KR20180054838A - 유전자 편집 돼지 - Google Patents

Abstract

본 발명은 RELA 유전자 내 유전자 이입 이종 핵산 서열을 포함하는 유전자 편집 돼지에 관한 것이다. 특히 본 발명은 가축 돼지(domestic pig)의 RELA 유전자 내 유전자 이입 혹멧돼지(warthog) 대립 유전자를 포함하는 유전자 편집 돼지에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 돼지, 및 이러한 유전자 이입 서열을 가지는 돼지 유래 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

유전자 편집 돼지

본 발명은 RELA 유전자 내 유전자 이입(introgressed) 이종 핵산 서열을 포함하는 유전자-편집(genetically-edited) 돼지에 관한 것이다.

고전적인 동물 사육은 전체 게놈에서 서열 변화를 이용한다. 두 마리 동물의 짝짓기에서 생산된 자손은 부모와 드 노보(de novo) 돌연변이가 혼합된 유전자형을 가지고 있다. 농업에서, 유익한 유전자형과 이들의 인코딩된 형질이 유전적 개선을 가져온다. 이러한 과정은 시간이 많이 소요되고, 복수의 교배를 필요로 하며, 사육 집단 내의 바람직한 유전적 변이의 존재에 의존한다; 사육 과정 동안 제거되는 변이는 이용될 수 없다.

아연 핑거 핵산가수분해효소(zinc finger nuclease, ZFN) 접근에 의해 개척된(Urnov, F.D., Rebar, E.J., Holmes, M.C., Zhang, H.S. & Gregory, P.D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature reviews. Genetics 11, 636-646 (2010)), 표적 게놈 편집의 개발(Carroll, D. Genome engineering with targetable nucleases. Annual review of biochemistry 83, 409-439 (2014))은 사용될 주어진 집단에 존재하지 않는 변이를 이제 사용할 수 있게 한다. 이러한 접근법은 특이적 표적 서열에 이중-가닥 절단(double-straind break, DSB)을 유도하기 위하여 조작된 핵산가수분해효소에 의존한다. 조사자가 제공한 DNA 주형과 함께 사용되면, DSB의 수선 동안 상동성-기반 공정에서 특이적인 변화가 염색체로 도입될 수 있다. 이런 식으로 원래의 표적 서열이 새로운 서열로 교환될 수 있고(Urnov, F.D. et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature 435, 646-651 (2005)), 이는 한 세대에서 표적 동물 집단으로의 단일 대립 유전자 유전자 이입을 가능하게 한다(Fahrenkrug, S.C. et al. Precision genetics for complex objectives in animal agriculture. Journal of animal science 88, 2530-2539 (2010)).

그럼에도 불구하고, 표적 게놈 편집의 가능성에도 불구하고, 표적 동물에의 대립 유전자 유전자 이입을 수행하는데 있어서 상당한 어려움이 남아있다. 특히, 사축 돼지(Sus scrofa)에의 대립 유전자 유전자 이입은 아직까지 성공적으로 달성되지 않았다.

단일 지점 돌연변이가 야생종의 가축화 동안의 주요 표현형의 차이를 가져온다는 것이 밝혀졌지만(Konishi, S. et al. An SNP caused loss of seed shattering during rice domestication. Science (New York, N.Y.) 312, 1392-1396 (2006)), 많은 경우에, 동일한 유전자 자리의 복수 지점 돌연변이가 원인으로 생각된다. 대표적인, 농업적으로 중요한 예는 RELA의 변이이다(Palgrave, C.J. et al. Species-specific variation in RELA underlies differences in NF-kappaB activity: a potential role in African swine fever pathogenesis. Journal of virology 85, 6008-6014 (2011)). 가축 돼지는, 아프리카에서 발견된 현대의 돼지 종과 달리, 아프리카 돼지 열 바이러스(African Swine Fever Virus)에 감염되기 매우 쉽다. 본 발명자들은 혹멧돼지(Phacochoerus africanus) 및 가축 돼지 RELA 사이의 세가지 아미노산 차이를 확인한바 있다(Palgrave, C.J. et al. Species-specific variation in RELA underlies differences in NF-kappaB activity: a potential role in African swine fever pathogenesis. Journal of virology 85, 6008-6014 (2011)).

WO2014/041327은 ZFN 및 TALEN에 의한 DNA 절단 후 NHEJ를 통해 삽입-결실(indel)을 생성하는 것에 의한 돼지의 게놈 편집에 대하여 개시하고 있으나, 대립 유전자의 유전자 이입에 대해서는 설명하고 있지 않다.

본 발명자들은 돼지의 RELA 유전자 내 대립 유전자 유전자 이입을 수행하는 것을 성공적으로 달성하였다. 따라서 본 발명은 이러한 획기적인 업적을 완료하는데 상당한 불확실성을 극복하는 것이다.

본 발명자들은 돼지 게놈에의 이종 핵산의 유전자 이입(introgression)을 첫 번째로 설명하고 있다; 특히, 본 발명자들은 완전한 단상형의 혹멧돼지 RELA 대립 유전자를 가축 돼지 RELA 유전자로 유전자 이입하였다. 돼지 게놈에의 이러한 단상형의 유전자 이입은 주목할 만한 업적으로, 결과로 생긴 돼지는 상당히 상업적으로 이득이 되는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면에 따르면, RELA 유전자 내 유전자 이입된 이종 핵산 서열을 포함하는 유전자 편집 돼지(genetically-edited swine)가 제공된다.

상기 돼지(swine)는 돼지(pig)인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 가축 돼지(domestic pig)이다.

RELA 단백질은 NFkappaB 헤테로다이머 전사 인자의 주된 성분이다. 이와 같이, RELA의 농도나 활성을 변경시키는 유전자 편집은 NFkappaB 의존적 세포 활성, 특히 NFkappaB 유도 유전자로부터의 전사에 직접적으로 영향을 미친다. NFkappaB는 감염을 포함하는 다양한 스트레스에 대한 동물 반응의 주요한 작용자(effector)이다. 그러므로 RELA 발현 또는 활성이 변형된 유전자 편집 동물은 감염, 만성 및/또는 자가면역 질환과 같은, 생물학적 스트레스 또는 모욕에 대하여 편집되지 않은 대응물과 다르게 반응한다.

유전자 이입 이종 핵산 서열이 이종 RELA 대립 유전자를 포함하는 것이 매우 바람직하다. 적절하게, 유전자 이입 이종 대립 유전자는 종간(trans-species) 히종 RELA 대립 유전자를 포함한다. 선택적으로, 유전자 이입된 이종 대립 유전자는 속간(trans-genus) 이종 RELA 대립 유전자를 포함한다.

따라서, 본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 상기 유전자 이입된 이종 대립 유전자는 야생형 RELA 대립 유전자를 이종 RELA 대립 유전자로, 더욱 바람직하게는 종간 이종 RELA 대립 유전자 또는 속간 이종 RELA 대립 유전자로, 그리고 적절하게는 혹멧돼지 RELA 대립 유전자로 전환한다.

동물(예를 들어, 가축 돼지)에 존재하는 RELA 유전자의 대립 유전자(조절 및 비-코딩 서열을 포함할 수 있다)가 상이한 대립 유전자가 존재하도록 유전자 이입을 통해 '재-기입될(re-written)' 수 있다는 것은 본 발명의 특히 바람직한 특징이다 - 많은 경우에, 이는 오로지 작은 수의 염기를 변화시키는데 관여할 수 있다. 이는 완전히 '깨끗한(clean)' 방식으로 행해지는데, 즉, 편집 건에 발자국 또는 다른 흔적이 남지 않고, 게놈에 만들어진 변화는 오로지 바람직한 대립 유전자 전환에 필요한 것들이다. 이런 식으로, 예를 들어, 하나의 종에서 자연적으로 발견된 ELA 대립 유전자는 상기 대립 유전자가 존재하지 않는 집단(예를 들어, 종)에 도입될 수 있다. 이러한 접근법은 게놈 파괴의 의미에서, 몇몇 발자국 형태가 야기되는, 유전자 (및 종종 선택가능한 마커)가 삽입되고, 이동되고, 또는 파괴되는 종래의 형질전환과는 매우 다르다.

본 발명의 이종 대립 유전자는 비-상동 말단 부착(NHEJ)의 전형적인 결과인, 결실, 역전 또는 다른 이러한 임의의 또는 잘 조절되지 않은 편집에 의해 형성되지 않는다. 상기 유전자 이입 이종 대립 유전자는 전형적으로 상기 이종 대립 유전자의 서열을 포함하는 주형 핵산(전형적으로 DNA) 서열을 근거로 한 상기 대립 유전자의 유전자 자리 또는 근처의 게놈 DNA 내 위치-특이적 핵산가수분해효소(SSN) 유도 이중 가닥 절단(DSB)의 상동 직접 수선(HDR)을 통한 대립 유전자 전환에 의해 유전자 이입된다.

