presente, tales como el micromegacromosoma de la línea celular mM2C1, que los hace adecuados únicamente para servir como materiales de partida en el aislamiento e identificación de componentes cromosómicos incluyen el hecho de que los centrómeros de cada megacromosoma dentro de una línea celular específica única son idénticos. La capacidad de comenzar con una fuente de centrómero homogénea (no una mezcla de diferentes cromosomas que tienen secuencias centroméricas diferentes) facilita en gran medida la clonación del ADN del centrómero. Mediante la digestión de megacromosomas purificados, particularmente megacromosomas truncados, tales como el micro-megacromosoma, con endonucleasas de restricción apropiada y clonación de fragmentos en los vectores YAC comercialmente disponibles y bien conocidos (ver, por ejemplo, Burke et al. (1987) Science 236:806-812), vectores BAC (ver, por ejemplo, Shizuya et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 8794-8797 cromosomas artificiales bacterianos que tienen una capacidad de incorporar 0,9 - 1 Mb de ADN) o vectores PAC (el vector de cromosomas artificiales P1 que es un derivado de plásmido P1 que tiene una capacidad de incorporar 300 kb de ADN y que se administra a células huésped de E. coli mediante electroporación más que mediante empaquetado de bacteriófagos; ver, por ejemplo, loannou et al. (1994) Nature Genetics 6:84-89; Pierce et al. (1992) Meth. Enzymol. 216:549-574; Pierce et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:2056-2060; Patente de los Estados Unidos No. 5.300.431 y Solicitud internacional PCT No. WO 92/14819), es posible para apenas 50 clones representar el micro-megacromosoma entero.

a. Centrómeros

Un centrómero ejemplar para su uso en la construcción de un cromosoma artificial de mamífero es el contenido dentro del megacromosoma de cualquiera de las líneas celulares que contienen megacromosomas proporcionadas en la presente, tal como, por ejemplo H1D3 y derivados del mismo, tal como células mM2C1. Los megacromosomas está aislados de dichas líneas celulares utilizando, por ejemplo, los procedimientos descritos en la presente, y la secuencia centromérica se extrae de los megacromosomas aislados. Por ejemplo, los megacromosomas pueden separarse en fragmentos utilizando endonucleasas que se reconocen y se cortan en sitios que, por ejemplo, están principalmente ubicados en sitios de replicación y/o de integración de ADN heterólogo y/o en el ADN satélite. En base a los tamaños de los fragmentos resultantes, ciertos elementos no deseados pueden separarse de las secuencias que contienen centrómeros. El ADN que contiene centrómeros podría llegar a 1 Mb.

Las sondas que específicamente reconocen las secuencias centroméricas, tales como sondas en base a ADN satélite menor de ratón [ver, por ejemplo, Wong et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16:11645-11661], pueden utilizarse para aislar los clones YAC, BAC o PAC que contienen centrómeros derivados del megacromosoma. Alternativamente o conjuntamente con la identificación directa de ADN megacromosómico que contiene centrómeros, sondas que específicamente reconocen los elementos no centroméricos, tales como sondas específicas para ADN satélite mayor de ratón, el ADN heterólogo y/o ADNr, puede utilizarse para identificar y eliminar los clones que contienen ADN no centromérico.

Adicionalmente, los métodos de clonación de centrómeros descritos en la presente pueden utilizarse para aislar la secuencia que contiene centrómeros del megacromosoma. Por ejemplo, el Ejemplo 12 describe el uso de vectores YAC en combinación con el gen de tirosinasa murina y ratones NMRI/Han para la identificación de la secuencia centromérica.

Una vez que se ha aislado el fragmento de centrómero, puede secuenciarse y la información de la secuencia puede a su vez utilizarse en amplificación por PCR de las secuencias de centrómero de los megacromosomas u otras

fuentes de centrómeros. También puede evaluarse la función in vivo de los centrómeros aislados mediante la transferencia del ADN en una célula de mamífero huésped. El análisis funcional puede incluir, por ejemplo, examinar la capacidad de la secuencia de centrómeros de unir proteínas de unión de centrómeros. El centrómero clonado se transferirá a células de mamífero con un gen marcador seleccionable y la unión de una proteína específica de centrómeros, tal como anticuerpos anti-centrómero (por ejemplo, LU851, ver Hadlaczky et al. (1986) Exp. Cell Res. 167:1-15) pueden utilizarse para evaluar la función de los centrómeros.

b. Telómeros

Los telómeros preferidos son el telómero sintético de 1 kB proporcionado en la presente (ver, Ejemplos). Puede utilizarse un constructo de telómero sintético doble, que contiene un telómero sintético de 1 kB unido a un gen marcador seleccionable dominante que continúa en una orientación invertida para facilitar la manipulación. Dicho constructo doble contiene una serie de repeticiones TTAGGG 3' del gen marcador y una serie de repeticiones de la secuencia invertida, es decir, GGGATT, 5' del gen marcador como se describe a continuación: (GGGATTT)n---gen marcador dominante---(TTAGGG)n. Utilizar un marcador invertido proporciona un medio fácil para la inserción, tal como mediante ligadura de extremos romos, ya que se seleccionarán sólo los fragmentos orientados de manera apropiada

c. Megareplicador

Las secuencias del megarreplicador, tales como el ADNr, proporcionado en la presente, son preferidas para su uso en constructos in vitro. El ADNr proporciona un origen de replicación y también proporciona secuencias que facilitan la amplificación del cromosoma artificial in vivo para aumentar el tamaño del cromosoma para, por ejemplo, albergar las crecientes copias de un gen heterólogo de interés así como niveles altos continuos de expresión de los genes heterólogos.

d. Heterocromatina de relleno

La heterocromatina de relleno, particularmente el ADN satélite, se incluye para mantener una integridad y estabilidad estructural del cromosoma artificial y proporcionar una base estructural para portar genes dentro del cromosoma. El ADN satélite es típicamente una secuencia de ADN rica en A/T, tal como ADN satélite mayor de ratón o secuencia de ADN rica en G/C, tal como ADN satélite natural de hámster. Las fuentes de dicho ADN incluyen cualquier organismo eucariota que porta ADN satélite no codificante con una composición A/T o G/C suficiente para promover una separación lista mediante secuencia, tal como mediante FACS o mediante gradientes de densidad. El ADN satélite también puede sintetizarse mediante la generación de secuencias que contienen repeticiones en tándem monótonas, de unidades de ADN altamente ricas en A/T o G/C.

La cantidad más adecuada de heterocromatina de relleno para su uso en la construcción del cromosoma artificial puede determinarse empíricamente, por ejemplo, mediante la inclusión de segmentos de varias longitudes, mediante el aumento en tamaño, en el proceso de construcción. Los fragmentos que son demasiado pequeños para ser adecuados para su uso no proporcionarán un cromosoma funcional, que puede evaluarse en estudios de expresión en base a células o que resultará en un cromosoma de vida funcional limitada o estabilidad mitótica y estructural.

e. Marcador seleccionable

Puede utilizarse cualquier marcador seleccionable conveniente y en cualquier locus conveniente en el SATAC.

2. Combinación de los elementos cromosómicos aislados

Una vez que se obtienen los elementos aislados, pueden combinarse para generar el cromosoma artificial funcional completo. Este ensamblaje puede lograrse por ejemplo, mediante ligadura in vitro ya sea en solución, LMP agarosa

o en microperlas. La ligadura se lleva a cabo de modo que un extremo del centrómero se une directamente a un telómero. El otro extremo del centrómero, que sirve como el brazo del cromosoma que porta genes, se construye de una combinación de ADN satélite y secuencia de ADNr y también puede contener un gen marcador seleccionable. Otro telómero se une al extremo del brazo de cromosoma que porta genes. El brazo que porta genes es el sitio en el cual cualquier gen heterólogo de interés, por ejemplo, en expresión de proteínas deseadas codificadas por el mismo, se incorpora ya sea durante la construcción in vitro del cromosoma o posteriormente.

3.

Análisis y evaluación del cromosoma artificial

Los cromosomas artificiales construidos in vitro pueden evaluarse para detectar la funcionalidad en sistemas de células de mamíferos in vivo, utilizando cualquiera de los métodos descritos en la presente para los SATAC o conocidos por los expertos en la técnica.

4.

Introducción de ADN heterólogo deseado en el cromosoma sintetizado in vitro

El ADN heterólogo puede introducirse en el cromosoma sintetizado in vitro utilizando métodos de rutina de biología molecular, puede introducirse utilizando los métodos descritos en la presente para los SATAC o puede introducirse en el cromosoma sintetizado in vitro como parte de uno de los elementos sintéticos, tales como la heterocromatina.

El ADN heterólogo puede unirse a un fragmento repetido seleccionado y luego el constructo resultante puede amplificarse in vitro utilizando los métodos para dicha amplificación in vitro proporcionados en la presente (ver los Ejemplos).

D. Introducción de cromosomas artificiales en células, tejidos, animales y plantas

Los huéspedes adecuados para la introducción de los SATAC proporcionados en la presente, incluyen, a modo no taxativo, cualquier animal o planta, célula o tejido de los mismos, incluyendo, a modo no taxativo: mamíferos, aves, reptiles, anfibios, insectos, peces, arácnidos, tabaco, tomate, trigo, plantas y algas. Los SATAC, si están contenidos en las células, pueden introducirse mediante fusión celular o fusión de microcélulas o si los SATAC se han aislado de las células, pueden introducirse en células huésped mediante cualquier método conocido por los expertos en la técnica, incluyendo a modo no taxativo: transferencia de ADN directa, electroporación, transferencia mediada por lípidos, por ejemplo, lipofección y liposomas, bombardeo de microproyectiles, microinyección en células y embriones, regeneración de protoplastos para plantas y cualquier otro método adecuado [ver, por ejemplo, Weissbach et al. (1988) Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, N.Y., Section VIII, páginas 421-463; Grierson et al. (1988) Plant Molecular Biology, 2d Ed., Blackie, London, Ch. 7-9; ver, también Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.491.075; 5.482.928 y 5.424.409; ver, también, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 5.470.708, que describe la transformación mediada por partículas de células sin unir de mamífero].

Otros métodos para introducir ADN en células incluyen microinyección nuclear y fusión de protoplastos bacteriana con células intactas. También pueden utilizarse policationes, tales como polibreno y poliornitina. Para ver varias técnicas para transformar células de mamíferos, ver, por ejemplo, Keown et al. Methods in Enzymology (1990) Vol. 185, páginas 527-537 y Mansour et al. (1988) Nature 336:348-352.

Por ejemplo, los cromosomas artificiales purificados aislados pueden inyectarse en una línea celular embrionaria tal como una línea celular embrionaria primaria de riñón humano [número de acceso de ATCC CRL 1573] o células madre embrionarias [ver, por ejemplo, Hogan et al. (1994) Manipulating the Mouse Embryo, A: Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, ver, específicamente, páginas 255-264 y Apéndice 3].

Preferiblemente los cromosomas se introducen mediante microinyección, utilizando un sistema tal como el sistema de microinyección automatizado Eppendorf y se cultivan en condiciones selectivas, tales como en presencia de higromicina B o neomicina.

1. Métodos para la introducción de cromosomas en huéspedes

Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas estándar apropiadas para dichas células. Estos métodos incluyen cualquiera conocido por los expertos en la técnica, incluyendo aquellos descritos en la presente.

a. Captación de ADN

Para las células de mamíferos que no tienen paredes celulares, el método de precipitación de fosfato de calcio para la introducción de ADN exógeno [ver, por ejemplo, Graham et al. (1978) Virology 52:456-457; Wigler et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76:1373-1376; y Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Wiley Inter-Science, Supplement 14, Unit 9.1.1-9.1.9 (1990)] es a menudo preferida. La captación de ADN puede lograrse mediante ADN solo o en presencia de polietilenglicol [transferencia de genes mediada por PEG], que es un agente de fusión o mediante cualquier variación de dichos métodos conocidos por los expertos en la técnica [ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 4.684.611].

Los sistemas portadores mediados por lípidos también se encuentran entre los métodos preferidos para la introducción de ADN en células [ver, por ejemplo, Teifel et al. (1995) Biotechniques 19:79-80; Albrecht et al. (1996) Ann. Hematol. 72:73-79; Holmen et al. (1995) In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 31:347-351; Remy et al. (1994) Bioconjug. Chem. 5:647-654; Le Bolc'h et al. (1995) Tetrahedron Lett. 36:6681-6684; Loeffler et al. (1993) Meth. Enzymol. 217:599-618]. También puede utilizarse la lipofección [ver, por ejemplo, Strauss (1996) Meth. Mol. Biol. 54:307-327] para introducir ADN en las células. Este método es particularmente adecuado para la transferencia de ADN exógeno en células de pollo (por ejemplo, células blastodérmicas de pollo y fibroblastos de pollo primarios; ver Brazolot et al. (1991) Mol. Repro. Dev. 30:304-312). En particular, el ADN de interés puede introducirse en pollos en enlace operativo con promotores de genes, tales como lisozima y ovalbúmina, que se expresan en el huevo, permitiendo así la expresión del ADN heterólogo en el huevo.

Métodos adicionales útiles en la transferencia directa de ADN en células incluye la electrofusión de cañón de partículas [ver, por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos Nos. 4.955.378, 4.923.814, 4.476.004,

4.906.576 y 4.441.972] y transferencia de genes mediada por viriones.

Un abordaje utilizado comúnmente para la transferencia de genes en plantas de tierra implica la introducción directa de ADN purificado en protoplastos. Los tres métodos básicos para la transferencia de genes directa en células de plantas incluyen: 1) captación de ADN mediada por polietilenglicol [PEG], 2) captación de ADN mediada por

electroporación y 3) microinyección. Además, las plantas pueden transformarse utilizando un tratamiento de ultrasonido [ver, por ejemplo, Publicación de solicitud PCT internacional No. WO 91/00358].

b. Electroporación

La electroporación implica proporcionar pulsos eléctricos de alto voltaje a una solución que contiene una mezcla de protoplastos y ADN ajeno para crear poros reversibles en las membranas de protoplastos de plantas así como otras células. La electroporación se utiliza generalmente para procariotas y otras células, tales como plantas que contienen barreras de paredes celulares sustanciales. Los métodos para efectuar la electroporación son bien conocidos [ver, por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos Nos. 4.784.737, 5.501.967, 5.501.662, 5.019.034, 5.503.999; ver, también Frommet al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:5824-5828].

Por ejemplo, la electroporación se utiliza a menudo para la transformación de plantas [ver, por ejemplo, Ag Biotechnology News 7:3 y 17 (Setiembre/Octubre 1990)]. En esta técnica, los protoplastos de plantas se electroporan en presencia del ADN de interés que también incluye un marcador fenotípico. Los impulsos eléctricos de fuerza de campo alta permeabilizan reversiblemente las biomembranas permitiendo la introducción de los plásmidos. Los protoplastos de planta electroporados reforman la pared celular, dividen y forman callos de planta. Las células de plantas transformadas se identificarán en virtud del marcador fenotípico expresado. El ADN exógeno puede agregarse a los protoplastos en cualquier forma tal como, por ejemplo, ADN desnudo lineal, circular o súper enrollado, ADN encapsulado en liposomas, ADN en esferoplastos, ADN en otros protoplastos de plantas, ADN en complejos con sales, y otros métodos.

c. Microcélulas

Los cromosomas pueden transferirse mediante la preparación de microcélulas que contienen un cromosoma artificial y luego la fusión con células objetivo seleccionadas. Los métodos para dicha preparación y fusión de microcélulas son bien conocidos [ver, los Ejemplos y también ver, por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.240.840, 4.806.476, 5.298.429, 5.396.767, Fournier (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:6349-6353 y Lambert et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:5907-59]. La fusión de microcélulas, utilizando microcélulas que contienen un cromosoma artificial, es un método particularmente útil para la introducción de MAC en células aviares, tales como células pre-B de pollo DT40 [para una descripción de fusión celular DT40, ver, por ejemplo, Dieken et al. (1996) Nature Genet. 12:174-182].

2. Huéspedes

Los huéspedes adecuados incluyen cualquier huésped que se conoce es útil para la introducción y expresión de ADN heterólogo. Es de particular interés en la presente, las células y tejidos de animales y plantas, incluyendo, a modo no taxativo, células de insectos y larvas, plantas y animales, particularmente células de animales no humanos transgénicos y de animales. Otros huéspedes incluyen, a modo no taxativo, mamíferos, aves, particularmente aves de corral tales como pollos, reptiles, anfibios, insectos, peces, arácnidos, tabaco, tomate, trigo, monocotiledóneas, dicotiledóneas y algas, y cualquier huésped en el cual sea deseada la introducción de ADN heterólogo. Dicha introducción puede efectuarse utilizando los SATAC proporcionados en la presente o de ser necesario, mediante el uso de SATAC proporcionados en la presente para identificar centrómeros específicos para la especie y/o unidades cromosómicas funcionales y luego utilizar los centrómeros resultantes o unidades cromosómicas como cromosomas artificiales o alternativamente mediante el uso de los métodos ejemplificados en la presente para la producción de SATAC para producir cromosomas artificiales específicos para la especie.

a. Introducción de ADN en embriones para la producción de animales no humanos transgénicos y la introducción de ADN en células de animales

Los animales transgénicos pueden producirse mediante la introducción de material genético exógeno en un pronúcleo de un cigoto de mamífero mediante microinyección [ver, por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos Nos. 4.873.191 y 5.354.674; ver, también, Publicación de solicitud PCT internacional No. WO 95/14769, que se basa en la solicitud de los Estados Unidos No. de serie 08/159.084]. El cigoto es capaz de desarrollarse en un mamífero. El embrión o cigoto se trasplanta en un útero de una hembra huésped y se le permite desarrollarse. A continuación se establecen protocolos y ejemplos detallados.

Transferencia nuclear [ver, Wilmut et al. (1997) Nature 385:810-813, Solicitudes PCT internacionales Nos. WO 97/07669 y WO 97/07668]. Brevemente en este método, el SATAC que contiene los genes de interés se introduce mediante cualquier método adecuado, en una célula donante apropiada, tal como una célula de glándula mamaria que contiene núcleos totipotentes. El núcleo diploide de la célula, que está ya sea en fase G0 o G1, se introduce entonces, tal como mediante fusión celular o microinyección, en un oocito inactivado, preferiblemente una célula enucleada, que se interrumpe en la metafase de la segunda división meiótica. La enucleación puede efectuarse mediante cualquier método adecuado, tal como eliminación real o mediante el tratamiento con un medio, tal como luz ultravioleta, que elimina funcionalmente el núcleo. El oocito se activa entonces, preferiblemente después de un periodo de contacto, aproximadamente 6-20 horas para ganado, del nuevo núcleo con el citoplasma, mientras que mantiene una ploidía correcta, para producir un embrión reconstruido, que se introduce entonces en un huésped. La ploidía se mantiene durante la activación, por ejemplo, mediante la incubación de la célula reconstruida en presencia

de un inhibidor de microtúbulos, tal como nocodazol, colchicina, colcemida y taxol, con lo cual el ADN se replica una vez.

Los pollos transgénicos pueden producirse mediante la inyección de células blastodérmicas dispersadas de embriones de pollo en Etapa X en embriones receptores en una etapa similar de desarrollo [ver por ejemplo, Etches et al. (1993) Poultry Sci. 72:882-889; Petitte et al. (1990) Development 108:185-189]. El ADN heterólogo se introduce primero en las células blastodérmicas donantes utilizando métodos tales como, por ejemplo, lipofección [ver, por ejemplo Brazolot et al. (1991) Mol. Repro. Dev. 30:304-312] o fusión de microcélulas [ver, por ejemplo, Dieken et al. (1996) Nature Genet. 12:174-182]. Las células donantes transfectadas se inyectan entonces en embriones de pollo receptores [ver, por ejemplo, Carsience et al. (1993) Development 117:669-675]. Los embriones de pollo receptores dentro de la cápsula se examinan a contraluz y se permite que empollen para proporcionar un pollo quimérico de línea germinal.

El ADN puede introducirse en células de animales utilizando cualquier procedimiento conocido, incluyendo, a modo no taxativo: captación directa, incubación con polietilenglicol [PEG], microinyección, electroporación, lipofección, fusión celular, fusión de microcélulas, bombardeo de partículas, incluyendo bombardeo de microproyectiles [ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 5.470.708, que proporciona un método para transformar las células de mamífero sin unir través de un bombardeo de partículas], y cualquier otro método. Por ejemplo, la transferencia de ADN plásmido en liposomas directamente a células humanas in situ ha sido aprobada por la FDA para su uso en humanos [ver, por ejemplo, Nabel, et al. (1990) Science 249: 1 285-1 288 y Patente de los Estados Unidos No. 5.461.032].

b. Introducción de ADN heterólogo en plantas

Numerosos métodos para producir o desarrollar plantas transgénicas están disponibles para los expertos en la técnica. El método utilizado depende principalmente de una función de las especies de planta. Estos métodos incluyen, a modo no taxativo: transferencia directa de ADN mediante procesos, tales como captación de ADN inducida por PEG, fusión de protoplastos, microinyección, electroporación y bombardeo de microproyectiles [ver, por ejemplo, Uchimiya et al. (1989) J. of Biotech. 12: 1-20 para un informe de dichos procedimientos, ver también, por ejemplo Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.436.392 y 5.489.520 y muchas otras]. A efectos de la presente, cuando se introduce un SATAC, se prefieren la microinyección, fusión de protoplastos y bombardeo del cañón de partículas.

Las especies de plantas, incluyendo tabaco, arroz, maíz, centeno, soja, Brassica napus, algodón, lechuga, papa y tomate, han sido utilizadas para producir plantas transgénicas. El tabaco y otras especies, tales como petunias, a menudo sirven como modelos experimentales en los cuales se han desarrollado los métodos y los genes se han introducido y expresado primero.

La captación de ADN puede lograrse mediante ADN solo o en presencia de PEG, que es un agente de fusión, con protoplastos de planta o mediante cualquier variación de dichos métodos conocidos por los expertos en la técnica [ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 4.684.611 de Schilperoot et al.] . La electroporación que implica pulsos eléctricos de alto voltaje a una solución que contiene una mezcla de protoplastos y ADN ajeno para crear poros reversibles se ha utilizado, por ejemplo, para introducir de manera exitosa genes ajenos en arroz y Brassica napus. También se han utilizado la microinyección de ADN en células de planta, incluyendo células cultivadas y células en órganos de plantas intactos y embroides en cultivo de tejido y bombardeo de microproyectiles [aceleración de partículas pequeñas de alta densidad, que contienen el ADN, a alta velocidad con un aparato de cañón de partículas, que obliga a las partículas a penetrar paredes y membranas celulares de planta]. Todas las células de plantas en las cuales el ADN puede introducirse y que puede regenerarse de las células transformadas pueden utilizarse para producir plantas completas transformadas que contienen el cromosoma artificial transferido. El protocolo y medios particulares para la introducción del ADN en el huésped de la planta puede necesitar adaptarse o refinarse para adaptar las especies de plantas o variedades particulares.

c. Células de insectos

Los insectos son huéspedes útiles para la introducción de cromosomas artificiales por numerosas razones, incluyendo, a modo no taxativo: (a) la amplificación de genes que codifican proteínas útiles puede lograrse en el cromosoma artificial para obtener rendimientos de proteína más altos en células de insectos; (b) las células de insectos confirman las modificaciones post-translacionales requeridas, tales como la glicosilación y fosforilación, que puede requerirse para el funcionamiento biológico de las proteínas; (c) las células de insectos no soportan los virus de mamíferos, y, por lo tanto, eliminan el problema de contaminación cruzada de productos con dichos agentes infecciosos; (d) esta tecnología evita los sistemas de baculovirus recombinante tradicionales para la producción de proteínas nutricionales, industriales o medicinales en sistemas de células de insectos; (e) la temperatura baja óptima para el crecimiento de células de insecto (28°C) permite un costo de producción de energía reducida; (f) el medio de crecimiento libre de suero para células de insectos permite costos de producción más bajos; (g) las células que contienen cromosomas artificiales pueden almacenarse indefinidamente a una temperatura baja; y (h) las larvas de insectos serán fábricas biológicas para la producción de proteínas nutricionales, medicinales o industriales mediante

microinyección de huevos de insecto fertilizados [ver, por ejemplo, Joy et al. (1991) Current Science 66:145-150, que proporciona un método para microinyectar ADN heterólogo en huevos de Bombyx mori].

Los SATAC se utilizarán para introducir genes en insectos. Tal como se describe en los Ejemplos, parece que los MAC funcionarán en insectos para dirigir la expresión de ADN heterólogo contenido en los mismos. Por ejemplo, tal como se describe en los Ejemplos, un MAC que contiene el promotor del gen actina de B. mori fusionado al gen lacZ se ha generado mediante transfección de células EC3/7C5 con un plásmido que contiene el gen de fusión. La fusión posterior de las células B. mori con las células EC3/7C5 transfectadas que sobrevivieron a la selección proporcionaron una línea celular híbrida insecto-ratón que contiene MAC en la cual la expresión de β-galactosidasa era detectable.

Las células huésped de insectos incluyen, a modo no taxativo, huéspedes tales como Spodoptera frugiperda [oruga], Aedes aegypti [mosquito], Aedes albopictus [mosquito], Drosphila melanogaster [mosca de la fruta], Bombyx mori [gusano de seda], Manduca sexta [gusano de cuerno del tomate] y Trichoplusia ni [oruga del repollo]. Los esfuerzos se han dirigido hacia la propagación de células de insecto en cultivo. Dichos esfuerzos se han enfocado en el gusano cogollero de otoño, Spodoptera frugiperda. Las líneas celulares se han desarrollado también de otros insectos tales como la oruga del repollo, Trichoplusia ni y el gusano de seda, Bombyx mori. También se ha sugerido que las líneas celulares análogas pueden crearse utilizando el gusano de cuerno del tomate, Manduca sexta. Para introducir ADN en un insecto, debe introducirse en la larva y permitir que prolifere y luego se recupera la hemolinfa de la larva de modo que las proteínas pueden aislarse de la misma.

El método preferido en la presente para la introducción de cromosomas artificiales en células de insectos es la microinyección [ver, por ejemplo, Tamura et al. (1991) Bio Ind. 8:26-31; Nikolaev et al. (1989) Mol. Biol. (Moscú) 23:1177-87 y métodos ejemplificados y descritos en la presente].

E. Aplicaciones para cromosomas artificiales y usos de los mismos

Los cromosomas artificiales proporcionan vectores convenientes y útiles y en algunas instancias [por ejemplo, en el caso de genes heterólogos muy grandes] los únicos vectores, para la introducción de genes heterólogos en huéspedes. Virtualmente cualquier gen de interés es abordable para la introducción en un huésped a través de cromosomas artificiales. Dichos genes incluyen, a modo no taxativo, genes que codifican receptores, citoquinas, enzimas, proteasas, hormonas, factores de crecimiento, anticuerpos, genes supresores de tumores, productos terapéuticos y vías de multigenes.

Los SATAC proporcionados en la presente se utilizarán en métodos de proteína y producción de productos génicos, particularmente utilizando insectos como células huésped para la producción de dichos productos y en los sistemas de producción celular (por ejemplo, células de mamíferos) en los cuales los cromosomas artificiales proporcionan medios confiables, estables y eficientes para optimizar la biofabricación de compuestos importantes para la medicina e industria. También se pretenden para el uso en métodos de terapia génica y para la producción de plantas y animales transgénicos [descritos anteriormente, más adelante y en los ejemplos].

1. Terapia génica

Cualquier ácido nucleico que codifica un producto génico terapéutico o producto de una vía de multigenes puede introducirse en un animal huésped, tal como un humano o en una línea celular objetivo para la introducción en un animal, a efectos terapéuticos. Dichos fines terapéuticos incluyen, terapia génica para curar o proporcionar productos génicos faltantes o defectuosos, para administrar agentes, tales como agentes anti-tumor, a células dirigidas o a un animal, y para proporcionar productos génicos que conferirán resistencia o reducirán la susceptibilidad a un patógeno o aliviarán los síntomas de una enfermedad o trastorno. Los siguientes son algunos genes y productos génicos ejemplares. Dicha ejemplificación no pretende ser limitante.

a. Ribozimas anti-VIH

Como se ejemplifica a continuación, el ADN que codifica ribozimas anti-VIH puede introducirse y expresarse en células utilizando MAC, incluyendo los minicromosomas en base a eucromatina y los SATAC. Estos MAC pueden utilizarse para obtener un ratón transgénico que expresa una ribozima y, por lo tanto, sirve como un modelo para evaluar la actividad de dichas ribozimas o de la cual pueden obtenerse líneas celulares que producen ribozimas. Asimismo, la introducción de un MAC que codifica una ribozima anti-VIH en células humanas servirá como tratamiento para la infección por VIH. Dichos sistemas demuestran además la viabilidad de utilizar cualquier ribozima específica de una enfermedad para tratar o aliviar una enfermedad particular.

b. Genes supresores de tumores

Los genes supresores de tumores son genes que, en sus alelos de tipo salvaje, expresan proteínas que suprimen la proliferación celular anormal. Cuando el gen que codifica una proteína supresora de tumores muta o se elimina, la proteína mutante resultante o la falta completa de expresión de una proteína supresora de tumores puede resultar en una falla para regular correctamente la proliferación celular. Consecuentemente, la proliferación celular anormal puede ocurrir, particularmente si ya existe un daño para el mecanismo regulador celular. Un número de tumores

humanos bien estudiados y líneas celulares de tumores han demostrado que tienen genes supresores de tumores faltantes o no funcionales.

Ejemplos de genes de supresión de tumores incluyen, a modo no taxativo, el gen de susceptibilidad de retinoblastoma o gen RB, el gen p53, el gen que se elimina en el carcinoma de colon [es decir, el gen DCC] y el gen supresor de tumores tipo 1 de neurofibromatosis [NF-1] [ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 5.496.731; Weinberg et al. (1991) 254:1138-1146]. La pérdida de función o inactivación de genes supresores de tumores puede jugar un papel central en la iniciación y/o avance de un número importante de cánceres humanos.

El gen p53

Se dice que las mutaciones de células somáticas del gen p53 son las más frecuentes de las mutaciones de genes asociadas con cáncer humano [ver, por ejemplo, Weinberg et al. (1991) Science 254:1138-1146]. El gen p53 normal

o tipo salvaje es un regulador negativo del crecimiento celular, que, cuando se daña, favorece la transformación celular. El producto de expresión de p53 se encuentra en el núcleo, donde puede actuar en paralelo o de manera cooperativa con otros productos génicos. Las líneas celulares de tumores en las cuales se ha eliminado el p53 han sido tratadas exitosamente con el vector p53 tipo salvaje para reducir la tumorigenicidad [ver, Baker et al. (1990) Science 249:912-915].

El ADN que codifica el gen p53 y los plásmidos que contienen este ADN también son conocidos [ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 5.260.191; ver, también, Chen et al. (1990) Science 250:1576; Farrel et al. (1991) EMBO J. 10:2879-2887; los plásmidos que contienen el gen están disponibles en la ATCC y la secuencia se encuentra en la base de datos de GenBank, nos. de acceso X54156, X60020, M14695, M16494, K03199].

c. El gen CFTR

La fibrosis quística [CF] es una enfermedad recesiva autosómica que afecta el epitelio de las vías respiratorias, glándulas sudoríparas, páncreas y otros órganos. Es una enfermedad genética letal asociada con un defecto en el transporte iónico de cloruro y es causada por mutaciones en el gen que codifica el regulador de la conductancia de la fibrosis quística [CFTR], una proteína de aminoácidos 1480 que ha estado asociada con la expresión de conductancia de cloruro en una variedad de tipos de células eucariotas. Los defectos en CFTR destruyen o reducen la capacidad de células epiteliales en las vías respiratorias, glándulas sudoríparas, páncreas y otros tejidos para transportar iones de cloruro en respuesta a agonistas mediados por cAMP y afectar la activación de canales de membranas apicales mediante quinasa A de proteína dependiente de cAMP [PKA]. Dada la alta incidencia y naturaleza devastadora de esta enfermedad, el desarrollo de tratamientos de la CF efectivos es imperativo.

El gen CFTR [~250 kb] puede transferirse en un SATAC para su uso, por ejemplo, en la terapia génica que se describe a continuación. Un CF-YAC [ver, Green et al. Science 250:94-98] puede modificarse para incluir un marcador seleccionable, tal como un gen que codifica una proteína que confiere resistencia a la puromicina o higromicina y ADN de λ para su uso en la integración específica de sitio en un SATAC. Dicho CF-YAC modificado puede introducirse en células que contienen MAC, tales como células EC3/7C5 o 19C5xHa4 mediante la fusión con protoplastos de levadura que alojan el CF-YAC modificado o microinyección de núcleos de levadura que alojan el CF-YAC modificado en las células. Los transformadores estables se seleccionan entonces en base a la resistencia antibiótica. Estos transformadores portan el CF-YAC modificado dentro del MAC contenido en las células.

2. Animales, aves, peces y plantas que son genéticamente alterados para poseer rasgos deseados tales como resistencia a una enfermedad

Los SATAC son idealmente adecuados para preparar animales, incluyendo vertebrados e invertebrados, incluyendo aves y peces así como mamíferos, que poseen ciertos rasgos deseados, tales como, por ejemplo, resistencia a enfermedades, resistencia a condiciones ambientales rigurosas, patrones de crecimiento alterados y características físicas mejoradas.

Un ejemplo del uso de cromosomas artificiales para generar organismos resistentes a enfermedades implica la preparación de vacunas multivalentes. Dichas vacunas incluyen genes que codifican antígenos múltiples que pueden ser portados en un SATAC y administrados a un huésped para inducir inmunidad o incorporados en embriones para producir animales no humanos y plantas transgénicos que son inmunes o menos susceptibles a ciertas enfermedades.

También pueden prepararse animales y plantas resistentes a enfermedades en los cuales la resistencia o susceptibilidad disminuida para enfermedades se confiere mediante la introducción en el organismo o embrión huésped de cromosomas artificiales que contienen ADN que codifica productos génicos (por ejemplo, ribozimas y proteínas que son tóxicos para ciertos patógenos) que destruyen o atenúan patógenos o limitan el acceso de patógenos al huésped.

Los animales y plantas que poseen rasgos deseados que, por ejemplo, pueden mejorar la utilidad, procesabilidad y valor comercial de los organismos en áreas tales como las industrias de plantas agrícolas y ornamentales también pueden generarse utilizando cromosomas artificiales del mismo modo según se describió anteriormente para la

producción de animales y plantas resistentes a enfermedades. En dichas instancias, los cromosomas artificiales que se introducen en el organismo o embrión contienen ADN que codifica productos génicos que sirven para conferir el rasgo deseado en el organismo.

Las aves, particularmente aves de corral, tales como pollos, peces y crustáceos servirán como huéspedes modelo para la producción de organismos genéticamente alterados utilizando cromosomas artificiales.

3.

Uso de MAC y otros cromosomas artificiales para la preparación y ensayo de detección de bibliotecas

Ya que pueden incorporarse fragmentos grandes de ADN en cada cromosoma artificial, los cromosomas son bien adecuados para su uso como vehículos de clonación que pueden albergar genomas enteros en la preparación de bibliotecas de ADN genómico, que pueden someterse a prueba fácilmente. Por ejemplo, los SATAC pueden utilizarse para preparar una biblioteca de ADN genómico útil en la identificación y aislamiento de ADN centromérico funcional de diferentes especies de organismos. En dichas aplicaciones, el MAC utilizado para preparar una biblioteca de ADN genómico de un organismo particular es uno que no es funcional en células de ese organismo. Es decir, el MAC no se replica, segrega o proporciona de manera estable para la expresión de genes contenidos en el en células del organismo. Preferiblemente, los MAC contienen un gen indicador (por ejemplo, el gen lacZ que codifica β-galactosidasa o genes que codifican productos que confieren resistencia a antibióticos tales como neomicina, puromicina, higromicina) unido a un promotor que es capaz de promover la transcripción del gen indicador en células del organismo. Se incorporan fragmentos del ADN genómico del organismo en los MAC, y los MAC se transfieren a células del organismo. Las células que contienen MAC que tienen incorporados centrómeros funcionales contenidos dentro de los fragmentos de ADN genómico se identifican mediante la detección de expresión del gen marcador.

4.

Uso de MAC y otros cromosomas artificiales para la producción de proteínas estables de alto nivel

Las células que contienen los SATAC proporcionados en la presente se utilizan de manera ventajosa para la producción de proteínas, particularmente varias proteínas de una línea celular, tal como múltiples proteínas que participan en una vía bioquímica o vacunas multivalentes. El gen que codifica las proteínas se introduce en los cromosomas artificiales que se introducen entonces en células. Alternativamente, el o los genes heterólogos de interés se transfieren a una línea celular de producción que ya contiene cromosomas artificiales de modo que dirige el gen o los genes a los cromosomas artificiales. Las células se cultivan en condiciones por las cuales se expresan las proteínas heterólogas. Debido a que las proteínas se expresarán a niveles altos en un sistema cromosómico extra-genómico permanente estable, no se requieren condiciones selectivas.

Cualquier célula que puede transfectarse capaz de servir como huésped recombinante adaptable a la propagación continua en un sistema de cultivo de células [ver, por ejemplo, McLean (1993) Trends In Biotech. 11:232-238] es adecuada para su uso en un sistema de producción de proteína en base a un cromosoma artificial. Líneas celulares huésped ejemplares incluyen, a modo no taxativo, los siguientes: Células de ovario de hámster chino (CHO) [ver, por ejemplo, Zang et al. (1995) Biotechnology 13:389-392], células HEK 293, Ltk-, COS-7, DG44 y BHK. Las células CHO son células huésped particularmente preferidas. La selección de líneas celulares huésped para su uso en sistemas de producción de proteínas en base a cromosomas artificiales se encuentra dentro de las habilidades del experto en la técnica, pero a menudo dependerá de una variedad de factores, incluyendo las propiedades de la proteína heteróloga a producir, toxicidad potencial de la proteína en las células huésped, cualquier requisito para la modificación post-translacional (por ejemplo, glicosilación, aminación, fosforilación) de la proteína, factores de transcripción disponibles en las células, el tipo de elemento promotor siendo utilizado para dirigir la expresión del gen heterólogo, ya sea si la producción será completamente intracelular o la proteína heteróloga se secretará preferiblemente de la célula y los tipos de enzimas de procesamiento en la célula.

El sistema en base a cromosomas artificiales para la producción de proteínas heterólogas tiene muchas características ventajosas. Por ejemplo, según se describió anteriormente, debido a que el ADN heterólogo se ubica en un cromosoma artificial extra-genómico independiente (en oposición a insertado de manera aleatoria en un área desconocida del genoma celular huésped o ubicado como elemento o elementos extracromosómicos que proporcionan sólo expresión transitoria) se mantiene establemente en una unidad de transcripción activa y no está sujeto a la eyección a través de la recombinación o eliminación durante la división celular. Por consiguiente, no es necesario incluir un gen de selección en las células huésped y por lo tanto el crecimiento en condiciones selectivas también es innecesario. Más aun, debido a que los cromosomas artificiales son capaces de incorporar grandes segmentos de ADN, múltiples copias del gen heterólogo y elementos promotores unidos pueden mantenerse en los cromosomas, proporcionando así una expresión de alto nivel de la o las proteínas ajenas. Alternativamente, múltiples copias del gen pueden unirse a un único elemento promotor y varios genes diferentes pueden unirse en un complejo de poligén fusionado a un único promotor para la expresión de, por ejemplo, todas las proteínas clave que constituyen una vía metabólica completa [ver, por ejemplo, Beck von Bodman et al. (1995) Biotechnology 13:587591]. Alternativamente, múltiples copias de un único gen pueden unirse operativamente a un único promotor o una o varias copias pueden unirse a diferentes promotores o múltiples copias del mismo promotor. Adicionalmente, debido a que los cromosomas artificiales tienen una capacidad casi ilimitada para la integración y expresión de genes ajenos, pueden utilizarse no sólo para la expresión de genes que codifican productos finales de interés, sino también para la expresión de genes asociados con el mantenimiento óptimo y gestión de la célula huésped, por ejemplo,

genes que codifican los factores de crecimiento, así como los genes que facilitan la síntesis rápida de forma correcta del producto de proteína heterólogo deseado, por ejemplo, genes que codifican enzimas de procedimiento y factores de transcripción. Los SATAC son adecuados para la expresión de cualquier proteína o péptido, incluyendo proteínas y péptidos que requieren una modificación post-translacional in vivo para su actividad biológica. Dichas proteínas incluyen, a modo taxativo, fragmentos de anticuerpo, anticuerpos de longitud completa y anticuerpos multiméricos, proteínas supresoras de tumores, anticuerpos y enzimas naturales o artificiales, proteínas de choque de calor y otros.

Por lo tanto, dichas "fábricas de proteínas" en base a células que emplean SATAC pueden generarse utilizando SATAC construidos con múltiples copias [teóricamente un número ilimitado o al menos hasta un número tal que el SATAC resultante es de aproximadamente hasta el tamaño de un cromosoma genómico] de genes que codifican proteínas con promotores apropiados o múltiples genes producidos por un único promotor, es decir, un complejo de genes fusionado [tal como una vía metabólica completa en un sistema de expresión de plantas; ver, por ejemplo Beck von Bodman (1995) Biotechnology 13:587-591]. Una vez que se construye un SATAC, puede transferirse a un sistema de cultivo de células adecuado, tal como una línea celular de CHO en un medio de cultivo libre de proteínas [ver, por ejemplo, (1995) Biotechnology 13:389-39] u otras líneas celulares inmortalizadas [ver, por ejemplo, (1993) TIBTECH 11:232-238] donde puede establecerse una producción continua.

Se demuestra la capacidad de los SATAC de proporcionar una expresión de alto nivel de proteínas heterólogas en células huésped, por ejemplo, mediante análisis de las líneas celulares H1D3 y G3D5 descritas en la presente y depositadas en la ECACC. El análisis de Northern blot del ARNm obtenido de estas células revela que la expresión de los genes de resistencia a la higromicina y β-galactosidasa en las células se correlaciona con el número de amplicones del megacromosoma contenido en la misma.

F. Métodos para la síntesis de secuencias de ADN que contienen unidades de ADN repetidas

Generalmente, el ensamblaje de ADN repetido en tándem presenta dificultades tales como el apareamiento de los oligos complementarios. Por ejemplo, los productos separadamente apareados pueden ligarse en una orientación invertida. Adicionalmente, las repeticiones invertidas o en tándem son particularmente susceptibles a eventos de recombinación y eliminación que pueden interrumpir la secuencia. La selección de organismos huésped apropiados (por ejemplo, cepas rec-) para su uso en las etapas de clonación de la síntesis de secuencias de unidades de ADN repetidas en tándem puede ayudar en la reducción y eliminación de dichos eventos.

En la presente se describen métodos para la síntesis de secuencias de ADN extendidas que contienen unidades de ADN repetidas. Estos métodos son particularmente aplicables a la síntesis de arreglos de unidades de ADN repetidas en tándem, que son generalmente difíciles o no son posibles de construir utilizando otras estrategias de ensamblaje de genes conocidas. Un uso específico de estos métodos se encuentra en la síntesis de secuencias de cualquier longitud que contiene repeticiones en tándem simples (por ejemplo, en el rango de 2-6 nucleótidos) (tales como telómeros y repeticiones de ADN satélite y repeticiones de trinucleótido de importancia clínica posible) así como secuencias de ADN repetidas complejas. En la presente se proporciona un ejemplo particular de la síntesis de una secuencia de telómero que contiene más de 150 hexámeros repetidos sucesivos utilizando estos métodos.

Los métodos proporcionados en la presente para la síntesis de arreglos de repeticiones de ADN en tándem se basan en una serie de etapas de extensión en las cuales las duplicaciones sucesivas de una secuencia de repeticiones resultan en una expansión exponencial del arreglo de repeticiones en tándem. Estos métodos proporcionan varias ventajas sobre los métodos previamente conocidos de ensamblaje de genes. Por ejemplo, los oligonucleótidos de partida se utilizan sólo una vez. Los intermediarios en, así como el producto final de, la construcción de los arreglos de ADN descritos en la presente pueden obtenerse en forma clonada en un organismo microbiano (por ejemplo, E. coli y levadura). De particular importancia, con respecto a estos métodos es el hecho de que la longitud de la secuencia aumenta exponencialmente, en oposición a linealmente, en cada etapa de extensión del procedimiento aunque sólo se requieren dos oligonucleótidos en los métodos. El proceso de construcción no depende de la compatibilidad de las secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción y la secuencia del ADN repetida debido a que los sitios de restricción se utilizan sólo temporalmente durante el procedimiento de ensamblaje. No se necesita adaptador, aunque una región de función similar se ubica entre dos de los sitios de restricción empleados en el proceso. La única limitación con respecto al uso del sitio de restricción es que los dos sitios empleados en el método no deben estar presentes en otras partes en el vector utilizado en cualquier etapa de clonación. Estos procedimientos también pueden utilizarse para construir repeticiones complejas con unidades de repetición perfectamente idénticas, tales como la repetición en tándem de número variable (VNTR) 3' del gen B100 de apoliproteína humana (una unidad de repetición de 30 pb, 100% AT) o ADN satélite alfoide.

El método para sintetizar secuencias de ADN que contiene repeticiones en tándem generalmente puede describirse de la siguiente manera.

1. Materiales de partida

Se utilizan dos oligonucleótidos como materiales de partida. El oligonucleótido 1 tiene una longitud k de secuencia repetida (cuyos flancos no son relevantes) y contiene un tramo relativamente corto (60-90 nucleótidos) de la secuencia repetida, flanqueado con sitios de restricción elegidos apropiadamente:

5'-S1 > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > S2_-3' en donde S1 es el sitio de restricción 1 escindido por E1 [preferiblemente una enzima que produce una saliente 3' (por ejemplo, Pacl, Pstl, Sphl, Nsil, etc.) o extremo romo], S2 es un segundo sitio de restricción escindido por E2 (preferiblemente una enzima que produce una saliente 3' o una que escinde fuera de la secuencia de reconocimiento, tal como TspRI), > representa una simple unidad de repetición y '_' denota una secuencia de flanqueo de nucleótidos corta (8-10) complementaria al nucleótido 2:

3'-_S3-5'

en donde S3 es un tercer sitio de restricción para la enzima E3 y que está presente en el vector a utilizar durante la construcción.

Debido a que existe una gran variedad de enzimas de restricción que reconoce muchas secuencias de ADN diferentes como sitios de escisión, siempre debería ser posible seleccionar sitios y enzimas (preferiblemente aquellas que proporcionan un extremo saliente 3') adecuados para estos métodos en conexión con la síntesis de cualquier arreglo de repetición particular. En la mayoría de los casos, se requiere la presencia de sólo 1 (o quizás 2) nucleótido de un sitio de restricción en la secuencia de repetición, y los nucleótidos restantes del sitio de restricción pueden eliminarse, por ejemplo:

PacI: TTAAT/TAA-- (Klenow/dNTP) TAA--

PstI: CTGCA/G-- (Klenow/dNTP) G--

NsiI: ATGCA/T-- (Klenow/dNTP) T--

KpnI: GGTAC/C-- (Klenow/dNTP) C--

Aunque no hay una enzima de restricción conocida que deje atrás una sola A, este problema puede resolverse con enzimas que no dejan atrás ninguna, por ejemplo:

TaiI: ACGT/ (Klenow/dNTP) --

NlaIII: CATG/ (Klenow/dNTP) --

Adicionalmente, si se utiliza la nucleasa de frijol mungo en lugar de Klenow, entonces el siguiente XbaI: nucleasa A de frijol mungo T/CTAGA --

Además, existe un número de enzimas de restricción que se cortan fuera de la secuencia de reconocimiento y en este caso, no hay limitación en absoluto:

TspRI NNCAGTGNN/--(Klenow/dNTP) --BsmI GAATG CN/-- · (Klenow/dNTP) --CTTAC/GN --(Klenow/dNTP) -

2.

Etapa 1 - Apareamiento

Los oligonucleótidos 1 y 2 se aparean a una temperatura seleccionada dependiendo de la longitud de la superposición (típicamente en el rango de 30-65°C).

3.

Etapa 2 - Generar una molécula de doble hebra

Los nucleótidos apareados están rellenos con polimerasa Klenow en presencia de dNTP para producir una secuencia de doble hebra (dh):

5'-S1>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>S2_S3-3'

3'-S1<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<S2_S3-5'

4. Etapa 3 - Incorporación de ADN de doble hebra en un vector

El ADN de doble hebra se escinde con enzimas de restricción E1 y E3 y posteriormente se ligan en un vector (por ejemplo, pUC19 o un vector de levadura) que se ha escindido con las mismas enzimas E1 y E3. El producto de la ligadura se utiliza para transformar las células huésped competentes con el vector que se está utilizando (por ejemplo cuando se utiliza pUC19, las células bacterianas tales como E. coli DH5α son huéspedes adecuados) que se colocan entonces en placas de selección. Los recombinantes pueden identificarse ya sea mediante color (por ejemplo, mediante tinción con X-gal para la expresión de β-galactosidasa) o mediante hibridación de colonias utilizando el oligonucleótido 2 etiquetado 32P (se prefiere la detección mediante hibridación para el oligonucleótido 2

debido a que su secuencia se elimina en cada etapa de extensión posterior y por lo tanto está presente sólo en recombinantes que contienen ADN que se ha sometido a la extensión exitosa de la secuencia repetida).

5.

Etapa 4 -Aislamiento de insertos del plásmido

Una alícuota del plásmido recombinante que contiene nucleótidos k de la secuencia de repetición se digiere con enzimas de restricción E1 y E3 y el inserto se aísla en un gel (poliacrilamida nativa mientras el inserto es corto, pero puede utilizarse agarosa para el aislamiento de insertos más largos en etapas posteriores). Una segunda alícuota del plásmido recombinante se corta con enzimas E2 (tratadas con Klenow y dNTP para eliminar la saliente 3') y E3, y el fragmento grande (ADN plásmido más el inserto) se aísla.

6.

Etapa 5 - Extensión de la secuencia de ADN de repeticiones k

Los dos ADN (el fragmento de inserto S1-S3 y el vector más el inserto) se ligan, se colocan en placas selectivas y se someten a prueba para la detección de recombinantes extendidos como en la Etapa 3. Ahora la longitud de la secuencia de repetición entre los sitios de restricción es dos veces la secuencia de repetición en la etapa previa, es decir, 2xk.

7.

Etapa 6 - Extensión de la secuencia de ADN de repeticiones 2xk

Las Etapas 4 y 5 se repiten las veces que sea necesario para alcanzar el tamaño de secuencia de repetición deseado. En cada ciclo de extensión, el tamaño de la secuencia de repetición se duplica, es decir, si m es el número de ciclos de extensión, el tamaño de la secuencia de repetición será de k x 2m nucleótidos.

Los siguientes ejemplos se incluyen con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención. En particular, los Ejemplos 2 y 3 no forman parte de la presente invención.

Materiales y métodos generales

Los siguientes materiales y métodos son ejemplares de métodos que se utilizan en los siguientes Ejemplos y que pueden utilizarse para preparar líneas celulares que contienen cromosomas artificiales. Pueden utilizarse otros materiales y métodos adecuados conocidos por los expertos en la técnica. También pueden emplearse modificaciones de estos materiales y métodos conocidos por los expertos en la técnica.

A. Cultivo de líneas celulares, fusión celular y transfección de células

1.

Células de hámster chino K-20 y células de fibroblastos A9 de ratón se cultivaron en un medio F-12. Las líneas celulares de ratón EC3/7 [ver, Patente de los Estados Unidos No. 5.288,625 y depositado en la Colección Europea de Cultivo de células de Animales (ECACC) con el no. de acceso 90051001; ver, también Hadlaczky et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:8106-8110 y solicitud de los Estados Unidos No. de serie 08/375.271] y EC3/7C5 [ver, Patente de los Estados Unidos No. 5.288.625 y Praznovszky et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:11042-11046] y la línea celular híbrida KE1-2/4 se mantuvieron en un medio F-12 que contiene 400 μg/ml de G418 [SIGMA, St. Louis, MO].

2.

Las células de ratón TF1004G19 y TF1004G-19C5, descritas más adelante y el híbrido 19C5xHa4, descrito más adelante y sus sublíneas se cultivaron en un medio F-12 que contenían hasta 400μg/ml de Higromicina B [Calbiochem]. Las células LP11 se mantuvieron en un medio F-12 que contenía 3-15 μg/ml de Puromicina [SIGMA, St. Louis, MO].

3.

La cotransfección de células EC3/7C5 con plásmidos [pH 132, pCH110 disponibles de Pharmacia, ver, también Hall et al. (1983) J. Mol. Appl. Gen. 2:101-109] y con ADN de λ se llevó a cabo utilizando el método de precipitación de ADN de fosfato de calcio [ver, por ejemplo, Chen et al. (1987) Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752], utilizando 2-5 μg de ADN plásmido y 20 μg de ADN de bacteriófago λ por célula receptora 5 × 106.

4.

Fusión celular

Las células de ratón y hámster se fusionaron utilizando polietilenglicol [Davidson et al. (1976) Som. Cell Genet. 2:165-176]. Las células híbridas se seleccionaron en un medio HAT que contenía 400 μg/ml de Higromicina B.

Aproximadamente se fusionaron 2×107 de células receptoras y 2×106 donantes utilizando polietilenglicol [Davidson et al. (1976) Som. Cell Genet. 2:165-176]. Se seleccionaron y mantuvieron híbridos en un medio F-12/HAT [Szybalsky et al. (1962) Natl. Cancer Inst. Monogr. 7:75-89] que contenía 10% de FCS y 400 μg/ml de G418. La presencia de cromosomas "parentales" en las líneas celulares híbridas se verificó mediante hibridación in situ con sondas específicas para la especie utilizando ADN humano etiquetado con biotina y genómico de hámster y un ADN repetitivo intercalado largo de ratón [pMCPE1.51].

5. Fusión microcelular

La transferencia mediada por microcélulas de cromosomas artificiales de células EC3/7C5 para células receptoras se realizó de acuerdo con Saxon et al. [(1985) Mol. Cell. Biol. 1:140-146] con las modificaciones de Goodfellow et al. [(1989) Techniques for mammalian genome transfer. In Genome Analysis a Practical Approach. K.E. Davies, ed., IRL Press, Oxford, Washington DC. páginas 1-17] y Yamada et al. [(1990) Oncogene 5:1141-1147]. A modo de resumen, 5 × 106 células EC3/7C5 en un matraz T25 se trataron primero con 0,05 μg/ml de colcemida durante 48 hr y luego con 10 μg/ml de citocalasina B durante 30 min. Los matraces T25 se centrifugaron en borde y las microcélulas granuladas se suspendieron en un medio DME libre de suero. Las microcélulas se filtraron primero a través de un filtro de policarbonato de 5 micrones y luego a través de uno de 3 micrones, tratado con 50 μg/ml de fitohemaglutinina y se utilizaron para una fusión mediada por polietilenglicol con células receptoras. La selección de células que contenían el MMCneo comenzó 48 horas después de la fusión en un medio que contenía 400-800 μg/ml de G418.

También se prepararon microcélulas de células donantes 1B3 y GHB42 de la siguiente forma con el fin de fusionarse con células E2D6K [una línea celular CHO K-20 que porta el gen puromicina N-acetiltransferasa, es decir, el gen de resistencia a la puromicina, bajo el control del promotor temprano SV40]. Las células donantes se sembraron para alcanzar 60-75% de confluencia dentro de 24-36 horas. Después de ese tiempo, las células se interrumpieron en mitosis mediante la exposición a colchicina (10 μg/ml) durante 12 o 24 horas para inducir la micronucleación. Para promover la micronucleación de células GHB42, las células se expusieron a un tratamiento hipotónico (10 min a 37°C). Después del tratamiento con colchicina o después del tratamiento hipotónico y con colchicina, las células se cultivaron en un medio libre de colchicina.

Las células donantes se tripsinizaron y centrifugaron y las grageas se suspendieron en un medio 1:1 Percoll e incubaron durante 30-40 min a 37°C. Después de la incubación, 1-3 x 107 de células (60-70% de índice de micronucleación) se cargaron en cada gradiente Percoll (cada fusión se distribuyó en 1-2 gradientes). Los gradientes se centrifugaron a 19.000 rpm durante 80 min en un rotor Sorvall SS-34 a 34-37°C. Después de la centrifugación, dos bandas de células visibles se retiraron, centrifugaron a 2000 rpm, 10 min a 4°C, resuspendieron y filtraron a través de filtros de nucleoporos con un tamaño de poro de 8 μm.

Las microcélulas se prepararon a partir de las células 1B3 y las GHB42 se fusionaron con E2D6K. Las células E2D6K se generaron mediante transfección por CaPO4 de células CHO K-20 con pCHTV2. El plásmido pCHTV2 contiene el gen de resistencia a la puromicina unido al promotor de SV40 y señal de poliadenilación, el gen de Saccharomyces cerevisiae URA3, fragmentos de 2,4 y 3,2 kb de un ADN satélite específico de cromosoma 2 de hámster chino (satélite HC-2; ver Fatyol et al. (1994) Nuc. Acids Res. 22:3728-3736), dos copias del gen de cadena de la toxina-A de difteria (una unida al promotor del gen timidina quinasa del virus del herpes simple (HSV-TK) y señal de poliadenilación de SV40 y el otro unido al promotor HSV-TK sin una señal de poliadenilación), el gen de resistencia a la ampicilina y origen de replicación ColE1. Después de la transfección se aislaron colonias resistentes a la puromicina. La presencia del plásmido pCHTV2 en la línea celular E2D6K se confirmó mediante la amplificación de ácido nucleico de ADN aislado de las células.

Las microcélulas purificadas se centrifugaron como se describió anteriormente y resuspendieron en 2 ml de fitohemaglutinina-P (PHA-P, 100μg/ml). La suspensión microcelular se agregó entonces a un cultivo receptor 6070% confluente de células E2D6K. La preparación se incubó a temperatura ambiente durante 30-40 min para aglutinar las microcélulas. Después de que el PHA-P se retiró, las células se incubaron con 1 ml de 50% polietilenglicol (PEG) durante un min. El PEG se retiró y el cultivo se lavó tres veces con un medio F-12 sin suero. Las células se incubaron en un medio no selectivo durante 48-60 horas. Después de este tiempo, el cultivo de células se tripsinizó y colocó en un medio F-12 que contenía 400μg/ml de higromicina B y 10 g/ml de puromicina para seleccionar con respecto a las líneas celulares parentales.

Los clones híbridos se aislaron de las células que se habían cultivado en un medio selectivo. Estos clones se analizaron entonces para la expresión de β-galactosidasa mediante el método de tinción con X-gal. Cuatro de los cinco clones híbridos analizados que se habían generado mediante la fusión de microcélulas GHB42 con células E2D6K proporcionaron resultados de tinción positivos indicando la expresión de β-galactosidasa del gen lacZ contenido en el megacromosoma contribuido por las células GHB42. De manera similar, un clon híbrido que se había generado mediante la fusión de microcélulas 1B3 con células E2D6K proporcionaron resultados de tinción positivos indicando la expresión de β-galactosidasa del gen lacZ contenido en el megacromosoma contribuido por las células 1B3. El análisis de hibridación in situ de los clones híbridos también se lleva a cabo para analizar el contenido de cromosomas de ratón de las células híbridas de ratón-hámster.

B. Bandeo cromosómico

El bandeo cromosómico G con tripsina de cromosomas se realizó utilizando el método de Wang y Fedoroff [(1972) Nature 235:52-54] y la detección de heterocromatina constitutiva con el BSG. El método de bandeo cromosómico C se realizó de acuerdo con Sumner [(1972) Exp. Cell Res. 75:304-306]. Para la detección de replicación de cromosomas mediante la incorporación de bromodesoxiuridina [BrdU], se utilizó el método de tinción con Fluoresceína más Giemsa [FPG] de Perry y Wolff [(1974) Nature 251:156-158].

C. Inmunoetiquetado de cromosomas e hibridación in situ

El etiquetado de inmunofluorescencia indirecta con suero anti-centrómero humano LU851 [Hadlaczky et al. (1986) Exp. Cell Res. 167:1-15] e inmunofluorescencia indirecta e hibridación in situ en la misma preparación se realizaron como se describió previamente [ver, Hadlaczky et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:8106-8110, ver, también solicitud de los Estados Unidos No. de serie 08/375.271]. El inmunoetiquetado con un anticuerpo monoclonal anti-BrdU conjugado con fluoresceína [Boehringer] se realizó de acuerdo con el procedimiento recomendado por el fabricante, excepto que para el tratamiento de cromosomas A9 de ratón, se utilizó ácido clorhídrico 2 M a 37°C durante 25 min, y para cromosomas de células híbridas, se utilizó ácido clorhídrico 1 M a 37°C durante 30 min.

D. Microscopía electrónica de barrido

La preparación de cromosomas mitóticos para la microscopía electrónica de barrido utilizando impregnación de osmio se realizó según se describió previamente [Sumner (1991) Chromosoma 100:410-418]. Los cromosomas se observaron con un microscopio electrónico de barrido de emisión de campo S-800 Hitachi operado con un voltaje de aceleración de 25 kV.

E. Manipulaciones de ADN, plásmidos y sondas

1. Métodos generales

Todas las manipulaciones de ADN generales se realizaron mediante procedimientos estándar [ver, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]. La sonda mayor de ratón fue proporcionada por el Dr. J. B. Rattner [Universidad de Calgary, Alberta, Canadá]. Las sondas de ADN satélite de ratón clonadas [ver Wong et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16:1164511661], incluyendo la sonda satélite mayor de ratón, fueron donadas por el Dr. J. B. Rattner, University of Calgary. El pintado cromosómico de hámster se realizó con ADN genómico de hámster total y también se utilizó una secuencia repetitiva clonada específica a la región centromérica del cromosoma 2 [Fátyol et al. (1994) Nucl. Acids Res. 22:3728-3736]. El pintado cromosómico de ratón se realizó con una secuencia repetitiva intercalada larga clonada [pMCP1.51] específica para la eucromatina de ratón.

Para la cotransfección e hibridación in situ, se utilizó el constructo de β-galactosidasa pCH110 [Pharmacia o Invitrogen] y el ADN de bacteriófago λcl 875 Sam7 [New England Biolabs].

2. Construcción del plásmido pPuroTel

El plásmido pPuroTel, que porta un gen de resistencia a la Puromicina y una secuencia telomérica humana 2,5 kb clonada [ver la SEQ ID No. 3], se construyó a partir del vector retroviral pBabe-puro [Morgenstern et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18:3587-3596; proporcionado por el Dr. L. Székely (Microbiology and Tumorbiology Center, Karolinska Institutet, Stockholm); ver, también Tonghua et al. (1995) Chin. Med. J. (Beijing, Engl. Ed.) 108:653-659; Couto et al. (1994) Infect. Immun. 62:2375-2378; Dunckley et al. (1992) FEBS Lett. 296:128-34; French et al. (1995) Anal. Biochem. 228:354-355; Liu et al. (1995) Blood 85:1095-1103; Solicitudes PCT internacionales Nos. WO 9520044; WO 9500178 y WO 9419456].

F. Líneas celulares depositadas

Las líneas celulares KE1-2/4, EC3/7C5, TF1004G19C5, 19C5xHa4, G3D5 y H1D3 se han depositado de acuerdo con el Tratado de Budapest en la Colección Europea de Cultivo de Células de Animales (ECACC) con los nos. de acceso 96040924, 96040925, 96040926, 96040927, 96040928 y 96040929, respectivamente. Las líneas celulares se depositaron el 9 de abril de 1996 en el Laboratorio de investigación y producción de vacunas de la Colección Europea de Cultivo de Células de Animales (ECACC), Servicio de Laboratorio de Salud Pública, Centro de Microbiología Aplicada e Investigación, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, Reino Unido. Los depósitos se realizaron en nombre de Gyula Hadlaczky de H. 6723, SZEGED, SZAMOS U.1.A. IX. 36. Hungría, quien ha autorizado las referencias a las líneas celulares depositadas en esta solicitud y quien ha proporcionado consentimiento irrevocable y sin reservas a las líneas celulares depositadas estando disponibles al público de acuerdo con la Norma 28(1)(d) de la Convención sobre la Patente Europea.

Ejemplo 2

Preparación de las líneas celulares EC3/7, EC3/7C5 y relacionadas

La línea celular EC3/7 es una línea celular de ratón de LMTK- que contiene el neo-centrómero. La línea celular EC3/7C5 es un subclón de una única célula de EC3/7 que contiene el neo-minicromosoma.

A. Línea celular EC3/7

Tal como se describe en la Patente de los Estados Unidos 5.288.625 [ver, también Praznovszky et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:11042-11046 y Hadlaczky et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:8106-8110] la formación de centrómeros de novo ocurre en una línea celular de fibroblastos LMTK-de ratón transformada [EC3/7] después de la cointegración de constructos λ [λCM8 y λgtWESneo] que portan ADN humano y bacteriano.

Mediante la cotransfección de un fragmento de ADN humano de 14 kb clonado en λ [λCM8] y un gen marcador dominante [λgtWESneo], un centrómero seleccionable unido a un gen marcador dominante [neo-centrómero] se formó en la línea celular LMTK- EC3/7 [Hadlaczky et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:8106-8110, ver Figura 1]. La integración del ADN heterólogo [el ADN de λ y el ADN que codifica el gen marcador] ocurrió en el brazo corto de un cromosoma acrocéntrico [cromosoma 7 (ver, Figura 1B)], donde un proceso de amplificación resultó en la formación del nuevo centrómero [neo-centrómero (Ver Figura 1C)]. En el cromosoma dicéntrico (Figura 1C), la región de centrómero recientemente formada contiene todo el ADN heterólogo (humano, λ y bacteriano) introducido en la célula y un centrómero activo.

Tener dos centrómeros funcionalmente activos en el mismo cromosoma provoca roturas regulares entre los centrómeros [ver, Figura 1E]. La distancia entre los dos centrómeros en el cromosoma dicéntrico se estima que es de ~10-15 Mb y la rotura que separa el minicromosoma ocurrió entre los dos centrómeros. Dichas roturas de cromosomas específicas resultaron en la aparición [en aproximadamente 10% de las células] de un fragmento de cromosoma que porta el neo-centrómero [Figura 1F]. Este fragmento de cromosoma está principalmente compuesto por un plásmido humano λ y un ADN de genes con resistencia a la neomicina, pero también tiene un poco de ADN cromosómico de ratón. La evidencia citológica sugiere que durante la estabilización del MMCneo, existió una duplicación invertida del fragmento de cromosoma que porta el neo-centrómero. El tamaño de los minicromosomas en las líneas celulares que contienen el MMCneo es de aproximadamente 20-30 Mb; este hallazgo indica un aumento de dos veces en tamaño.

De la línea celular EC3/7 que contiene el cromosoma dicéntrico [Figura 1E], se seleccionaron dos sublíneas [EC3/7C5 y EC3/7C6] mediante clonación de una única célula repetida. En estas líneas celulares, el neo-centrómero se encontró exclusivamente en un cromosoma pequeño [neo-minicromosoma], mientras que el cromosoma anteriormente dicéntrico portó cantidades detectables de las secuencias de ADN derivadas exógenamente pero no un neo-centrómero activo [Figura 1F y 1G].

Los minicromosomas de las líneas celulares EC3/7C5 y EC3/7C6 son similares. No se detectan diferencias en sus arquitecturas ni en el nivel citológico ni molecular. Los minicromosomas fueron indistinguibles mediante mapeo de endonucleasa de restricción convencional o mediante mapeo de largo alcance utilizando electroforesis de campo pulsado e hibridación Southern. El citoesqueleto de las células de la línea EC3/7C6 mostró una sensibilidad aumentada a la colchicina, por lo que la línea EC3/7C5 se utilizó para un análisis detallado adicional.

B. Preparación de las líneas celulares EC3/7C5 y EC3/7C6

Las células EC3/7C5 que contienen los neo-minicromosomas se produjeron mediante la subclonación de la línea celular EC3/7 en altas concentraciones de G418 [40 veces la dosis letal] para 350 generaciones. Se establecieron dos líneas celulares estables derivadas de una única célula [EC3/7C5 y EC3/7C6]. Estas líneas celulares portan el neo-centrómero en minicromosomas y también contienen el fragmento restante del cromosoma dicéntrico. La inmunofluorescencia indirecta con anticuerpos anti-centrómero y posteriores experimentos de hibridación in situ demostraron que los minicromosomas derivaron del cromosoma dicéntrico. En las líneas celulares EC3/7C5 y EC3/7C6 (140 y 128 metafases, respectivamente) no se encontraron cromosomas dicéntricos intactos y los minicromosomas se detectaron en el 97,2% y 98,1% de las células, respectivamente. Los minicromosomas se han mantenido durante más de 150 generaciones de células. Contienen la porción restante del cromosoma anteriormente dicéntrico.

Las copias múltiples de secuencias de ADN teloméricas se detectaron en la región centromérica del marcador de la porción restante del cromosoma anteriormente dicéntrico mediante hibridación in situ. Esto indica que las secuencias teloméricas se coamplificaron con las secuencias de ADN ajeno. Estas líneas celulares que portan minicromosomas estables proporcionan evidencia directa de que el centrómero extra está funcionando y es capaz de mantener los minicromosomas [ver, Patente de los Estados Unidos No. 5.288.625].

La rotura del cromosoma en las células EC3/7, que separa el neo-centrómero del cromosoma de ratón, se produjo en la región de ADN "ajeno" positiva de bandeo cromosómico G. Esto se confirma por la observación de trazas de secuencias de ADN de λ y humano en el extremo fragmentado del cromosoma anteriormente dicéntrico. Comparando el patrón de bandeo cromosómico del fragmento de cromosoma que porta el neo-centrómero con el del neo-minicromosoma estable, se revela que el neo-cromosoma es un duplicado invertido del fragmento de cromosoma que comprende el neo-centrómero. Esto también se demuestra por la observación de que aunque el neo-minicromosoma sólo porta un centrómero funcional, ambos extremos del minicromosoma son heterocromáticos y las secuencias de ADN satélite de ratón se encontraron en estas regiones heterocromáticas mediante hibridación in situ.

Estas dos líneas celulares, EC3/7C5 y EC3/7C6, por lo tanto portan un minicromosoma de mamífero seleccionable [MMCneo] con un centrómero unido a un gen marcador dominante [Hadlaczky et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A. 88:8106-8110]. Se pretende que el MMCneo se utilice como un vector para la transferencia de genes mediada por minicromosomas y se ha utilizado como modelo de un sistema de vector en base a minicromosomas.

Los estudios de mapeo de largo alcance del MMCneo indicaron que el ADN humano y los constructos de genes con resistencia a la neomicina se integraron en el cromosoma de ratón en forma separada, seguido por la amplificación de la región del cromosoma que contiene el ADN exógeno. El MMCneo contiene aproximadamente 30-50 copias del ADN de λCM8 y λgtWESneo en la forma de bloques repetidos de aproximadamente 160 kb, que cubren juntos al menos una región de 3,5 Mb. Además de estos, existen secuencias teloméricas de ratón [Praznovszky et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:11042-11046] y cualquier ADN de origen de ratón necesarios para la organización estructural de orden superior correcta de cromátidas.

Utilizando una sonda de pintado cromosómico mCPE1.51 [ADN repetido intercalado largo de ratón] que reconoce exclusivamente ADN de ratón eucromático, se encontraron cantidades detectables de secuencias de repetición intercaladas en el MMCneo mediante hibridación in situ. El neo-centrómero se asocia con una cantidad pequeña pero detectable de ADN satélite. La rotura del cromosoma que separa el neo-centrómero del cromosoma de ratón ocurre en la región de ADN "ajeno". Esto se demuestra por la presencia de ADN de λ y humano en el extremo fragmentado del cromosoma anteriormente dicéntrico. Sin embargo, en ambos extremos del MMCneo hay trazas de ADN satélite mayor de ratón según se evidenció mediante hibridación in situ. Esta observación sugiere que el duplicado en tamaño del fragmento de cromosoma que porta el neo-centrómero durante la estabilización del MMCneo es un resultado de una duplicación invertida. Aunque las secuencias de telómero de ratón que se coamplifican con las secuencias de ADN exógeno durante la formación de neo-centrómeros pueden proporcionar telómeros suficientes para el MMCneo, la duplicación podría haber suministrado los telómeros funcionales para el minicromosoma.

La secuencia de nucleótidos de porciones de los neo-minicromosomas se determinó de la siguiente forma. El ADN total se aisló de las células EC3/7C5 de acuerdo con los procedimientos estándar. El ADN se sometió a amplificación con ácido nucleico utilizando el sistema Expand Long Template PCR [Boehringer Mannheim] de acuerdo con los procedimientos del fabricante. El procedimiento de amplificación requirió sólo un cebador de oligonucleótidos de 33 mer correspondiente a la secuencia en una región del brazo derecho λ bacteriófago que está contenido en el neo-minicromosoma. La secuencia de este oligonucleótido está establecida como los primeros 33 nucleótidos de la SEQ ID No. 13. Debido a que el neo-minicromosoma contiene una serie de repeticiones invertidas de esta secuencia, el único oligonucleótido se utilizó como un cebador directo e inverso que resultó en la amplificación de ADN ubicado entre conjuntos de repeticiones invertidas del ADN de bacteriófago λ. Se obtuvieron tres productos de la única reacción de amplificación que sugirió que la secuencia de ADN ubicada entre los diferentes conjuntos de repeticiones invertidas puede diferir. En una unidad de ácido nucleico de repetición dentro de un cromosoma artificial, puede haber diferencias menores presentes y pueden ocurrir durante el cultivo de células que contienen el cromosoma artificial. Por ejemplo, pueden ocurrir cambios de pares de base así como la integración de elementos genéticos móviles y eliminaciones de secuencias repetidas.

Cada uno de los tres productos se sometió a análisis de secuencia de ADN. Las secuencias de los tres productos se establecen en las SEQ ID NOs: 13, 14 y 15, respectivamente. Para asegurarse de que los productos secuenciados se amplificaron a partir del neo-minicromosoma, se llevaron a cabo amplificaciones de control utilizando los mismos cebadores en ADN aislado de líneas celulares testigo negativos (células Ltk de ratón) que carecen de minicromosomas y el cromosoma anteriormente dicéntrico, y líneas celulares testigo positivas [la línea celular híbrida de ratón-hámster GB43 generada mediante el tratamiento de células 19C5xHa4 (ver Figura 4) con BrdU seguido por el crecimiento en un medio selectivo que contiene G418 y retratamiento con BrdU] que contienen sólo el neominicromosoma. Sólo la línea celular testigo positiva proporcionó los tres productos amplificados; ningún producto de amplificación se detectó en la reacción testigo negativa. Los resultados obtenidos en la amplificación testigo positiva también demostraron que se amplificó el ADN del neo-minicromosoma y no el fragmento del cromosoma de ratón anteriormente dicéntrico.

Las secuencias de los tres productos de amplificación se compararon con aquellos contenidos en la base de datos de Genbank/EMBL. Las SEQ ID Nos. 13 y 14 mostraron una alta homología (~96%) a porciones de ADN de las partículas A intracisternales de ratón. La SEQ ID No. 15 no mostró una homología importante con las secuencias disponibles en la base de datos. Las tres secuencias pueden utilizarse para generar vectores que se dirigen a genes como ADN homólogos al neo-minicromosoma.