바람직하게는 상기 유전자 편집 돼지는 두 개 이상의 염기 내 변화에 의해 야생형 RELA 대립 유전자와 상이한 유전자 이입된 RELA 대립 유전자를 포함한다. 따라서 돼지는 바람직하게는 유전자 이입된 RELA 단상형을 포함한다. 상기 단상형은 바람직하게는 단일 편집 건을 통해 유전자 이입된다. 상기 단상형은 야생형 RELA 서열과 비교할 때 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 또는 그 이상의 염기 변화를 포함할 수 있다.

본 발명의 어느 구현예에서, 상기 유전자 편집 돼지는 50개 이상의 염기 길이의 적절하게 100 이상, 150 이상, 200 이상, 250 이상, 500 이상, 또는 1000 이상, 또는 1500 이상의 염기 길이의, RELA 유전자 내 유전자 이입된 핵산을 포함한다. 유전자 이입된 단상형에 관련된 발명에 있어서, 변형된 2개 이상의 염기에 걸친 거리는 50개 이상의 염기, 선택적으로, 100 이상, 150 이상, 200 이상, 250 이상, 500 이상, 또는 1000 이상의 염기일 수 있다.

바람직하게는 상기 유전자 편집 돼지의 모든 세포는 유전자 이입된 이종 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이는 예를 들어, 단일세포 접합체를 변형시키고 접합체로부터 돼지를 발생시켜, 달성될 수 있다.

상기 유전자 이입된 RELA 대립 유전자는 바람직하게는 RELA 유전자에 의해 인코딩된 RELA 단백질 서열을 변화시킨다. 상기 유전자 이입된 RELA 대립 유전자가 RELA 유전자의 코딩 영역(엑손), 즉, 서열번호 15에 기재된 cDNA 서열에 상응하는 것에 대한 변형을 일으키는 것이 일반적으로 바람직하다. 따라서 상기 유전자 이입된 RELA 대립 유전자는 서열번호 16에 나타낸 야생형 가축 돼지 RELA 아미노산 서열에 관련된 하나 이상의 아미노산의 변화를 일으키는 것이 바람직하다.

상기 유전자 이입된 RELA 대립 유전자가 RELA의 전사활성화 도메인을 인코딩하는 RELA 유전자의 영역 내 서열을 변화시키는 것이 매우 바람직하다. 돼지에서, 이러한 도메인은 야생형 RELA 단백질 서열의 431 내지 553 아미노산(달리 언급이 없는 한, 핵산 및 아미노산의 번호는 야생형 Sus scrofa RELA cDNA 또는 단백질 서열을 참고한 것이다)으로부터 연장된다. 전사활성화 도메인 2는 431 내지 521 아미노산으로부터 연장되고, 전사활성화 도메인 1은 522번 아미노산으로부터 553 아미노산에서의 단백질의 C-말단까지 연장된다. 더욱 바람직하게는, 상기 유전자 이입된 RELA 대립 유전자는 RELA의 448 내지 531 아미노산을 인코딩하는 RELA 유전자의 영역을 변화시킨다.

적절하게 상기 유전자 편집 돼지는 RELA 유전자의 유전자 이입된 종간 대립 유전자를 포함하는 돼지이다. 다시 말해서, 상기 돼지는 가축 돼지 RELA 서열을 종간 대립 유전자 서열로 전환시키는 유전자 이입된 이종 핵산 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 돼지는 Sus 속 이외의 돼지 종으로부터 RELA 유전자의 유전자 이입된 종간 대립 유전자를 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 돼지는 혹멧돼지 RELA 유전자의 유전자 이입된 종간 대립 유전자, 특히, RELA의 전사활성화 도메인을 인코딩하는 서열의 대립 유전자를 포함한다.

본 발명의 어느 구현예에서는, 상기 유전자 이입된 이종 핵산 서열은 유전자 편집 돼지의 품종, 아종(sub-species) 및 바람직하게는 종 내에 존재하지 않는 서열이다(예를 들어, 관련 종에 비-자연적인 것). 예를 들어, 상기 유전자 이입된 이종 핵산 서열은 가축 돼지에 존재하지 않는 이종 RELA 대립 유전자를 적절히 포함한다.

상기 돼지는 상기 유전자 이입된 RELA 대립 유전자에 대해 이형접합(단일-대립 유전자) 또는 동형접합(이중-대립 유전자)일 수 있다. 바람직하게는 상기 돼지는 상기 유전자 이입된 RELA 대립 유전자에 대하여 동형접합(이중-대립 유전자)이다.

바람직한 구현예에서, 변형은 RELA의 다음 아미노산 중 하나 이상에 위치한 아미노산의 변화를 일으킨다:

- T448;

- S485; 및

- S531.

적절하게 이러한 위치의 2 이상의 아미노산이 변형된다. 그러나, 세 개 위치 모두의 아미노산이 변형되는 것이 더욱 바람직하다.

변형은 적절하게 RELA의 아미노산 내 다음 변화를 일으킨다: T448A, S485P 및/또는 S531P. 이러한 변형은 가축 돼지 및 혹멧돼지 사이에서 관찰된 다형(polymorphism)에 일치한다. 이러한 다형은 혹멧돼지 내 ASFV 감염에 대한 저항력과 연관성이 있다.

어느 구현예에서, 상기 변형은 RELA의 아미노산의 다음 변화를 적절하게 일으킨다: T448A; S485P; S531P; T448A 및 S485P; S485P 및 S531P; T448A 및 S531P; T448A, S485P 및 S531P.

매우 바람직한 구현예에서, 상기 돼지는 가축 돼지 RELA 단백질에 대하여 다음 아미노산 변화를 일으키는 유전자 이입된 이종 핵산 서열을 포함하는 돼지이다: T448A, S485P 및 S531P. 이러한 세 가지 변화는 가축 돼지 내 야생형 RELA 단백질 서열 및 혹멧돼지 내 야생형 RELA 단백질 서열 사이의 아미노산 차이이다. 상기 유전자 이입된 이종 핵산에 의해 T448A, S485P 및 S531P를 제외한 아미노산에 아무 변화도 유발되지 않는 것이 바람직하다.

유전자 편집 건이 이러한 세 가지 아미노산 변화가 (다른 것에는 변화 없음) 가축 돼지에 만들어지는 것을 의미하는 경우에 있어서, 완벽한 속간 대립 유전자 전환이 일어났다고, 즉, 가축 돼지 RELA 대립 유전자를 어떠한 의도되지 않은 변화 없이, 상응하는 혹멧돼지 대립 유전자로 완벽하게 전환하였다고 할 수 있다. 혹멧돼지는 핵산 수준에서 몇몇 다른 다형을 포함하나, 발현된 아미노산 서열에는 영향을 미치지 않아, 따라서 본 경우에 있어서 무시할 수 있다.

바람직한 구현예에서, 따라서 본 발명은 RELA 유전자가 하기 개시된 서열을 포함하도록 편집된, 유전자 편집 돼지를 제공한다 (448, 485 및 531 위치의 아미노산은 진하게 나타내었다):

- LLQLQFDADEDLGALLGNNTDPTVFTDLASVDNSEFQQLLNQGVPMPPHTAEPMLMEYPEAITRLVTGSQRPPDPAPTPLGASGLTNGLLPDGEDFSSIADM (즉, T449A, S485P 및 S531P 변이 포함 - 서열번호 17).

이에 따라, 본 발명은 S531, T449 및 S485를 인코딩하는 서열을 포함하는 자가조직 RELA 서열의 적어도 일부분이 상응하는 혹멧돼지(Phacochoerus sp.) RELA 단백질 서열을 인코딩하는 서열의 유전자 이입에 의해 교체되도록 (적절히 표적된 SSN에 의해 유도된 DSB의 HDR을 통해 적절히) 유전자 편집된 가축 돼지를 제공한다. 유전자 이입된 핵산 서열은 혹멧돼지 서열과 동일할 수 있고, 또는 하나 이상의 동의의 염기 변화를 포함하는 동등한 인공 서열일 수 있다.

본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 상기 유전자 편집 돼지는 유전자 이입된 이종 핵산 서열로부터 야기된 ASFV 감염에 대한 향상된 저향략을 가지는 돼지(바람직하게는 가축 돼지)이다.

사망률(morality rate), 질병률(morbidity rate), 현저한 질병률을 나타내는 동물의 비율 (예를 들어, 체중 감소 또는 감소된 성장률), 질병 정도 또는 질병 지속 기간이 감소될 때, 동물이 감염에 더욱 저항력이 있다고 볼 수 있다. 가축 돼지 내 ASFV의 경우, 질병률이 생무지의 떼에서 100%에 근접한다. 질병률은 분리물(isolate)의 독성에 의존적이고, 0% 내지 100%의 범위일 수 있다. 매우 독성인 분리물은 모든 연령의 돼지에서 거의 100% 사망률을 가져온다. 덜 독성인 분리물은 동시 발생한 질병과 함께 임신한 동물 및 어린 동물에 있어서 치명적이기 쉽다. 아급성 질병에 있어서, 사망률은 어린 돼지에서 70-80%로 높을 수 있지만, 늙은 돼지에서는 20% 미만이다. 동일한 독성 수준의 ASFV에 노출된 (이상적으로 동일한 분리물) 유전자 편집 돼지 집단과 동등한 비-편집 돼지 사이에 사망률 또는 질병률의 어떠한 통계적으로 유의한 감소(예를 들어, 적절한 시험을 이용한 95% 신뢰, 또는 99% 신뢰)는 향상된 저항력을 입증하는 것이다.