C. Aislamiento y purificación parcial de minicromosomas

Se aislaron cromosomas mitóticos de células EC3/7C5 como se describe por Hadlaczky et al. [(1981) Chromosoma 81:537-555], utilizando un sistema amortiguador de glicina-hexilenglicol [Hadlaczky et al. (1982) Chromosoma 86:643-659]. Las suspensiones de cromosomas se centrifugaron a 1.200 x g durante 30 minutos. El sobrenadante que contenía minicromosomas se centrifugó a 5.000 x g durante 30 minutos y el granulado se resuspendió en la solución amortiguadora apropiada. Los minicromosomas parcialmente purificados se almacenaron en 50% de glicerol a -20°C.

D. Estabilidad del mantenimiento y neo expresión del MMCneo

Las células EC3/7C5 cultivadas en un medio no selectivo durante 284 días y luego transferidas a un medio selectivo que contenía 400 μg/ml de G418 mostraron una eficiencia de cultivos en placas de 96% (formación de colonias) en

comparación con las células testigo cultivadas permanentemente en presencia de G418. Los análisis citogenéticos indicaron que el MMCneo se mantiene establemente a una copia por célula en condiciones de cultivo selectivas y no selectivas. Sólo se encontraron dos metafases con dos MMCneo en 2.270 metafases analizadas.

El análisis de hibridación Southern no mostró cambios detectables en los patrones de restricción de ADN y se observaron intensidades de hibridación similares con una neo sonda cuando se comparó el ADN de células cultivadas en condiciones de cultivo selectivas o no selectivas.

El análisis Northern de transcriptos de ARN del neo gen aislado de las células cultivadas en condiciones selectivas y no selectivas mostró sólo diferencias menores y no importantes. La expresión del neo gen persistió en las células EC3/7C5 mantenidas en un medio F-12 libre de G418 durante 290 días en condiciones de cultivo no selectivas. La expresión a largo plazo del o los neo genes del minicromosoma puede estar influenciada por la ubicación nuclear del MMCneo. Los experimentos de hibridación in situ revelaron una ubicación periférica preferencial del MMCneo en el núcleo interfase. En más del 60% de los 2.500 análisis de núcleos, el minicromosoma se observó en el perímetro del núcleo cerca de la envoltura nuclear.

Ejemplo 3

Transferencia de minicromosomas y producción del λ -neo-cromosoma

A. Transferencia de minicromosomas

El neo-minicromosoma [denominado como MMCneo, FIG. 2C] se ha utilizado para la transferencia génica mediante fusión de células que contienen minicromosomas [EC3/7C5 o EC3/7C6] con células de mamíferos diferentes, incluyendo de hámster y humanas. Se han producido treinta y siete líneas celulares híbridas. Todas las líneas celulares híbridas establecidas demostraron ser verdaderos híbridos según se evidenció mediante la hibridación in situ que utiliza sondas de ADN repetidas intercaladas largas de ratón pMCPE1.51 o genómicas de hámster humanas y biotiniladas para el "pintado cromosómico". El MMCneo también se ha transferido exitosamente en células de teratocarcinoma de ratón A9, L929 y pluripotentes F9 mediante fusión de las microcélulas derivadas de las células EC3/7C5. La transferencia se confirmó mediante PCR, Southern blot e hibridación in situ con sondas específicas de minicromosomas. El análisis citogenético confirmó que, como se esperaba para la fusión de microcélulas, unas pocas células [1-5%] recibieron [o retuvieron] el MMCneo.

Estos resultados demostraron que el MMCneo es tolerado por un amplio rango de células. Los genes procariotas y la dosificación extra para las secuencias humanas y λ en el minicromosoma no parecen desventajosas para las células de cultivo de tejido.

El MMCneo es el cromosoma más pequeño del genoma EC3/7C5 y se estima que es de aproximadamente 20-30 Mb, lo que es considerablemente más pequeño que la mayoría de los cromosomas (de ratón) de células huésped. En virtud del tamaño más pequeño, los minicromosomas pueden purificarse parcialmente a partir de una suspensión de cromosomas aislados mediante una centrifugación diferencial simple. De este modo, se han preparado las suspensiones de minicromosomas de 15-20% de pureza. Estas preparaciones de minicromosomas enriquecidos pueden utilizarse para introducir, tal como mediante microinyección o lipofección, el minicromosoma en células objetivo seleccionadas. Las células objetivo incluyen células terapéuticas que pueden utilizarse en métodos de terapia génica y también células embrionarias para la preparación de animales no humanos transgénicos.

El MMCneo es capaz de una replicación autónoma, se mantiene establemente en células y permite la expresión persistente del o de los neogenes, incluso después de un cultivo a largo plazo en condiciones no selectivas. Es un vector no integrador que parece ocupar un territorio cerca de la envoltura nuclear. Su localización periférica en el núcleo puede tener un papel importante en mantener la integridad y estabilidad funcional del MMCneo. La compartimentalización funcional del núcleo huésped puede tener un efecto en la función de secuencias ajenas. Además, el MMCneo contiene megabases de secuencias de ADN de λ que deberían servir como un sitio objetivo para la recombinación homóloga y por lo tanto la integración de genes deseados en el MMCneo. Puede transferirse mediante fusión de células y microcélulas, microinyección, electroporación, sistemas de portadores mediados por lípidos o captación de cromosomas. El neo-centrómero del MMCneo es capaz de mantener y respaldar la segregación normal de un λneo-cromosoma de 150-200 Mb. Este resultado demuestra que el cromosoma MMCneo debería ser útil para portar grandes fragmentos de ADN heterólogo.

B. Producción del λneo-cromosoma

En la línea celular híbrida KE1-2/4 producida mediante fusión de EC3/7 y células de ovario de hámster chino [FIG. 2], la separación del neo-centrómero del cromosoma dicéntrico se asoció con un proceso de amplificación adicional. Esta amplificación resultó en la formación de un cromosoma estable de tamaño promedio [es decir, el λ neocromosoma; ver, Praznovszky et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:11042-11046]. El λ neo-cromosoma porta un centrómero funcional ubicado terminalmente y está compuesto por siete amplicones grandes que contienen múltiples copias de secuencias de ADN de λ, humano, bacteriano y de ratón [ver FIG. 2]. Los amplicones se separan mediante ADN satélite mayor de ratón [Praznovszky et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:11042-11046] que forma bandas estrechas de heterocromatina constitutiva entre los amplicones.

Ejemplo 4

Formación del "cromosoma salchicha" [SC]

Los hallazgos establecidos en los ejemplos anteriores demuestran que la región centromérica del cromosoma 7 de ratón tiene la capacidad de amplificación a gran escala [otros resultados indican que esta capacidad no es única para el cromosoma 7]. Esta conclusión es además respaldada por resultados de los experimentos de cotransfección, en los cuales un segundo gen marcador seleccionable dominante y un gen marcador no seleccionado se introdujeron en células EC3/7C5 que portan el cromosoma 7 anteriormente dicéntrico y el neo-minicromosoma. La línea celular EC3/7C5 se transformó con ADN de bacteriófago λ, un constructo del gen de resistencia a la higromicina [pH132] y un constructo del gen de β-galactosidasa [pCH110]. Los transformantes estables se seleccionaron en presencia de Higromicina B en altas concentraciones [400 μg/ml] y se analizaron mediante hibridación Southern. Las líneas celulares transformantes establecidas que muestran múltiples copias de un ADN exógeno integrado se estudiaron mediante hibridación in situ para localizar el o los sitios de integración y mediante tinción de LacZ para detectar la expresión de β-galactosidasa.

A. Materiales y métodos

1. Construcción de pH132

El plásmido pH132 porta el gen de resistencia a la higromicina B y la ribozima gag anti-VIH-1 [ver, SEQ ID NO. 6 para la secuencia de ADN que corresponde a la secuencia de la ribozima] bajo el control del promotor de β-actina. Este plásmido se construyó a partir de un plásmido pHyg [Sugden et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:410-413; donado por el Dr. A. D. Riggs, Beckman Research Institute, Duarte; ver, también, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 4.997.764 ] y a partir de un plásmido pPC-RAG12 [ver, Chang et al. (1990) Clin Biotech 2:23-31; proporcionado por el Dr. J. J. Rossi, Beckman Research Institute, Duarte; ver, también las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.272.262, 5.149.796 y 5.144.019, que describen la ribozima gag anti-VIH y la construcción de un vector de expresión de mamífero que contiene el inserto de ribozima unido al promotor de β-actina y las señales de terminación transcripcional del gen tardío SV40 y de poliA]. La construcción de pPC-RAG12 implicó la inserción del inserto de ribozima flanqueado por enlazantes BamHI en pHβ-Apr-1gpt digerido por BanHI [ver, Gunning et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:4831-4835, ver, también Patente de los Estados Unidos No. 5.144.019].

El plásmido pH132 se construyó de la siguiente forma. Primero, el pPC-RAG12 [descrito por Chang et al. (1990) Clin. Biotech. 2:23-31] se digirió con BamHI para eliminar un fragmento que contenía un gen de ribozima anti-VIH [denominado ribozima D por Chang et al. ((1990) Clin. Biotech. 2:23-31]; ver también Patente de los Estados Unidos No. 5.144.019 de Rossi et al.., particularmente la Figura 4 de la patente] flanqueado por el promotor de β-actina humano en el extremo 5' del gen y las señales de terminación transcripcional tardía de SV40 y de poliadenilación en el extremo 3' del gen. Como se describió por Chang et al. [(1990) Clin. Biotech. 2:23-31], la ribozima D es dirigida para la escisión de la región de iniciación translacional del gen gag de VIH. Este fragmento de pPC-RAG12 se subclonó en pBluescript-KS(+) [Stratagene, La Jolla, CA] para producir el plásmido 132. El plásmido 132 se digirió entonces con XhoI y EcoRI para proporcionar un fragmento que contenía el gen de ribozima D flanqueado por el promotor de β-actina en el extremo 5' y las señales de terminación SV40 y poliadenilación en el extremo 3' del gen. Este fragmento se ligó al fragmento más grande generado por la digestión de pHyg [Sugden et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:410-413] con EcoRI y SalI para proporcionar pH 132. Por lo tanto, pH 132 es un plásmido de ~9,3 que contiene los siguientes elementos: el promotor de β-actina unido a un gen de ribozima anti-VIH seguido por las señales de terminación de SV40 y de poliadenilación, el promotor del gen de timidina quinasa unido al gen de resistencia a la higromicina seguido por la señal de poliadenilación del gen de timidina quinasa y el origen de replicación de E. coli ColE1 y el gen de resistencia a la ampicilina.

El plásmido pHyg [ver, por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos Nos. 4.997.764, 4.686.186 y 5.162.215] que confiere resistencia a la higromicina B utilizando controles transcripcionales del gen HSV-1 tk, se construyó originalmente a partir de pKan2 [Yates et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:3806-3810] y pLG89 [ver, Gritz et al. (1983) Gene 25:179-188]. A modo de resumen, pKan2 fue digerido con SmaI y BglII para eliminar las secuencias derivadas del transposón Tn5. El gen hph de resistencia a la higromicina se insertó en el pKan2 digerido utilizando una ligadura de extremo romo en el sitio Snal y ligadura de "extremo cohesivo" [utilizando 1 unidad Weiss de ligasa de ADN T4 (BRL) en un volumen de 20 microlitros] en el sitio de BglII. Los sitios SmaI y BglII de pKan2 se perdieron durante la ligadura.

El plásmido resultante pH132, producido a partir de la introducción del constructo de ribozima anti-VIH con el promotor y sitio poliA en pHyg, incluye la ribozima anti-VIH bajo el control del promotor de β-actina así como el gen de la resistencia a la higromicina bajo el control del promotor deTK.

2.

Bandeo cromosómico

3.

Cultivos celulares

El bandeo cromosómico G con tripsina de cromosomas se realizó como se describió en el Ejemplo 1.

Las células de ratón TF1004G19 y TF1004G-19C5 y el híbrido 19C5xHa4 descritos más adelante y sus sublíneas se cultivaron en un medio F-12 que contenía 400 μg/ml de Higromicina B [Calbiochem].

B. Cotransfección de EC3/7C5 para producir TF1004G19

La cotransfección de células EC3/7C5 con plásmidos [pH 132, pCH110 disponibles de Pharmacia, ver, también Hall et al. (1983) J. Mol. Appl. Gen. 2:101-109] y con ADN de λ [λcl 875 Sam 7(New England Biolabs)] se llevó a cabo utilizando el método de precipitación de ADN de fosfato de calcio [ver, por ejemplo, Chen et al. (1987) Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752], utilizando 2-5 μg de ADN plásmido y 20 μg de ADN de bacteriófago λ por 5 × 106 células receptoras.

C. Líneas celulares que contenían el cromosoma salchicha

El análisis de uno de los transformantes, designado TF1004G19, reveló que tiene un alto número de copias de las secuencias pH132 y pCH110 integradas, y un nivel alto de expresión de β-galactosidasa. El bandeo cromosómico G e hibridación in situ con una sonda humana [CM8; ver, por ejemplo, Solicitud de los Estados Unidos No. de serie 08/375.271] reveló inesperadamente que la integración había ocurrido en el cromosoma 7 anteriormente dicéntrico de la línea celular EC3/7C5. Además, este cromosoma portó un brazo de cromosoma heterocromático recientemente formado. El tamaño de este brazo heterocromático varió entre ~ 150 y ~800 Mb en metafases individuales.

Mediante la clonación de una única célula de la línea celular TF1004G19, se obtuvo un subclón TF1004G-19C5 [FIG. 2D], que porta un cromosoma 7 estable con un brazo heterocromático de ~100-150 Mb [el cromosoma salchicha]. Esta línea celular se ha depositado en la ECACC con el no. de acceso 96040926. Este brazo de cromosoma está compuesto por cuatro a cinco segmentos de satélite rico en ADN satélite, y secuencias de ADN "ajeno" heterólogo integrado uniformemente separadas. En el extremo del brazo heterocromático compacto del cromosoma salchicha, se observa regularmente un segmento terminal eucromático menos condensado. Este subclón se utilizó para un análisis adicional.

D. Demostración de que el cromosoma salchicha deriva del cromosoma anteriormente dicéntrico

La hibridación in situ con ADN de bacteriófago λ y de pH132 en la línea celular TF1004G-19C5 mostró una hibridación positiva sólo en el minicromosoma y en el brazo heterocromático del cromosoma "salchicha" [Fig. 2D]. Parece que el cromosoma "salchicha" [también denominado en la presente SC] se desarrolló a partir del cromosoma anteriormente dicéntrico (FD) de la línea celular EC3/7C5.

Para establecer esto, se establecieron los sitios de integración de los plásmidos pCH110 y pH 132. Esto se logró mediante la hibridación in situ en estas células con subfragmentos etiquetados con biotina del gen de resistencia a la higromicina y el gen de β-galactosidasa. Ambos experimentos resultaron en bandas de hibridación estrechas en el brazo heterocromático del cromosoma salchicha. Se detectó el mismo patrón de hibridación en el cromosoma salchicha utilizando una mezcla de sonda λ etiquetada con biotina y plásmido pH132 lo que proporcionó la cointegración de bacteriófagos λ, plásmidos pH132 y pCH110.

Para examinar esto en más detalle, las células se cultivaron en presencia del tinte de unión a ADN Hoechst 33258. El cultivo de células de ratón en presencia de este tinte resulta en una condensación insuficiente de la heterocromatina pericéntrica de los cromosomas metafase, permitiendo así una mejor observación del patrón de hibridación. Utilizando esta técnica, el brazo heterocromático del cromosoma salchicha de células TF1004G-19C5 mostró una condensación insuficiente regular que reveló los detalles de la estructura del cromosoma "salchicha" mediante hibridación in situ. Los resultados de la hibridación in situ en células TF1004G-19C5 tratadas con Hoechst con subfragmentos etiquetados con biotina de genes de resistencia a la higromicina y de β-galactosidasa muestran que estos genes están localizados sólo en el brazo heterocromático del cromosoma salchicha. Además, se observó un patrón de hibridación de bandeo cromosómico igual. Este patrón de unidades de repetición [amplicones] claramente indica que el cromosoma salchicha se formó mediante un proceso de amplificación y que las secuencias de ADN de bacteriófago λ, plásmido pH132 y pCH110 delimitan los amplicones.

En otra serie de experimentos que utilizan hibridación in situ de fluorescencia [FISH] llevada a cabo con ADN satélite mayor de ratón, el componente principal de la heterocromatina pericéntrica de ratón, los resultados confirmaron que los amplicones del cromosoma salchicha están principalmente compuestos por ADN satélite.

E. El cromosoma salchicha tiene un centrómero

Para determinar si las secuencias centroméricas de ratón habían participado en el proceso de amplificación que forma el cromosoma "salchicha" y si los amplicones portan o no centrómeros inactivos, la hibridación in situ se llevó a cabo con ADN satélite menor de ratón. El ADN satélite menor de ratón está localizado específicamente cerca de los centrómeros de todos los cromosomas de ratón. Se detectó hibridación positiva en todos los centrómeros de ratón incluyendo el cromosoma salchicha. Sin embargo el mismo sólo mostró una señal positiva en el comienzo del brazo heterocromático.

La inmunofluorescencia con un anticuerpo anti-centrómero humano [LU 851] que reconoce sólo centrómeros funcionales [ver, por ejemplo, Hadlaczky et al. (1989) Chromosoma 97:282-288] demostró que el cromosoma salchicha tiene sólo un centrómero activo. El centrómero proviene de la parte anteriormente dicéntrica del cromosoma y se co-localiza con la señal de hibridación in situ de la sonda de ADN menor de ratón.

F. Se expresa el ADN heterólogo seleccionado y no seleccionado en la heterocromatina del cromosoma salchicha

1. Se expresan altos niveles de los genes heterólogos

La línea celular TF1004G-19C5 porta así múltiples copias de genes de resistencia a la higromicina y de βgalactosidasa localizados sólo en el brazo heterocromático del cromosoma salchicha. Las células TF1004G-19C5 pueden crecer muy bien en presencia de 200μg/ml o incluso 400 μg/ml de higromicina B. [El nivel de expresión se determinó mediante hibridación Northern con un subfragmento del gen de resistencia a la higromicina y gen de una única copia].

La expresión del gen de β-galactosidasa no seleccionado en el transformante TF1004G-19C5 se detectó con la tinción de LacZ de las células. Mediante este método el cien por ciento de las células se tiñeron de azul oscuro, lo que muestra que existe un alto nivel de expresión de β-galactosidasa en todas las células TF1004G-19C5.

2. Los genes heterólogos que se expresan se encuentran en la heterocromatina del cromosoma salchicha

Para demostrar que los genes localizados en la heterocromatina constitutiva del cromosoma salchicha proporcionan la resistencia a la higromicina y la capacidad de tinción de LacZ de los transformantes TF1004G-19C5 [es decir, expresión β-gal], se realizó la fusión celular inducida por PEG entre las células de ratón TF1004G-19C5 y las células de ovario de hámster chino. Los híbridos se seleccionaron y mantuvieron en un medio HAT que contiene G418 [400μg/ml] e higromicina [200 μg/ml]. Se seleccionaron dos clones híbridos designados 19C5xHa3 y 19C5xHa4 que han sido depositados en la ECACC con el no. de acceso 96040927. Ambos portan el cromosoma salchicha y el minicromosoma.

Veintisiete colonias derivadas de una única célula del híbrido 19C5xHa4 se mantuvieron y analizaron como subclones individuales. La hibridación in situ con sondas de pintado de cromosomas de ratón y de hámster y sondas específicas del cromosoma 2 de hámster verificó que el clon 19C5xHa4 contiene el genoma de hámster chino completo y un genoma de ratón parcial. Todos los subclones 19C5xHa4 retuvieron el genoma de hámster, pero diferentes subclones mostraron diferentes números de cromosoma de ratón que indican la eliminación preferencial de cromosomas de ratón.

Para promover una eliminación adicional de los cromosomas de ratón, las células híbridas se trataron repetidamente con BrdU. Los tratamientos con BrdU, que desestabilizan el genoma, resultan en una pérdida importante de cromosomas de ratón. Las células híbridas 19C5xHa4 tratadas con BrdU se dividieron en tres grupos. Un grupo de las células híbridas (GH) se mantuvieron en presencia de higromicina (200 μg/ml) y G418 (400 μg/ml) y los otros dos grupos de las células se cultivaron en condiciones de selección de G418 (G) o higromicina (H) para promover la eliminación del cromosoma salchicha o minicromosoma.

Un mes después, los subclones derivados de una única célula se establecieron de estos tres subcultivos de la línea híbrida 19C5xHa4. Los subclones se monitorearon mediante hibridación in situ con bacteriófago λ etiquetado con biotina y sondas de pintado de cromosoma de hámster. Se encontraron cuatro clones individuales [G2B5, G3C5, G4D6, G2B4] seleccionados en presencia de G418 que había perdido el cromosoma salchicha pero que retuvo el minicromosoma. Bajo la selección de la higromicina sólo un subclón [H1D3] perdió el minicromosoma. En este clon el megacromosoma [ver Ejemplo 5] estaba presente.

Debido a que se creía que los genes de resistencia a la higromicina y de β-galactosidasa se expresaban a partir del cromosoma salchicha, la expresión de estos genes se analizó en los cuatro subclones que habían perdido el cromosoma salchicha. En presencia de 200 μg/ml de higromicina, el cien por ciento de las células de cuatro subclones individuales murieron. A efectos de detectar el híbrido de expresión de β-galactosidasa, se analizaron los subclones mediante tinción de LacZ. El cien por ciento de las células de los cuatro subclones que perdieron el cromosoma salchicha también perdieron la capacidad de tinción de LacZ. Todos los subclones híbridos que no habían perdido el cromosoma salchicha bajo las condiciones de cultivo no selectivas mostraron una tinción de LacZ positiva.

Estos hallazgos demuestran que la expresión de genes de resistencia a la higromicina y de β-galactosidasa está unida a la presencia del cromosoma salchicha. Los resultados de las hibridaciones in situ muestran que el ADN heterólogo se expresa a partir de la heterocromatina constitutiva del cromosoma salchicha.

Los estudios de hibridación in situ de otros tres subclones híbridos [G2C6, G2D1 y G4D5] no detectaron la presencia del cromosoma salchicha. Mediante el método de tinción de LacZ, se detectaron algunas células teñidas en estas líneas híbridas y cuando estos subclones se transfirieron a la selección de higromicina algunas colonias sobrevivieron. El análisis citológico e hibridación in situ de estas colonias resistentes a la higromicina revelaron la presencia del cromosoma salchicha, lo que sugiere que sólo las células de los híbridos G2C6, G2D1 y G4D5 que no

habían perdido el cromosoma salchicha fueron capaces de preservar la resistencia a la higromicina y la expresión de β-galactosidasa. Estos resultados confirmaron que la expresión de estos genes está unida a la presencia del cromosoma salchicha. El nivel de expresión de β-galactosidasa se determinó mediante la técnica de inmunotransferencia utilizando un anticuerpo monoclonal.

La resistencia a la higromicina y la expresión de β-galactosidasa de las células que contenían el cromosoma salchicha fueron proporcionados por los genes localizados en la heterocromatina pericéntrica de ratón. Esto se demostró mediante la realización de hibridaciones de ADN Southern en las células híbridas que carecen del cromosoma salchicha utilizando subfragmentos amplificados por PCR de los genes de resistencia a la higromicina y de β-galactosidasa como sondas. Ninguno de los subclones mostró hibridación con estas sondas. Sin embargo, todos los clones analizados contenían el minicromosoma. Otros clones híbridos que contenían el cromosoma salchicha mostraron hibridación intensa con estas sondas de ADN. Estos resultados conducen a la conclusión de que la resistencia a la higromicina y la expresión de β-galactosidasa de las células que contenían el cromosoma salchicha fueron proporcionados por los genes localizados en la heterocromatina pericéntrica de ratón.

Ejemplo 5

El gigacromosoma

Tal como se describe en el Ejemplo 4, el cromosoma salchicha se transfirió en células de hámster chino mediante fusión celular. Utilizando la selección de Higromicina B/HAT y G418, se produjeron dos clones híbridos 19C5xHa3 y 19C5xHa4 que portan el cromosoma salchicha. La hibridación in situ, utilizando las sondas de pintado de cromosomas de ratón y de hámster y una sonda específica del cromosoma 2 de hámster, verificó que el clon 19C5xHa4 contiene un genoma de hámster chino completo así como genomas de ratón parciales. Veintisiete colonias separadas de células 19C5xHa4 se mantuvieron y analizaron como subclones individuales. Veintiséis de 27 subclones contenían un cromosoma salchicha morfológicamente sin cambios.

En un subclón de la línea celular 19C5xHa3, 19C5xHa47 [ver Fig, 2E], el brazo heterocromático del cromosoma salchicha se volvió inestable y mostró un crecimiento intracromosómico continuo. En casos extremos, el brazo del cromosoma amplificado excedió los 1000 Mb en tamaño (gigacromosoma).

Ejemplo 6

El megacromosoma estable

A. Generación de líneas celulares que contienen el megacromosoma

Todos los subclones 19C5xHa4 retuvieron un genoma de hámster completo, pero diferentes subclones mostraron diferentes números de cromosoma de ratón que indican la eliminación preferencial de cromosomas de ratón. Tal como se describió en el Ejemplo 4, para promover una eliminación adicional de los cromosomas de ratón, las células híbridas se trataron con BrdU, se cultivaron en condiciones de selección de G418 (G) o higromicina (H) seguido por un tratamiento repetido con BrdU 10-4 M durante 16 horas y se establecieron subclones de una única célula. Los tratamientos con BrdU parecieron desestabilizar el genoma, lo que resultó también en un cambio en el cromosoma salchicha. Se observó un aumento gradual en una población celular en la cual había ocurrido una amplificación adicional. Además del brazo heterocromático de ~100-150 Mb del cromosoma salchicha, se formaron un centrómero extra y un brazo del cromosoma heterocromático ~150-250 Mb, lo que difirió de aquellos del cromosoma 7 de ratón. Mediante la adquisición de otro segmento terminal eucromático, se formó un nuevo cromosoma submetacéntrico (megacromosoma). Se establecieron setenta y nueve subclones individuales de estos cultivos tratados con BrdU mediante clonación de una única célula: 42 subclones portaron el megacromosoma intacto, 5 subclones portaron el cromosoma salchicha y se observaron en 32 fragmentos de subclones o segmentos desplazados del megacromosoma. Veintiséis subclones que portaron el megacromosoma se cultivaron en condiciones no selectivas durante un período de dos meses. En 19 de los 26 subclones, el megacromosoma se retuvo. Aquellos subclones que perdieron los megacromosomas se volvieron todos sensibles a la Higromicina B y no tenían expresión de βgalactosidasa, lo que indica que ambos marcadores estaban unidos al megacromosoma.

Dos sublíneas (G3D5 y H1D3) que se eligieron para experimentos adicionales, no mostraron cambios en la morfología del megacromosoma durante más de 100 generaciones en condiciones selectivas. Las células G3D5 se habían obtenido mediante el crecimiento de células 19C5xHa4 en un medio que contenía G418 seguido por un tratamiento con BrdU repetido, mientras que las células H1D3 se habían obtenido mediante el cultivo de células 19C5xHa4 en un medio que contenía higromicina seguido por un tratamiento con BrdU repetido.

B. Estructura del megacromosoma

Los siguientes resultados demuestran que, aparte de los segmentos terminales eucromáticos, el ADN ajeno integrado (y como en las realizaciones ejemplificadas, secuencia ADNr), el megacromosoma completo es heterocromatina constitutiva, que contiene un arreglo en tándem de al menos 40 [~7,5 Mb] bloques de ADN satélite mayor de ratón [ver Figuras 2 y 3]. Cuatro bloques de ADN satélite están organizados en un palíndromo gigante [amplicón] que porta secuencias de ADN exógeno integradas en cada extremo. Los brazos largo y corto del

megacromosoma submetacéntrico contienen 6 y 4 amplicones, respectivamente. Se comprende por supuesto que la organización específica y tamaño de cada componente puede variar entre las especies y también el cromosoma en el cual el evento de amplificación se inicia.

1. El megacromosoma está compuesto principalmente de heterocromatina

Con excepción de las regiones terminales y el ADN ajeno integrado, el megacromosoma está compuesto principalmente de heterocromatina. Esto se demostró mediante el bandeo cromosómico C del megacromosoma, que resultó en una característica de tinción positiva de heterocromatina constitutiva. Además de las regiones terminales y el ADN ajeno integrado, el megacromosoma completo parece ser heterocromático. El ADN satélite mayor de ratón es el componente principal de la heterocromatina constitutiva pericéntrica de cromosomas de ratón y representa ~10% del ADN total [Waring et al. (1966) Science 154:791-794]. Utilizando una sonda de ADN satélite mayor de ratón para una hibridación in situ, se observó una hibridación fuerte en todo el megacromosoma, excepto por sus regiones terminales. La hibridación mostró un patrón segmentado: cuatro bloques grandes aparecieron en el brazo corto y generalmente 4-7 bloques se vieron en el brazo largo. Mediante la comparación de estos segmentos con las regiones pericéntricas de cromosomas de ratón normales que portan ~15 Mb de ADN satélite mayor, el tamaño de los bloques de ADN satélite mayor en el megacromosoma se estimó én ~30 Mb.

Utilizando una sonda de ratón específica para la eucromatina [pMCPE1.51; una sonda de ADN repetido intercalado largo de ratón]; se detectó hibridación positiva sólo en los segmentos terminales del megacromosoma de las sublíneas híbridas H1D3. En los híbridos G3D5, la hibridación con una sonda específica de hámster reveló que varios megacromosomas contenían segmentos terminales de origen de hámster en el brazo largo. Esta observación indicó que la adquisición de los segmentos terminales en estos cromosomas sucedió en las células híbridas y que el brazo largo del megacromosoma fue el brazo recientemente formado. Cuando se utilizó una sonda satélite menor de ratón, específica para los centrómeros de cromosomas de ratón [Wong et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16:1164511661], se detectó una señal de hibridación fuerte sólo en la constricción primaria del megacromosoma, que se colocalizó con la señal de inmunofluorescencia positiva producida con suero anti-centrómero humano [LU 851].

Los experimentos de hibridación in situ con sondas de pH132, pCH110 y ADN de λ revelaron que todo el ADN heterólogo estaba localizado en las brechas entre los segmentos de ADN satélite mayor de ratón. Cada segmento de ADN satélite mayor de ratón estaba delimitado por una banda estrecha de ADN heterólogo integrado, excepto en el segundo segmento del brazo largo donde existió una doble banda de ADN heterólogo, indicando que el segmento de ADN satélite mayor faltaba o estaba considerablemente reducido en tamaño aquí. Esta región del cromosoma sirvió como un marcador citológico útil para identificar el brazo largo del megacromosoma. A una frecuencia de 10-4, el "restablecimiento" de estos bloques de ADN satélite faltantes se observó en una cromátida, cuando ocurrió la formación de un segmento completo en una cromátida.

Después del tratamiento con Hoechst 33258 (50 μg/ml durante 16 horas), el megacromosoma mostró una condensación insuficiente en toda su longitud excepto por los segmentos terminales. Esto hizo posible estudiar la arquitectura del megacromosoma en una resolución más alta. La hibridación in situ con la sonda satélite mayor de ratón en megacromosomas con condensación insuficiente demostró que los segmentos satélite mayores de ~30 Mb estaban compuestos por cuatro bloques de ~7,5 Mb separados entre sí por una banda estrecha de secuencias de no hibridación [Figura 3]. Puede observarse una segmentación similar en el bloque grande de heterocromatina pericéntrica en cromosomas de ratón metacéntrico de las líneas celulares LMTK-y A9.

2. El megacromosoma está compuesto por segmentos que contienen dos bloques de ~7,5 Mb en tándem seguido por dos bloques invertidos.

Debido a la asimetría en el contenido de timidina entre las dos hebras del ADN del satélite mayor de ratón, cuando las células de ratón se cultivan en presencia de BrdU para una única fase S, la heterocromatina constitutiva muestra una asimetría lateral después de la tinción FPG. Asimismo, en los híbridos 19C5xHa4, la deficiencia timidina-quinasa [Tk] de las células de fibroblastos de ratón se complementó por el gen Tk de hámster, permitiendo experimentos de incorporación de BrdU.

Se detectó una regularidad estructural sorprendente en el megacromosoma utilizando la técnica de FPG. En ambas cromátidas, se observó una tinción que alternaba entre oscuro y claro que produjo una apariencia a cuadros del megacromosoma. Una imagen similar se obtuvo mediante el etiquetado con un anticuerpo anti-BrdU conjugado con fluoresceína. Comparar estas imágenes con la apariencia segmentada del megacromosoma mostró que una banda FPG oscura y una clara correspondían al segmento de ~30 Mb de la zona del megacromosoma. Estos resultados sugieren que dos mitades del segmento de ~30 Mb tienen una orientación invertida. Esto se verificó mediante la combinación de la hibridación in situ y el inmunoetiquetado del BrdU incorporado con un anticuerpo anti-BrdU conjugado con fluoresceína en el mismo cromosoma. Debido a que los segmentos de ~30 Mb [o amplicones] del megacromosoma están compuestos por cuatro bloques de ADN satélite mayor de ratón, puede concluirse que dos bloques de ~7,5 Mb en tándem están seguidos por dos bloques invertidos dentro de un segmento.

El mapeo a gran escala de ADN del megacromosoma mediante electroforesis de campo pulsado e hibridación Southern con sondas de ADN "ajeno" reveló un patrón simple de fragmentos de restricción. Utilizando

endonucleasas con ningún o sólo un único sitio de escisión en las secuencias de ADN ajeno integradas, seguido por la hibridación con una sonda hyg, se detectaron 1-4 fragmentos predominantes. Debido a que el megacromosoma contiene 10-12 amplicones con un estimado de 3-8 copias de secuencias hyg por amplicón (30-90 copias por megacromosoma), el número pequeño de fragmentos de hibridación indica la homogeneidad de ADN en los segmentos amplificados.

3.

La microscopía electrónica de barrido del megacromosoma confirmó los hallazgos anteriores

La arquitectura homogénea de los brazos heterocromáticos del megacromosoma se confirmó mediante microscopía electrónica de barrido de alta resolución. Los brazos extendidos de megacromosomas y la región heterocromática pericéntrica de cromosomas de ratón, tratados con Hoechst 33258, mostraron una estructura similar. Las regiones heterocromáticas constitutivas parecían más compactas que los segmentos eucromáticos. Aparte de las regiones terminales, ambos brazos del megacromosoma estaban completamente extendidos y mostraron leves surcos, que deberían corresponder al límite de los bloques de ADN satélite en los cromosomas no amplificados y en el megacromosoma. Sin el tratamiento con Hoechst, los surcos parecían corresponder a los bordes del amplicón en los brazos del megacromosoma. Además, los centrómeros mostraron una apariencia finamente fibrosa más compacta que la heterocromatina circundante.

4.

El megacromosoma de las células 1B3 contiene la secuencia de genes de ARNr

La secuencia del megacromosoma en la región de los sitios de integración del ADN heterólogo se investigó mediante el aislamiento de estas regiones a través del uso de métodos de clonación y análisis de secuencia de los clones resultantes. Los resultados de este análisis revelaron que el ADN heterólogo estaba localizado cerca de secuencias de genes de ARN ribosómico de ratón (es decir, ADNr) contenidas en el megacromosoma.

a. Clonación de regiones de los megacromosomas en las cuales se había integrado el ADN heterólogo

Los megacromosomas se aislaron de células 1B3 (que se generaron mediante un tratamiento con BrdU repetido y clonación de una única célula de las células H1xHE41 (ver Figura 4) y que contienen un megacromosoma truncado) utilizando métodos de clasificación activados por fluorescencia según se describe en la presente (ver Ejemplo 10). Después de la separación de los SATAC (megacromosomas) de los cromosomas endógenos, los megacromosomas aislados se almacenaron en solución amortiguadora GH (glicina 100 mM, 1% de hexilenglicol, pH 8,4-8,6 ajustado con solución de hidróxido de calcio saturada; ver Ejemplo 10) y centrifugaron en un lecho de agarosa en EDTA 0,5

M.

El mapeo a gran escala del megacromosoma alrededor del área del sitio de integración del ADN heterólogo reveló que está enriquecido en secuencia que contiene sitios de enzimas de corte poco frecuente, tal como el sitio de reconocimiento para Notl. Adicionalmente, el ADN satélite mayor de ratón (que compone la mayoría del megacromosoma) no contiene sitios de reconocimiento de Notl. Por lo tanto, para facilitar el aislamiento de las regiones del megacromosoma asociado con el sitio de integración del ADN heterólogo, los megacromosomas aislados se escindieron con Notl, una endonucleasa de restricción de corte poco frecuente con un sitio de reconocimiento de GC de 8 pb. Los fragmentos del megacromosoma se insertaron en el plásmido pWE15 (Stratagene, La Jolla, California) de la siguiente forma. La mitad de un bloque de agarosa con un punto de fusión bajo de 100 μl (mega-tapón) que contiene los SATAC aislados se digirió con Notl durante la noche a 37ºC. El plásmido pWE 15 se digirió similarmente con Notl durante la noche. El mega-tapón se fundió entonces y mezcló con el plásmido digerido, solución amortiguadora de ligadura y ligasa T4. La ligadura se llevó a cabo a 16ºC durante la noche. Las células DH5α bacterianas se transformaron con el producto de ligadura y las células transformadas se colocaron en placas LB/Amp. Quince a veinte colonias se cultivaron en cada placa para un total de 189 colonias. El ADN plásmido se aisló de colonias que sobrevivieron al crecimiento en un medio LB/Amp y se analizó mediante hibridación Southern blot para detectar la presencia de ADN que se hibridó con una sonda pUC19. Esta metodología de detección aseguró que se detectarían todas las colonias, incluso los clones que carecían de un inserto pero que contenían aun el plásmido pWE15. Se esperaría que cualquier clon que contenga ADN de inserto contenga secuencias de ADN de megacromosoma rico en GC, no satélite localizadas en el sitio de integración del ADN heterólogo. Todas las colonias dieron positivo para ADN de hibridación.

Los cultivos líquidos de los 189 transformantes se utilizaron para generar miniprep cósmidas para el análisis de los sitios de restricción dentro del ADN de inserto. Seis de los 189 clones cósmidos originales contenían un inserto. Estos clones fueron designados de la siguiente forma: 28 (inserto de ~9 kb), 30 (inserto de ~ 9 kb), 60 (inserto de ~4 kb), 113 (inserto de ~9 kb), 157 (inserto de ~9 kb) y 161 (inserto de ~9 kb). El análisis de la enzima de restricción indicó que tres de los clones (113, 157 y 161) contenían el mismo inserto.

b. Experimentos de hibridación in situ utilizando segmentos aislados del megacromosoma como sondas

El ADN de inserto de los clones 30, 113, 157 y 161 se purificó, etiquetó y utilizó como sondas en estudios de hibridación in situ de varias líneas celulares. La contratinción de las células con yoduro de propidio facilitó la identificación de los sitios citológicos de las señales de hibridación. Las ubicaciones de las señales detectadas dentro de las células están resumidas en la siguiente tabla:

TIPO DE CÉLULA

SONDA UBICACIÓN DE LA SEÑAL

Linfocito humano (macho)

No. 161 4-5 pares de cromosomas acrocéntricos en regiones centroméricas.

Bazo de ratón

No. 161 Extremos acrocéntricos de 4 pares de cromosomas.

Células EC3/7C5

No. 161 Minicromosoma y el extremo del cromosoma anteriormente dicéntrico. Heterocromatina pericéntrica de uno de los cromosomas de ratón metacéntrico. Región centromérica de algunos de los otros cromosomas de ratón.

Células de hámster chino K20

No. 30 Extremos de al menos 6 pares de cromosomas. Una señal intersticial en un cromosoma corto.

Células HB31 (células híbridas de ratón-hámster derivadas de células H1D3 mediante tratamiento con BrdU repetido y clonación de una única célula que porta el megacromosoma)

No. 30 Extremos acrocéntricos de al menos 12 pares de cromosomas. Centrómeros de ciertos cromosomas y el megacromosoma. Límites de los amplicones del megacromosoma.

Células de bazo de ratón

No. 30 Similar a la señal observada para la sonda no. 161. Centrómeros de 5 pares de cromosomas. Hibridación cruzada débil con heterocromatina pericéntrica.

Células HB31

No. 113 Similar a la señal observada para la sonda no. 30.

Células de bazo de ratón

No. 113 Región centromérica de 5 pares de cromosomas.

Células K20

No. 113 Al menos 6 pares de cromosomas. Señal débil en algunos telómeros y varias señales intercaladas.

Células de linfocito humano (macho)

No. 157 Similar a la señal observada para la sonda no. 161.

c. Hibridación Southern blot utilizando segmentos aislados del megacromosoma como sondas

Se aisló ADN de tejido de bazo de ratón, células LMTK-de ratón, células de ovario de hámster chino K20, células de fibroblastos humano EJ30 y células H1D3. El ADN aislado y el ADN de bacteriófago lambda se sometieron a hibridación Southern blot utilizando insertos aislados de clones de megacromosomas nos. 30, 113, 157 y 161 como

5 sondas. El plásmido pWE15 se utilizó como una sonda testigo negativa. Cada uno de los cuatro insertos de clon de megacromosoma se hibridó en una forma de múltiples copias (según se demuestra por la intensidad de hibridación y el número de bandas de hibridación) a todas las muestras de ADN, excepto el ADN de bacteriófago lambda. El plásmido pWE15 se hibridó solo a ADN lambda.

d. Análisis de secuencia del clon del megacromosoma no. 161

10 El clon del megacromosoma no. 161 pareció mostrar la hibridación más fuerte en los experimentos de hibridación in situ y Southern y se eligió para el análisis de la secuencia de inserto. El análisis de la secuencia se abordó primero mediante la subclonación del inserto del clon cósmido no. 161 para obtener cinco subclones de la siguiente forma.

Para obtener los fragmentos del extremo del inserto del clon no. 161, el clon se digirió con Notl y BanHI y se ligó con pBluescript KS digerido con NotI/BamHI (Stratagene, La Jolla, California). Se obtuvieron dos fragmentos del inserto

15 del clon no. 161: un fragmento de inserto de 0,2 kb y uno de 0,7 kb. Para subclonar el fragmento interno del inserto del clon no. 161, la misma digestión se ligó con pUC19 digerida con BamHI. Se obtuvieron tres fragmentos del inserto del clon no. 161: un fragmento de inserto de 0,6 kb, uno de 1,8 kb y uno de 4,8 kb.

Los extremos de todos los fragmentos de inserto subclonados primero se secuenciaron manualmente. Sin embargo, debido a su contenido de GC extremadamente alto, las autorradiografías eran difíciles de interpretar y la 20 secuenciación se repitió utilizando un secuenciador ABI y el protocolo de ciclo terminador de tinte. Una comparación de los datos de secuencia a secuencias en la base de datos GENBANK reveló que el inserto del clon no. 161 corresponde a una sección interna de la unidad de repetición del gen de ARN ribosómico de ratón (ADN) entre las posiciones 7551-15670 como se establece en el no. de acceso de GENBANK X82564, que se proporciona como la SEQ ID NO. 16 en la presente. Los datos de secuencia obtenidos para el inserto del clon no. 161 se establecen en

las SEQ ID NOS. 18-24. Específicamente, los subclones individuales correspondían a las siguientes posiciones en el no. de acceso de GENBANK X82564 (es decir, SEQ ID NO. 16) y en SEQ ID Nos. 18-24.

Subclón

Inicio Fin Sitio SEQ ID No.

en X82564

161k1

7579 7755 NotI,BamHI 18

161m5

7756 8494 BamHI 19

161m7

8495 10231 BamHI 20 (muestra sólo la secuencia correspondiente a nt. 84958950), 21 (muestra sólo la secuencia correspondiente a nt. 9851- 10231)

161m12

10232 15000 BamHI 22 (muestra sólo la secuencia correspondiente a nt. 1023210600), 23 (muestra sólo la secuencia correspondiente a nt. 14267- 15000)

161k2

15001 15676 NotI, BamHI 24

La secuencia establecida en las SEQ ID NOs.18-24 diverge en algunas posiciones de la secuencia presentada en las posiciones 7551-15670 del no. de acceso GENBANK X82564. Dicha divergencia puede atribuirse a mutaciones aleatorias entre unidades de repetición de ADNr. Los resultados del análisis de secuencia del clon no. 161 que revelan que corresponde a ADNr, se correlacionan con la apariencia de la señal de hibridación in situ que generó en linfocitos humanos y células de bazo de ratón. La señal de hibridación se observó claramente en cromosomas acrocéntricos en estas células, y se conoce que dichos tipos de cromosomas incluyen ADNr adyacente al ADN satélite pericéntrico en el brazo corto del cromosoma. Más aun, los genes de ARNr están altamente conservados en mamíferos como se confirma por la hibridación de especies cruzadas del clon no. 161 al ADN cromosómico humano.

Para aislar las regiones testigo de amplificación-replicación tales como aquellas encontradas en el ADNr, puede ser posible someter el ADN aislado de las células que contienen megacromosomas, tales como las células H1D3, a amplificación de ácido nucleico utilizando, por ejemplo, la reacción en cadena de polimerasa (PCR) con los siguientes cebadores:

cebador directo del elemento testigo (1-30) 5'-GAGGAATTCCCCATCCCTAATCCAGATTGGTG-3' (SEQ ID NO. 25)

cebador inverso del elemento testigo de amplificación (2142-2111) 5'-AAACTGCAGGCCGAGCCACCTCTCTTCTGTGTTTG-3' (SEQ ID NO. 26)

origen del cebador directo de la región de replicación (2116-2141) 5'-AGGAATTCACAGAAGAGAGGTGGCTCGGCCTGC-3' (SEQ ID NO. 27)

origen del cebador inverso de la región de replicación (5546-5521) 5'-AGCCTGCAGGAAGTCATACCTGGGGAGGTGGCCC-3' (SEQ ID NO. 28)

C. Resumen de la formación del megacromosoma

La Figura 2 establece esquemáticamente eventos que conducen a la formación de un megacromosoma estable que comienza con la generación de un cromosoma dicéntrico en una línea celular LMTK-de ratón: (A) Una amplificación tipo E única en la región centromérica del cromosoma 7 de ratón después de la transfección de las células LMTKcon λCM8 y λgtWESneo genera el neo-centrómero unido al ADN ajeno integrado y forma un cromosoma dicéntrico. La amplificación tipo E múltiple forma el λ neo-cromosoma que se derivó del cromosoma 7 y se estabilizó en una línea celular híbrida de ratón-hámster; (B) Rotura específica entre los centrómeros de un cromosoma 7 dicéntrico genera un fragmento de cromosoma con el neo-centrómero y un cromosoma 7 con trazas de ADN ajeno en el extremo; (C) Duplicación invertida del fragmento que porta el neo-centrómero resulta en la formación de un neominicromosoma estable; (D) Integración de ADN exógeno en la región de ADN ajeno del cromosoma 7 anteriormente dicéntrico inicia una amplificación tipo H, y la formación de un brazo heterocromático. Mediante la captura de un segmento terminal eucromático, este nuevo brazo de cromosoma se estabiliza en la forma del cromosoma "salchicha"; (E) El tratamiento con BrdU y/o selección de fármaco parece inducir a una amplificación tipo H adicional, lo que resulta en la formación de un gigacromosoma inestable: (F) Tratamientos con BrdU repetidos y/o selección de fármaco inducen a una amplificación tipo H adicional que incluye una duplicación de centrómero, que conduce a la formación de otro brazo del cromosoma heterocromático. Se divide del cromosoma 7 mediante rotura de cromosoma y adquiere un segmento terminal para formar el megacromosoma estable.

D. Expresión de β-galactosidasa y genes de higromicina transferasa en líneas celulares que portan el megacromosoma o derivados del mismo

Se midió cuantitativamente el nivel de expresión de genes heterólogos (es decir, genes de β-galactosidasa e higromicina transferasa) en líneas celulares que contienen el megacromosoma o un derivado del mismo. También se determinó la relación entre el número de copias de los genes heterólogos y el nivel de proteína expresado en los mismos.

1. Materiales y métodos

a. Líneas celulares

Los niveles de expresión de genes heterólogos de las células H1D3 que portan un megacromosoma de 250-400 Mb según se describió anteriormente y las células mM2C1 que portan un micro-megacromosoma de 50-60 Mb se evaluaron cuantitativamente. Las células mM2C1 se generaron mediante tratamiento con BrdU repetido y clonación de una única célula de la línea celular H1 xHe41 (línea celular híbrida de ratón-hámster-humano que porta el megacromosoma y un cromosoma humano único con genes CD4 y neor; ver Figura 4). Las líneas celulares se cultivaron en condiciones estándar en un medio F12 en condiciones selectivas (120 μg/ml de higromicina) o no selectivas.

b. Preparación del extracto celular para ensayos de β-galactosidasa

Se lavaron tres veces monocapas de cultivos celulares de mM2C1 o H1D3 con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las células se rasparon mediante espátula de goma y se suspendieron y lavaron de nuevo en PBS. Las células lavadas se resuspendieron en Tris-HCl 0,25 M, pH 7,8 y se alteraron mediante tres ciclos de congelamiento en nitrógeno líquido y descongelamiento a 37°C. El extracto se aclaró mediante centrifugación a

12.000 rpm durante 5 min a 4°C.

c. Ensayo de β-galactosidasa

La mezcla de ensayo de β-galactosidasa contenía MgCl2 1 mM, β-mercaptoetanol 45 mM, 0,8 mg/ml de o-nitrofenilβ-D-galactopiranósido y fosfato de sodio 66 mM, pH 7,5. Después de incubar la mezcla de reacción con el extracto celular a 37°C durante tiempo creciente, la reacción se interrumpió mediante la adición de tres volúmenes de Na2CO3 1 M y la densidad óptica se midió a 420 nm. La mezcla de ensayo incubada sin extracto celular se utilizó como un testigo. El rango lineal de la reacción se determinó entre 0,1-0,8 OD420. Una unidad de la actividad de βgalactosidasa se definió como la cantidad de enzima que hidrolizará 3 nmoles de o-nitrofenil-β-D-galactopiranósido en 1 minuto a 37°C.

d. Preparación del extracto celular para el ensayo de higromicina fosfotransferasa

Las células se lavaron como se describió anteriormente y se resuspendieron en solución amortiguadora Hepes 20 mM, pH7,3, acetato de potasio 100 mM, acetato de Mg 5 mM y de ditiotreitol 2 mM. Las células se alteraron a 0°C mediante seis explosiones de 10 seg en un desintegrador ultrasónico MSE utilizando una sonda de micropunta. Las células se dejaron enfriar durante 1 min después de cada explosión ultrasónica. Los extractos se aclararon mediante centrifugación durante 1 min a 2000 rpm en una microcentrífuga.

e. Ensayo de higromicina fosfotransferasa

La actividad de la enzima se midió mediante el ensayo de unión de papel de fosfocelulosa según se describió por Haas y Dowding [(1975). Meth. Enzymol. 43:611-628]. El extracto celular se complementó con cloruro de amonio 0,1 M y adenosina-γ-32P-trifosfato 1 mM (actividad específica: 300 Ci/mmol). La reacción se inició mediante la adición de 0,1 mg/ml de higromicina y se incubó durante tiempo creciente a 37°C. La reacción se interrumpió mediante el calentamiento de muestras durante 5 min a 75°C en un baño de agua y luego retirando las proteínas precipitadas mediante centrifugación durante 5 min en una microcentrífuga y una alícuota del sobrenadante se colocó en una pieza de papel de fosfocelulosa Whatman P-81 (2 cm2). Después de 30 seg a temperatura ambiente los papeles se colocaron en 500 ml de agua destilada caliente (75°C) durante 3 min. Si bien el ATP radioactivo permanece en una solución bajo estas condiciones, la higromicina fosfato se une fuertemente y cuantitativamente a la fosfocelulosa. Los papeles se enjuagaron 3 veces en 500 ml de agua destilada y la radioactividad unida se midió en un cócktel de centelleo de tolueno en un contador de centelleo líquido Beckman. La mezcla de reacción incubada sin higromicina agregada sirvió como un testigo.

f. Determinación del número de copia de los genes heterólogos

El ADN se preparó a partir de las células H1D3 y mM2C1 utilizando los protocolos de purificación estándar que implican la lisis SDS de las células seguido por el tratamiento con Proteinasa K y extracciones de fenol/cloroformo. El ADN aislado se digirió con una endonucleasa de restricción apropiada, se fraccionó en gel de agarosa, se transfirió a filtros de nylon y se hibridó con una sonda radioactiva derivada ya sea de la β-galactosidasa o los genes de higromicina fosfotransferasa. El nivel de hibridación se cuantificó en un analizador PhosphorImage de Molecular Dynamics. Para controlar la cantidad total de ADN cargado de las diferentes líneas celulares, los filtros se volvieron a sondear con un gen de una única copia y la hibridación de los genes de β-galactosidasa e higromicina fosfotransferasa se normalizaron a una hibridación de un gen de una única copia.

g. Determinación de la concentración de proteína

El contenido total de proteína de los extractos celulares se midió mediante el ensayo colorimétrico Bradford utilizando albúmina de suero bovino como estándar.

2. Caracterización de la actividad de β-galactosidasa e higromicina fosfotransferasa expresada en las células H1D3 y mM2C1

Con el fin de establecer condiciones cuantitativas, se estudiaron los parámetros cinéticos más importantes de la actividad de β-galactosidasa e higromicina fosfotransferasa. La actividad de β-galactosidasa medida con este ensayo colorimétrico fue lineal entre el rango de 0,1-0,8 OD420 ambos para las líneas celulares nM2C1 y H1D3. La actividad de β-galactosidasa también fue proporcional en ambas líneas celulares con la cantidad de proteína agregada a la mezcla de reacción dentro del rango de concentración total de proteína de 5-100 μg. La actividad de higromicina fosfotransferasa de las líneas celulares nM2C1 y H1D3 también fue proporcional con el tiempo de reacción o la cantidad total de extracto celular agregado bajo las condiciones descritas para la β-galactosidasa.

a. Comparación de la actividad de β-galactosidasa de las líneas celulares mM2C1 y H1D3

Los extractos celulares preparados a partir del cultivo logarítmico de las líneas celulares mM2C1 y H1D3 se evaluaron para la actividad de β-galactosidasa y las actividades específicas se compararon en 10 experimentos independientes. La actividad de β-galactosidasa de los extractos celulares de H1D3 fue de 440 ± 25 U/mg de proteína total. Bajo condiciones idénticas la actividad de β-galactosidasa de los extractos celulares de mM2C1 fue 4,8 veces más baja: 92 ± 13 U/mg de proteína total.

También se compararon las actividades de β-galactosidasa de cultivos altamente subconfluentes, subconfluentes y casi confluentes de H1D3 y las líneas celulares mM2C1. En estos experimentos los números diferentes de células H1D3 y mM2C1 logarítmicas se sembraron en un volumen constante de un medio de cultivo y se cultivaron durante 3 días en condiciones estándar. No se encontró ninguna diferencia importante en las actividades específicas de βgalactosidasa de los cultivos celulares a diferentes densidades celulares y la relación de las actividades específicas de β-galactosidasa H1D3/mM2C1 fue similar para las tres densidades celulares. Sin embargo, en cultivos celulares estacionarios confluentes de las células H1D3 o mM2C1, la expresión de β-galactosidasa disminuyó significativamente debido probablemente al cese de la división celular como resultado de la inhibición de contacto.

b. Comparación de la actividad de higromicina fosfotransferasa de las líneas celulares H1D3 y mM2C1

La higromicina fosfotransferasa bacteriana está presente en una forma unida a la membrana en las líneas celulares H1D3 o mM2C1. Esto se desprende de la observación de que la actividad de higromicina fosfotransferasa puede retirarse completamente mediante centrifugación a alta velocidad de estos extractos celulares y la actividad de la enzima puede recuperarse mediante la resuspensión del granulado a alta velocidad.

La relación de la actividad específica de enzimas en las líneas celulares H1D3 y mM2C1 fue similar a la de la actividad de β-galactosidasa, es decir, las células H1D3 tienen una actividad específica 4,1 veces más alta en comparación con células mM2C1.

c. Actividad de higromicina fosfotransferasa en las células H1D3 y mM2C1 cultivadas en condiciones no selectivas

El nivel de expresión del gen de higromicina fosfotransferasa se midió en base a la cuantificación de las actividades de la enzima específica en las líneas celulares H1D3 y mM2C1 cultivadas en condiciones no selectivas por 30 generaciones. La ausencia de higromicina en el medio no influyó en la expresión del gen higromicina fosfotransferasa.

3.

Cuantificación del número de copias del gen de β-galactosidasa e higromicina fosfotransferasa en las líneas celulares H1D3 y mM2C1

Tal como se describió anteriormente, los genes de β-galactosidasa e higromicina fosfotransferasa están ubicados solamente dentro del megacromosoma o micro-megacromosoma en las células H1D3 y mM2C1. El análisis cuantitativo de los Southern blot genómicos de ADN aislado de las líneas celulares H1D3 y mM2C1 con el analizador PhosphorImage reveló que el número de copia de los genes de β-galactosidasa integrados en el megacromosoma es aproximadamente 10 veces mayor en células H1D3 que en células mM2C1. El número de copias de los genes de higromicina fosfotransferasa es aproximadamente 7 veces mayor en células H1D3 que en células mM2C1.

4.

Resumen y conclusiones de la cuantificación de la expresión de genes heterólogos en células que contienen megacromosomas o derivados de los mismos

La determinación cuantitativa de la actividad de β-galactosidasa de las células eucariotas superiores (por ejemplo, las células H1D3) que portan el gen de β-galactosidasa bacteriano en megacromosomas heterocromáticos confirmó la expresión de alto nivel observada del gen bacteriano integrado detectado por los métodos de tinción citológicos. Generalmente se ha establecido en informes de estudios de la expresión de genes ajenos en animales transgénicos

que aunque la expresión de transgenes muestra especificidad correcta de tejido y de desarrollo, el nivel de expresión es típicamente bajo y muestra una variabilidad extensiva dependiente de la posición (es decir, el nivel de expresión transgénica depende del sitio de integración cromosómico). Generalmente se asume que la expresión transgénica de bajo nivel puede deberse a la ausencia de secuencias de ADN especial que pueden aislar el transgén del efecto inhibitorio de la cromatina circundante y promover la formación de una estructura de cromatina activa requerida para la expresión de genes eficiente. Se han identificado varios elementos de secuencias de ADN que actúan en cis que pueden abolir esta variabilidad dependiente de la posición y pueden asegurar una expresión de alto nivel de las secuencias de la región de activación del locus (LAR) del transgén en eucariotas superiores y elementos de estructura de cromatina específica (scs) en eucariotas inferiores (ver, por ejemplo, Eissenberg and Elgin (1991) Trends in Genet. 7:335-340). Si estas secuencias de ADN que actúan en cis están ausentes, el nivel de expresión transgénica es bajo e independiente del número de copias.

Aunque el gen reportero de β-galactosidasa bacteriano contenido en los megacromosomas heterocromáticos de las células H1D3 y mM2C1 es generado por un elemento potenciador de promotores eucariota, no se designó un elemento específico de secuencia de ADN que actúa en cis ni se incorporó en el constructo de ADN bacteriano que podría funcionar como un elemento límite. Por lo tanto, la expresión de β-galactosidasa de alto nivel medida en estas células es de importancia, particularmente debido a que el gen de β-galactosidasa en el megacromosoma está ubicado en un ambiente heterocromático compacto y largo, que se conoce es capaz de bloquear la expresión de genes. El megacromosoma parece contener elementos de secuencia de ADN en asociación con las secuencias de ADN bacteriano que funcionan para anular el efecto inhibitorio de la heterocromatina en la expresión de genes.

La especificidad de la expresión de genes heterólogos en el megacromosoma se confirma también por la observación de que el nivel de expresión de β-galactosidasa es dependiente del número de copias. En la línea celular H1D3, que porta un megacromosoma de tamaño completo, la actividad específica de la β-galactosidasa es aproximadamente 5 veces mayor que en las células mM2C1, que portan sólo una versión truncada más pequeña del megacromosoma. Una comparación del número de copias del gen de β-galactosidasa en las líneas celulares H1D3 y mM2C1 mediante técnicas de hibridación cuantitativas confirmó que la expresión de β-galactosidasa es dependiente del número de copias. El número de copias del gen de β-galactosidasa integrado es aproximadamente 10 veces mayor en las células H1D3 que en las células mM2C1. Por lo tanto, la línea celular que contiene el mayor número de copias del gen de β-galactosidasa también proporciona mayores niveles de actividad de β-galactosidasa, lo que confirma la dependencia del número de copias de la expresión. La dependencia del número de copias de los niveles de enzima de β-galactosidasa e higromicina fosfotransferasa en las líneas celulares que portan diferentes derivados del megacromosoma indica que ni la organización de cromatina que rodea al sitio de integración de los genes bacterianos ni el ambiente heterocromático del megacromosoma suprime la expresión de los genes.

La cantidad relativa de proteína de β-galactosidasa expresada en las células H1D3 puede estimarse en base la Vmáx de esta enzima [500 para β-galactosidasa bacteriana cristalizada homogénea (Naider et al. (1972) Biochemistry 11:3202-3210)] y la actividad específica de la proteína de la células H1D3. Una Vmáx de 500 significa que la proteína de β-galactosidasa homogénea hidroliza 500 μmoles de sustrato por minuto por mg de la proteína de enzima a 37°C. Un mg del extracto de proteína de la célula H1D3 total puede hidrolizar 1,4 μmoles de sustrato por minuto a 37°C, lo que significa que 0,28% de la proteína presente en el extracto de la célula H1D3 es β-galactosidasa.

La higromicina fosfotransferasa está presente en una forma unida a la membrana en las células H1D3 y mM2C1. La tendencia de la enzima de integrarse en las membranas en células eucariotas superiores puede estar relacionada con su ubicación periplásmica en las células procariotas. La higromicina fosfotransferasa bacteriana no se ha purificado hasta homogeneizarse; por lo tanto no se ha determinado su Vmáx. Por lo tanto, no puede realizarse un estimado sobre la cantidad total de proteína de higromicina fosfotransferasa expresada en estas líneas celulares. Sin embargo, la actividad específica 4 veces mayor de la higromicina fosfotransferasa en células H1D3 en comparación con las células mM2C1 indica que su expresión es también dependiente del número de copias.

La expresión de alto nivel constante del gen de β-galactosidasa en las células H1D3 y mM2C1, particularmente en ausencia de cualquier presión selectiva para la expresión de este gen, claramente indica la estabilidad de la expresión de genes portados en los megacromosomas heterocromáticos. Esta conclusión se confirma también por la observación de que el nivel de higromicina fosfotransferasa no cambió cuando las células H1D3 y mM2C1 se cultivaron en condiciones no selectivas. La expresión dependiente del número de copias, estable, de alto nivel y consistente de genes marcadores bacterianos claramente indica que el megacromosoma es un sistema de vectores ideal para la expresión de genes ajenos.

Ejemplo 7

Resumen de algunas líneas celulares con SATAC y minicromosomas que se han construido

1. Líneas celulares derivadas de EC3/7

La línea celular derivada de LMTK-, que es una línea celular de fibroblastos de ratón, se transfectó con ADN de λCM8 y λgtWESneo [ver, Ejemplo 2] para producir líneas celulares transformadas. Entre estas líneas celulares estaba EC3/7, depositada en la Colección Europea de Cultivo de Células de Animales (ECACC) con el no. de

acceso 90051001 [ver, Patente de los Estados Unidos 5.288.625; ver, también Hadlaczky et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:8106-8110 y Solicitud de los Estados Unidos no. de serie 08/375.271]. Esta línea celular contiene el cromosoma dicéntrico con el neo-centrómero. La reclonación y selección produjeron líneas celulares tales como EC3/7C5, que son líneas celulares con el neo-minicromosoma estable y el cromosoma anteriormente dicéntrico [ver, Fig. 2C].

2.

Células KE1-2/4

La fusión de las células EC3/7 con CHO-K20 y la selección con G418/HAT produjo líneas celulares híbridas, entre ellas estaba KE1-2/4, que se ha depositado con la ECACC con el no. de acceso 96040924. KE1-2/4 es una línea celular estable que contiene el λneo-cromosoma [ver, Fig. 2D; ver, también Patente de los Estados Unidos No. 5.288.625], producido mediante amplificaciones de tipo E. KE1-2/4 se ha transfectado con vectores que contienen ADN de λ , marcadores seleccionables, tales como el gen de resistencia a la puromicina y genes de interés, tales como p53 y el gen de ribozima anti-VIH. Estos vectores se dirigen al gen de interés en el λneo-cromosoma en virtud de la recombinación homóloga con el ADN heterólogo en el cromosoma.

3.

Células C5pMCT53

La línea celular EC3/7C5 se ha co-transfectado con pH 132, pCH110 y ADN de λ [ver, Ejemplo 2] así como otros constructos. Se han seleccionado varios clones y subclones. Por ejemplo, la transformación con un constructo que incluye p53 que codifica ADN, produjo células designadas C5pMCT53.

4.

Células TF1004G24

Tal como se describió anteriormente, la cotransfección de las células EC3/7C5 con plásmidos [pH132, pCH110 disponibles de Pharmacia, ver, también Hall et al. (1983) J. Mol. Appl. Gen. 2:101-109] y con ADN de λ [λcl 875 Sam 7 (New England Biolabs)] produjo células transformadas. Entre estas está TF1004G24, que contiene el ADN que codifica la ribozima anti-VIH en el neo-minicromosoma. La reclonación de TF1004G24 produjo numerosas líneas celulares. Entre estas está la línea celular NHHL24. Esta línea celular también tiene la ribozima anti-VIH en el neominicromosoma y expresa niveles altos de β-gal. Se ha fusionado con células CHO-K20 para producir varios híbridos.

5.

Células derivadas de TF1004G19

La reclonación y selección de los transformantes de TF1004G produjeron la línea celular TF1004G19, descrita anteriormente en el Ejemplo 4, que contiene el cromosoma salchicha inestable y el neo-minicromosoma. La clonación de una única célula produjo la línea celular TF1004G-19C5 [ver Figura 4], que tiene un cromosoma salchicha estable y el neo-minicromosoma. TF1004G-19C5 se ha fusionado con células CHO y los híbridos se han cultivado en condiciones selectivas para producir las líneas celulares 19C5xHa4 y 19C5xHa3 [ver, Ejemplo 4] y otras. La reclonación de la línea celular 19C5xHa3 proporcionó una línea celular que contiene un gigacromosoma, es decir, una línea celular 19C5xHa47, ver Figura 2E. El tratamiento con BrdU de las células 19C5xHa4 y crecimiento en condiciones selectivas [neomicina (G) y/o higromicina (H)] ha producido líneas celulares híbridas tales como las líneas celulares G3D5 y G4D6 y otras. G3D5 tiene el neo-minicromosoma y el megacromosoma. G4D6 sólo tiene el neo-minicromosoma.

La reclonación de las células 19C5xHa4 en un medio H produjo numerosos clones. Entre ellos está H1D3 [ver Figura 4], que tiene un megacromosoma estable. El tratamiento con BrdU repetido y la reclonación de células H1D3 han producido la línea celular HB31, que se ha utilizado para transformaciones con los vectores pTEMPUD, pTEMPU, pTEMPU3 y pCEPUR-132 [ver, Ejemplos 12 y 14 más adelante].

H1D3 se ha fusionado con una línea celular Hela CD4+ que porta ADN que codifica CD4 y resistencia a la neomicina en un plásmido [ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos Nos. 5.413.914, 5.409.810, 5.266.600, 5.223.263,

5.215.914 y 5.144.019, que describen estas células Hela]. La selección con GH ha producido híbridos, incluyendo H1xHE41 [ver Figura 4] que porta el megacromosoma y también un cromosoma humano único que incluye el constructo CD4neo. El tratamiento con BrdU repetido y la clonación de una única célula produjeron líneas celulares con el megacromosoma [línea celular 1B3, ver Figura 4]. Aproximadamente el 25% de las células 1B3 tienen un megacromosoma truncado [~90-120 Mb]. Otro de estos subclones, designado 2C5, se cultivó en un medio que contiene higromicina y se obtuvieron líneas celulares libres de megacromosoma y se cultivaron en un medio que contiene G418. La reclonación de estas células proporcionó líneas celulares tales como IB4 y otras que tienen un megacromosoma enano [~150-200 Mb] y líneas celulares, tales como I1C3 y mM2C1, que tienen un micromegacromosoma [~50-90 Mb]. El micro-megacromosoma de la línea celular mM2C1 no tiene telómeros. Sin embargo, si se desea, los telómeros sintéticos, tales como aquellos descritos y generados en la presente, pueden agregarse al micro-megacromosoma de la célula mM2C1. Las líneas celulares que contienen megacromosomas truncados más pequeños, tales como la línea celular mM2C1 que contiene el micro-megacromosoma, pueden utilizarse para generar megacromosomas aun más pequeños, por ejemplo, ~10-30 Mb en tamaño. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante la rotura y fragmentación del micro-megacromosoma en estas células a través de la exposición de las células a irradiación de rayos X, BrdU o fragmentación de cromosomas in vivo dirigida a telómeros.

Ejemplo 8

Replicación del megacromosoma

La arquitectura homogénea de los megacromosomas proporciona una oportunidad única para realizar un análisis detallado de la replicación de la heterocromatina constitutiva.

A. Materiales y métodos

1.

Cultivo de líneas celulares

Las células híbridas de ratón-hámster H1D3 que portan el megacromosoma [ver, Ejemplo 4] se cultivaron en un medio F-12 que contenía 10% de suero de ternero fetal [FCS] y 400 μg/ml de Higromicina B [Calbiochem]. Las células híbridas G3D5 [ver, Ejemplo 4] se mantuvieron en un medio F-12 que contenía 10% de FCS, 400 μg/ml de Higromicina B (Calbiochem) y 400 μg/ml de G418 [SIGMA]. Se cultivaron células de fibroblastos A9 de ratón en un medio F-12 complementado con 10% de FCS.

2.

Etiquetado con BrdU

En experimentos típicos, 20-24 cultivos celulares semi-confluentes paralelos se dispusieron en placas de Petri de 10 cm. La bromodesoxiuridina (BrdU) (Fluka) se disolvió en agua destilada alcalinizada con una gota de NaOH, para obtener una solución concentrada de 10-2 M. Las alícuotas de 10-50 μl de esta solución concentrada de BrdU se agregaron a cada cultivo de 10 ml, para proporcionar una concentración de BrdU final de 10-50 μM. Las células se cultivaron en presencia de BrdU durante 30 min, y luego se lavaron con un medio completo tibio e incubaron sin BrdU hasta que fue requerido. En este momento, se agregaron 5 μg/ml de colchicina a un cultivo de muestra cada 1

o 2 h. Después del tratamiento con colchicina de 1-2 h, las células mitóticas se recogieron mediante "agitación" y se realizaron preparaciones de cromosomas regulares para inmunoetiquetado.

3.

Inmunoetiquetado de cromosomas e hibridación in situ

El inmunoetiquetado con un anticuerpo monoclonal anti-BrdU conjugado con fluoresceína (Boehringer) se realizó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, excepto que para los cromosomas A9 de ratón, se utilizó ácido clorhídrico 2 M a 37°C durante 25 min, mientras que para cromosomas de células híbridas, se utilizó ácido clorhídrico 1 M a 37°C durante 30 min. La hibridación in situ con sondas etiquetadas con biotina e inmunofluorescencia indirecta e hibridación in situ en la misma preparación, se realizaron como se describió previamente [Hadlaczky et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:8106-8110, ver, también Patente de los Estados Unidos No. 5.288.625].

4.

Microscopía

Todas las observaciones y microfotografía se realizaron mediante el uso de un microscopio Vanox AHBS (Olympus). Se utilizaron los negativos de color de alta velocidad Fujicolor 400 Super G o Fujicolor 1600 Super HG para fotografías.

B. Resultados

La replicación del megacromosoma se analizó mediante etiquetado de pulso con BrdU seguido por inmunoetiquetado. Los parámetros básicos para el etiquetado de ADN in vivo se establecieron primero. Utilizando un pulso de 30 min de BrdU 50 μM en cultivos paralelos, se tomaron las muestras y se fijaron a intervalos de 5 min desde el comienzo del pulso y cada 15 min hasta 1 h después de la remoción de la BrdU. La BrdU incorporada se detectó mediante inmunoetiquetado con un anticuerpo monoclonal anti-BrdU conjugado con fluoresceína. En el primer punto de tiempo (5 min) 38% de los núcleos se etiquetaron y se observó un aumento gradual en el número de núcleos etiquetados durante la incubación en presencia de BrdU, que culmina en 46% en la muestra a los 30 min, en el momento de la remoción de la BrdU. En otros puntos de tiempo (60, 75 y 90 min) no se observó ningún cambio importante y la fracción de núcleos etiquetados permaneció constante [44,5-46%].

Estos resultados indican que (i) la incorporación de la BrdU es un proceso rápido, (ii) el tiempo de pulso de 30 min es suficiente para un etiquetado confiable de núcleos de fase S y (iii) la BrdU puede retirarse de manera efectiva de los cultivos mediante lavado.

La duración del ciclo celular de las células H1D3 y G3D5 se estimó mediante la medición del tiempo entre la aparición de las señales de BrdU más tempranas en los segmentos de cromosoma de replicación tardíos extremos y la aparición del mismo patrón sólo en una de las cromátidas de los cromosomas después de completado un ciclo celular. La duración del período G2 se determinó por el tiempo de la primera señal de BrdU detectable en cromosomas de profase y mediante el método de mitosis etiquetada [Qastler et al. (1959) Exp. Cell Res. 17:420438]. La duración de la fase S se determinó de tres formas: (i) en base a la duración del ciclo celular y la fracción de núcleos etiquetados durante el pulso de 30-120 min; (ii) mediante la medición del tiempo entre el final de la replicación de los cromosomas de replicación tardíos extremos y la detección de la primera señal en los

cromosomas en el comienzo de la fase S; (iii) mediante el método de mitosis etiquetada. En experimentos repetidos, la duración del ciclo celular se encontró que era de 22-26 h, la fase S de 10-14 h y la fase G2 de 3,5-4,5 h.

Los análisis de la replicación del megacromosoma se realizaron en cultivos paralelos mediante la recolección de células mitóticas a intervalos de dos horas seguido de dos horas de tratamiento con colchicina. En un experimento de repetición, el mismo análisis se realizó utilizando intervalos de muestra de una hora y un tratamiento con colchicina de una hora. Aunque los dos procedimientos proporcionaron resultados comparables, los intervalos de muestra de dos horas fueron vistos como más apropiados debido a que se encontró que aproximadamente 30% de las células tenían un ciclo celular considerablemente más corto o más largo que el promedio. Los patrones de replicación característicos de los cromosomas individuales, especialmente algunos de los cromosomas de hámster de replicación tardíos, sirvieron como marcadores internos útiles para las diferentes etapas de la fase S. Para minimizar el error causado por las diferentes duraciones de los ciclos celulares en los diferentes experimentos, se tomaron muestras y se analizaron a lo largo de todo el ciclo celular hasta la aparición de las primeras señales en una cromátida en el comienzo de la segunda fase S.