본 발명의 두 번째 측면에 따르면, RELA 유전자 내 유전자 이입된 이종 핵산 서열을 포함하는 돼지의 세포 핵, 생식 세포, 줄기 세포, 배우자(gamete), 배반포(blastocyst), 배아, 태아(foetus) 및/또는 공여 세포가 제공된다.

본 발명의 두 번째 측면의 바람직한 특징은 본 발명의 첫 번째 측면의 것에 일치한다.

바람직한 구현예에서, 상기 세포 핵, 생식 세포, 줄기 세포, 배우자, 배반포, 배아, 태아 및/또는 공여 세포는 가축 돼지 유래이고, 유전자 이입된 종간 RELA 대립 유전자, 예를 들어, 혹멧돼지 RELA 대립 유전자를 포함한다.

적절하게 상기 세포 핵, 생식 세포, 줄기 세포, 배우자, 배반포, 배아, 태아 및/또는 공여 세포는 상기 개시된 돼지로부터 유래된 것이다. 선택적으로, 여기서 설명된 방법을 이용하여 드 노보 (de novo) 생성된 것일 수 있다.

본 발명의 세 번째 측면에 따르면, RELA 유전자 내 유전자 이입 이종 핵산 서열을 가지는 유전자 편집 돼지의 생산 방법이 제공되는데, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

- 돼지 접합체를 제공하는 단계;

- 상기 접합체로 위치-특이적 핵산가수분해효소를 도입하는 단계로서, 핵산가수분해효소는 편집될 RELA 유전자 내 바람직한 게놈 서열을 표적하고, 이중 가닥 절단을 도입하기 위하여 개작된 것인 단계;

- 이종 핵산 서열을 포함하는 주형 핵산을 RELA 유전자에 유전자 이입되도록 도입시키는 단계로서, 상기 이종 서열은 게놈 RELA 서열에 상동인 서열로 측면에 배치된 것인 단계;

- 위치-특이적 핵산가수분해효소에 의한 게놈의 절단 및 상동 직접 수선에 의한 RELA 유전자로의 상기 이종 핵산 서열의 유전자 이입을 가능하게 하기 위한 적절한 조건 하에서 상기 접합체를 배양하는 단계; 및

- 상기 접합체로부터 동물을 생성하는 단계.

바람직하게는 상기 돼지(swine)은 돼지(pig)이고, 더욱 바람직하게는 가축 돼지(domestic pig)이다.

바람직하게는 상기 위치-특이적 핵산가수분해효소는 아연 핑거 핵산가수분해효소(zinc finger nuclease, ZFN), 전사 활성제-유사 작용자 핵산가수분해효소(Transcription Activator-Like Effector Nuclease, TALEN), RNA-인도 CRISPR/Cas 핵산가수분해효소(RNA-guided CRISPR/Cas nuclease, CRISPR) 또는 메가핵산가수분해효소를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 위치-특이적 핵산가수분해효소는 쌍의 구성원 모두가 존재할 때만 DNA 절단이 일어나고, DNA 분자의 양 가닥 모두를 자를 수 있는, 헤테로다이머를 형성하도록 개작된, 한 쌍의 협동 ZFN, TALEN 또는 RNA-인도 CRISPR '틈내기효소(nickases)' (예를 들어, 오로지 하나의 DNA 가닥을 절단할 수 있는 변형된 Cas9 핵산가수분해효소를 포함)를 포함한다. 한 쌍의 협동 ZFN, TALEN 또는 RNA-인도 CRISPR의 사용은 가능한 표적을 벗어난(off-target) 절단 건의 감소를 가져온다. 어느 바람직한 구현예에서, 상기 위치-특이적 핵산가수분해효소는 한 쌍의 ZFN을 포함한다.

바람직하게는 상기 위치-특이적 핵산가수분해효소는 RELA의 전사활성화 도메인을 인코딩하는 RELA 유전자의 영역 내 (즉, 야생형 RELA 단백질 서열의 431 내지 553 아미노산) 또는 그의 약간 상류(upstream) 또는 하류(downstream), 예를 들어, 그의 상류 또는 하류 500, 300, 200, 100, 50 또는 20 염기를, 표적하고 절단하도록 개작된다. 보다 바람직하게는 상기 위치-특이적 핵산가수분해효소는 RELA의 448 내지 531 아미노산을 인코딩하는 RELA 유전자 영역 내, 또는 그의 약간의 상류, 예를 들어, 그의 상류 500, 300, 200, 100, 50, 20 또는 10 염기를 표적하고 절단하기 위하여 개작된다.

바람직하게는 상기 위치-특이적 핵산가수분해효소는 RELA 유전자의 엑손 9 내를 표적하고 절단하도록 개작된다.

바람직한 구현예에서, 상기 위치-특이적 핵산가수분해효소는 T448 아미노산을 인코딩하는 RELA의 영역의 상류, 예를 들어, 그의 상류 500, 300, 200, 100, 50 또는 20 염기를 표적하고 절단하기 위하여 개작된다.

특히 바람직한 구현예에서, 상기 위치-특이적 핵산가수분해효소는 1200 및 1341 염기 사이에 놓인 위치에서 (서열번호 15 참고), 더욱 바람직하게는 1250 및 1340 염기 사이에 놓인 위치에서, 더 더욱 바람직하게는 1300 및 1340 염기 사이에 놓인 위치에서, 그리고 더 더욱 바람직하게는 1320 및 1340 염기 사이에 놓인 위치에서, 절단하기 위한 적절한 서열을 표적하도록 개작된다. 하나의 구현예에서, 상기 절단 위치는 1332 및 1333 염기 사이에 놓인다.

본 발명의 하나의 구체적인 구현예에서, 한 쌍의 협동 SSN 중 하나의 표적 위치는 GATACTGATGAGGAC (서열번호 18)이고, 그 쌍의 SSN의 다른 하나의 표적 위치는 CTCCGGGACGACGTC (서열번호 19)이다. 다른 표적 서열이 사용될 수 있고, 통상의 기술자에게 있어서 다른 SSN에 최적화된 적절한 표적 위치를 결정하는 것은 이미 자명한 것이다.

상기 위치-특이적 핵산가수분해효소는 어떠한 적절한 형태로 세포에 도입될 수 있다는 것을 알아야 한다. 예를 들어, 상기 핵산가수분해효소는 기능적 단백질로서, 접합체로 직접 제공될 수 있다. 선택적으로, 상기 핵산가수분해효소는 활성 핵산가수분해효소가 접합체에 의해 생산되는 전구체 또는 주형의 형태로 접합체에 제공될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 핵산가수분해효소를 인코딩하는 mRNA가 예를 들어, 주입(injection)에 의해 접합체로 도입된다. 상기 mRNA는 그 다음 기능하는 단백질을 형성하기 위해 세포에 의해 번역된다. 이러한 방식으로의 mRNA 사용은 세포 내에서 핵산가수분해효소의 신속하지만 일시적인 발현을 가능하게 하는데, 이는 유전자 편집의 목적에 이상적이다.

용어 '접합체(zygote)'는 배우자(gamete)의 융합에 의해 형성된 단일 세포를 지칭하기 위한 엄격한 의미로 사용되는 것이다. 그러나, 이는 진짜 접합체의 처음 몇 가지 분열에서 기인한 세포 다발을 지칭하는 것으로 더욱 넓게 사용될 수 있다 (이는 더욱 적절하게는 상실배(morula)로 알려져 있다).

본 발명의 방법은, 단일 세포 단계의 접합체에서, 적어도 개시되는 것이 바람직하고, 바람직하게는 완료된다.

유전자 편집 접합체는 배아 및 최종적으로 성체 동물이 되도록 성장할 수 있다. 만약 편집 건이 단일 세포 접합체에서 일어난 경우, 이 동물의 모든 세포가 단일의 유전자 편집 세포로부터 유래되었으므로, 이 동물의 모든 세포는 변형된 RELA 유전자를 포함할 것이다. 만약 편집 건이 하나 이상의 세포 분열 후에 일어난 경우, 결과 생성된 동물은 편집 건에 모자이크가 될 가능성이 크고, 즉, 편집된 세포로부터 유래된 몇몇 세포와 편집되지 않은 세포로부터 유래된 몇몇 세포를 포함할 것이다.

상기 방법은 복수 개의 접합체에서 수행될 수 있고, 상기 방법은 바람직한 유전적 변형이 달성된 접합체 선택에 관련되어 있다.

바람직하게는 상기 주형 핵산은 상동 서열에 의해 각 측면에 배치된 이종 핵산 서열을 포함하는 영역을 포함한다. 상기 주형 구조체는 이종 핵산 서열, 즉, 예를 들어, 50개 이상의 염기 길이, 적절하게 100 이상, 150 이상, 200 이상, 250 이상, 500 이상 또는 1000 이상, 또는 1500 이상의 염기 길이를 포함한다. 측면 배치된 상동 서열은 예를 들어, 50개 이상의 염기 길이, 적절하게 100 이상, 150 이상, 200 이상, 250 이상, 500 이상 또는 1000 이상의 염기 길이일 수 있다.