La secuencia de replicación en el megacromosoma se describe a continuación. Bien al comienzo de la fase S, la replicación del megacromosoma comienza en los extremos de los cromosomas. La primera iniciación de replicación en una posición intersticial puede detectarse generalmente en la región centromérica. Poco después, pero aun en el primer cuarto de la fase S, cuando la región terminal del brazo corto casi ha completado su replicación, aparecen señales de iniciación discretas a los largo de los brazos del cromosoma. En el segundo cuarto de la fase S, mientras procede la replicación, las zonas etiquetadas con BrdU se ensanchan gradualmente, y un patrón a cuadros del megacromosoma se vuelve claro [ver, por ejemplo, Fig. 2F]. Al mismo tiempo, las regiones pericéntricas de cromosomas de ratón también muestran la incorporación intensa de BrdU. La replicación del megacromosoma alcanza su punto máximo al final del segundo cuarto y en el tercer cuarto de la fase S. Al final del tercer cuarto, y bien al comienzo del último cuarto de la fase S, el megacromosoma y la heterocromatina pericéntrica de los cromosomas de ratón completan su replicación. Al final de la fase S, sólo los segmentos de replicación bien tardíos de cromosomas de ratón y hámster están aun incorporando BrdU.

La replicación del genoma completo ocurre en fases diferentes. La señal de BrdU incorporada aumentó continuamente hasta el final de la primera mitad de la fase S, pero al comienzo del tercer cuarto de la fase S los segmentos de cromosoma que no eran las regiones heterocromáticas apenas incorporaron BrdU. En el último cuarto de la fase S, las señales de BrdU aumentaron de nuevo cuando los segmentos de replicación tardíos extremos mostraron una incorporación muy intensa.

Análisis similares de la replicación en células A9 de ratón se realizaron como testigos. Para aumentar la resolución del patrón de inmunoetiquetado, las regiones pericéntricas de cromosomas A9 se descondensaron mediante tratamiento con Hoechst 33258. Debido a la replicación intensa de las secuencias eucromáticas circundantes, la ubicación precisa de la señal de BrdU inicial en la heterocromatina fue normalmente difícil, incluso en cromosomas de ratón con condensación insuficiente. En aquellos cromosomas donde la o las señales de iniciación se localizaron sin ambigüedades, la replicación de la heterocromatina pericéntrica de cromosomas A9 fue similar a aquella del megacromosoma. Los cromosomas de las células A9 también exhibieron patrones de replicación y secuencias similares a aquellas de los cromosomas de ratón en células híbridas. Estos resultados indican que los replicadores del megacromosoma y los cromosomas de ratón retuvieron su momento y especificidad originales en las células híbridas.

Al comparar el patrón de los sitios de iniciación obtenidos después de la incorporación de BrdU con la ubicación de los sitios de integración del ADN "ajeno" en un análisis detallado del primer cuarto de la fase S, se realizó un intento para identificar orígenes de replicación (sitios de iniciación) en relación con la estructura de amplicones del megacromosoma. La banda doble de ADN integrado en el brazo largo del megacromosoma sirvió como un marcador citológico. Los resultados mostraron una co-localización de la BrdU y señales de hibridación in situ encontradas en el nivel citológico, indicando que las secuencias de ADN "ajeno" se encuentran en proximidad cercana a los orígenes de replicación, presumiblemente integrados en las secuencias no satélite entre el replicador y las secuencias satélite [ver, Figura 3]. Tal como se describió en el Ejemplo 6.B.4, las secuencias de ADNr detectadas en el megacromosoma también están ubicadas en los bordes del amplicón en el sitio de integración de las secuencias de ADN "ajeno", lo que sugiere que los orígenes de replicación responsables para la iniciación de replicación del megacromosoma implica secuencias de ADNr. En la región pericéntrica de otros varios cromosomas también puede observarse que las señales de BrdU tipo punto son comparables a las señales de iniciación en el megacromosoma. Estas señales pueden representar sitios de iniciación similares en las regiones heterocromáticas de cromosomas normales.

A una frecuencia de 10-4, se observó una amplificación "descontrolada" de las secuencias de ADN integrado en el megacromosoma. Consistente con la hipótesis (anterior) de que las secuencias "ajenas" se encuentran en proximidad de los replicadores, esta amplificación parcialmente restringida es probable que sea una consecuencia de la activación repetida descontrolada de los orígenes de replicación sin completar la replicación del segmento completo.

C. Análisis

Generalmente se ha creído que la heterocromatina constitutiva de las regiones pericéntricas de cromosomas es de replicación tardía [ver, por ejemplo, Miller (1976) Chromosoma 55:165-170]. Por el contrario, estos experimentos demuestran que la replicación de los bloques heterocromáticos comienza en un sitio de iniciación discreto en la primera mitad de la fase S y continúa a través de aproximadamente tres cuartos de la fase S. Esta diferencia puede explicarse en las siguientes formas: (i) en cromosomas normales, las secuencias eucromáticas que se replican activamente que rodean el ADN satélite oscurecen las señales de iniciación y por lo tanto la ubicación precisa de los sitios de iniciación se oscurece; (ii) la replicación de la heterocromatina sólo puede detectarse sin ambigüedades en un periodo durante la segunda mitad de la fase S, cuando la mayor parte de las réplicas de heterocromatina y la mayoría de las otras regiones cromosómicas han completado su replicación o aun no la han comenzado. Por lo tanto, las técnicas citológicas de baja resolución, tales como análisis de incorporación de precursores etiquetados radioactivamente mediante autorradiografía, sólo detectan señales de replicación prominentes en la heterocromatina en la segunda mitad de la fase S, cuando los segmentos eucromáticos adyacentes ya no se están replicando.

En el megacromosoma, los sitios de iniciación primarios de replicación se co-localizan con los sitios donde las secuencias de ADN "ajeno" y secuencias de ADNr se integran en los bordes del amplicón. Se observaron señales de iniciación similares al mismo tiempo en la heterocromatina pericéntrica de algunos de los cromosomas de ratón que no tienen ADN "ajeno", lo que indica que los sitios de iniciación de replicación en los bordes de los amplicones pueden residir en las secuencias de flanqueo no satélite de los bloques de ADN satélite. La presencia de un sitio de iniciación primario en cada doblete de ADN satélite implica que este segmento de cromosoma grande es una unidad enorme única de replicación [megarreplicón] delimitada por el sitio de iniciación primario y el punto de terminación en cada extremo de la unidad. Varias líneas de evidencia indican que, dentro de esta unidad de replicación de orden superior, los orígenes y replicones "secundarios" contribuyen a la replicación completa del megarreplicón:

1.

El tiempo de replicación total de las regiones heterocromáticas del megacromosoma fue ~9-11 h. A la tasa de movimiento de las horquillas de replicación, 0,5-5 kb por minuto, que es típica de cromosomas eucariotas [Kornberg et al. (1992) DNA Replication. 2nd. ed., New York: W. H. Freeman and Co, página 474], la replicación de un replicón de ~15 Mb requeriría 50-500 h. Alternativamente, si se utilizó sólo un único origen de replicación, la velocidad de replicación promedio tendría que ser de 25 kb por minuto para completar la replicación en menos de 10 h. Al comparar la intensidad de las señales de BrdU en los segmentos del cromosoma eucromático con el heterocromático, no se encontró evidencia para una diferencia de 5 a 50 veces en la velocidad de replicación.

2.

Utilizando un etiquetado de pulso de BrdU corto, un origen único de replicación produciría una banda de replicación que se mueve a lo largo del replicón, reflejando el movimiento de la horquilla de replicación. Por el contrario, se observó un incremento de la zona de replicación que finalmente dio lugar al patrón a cuadros del megacromosoma y dentro del periodo de replicación, la incorporación de BrdU más intensiva ocurrió en la segunda mitad de la fase S. Esto sugiere que una vez que el megarreplicador ha sido activado, permite la activación y encendido de orígenes "secundarios" y que la replicación de la mayor parte del ADN satélite se efectúa a partir de estos orígenes "secundarios" durante la segunda mitad de la fase S. Esto se confirmó por la observación de que en ciertas etapas de la replicación del megacromosoma, el amplicón completo puede etiquetarse aparentemente por un pulso de BrdU corto.

Los megarreplicadores y orígenes de replicación secundarios parecen estar bajo control temporal y espacial estricto. La primera iniciación dentro de los megacromosomas usualmente ocurrió en el centrómero y poco después todos los megarreplicadores se volvieron activos. El último segmento del megacromosoma para completar la replicación fue generalmente el segundo segmento del brazo largo. Los resultados de los experimentos testigo con cromosomas A9 de ratón indican que la replicación de la heterocromatina de cromosomas de ratón corresponde a la replicación de los amplicones del megacromosoma. Por lo tanto, el control de replicación temporal pre-existente en los bloques heterocromáticos se preserva en el megacromosoma. Se han propuesto las correlaciones positivas [Hassan et al. (1994) J. Cell. Sci. 107:425-434] y negativas [Haase et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14:2516-2524] entre la actividad transcripcional y la iniciación de replicación. En el megacromosoma, la transcripción de los genes integrados parece no tener efecto en el momento original de los orígenes de replicación. El momento preciso concertado de las iniciaciones del megarreplicador en los diferentes amplicones sugiere la presencia de secuencias que actúan en cis específicas, orígenes de replicación.

Al considerar que la heterocromatina pericéntrica de los cromosomas de ratón contiene miles de repeticiones simples cortas que abarcan 7-15 Mb y que el centrómero en sí también puede contener cientos de kilobases, la existencia de una unidad de orden superior de replicación parece probable. La amplificación intracromosómica descontrolada observada restringida a una región de iniciación de replicación del megacromosoma sugiere fuertemente una amplificación tipo círculo rodante y proporciona evidencia adicional para la presencia de un origen de replicación en esta región.

El hallazgo de que se produce un sitio de iniciación de replicación específico en los límites de amplicones sugiere que la replicación podría jugar un papel en el proceso de amplificación. Estos resultados sugieren que cada amplicón del megacromosoma puede considerarse como un enorme megarreplicón definido por un sitio de iniciación primario [megarreplicador] que contiene orígenes de replicación "secundarios". La fusión de las burbujas de replicación de diferentes orígenes de replicación bidireccional [DePamphilis (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:29-63] dentro del megarreplicón podrían formar una burbuja de replicación gigante que correspondería al megarreplicón

completo. A la luz de esto, la formación de amplicones de tamaño de megabases puede tener cabida en un mecanismo de amplificación dirigido al replicón. En las amplificaciones tipo H y E, se observó una multiplicación intracromosómica de los amplicones [ver, Ejemplos anteriores], que es consistente con el modelo de intercambio de cromátidas hermanas desigual. La replicación programada inducida o espontánea de un megarreplicón en la heterocromatina constitutiva también puede formar nuevos amplicones que conducen a la expansión de la amplificación o al polimorfismo heterocromático de cromosomas "normales". El "restablecimiento" del segmento faltante en el brazo largo del megacromosoma bien puede ser el resultado de la re-replicación de un amplicón limitado a una hebra.

Tomados juntos, sin ceñirnos a ninguna teoría, un mecanismo dirigido a la replicación es una explicación posible para la iniciación de amplificaciones a gran escala en las regiones centroméricas de cromosomas de ratón, así como para las formaciones de cromosomas de novo. Si secuencias específicas [amplificador, es decir, secuencias que controlan la amplificación] juegan un papel en promover el proceso de amplificación, las secuencias en el sitio de iniciación de replicación primaria [megarreplicador] del megarreplicón son posibles candidatos.

La presencia de una secuencia de genes de ARNr en los bordes del amplicón cerca del ADN ajeno en el megacromosoma sugiere que esta secuencia contribuye al sitio de iniciación de replicación primaria y participa en la amplificación a gran escala de la heterocromatina pericéntrica en la formación de novo de SATAC. Los genes de ARN ribosómico tienen un mecanismo de amplificación intrínseca que proporciona múltiples copias de genes en tándem. Por lo tanto, a los efectos de la presente, en la construcción de SATAC en células, el ADNr servirá como una región para la integración dirigida y como componentes de SATAC construidos in vitro.

Ejemplo 9

Generación de cromosomas con regiones amplificadas derivadas del cromosoma 1 de ratón

Para mostrar que los eventos descritos en los EjemploS 2-7 no son únicos para el cromosoma 7 de ratón y para mostrar que la línea celular EC7/3 no se requiere para la formación de los cromosomas artificiales, los experimentos se han repetido utilizando diferentes líneas celulares iniciales y fragmentos de ADN. Cualquier célula o línea celular debería ser susceptible a utilizarse o puede determinarse fácilmente que no lo es.

A. Materiales

La línea celular LP11 se produjo mediante el método de transfección "carga de raspaduras" [Fechheimer et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:8463-8467] utilizando 25 μg de ADN plásmido para 5 × 106 células receptoras. Las células LP11 se mantuvieron en un medio F-12 que contenía 3-15 μg/ml de Puromicina [SIGMA].

B. Amplificación en células LP11

La amplificación a gran escala descrita en los Ejemplos anteriores no está restringida a la línea celular EC3/7 transformada o al cromosoma 7 de ratón. En un experimento de transformación independiente, las células LMTK-se transfectaron utilizando el procedimiento de precipitación de fosfato de calcio con un constructo que contiene el gen de resistencia a la puromicina designado pPuroTel [ver Ejemplo 1.E.2. para una descripción de este plásmido], para establecer la línea celular LP11. La línea celular LP11 porta cromosomas con segmentos de cromosoma amplificados de diferentes longitudes [~150-600 Mb]. El análisis citológico de las células LP11 indicó que la amplificación ocurrió en la región pericéntrica del brazo largo de un cromosoma submetacéntrico formado por translocación robertsoniana. Este brazo del cromosoma se identificó mediante bandeo cromosómico G como el cromosoma 1. El bandeo cromosómico C e hibridación in situ con una sonda de ADN satélite mayor de ratón mostró que había ocurrido una amplificación tipo E. La región recientemente formada estaba compuesta por un arreglo de segmentos de cromosoma eucromático que contenían diferentes cantidades de heterocromatina. El tamaño y patrón de bandeo cromosómico C de los segmentos amplificados fueron heterogéneos. En varias células, el número de estas unidades amplificadas excedió 50. Sin embargo, los subclones de una única célula de línea celulares LP11, portan cromosomas marcadores estables con 10-15 segmentos y patrones de bandeo cromosómico C constantes.

Las sublíneas de las células LP11 con deficiencia de timidina quinasa (por ejemplo, línea celular LP11-15P 1C5/7) establecidas mediante clonación de una única célula se transfectaron con un constructo del gen de timidina quinasa. Se establecieron los transfectantes TK+ estables.

Ejemplo 10

Aislamiento de SATAC y otros cromosomas con contenido de base y/o tamaño atípico

I. Aislamiento de cromosomas artificiales de cromosomas endógenos

Pueden clasificarse cromosomas artificiales, tales como SATAC, a partir de cromosomas endógenos utilizando cualquier procedimiento adecuado y típicamente implica aislar los cromosomas metafase, distinguiendo los cromosomas artificiales de los cromosomas endógenos y separando los cromosomas artificiales de los cromosomas endógenos. Dichos procedimientos incluirán generalmente las siguientes etapas básicas: (1) cultivo de un número

suficiente de células (típicamente aproximadamente 2 x 107 células mitóticas) para proporcionar cromosomas artificiales, preferiblemente en el orden de 1 x 106 , (2) detención de los ciclos celulares de las células en una etapa de mitosis, preferiblemente metafase, utilizando un agente de arresto mitótico tal como colchicina, (3) tratamiento de las células, particularmente mediante hinchazón de las células en solución amortiguadora hipotónica, para aumentar la susceptibilidad de las células a la interrupción, (4) mediante la aplicación de fuerza física para alterar las células en presencia de soluciones amortiguadoras de aislamiento para la estabilización de los cromosomas liberados, (5) dispersión de cromosomas en presencia de soluciones amortiguadoras de aislamiento para la estabilización de cromosomas libres, (6) separación de cromosomas artificiales de endógenos y (7) almacenamiento (y envío si se desea) de los cromosomas artificiales aislados en soluciones amortiguadoras apropiadas. Pueden determinarse empíricamente modificaciones y variaciones del procedimiento general para el aislamiento de cromosomas artificiales, por ejemplo, para albergar diferentes tipos de células con diferentes características y requisitos de crecimiento y para optimizar la duración del bloque mitótico con agentes de detención para obtener el equilibrio deseado de rendimiento de cromosomas y nivel de desechos.

Las etapas 1-5 se refieren al aislamiento de cromosomas metafase. La separación de cromosomas artificiales de endógenos (etapa 6) puede lograrse en una variedad de formas. Por ejemplo, los cromosomas pueden teñirse con tintes específicos de ADN como Hoeschst 33258 y cromomicina A3 y pueden clasificarse en cromosomas artificiales y endógenos en base al contenido del tinte mediante el empleo de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Para facilitar el aislamiento a gran escala de los cromosomas artificiales, pueden emplearse diferentes técnicas de separación tales como centrifugación de cesto giratorio (para efectuar la separación en base al tamaño y densidad del cromosoma) [ver, por ejemplo, Mendelsohn et al. (1968) J. Mol. Biol. 32:101-108], centrifugación de rotor zonal (para efectuar la separación en base al tamaño y densidad del cromosoma) [ver, por ejemplo, Burki et al. (1973) Prep. Biochem. 3:157-182; Stubblefield et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 83:14041414], sedimentación de velocidad (para efectuar la separación en base al tamaño y forma del cromosoma) [ver por ejemplo, Collard et al. (1984) Cytometry 5:9-19]. También puede emplearse la purificación de inmuno-afinidad en procedimientos de aislamiento de cromosomas artificiales a gran escala.

En este proceso, las grandes poblaciones de células que contienen cromosomas artificiales (asíncronas o enriquecidas mitóticamente) se han cosechado en masa y los cromosomas mitóticos (que pueden liberarse de las células utilizando procedimientos estándar tales como mediante incubación de las células en solución amortiguadora hipotónica y/o tratamiento de detergente de las células conjuntamente con interrupción física de las células tratadas) se enriquecen mediante unión a los anticuerpos que están unidos a las matrices en estado sólido (por ejemplo, resinas de columna o perlas magnéticas). Los anticuerpos adecuados para su uso en este procedimiento se unen a proteínas centroméricas condensadas o proteínas de histona unidas al ADN y condensadas. Por ejemplo, el autoanticuerpo LU851 (ver Hadlaczky et al. (1989) Chromosoma 97:282-288), que reconoce centrómeros de mamífero pueden utilizarse para un aislamiento a gran escala de cromosomas antes de la separación posterior de cromosomas artificiales de endógenos utilizando métodos tales como FACS. Los cromosomas unidos se lavarían y eventualmente eludirían para su clasificación. También puede utilizarse la purificación de inmunoafinidad directamente para separar los cromosomas artificiales de cromosomas endógenos. Por ejemplo, los SATAC pueden generarse en o transferirse a (por ejemplo, mediante microinyección o fusión de microcélulas como se describe en la presente) una línea celular que tiene cromosomas que contienen cantidades relativamente pequeñas de heterocromatina, tales como células de hámster (por ejemplo, células V79 o células CHO-K1). Los SATAC, que son predominantemente heterocromatina, se separan entonces de los cromosomas endógenos mediante el uso de un anticuerpo de una proteína de unión anti-heterocromatina (Drosophila HP-1) conjugada a una matriz sólida. Dicha matriz preferentemente se une a los SATAC con respecto a los cromosomas de hámster. Los cromosomas de hámster sin unir se lavan de la matriz y los SATAC se eluyen mediante técnicas estándar.

A. Procedimientos de cultivo de líneas celulares y células

En un procedimiento de aislamiento, las células híbridas de ratón-hámster-humano 1B3 [ver, Figura 4] que portan el megacromosoma o el megacromosoma truncado se cultivaron en un medio F-12 complementado con 10% de suero de ternero fetal, 150 μg/ml de higromicina B y 400 μg/ml de G418. Las células híbridas de ratón-hámster GHB42 [una línea celular reclonada a partir de células G3D5] que portan el megacromosoma y el minicromosoma también se cultivaron en un medio F-12 que contenía 10% de suero de ternero fetal, 150 μg/ml de higromicina B y 400 μg/ml de G418. El tiempo de duplicación de ambas líneas celulares fue aproximadamente 24-40 horas, típicamente aproximadamente 32 horas.

Típicamente, las monocapas celulares se pasan cuando alcanzan aproximadamente 60-80% de confluencia y se dividen cada 48-72 horas. Las células que pueden alcanzar más de 80% de confluencia crecen en cultivo y no son preferidas para la cosecha de cromosomas. Las células pueden colocarse en platos de 100-200 mm en aproximadamente 50-70% de confluencia 12-30 horas antes de la detención mitótica (ver más adelante).

Otras líneas celulares que pueden utilizarse como huéspedes para cromosomas artificiales y de las cuales pueden aislarse los cromosomas artificiales incluyen, a modo no taxativo, células de riñón de marsupial PtK1 (NBL-3) (no. de acceso de ATCC CCL35), células de ovario de hámster chino CHO-K1 (no. de acceso de ATCC CCL61), células de pulmón de hámster chino V79-4 (no. de acceso de ATCC CCL93), células de la piel del muntjac de la India (no. de acceso de ATCC CCL157), células L de murino con deficiencia de timidina quinasa LMTK(-) (no. de acceso de

ATCC CCL1.3), células de ovario de gusano cogollero de otoño (Spodoptera frugiperda) Sf9 (no. de acceso de ATCC CRL 1711) y cualquier línea celular heterocariota generada (híbrida), tal como, por ejemplo, las células híbridas de hámster-murino descritas en la presente que pueden utilizarse para construir MAC, particularmente SATAC.

Las líneas celulares pueden seleccionarse, por ejemplo, para mejorar la eficiencia de producción de cromosomas artificiales y aislamiento como se desee en procesos de producción a gran escala. Por ejemplo, una consideración en seleccionar células huésped puede ser la relación entre cromosoma artificial y cromosoma total de las células. Para facilitar la separación de cromosomas artificiales de cromosomas endógenos, puede ser deseable una mayor relación entre cromosoma artificial y cromosoma total. Por ejemplo, para células H1D3 (una heterocariota de murino/hámster; ver Figura 4), esta relación es de 1:50, es decir, un cromosoma artificial (el megacromosoma) y 50 cromosomas totales. Por el contrario, las células de la piel de muntjac de India (no. de acceso de ATCC CCL157) contienen un número total de cromosomas más pequeño (un número diploide de cromosomas de 7), así como las células de rata canguro (un número diploide de cromosomas de 12) que proporcionarían una mayor relación entre cromosoma artificial y cromosoma total tras la introducción o generación de cromosomas artificiales en las células.

Otra consideración al seleccionar células huésped para la producción y aislamiento de cromosomas artificiales puede ser el tamaño de los cromosomas endógenos en comparación con el de los cromosomas artificiales. Las diferencias en tamaño de los cromosomas pueden ser explotadas para facilitar la separación de cromosomas artificiales de cromosomas endógenos. Por ejemplo, debido a que los cromosomas de células de la piel de muntjac de la India son considerablemente más grandes que los minicromosomas y megacromosomas truncados, la separación del cromosoma artificial de los cromosomas de muntjac puede lograrse posiblemente utilizando procedimientos de separación FACS de variable única (un tinte, ya sea Hoechst 33258 o Cromomicina A3).

Otra consideración al seleccionar células huésped para la producción y aislamiento de cromosomas artificiales puede ser el tiempo de duplicación de las células. Por ejemplo, la cantidad de tiempo requerido para generar un número suficiente de células que contienen cromosomas artificiales para su uso en procedimientos para aislar cromosomas artificiales puede ser de importancia para la producción a gran escala. Por lo tanto, pueden ser deseables las células huésped con tiempos de duplicación más cortos. Por ejemplo, el tiempo de duplicación de células de pulmón de hámster V79 es de aproximadamente 9-10 horas en comparación con el tiempo de duplicación de aproximadamente 32 horas de células H1D3.

Por consiguiente, varias consideraciones pueden entrar en la selección de células huésped para la producción y aislamiento de cromosomas artificiales. Puede ser que la célula huésped seleccionada como la más deseable para la formación de novo de cromosomas artificiales no esté optimizada para la producción a gran escala de los cromosomas artificiales generados en la línea celular. En dichos casos, puede ser posible, una vez que el cromosoma artificial se ha generado en la línea celular huésped inicial, transferirlo a una línea celular de producción más adecuada para una producción de alto nivel eficiente y aislamiento del cromosoma artificial. Dicha transferencia puede lograrse a través de varios métodos, por ejemplo a través de fusión de microcélulas, como se describe en la presente o microinyección en la producción de la línea celular de cromosomas artificiales purificados a partir de la línea celular generadora utilizando procedimientos tales como los descritos en la presente. Las líneas celulares de producción preferiblemente contienen dos o más copias del cromosoma artificial por célula.

B. Aislamiento de cromosomas

En general, las células se cultivan típicamente para dos generaciones a un crecimiento exponencial anterior a la detención mitótica. Para acumular las células 1B3 y GHB42 mitóticas en un procedimiento de aislamiento particular, se agregaron 5μg/ml de colchicina durante 12 horas a los cultivos. El índice mitótico obtenido fue 60-80%. Las células mitóticas se cosecharon mediante desprendimiento selectivo mediante pipeteado suave del medio en las células de monocapa. También es posible utilizar una agitación mecánica como un medio para liberar las células redondeadas (mitóticas) de la placa. Las células se sedimentaron mediante centrifugación a 200 x g durante 10 minutos.

Las células (cultivadas en plástico o en suspensión) pueden ser detenidas en diferentes etapas del ciclo celular con agentes químicos que no sean colchicina, tal como hidroxiurea, vinblastina, colcemida o alfidicolina. Los agentes químicos que detienen las células en las etapas distintas de la mitosis, tales como la hidroxiurea y afidicolina, se utilizan para sincronizar los ciclos de todas las células en la población y luego se retiran del medio celular para permitir que las células procedan, más o menos simultáneamente, a la mitosis en el momento en que pueden cosecharse para dispersar los cromosomas. Las células mitóticas podrían enriquecerse para una agitación mecánica (células adherentes). Los ciclos celulares de células dentro de una población de células que contienen MAC también pueden sincronizarse mediante un nutriente, factor de crecimiento o privación de hormonas que conduce a una acumulación de células en la etapa G1 o G0; otra adición de nutrientes o factores de crecimiento permite entonces que las células quiescentes vuelvan a ingresar en el ciclo celular en sincronía para aproximadamente una generación. Las líneas celulares que se conoce responden a la privación de hormonas de este modo y que son adecuadas como huéspedes para cromosomas artificiales, incluyen la línea celular de linfoma de rata Nb2 que depende absolutamente de la prolactina para la estimulación de la proliferación (ver, Gout et al. (1980) Cancer Res. 40:2433-2436). El cultivo de células en un medio con deficiencia de prolactina durante 18-24 horas conduce a la

detención de la proliferación, con células que se acumulan de manera temprana en la fase G1 del ciclo celular. Tras la adición de prolactina, todas las células evolucionan a través del ciclo celular hasta que la fase M, momento en el cual más del 90% de las células estaría en mitosis (la adición de colchicina podría aumentar la cantidad de las células mitóticas a más de 95%). El tiempo entre el restablecimiento de la proliferación mediante adición de prolactina y el cultivo de células mitóticas para la separación de cromosomas puede determinarse empíricamente.

Alternativamente, células adherentes, tales como células V79, pueden cultivarse en botellas de cultivo rotatorias y las células mitóticas pueden liberarse de la superficie plástica mediante la rotación de las botellas de cultivo rotatorias a 200 rpm o más (Shwarchuk et al. (1993) Int. J. Radiat. Biol. 64:601-612). En cualquier momento dado, aproximadamente 1% de las células en una población asíncrona que crece exponencialmente se encuentran en la fase M. Aun sin la adición de colchicina, 2 x 107 de células mitóticas se han cosechado de cuatro botellas de cultivo rotatorias de 1750 cm2 después de una centrifugación de 5 min a 200 rpm. La adición de colchicina durante 2 horas puede aumentar el rendimiento a 6 x 108 células mitóticas.

Pueden utilizarse varios procedimientos para aislar los cromosomas metafase de estas células, incluyendo, a modo no taxativo, uno en base a un sistema amortiguador de poliamina [Cram et al. (1990) Methods in Cell Biology 33:377-382], uno en base a un sistema amortiguador de hexilenglicol modificado [Hadlaczky et al. (1982) Chromosoma 86:643-65], uno en base a un sistema amortiguador de sulfato de magnesio [Van den Engh et al. (1988) Cytometry 9:266-270 y Van den Engh et al. (1984) Cytometry 5:108], uno en base a un sistema amortiguador de fijación de ácido acético [Stoehr et al. (1982) Histochemistry 74:57-61], y uno en base a una técnica que utiliza KCl hipotónico y yoduro de propidio [Cram et al. (1994) XVII meeting of the International Society for Analytical Cytology, October 16-21, Tutorial IV Chromosome Analysis and Sorting with Commerical Flow Cytometers; Cram et al. (1990) Methods in Cell Biology 33:376].

1. Procedimiento con poliamina

En el procedimiento con poliamina que se utilizó para aislar cromosomas artificiales de células 1B3 o GHB42, aproximadamente 107 células mitóticas se incubaron en 10 ml de solución amortiguadora hipotónica (KCl 75 mM, espermina 0,2 mM, espermidina 0,5 mM) durante 10 minutos a temperatura ambiente para hinchar las células. Las células se hincharon en una solución amortiguadora hipotónica para soltar los cromosomas metafase pero no al punto de lisis celular. Las células se centrifugaron entonces a 100 x g durante 8 minutos, típicamente a temperatura ambiente. El granulado celular se drenó cuidadosamente y aproximadamente 107 células se resuspendieron en 1 ml de solución amortiguadora de poliamina [Tris-HCl 15 mM, NaCl 20 mM, KCl 80 mM, EDTA 2 mM, EGTA 0,5 mM, βmercapto-etanol 14 mM, 0,1% de digitonina, Espermina 0,2 mM, espermidina 0,5 mM] para una dispersión física de los cromosomas metafase. Los cromosomas se liberaron entonces retirando suavemente la suspensión celular y expulsándola a través de una aguja de 22 G unida a una jeringa plástica de 3 ml. La concentración de cromosomas fue de aproximadamente 1-3 x 108 cromosomas/ml.

El protocolo de aislamiento de la solución amortiguadora de poliamina es adecuado para obtener un ADN cromosómico de alto peso molecular [Sillar y Young (1981) J. Histochem. Cytochem. 29:74-78; VanDilla et al. (1986) Biotechnology 4:537-552; Bartholdi et al. (1988) en "Molecular Genetics of Mammalian Cells" (M.Goettsman, ed.), Methods in Enzymology 151:252-267. Academic Press, Orlando]. La solución amortiguadora que estabiliza cromosomas utiliza las poliaminas espermina y espermidina para estabilizar la estructura del cromosoma [Blumenthal et al. (1979) J. Cell Biol. 81:255-259; Lalande et al. (1985) Cancer Genet. Cytogenet. 23:151-157] y quelantes de metales pesados para reducir la actividad nucleasa.

El protocolo de solución amortiguadora de poliamina tiene amplia aplicabilidad. Sin embargo, al igual que otros protocolos, las siguientes variables deben optimizarse para cada tipo celular: tiempo de bloqueo, concentración celular, tipo de solución amortiguadora de hinchazón hipotónica, tiempo de hinchazón, volumen de solución amortiguadora hipotónica y tiempo de agitación con agitador vorticial. Los cromosomas preparados utilizando este protocolo están típicamente altamente condensados.

Estas son varias soluciones amortiguadoras hipotónicas que pueden utilizarse para hinchar las células, por ejemplo solución amortiguadoras tales como las siguientes: KCl 75 mM; KCl 75 mM, espermina 0,2 mM, espermidina 0,5 mM; solución amortiguadora de Ohnuki de nitrato de sodio 16,2 mM, acetato de sodio 6,5 mM, KCl 32,4 mM [Ohnuki (1965) Nature 208:916-917 y Ohnuki (1968) Chromosoma 25:402-428]; y una variación de solución amortiguadora de Ohnuki que contiene adicionalmente espermina 0,2 mM y espermidina 0,5 mM. La cantidad de hipotonicidad de una solución amortiguadora agregada varía dependiendo del tipo celular y concentración celular. Las cantidades pueden estar en el rango de 2,5 - 5,5 ml por 107 células o más. Los tiempos de hinchazón pueden variar de 10-90 minutos dependiendo del tipo celular y de la solución de hinchazón utilizada.

La composición de la solución amortiguadora de aislamiento de poliamina también puede variarse. Por ejemplo, una solución amortiguadora modificada contiene Tris-HCl 15 mM, pH 7,2, NaCl 70 mM, KCl 80 mM, EDTA 2 mM, EGTA 0,5 mM, beta-mercaptoetanol 14 mM, 0,25% de Triton-X, espermina 0,2 mM y espermidina 0,5 mM.

La dispersión cromosómica también puede alcanzarse mediante una variedad de medios físicos. Por ejemplo, la suspensión celular puede retirarse suavemente y expulsarse en una jeringa de 3 ml ajustada con una aguja de

calibre 22 [Cram et al. (1990) Methods in Cell Biology 33:377-382], la suspensión celular puede agitarse en un agitador vorticial de mesa [Cram et al. (1990) Methods in Cell Biology 33:377-382], la suspensión celular puede interrumpirse con un homogenizador [Sillar y Young (1981) J. Histochem. Cytochem. 29:74-78; Carrano et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76:1382-1384] y la suspensión celular puede interrumpirse con un baño ultrasónico de mesa [Stoehr et al. (1982) Histochemistry 74:57-61].

2. Sistema amortiguador de hexilenglicol

En el procedimiento de solución amortiguadora de hexilenglicol que se utilizó para aislar cromosomas artificiales de células 1B3 o GHB42, aproximadamente 8 x 106 células mitóticas se resuspendieron en 10 ml de solución amortiguadora de glicina-hexilenglicol [glicina 100 mM, 1 % de hexilenglicol, pH 8,4-8,6 ajustado con solución de hidróxido de Ca saturado] y se incubaron durante 10 minutos a 37°C, seguido por centrifugación durante 10 minutos para retirar los núcleos. El sobrenadante se centrifugó de nuevo a 200 x g durante 20 minutos para retirar los cromosomas. Los cromosomas se resuspendieron en solución amortiguadora de aislamiento (1-3 x 108 cromosomas/ml).

La composición amortiguadora de hexilenglicol también puede modificarse. Por ejemplo, una solución amortiguadora modificada contiene Tris-HCl 25 mM, pH 7,2, hexilenglicol 750 mM, CaCl2 0,5 mM, MgCl2 1,0 mM [Carrano et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76:1382-1384].

3. Sistema amortiguador de sulfato de magnesio

Este sistema amortiguador puede utilizarse con cualquiera de los métodos de hinchazón de células y dispersión cromosómica, tales como los descritos anteriormente en conexión con los sistemas amortiguadores de poliamina y hexilenglicol. En este procedimiento, las células mitóticas se resuspenden en la siguiente solución amortiguadora: HEPES 4,8 mM, pH 8,0, MgSO4 9,8 mM, KCl 48 mM, ditiotreitol 2,9 mM [Van den Engh et al. (1985) Cytometry

6:92 y Van den Engh et al. (1984) Cytometry 5:108].

4.

Sistema amortiguador de fijación de ácido acético

Este sistema amortiguador puede utilizarse con cualquiera de los métodos de hinchazón de células y dispersión cromosómica, tales como los descritos anteriormente en conexión con los sistemas amortiguadores de poliamina y hexilenglicol. En este procedimiento, las células mitóticas se resuspenden en la siguiente solución amortiguadora: Tris-HCl 25 mM, pH 3,2, (1,6)-hexandiol 750 mM, CaCl2 0,5 mM, 1,0% de ácido acético [Stoehr et al. (1982) Histochemistry 74:57-61].

5.

Sistema amortiguador de KCl - yoduro de propidio

Este sistema amortiguador puede utilizarse con cualquiera de los métodos de hinchazón de células y dispersión cromosómica, tales como los descritos anteriormente en conexión con los sistemas amortiguadores de poliamina y hexilenglicol. En este procedimiento, las células mitóticas se resuspenden en la siguiente solución amortiguadora: KCl 25 mM, 50 μg/ml de yoduro de propidio, 0,33% de Triton X-100, 333 μg/ml de RNasa [Cram et al. (1990) Methods in Cell Biology 33:376].

Se utiliza el yoduro de propidio de tinte fluorescente y también sirve como un agente estabilizador de cromosomas. La hinchazón de las células en el medio hipotónico (que también puede contener yoduro de propidio) puede monitorearse ubicando una pequeña gota de la suspensión en un portaobjetos de microscopio y observando las células mediante microscopía de fase/fluorescente. Las células deberían excluir el yoduro de propidio mientras se hinchan, pero algunas pueden lisarse prematuramente y mostrar fluorescencia de cromosomas. Después de que las células se han centrifugado y resuspendido en el sistema amortiguador de KCl-yoduro de propidio, se lisarán debido a la presencia del detergente en la solución amortiguadora. Los cromosomas pueden dispersarse entonces y luego incubarse a 37°C durante hasta 30 minutos para permitir que la RNasa actúe. La preparación de cromosomas se analiza entonces por citometría de flujo. La fluorescencia de yoduro de propidio puede excitarse en la longitud de onda de 488 nm de un láser de argón y detectarse a través de un filtro óptico OG 570 mediante un único tubo fotomultiplicador. El único pulso puede estar integrado y adquirirse en un histograma de variable única. El citómetro de flujo puede alinearse a un CV de 2% o menos utilizando microesferas pequeñas (1,5 μm de diámetro). La preparación de cromosomas se filtra a través de una malla de nylon de 60 μm antes del análisis.

C. Tinción de cromosomas con tintes específicos de ADN

Posterior al aislamiento, la preparación de cromosomas se tiñó con Hoechst 33258 a 6 μg/ml y cromomicina A3 a 200 μg/ml. Quince minutos antes del análisis, se agregaron sulfito de Na 25 mM y citrato de Na 10 mM a la suspensión de cromosomas.