바람직하게는 상기 주형 핵산은 상동 영역에 의해 각 측면에 배치된 혹멧돼지 RELA 단상형을 포함하는 영역을 포함한다. 혹멧돼지 RELA 단상형을 포함하는 영역이 전형적으로 바람직한 편집을 달성하기 위하여 필수적인 염기에서의 변화를 제외하고, 야생형 표적 서열에 크게 상동이라는 것을 아는 것은 중요하다. 상동 영역은, 예를 들어, 200 내지 1000 염기 길이, 적절하게 500 내지 900 염기 길이일 수 있다.

하나의 특별한 구현예에서, 상기 주형 핵산은 251 이상의 뉴클레오티드 길이의 혹멧돼지 RELA를 포함하는 영역을 포함하는데, 이는 상동 영역에 의해 측면 배치된 단백질 서열 ADEDLGALLGNNTDPTVFTDLASVDNSEFQQLLNQGVPMPPHTAEPMLMEYPEAITRLVTGSQRPPDPAPTPLGASGLTNGLLP (T448A, S485P 및 S531P 아미노산 변화는 진하게 나타냄) (서열번호 23)을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 상동 영역은 200 염기 또는 그 이상, 적절하게 400 염기 또는 그 이상, 더욱 바람직하게는 600 염기 또는 그 이상일 수 있다.

바람직하게는 상기 주형 핵산은 이중 가닥이다.

바람직하게는 상기 주형 핵산은 플라스미드로 제공된다. 플라스미드 형태로의 주형의 제공은 향상된 유전자 이입의 효능 및/또는 효율을 야기한다.

하나의 특별한 구현예에서, 상기 주형은 626 bp 및 799 bp의 상동 위치(homology arm)에 의해 측면에 배치된 혹멧돼지 RELA 단상형(즉, 서열번호 23을 인코딩)을 포함하는 251 bp 영역을 포함하는 플라스미드이다. 상기 251bp 영역은 가축 돼지 서열을 혹멧돼지 단상형으로 전환하기 위한 5개의 염기 변화를 포함한다.

상기 주형 핵산이 SSN에 대한 표적 위치에서의 상응하는 게놈 핵산 서열과 비교할 때 하나 이상(바람직하게는 둘 이상, 더 더욱 바람직하게는 셋 이상)의 염기 변화를 포함하는 것이 매우 바람직하다. 이러한 변화의 제공은 HDR 이후 SSN에 대한 표적 위치가 파괴되어 (또는 적어도 최적 이하로 되어), 성공적인 유전자 이입이 일어나면 재-절단을 방지하거나 감소시킨다는 것을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, DDNA에 대한 표적 위치는 GATACTGATGAGGAC (서열번호 18)이고, 상기 주형 핵산은 SSN에 의해 게놈 서열을 교체하고 재-절단을 방지하기 위하여 서열 GATgCaGAcGAGGAC (서열번호 20)을 포함한다. 명확하게, 유전자 이입 전 및 후의 상응하는 서열을 하기에 나타내었다 (SSN 표적 위치는 밑줄이 그어져 있고, 절단 위치는 진하게 나타내었고, 변화는 소문자로 나타내었다):

TGCAGTTTGATACTGATGAGGAC (서열번호 21) - 게놈

TGCAGTTTGATgCaGAcGAGGAC (서열번호 22) - 유전자 이입 후.

따라서, 본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 유전자 이입 혹멧돼지 RELA 단상형을 포함하는 유전자 편집 가축 돼지의 생산 방법이 제공되는데, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

- 돼지 접합체를 제공하는 단계;

- 상기 접합체로 한 쌍의 협동 위치-특이적 핵산가수분해효소(적절하게는 ZFN)를 도입하는 단계로서, 핵산가수분해효소는 T448A를 인코딩하는 서열 (바람직하게는 상류, 및 적절하게는 20bp 내) 영역에서 RELA 유전자를 표적하고, 이중 가닥 절단을 도입하기 위하여 개작된 것인 단계;

- 돼지의 게놈 RELA 서열에 상동인 서열에 의해 측면에 배치된 상응하는 혹멧돼지 RELA 단상형을 인코딩하는 서열을 포함하는 이종 핵산 서열을 포함하는 주형 핵산(바람직하게는 이중 가닥 DNA 주형, 예를 들어, 플라스미드)을 도입시키는 단계;

- 위치-특이적 핵산가수분해효소에 의한 게놈의 절단 및 상동 직접 수선에 의한 상기 이종 핵산 서열의 유전자 이입을 가능하게 하기 위한 적절한 조건 하에서 상기 접합체를 배양하는 단계; 및

- 상기 접합체로부터 동물을 생성하는 단계.

이하 첨부된 도면을 참조하여, 비-제한적 예의 방식으로, 본 발명의 구현예들을 설명할 것이다.

도 1은 가축 돼지 RELA의 DSB 및 뒤이은 HDR의 창출을 위한 설계 전략에 관한 것이다. (a)는 고체 바로 나타낸 엑손과 RELA 유전자의 묘사로서, 최종 엑손 영역의 확대된 사진은 가축 돼지(붉은색) 및 혹멧돼지(녹색) 사이의 3개 아미노산 차이를 강조하여 나타낸 것이고, 가위는 DSB의 목표 위치를 나타낸 것이다. (b)는 DNA 서열과 가축 돼지 서열 상의 ZFN 결합 위치를 나타내는 고체 바로, 아래쪽 패널은 ZFN에 의한 재-절단을 막는 동시에, 가축 돼지 트레오닌을 혹멧돼지 알라닌로 동시에 변화시키는 서열 변화를 나타낸 것이다. (c)는 가축 돼지 서열을 혹멧돼지 단상형으로 전환시키는 5개 염기 변화를 포함하는, 251bp 영역을 측면에 배치한 626 bp 및 799 bp 상동 위치와, HDR 주형의 디자인이다.
도 2는 정상 출산 돼지새끼의 서열 분석으로, 세 개의 관찰된 아미노산 차이를 인코딩하는 가축 돼지 및 혹멧돼지 둘 다의 서열을 각 동물로부터 추적한 서열과 함께 위에 나타낸 것이다. 염색체의 삽입 그림은 각 동물의 각 위치에서의 대립 유전자 구성을 나타낸 것이다 (가축 돼지 대립 유전자 - 붉은색; 혹멧돼지 대립 유전자 - 녹색).

본 발명의 이해를 가능하게 하기 위하여, 다수의 용어를 이하 정의하였다. 여기서 정의된 용어는 본 발명과 관련된 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가진다. "하나의(a)", "하나의(an)" 및 "그(the)"와 같은 용어는 오로지 단수의 독립체만을 의미하기 위한 것이 아니라, 설명을 위해 사용된 특정한 예의 일반적인 부류(class)를 포함한다. 여기의 전문 용어는 본 발명의 특정한 구현예를 설명하기 위해 사용되었으나, 청구항에 기재된 것을 제외하고는, 그 사용이 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

여기서 사용된 용어 "돼지(swine)" 또는 그 변형은 페커리(peccary), 바비루사(babirusa), 및 혹멧돼지(warthog)를 포함하는, 속(genus) Sus 및 다른 관련 종의 동물들을 포함하는 Suidae 과(family)의 소목 내 어느 동물을 지칭하는 것이다.

여기서 사용된 용어 "돼지(pig)" 또는 그 변형은 속 Sus 내 어느 동물을 지칭하는 것이다. 이는 가축 돼지(Sus scrofa domesticus 또는 Sus domesticus) 및 그 조상, 일반적인 유라시아 멧돼지(wild boar) (Sus scrofa)를 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 가축 돼지는 종 Sus scrofa의 아종으로 간주하였다. 이는 페커리, 바비루사 및 혹멧돼지는 포함하지 않는다.

여기서 사용된 용어 "가축 돼지(domestic pig)" 또는 그 변형은 아종 Sus scrofa domesticus의 동물을 지칭하는 것이다.

여기서 사용된 용어 "RELA 유전자" 또는 그 변형은 RELA (V-Rel Avian Reticuloendotheliosis Viral Oncogene Homolog A gene, p65 gene으로도 알려짐, NCBI Gene ID: 100135665) 유전자를 지칭하며, 코딩 및 비-코딩 영역과 또한 조절인자 프로모터 및 인핸서 영역을 모두 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 유전자 이입은 RELA 유전자 ORF 내, 및 보다 바람직하게는 적어도 하나의 엑손 내 서열을 변형시킨다.

여기서 사용된 용어 "위치-특이적 핵산가수분해효소(site-specific nuclease)" 또는 그 변형은 바람직한 위치에서 DNA를 절단하기 위하여 설정될 수 있는 조작된 핵산가수분해효소를 지칭한다. 이러한 위치-특이적 핵산가수분해효소는 조작된 핵산가수분해효소, 표적가능한 핵산가수분해효소, 게놈 편집 핵산가수분해효소, 분자 가위 및 그러한 것들로도 알려져 있다. 위치-특이적 핵산가수분해효소의 예는 아연 핑거 핵산가수분해효소(zinc finger nuclease, ZFN), 전사 활성화인자-유사 작용자 핵산가수분해효소(Transcription Activator-Like Effector Nuclease, TALEN), CRISPR/Cas 시스템(CRISPR), 및 하이브리드 메가핵산가수분해효소와 같은 메가핵산가수분해효소를 포함한다.

여기서 사용된 용어 "이종 대립 유전자(heterologous allele)" 또는 그 변형은 관련 동물에 존재하지 않는 대립 유전자를 지칭한다. 이종 대립 유전자는 또 다른 종 또는 속에 자연적으로 발생할 수 있거나, 어느 종에서 비-자연적일 수 있다(즉, 전체로서 인공). 바람직하게는 상기 대립 유전자는 또 다른 종에 자연적으로 발생하는 것이다.

여기서 사용된 용어 "종간(trans-species) 이종 대립 유전자" 또는 그 변형은 관련 동물의 종에 자연적으로 발생하지 않으나, 또 다른 종에 자연적으로 발생하는 대립 유전자를 지징한다. 상기 이종 대립 유전자는 또 다른 종에 자연적으로 발생할 수 있고, 상기 종은 동일하거나 상이한 종일 수 있다. 따라서 종간 대립 유전자는 인공적이지 않고 자연에서 발견된 것이나, 바람직한 특징을 가진 새로운 동물을 형성하기 위하여 새로운 종으로 유전자 이입된다는 의미에서 여전히 "자연적인 대립 유전자(natural allele)"이다.

여기서 사용된 용어 "속간(trans-genus) 이종 대립 유전자" 또는 그 변형은 관련 동물의 속에 자연적으로 발생하지 않으나, 또 다른 속에 자연적으로 발생하는 대립 유전자를 지칭한다. 따라서 "속간 이종 대립 유전자" 집합은 "종간 이종 대립 유전자"의 부분 집합으로, 즉, 속간 이종 대립 유전자는 관련 동물의 속 외에서 유래되고, 관련 동물의 종 외에서 유래되는 것이 아니다. 예를 들어, 혹멧돼지 유래 RELA 대립 유전자는 속 Sus 내 동물에 대한 속간 이종 대립 유전자, 특히 가축 돼지에 대한 것이다.

여기서 사용된 용어 "단상형(haplotype)" 또는 그 변형은 염색체 쌍의 단일 염색질 상의 특정한 유전자 자리에서의 연결된 세트의 DNA 서열 변이(전형적으로 단일-뉴클레오티드 다형(SNP))를 지칭한다. 본 발명에서, 단상형은 전형적으로 하나의 종 또는 속과 다른 것 사이의 복수의 SNP 차이이고, 이는 하나의 종 또는 속과 나머지 사이의 이종 대립 유전자에 기여하거나 정의하는 것이다. 예를 들어, 본 발명의 실시예에서 RELA 대립 유전자의 경우 가축 돼지와 혹멧돼지 사이에 3개의 아미노산 변화가 있다; 이러한 변화는 가축 돼지와 혹멧돼지 사이에 이종 RELA 대립 유전자의 단상형을 나타낸다.

여기서 사용된 용어 "유전자 이입(introgression)" 또는 그 변형은 전형적으로 존재하는 게놈 서열의 재기입(rewriting) 또는 전환에 의해, 주어진 근원으로부터 동물로, 이종 핵산 서열, 특히 유전자 또는 대립 유전자의 도입을 지칭한다. 본 발명에 있어서 재기입 또는 전환은 HDR에 의해 달성된다. 이종 핵산 서열의 근원은 또 다른 종 또는 속 유래 동물일 수 있고, 또는 인공 서열일 수 있다.

여기서 사용된 용어 "대립 유전자 유전자 이입" 또는 그 변형은 대립 유전자를 동물의 게놈으로 도입하는 유전자 편집을 지칭한다. 상기 대립 유전자 유전자 이입은 "대립 유전자 전환(allele conversion)" 또는 "대립 유전자 교체(allele replacement)"일 수 있고, 또는 예를 들어, 전체로서 새로운 유전자를 도입하는 것일 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 대립 유전자 유전자 이입은 대립 유전자 전환 또는 대립 유전자 교체이다.

여기서 사용된 용어 "대립 유전자 전환" 또는 "대립 유전자 교체" 또는 그 변형은 정상, 보통 '야생형', 대립 유전자를 이종 대립 유전자로 교체하는 유전자 이입을 지칭한다. 야생형 대립 유전자의 이종 대립 유전자로의 전환 또는 교체는 몇몇 경우에 또 다른 동물 유래의 이종 대립 유전자의 DNA 서열과 정확하게 일치하게 하기 위한 야생형 게놈 DNA 서열의 변형과 관련되어 있다. 그러나, 다른 경우에 있어서, 전환 또는 교체는 인코딩된 단백질이 이종 대립 유전자에 의해 인코딩된 단백질에 일치되도록 야생형 게놈 DNA 서열에 대한 변형만을 요구하는 것일 수 있다 (즉, 동의의 치환은 야생형 게놈 서열에 만들어질 필요가 없다). 요구되는 변형의 유형은 대립 유전자가 그 표현형을 행사하는 방식에, 예를 들어, 전사 조절에 대한 인코딩된 단백질의 활성을 통해, 의존할 것이다; 전자에서는 인코딩된 단백질 서열이 가장 중요한 반면, 후자에서는 DNA 서열이 가장 중요하다.

본 발명의 다양한 구현예의 제조 및 사용이 이하 구체적으로 설명되지만, 본 발명은 특정한 상황에서 구현될 수 있는 많은 적용가능한 발명적 개념을 제공하는 것이라는 점을 이해하여야 한다. 여기에서 논의된 특정한 구현예들은 단지 본 발명을 제조하고 사용하기 위한 특정한 방법의 예시이며, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

자신(Jasin) 실험실의 선구자적 연구는 포유류 세포에서 단일 DSB가 중단되지 않은, 짧은 (<200bp) 단상형을 형성하는 단일 뉴클레오티드 다형(SNP)의 패널의 염색체외 수선 주형 유래 염색체로의 이동을 유도할 수 있음을 증명하였다(Elliott, B., Richardson, C., Winderbaum, J., Nickoloff, J.A. & Jasin, M. Gene conversion tracts from double-strand break repair in mammalian cells. Molecular and cellular biology 18, 93-101 (1998)).

본 발명자들은 단일 핵산가수분해효소-유도 DSB를 통해 전체 혹멧돼지 RELA 단상형(3개 아미노산 변화를 일으키는 5개 SNP를 가지는 251개 염기 쌍에 걸친 것)을 도입하는 게놈 편집을 사용하고자 하였다. 우리가 아는 한, 이러한 편집-중심의 단상형 유전자 이입은 어떠한 포유류 종의 살아있는 동물에서 이전에 보고된바 없다. 우리는 이는 접합체 세포질로의 직접 주입에 의해 가축 돼지에서 효과적으로 달성될 수 있음을 증명한다. 놀랍게도, 우리는 새끼돼지의 유전자형에 의한 단일-단계 이중-대립 유전자 단상형 이동을 관찰한다. 구체적인 자료와 방법은 하기 별도의 부분에서 제공되며, 개요 방법론, 결과 및 결론은 이제 논의될 것이다.

ZFN은 어느 게놈 위치에서 DSN를 유도하도록 조작될 수 있다. 이러한 특정한 경우에서, 핵산가수분해효소 설계 고려사항은 다수의 SNP를 가지는 전체 251 bp 단상형을 이동시킬 필요에 의해 알려졌다. 본 발명자들은 상류 염색체 부분(arm)에 의한 수선 주형의 단일-측면 침입이 합성-의존적 가닥 어닐링-기반 전체 하류 단상형의 내생 유전자 자리로의 이동에 이르게 할 목적으로, ZFN이 단상형-표지 스트레치의 상류 바로 옆 영역에 대해 조작되는 전략(도 1의 a)을 고안하였다.

돼지 RELA cDNA 서열 (NM_001114281) 내 번역 시작 위치와 관련된 1330 내지 1338 bp를 측면에 배치한 영역에 결합하도록, ZFN 헤테로다이머 (구체적인 내용은 표 1 참조)를 제조하였다. 우리는 ZFN에 대하여 두 개 포맷의 발현 구조체를 비교하였다: 두 개 플라스미드, 각각 단일 ZFN 모노머를 인코딩, 및 리보솜 더듬(stuttering) 신호 또는 2A 펩티드에 의해 걸쳐 이어진 두 ZFN 모노머들을 인코딩하는 하나의 플라스미드(Fang, J. et al. Stable antibody expression at therapeutic levels using the 2A peptide. Nature biotechnology 23, 584-590 (2005); Perez, E.E. et al. Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases. Nature biotechnology 26, 808-816 (2008)). 우리는 이들 플라스미드를 가축 돼지로부터 확립된 형질전환 세포주(PK15)로 형질주입하고, Surveyor/Cel-1 내부핵산가수분해효소(endonuclease) 분석을 통해 게놈 편집 효율을 비교하였다(Guschin, D.Y. et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 649, 247-256 (2010)). 우리는 발현 구조체 구성에 따른 비교할 만한 적중한 편집을 관찰하였다. RELA-유도 ZFN에 따른 편집 효율은 GGTA 유전자의 파괴를 발생시키는 살아있는 돼지를 얻기 위해 성공적으로 사용된 ZFN에서 보인 것에 대해 거의 두 배인데(Hauschild, J. et al. Efficient generation of a biallelic knockout in pigs using zinc-finger nucleases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108, 12013-12017 (2011)), 이는 이러한 핵산가수분해효소가 배아-내(in-embryo) 편집에 매우 적합하다는 것을 나타내는 것이다.