D. Clasificación de flujo de cromosomas

Los cromosomas obtenidos de las células 1B3 y GHB42 y mantenidos se suspendieron en una solución amortiguadora envolvente en base a poliamina (EGTA 0,5 mM, EDTA 2,0 mM, KCl 80 mM, NaCl 70 mM, Tris-HCl 15

mM, pH 7,2, espermina 0,2 mM y espermidina 0,5 mM) [Sillar y Young (1981) J. Histochem. Cytochem. 29:74-78]. Los cromosomas se pasaron entonces a través de un clasificador celular en base a rayo láser dual [FACStar Plus o FAXStar Vantage Becton Dickinson Immunocytometry System; también pueden utilizarse otros clasificadores en base a rayo láser dual, tales como aquellos fabricados por Coulter Electronics (Elite ESP) y Cytomation (MoFlo)] en el cual dos láseres se ajustaron para excitar los tintes separadamente, permitiendo un análisis bivariante del cromosoma mediante el tamaño y composición de pares de bases. Debido a la diferencia entre la composición de bases de los SATAC y los otros cromosomas y la diferencia resultante en la interacción con los tintes, así como las diferencias de tamaño, los SATAC se separaron de los otros cromosomas.

E. Almacenamiento de los cromosomas artificiales clasificados

Los cromosomas clasificados pueden granularse por centrifugación y resuspenderse en una variedad de soluciones amortiguadoras y almacenarse a 4°C. Por ejemplo, los cromosomas artificiales aislados pueden almacenarse en una solución amortiguadora GH (glicina 100 mM, 1 % de hexilenglicol pH 8,4-8,6 ajustado con solución de hidróxido de Ca saturado) [ver, por ejemplo, Hadlaczky et al. (1982) Chromosoma 86:643-659] durante un día y fijarse mediante centrifugación en agarosa. Los cromosomas clasificados se centrifugaron en un lecho de agarosa y los tapones se almacenaron en EDTA 500 mM a 4°C. Las soluciones amortiguadoras de almacenamiento adicional incluyen solución amortiguadora de CMB-I/poliamina (Tris-HCl 17,5 mM, pH 7,4, EDTA 1,1 mM, épsilon-ácido aminocaproico 50 mM, benzamida-HCl 5 mM, espermina 0,40 mM, espermidina 1,0 mM, EGTA 0,25 mM, KCl 40 mM, NaCl 35 mM) y solución amortiguadora de CMB-II/poliamina (glicina 100 mM, pH 7,5, hexilenglicol 78 mM, EDTA 0,1 mM, épsilonácido aminocaproico 50 mM, benzamida-HCl 5 mM, espermina 0,40 mM, espermidina 1,0 mM, EGTA 0,25 mM, KCl 40 mM, NaCl 35 mM).

Cuando la microinyección es el uso que se pretende, los cromosomas clasificados se almacenan en 30% de glicerol a -20°C. Los cromosomas clasificados también pueden almacenarse sin glicerol por períodos cortos de tiempo (3-6 días) en soluciones amortiguadoras de almacenamiento a 4°C. Soluciones amortiguadoras ejemplares para microinyección incluyen CBM-I (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, EDTA 0,1 mM, épsilon-ácido aminocaproico 50 mM, benzamida-HCl 5 mM, espermina 0,30 mM, espermidina 0,75 mM), CBM-II (glicina 100 mM, pH 7,5, hexilenglicol 78 mM, EDTA 0,1 mM, épsilon-ácido aminocaproico 50 mM, benzamida-HCl 5 mM, espermina 0,30 mM, espermidina 0,75 mM).

Para un almacenamiento a largo plazo de cromosomas clasificados, las soluciones amortiguadoras anteriores se complementan preferiblemente con 50% de glicerol y se almacenan a -20°C.

F. Control de calidad

1.

Análisis de la pureza

La pureza de los cromosomas clasificados se verificó mediante hibridación in situ de fluorescencia (FISH) con una sonda de ADN satélite de ratón etiquetada con biotina [ver, Hadlaczky et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:8106-8110]. La pureza de los cromosomas aislados fue de aproximadamente 97-99%.

2.

Características de los cromosomas clasificados

La electroforesis con gel de campo pulsado e hibridación Southern se llevaron a cabo para determinar la distribución de tamaño del contenido de ADN de los cromosomas artificiales clasificados.

G. Funcionamiento de los cromosomas artificiales purificados

Para verificar si su actividad se conserva, los cromosomas artificiales purificados pueden microinyectarse (utilizando métodos tales como los descritos en el Ejemplo 13) en células primarias, células somáticas y células madre que se analizan entonces para la expresión de los genes heterólogos portados por los cromosomas artificiales, por ejemplo, tales como análisis para el crecimiento en medio selectivo y ensayos de actividad β-galactosidasa.

II.

Clasificación de microcélulas que contienen cromosomas artificiales de mamífero

A.

Micronucleación

Se cultivaron a 80-90% de confluencia en 4 matraces T150. La colcemida se agregó a una concentración final de 0,06 μg/ml y luego se incubó con las células a 37°C durante 24 horas.

B. Enucleación

Se agregaron 10 μg/ml de citocalasina B y las microcélulas resultantes se centrifugaron a 15.000 rpm durante 70 minutos a 28-33°C.

C. Purificación de microcélulas mediante filtración

Las microcélulas se purificaron utilizando unidades de filtro Swinnex y filtros Nucleopore [5 μm y 3 μm].

D. Tinción y clasificación de microcélulas

Como se mencionó anteriormente, las células se tiñeron con Hoechst y tintes de cromomicina A3. Las microcélulas se clasificaron mediante un clasificador de células para aislar las microcélulas que contenían los cromosomas artificiales de mamífero.

E. Fusión

Las microcélulas que contienen el cromosoma artificial están fusionadas, por ejemplo, según se describió en el Ejemplo 1.A.5, para células primarias seleccionadas, células somáticas, células madre embrionarias para generar animales no humanos transgénicos y a los efectos de la terapia génica y para otras células para administrar los cromosomas a las células.

Ejemplo 11

Introducción de cromosomas artificiales de mamífero en células de insecto

Las células de insecto son huéspedes útiles para MAC, particularmente para su uso en la producción de productos génicos, por varias razones, incluyendo:

1.

Un cromosoma artificial de mamífero proporciona un sitio de integración específico extra-genómico para la introducción de genes que codifican proteínas de interés [posibilidad reducida de mutación en sistema de producción].

2.

El tamaño grande de un cromosoma artificial permite la integración de ADN de tamaño de megabases de modo que los genes que codifican un pasaje entero que conduce a una proteína o no proteína de valor terapéutico, tal como un alcaloide [digitalis, morfina, taxol] puede ser albergados por el cromosoma artificial.

3.

La amplificación de genes que codifican proteínas útiles puede lograrse en el cromosoma de mamífero artificial para obtener mayores rendimientos de proteína en células de insectos.

4.

Las células de insectos soportan modificaciones post-translacionales requeridas (glicosilación, fosforilación) esenciales para la función biológica de las proteínas.

5.

Las células de insecto no soportan virus de mamífero, eliminan la contaminación cruzada del producto con agentes infecciosos humanos.

6.

La capacidad de introducir cromosomas evita los sistemas de baculovirus recombinante tradicionales para la producción de proteínas nutricionales, industriales o medicinales en sistemas de células de insectos.

7.

La baja temperatura óptima para el crecimiento celular de insectos (28°C) permite un costo de energía de producción reducido.

8.

Medio de crecimiento libre de suero para las células de insecto resultarán en costos de producción más bajos.

9.

Las células que contienen cromosomas artificiales pueden almacenarse indefinidamente a baja temperatura.

10.

La larva de insectos servirá como fábricas biológicas para la producción de proteínas nutricionales, medicinales

o industriales mediante microinyección de huevos de insecto fertilizados.

A.

Demostración de que las células de insectos reconocen promotores de mamífero

Los constructos de genes que contienen un promotor mamífero, tales como el promotor de CMV, unido a un gen marcador detectable [gen de luciferasa de Renilla (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No.

5.292.658 para una descripción de ADN que codifica la luciferasa de Renilla y el plásmido pTZrLuc-1, que pueden proporcionar el material de partida para la construcción de dichos vectores, ver también SEQ ID No. 10] y que también incluye el promotor del virus del simio 40 (SV40) unido operativamente al gen de β-galactosidasa se introdujeron en las células de dos especies Trichoplusia ni [oruga de repollo] y Bombyx mori [gusano de seda].

Después de transferir los constructos en las líneas celulares de insecto ya sea mediante electroporación o mediante microinyección, la expresión de los genes marcadores se detectó en ensayos de luciferasa (ver por ejemplo, Ejemplo 12.C.3) y en ensayos de β-galactosidasa (tales como ensayos de tinción de LacZ) después de una incubación de 24 h. En cada caso se obtuvo un resultado positivo en las muestras en las cuales los genes fueron omitidos. Además, se introdujo una fusión entre el promotor de β-actina de B. mori -gen de luciferasa de Renilla en las células de T. ni y B. mori que proporcionó una emisión de luz después de la transfección. Por lo tanto, ciertos promotores de mamíferos funcionan para dirigir la expresión de estos genes marcadores en células de insecto. Por lo tanto, los MAC son candidatos para la expresión de genes heterólogos en células de insectos.

B. Construcción de vectores para su uso en células de insectos y fusión con células de mamíferos

1. Transformar células LMTK- con vector de expresión con:

a.

promotor de β-actina de B. mori - gen marcador seleccionable de Hygr para células de insecto y

b.

promotores de SV40 o CMV que controlan un gen marcador seleccionable de puromicinar para células de mamífero.

2.

Detectar la expresión del promotor de mamífero en células LMTK (células LMTK de puromicinar)

3.

Utilizar células de puromicinar en experimentos de fusión con células de Bómbix y Trichoplusia, seleccionar células Hygr.

C. Inserción de los MAC en células de insecto

Estos experimentos están diseñados para detectar la expresión de un gen marcador detectable [tal como el gen de β-galactosidasa expresado bajo el control de un promotor de mamífero, tal como pSV40] ubicado en un MAC que se ha introducido en una célula de insecto. Los datos indican que se expresó β-gal.

Las células de insecto se fusionan con células de mamífero que contienen cromosomas artificiales de mamífero, por ejemplo, el minicromosoma [EC3/7C5] o el mini y el megacromosoma [tal como GHB42, que es una línea celular reclonada de G3D5] o una línea celular que porta sólo el megacromosoma [tal como H1D3 o un reclón del mismo]. La fusión se lleva a cabo de la siguiente forma:

1.

se mezclan células de mamífero + de insecto (50/50%) en crecimiento de fase logarítmica;

2.

fusión celular calcio/PEG: (10 min - 0,5 h);

3.

se seleccionan heterocariotas (+ 72h).

Pueden utilizarse las siguientes condiciones de selección para seleccionar células de insecto que contienen un MAC: [+ = selección positiva; - = selección negativa]:

1.

crecimiento a 28°C (+ células de insecto, - células de mamífero);

2.

medio de células de insecto de Grace [SIGMA] ( - células de mamífero);

3.

ningún CO2 exógeno (-células de mamífero); y/o

4.

selección de antibióticos (Hyg o G418) (+ células de insecto transformadas).

Inmediatamente después del protocolo de fusión, se observan muchas heterocariotas [eventos de fusión] entre las células de mamífero y cada especie de insecto [hasta el 90% de heterocariotas]. Después del crecimiento [2+ semanas] en un medio de insecto que contiene G418 y/o higromicina a niveles de selección utilizados para la selección de células de mamífero transformadas, se detectan colonias individuales que crecen en las placas de fusión. En virtud de la selección de la resistencia a antibióticos conferida por el MAC y la selección para células de insecto, estas colonias deberían contener MAC.

El promotor del gen de β-actina de B. mori ha demostrado dirigir la expresión del gen de β-galactosidasa en células de B. mori y células de mamífero (por ejemplo, células EC3/7C5). El promotor del gen de β-actina de B. mori es, por lo tanto, particularmente útil para la inclusión en MAC generados en células de mamífero que posteriormente se transferirán en células de insecto debido a que la presencia de cualquier gen marcador unido al promotor puede determinarse en las líneas celulares de mamífero y de insecto resultantes.

Ejemplo 12

Preparación de vectores de fragmentación de cromosomas y otros vectores para la integración dirigida de ADN en MAC

La fragmentación del megacromosoma debería, en última instancia, resultar en cromosomas estables más pequeños que contienen de aproximadamente 15 Mb a 50 Mb que serán más fáciles de manipular para su uso como vectores. Para que los vectores efectúen dicha fragmentación también deberían ayudar en la determinación e identificación de los elementos requeridos para la preparación de un cromosoma artificial producido in vitro.

La reducción en el tamaño del megacromosoma puede lograrse de varias maneras diferentes incluyendo: tratamiento por estrés, tal como mediante supresión o tratamiento con frío o calor; tratamiento con agentes que desestabilizan el genoma o ADN de mella, tal como BrdU, coumarina, EMS y otros; tratamiento con radiación ionizante [ver, por ejemplo, [Brown (1992) Curr. Opin. Genes Dev. 2:479-486]; y fragmentación de cromosomas in vivo dirigido a telómeros [ver, por ejemplo, Farr et al. (1995) EMBO J. 14:5444-5454].

A. Preparación de vectores para la fragmentación del cromosoma artificial y también para la integración dirigida de productos génicos seleccionados

1. Construcción de pTEMPUD

El pTEMPUD plásmido [ver Figura 5] es un vector "destructor" de recombinación homólogo de ratón para una fragmentación de cromosomas in vivo y también para inducir una amplificación a gran escala a través de una integración específica de sitio. Con referencia a la Figura 5, el fragmento SalI-PstI de ~3,625 pb se derivó del vector retroviral pBabe-puro [ver, Morgenstern et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:3587-3596]. Este fragmento contiene ADN que codifica la resistencia a la ampicilina, el origen de replicación de pUC y el gen de puromicina N-acetil transferasa bajo el control del promotor temprano SV0. La porción del gen URA3 proviene del vector de clonación pYAC5 [SIGMA]. URA3 se cortó de pYAC5 con la digestión de SalI-XhoI, se clonó en pNEB193 [New England Biolabs], que luego se cortó con EcoRI-SalI y ligó al sitio Sall de pBabepuro para producir pPU.

Un fragmento de 1293 pb [ver SEQ ID No. 1] que codifica el satélite mayor de ratón, se aisló como un fragmento EcoRI de una biblioteca de ADN producida a partir de células de fibroblastos LMTK-y se insertó en el sitio EcoRI de pPU para producir pMPU.

El gen de toxina diftérica generado por el promotor de TK [DT-A] se derivó de pMC1DT-A [ver, Maxwell et al. (1986) Cancer Res. 46:4660-4666] mediante digestión de BglII-XhoI y se clonó en el vector de expresión poli A pMC1neo [STRATAGENE, La Jolla, CA] mediante el reemplazo de la secuencia de codificación del gen de resistencia a la neomicina. El promotor de TK, el gen DT-A y la secuencia poli A se retiraron de este vector, los extremos cohesivos se llenaron con Klenow y el fragmento resultante se ligó al extremo romo y se ligó en el SnaBI [TACGTA] de pMPU para producir pMPUD.

El fragmento Hutel de 2,5 kb [ver SEQ ID No. 3] se insertó en el sitio Pstl [ver el fragmento de 6100 PstI - 3625 PstI en pTEMPUD] de pMPUD para producir pTEMPUD. Este fragmento incluye un telómero humano. Incluye un sitio de BglII único [ver nucleótidos 1042-1047 de la SEQ ID No.3], que se utilizará como un sitio para la introducción de un telómero sintético que incluye múltiples repeticiones [80] de TTAGGG con extremos BamHI y BglII para la inserción en el sitio de BglII que luego permanecerá único, debido a que la saliente BamHI es compatible con el sitio de BglII. La ligadura de un fragmento BamHI a BglII destruye el sitio de BglII de modo que sólo permanecerá un único sitio de BglII. La selección para el único sitio de BglII asegura que el telómero sintético se insertará en la orientación correcta. El único sitio de BglII es el sitio en el cual el vector se linealiza.

Para generar un telómero sintético compuesto por múltiples repeticiones de la secuencia TTAGGG, se realizaron intentos para clonar o amplificar los productos de ligadura de oligonucleótidos de 30 mer que contienen repeticiones de la secuencia. Se aparearon dos oligonucleótidos de 30 mer conteniendo uno cuatro repeticiones de TTAGGG unidas en cada extremo de la pasada completa de repeticiones por media repetición y conteniendo el otro cinco repeticiones del complemento AATCCC. La molécula de doble hebra resultante con extremos salientes de 3 pb, cada uno representando una mitad de una repetición, se esperaba que se ligara consigo misma para proporcionar concatámeros de n x 30 pb. Sin embargo, este abordaje no fue exitoso, probablemente debido a la formación de ADN cuádruplex de la hebra rica en G. Se han encontrado dificultades similares en intentos para generar repeticiones largas de las unidades II y III satélite humanas pentaméricas. Por lo tanto, parece que, en general, cualquier secuencia de oligómeros que contiene una serie consecutiva periódicamente separada de nucleótidos de guanina es probable que forme una formación de cuádruplex no deseada que impide la construcción de ADN de doble hebra largos que contienen la secuencia.

Por lo tanto, en otro intento para construir un telómero sintético para la inserción en el sitio de BglII de pTEMPUD, el material de partida se basó en la secuencia de repetición rica en C complementaria (es decir, AATCCC) que no sería susceptible para la formación de una estructura de cuádruplex. Dos plásmidos, designados pTEL280110 y pTel280111 se construyeron de la siguiente manera para servir como los materiales de partida.

Primero, un oligonucleótido largo que contenía 9 repeticiones de la secuencia AATCCC (es decir, el complemento de la secuencia de telómeros TTAGGG) en orden inverso unido en cada extremo de la pasada completa de repeticiones por media repetición (por lo tanto, en esencia, que contenía 10 repeticiones) y sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción PstI y PacI se sintetizó utilizando métodos estándar. La secuencia del oligonucleótido es la siguiente: 5'-AAACTGCAGGTTAATTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAAC CCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCGGGAT-3' (SEQ ID NO. 29)

También se sintetizó un oligonucleótido corto parcialmente complementario de la secuencia 3'-TTGGGCCCTAGGCTTAAGG-5' (SEQ ID NO. 30). Los oligonucleótidos se purificaron con gel, aparearon, repararon con polimerasa Klenow y digirieron con EcoRI y PstI. El fragmento EcoRI/PstI resultante se ligó con pUC19 digerido con EcoRI/PstI. El plásmido resultante se utilizó para transformar las células competentes Dh5α de E. coli y el ADN plásmido (pTel102) de uno de los transformantes que sobrevivió a la selección en LB/ampicilina se digirió con Pacl, produjo extremos romos con Klenow y dNTPs y se digirió con HindIII. El fragmento de 2,7 kb resultante se purificó con gel.

Simultáneamente, el mismo plásmido se amplificó mediante la reacción en cadena de polimerasa utilizando cebadores de secuenciación M 13 de 26 mer extendidos y más distales. El producto de amplificación se digirió con Smal y HindIII, el fragmento de 84 pb de doble hebra que contenía la repetición telomérica de 60 pb (más 24 pb de una secuencia enlazante) se aisló en 6% de gel de poliacrilamida nativo y se ligó con pTel102 doblemente digerido para proporcionar una secuencia telomérica de 120 pb. Este plásmido se utilizó para transformar células DH5α. El ADN plásmido de dos de los recombinantes resultantes que sobrevivió a la selección en ampicilina (100 μg/ml) se secuenció en un secuenciador de ADN ABI utilizando el método de finalización de tinte. Uno de los plásmidos, designado pTel29, que contenía una secuencia de 20 repeticiones de la secuencia TTAGGG (es decir, 19 repeticiones sucesivas de TTAGGG unidas en cada extremo de la pasada completa de repeticiones con la mitad de una repetición). El otro plásmido, designado pTel28, se había sometido a una eliminación de 2 pb (TA) en la unión donde las dos secuencias, contendiendo cada una, en esencia, 10 repeticiones de la secuencia TTAGGG se había ligado para proporcionar el plásmido. Esto resultó en un motivo GGGTGGG en la unión en pTel28. Esta mutación proporciona una etiqueta útil en los experimentos de fragmentación de cromosomas dirigidos al telómero. Por lo tanto, el inserto pTel29 se amplificó mediante PCR utilizando cebadores de secuenciación pUC/M 13 en base a la secuencia algo más larga y más lejos del poliligador que lo usual de la siguiente forma:

5'-GCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGT-3' (SEQ ID NO. 31) o en algunos experimentos

5'-GCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC-3' (SEQ ID NO. 32) como el cebador directo m13 y

5'-TATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGAT-3' (SEQ ID NO. 33) como el cebador inverso m13.

El producto de amplificación se digirió con Smal y HindIII. El fragmento de 144 pb resultante se purificó con gel en 6% de gel de poliacrilamida nativo y se ligó con pTel28 que se había digerido con Pacl, se cortó para producir extremos romos con Klenow y dNTP y luego se digirió con HindIII para retirar el enlazante. La ligadura proporcionó un plásmido designado pTel2801 que contenía una secuencia telomérica de 40 repeticiones de la secuencia TTAGGG en la cual una de las repeticiones (es decir, la 30ª repetición) carecía de dos nucleótidos (TA), debido a la eliminación que había ocurrido en pTel28, para proporcionar una repetición de la siguiente forma: TGGG.

En la siguiente etapa de extensión, pTel2801 se digirió con Smal y HindIII y el fragmento de inserto de 264 pb se purificó con gel y se ligó con pTel2801 que se había digerido con Pacl, se cortó para producir extremos romos y se digirió con HindIII. El plásmido resultante se transformó en células DH5α y el ADN plásmido de 12 de los transformantes resultantes que sobrevivió a la selección en ampicilina se examinó mediante análisis de enzimas de restricción para detectar la presencia de un fragmento de inserto EcoRI/PstI de 0,5 kb. Once de los recombinantes contenían el inserto de 0,5 kb esperado. Los insertos de dos de los recombinantes se secuenciaron y se encontró que eran como se esperaba. Estos plásmidos fueron designados pTel280110 y pTel280111. Estos plásmidos, que son idénticos, ambos contienen 80 repeticiones de la secuencia TTAGGG, en la cual dos de las repeticiones (es decir, las 30ª y 70ª repeticiones) carecían de dos nucleótidos (TA), debido a la eliminación que había ocurrido en pTel28, para proporcionar una repetición de la siguiente forma: TGGG. Por lo tanto, en cada una de las etapas de clonación (excepto en la primera), la longitud del telómero sintético se duplicó; es decir, aumentó en tamaño exponencialmente. Su longitud fue de 60x2n pb, en donde n es el número de etapas de clonación de extensión llevadas a cabo. Por lo tanto, en principio (asumiendo que E. coli o cualquier otro huésped microbiano, por ejemplo, levadura, tolera ADN repetitivo en tándem largo), es posible ensamblar cualquier tamaño deseado de repeticiones teloméricas seguras.

En otra etapa de extensión, pTel280110 se digirió con PacI, se cortó para producir extremos romos con polimerasa Klenow en presencia de dNTP, luego se digirió con HindIII. El fragmento de 0,5 kb resultante se purificó con gel. El plásmido pTel280111 se escindió con Smal y HindIII y el fragmento de 3,2 kb se purificó con gel y se ligó al fragmento de 0,5 kb del pTel280110. El plásmido resultante se utilizó para transformar las células DH5α. El ADN plásmido se purificó de los transformantes que sobrevivieron a la selección con ampicilina. Nueve de los recombinantes seleccionados se examinaron mediante análisis de enzimas de restricción para detectar la presencia de un fragmento EcoRI/PstI de 1,0 kb. Se encontró que cuatro de los recombinantes (designados pTlk2, pTlk6, pTlk7 y pTlk8) contenían entonces la secuencia de insertos de ADN de telómeros de 960 pb deseada que incluyó 160 repeticiones de la secuencia TTAGGG en la cual cuatro de las repeticiones carecían de dos nucleótidos (TA), debido a la eliminación que había ocurrido en pTel28, para proporcionar una repetición de la siguiente forma: TGGG. El análisis de la secuencia de ADN parcial del fragmento EcoRI/PstI de dos de estos plásmidos (es decir, pTlk2 y pTlk6) en la cual aproximadamente 300 pb de ambos extremos del fragmento se dilucidaron, confirmó que la secuencia estaba compuesta de repeticiones sucesivas de la secuencia TTAGGG.

Para agregar los sitios PmeI y BglII a la secuencia de telómeros sintética, pTlk2 se digirió con PacI y PstI y el fragmento de 3,7 kb (es decir, pUC19 de 2,7 kb y secuencia de repetición de 1,0 kb) se purificó con gel y se ligó en el extremo cohesivo Pstl con el siguiente oligonucleótido 5'-GGGTTTAAACAGATCTCTGCA-3' (SEQ ID NO. 34). El producto de ligadura posteriormente se reparó con polimerasa Klenow y dNTP, se ligó a sí mismo y se transformó en DH5α de cepa E. coli. Se obtuvo un total de 14 recombinantes que sobrevivieron a la selección en ampicilina. El ADN plásmido de cada recombinante fue capaz de escindirse con BglII lo que indicó que este sitio de restricción único agregado habia sido retenido por cada recombinante. Cuatro de los 14 recombinantes contenían el inserto de telómero sintético de 1 kb, mientras que el inserto de los 10 recombinantes restantes se había sometido a

eliminaciones de varias longitudes. Los cuatro plásmidos en los cuales la secuencia de telómero sintética de 1 kb permaneció intacta fueron designados pTlkV2, pTlkV5, pTlkV8 y pTlkV12. Cada uno de estos plásmidos también podría digerirse con PmeI; además la presencia de ambos sitios BglII y PmeI se verificó mediante análisis de secuencia. Cualquiera de estos cuatro plásmidos puede digerirse con BamHI y BglII para liberar un fragmento que contiene la secuencia de telómero sintético de 1 kb que se liga entonces con pTEMPUD digerido con BglII.

2. Uso de pTEMPUD para fragmentación de cromosomas in vivo

La linealización de pTEMPUD por BglII resulta de una molécula lineal con un telómero humano en un extremo. La integración de este fragmento lineal en el cromosoma, tal como el megacromosoma en células híbridas o cualquier cromosoma de ratón que contiene repeticiones de la secuencia satélite mayor de ratón resulta en una integración del gen de resistencia a la puromicina marcador seleccionable y la escisión del plásmido en virtud del extremo telomérico. El gen DT previene que el fragmento lineal entero se integre mediante eventos aleatorios, debido a que tras la integración y expresión es tóxico. Por lo tanto, una integración aleatoria será tóxica, entonces se seleccionará la integración dirigida al sitio en el ADN dirigido. Dicha integración producirá cromosomas fragmentados.

El cromosoma truncado fragmentado con el telómero nuevo sobrevivirá y el otro fragmento sin el centrómero se perderá. Las fragmentaciones in vivo repetidas resultarán finalmente en la selección del cromosoma artificial en funcionamiento más pequeño posible. Por lo tanto, este vector puede utilizarse para producir minicromosomas de cromosomas de ratón o para fragmentar el megacromosoma. En principio, este vector puede utilizarse para dirigirse a cualquier secuencia de ADN seleccionada en cualquier cromosoma para alcanzar la fragmentación.

3.

Construcción de pTERPUD

Un vector de fragmentación/direccionamiento análogo a pTEMPUD para una fragmentación de cromosomas in vivo y también para inducir una amplificación a gran escala a través de una integración específica de sitio pero que se basa en una secuencia de ADNr de ratón en lugar de un ADN satélite mayor de ratón se ha designado pTERPUD. En este vector, la secuencia de ADN satélite mayor de ratón de pTEMPUD se ha reemplazado con un fragmento BamHI de 4770 pb del clon 161 de megacromosoma que contiene una secuencia que corresponde a los nucleótidos 10.232-15.000 en la SEQ ID NO. 16.

4.

pHASPUD y pTEMPhu3

Los vectores que se dirigen específicamente a cromosomas humanos pueden construirse a partir de pTEMPUD. Estos vectores pueden utilizarse para fragmentar cromosomas humanos específicos, dependiendo de la secuencia satélite seleccionada, para producir minicromosomas humanos y también para aislar centrómeros humanos.

a. pHASPUD

Para hacer al pTEMPUD adecuado para fragmentar cromosomas humanos, la secuencia satélite mayor de ratón se reemplaza por secuencias satélite humanas. A diferencia de cromosomas de ratón, cada cromosoma humano tiene una secuencia satélite única. Por ejemplo, el satélite mayor de ratón se ha reemplazado por una secuencia de ADN α-satélite hexamérica [o satélite alfoide]. Esta secuencia es un fragmento de 813 pb [nucleótido 232-1044 de la SEQ ID No. 2] del clon pS12, depositado en la base de datos EMBL con el número de acceso X60716, aislado de una línea celular de carcinoma de colon humano Colo320 [depositada con el no. de acceso de ATCC CCL 220.1]. El fragmento alfoide de 813 pb puede obtenerse del clon pS12 mediante amplificación de ácido nucleico utilizando cebadores sintéticos, cada uno de los cuales contiene un sitio EcoRI, como se describe a continuación:

cebador directo GGGGAATTCAT TGGGATGTTT CAGTTGA [SEQ ID No. 4]

cebador inverso CGAAAGTCCCC CCTAGGAGAT CTTAAGGA [SEQ ID No. 5].

La digestión del producto amplificado con EcoRI resulta en un fragmento con extremos EcoRI que incluye la secuencia α-satélite humana. Esta secuencia se inserta en pTEMPUD en lugar del fragmento EcoRI que contiene el satélite mayor de ratón para proporcionar pHASPUD.

El vector pHASPUD se linealizó con BglII y se utilizó para transformar células EJ30 (fibroblasto humano) mediante carga de raspaduras. Se obtuvieron veintisiete cepas transformantes resistentes a la puromicina.

b. pTEMPhu3

En pTEMPhu3, la secuencia satélite mayor de ratón se reemplazó por α-satélite específico del cromosoma 3 humano de 3 kb de D3Z1 [depositado con el no. de acceso de ATCC 85434; ver, también Yrokov (1989) Cytogenet. Cell Genet. 51:1114].

5. Uso del pTEMPHU3 para inducir la amplificación en un cromosoma N°3 humano

Cada cromosoma humano contiene una secuencia alfoide específica de cromosoma único. Por lo tanto, pTEMPHU3, que se dirige al α-satélite específico del cromosoma 3 puede introducirse en células humanas en

condiciones selectivas, por las cuales se produce la amplificación a gran escala de la región centromérica del cromosoma 3 y la producción de un cromosoma de novo. Dicha amplificación a gran escala inducida proporciona un medio para inducir la formación de cromosomas de novo y también para la clonación in vivo de fragmentos de cromosoma humano definidos hasta un tamaño de megabases.

Por ejemplo, el punto de rotura en el cromosoma 3 humano se encuentra en el brazo corto cerca del centrómero. Esta región participa en la formación del carcinoma de células renales. Al dirigir pTEMPhu3 a esta región, la amplificación a gran escala inducida puede contener esta región, que puede clonarse entonces utilizando los marcadores bacteriano y de levadura en el vector pTEMPhu3.

El vector de clonación pTEMPhu3 permite no sólo la selección para recombinantes homólogos, sino también para una clonación directa del sitio de integración en YACS. Este vector también puede utilizarse para dirigirse al cromosoma 3 humano, preferiblemente con un brazo corto eliminado, en una línea híbrida de microcélulas monocromosómicas de ratón-humano. Los recombinantes homólogos pueden someterse a amplificación de ácido nucleico (PCR) y la amplificación puede detectarse sistemáticamente mediante hibridación de ADN, hibridación Southern e hibridación in situ. La región amplificada puede clonarse en un YAC. Este vector y estos métodos también permiten un análisis funcional de las regiones de cromosoma clonadas mediante la reintroducción de la región amplificada clonada en células de mamífero.

B. Preparación de bibliotecas en vectores YAC para la clonación de centrómeros e identificación de unidades cromosómicas funcionales

Otro método que puede utilizarse para obtener unidades de cromosoma artificial de mamífero funcionales de tamaño más pequeño y para clonar ADN centromérico implica detectar sistemáticamente bibliotecas en base al vector YAC de ADN de mamífero y análisis funcional de clones positivos potenciales en un sistema de modelo de ratón transgénico. Una biblioteca de ADN de mamífero se prepara en un vector YAC, tal como YRT2 [ver Schedl et al. (1993) Nuc. Acids Res. 21:4783-4787], que contiene el gen de tirosinasa de murino. La biblioteca se somete a hibridación para un telómero de mamífero y sondas de secuencia de centrómeros. Los clones positivos se aíslan y microinyectan en pronúcleos de oocitos fertilizados de ratones NMRI/Han siguiendo técnicas estándar. Los embriones se transfieren entonces en madres adoptivas de NMRI/Han. La expresión del gen de tirosinasa en descendencia transgénica confiere un fenotipo identificable (pigmentación). Se confirmó que los clones que dan lugar a ratones transgénicos que expresan tirosinasa entonces contienen unidades de cromosomas artificiales de mamífero funcionales.

Alternativamente, los fragmentos de SATAC pueden introducirse en vectores YAC y luego introducirse en pronúcleos de oocitos fertilizados de ratones NMRI/Han siguiendo técnicas estándar como se hizo anteriormente. Se confirmó que los clones que dan lugar a ratones transgénicos que expresan tirosinasa entonces contienen unidades de cromosomas artificiales de mamífero funcionales, particularmente centrómeros.

C. Incorporación de genes homólogos en cromosomas artificiales de mamífero a través del uso de vectores de direccionamiento de homología

Tal como se describió anteriormente, el uso de cromosomas artificiales de mamífero para la expresión de genes heterólogos obvia ciertos efectos negativos que pueden resultar de la integración aleatoria de ADN plásmido heterólogo en el genoma de la célula receptora. Una característica esencial del cromosoma artificial de mamífero que lo hace una herramienta útil para evitar los efectos negativos de integración aleatoria es su presencia como una fuente de genes extra-genómica en células receptoras. Por consiguiente, los métodos para una incorporación dirigida, específica de genes heterólogos exclusivamente en el cromosoma artificial de mamífero, sin integración aleatoria externa en el genoma de células receptoras, son deseados para la expresión de genes heterólogos de un cromosoma artificial de mamífero.

Un medio para alcanzar la integración específica de sitio de genes heterólogos en cromosomas artificiales es a través del uso de vectores de direccionamiento de homología. El gen de interés heterólogo se subclona en un vector de direccionamiento que contiene secuencias de ácido nucleico que son homólogas a nucleótidos presentes en el cromosoma artificial. El vector se introduce entonces en células que contienen el cromosoma artificial para la integración específica dirigida al sitio en el cromosoma artificial a través de un evento de recombinación en sitios de homología entre el vector y el cromosoma. Los vectores de direccionamiento de homología también pueden contener marcadores seleccionables para facilitar la identificación de células que tienen incorporado el vector en el cromosoma artificial así como los genes de selección letal que se expresan sólo tras la integración externa del vector en el genoma de célula receptora. Dos vectores de direccionamiento de homología ejemplares, λCF-7 y pλCF-7-DTA, se describen a continuación.

1. Construcción del vector λCF-7

El vector λCF-7 contiene el gen regulador de conductancia de fibrosis quística [CFTR] como un ácido nucleico que codifica una molécula terapéutica ejemplar que puede incorporarse en cromosomas artificiales de mamífero para su uso en aplicaciones de terapia génica. Este vector, que también contiene el gen de resistencia a la puromicina como

un marcador seleccionable, así como el gen Saccharomyces cerevisiae ura3 [orotidina-5-fosfato decarboxilasa], se construyó en una serie de etapas como se describe a continuación.

a. Construcción de pURA

El plásmido pURA se preparó ligando un fragmento SalI/XhoI de 2,6 kb del vector de cromosoma artificial de levadura pYAC5 [Sigma; ver también Burke et al. (1987) Science 236:806-812 para una descripción de los vectores YAC así como el no. de acceso de GenBank U01086 para la secuencia completa de pYAC5] que contiene el gen ura3 de S.cerevisiae con un fragmento SalI/SmaI de 3,3 kb de pHyg [ver, por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos Nos. 4.997.764, 4.686.186 y 5.162.215 y la descripción anterior]. Antes de la ligadura el extremo Xhol se trató con polimerasa Klenow para la ligadura de extremo romo al extremo Smal del fragmento de 3,3 kb de pHyyg. Por lo tanto, pURA contiene el gen ura3 de S.cerevisiae y el origen de replicación de ColE1 de E. coli y el gen de resistencia a la ampicilina. El gen uraE está incluido para proporcionar un medio para recuperar el constructo integrado de una célula de mamífero como un clon de YAC.

b. Construcción de pUP2

El plásmido pURA se digirió con SalI y se ligó a un fragmento SalI de 1,5 kb de pCEPUR. El plásmido pCEPUR se produce ligando el fragmento SnaBI-NhaI de 1,1 kb de pBabe-puro [Morgenstern et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18:3587-3596; proporcionado por el Dr. L. Székely (Microbiology and Tumorbiology Center, Karolinska Institutet, Stockholm); ver, también Tonghua et al. (1995) Chin. Med. J. (Beijing, Engl. Ed.) 108:653-659; Couto et al. (1994) Infect. Immun. 62:2375-2378; Dunckley et al. (1992) FEBS Lett. 296:128-34; French et al. (1995) Anal. Biochem. 228:354-355; Liu et al. (1995) Blood 85:1095-1103; Solicitudes PCT internacionales Nos. WO 9520044; WO 9500178 y WO 9419456] al fragmento NheI-NruI de pCEP4 [Invitrogen].