본 발명자들은 게놈에서 DSB를 창출하기 위하여 ZFN을 사용한 반면, 이러한 절단은 통상의 기술자에게 지금 잘 알려진 다양한 다른 위치-특이적 핵산가수분해효소를 이용하여 달성할 수 있다. 예를 들어, 적절한 TALEN 쌍은 동일한 유전자 자리를 표적하도록 이미 설계될 수 있고, CRISPR/Cas 시스템은 야생형 또는 짝지어진 '틈내기효소(nickase)' Cas 핵산가수분해효소를 안내하는 적절한 안내 RNA 서열을 제공하여 사용될 수 있다. 따라서, ZFN이 본 발명의 실시예에서 개시되어 있고, ZFN이 매우 바람직한 특성을 나타내었으나, 본 발명은 ZFN의 사용에 제한되는 것이 아니다.

ZFN 기술은 문헌에, 그 중에서도, 다음 특허 문헌에, 광범위하게 설명되어 있다: US 6,479,626, 6,534,261, 6,607,882, 6,746,838, 6,794,136, 6,824,978, 6,866,997, 6,933,113, 6,979,539, 7,013,219, 7,030,215, 7,220,719, 7,241,573, 7,241,574, 7,585,849, 7,595,376, 6,903,185, 6,479,626, 8,106,255, 20030232410, 및 20090203140, 이들 모두는 참조로 포함된다. ZFN은 CompoZr® Zinc Finger Nuclease Technology 상표 상품 및 서비스 하에서 Sigam-Aldrich (St. Louis, MO, US)로부터 상업적으로 얻을 수 있다.

TALEN 기술은 문헌에, 그 중에서도, 다음 특허 문헌에, 광범위하게 설명되어 있다: US8420782, US8470973, US8440431, US8440432, US8450471, US8586363, US8697853, EP2510096, US8586526, US8623618, EP2464750, US2011041195, US2011247089, US2013198878, WO2012/116274, WO2014110552, WO2014070887, WO2014022120, WO2013192316, 및 WO2010008562, 이들 모두는 참조로 포함된다. TALEN은 GeneArt® TALs 상표 상품 및 서비스 하에서 Thermo Fisher Scientific, Inc. (Waltham, MA, US)로부터 상업적으로 얻을 수 있다(공식적으로 Life Technologies 상표로 판매됨).

CRISPR/Cas 기술은 문헌(예를 들어, Cong et al. 'Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems', Science, 15 February 2013: Vol. 339 no. 6121 pp. 819-823)에, 그 중에서도, 다음 특허 문헌에, 광범위하게 설명되어 있다: US 8,697,359, US2010076057, WO2013/176772, US8,771,945, US2010076057, US2014186843, US2014179770, US2014179006, WO2014093712, WO2014093701, WO2014093635, WO2014093694, WO2014093655, WO2014093709, WO2013/188638, WO2013/142578, WO2013/141680, WO2013/188522, US8546553, WO2014/089290, 및 WO2014/093479, 이들 모두는 참조로 포함된다. CRISPR/Cas 시스템은 CRISPR/Cas Nuclease RNA-guided Genome Editing 모음(suite) 상품 및 서비스 하에서 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, US), 또는 GeneArt® CRISPR 상표 상품 및 서비스 하에서 Thermo Fisher Scientific, Inc. (Waltham, MA, US)로부터 상업적으로 얻을 수 있다.

효율적인 적절한 표지 및 초기 배아발생에 대한 최소한의 독성의 강력한 조합은 핵산가수분해요소-인코딩 mRNA의 배아로의 전달에 의해 달성될 수 있다(Geurts, A.M. et al. Knockout rats via embryo microinjection of zinc-finger nucleases. Science (New York, N.Y.) 325, 433 (2009)). 우리는 RELA ZFN을 인코딩하는 ORF를 in vitro mRNA 생성을 위한 두 개의 다른 벡터로 이동시켰다 (in vitro 폴리아데닐화에서 요구되는 pVAX 및 정해진 길이의 폴리A 트랙을 함유하는 pGEM). 두 벡터에 대하여, 우리는 단일 ZFN을 가지는 구조체 및 자가절단 2A 신호에 의해 분리된 동일한 ORF 상의 두 개의 ZFN을 가지는 구조체를 제조하였다. 캡핑되고 폴리아데닐화된 mRNA를 그 다음 모든 구조체로부터 in vitro 전사시키고, 적절한 편집 효율을 돼지 PK15 세포로의 순간적인 형질주입으로 평가하였다.

편집된 염색질의 백분율을 측정하기 위하여, 뒤이어 Serveyor/Cel-1 및 딥-시퀀싱 기반 분석을 행하였다. 양성 대조군 ZFN에 따른 것을 초과하는 모든 경우에 있어서, 모든 4개 벡터/ORF 구성과 함께 강력한 편집 효율이 얻어졌다. 우리는 조작된 핵산가수분해효소의 가축 접합체의 세포질로의 전달이 표적 위치의 비-상동 말단-부착-유도(NHEJ) 절단 수선에 따른 적은 삽입 또는 결실(indel)의 생성을 유발할 수 있다는 것을 이미 밝힌바 있다(Carlson, D.F. et al. Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109, 17382-17387 (2012); Lillico, S.G. et al. Live pigs produced from genome edited zygotes. Scientific reports 3, 2847 (2013); Proudfoot, C. et al. Genome edited sheep and cattle. Transgenic research 24, 147-153 (2015)). 이러한 전달 방법이 DNA 주형과 결합되었을 때 HDR 또한 유발할 수 있는지 명확하지 않다. 우리는 ZFN 쌍과, 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드(ssODN(Chen, F. et al. High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases. Nature methods 8, 753-755 (2011))) 또는 혹멧돼지 SNP를 가지는 플라스미드 DNA 중 하나로 돼지 접합체를 공동-주입하였다. 주입된 접합체를 수용체 어린 암퇘지(gilt)로 이동시켰다(Lillico, S.G. et al. Live pigs produced from genome edited zygotes. Scientific reports 3, 2847 (2013)).

핵산가수분해효소가 돼지 RELA의 표적 편집을 유도했는지 여부를 확인하기 위하여, 산후 2일 새끼돼지에서 귀 노치(notch)를 취하고, 게놈 DNA를 준비하였다. 표적 유전자 자리에 걸친 PCR 및 이러한 산물의 시퀀싱을 적은 삽입 또는 결실(indel) (NHEJ의 결과)을 가지는 대립 유전자 또는 특정한 지점 변이(HDR 건의 결과) 중 하나를 확인하기 위하여 사용하였다. 매우 놀랍게도, 유전자형 어느 동물 내 ZFN 표적 위치에서 삽입 또는 결실(indel)이 관찰되지 않았다; 이는 NHEJ-생성 대립 유전자를 가지는 편집된 동물을 얻기 위한 우리의 능력 및 돼지에서 삽입 또는 결실(indel)에 의한 게놈 편집에 대한 우리의 이전 경험 모두와 대조된다(Carlson, D.F. et al. Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109, 17382-17387 (2012); Lillico, S.G. et al. Live pigs produced from genome edited zygotes. Scientific reports 3, 2847 (2013)).

핵산가수분해효소 표적 부위에서의 삽입 또는 결실(idel)의 결핍은 4 마리의 살아있는 새끼돼지가 RELA의 HDR-생성 대립 유전자를 발생시켰으므로, 게놈 편집 과정 그 자체의 실패 때문은 아니었다(하기 표 2 참조). 네 가지 모두 ZFN-인코딩 mRNA 및 플라스미드 수선 주형과 함께 주입된 46 마리의 동물 집단에서 발생하였다. 반대로, HDR 주형으로 ssODN이 제공된 39 마리의 살아있는 돼지에서 HDR 건이 관찰되지 않았다. HDR 양성 돼지의 표적 유전자 자리에 걸친 PCR 산물의 생어(Sanger) 시퀀싱은 354 및 364 새끼돼지들이 플라스미드 주형에 의해 인코딩된 각각의 5개 염기 변화에서 이형접합체라는 것을 나타내고, 따라서 전장 단상형 유전자 이입을 나타낸다(도 2). 367 새끼돼지는 ZFN 표적 위치 근위의 4개 염기 변화에 동형접합이고, 가장 먼 쪽의 변형에 대해 이형접합이었다. 이러한 발견은 포유류 세포 내 DSB-R 유래 유전자 전환 트랙의 지속성을 증명하는 것이고, 이른 배아 내 두 개의 동족체가 절단되고, 절단의 분명한 HDR-기반 해결이 뒤이은다는 것을 나타낸다. 분명하게도, 새끼돼지 563은 모든 5개 염기 변화에 대해 동형접합이었다.

축산은 동물 육종 이래로 동물 생산성의 지속적인 증가를 가능하게 하였다. 앞으로의 과제는 인구 증가와 함께 기후 변화, 자원 및 토지 이용가능성을 통한 농업에 부과된 요구를 충족시키기 위해 이러한 개선 공정을 가속화하는 것이다. 게놈 편집 기술은 축산에 혁명을 일으킬 잠재력을 가지고 있으며(Fahrenkrug, S.C. et al. Precision genetics for complex objectives in animal agriculture. Journal of animal science 88, 2530-2539 (2010)), 몇몇 가축 종의 표적 유전자 녹아웃은 ZFN, TAL 작용자 핵산가수분해효소 및 CRISPR/Cas9를 포함하는, 다수의 구별되는 설계된 핵산가수분해효소 플랫폼을 이용하여 달성되어 왔다(Hauschild, J. et al. Efficient generation of a biallelic knockout in pigs using zinc-finger nucleases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108, 12013-12017 (2011); Carlson, D.F. et al. Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109, 17382-17387 (2012); Proudfoot, C. et al. Genome edited sheep and cattle. Transgenic research 24, 147-153 (2015); Cui, C. et al. Gene targeting by TALEN-induced homologous recombination in goats directs production of beta-lactoglobulin-free, high-human lactoferrin milk. Scientific reports 5, 10482 (2015); Ni, W. et al. Efficient gene knockout in goats using CRISPR/Cas9 system. PloS one 9, e106718 (2014); Hai, T., Teng, F., Guo, R., Li, W. & Zhou, Q. One-step generation of knockout pigs by zygote injection of CRISPR/Cas system. Cell research 24, 372-375 (2014)).

본 발명자들은 전체 단상형의 표적 이동을 포함하도록 게놈 편집자 도구(genome editors' toolbox)를 현저히 확장시켰다. 특히, 플라스미드 수선 주형을 이용한 ZFN-유도 절단의 상동성 의존적 수선을 통해, 우리는 돼지 종 간에 RELA 유전자의 대립 유전자를 유전자 이입하여, 바람직한 단상형에 대해 이형접합 및 동형접합인 살아있는 새끼돼지를 생성하였다.

재료 및 방법

ZFN 설계 및 확인

돼지 RELA 유전자의 지시된 위치에 대한 ZFN을 설명된 바와 같이 사전-검증된 두-핑거 모듈의 보관소(archive)를 이용하여 설계하고 조립하였다(Urnov, F.D., Rebar, E.J., Holmes, M.C., Zhang, H.S. & Gregory, P.D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature reviews. Genetics 11, 636-646 (2010)). ORF를 DNA 형태의 전달 및 in vitro 전사된 mRNA의 생산에 최적화된 FokI(20) 형태의 향상된 절대의 헤테로다이머 형태의 온상인 발현 벡터로 클로닝하였다(Vierstra et al., 인쇄 중). ZFN 표적 서열 및 DNA 인식 헬릭스를 표 1에 나타내었다. 돼지 PK15 세포들을 설명된 바와 같은 ZFN-인코딩 DNA 또는 mRNA를 이용하여 전기 천공시키고, 전기 천공에 뒤이어 게놈 DNA를 48시간 동안 수확하고, 삽입 또는 결실(indel)을 가지는 염색질의 백분율을 설명된 바와 같이 Surveyor/Cel1(Guschin, D.Y. et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods in molecular biology (Clifton, N.J .) 649, 247-256 (2010)) 또는 Illumina 플랫폼 상의 딥 시퀀싱을 이용하여 측정하였다.

[표 1a]

ZFN 표적 서열 (서열번호는 괄호 안에 제공)

[표 1b]

ZFN DNA 인식 헬릭스

HDR 주형의 설계 및 제작

ZFN의 표적 위치에 걸쳐 있고, 어느 유전자 이입된 대립 유전자의 ZFN 재-절단을 방지하는 것을 돕기 위한 세 번째(침묵) 염기 변화에 더하여, 바람직한 T448A 전환을 인코딩하는 두 개 염기 변화(도 1)를 함유하는 96-mer ssODN을 설계하였다. S485P 및 S531P를 인코딩하는 추가의 단일 염기 변화와 함께, ZFN 표적 위치에서 ssODN과 동일한 세 가지 염기 변화를 가진, 플라스미드 DNA 주형을 설계하였다(도 1). 모든 5개 염기 변화를 포함하는 이러한 251 bp 중앙 도메인을 첫 번째 염기 변화에 5' 및 최종 염기 변화에 3'로 각각, 626 bp 및 799 bp의 상동 부분(homology arm)에 의해 측면에 배치하였다.

접합체 주입 및 이동

사용 시기에 대략 9개월령이고 적어도 120kg의 무게가 나가는 라아지-화이트 어린 암퇘지(Large-White gilts)로부터 배아를 생산하였다. 관찰된 발정기 후 11일 및 15일 사이에, 4일 동안 매일 한 번 20 mg 알트레노제스트(altrenogest, Regumate, Hoechst Roussel Vet Ltd) 및 5일 째 날에 두 번 20 mg 알트레노제스트의 공급으로 과-배란을 달성하였다. 6일 째 날에, 20:00시에 1500 IU의 eCG (PMSG, Intervet UK Ltd)를 주입하였다. 83시간 후에 750 IU hCG (Chorulon, Intervet UK Ltd)를 주입하였다. 공여 어린 암퇘지를 과-배란 후 열 발생을 나타낸 후 6시간 사이를 두고 두 번 수정시켰다. 배아를 발정기 후 1일 째에 일반적인 마취 하에서 중심선 개복에 의해 짝지어진 공여체로부터 NCSU-23 HEPES 염기 배지에서 외과적으로 회수하였다. 배아에 ssODN과 함께 2 ng/μL 또는 4 ng/μL에서 pVAX 단일 mRNA, 또는 플라스미드 주형, 각각의 단일 2-5pl 세포질 주입을 하였다. 수용체 암컷은 공여자 어린 암퇘지와 동일한 처리를 받았으나, 짝지어지지 않은 상태로(un-mated) 남았다. ZFN 주입 후에, 수정된 배아를 일반적인 마취 하 중심선 개복에 뒤이에 수용체 어린 암퇘지로 이동시켰다. 수술 중에, 재생 트랙을 노출시키고, 배아를 3.5 프랑스 게이지 수고양이 카테테르를 이용하여 수용체의 난관으로 이동시켰다. 산자수는 1-13 새끼돼지 범위였다.

[표 2]

돼지 접합체 주입의 요약

유전자형(Genotyping)

게놈 DNA를 산후 2일째 새끼돼지로부터 취한 귀 생체 검사로부터 준비하였다. AccuPrime HiFi로의 PCR 증폭을 플라스미드에 의해 인코딩된 5' 상동 부분(homology arm)과 결합하는 프라이머 oSL1(gggtacaaagaggggtgagg - 서열번호 13) 및 플라스미드의 3' 상동 부분 내에 결합하는 oSL2(ctagctctgccctttccaga - 서열번호 14)를 이용하여 수행하였다. 95℃에서 120초 동안, 그 다음 94℃에서 30초 동안 40 사이클, 59℃에서 30초 동안, 및 68℃에서 90초 동안의 순환에, 뒤이어 68℃에서 5분 동안의 프라이머 연장이 있었다. 정제된 PCR 산물을 직접 시퀀싱하였다.