El plásmido resultante, pUP2, contiene todos los elementos de pURA más el gen de resistencia a la puromicina unido al promotor y señal de poliadenilación de SV40 de pCEPUR.

c. Construcción de pUP-CFTR

El plásmido intermedio pUP-CFTR se generó para combinar los elementos de pUP2 en un plásmido junto con el gen CFTR. Primero, un fragmento SalI de 4,5 kb de pCMV-CFTR que contiene el ADN que codifica CFTR [ver, también, Riordan et al. (1989) Science 245:1066-1073, Patente de los Estados Unidos No. 5.240.846 y no. de acceso de Genbank M28668 para la secuencia del gen CFTR] que contiene el gen CFTR sólo se ligó al pCEP4 digerido por Xhol [Invitrogen y también descrito en la presente] para insertar el gen CFTR en el sitio de clonación múltiple del vector pCEP4 en base al virus Epstein Barr (EBV) [Invitrogen, San Diego, CA; ver también Yates et al. (1985) Nature 313:812-815; ver, también Patente de los Estados Unidos No. 5.468.615] entre el promotor de CMV y la señal de poliadenilación de SV40. El plásmido resultante se designó pCEP-CFTR. El plásmido pCEP-CFTR se digirió entonces con SalI y el fragmento de 5,8 kb que contenía el gen CFTR se flanqueó por el promotor de CMV y la señal de poliadenilación de SV40 se ligó al pUP2 digerido con SalI para generar pUP-CFTR. Por lo tanto, pUP-CFTR contiene todos los elementos de pUP2 más el gen CFTR unido al promotor de CMV y la señal de poliadenilación de SV40.

d. Construcción de λCF-7

El plásmido pUP-CFTR se linealizó entonces mediante digestión parcial con EcoRI y el fragmento de 13 kb que contenía el gen CFTR se ligó con Charon 4Aλ digerido con EcoRI [ver, Blattner et al. (1977) Science 196:161; Williams t Blattner (1979) J. Virol. 29:555 t Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Volumen 1, Sección 2.18, para descripciones de Charon 4Aλ]. El vector resultante, λCF8, contiene el brazo izquierdo del bacteriófago Charon 4Aλ, el gen CFTR unido al promotor de CMV y la señal de poliadenilación de SV40, el gen ura3, el gen de resistencia a la puromicina unido al promotor y señal de poliadenilación de SV40, el promotor de timidina quinasa [TK], el origen de replicación ColE1, el gen de resistencia a la ampicilina y el brazo derecho del bacteriófago Charon 4Aλ. El constructo λCF8 se digirió entonces con Xhol y el resultante 27.1 kb se ligó al fragmento XhoI/EcoRI de 0,4kb de pJBP86 [descrito a continuación] que contenía la señal poliA de SV40 y el brazo derecho Charon 4A λ digerido con EcoRI. El vector λCF-7 resultante contenía el brazo izquierdo Charon 4A λ, el CFTR que codifica ADN unido al promotor de CMV y la señal de poliA de SV40, el gen ura3, el gen de resistencia a la puromicina unido al promotor y la señal poliA de SV40 y el brazo derecho Charon 4A λ. Los fragmentos de ADN de λ proporcionan la codificación de secuencias homólogas a nucleótidos presentes en los cromosomas artificiales ejemplares.

El vector se introduce entonces en células que contienen los cromosomas artificiales ejemplificados en la presente. Por consiguiente, cuando el vector λCF-7 lineal se introduce en líneas celulares de fusión que portan megacromosomas, tales como los descritos en la presente, se integraran específicamente en el megacromosoma a través de recombinación entre las secuencias λ de bacteriófago homólogas del vector y el cromosoma artificial.

2. Construcción del vector λCF-7-DTA El vector λCF-7-DTA también contiene todos los elementos contenidos en λCF-7, pero adicionalmente contiene un marcador de selección letal, el gen de la toxina A de difteria así como el gen de resistencia a la ampicilina y un origen de replicación. Este vector se construyó en una serie de etapas como se describe a continuación.

a. Construcción de pJBP86

El plásmido pJBP86 se utilizó en la construcción de λCF-7, anterior. Un fragmento SalI de 1,5 kb de pCEPUR que contiene el gen de resistencia a la puromicina unido al promotor y señal de poliadenilación de SV40 se ligó al pJB8 digerido por HindIII [ver, por ejemplo, Ish-Horowitz et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9:2989-2998; disponible con el no. de acceso de ATCC 37074; disponible comercialmente de Amersham, Arlington Heights, IL]. Antes de la ligadura los extremos SalI del fragmento de 1,5 kb de pCEPUR y los extremos pJB8 linealizados por th4 HindIII fueron tratados con polimerasa Klenow. El vector resultante pJBP86 contiene el gen de resistencia a la puromicina unido al promotor y la señal poliA de SV40, la región COS de 1,8 kb de Charon 4Aλ, el origen de replicación de ColE1 y el gen de resistencia a la ampicilina.

b. Construcción de pMEP-DTA

Un fragmento XhoI/SalI de 1,1 kb de pMC1-DT-A [ver, por ejemplo, Maxwellet al. (1986) Cancer Res. 46:4660-4666] que contenía el gen de la toxina A de difteria se ligó al pMEP4 digerido con Xhol [Invitrogen, San Diego, CA] para generar pMEP-DTA. Para producir pMC1-DT-A, la región de codificación del gen DTA se aisló como un fragmento PstIHindIII de 800pb del p2249-1 y se insertó en pMC1neopoliA [pMC1 disponible de Stratagene] en lugar del neo gen y bajo el control del promotor de TK. El constructo resultante pMC1DT-A se digirió con HindIII, los extremos llenos por los enlazantes Klenow y SalI se ligaron para producir un casete del gen TK-DTA de 1061 pb con un extremo Xhol [5'] y un extremo SalI que contiene el promotor de TK de 270 pb y el fragmento DT-A de ~790 pb. Este fragmento se ligó en pMEP4 digerido con XhoI.

Por lo tanto, el plásmido pMEP-DTA contiene el gen DT-A unido al promotor de TK y SV40, origen de replicación ColE1 y el gen de resistencia a la ampicilina.

c. Construcción de pJB83-DTA9

El plásmido pJB8 se digirió con HindIII y ClaI y se ligó con un oligonucleótido [ver SEQ ID Nos. 7 y 8 para las hebras sentido y antisentido del oligonucleótido, respectivamente] para generar pJB83. El oligonucleótido que se ligó a pJB8 digerido con ClaI/HindIII contenía los sitios de reconocimiento de las endonucleasas de restricción SwaI, PacI y SrfI. Estos sitios permitirán una linealización lista del constructo pλCF-7-DTA.

Luego, un fragmento XhoI/SalI de 1,4 kb de pMEP-DTA que contenían el gen DT-A se ligó a pJB83 digerido con SalI para generar pJB83-DTA9.

d. Construcción de λCF-7-DTA

Las salientes de 12 pb de λCF-7 se retiraron por nucleasa de frijol mungo y posteriores tratamientos con polimerasa T4. El vector λCF-7 lineal de 41,1 kb resultante se ligó entonces a pFB83-DTA9 que se había digerido con ClaI y tratado con polimerasa T4. El vector resultante, λCF-7-DTA, contiene todos los elementos de λCF-7 así como el gen DT-A unido al promotor de TK y la señal de poliadenilación de SV40, la región Charon 4A λ COS de 1,8 kB, el gen de resistencia a la ampicilina [de pJB83-DTA9] y el origen de replicación Col E1 [de pJB83-DT9A].

D. Vectores de direccionamiento que utilizan marcadores de luciferasa: Plásmido pMCT-RUC

El plásmido pMCT-RUC [14 kpb] se construyó para un direccionamiento específico de sitio del gen de luciferasa de Renilla [ver, por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.292.658 y 5.418.155 para una descripción del ADN que codifica luciferasa de Renilla y el plásmido pTZrLuc-1 que puede proporcionar el material de partida para la construcción de dichos vectores] a un cromosoma artificial de mamífero. Las características relevantes de este plásmido son el gen de luciferasa de Renilla bajo el control transcripcional del potenciador/promotor del gen temprano-inmediato de citomegalovirus humano; gen de resistencia a la higromicina, marcador seleccionable positivo, bajo el control transcripcional del promotor de timidina quinasa. En particular, este plásmido contiene el plásmido pAG60 [ver, por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.118.620, 5.021.344, 5.063.162 y 4.946.952; ver, también Colbert-Garapin et al. (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14], que incluye ADN (es decir, el gen de resistencia a la neomicina) homólogo al minicromosoma, así como los genes de Renilla y de resistencia a la higromicina, el gen HSV-tk bajo el control del promotor de tk como un marcador seleccionable negativo para la recombinación homóloga y un sitio Hpal único para linealizar el plásmido.

Este constructo se introdujo, a través de una transfección con fosfato de calcio, en células EC3/7C5 [ver, Lorenz et al. (1996) J. Biolum. Chemilum. 11:31-37]. Las células EC3/7C5 se mantuvieron como una monocapa [ver, Gluzman (1981) Cell 23:175-183]. Las células a 50% de confluencia en placas de Petri de 100 mm se utilizaron para una transfección con fosfato de calcio [ver, Harper et al. (1981) Chromosoma 83:431-439] utilizando 10 μg de pMCT-RUC linealizado por placa. Las colonias que se originaron a partir de células transfectadas únicas se aislaron y mantuvieron en un medio F-12 que contenía higromicina (300 μg/mL) y 10% de suero bovino fetal. Las células se cultivaron en placas de Petri de 100 mm antes del ensayo de luciferasa de Renilla.

Se llevó a cabo el ensayo de luciferasa de Renilla [ver, por ejemplo, Matthews et al. (1977) Biochemistry 16:85-91]. Las líneas celulares resistentes a la higromicina obtenidas después de la transfección de células EC3/7C5 con el plásmido pMCT-RUC linealizado [líneas celulares "B"] se cultivaron a 100% de confluencia para mediciones de emisión de luz in vivo e in vitro. La emisión de luz se midió in vivo después de aproximadamente 30 generaciones de la siguiente forma: se retiró el medio de crecimiento y se reemplazó por 1 mL de RPMI 1640 que contenía coelenteracina [1 mmol/L de concentración final]. La emisión de luz de las células se visualizó entonces mediante la colocación de las placas de Petri en un analizador de imagen de video de luz baja [Hamamatsu Argus-100]. Después de 5 min. se formó una imagen de acumulación de fotones utilizando 100% de sensibilidad del tubo de conteo de fotones. Para medir la emisión de luz in vitro, las células se tripsinizaron y cosecharon de una placa de Petri, granularon, resuspendieron en 1 mL de solución amortiguadora de ensayo [0,5 mol/L de NaCl, 1 mmol/L de EDTA, 0,1 mol/L de fosfato de potasio, pH 7,4] y se sonicaron en hielo durante 10 s. Los lisados se sometieron a ensayo entonces en un luminómetro TD-20e Turner durante 10 s después de una inyección rápida de 0,5 mL de 1 mmol/L de coelenteracina y el valor promedio de emisión de luz se registró como LU [1 LU = 1,6 x 106 hu/s para este instrumento].

Líneas celulares independientes de células EC3/7C5 transfectadas con el plásmido pMCT-RUC linealizado mostraron diferentes niveles de actividad luciferasa de Renilla. Se observaron similares diferencias en la emisión de luz cuando se realizaron mediciones en lisados de la misma línea celular. Esta variación en emisión de luz fue probablemente debido a un efecto de posición que resulta de la integración aleatoria del plásmido pMCT-RUC en el genoma de ratón, debido a que no se realizó un enriquecimiento para el direccionamiento del sitio del gen de luciferasa en este experimento.

Para obtener poblaciones transfectantes enriquecidas en células en las cuales se había integrado el gen de luciferasa en el minicromosoma, las células transfectadas se cultivaron en presencia de ganciclovis. Este medio de selección negativo selecciona contra células en las cuales el plásmido pMCT-RUC agregado se integró en el genoma EC3/7C5 huésped. Por lo tanto esta selección enriquece la población transfectante de supervivencia con células que contienen pMCT-RUC en el minicromosoma. Las células que sobrevivieron a esta selección se evaluaron en ensayos de luciferasa que revelaron un nivel más uniforme de expresión de luciferasa. Adicionalmente, los resultados de los ensayos de hibridación in situ indicaron que el gen de luciferasa de Renilla estaba contenido en el minicromosoma en estas células, lo que indica además un direccionamiento exitoso de pMCT-RUC en el minicromosoma.

El plásmido pNEM-1, una variante de pMCT-RUC que también contiene ADN de λ para proporcionar una región extendida de homología al minicromosoma [ver, otros vectores de direccionamiento, a continuación], también se utilizó para transfectar células EC3/7C5. Se logró el direccionamiento dirigido al sitio del gen de luciferasa de Renilla y del gen de resistencia a la higromicina en pNEM-1 para el minicromosoma en las células EC3/7C5 receptoras. Esto se verificó mediante análisis de amplificación de ADN y mediante hibridación in situ. Adicionalmente, la expresión del gen de luciferasa se confirmó en ensayos de luciferasa de los transfectantes.

E. Vectores de direccionamiento de secreción de proteínas

El aislamiento de las proteínas heterólogas producido intracelularmente en sistemas de expresión de células de mamífero requiere una interrupción celular en condiciones potencialmente rigurosas y purificación de la proteína recombinante de los contaminantes celulares. El proceso de aislamiento de proteínas puede facilitarse en gran medida mediante la secreción de la proteína producida de forma recombinante en el medio extracelular donde hay menos contaminantes para retirar durante la purificación. Por lo tanto, los vectores de direccionamiento de secreción se han construido para su uso con el sistema de cromosomas artificiales de mamífero.

Un vector modelo útil para demostrar la producción y secreción de la proteína heteróloga en células de mamífero contiene ADN que codifica una proteína reportera fácilmente detectable fusionada a una señal de secreción eficiente que dirige el transporte de la proteína a la membrana celular y la secreción de la proteína de la célula. Los vectores pLNCX-ILRUC y pLNCX-ILRUCλ, descritos a continuación, son ejemplos de dichos vectores. Estos vectores contienen ADN que codifica una proteína de fusión de péptido señal de interleuquina-2 (IL2) -luciferasa de Renilla reniformis. El péptido señal de IL-2 [codificado por la secuencia establecida en la SEQ ID No. 9] dirige la secreción de la proteína de luciferasa, a la cual está unido, de células de mamífero. Tras la secreción de la célula de mamífero huésped, el péptido señal de IL-2 se escinde de la proteína de fusión para entregar una proteína de luciferasa activa, madura al el medio extracelular. La producción y secreción exitosa de esta proteína heteróloga puede detectarse fácilmente realizando ensayos de luciferasa que miden la luz emitida tras la exposición del medio al sustrato de luciferina bioluminiscente de la enzima de luciferasa.

Por lo tanto, esta característica será útil cuando los cromosomas artificiales se utilizan para la terapia génica. La presencia de un cromosoma artificial funcional que porta una fusión IL-Ruc con los genes terapéuticos que acompañan se monitoreará fácilmente. Los fluidos o tejidos corporales pueden tomarse como muestras y evaluarse para expresión de luciferasa mediante la adición de luciferina y cofactores apropiados y observando la bioluminiscencia.

1. Construcción del vector de secreción de proteínas pLNCX-ILRUC

El vector pLNCX-ILRUC contiene un gen de fusión de péptido señal de IL-2 humano - R.reniformis unido al promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV) humano para la expresión constitutiva del gen en células de mamífero. El constructo se preparó como se describe a continuación.

a. Preparación del ADN que codifica la secuencia de señal de IL-2

Un fragmento de ADN de 69-pb que contenía ADN que codifica el péptido señal de IL-2 humano se obtuvo a través de una amplificación de ácido nucleico, utilizando cebadores apropiados para IL-2, de una línea celular HEK 293 [ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 4.518.584 para un ADN que codifica IL-2; ver, también, SEQ ID No. 9; el gen IL-2 y la secuencia de aminoácido correspondiente también se proporciona en los nos. de acceso de la base de datos de secuencias de Genbank K02056 y J00264]. El péptido señal incluye los primeros 20 aminoácidos que se muestran en las traducciones proporcionadas en ambas entradas de Genbank y en la SEQ ID NO. 9. La secuencia de nucleótidos correspondiente que codifica los primeros 20 aminoácidos también se proporciona en estas entradas [ver, por ejemplo, nucleótidos 293-52 del no. de acceso K02056 y los nucleótidos 478-537 del no. de acceso J00264), así como en la SEQ ID NO. 9. Los cebadores de amplificación incluyeron un sitio EcoRI [GAATTC] para subclonar el fragmento de ADN después de la ligadura en pGEMT [Promega]. El cebador directo se establece en la SEQ ID No. 11 y la secuencia del cebador inverso se establece en la SEQ ID No. 12.

TTTGAATTCATGTACAGGATGCAACTCCTG directo [SEQ ID No. 11]

TTTGAATTCAGTAGGTGCACTGTTTGTGAC inverso [SEQ ID No. 12]

b. Preparación del ADN que codifica luciferasa de R. reniformis

La fuente inicial del gen de luciferasa de R. reniformis fue el plásmido pLXSN-RUC. El vector pLXSN [ver, por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.324.655, 5.470.730, 5.468.634, 5.358.866 y Miller et al. (1989) Biotechniques 7:980] es un vector retroviral capaz de expresar ADN heterólogo bajo el control transcripcional del LTR retroviral; también contiene el gen de resistencia a la neomicina unido operativamente para la expresión del promotor de la región temprana de SV40. El gen de luciferasa de R. reniformis se obtuvo a partir del plásmido pTZrLuc-1 [ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 5.292.658; ver también el no. de acceso de la base de datos de secuencias de Genbank M63501 y ver también Lorenz et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:4438-4442] y se muestra como SEQ ID NO. 10. El fragmento EcoRI/Smal de 0,97 kb de pTZrLuc-1 contiene la región de codificación del ADN que codifica luciferasa de Renilla. El vector pLXSN se digirió y ligó con el gen de luciferasa contenido en un pLXSN-RUC, que contiene el gen de luciferasa ubicado unido operativamente al LTR viral y corriente arriba del promotor de SV40, que dirige la expresión del gen de resistencia a la neomicina.

c. Fusión del ADN que codifica el péptido señal de IL-2 y el gen de luciferasa de R. reniformis para proporcionar pLXSN-ILRUC

El vector pGEMT que contiene el ADN que codifica un péptido señal de IL-2 descrito en 1.a. anterior se digirió con EcoRI y el fragmento resultante que codifica el péptido señal se ligó al pLXSN-RUC digerido con EcoRI. El plásmido resultante, llamado pLXSN-ILRUC, contiene el ADN que codifica el péptido señal de IL-2 ubicado inmediatamente corriente arriba del gen R. reniformis en pLXSN-RUC. El plásmido pLXSN-ILRUC se utilizó entonces como una plantilla para la amplificación de ácido nucleico del gen de fusión para agregar un sitio SmaI en el extremo 3' del gen de fusión. El producto de amplificación se subclonó en pGEMT linealizado [digerido con EcoRI/SmaI] [Promega] para generar ILRUC-pGEMT.

d. Introducción del gen de fusión en un vector que contiene elementos de control para la expresión en células de mamífero

El plásmido ILRUC-pGEMT se digirió con KspI y SmaI para liberar un fragmento que contenía el gen de fusión de péptido señal de IL-2 - luciferasa que se ligó a pLNCX digerido con HpaI. El vector pLNCX [ver, por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.324.655 y 5.457.182; ver, también Miller y Rosman (1989) Biotechniques 7:980-990] es un vector retroviral para la expresión de ADN heterólogo bajo el control del promotor de CMV; también contiene el gen de resistencia a la neomicina bajo el control transcripcional de un promotor viral. El vector que resulta de la reacción de ligadura se designó pLNCX-ILRUC. El vector pLNCX-ILRUC contiene el gen de fusión de péptido señal de IL-2 - luciferasa ubicado inmediatamente corriente abajo del promotor de CMV y corriente arriba del LTR 3' viral y señal de poliadenilación en pLNCX. Este arreglo proporciona la expresión del gen de fusión bajo el control del promotor de CMV. La ubicación del ADN que codifica la proteína heteróloga [es decir, el gen de luciferasa] en unión operativa con el ADN que codifica el péptido señal de IL-2 proporciona la expresión de la fusión en células de mamífero transfectadas con el vector de modo que la proteína heteróloga se secreta de la célula huésped en el medio extracelular.

2. Construcción del vector de secreción de proteínas pLNCX-ILRUCλ

El vector pLNCX-ILRUC puede modificarse de modo que puede utilizarse para introducir el gen de fusión de péptido señal de IL-2 -luciferasa en un cromosoma artificial de mamífero en una célula huésped. Para facilitar la incorporación específica del vector de expresión pLNCX-ILRUC en un cromosoma artificial de mamífero, se agregan las secuencias de ácido nucleico que son homólogas a los nucleótidos presentes en el cromosoma artificial al vector para permitir una recombinación dirigida al sitio.

Los cromosomas artificiales ejemplares descritos en la presente contienen el ADN de bacteriófago λ. Por lo tanto, el vector pLNCX-ILRUCλ de direccionamiento de secreción de proteínas se preparó mediante la adición del ADN de bacteriófago λ [de los brazos Charon 4A] para producir el vector de secreción pLNCX-ILRUC.

3. Expresión y secreción de luciferasa de R. reniformis de células de mamífero

a. Expresión de luciferasa de R. reniformis utilizando pLNCX-ILRUC

Las células de mamífero [LMTK- de ATCC] se transfectaron transitoriamente con el vector pLNCX-ILRUC [~ 10 μg] mediante electroporación [BIORAD, realizada de acuerdo con las instrucciones del fabricante]. También se han preparado transfectantes estables producidos mediante el crecimiento en G418 para una neo selección.

Los transfectantes se cultivaron y luego analizaron para la expresión de luciferasa. Para determinar si la luciferasa activa se secretó a partir de las células transfectadas, los medios de cultivo se sometieron a ensayo para luciferasa mediante la adición de coelenteracina [ver, por ejemplo, Matthews et al. (1977) Biochemistry 16:85-91].

Los resultados de estos ensayos establecen que el vector pLNCX-ILRUC es capaz de proporcionar una expresión constitutiva de ADN heterólogo en células huésped de mamífero. Además, los resultados demuestran que el péptido señal de IL-2 humano es capaz de dirigir la secreción de proteínas fusionadas al extremo C terminal del péptido. Adicionalmente, estos datos demuestran que la proteína luciferasa de R. reniformis es una molécula reportera altamente efectiva, que es estable en un ambiente de células de mamífero y forma la base de un ensayo fácil, sensible para la expresión de genes.

b. La luciferasa de Renilla reniformis parece secretarse a partir de células LMTK

(i) Ensayo de luciferasa de Renilla de granulados celulares

Se evaluaron las siguientes células:

células sin vector: células LMTK-sin vector como un testigo negativo;

células transfectadas sólo con pLNCX;

células transfectadas con RUC-pLNCX [gen de luciferasa de Renilla en un vector pLNCX];

células transfectadas con pLNCX-ILRUC [vector que contiene el gen de fusión de secuencia líder IL-2 + luciferasa de Renilla en vector pLNCX].

Cuarenta y ocho horas después de la electroporación, se recogieron las células y el medio de cultivo. El granulado celular de 4 placas de células se resuspendió en 1 ml de solución amortiguadora de ensayo y se lisó mediante sonicación. Doscientos μl del granulado celular resuspendido se utilizaron para cada ensayo para la actividad luciferasa [ver, por ejemplo, Matthews et al. (1977) Biochemistry 16:85-91]. El ensayó se repitió tres veces y se obtuvo la medición de bioluminiscencia promedio.

Los resultados mostraron que hubo una bioluminiscencia de fondo relativamente baja en las células transformadas con pLNCX o las células testigo negativas; se observó un nivel bajo en el granulado celular de células que contenían el vector con el gen de fusión de la secuencia líder de IL-2-luciferasa y más de 5000 RLU en la muestra de las células que contenían RUC-pLNCX.

(ii) Ensayo de luciferasa de Renilla del medio celular

Cuarenta milímetros de medio de 4 placas de células se cultivaron y se centrifugaron. Doscientos microlitros de medio se utilizaron para cada ensayo de actividad de luciferasa. El ensayo se repitió varias veces y se obtuvo la medición de bioluminiscencia promedio. Estos resultados mostraron que un nivel relativamente alto de bioluminiscencia se detectó en el medio celular de células transformadas con pLNCX-ILRUC; aproximadamente niveles 10 veces más bajos [levemente por encima de los niveles de fondo en el medio de células sin vector o transfectadas sólo con pLNCX] se detectaron en las células transfectadas con RUC-pLNCX.

(iii) conclusiones

Los resultados de estos experimentos demostraron que la luciferasa de Renilla parece secretarse de células LMTKbajo la dirección del péptido señal de IL-2. El medio de células transfectadas con ADN que codifica luciferasa de Renilla unido al ADN que codifica la señal de secreción de IL-2 tenía niveles sustancialmente más altos de actividad luciferasa de Renilla que testigos o células que contenían ADN que codifica luciferasa sin el ADN que codifica el péptido señal. Asimismo, las diferencias entre los testigos y las células que contenían el ADN que codifica luciferasa demuestran que la actividad luciferasa es específicamente de la luciferasa, no de una reacción no específica.

Además, los resultados del medio de células transfectadas con RUC-pLNCX, que es similar al fondo, muestran que la actividad luciferasa en el medio no viene de la lisis celular, pero sí de la luciferasa secretada.

c. Expresión de luciferasa de R. reniformis utilizando pLNCX-ILRUCλ

Para expresar el gen de fusión de péptido de señal de IL-2-R. reniformis de un cromosoma artificial de mamífero, el vector pLNCX-ILRUCλ se dirige para una integración específica de sitio en un cromosoma artificial de mamífero a través de una recombinación homóloga de las secuencias de ADN de λ contenidas en el cromosoma y el vector. Esto se logra mediante la introducción de pLNCX-ILRUCλ en una línea celular de fusión que aloja cromosomas artificiales de mamífero o células huésped de mamífero que contienen cromosomas artificiales de mamífero. Si el vector se introduce en una línea celular de fusión que aloja los cromosomas artificiales, por ejemplo, a través de una microinyección del vector o transfección de la línea celular de fusión con el vector, las células se cultivan en condiciones selectivas. Los cromosomas artificiales, que se han incorporado en el vector pLNCX-ILRUCλ, se aíslan de las células supervivientes, utilizando procedimientos de purificación como se describió anteriormente y luego se inyectan en las células huésped de mamífero.

Alternativamente, las células huésped de mamífero pueden inyectarse primero con cromosomas artificiales de mamífero que se han aislado de una línea celular de fusión. Las células huésped luego se transfectan con el vector pLNCX-ILRUCλ y se cultivan.

Las células huésped recombinantes entonces se someten a prueba para expresión luciferasa como se describió anteriormente.

F. Otros vectores de direccionamiento

Estos vectores, que están basados en el vector pMCT-RUC, dependen de una selección positiva y negativa para asegurar la inserción y selección para los recombinantes dobles. Un único cruce resulta en la incorporación del DT-A, que destruye la célula, la recombinación de cruce doble elimina el gen DT-1.

1. El plásmido pNEM1 contiene: DT-A: Gen de toxina diftérica (marcador seleccionable negativo) Hyg: Gen de higromicina (marcador seleccionable positivo) ruc: Gen de luciferasa de Renilla (marcador no seleccionable)

1: Promotor de LTR-MMTV

2: Promotor de TK

3: Promotor de CMV MMR: Región de homología (plásmido pAG60)

2.

Los plásmidos pNEM-2 y -3 son similares a pNEM 1 excepto para diferentes marcadores seleccionables negativos: pNEM-1: gen de toxina diftérica como marcador seleccionable "-"

pNEM-2: gen antisentido de higromicina como marcador seleccionable "-" pNEM-3: gen HSV-1 de timidina quinasa como marcador seleccionable "-"

3.

Homología en base a plásmido - ADN de λ: pNEMλ-1: vector base pNEMλ-2: vector base que contiene p5 = gen

1: Promotor de LTR MMTV

2: Promotor de SV40

3: Promotor de CMV

4: Promotor de μTIIA (promotor del gen de metalotioneína)

-

región de homología (plásmido pAG60)

Regiones de homología λ L.A. y λ R.A. para los brazos λ izquierdo y derecho (λ gt-WES).

Ejemplo 13

Microinyección de células de mamífero con ADN plásmido

Estos procedimientos se utilizarán para microinyectar MAC en células eucariotas, incluyendo células de mamífero y de insecto.

La técnica de microinyección se basa en el uso de pequeños capilares de vidrio como un sistema de administración en células y se ha utilizado para la introducción de fragmentos de ADN en núcleos [ver, por ejemplo, Chalfie et al. (1994) Science 263:802-804]. Permite la transferencia de casi cualquier tipo de molécula, por ejemplo, hormonas, proteínas, ADN y ARN, en el citoplasma o núcleos de las células receptoras. Esta técnica no tiene restricción en el tipo de células y es más eficiente que otros métodos, incluyendo una transferencia de genes mediada por Ca2+ y transferencia de genes mediada por liposomas. Aproximadamente 20-30% de las células inyectadas se transforman de manera exitosa.

La microinyección se realiza bajo un microscopio de contraste de fases. Un microcapilar de vidrio, precargado con la muestra de ADN, se dirige a una célula para inyectarse con la ayuda de un micromanipulador. Un volumen de muestra apropiado (1-10 pl) se transfiere en la célula mediante suave presión de aire ejercida por un transyector conectado al capilar. Las células receptoras se cultivan en portaobjetos de vidrio grabados con cuadrados numerados para la localización conveniente de las células inyectadas.

a. Materiales y equipo

Placas de cultivo de tejido Nunclon de 35 x 10 mm, pCH110 de ADN plásmido de línea celular de ratón EC3/7C5 [Pharmacia], proteína fluorescente verde purificada (GFP) [GFPs de Aequorea y Renilla se ha purificado y también el ADN que codifica GFP se ha clonado; ver, por ejemplo, Prasher et al. (1992) Gene 111:229-233; Solicitud PCT Internacional No. WO 95/07463, que se basa en la Solicitud de los Estados Unidos No. de serie 08/119.678 y Solicitud de los Estados Unidos No. de serie 08/192.274], microscopio ZEISS Axiovert 100, transyector 5246 Eppendorf, micromanipulador 5171 Eppendorf, cubreobjetos Eppendorf Cellocate, microcargadores Eppendorf, Femtotips Eppendorf y otros equipos estándar.

b. Protocolo para inyectar

(1)

Las células de fibroblastos se cultivan en platos de cultivo de tejido de 35 mm (37°C, 5% de CO2) hasta que la densidad celular alcanza el 80% de confluencia. Los platos se retiran de la incubadora y el medio se agrega a una profundidad de aproximadamente 5mm.

(2)

El plato se coloca en el portaplato y las células se observan con un objetivo 10 x; el foco se encuentra de manera deseable sobre la superficie celular.

(3)

La solución de ADN plásmido o cromosómico [1 ng/μl] y la solución de proteína GFP se purifican además mediante una centrifugación de la muestra de ADN a una fuerza suficiente para retirar cualquier desecho particular [típicamente aproximadamente 10.000 rpm durante 10 minutos en una microcentrífuga].

(4)

Se cargan 2 μl de la solución de ADN (1 ng/μl) en un microcapilar con un microcargador Eppendorf. Durante la carga, el cargador se inserta al extremo de la punta del microcapilar. Se cargaGFP (1 mg/ml) con el mismo procedimiento.

(5)

La vaina protectora se retira del microcapilar y el microcapilar se fija en el soporte del capilar conectado con el micromanipulador.

(6)

La punta del capilar se baja a la superficie del medio y se enfoca en las células gradualmente hasta que la punta del capilar alcanza la superficie de una célula. El capilar se baja más de modo que la punta se inserta en la célula. Varios parámetros, tales como el nivel del capilar, el tiempo y presión, se determinan para el equipo particular. Por ejemplo, utilizando la línea celular de fibroblastos C5 y el equipo indicado anteriormente, las mejores condiciones son: tiempo de inyección 0,4 segundos, presión 80 psi. El ADN puede inyectarse entonces automáticamente a los núcleos de las células.

(7)

Después de la inyección, las células se devuelven a la incubadora y se incuban durante aproximadamente 18-24 horas.

(8)

Después de la incubación el número de transformantes puede determinarse mediante un método adecuado, lo que depende del marcador de selección. Por ejemplo, si se utiliza la proteína fluorescente verde, el ensayo puede

realizarse utilizando una fuente de luz UV y un filtro fluorescente configurado 0-24 horas después de la inyección. Si el ADN que contiene β-gal, tal como ADN derivado de pHC110, se ha inyectado, entonces los transformantes pueden someterse a ensayo para β-gal.

(c)

Detección de β-galactosidasa en células inyectadas con ADN plásmido

El medio se retira de la placa de cultivo y las células se fijan mediante la adición de 5 ml de solución de fijación I: (1% de glutaraldehído; solución amortiguadora de fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,0; MgCl21 mM), y se incuban durante 15 minutos a 37° C. La solución de fijación I se reemplaza con 5 ml de solución X-gal II: [0,2% de X-gal, solución amortiguadora de fosfato de sodio 10 mM (pH 7,0), NaCl 150 mM, MgCl21 mM, K4Fe(CN)6H2O 3,3 mM, K3Fe(CN)6 3,3 mM] y las placas se incuban durante 30-60 minutos a 37°C. La solución X-gal se retira y se agregan 2 ml de 70% glicerol a cada plato. Las células teñidas de azul se identifican bajo un microscopio de luz.

Este método se utilizará para introducir un MAC, particularmente el MAC con el megacromosoma anti-VIH, para producir un modelo de ratón para actividad anti-VIH.

Ejemplo 14

Animales no humanos transgénicos

Los animales no humanos transgénicos pueden generarse de modo que expresen genes heterólogos que confieren rasgos deseados, por ejemplo, resistencia a una enfermedad, en los animales. Un ratón transgénico se prepara para servir como un modelo de un animal resistente a una enfermedad. Los genes que codifican las vacunas o que codifican las moléculas terapéuticas pueden introducirse en embriones o células ES para producir animales que expresan el producto génico y por lo tanto son resistentes o menos susceptibles a un trastorno particular.

El megacromosoma artificial de mamífero y otros de los cromosomas artificiales, particularmente los SATAC, pueden utilizarse para generar animales no humanos transgénicos, incluyendo mamíferos y aves, que expresan de manera estable genes que confieren rasgos deseados, tales como genes que confieren resistencia a virus patogénicos. Los cromosomas artificiales también pueden utilizarse para producir animales no humanos transgénicos, tales como cerdos, que pueden producir órganos inmunológicamente humanizados para un xenotransplante.

Por ejemplo, los ratones transgénicos que contienen un transgén que codifica una ribozima anti-VIH proporcionan un modelo útil para el desarrollo de animales no humanos transgénicos estables utilizando estos métodos. Los cromosomas artificiales pueden utilizarse para producir animales no humanos transgénicos, particularmente, vacas, cabras, ratones, bueyes, camellos, cerdos y ovejas, que producen la proteína de interés en su leche; y para producir pollos transgénicos y otras aves de corral que producen huevos, que producen proteínas terapéuticas u otras proteínas de interés en sus huevos. Por ejemplo, se conoce el uso de promotores específicos de glándulas mamarias para la expresión de ADN heterólogo en leche [ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 4.873.316]. En particular, un promotor específico de leche o un promotor, preferiblemente unido a un péptido señal específico de leche, específicamente activado en tejido de mamífero está unido operativamente al ADN de interés, proporcionando así una expresión de esa secuencia de ADN en leche.

1. Desarrollo de ratones transgénicos testigo que expresan la ribozima anti-VIH

Los ratones transgénicos testigo se generan para comparar la estabilidad y cantidades de expresión transgénica en ratones desarrollados utilizando un ADN transgén portado en un vector (ratones testigo) con la expresión en ratones desarrollados utilizando transgenes portados en un megacromosoma artificial.

a. Desarrollo de ratones transgénicos testigo que expresan β-galactosidasa

Un conjunto de ratones transgénicos testigo se generó mediante microinyección de embriones de ratón con el gen de β-galactosidasa solo.

El procedimiento de microinyección utilizado para introducir el ADN plásmido en los embriones de ratón es como se describe en el Ejemplo 13, pero modificado para su uso en embriones [ver, por ejemplo, Hogan et al. (1994) Manipulating the Mouse Embryo, A: Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, ver especialmente las páginas 255-264 y Apéndice 3]. Los embriones de ratón fertilizados [Cepa CB6 obtenida de Charles River Co.] se inyectaron con 1 ng de plásmido pCH 110 (Pharmacia) que se había linealizado mediante digestión con BamHI. Este plásmido contiene el gen de β-galactosidasa unido al promotor tardío de SV40. El producto del gen de β-galactosidasa proporciona un marcador fácilmente detectable para una expresión transgénica exitosa. Más aun, estos ratones testigo proporcionan confirmación del procedimiento de microinyección utilizado para introducir el plásmido en los embriones. Adicionalmente, debido a que el megacromosoma que se transfiere a los embriones de ratón en el sistema modelo (ver a continuación) también contiene el gen de β-galactosidasa, los ratones transgénicos testigo que se han generado mediante inyección de pCH110 en embriones sirven como un sistema análogo para la comparación de la expresión del gen heterólogo de un plásmido con respecto a un gen portado en un cromosoma artificial.

Después de la inyección, los embriones se cultivan en un medio HTF modificado bajo 5% de CO2 a 37°C durante un día hasta que se dividen para formar dos células. Los embriones de dos células se implantan entonces en ratones hembra como madres adoptivas [para procedimientos ver, Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual (1994) Hogan et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, página 127 et seq.].

b. Desarrollo de ratones transgénicos testigo que expresan la ribozima anti-VIH

Un conjunto de ratones transgénicos testigo que contienen el gen de ribozima anti-VIH se generó mediante microinyección de embriones de ratón con el plásmido pCEPUR-132 que contiene tres genes diferentes: (1) ADN que codifica una ribozima anti-VIH, (2) el gen de resistencia a la puromicina y (3) el gen de resistencia a la higromicina. El plásmido pCEPUR-132 se construyó mediante la ligadura de porciones del plásmido pCEP-132 que contiene el gen de ribozima anti-VIH (denominado ribozima D por Chang et al. [(1990) Clin. Biotech. 2:23-31]; ver también Patente de los Estados Unidos No. 5.144.019 de Rossi et al., particularmente la Figura 4 de la patente) y el gen de resistencia a la higromicina con una porción del plásmido pCEPUR que contiene el gen de resistencia a la puromicina.

El plásmido pCEP-132 se construyó de la siguiente forma. El vector pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA; ver también Yates et al. (1985) Nature 313:812-815) se digirió con Xhol que se escinde en la región del sitio de clonación múltiple del vector. Este vector de ~10,4 kb contiene el gen de resistencia a la higromicina unido al promotor del gen de timidina quinasa y señal de poliadenilación, así como el gen de resistencia a la ampicilina y los genes del origen de replicación ColE 1 y EBNA-1 (antígeno nuclear del virus de Epstein-Barr) y OriP. El sitio de clonación múltiple se flanquea mediante el promotor de citomegalovirus y la señal de poliadenilación de SV40.

Se ligó pCEP4 digerido con XhoI con un fragmento obtenido mediante la digestión del plásmido 132 (ver Ejemplo 4 para una descripción de este plásmido) con XhoI y SalI. Este fragmento XhoI/SalI contiene el gen de ribozima anti-VIH unido al extremo 3' a la señal poliadenilación de SV40. El plásmido resultante de esta ligadura se designó pCEP-132. Por lo tanto, en efecto, pCEP-132 comprende pCEP4 con el gen de ribozima anti-VIH y señal de poliadenilación de SV40 insertados en el sitio de clonación múltiple para la expresión impulsada por el promotor de CMV del gen de ribozima anti-VIH.

Para generar pCEPUR-132, pCEP-132 se ligó con un fragmento de pCEPUR. Se preparó pCEPUR mediante la ligadura de un fragmento de 7,7 kb generado tras la digestión NheI/NruI de pCEP4 con un fragmento de NheI/SnaBI de 1,1 kb de pBabe [ver Morgenstern y Land (1990) Nucleic Acids Res. 18:3587-3596 para una descripción de pBabe] que contiene el gen de resistencia a la puromicina unido en el extremo 5' al promotor de SV40. Por lo tanto, pCEPUR está compuesto de los genes de resistencia a la ampicilina y EBNA1, así como los elementos CoIE1 y OriP de pCEP4 y el gen de resistencia a la puromicina de pBabe. El gen de resistencia a la puromicina en pCEPUR está flanqueado por el promotor de SV40 (de pBabe) en el extremo 5' y la señal de poliadenilación de SV40 (de pCEP4) en el extremo 3'.

El plásmido pCEPUR se digirió con XhoI y SalI y el fragmento que contiene el gen de resistencia a la puromicina unido en el extremo 5' al promotor de SV40 se ligó con pCEP-132 digerido con Xhol para proporcionar el plásmido de ~12,1 kb designado pCEPUR-132. Por lo tanto, pCEPUR-132, en efecto comprende pCEP-132 con el gen de resistencia a la puromicina y el promotor de SV40 insertados en el sitio Xhol. Los elementos principales de pCEPUR132 son el gen de resistencia a la higromicina unido al promotor de timidina quinasa y la señal de poliadenilación, el gen de ribozima anti-VIH unido al promotor de CMV y la señal de poliadenilación de SV40 y el gen de resistencia a la puromicina unido al promotor de SV40 y la señal de poliadenilación. El plásmido también contiene los genes de resistencia a la ampicilina y EBNA1 y el origen de replicación ColE1 y OriP.

Los cigotos se prepararon a partir de ratones hembra (C57BL/6JxCBA/J) F1 [ver, por ejemplo, Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual (1994) Hogan et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, página 429], que se habían apareado previamente con un macho (C57BL/6JxCBA/J) F1. Los núcleos del macho de estos cigotos F2 se inyectaron [ver, Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual (1994) Hogan et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY] con pCEPUR-132 (~3 μg/ml), que se había linealizado mediante la digestión con Nrul. Los huevos inyectados se implantaron entonces en ratones hembra como madres adoptivas para el desarrollo en descendencia transgénica.

Esta descendencia portadora primaria se analizó (como se describe más adelante) para la presencia del transgén en ADN aislado de células de la cola. A siete ratones portadores que contenían los transgenes en sus células de la cola (pero que pueden no portar el transgén en todas sus células, es decir, pueden ser quiméricos) se les permitió aparearse para producir heterocigotos no quiméricos o de línea germinal. Los heterocigotos, a su vez, se cruzaron para generar descendencia transgénica de homocigotos.

2. Desarrollo de ratones transgénicos modelo utilizando cromosomas artificiales de mamífero

Los embriones de ratón fertilizados se microinyectan (como se describió anteriormente) con los megacromosomas (1-10 pL que contiene 0-1 cromosomas/pL) aislados de la línea celular de fusión G3D5 o H1D3 (descrita anteriormente). Los megacromosomas se aíslan como se describe en la presente. Los megacromosomas aislados de cada línea celular portan el gen de ribozima anti-VIH (ribozima D) así como los genes de resistencia a la higromicina y de β-galactosidasa. Los embriones inyectados se desarrollan entonces en ratones transgénicos como se describió anteriormente.

Alternativamente, la línea celular G3D5* o H1D3* que contiene el megacromosoma se fusiona con las células madre embrionarias [ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 5.453.357, disponible comercialmente; ver Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual (1994) Hogan et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, páginas 253-289] siguiendo procedimientos estándar [ver también, por ejemplo, Guide to Techniques in Mouse Development in Methods in Enzymology Vol. 25, Wassarman y De Pamphilis, eds. (1993), páginas 803-932]. (También es posible administrar megacromosomas aislados en células madre embrionarias utilizando el procedimiento de microcélulas [tal como el descrito anteriormente].) Las células madre se cultivan en presencia de un fibroblasto [por ejemplo, fibroblastos STO que son resistentes a la higromicina y puromicina]. Las células de la línea celular de fusión resultante, que contienen megacromosomas que portan los transgenes [es decir, genes de ribozima anti-VIH, resistencia a la higromicina y β-galactosidasa], se trasplantan entonces en blastocitos de ratón, que a su vez se implantan en un ratón hembra como madre adoptiva en donde se producirá el desarrollo de un ratón transgénico.

Los ratones generados mediante este método son quiméricos; los transgenes se expresarán sólo en ciertas áreas del ratón, por ejemplo, la cabeza y por lo tanto no pueden expresarse en todas las células.

3. Análisis de ratones transgénicos para la expresión transgénica

Al comenzar cuando los ratones transgénicos, generados como se describió anteriormente, tienen de tres a cuatro semanas de edad pueden analizarse para una expresión estable de los transgenes que se transfirieron en los embriones [o huevos fertilizados] de los cuales se desarrollan. Los ratones transgénicos pueden analizarse de varias formas tal como se indica a continuación.

a. Análisis de células obtenidas de los ratones transgénicos

Las muestras de células [por ejemplo, células de bazo, hígado y riñón, linfocitos, células de la cola] se obtienen de ratones transgénicos. Cualquier célula puede evaluarse para la expresión transgénica. Sin embargo, si los ratones son quimeras, generadas por microinyección de huevos fertilizados o mediante fusión de células madre embrionarias con células que contienen megacromosomas, se espera que sólo las células de áreas del ratón que portan el transgén expresen el transgén. Si las células sobreviven al crecimiento en higromicina [o higromicina y puromicina o neomicina, si las células se obtienen de ratones generados por transferencia de ambos genes de resistencia a antibióticos], esta es una indicación de que expresan establemente los transgenes. También puede analizarse ARN aislado de las células de acuerdo con métodos estándar mediante procedimientos northern blot para determinar si las células expresan transcriptos que se hibridan con sondas de ácido nucleico en base a los genes de resistencia a antibióticos. Adicionalmente, las células obtenidas de ratones transgénicos también pueden analizarse para la expresión de β-galactosidasa utilizando ensayos estándar para esta enzima marcadora [por ejemplo, mediante tinción directa del producto de una reacción que implica β-galactosidasa y el sustrato X-gal, ver, por ejemplo, Jones (1986) EMBO 5:3133-3142 o mediante cualquier medición de la actividad de β-galactosidasa, ver, por ejemplo, Miller (1972) en Experiments in Molecular Genetics páginas 352-355, Cold Spring Harbor Press]. El análisis de la expresión de β-galactosidasa se utiliza particularmente para evaluar la expresión transgénica en células obtenidas de ratones transgénicos testigo en los cuales el único transgén que se transfiere en el embrión fue el gen de β-galactosidasa.

La expresión estable del gen de ribozima anti-VIH en las células obtenidas de los ratones transgénicos puede evaluarse de varias formas. Primero, el ADN aislado de las células de acuerdo con procedimientos estándar puede someterse a una amplificación de ácido nucleico utilizando los cebadores correspondientes a la secuencia de genes de ribozima. Si el gen está contenido dentro de las células, se detecta un producto amplificado de tamaño predeterminado tras la hibridación de la mezcla de reacción a una sonda de ácido nucleico en base a la secuencia de genes de ribozima. Más aun, el ADN aislado de las células puede analizarse utilizando métodos de Southern blot para la hibridación con dicha sonda de ácido nucleico. Segundo, el ARN aislado de las células puede someterse a hibridación de northern blot para determinar si las células expresan el ARN que se hibrida con sondas de ácido nucleico en base al gen de ribozima. Tercero, las células pueden analizarse para determinar la presencia de la actividad de ribozima anti-VIH como se describió, por ejemplo, en Chang et al. (1990) Clin. Biotech. 2:23-31. En este análisis, el ARN aislado de las células se mezcla con ARN objetivo gag VIH etiquetado radioactivamente que puede obtenerse mediante transcripción in vitro de la plantilla del gen gag en condiciones de reacción favorables para una escisión in vitro del objetivo gag, tales como aquellas descritas en Chang et al. (1990) Clin. Biotech. 2:23-31. Después de que la reacción se ha detenido, la mezcla se analiza mediante electroforesis con gel para determinar si se detectan productos de escisión más pequeños en tamaño que la plantilla completa; la presencia de dichos fragmentos de escisión indica la presencia de ribozima expresada de forma estable.

b. Análisis de ratones transgénicos enteros

Los ratones transgénicos enteros que se han generado mediante la transferencia del gen de ribozima anti-VIH [así como los genes de selección y marcadores] en embriones o huevos fertilizados pueden analizarse adicionalmente para la expresión transgénica desafiando los ratones con la infección con VIH. Es posible infectar ratones con VIH tras una inyección intraperitoneal con células U937 infectadas con VIH de alta producción [ver, por ejemplo, Locardi et al. (1992) J. Virol. 66:1649-1654]. Puede confirmarse una infección exitosa mediante el análisis de ADN aislado de células, tales como células mononucleares de sangre periférica, obtenido de ratones transgénicos a los que se les ha inyectado células humanas infectadas con VIH. El ADN de las células de ratones transgénicos infectados contendrán secuencias gag y env específicas de VIH, como se demostró mediante, por ejemplo, amplificación de ácido nucleico utilizando cebadores específicos de VIH. Si las células también expresan de manera estable la ribozima anti-VIH, entonces el análisis de los extractos de ARN de las células debería revelar los fragmentos de gag más pequeños que surgen de la escisión del transcripto de gag por la ribozima.

Adicionalmente, los ratones transgénicos que portan el gen de ribozima anti-VIH pueden cruzarse con ratones transgénicos que expresan CD4 humana (es decir, el receptor celular para VIH) [ver Gillespie et al. (1993) Mol. Cell. Biol. 13:2952-2958; Hanna et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14:1084-1094 y Yeung et al. (1994) J. Exp. Med. 180:19111920, para una descripción de ratones transgénicos que expresan CD4 humana]. La descendencia de estos ratones transgénicos cruzados que expresan los transgenes de ribozima anti-VIH y CD4 deberían ser más resistentes a la infección [como resultado de una reducción en los niveles de VIH activo en las células] que los ratones que expresan CD4 solo [sin expresar una ribozima anti-VIH].

4. Desarrollo de pollos transgénicos utilizando cromosomas artificiales

El desarrollo de pollos transgénicos tiene muchas aplicaciones en la mejora de aves de corral domésticas, una especie agrícola de importancia comercial, tales como genes de resistencia a enfermedades y genes que codifican proteínas terapéuticas. Parece que los esfuerzos en el área de transgénesis de pollos se han obstaculizado debido a la dificultad en alcanzar una expresión estable de transgenes en células de pollo utilizando métodos convencionales de transferencia génica a través de una introducción aleatoria en células receptoras. Por lo tanto los cromosomas artificiales son particularmente útiles en el desarrollo de pollos transgénicos debido a que proporcionan un mantenimiento estable de transgenes en células huésped.

a. Preparación de cromosomas artificiales para la introducción de transgenes en células de pollo receptoras

(i) Cromosomas artificiales de mamífero

Los cromosomas artificiales de mamífero, tales como los SATAC y los minicromosomas descritos en la presente, pueden modificarse para incorporar genes reporteros detectables y/o transgenes de interés para su uso en desarrollar pollos transgénicos. Alternativamente, los cromosomas artificiales específicos para pollos pueden construirse utilizando los métodos en la presente. En particular, los cromosomas artificiales de pollo [CAC] pueden prepararse utilizando los métodos en la presente para preparar MAC o como se describió anteriormente, las bibliotecas de pollos pueden introducirse en MAC proporcionados en la presente y los MAC resultantes introducirse en células de pollo y aquellos que son funcionales en células de pollo seleccionadas.

Como se describió en los Ejemplos 4 y 7, y en otras partes en la presente, las líneas celulares derivadas de LMTKde ratón que contienen cromosomas artificiales o líneas celulares que contienen minicromosomas, así como híbridos de las mismas, pueden transfectarse con ADN seleccionado para generar MAC [o CAC] que tienen integrado el ADN ajeno para una expresión funcional de genes heterólogos contenidos dentro del ADN.

Para generar MAC o CAC que contienen transgenes para expresar en células de pollo, las líneas celulares que contienen MAC pueden transfectarse con ADN que incluye ADN de λ y transgenes de interés unidos operativamente a un promotor que es capaz de generar una expresión de genes en células de pollo. Alternativamente, los minicromosomas o MAC [o CAC], producidos como se describió anteriormente, pueden aislarse e introducirse en células, seguido por una integración dirigida de ADN seleccionado. Los vectores para una integración dirigida se proporcionan en la presente o pueden construirse como se describió en la presente.

Los promotores de interés incluyen promotores específicos constitutivos, inducibles y de tejido (o célula) que los expertos en la técnica conocen que promueven la expresión de genes en células de pollo. Por ejemplo, la expresión del gen lacZ en células blastodérmicas de pollo y fibroblastos de pollo primarios se ha demostrado utilizando un promotor de la proteína 68 de choque de calor (hsp 68) de ratón [phspPTIacZpA; ver Brazolot et al. (1991) Mol. Reprod. Devel. 30:304-312], un promotor de metalotioneína de pollo (cMt) inducible por Zn2+ [pCBcMtlacZ; ver Brazolot et al. (1991) Mol. Reprod. Devel. 30:304-312], los promotores del virus de sarcoma de Rous constitutivo y de β-actina de pollo en tándem [pmiwZ; ver Brazolot et al. (1991) Mol. Reprod. Devel. 30:304-312] y el promotor de citomegalovirus (CMV) constitutivo. Son de particular interés en la presente los promotores específicos de huevo que se derivan de genes, tales como ovalbúmina y lisozima, que se expresan en los huevos.

La elección del promotor dependerá de una variedad de factores, incluyendo, por ejemplo, si el producto transgénico se expresará en todo el pollo transgénico o se restringirá a ciertas ubicaciones, tales como el huevo. Los promotores específicos de células funcionales en pollos incluyen el promotor sensible a los esteroides del gen que codifica la proteína de ovalbúmina del huevo [ver, Gaub et al. (1987) EMBO J. 6:2313-2320; Tora et al. (1988) EMBO J. 7:3771-3778; Park et al. (1995) Biochem. Mol. Biol. Int. (Australia) 36:811-816].

(ii) Cromosomas artificiales de pollo

Adicionalmente, los cromosomas artificiales de pollo pueden generarse utilizando métodos descritos en la presente. Por ejemplo, las células de pollo, tales como fibroblastos de pollo primarios [ver Brazolot et al. (1991) Mol. Reprod. Devel. 30:304-312], pueden transfectarse con ADN que codifica un marcador seleccionable [tal como una proteína que confiere resistencia a los antibióticos] y que incluye ADN (tal como ADN satélite de pollo) que se dirige al ADN introducido a la región pericéntrica de los cromosomas de pollo endógenos. Los transfectantes que sobreviven al crecimiento en un medio de selección se analizan entonces utilizando métodos descritos en la presente, para la presencia de cromosomas artificiales, incluyendo minicromosomas y particularmente SATAC. Una línea celular transfectante que contiene el cromosoma artificial puede transfectarse entonces con ADN que codifica el transgén de interés [fusionado a un promotor apropiado] junto con el ADN que se dirige al ADN ajeno al cromosoma artificial de pollo.

b. Introducción de cromosomas artificiales que portan transgenes de interés en células de pollo receptoras

Pueden fusionarse líneas celulares que contienen cromosomas artificiales que alojan transgenes de interés (es decir, células donantes) con células de pollo receptoras para transferir los cromosomas en las células receptoras. Alternativamente, los cromosomas artificiales pueden aislarse de las células donantes, por ejemplo, utilizando métodos descritos en la presente [ver, por ejemplo, Ejemplo 10] e introducirse directamente en células receptoras.

Líneas celulares receptoras de pollo ejemplares incluyen, a modo no taxativo, células blastodérmicas en Etapa X [ver, por ejemplo Brazolot et al. (1991) Mol. Reprod. Dev. 30:304-312; Etches et al. (1993) Poultry Sci. 72:882889; Petitte et al. (1990) Development 108:185-189] y cigotos de pollo [ver, por ejemplo, Love et al. (1994) Biotechnology 12:60-63].

Por ejemplo, la fusión de microcélulas es un método para la introducción de cromosomas artificiales en células aviares [ver, por ejemplo, Dieken et al. [(1996) Nature Genet. 12:174-182 para métodos para fusionar microcélulas con células pre-B de pollo DT40]. En este método, las microcélulas se preparan [por ejemplo, utilizando los procedimientos descritos en el Ejemplo 1.A.5] a partir de líneas celulares que contienen cromosomas artificiales y se fusionan con células receptoras de pollo.

Los cromosomas artificiales aislados pueden introducirse directamente en líneas celulares receptoras de pollo, por ejemplo, sistemas portadores mediados por lípidos, tales como procedimientos de lipofección [ver, por ejemplo, Brazolot et al. (1991) Mol. Reprod. Dev. 30:304-312] o microinyección directa. La microinyección es generalmente preferida para la introducción de los cromosomas artificiales en cigotos de pollo [ver, por ejemplo, Love et al. (1994) Biotechnology 12:60-63].

c. Desarrollo de pollos transgénicos

Las pollos transgénicos pueden desarrollarse mediante la inyección de células blastodérmicas en Etapa X receptoras (que han recibido los cromosomas artificiales) en embriones en una etapa similar de desarrollo [ver por ejemplo, Etches et al. (1993) Poultry Sci. 72:882-889; Petitte et al. (1990) Development 108:185-189; y Carsience et al. (1993) Development 117: 669-675]. Los embriones de pollo receptores dentro de la cápsula se examinan a contraluz y se permite que empollen para proporcionar un pollo quimérico de línea germinal que expresará el o los transgenes en algunas de sus células.

Alternativamente, los cromosomas artificiales pueden introducirse en cigotos de pollo, por ejemplo a través de microinyección directa [ver, por ejemplo, Love et al. (1994) Biotechnology 12:60-63], que por lo tanto están incorporados en al menos una porción de las células en el pollo. La inclusión de un promotor específico de tejido, tal como un promotor específico de huevo, asegurará una expresión apropiada de ADN heterólogo unido operativamente.

El ADN de interés también puede introducirse en un minicromosoma, mediante métodos descritos en la presente. El minicromosoma puede describirse en la presente o generarse en células de pollo utilizando los métodos en la presente. El ADN heterólogo se introducirá utilizando un vector de direccionamiento, tal como aquellos descritos en la presente o construidos como se describe en la presente.

LISTA DE SECUENCIAS

(1) INFORMACIÓN GENERAL

(i)

SOLICITANTE:

(A)

NOMBRE: Centro de Investigación Biológica de la Academia Húngara de Ciencias

(B)

CALLE: Post Office Box 521

(C)

CIUDAD: H-6701 Szeged

(D)

ESTADO:

(E)

PAÍS: Hungría

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP):

(i)

SOLICITANTE:

(A)

NOMBRE: Universidad de Loma Linda

(B)

CALLE:

(C)

CIUDAD: Loma Linda

(D)

ESTADO: California

(E)

PAÍS: EE.UU.

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 92350

(i)

SOLICITANTE:

(A)

NOMBRE: AMERICAN GENE THERAPY, INC.

(B)

CALLE: 5022 154 Street

(C)

CIUDAD: Edmonton, T6H5PE

(D)

ESTADO:

(E)

PAÍS: CANADÁ

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP):

(i)

INVENTOR/SOLICITANTE:

(A)

NOMBRE: Gyula Hadlaczky

(B)

CALLE: H. 6723, Szeged

(C)

CIUDAD: Szamos U.1.A IX 36

(D)

ESTADO:

(E)

PAÍS: Hungría

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP):

(i)

INVENTOR/SOLICITANTE:

(A)

NOMBRE: Aladar Szalay

(B)

CALLE: 7327 Fairwood

(C)

CIUDAD: Highland

(D)

ESTADO: California

(E)

PAÍS: EE.UU.

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 92346

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: CROMOSOMAS ARTIFICIALES, USOS DE LOS MISMOS Y MÉTODOS PARA PREPARAR CROMOSOMAS ARTIFICIALES

(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 34

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

(A)

DESTINATARIO: Brown, Matin, Haller & McClain

(B)

CALLE: 1660 Union Street

(C)

CIUDAD: San Diego

(D)

ESTADO: CA

(E)

PAÍS: EE.UU.

(F)

ZIP: 92101-2926

(v)

FORMATO LEGIBLE POR COMPUTADORA:

(A)

MEDIO: Diskette

(B)

COMPUTADORA: Compatible con IBM

(C)

SISTEMA OPERATIVO: DOS

(D)

SOFTWARE: FastSEQ Versión 1.5

(vi)

DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

(C)

CLASIFICACIÓN:

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/695.191

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 07-AGO-1996

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/682.080

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 15-JUL-1996

(C)

CLASIFICACIÓN:

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/629.822

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 10-ABR-1996

(C)

CLASIFICACIÓN:

(viii) INFORMACIÓN DEL REPRESENTANTE/AGENTE:

(A)

NOMBRE: Seidman, Stephanie L

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 33.789

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 6869-402PC

(ix)

INFORMACIÓN DE CONTACTO:

(A)

TELÉFONO: 619-238-099

(B)

FAX: 619-232-0062

(C)

TELEX:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1293 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN Genómico

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1044 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN Genómico

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 2492 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN Genómico

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN Genómico

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN Genómico

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 47 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ARN

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN Genómico

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN Genómico

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 69 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN Genómico

(D) OTRA INFORMACIÓN: Secuencia señal de IL-2

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 945 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

HEBRA: lineal

(D)

TOPOLOGÍA: simple

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

(B)

UBICACIÓN: 1…942

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Luciferasa de Renilla Reinformis

(x)

INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN: PATENTE NO.: 5.418.155

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN Genómico

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN Genómico

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1434 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN Genómico

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1400 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN Genómico

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1369 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN Genómico

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 22118 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN Genómico

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 17:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 42999 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN Genómico

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 18:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 175 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN Genómico

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 19:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 755 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN Genómico

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 20:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 463 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN Genómico

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 21:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 378 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN Genómico

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 22:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 378 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN Genómico

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 23:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 719 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN Genómico

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 685 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN Genómico

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 25:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN Genómico

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 35 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN Genómico

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 27:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN Genómico

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 28:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 34 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN Genómico

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 29:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 80 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN Genómico

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 30:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN Genómico

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 31:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN Genómico

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 32:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN Genómico

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN Genómico

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 34:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN Genómico

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO:

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

Claims (52)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un cromosoma artificial en base a ADN satélite sustancialmente puro, aislado, que contiene más heterocromatina que eucromatina y que está compuesto principalmente por unidades de ADN de repetición que comprenden:

   bloques en tándem de ADN satélite flanqueado por ADN no satélite, un sitio de replicación primario, e incluye ADN heterólogo;

   en donde las unidades de repetición son de aproximadamente 7 a aproximadamente 20 Mb.

2. 2.

   El cromosoma artificial en base a ADN satélite de la reivindicación 1 que es un cromosoma de animal.

3. 3.

   El cromosoma artificial en base a ADN satélite de la reivindicación 2 que es un cromosoma de mamífero.

4. 4.

   El cromosoma artificial en base a ADN satélite de la reivindicación 3 que es un cromosoma artificial en base a ADN satélite humano o de ratón.

5. 5.

   El cromosoma artificial en base a ADN satélite de la reivindicación 1 o reivindicación 2 que es un megacromosoma que comprende "amplicones" repetidos en tándem que contienen dos "megarreplicones" invertidos que comprenden bloques en tándem de ADN satélite flanqueado por ADN no satélite, en donde los dos "megarreplicones" invertidos están delimitados por ADN heterólogo y el sitio de replicación primario.

6. 6.

   El cromosoma artificial en base a ADN satélite de la reivindicación 1 o reivindicación 2, que contiene aproximadamente 500 a aproximadamente 1000 Mb, aproximadamente 250 a aproximadamente 400 Mb, aproximadamente 150 a aproximadamente 200 Mb, aproximadamente 90 a aproximadamente 120 Mb, aproximadamente 15 a aproximadamente 60 Mb, aproximadamente 7,5 a aproximadamente 50 Mb, aproximadamente 10 a aproximadamente 30 Mb o mayor que aproximadamente 1000 Mb.

7. 7.

   El cromosoma artificial en base a ADN satélite de cualquiera de las reivindicaciones 1-6 que comprende ácido nucleico heterólogo que codifica un producto o productos génicos.

8. 8.

   El cromosoma artificial en base a ADN satélite de la reivindicación 7, en donde el ADN heterólogo en el cromosoma artificial en base a ADN satélite comprende un marcador seleccionable.

9. 9.

   El cromosoma artificial en base a ADN satélite de la reivindicación 7 que comprende ácido nucleico que codifica ARN antisentido, en donde el cromosoma artificial en base a ADN satélite es mamífero.

10. 10.

    El cromosoma artificial en base a ADN satélite de la reivindicación 1, en donde el cromosoma artificial en base a ADN satélite se aísla de las células de la línea celular G3D5 depositada en la ECACC con el no. de acceso 96040928 o la línea celular H1D3 depositada en la ECACC con el no. de acceso 96040929.

11. 11.

    El cromosoma artificial en base a ADN satélite de cualquiera de las reivindicaciones 1-10 que es sustancialmente todo heterocromatina, excepto por el ADN heterólogo.

12. 12.

    Un método para producir un cromosoma artificial en base a ADN satélite que comprende:

    introducir uno o más fragmentos de ADN heterólogo en una célula, en donde el fragmento o fragmentos de ADN comprenden un marcador seleccionable;

    cultivar la célula en condiciones selectivas para producir células que tienen incorporado el fragmento o fragmentos de ADN heterólogo en su ADN genómico;

    identificar de entre las células resultantes aquellas que incluyen cromosomas con más de un centrómero y/o fragmentos de dichos cromosomas;

    seleccionar una célula o células de entre las células identificadas y cultivar la célula o células en condiciones mediante las cuales se producen células que contienen cromosomas con unidades de ADN de repetición que comprenden bloques en tándem de ADN satélite flanqueado por ADN no satélite, un sitio de replicación primario e incluyen ADN heterólogo, en donde las unidades de ADN de repetición son de aproximadamente 7 a aproximadamente 20 Mb:

    subclonar células que contienen cromosomas con dichas unidades de ADN de repetición y cultivar las células en condiciones selectivas hasta que se produce una célula o células que contienen un cromosoma artificial en base a ADN satélite, que contiene dichas unidades de ADN de repetición; y

    seleccionar una célula que comprende un cromosoma artificial en base a ADN satélite que contiene más heterocromatina que eucromatina y está compuesto principalmente por unidades de ADN de repetición que comprenden bloques en tándem de ADN satélite flanqueado por ADN no satélite, un sitio de replicación primario y que incluye ADN heterólogo, en donde las unidades de ADN de repetición son de aproximadamente 7 a aproximadamente 20 Mb

    en donde la célula no es una célula madre embrionaria humana.

13. 13.

    El método de la reivindicación 12, en donde el fragmento o fragmentos de ADN heterólogo se introducen o están adyacentes a un centrómero de un cromosoma en la célula.

14. 14.

    El método de la reivindicación 12, en donde dicho ADN genómico comprende heterocromatina.

15. 15.

    El método de la reivindicación 12, en donde la célula es una célula de mamífero.

16. 16.

    El método de la reivindicación 12, en donde dicho cromosoma artificial en base a ADN satélite es predominantemente heterocromatina.

17. 17.

    El método de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en donde el fragmento o fragmentos de ADN heterólogo comprenden una secuencia de nucleótidos que dirige el fragmento o fragmentos a una región pericéntrica

    o una región heterocromática de un cromosoma.

18. 18.

    El método de la reivindicación 17, en donde la secuencia de direccionamiento de nucleótidos comprende ADN satélite.

19. 19.

    El método de cualquiera de las reivindicaciones 12, 14 y 16-18, en donde la célula es una célula de pez, insecto, reptil, anfibio, arácnido, roedor o ave.

20. 20.

    Los métodos de cualquiera de las reivindicaciones 12 y 14-19, en donde el cromosoma artificial en base a ADN satélite es un megacromosoma que comprende "amplicones" repetidos en tándem que contienen dos "megarreplicones" invertidos que comprenden bloques en tándem de ADN satélite flanqueado por ADN no satélite, en donde los dos "megarreplicones" invertidos están delimitados por ADN heterólogo y un sitio de replicación primario y el método comprende además una rotura o fragmentación de dichos megacromosomas, mediante la cual se producen las células que contienen megacromosomas truncados.

21. 21.

    El método de la reivindicación 20, en donde el megacromosoma truncado comprende ADN de aproximadamente 15 a aproximadamente 60 Mb.

22. 22.

    El método de cualquiera de las reivindicaciones 12 y 14-21, que comprende además aislar el cromosoma artificial en base a ADN satélite de la célula.

23. 23.

    El método de la reivindicación 22, en donde el aislamiento se efectúa mediante un método que comprende: aislar cromosomas metafase; distinguir cromosomas artificiales en base a ADN satélite de cromosomas endógenos; y separar los cromosomas artificiales en base a ADN satélite de cromosomas endógenos.

24. 24.

    El método de la reivindicación 23, en donde:

    los cromosomas artificiales en base a ADN satélite se distinguen de cromosomas endógenos mediante la tinción de los cromosomas con tintes específicos de secuencias de ADN; y la separación se efectúa mediante un clasificador de célula de flujo.

25. 25.

    El método de la reivindicación 12, que comprende además introducir un ADN heterólogo que codifica un producto génico, en donde:

    el ADN que codifica el producto génico está en el fragmento heterólogo que comprende el marcador seleccionable o está en un segundo fragmento de ADN; y

    el cromosoma artificial en base a ADN satélite resultante comprende el ADN heterólogo que codifica un producto génico.
26. 26. El método de la reivindicación 12, en donde:

    la célula con un cromosoma que tiene más de un centrómero que se selecciona es una célula que tiene un cromosoma dicéntrico que comprende un centrómero de novo; y

    la célula seleccionada se cultiva en condiciones mediante las cuales se produce un cromosoma artificial en base a ADN satélite.
27. 27. El método de cualquiera de las reivindicaciones 12 y 14-26, en donde:

    la célula con un cromosoma que tiene más de un centrómero que se selecciona es una célula que tiene un cromosoma dicéntrico que comprende un centrómero de novo; y la célula seleccionada se cultiva en condiciones que producen células en las cuales el cromosoma dicéntrico se ha

    sometido a una rotura para producir un cromosoma anteriormente dicéntrico; y el método comprende además: seleccionar una célula que tiene un cromosoma anteriormente dicéntrico; cultivar la célula en condiciones mediante las cuales se produce un "cromosoma salchicha", en donde dicho

    "cromosoma salchicha" comprende heterocromatina amplificada y una porción de eucromatina restante; y cultivar la célula en condiciones que desestabilizan el cromosoma mediante las cuales se produce un cromosoma artificial en base a ADN satélite.

28. 28.

    El método de la reivindicación 27, que comprende además: introducir un vector de fragmentación que se dirige a un cromosoma artificial en base a ADN satélite; cultivar las células; y seleccionar una célula que comprende un cromosoma artificial en base a ADN satélite, en donde el cromosoma

    artificial en base a ADN satélite es más pequeño que el cromosoma artificial en base a ADN satélite de la célula en la cual se introdujo el vector de fragmentación.

29. 29.

    El método de la reivindicación 12, 14 o 17, en donde se selecciona una célula que tiene un cromosoma dicéntrico que se cultiva en condiciones mediante las cuales se produce un cromosoma con un brazo heterocromático; y el método comprende además:

    cultivar la célula que contiene el cromosoma con un brazo heterocromático en condiciones que desestabilizan el cromosoma, mediante las cuales se produce un cromosoma artificial en base a ADN satélite.

30. 30.

    El método de la reivindicación 29, en donde las condiciones que desestabilizan el cromosoma comprenden un agente que desestabiliza los cromosomas.

31. 31.

    El método de la reivindicación 30, que comprende además identificar células que contienen un cromosoma heterocromático que es de aproximadamente 50 a aproximadamente 400 Mb.

32. 32.

    Una célula aislada, que comprende un cromosoma artificial en base a ADN satélite de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde la célula no es una célula madre embrionaria humana.

33. 33.

    La célula de la reivindicación 32 que es una célula de animal.

34. 34.

    La célula de la reivindicación 32 que es una célula de mamífero.

35. 35.

    La célula de la reivindicación 32, en donde la célula se selecciona de entre cualquiera de TF1004G19C5, 19C5xHa4, H1D3 y G3D5, que se han depositado en la ECACC con los nos. de acceso 96040926, 96040927, 96040929 y 96040928, respectivamente.

36. 36.

    La célula de cualquiera de las reivindicaciones 32-34 que contiene múltiples copias de un gen heterólogo o una pluralidad de genes heterólogos, en donde el cromosoma artificial en base a ADN satélite comprende las copias del o los genes heterólogos.

37. 37.

    La célula de la reivindicación 36, en donde los genes heterólogos codifican proteínas que comprenden una vía metabólica.

38. 38.

    La célula de la reivindicación 36, en donde los genes heterólogos se expresan en la célula en ausencia de condiciones selectivas.

39. 39.

    La célula de la reivindicación 36, en donde al menos uno de los genes heterólogos codifica un producto seleccionado del grupo que consiste en factores de crecimiento, anticuerpos, proteínas supresoras de tumores, enzimas, receptores, citoquinas, proteasas, luciferasas y hormonas.

40. 40.

    La célula de la reivindicación 36, en donde los genes heterólogos codifican uno o más productos terapéuticamente efectivos.

41. 41.

    Un método para producir una célula que contiene ácido nucleico heterólogo, que comprende: introducir un cromosoma artificial en base a ADN satélite de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 en la célula,

    en donde la célula no es una célula madre embrionaria humana.

42. 42.

    El método de la reivindicación 41, en donde la célula es una célula de animal.

43. 43.

    El método de la reivindicación 41, en donde el cromosoma artificial en base a ADN satélite es un cromosoma artificial en base a ADN satélite de mamífero.

44. 44.

    El método de la reivindicación 41, en donde el cromosoma artificial en base a ADN satélite se introduce mediante un método seleccionado de los sistemas de transferencia o captación de ADN directa, electroporación, lipofección, microinyección, transferencia nuclear, electrofusión, bombardeo de proyectiles, microinyección nuclear, transferencia mediada por policationes, transferencia mediada por liposomas, transferencia de polietilenglicol y transferencia mediada por lípidos.

45. 45.

    El método de la reivindicación 42, en donde la célula es una célula animal seleccionada de entre un mamífero, ave, ave de corral, pez, invertebrado, vertebrado, reptil e insecto.

46. 46.

    El método de cualquiera de las reivindicaciones 41 o 44, en donde la célula es una célula animal donante nuclear no humana; y el método comprende además:

    transferir el núcleo de la célula donante nuclear a un oocito no humano receptor.

47. 47.

    El método de la reivindicación 46, en donde el núcleo de la célula donante nuclear se transfiere a la célula receptora mediante fusión de las células donante y receptora.

48. 48.

    El método de la reivindicación 46, en donde el núcleo de la célula donante nuclear se transfiere a la célula receptora mediante microinyección.

49. 49.

    El uso de un cromosoma artificial en base a ADN satélite de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para la preparación de una composición útil para la terapia génica.

50. 50.

    El uso de la reivindicación 49, en donde el cromosoma artificial en base a ADN satélite comprende ADN que codifica un producto terapéutico.

51. 51.

    El uso de la reivindicación 50, en donde la composición es útil para la terapia génica en una célula objetiva seleccionada de un grupo que consiste en linfocitos, células nerviosas, células musculares y células madre pero que excluye células madre embrionarias humanas.

52. 52.

    Una composición que comprende un cromosoma artificial en base a ADN satélite de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para su uso en medicina.