참조 서열

Sus scrofa v-rel 조류(avian) 세망내피계 바이러스성 암유전자 호몰로그 A (RELA), mRNA/cDNA 서열 (NCBI Accesion NM_001114281, 버전 NM_001114281.1), ZFN 결합 위치는 밑줄 그어져 있고, 절단 위치는 진하게 나타낸 두 개의 염기 사이에 위치한다:

1 atggacgacc tcttccccct catcttcccc tcggagccgg ccccggcctc gggcccctat

61 gtggagatca tcgagcagcc caagcagcgg ggcatgcgct tccgctacaa gtgcgagggc

121 cgctcagccg gcagtatccc gggcgagagg agcacggata ccaccaagac ccaccccacc

181 atcaagatca atggctacac ggggccaggg acagtgcgca tctccctggt caccaaggac

241 ccccctcacc ggcctcaccc ccatgagctc gtggggaaag actgccggga tggcttctat

301 gaggctgagc tctgcccaga ccgctgcatc cacagcttcc agaacctggg gatccagtgt

361 gtaaagaagc gggacctgga acaggccatc aatcagcgca tccagaccaa caacaacccc

421 ttccaagttc ccatagaaga gcagcgcggg gactacgacc tgaatgctgt gcggctctgc

481 ttccaggtga cagtgcggga cccagcaggc aggcccctcc gcctgccgcc tgtcctctct

541 caccccatct ttgacaaccg tgcccccaac actgcagagc tcaagatctg ccgggtgaat

601 cggaactcgg ggagctgcct tgggggcgat gagatcttcc tgctgtgcga caaggtgcag

661 aaagaggaca tcgaggtgta tttcacgggc ccgggctggg aggcccgagg ctccttttca

721 caagccgacg tgcaccgaca agtggccatc gtgttccgga cgcctcccta cgcggacccc

781 agcctgcagg cccccgtgcg cgtctccatg cagctgcggc ggccttcgga tcgggagctc

841 agcgagccca tggaattcca gtacttgcca gacacagatg accggcaccg gattgaggag

901 aaacgcaaaa ggacctatga gacctttaag agcatcatga agaagagtcc tttcaatgga

961 cccaccgacc cccggcctgc aacccggcgc attgctgtgc cttcccgcag ctcagcttcc

1021 gtccccaagc cagctcccca gccctatccc tttacgccat ctctcagcac catcaacttt

1081 gacgagttca cgcccatggc ctttgcttct gggcagatcc caggccagac ctcagccttg

1141 gccccagccc ctgccccagt cctggtccag gccccagccc cggccccagc cccagccatg

1201 gcatcagctc tggcccaggc cccagcccct gtccccgtcc tagcccccgg ccttgctcag

1261 gctgtggccc cgcctgcccc taaaaccaac caggctgggg aagggacact gacagaggcc

1321 ctgctgcagc tgcagtttga tactgatgag gacctggggg ccctgctcgg caataacact

1381 gacccgaccg tgttcacgga cctggcatcc gtcgacaact ctgagtttca gcagctgctg

1441 aaccagggtg tatccatgcc cccccacaca gctgagccca tgctgatgga gtaccctgag

1501 gctataactc gcttggtgac agggtcccag agaccccctg acccagctcc cactcccctg

1561 ggggcctctg ggctcaccaa cggtctcctc tcgggggacg aagacttctc ctccattgcg

1621 gacatggact tctcagccct tctgagtcag atcagctcct aa (서열번호 15)

Sus scrofa RELA, 단백질 서열 (NCBI Reference Sequence: NP_001107753.1):

MDDLFPLIFPSEPAPASGPYVEIIEQPKQRGMRFRYKCEGRSAGSIPGERSTDTTKTHPTIKINGYTGPGTVRISLVTKDPPHRPHPHELVGKDCRDGFYEAELCPDRCIHSFQNLGIQCVKKRDLEQAINQRIQTNNNPFQVPIEEQRGDYDLNAVRLCFQVTVRDPAGRPLRLPPVLSHPIFDNRAPNTAELKICRVNRNSGSCLGGDEIFLLCDKVQKEDIEVYFTGPGWEARGSFSQADVHRQVAIVFRTPPYADPSLQAPVRVSMQLRRPSDRELSEPMEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFNGPTDPRPATRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTPSLSTINFDEFTPMAFASGQIPGQTSALAPAPAPVLVQAPAPAPAPAMASALAQAPAPVPVLAPGLAQAVAPPAPKTNQAGEGTLTEALLQLQFDTDEDLGALLGNNTDPTVFTDLASVDNSEFQQLLNQGVSMPPHTAEPMLMEYPEAITRLVTGSQRPPDPAPTPLGASGLTNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISS (서열번호 16)

<110> THE UNIVERSITY COURT OF THE UNIVERSITY OF EDINBURGH <120> Genetically-Edited Swine <130> IP2167GB <150> GB 1517227.3 <151> 2015-09-29 <150> PCT/GB 2016/053025 <151> 2016-09-29 <160> 23 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 41 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 1 agaggccctg ctgcagctgc agtttgatac tgatgaggac c 41 <210> 2 <211> 41 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 2 tctccgggac gacgtcgacg tcaaactatg actactcctg g 41 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZFN DNA recognition helicase <400> 3 Asp Arg Ser Asp Leu Ser Arg 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZFN DNA recognition helicase <400> 4 Arg Ser Asp Asn Leu Thr Arg 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZFN DNA recognition helicase <400> 5 Thr Ser Gly Asn Leu Thr Arg 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZFN DNA recognition helicase <400> 6 Leu Arg Gln Asp Leu Asn Lys 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZFN DNA recognition helicase <400> 7 Thr Ser Ser Asn Leu Ser Arg 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZFN DNA recognition helicase <400> 8 Ala Met Gln Thr Leu Arg Val 1 5 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZFN DNA recognition helicase <400> 9 Asp Arg Ser His Leu Ala Arg 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZFN DNA recognition helicase <400> 10 Arg Ser Asp Asn Leu Ser Glu 1 5 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZFN DNA recognition helicase <400> 11 Lys Arg Cys Asn Leu Arg Cys 1 5 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZFN DNA recognition helicase <400> 12 Arg Ser Ala Val Leu Ser Glu 1 5 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer oSL1 sequence <400> 13 gggtacaaag aggggtgagg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer oSL2 sequence <400> 14 ctagctctgc cctttccaga 20 <210> 15 <211> 1662 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 15 atggacgacc tcttccccct catcttcccc tcggagccgg ccccggcctc gggcccctat 60 gtggagatca tcgagcagcc caagcagcgg ggcatgcgct tccgctacaa gtgcgagggc 120 cgctcagccg gcagtatccc gggcgagagg agcacggata ccaccaagac ccaccccacc 180 atcaagatca atggctacac ggggccaggg acagtgcgca tctccctggt caccaaggac 240 ccccctcacc ggcctcaccc ccatgagctc gtggggaaag actgccggga tggcttctat 300 gaggctgagc tctgcccaga ccgctgcatc cacagcttcc agaacctggg gatccagtgt 360 gtaaagaagc gggacctgga acaggccatc aatcagcgca tccagaccaa caacaacccc 420 ttccaagttc ccatagaaga gcagcgcggg gactacgacc tgaatgctgt gcggctctgc 480 ttccaggtga cagtgcggga cccagcaggc aggcccctcc gcctgccgcc tgtcctctct 540 caccccatct ttgacaaccg tgcccccaac actgcagagc tcaagatctg ccgggtgaat 600 cggaactcgg ggagctgcct tgggggcgat gagatcttcc tgctgtgcga caaggtgcag 660 aaagaggaca tcgaggtgta tttcacgggc ccgggctggg aggcccgagg ctccttttca 720 caagccgacg tgcaccgaca agtggccatc gtgttccgga cgcctcccta cgcggacccc 780 agcctgcagg cccccgtgcg cgtctccatg cagctgcggc ggccttcgga tcgggagctc 840 agcgagccca tggaattcca gtacttgcca gacacagatg accggcaccg gattgaggag 900 aaacgcaaaa ggacctatga gacctttaag agcatcatga agaagagtcc tttcaatgga 960 cccaccgacc cccggcctgc aacccggcgc attgctgtgc cttcccgcag ctcagcttcc 1020 gtccccaagc cagctcccca gccctatccc tttacgccat ctctcagcac catcaacttt 1080 gacgagttca cgcccatggc ctttgcttct gggcagatcc caggccagac ctcagccttg 1140 gccccagccc ctgccccagt cctggtccag gccccagccc cggccccagc cccagccatg 1200 gcatcagctc tggcccaggc cccagcccct gtccccgtcc tagcccccgg ccttgctcag 1260 gctgtggccc cgcctgcccc taaaaccaac caggctgggg aagggacact gacagaggcc 1320 ctgctgcagc tgcagtttga tactgatgag gacctggggg ccctgctcgg caataacact 1380 gacccgaccg tgttcacgga cctggcatcc gtcgacaact ctgagtttca gcagctgctg 1440 aaccagggtg tatccatgcc cccccacaca gctgagccca tgctgatgga gtaccctgag 1500 gctataactc gcttggtgac agggtcccag agaccccctg acccagctcc cactcccctg 1560 ggggcctctg ggctcaccaa cggtctcctc tcgggggacg aagacttctc ctccattgcg 1620 gacatggact tctcagccct tctgagtcag atcagctcct aa 1662 <210> 16 <211> 553 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 16 Met Asp Asp Leu Phe Pro Leu Ile Phe Pro Ser Glu Pro Ala Pro Ala 1 5 10 15 Ser Gly Pro Tyr Val Glu Ile Ile Glu Gln Pro Lys Gln Arg Gly Met 20 25 30 Arg Phe Arg Tyr Lys Cys Glu Gly Arg Ser Ala Gly Ser Ile Pro Gly 35 40 45 Glu Arg Ser Thr Asp Thr Thr Lys Thr His Pro Thr Ile Lys Ile Asn 50 55 60 Gly Tyr Thr Gly Pro Gly Thr Val Arg Ile Ser Leu Val Thr Lys Asp 65 70 75 80 Pro Pro His Arg Pro His Pro His Glu Leu Val Gly Lys Asp Cys Arg 85 90 95 Asp Gly Phe Tyr Glu Ala Glu Leu Cys Pro Asp Arg Cys Ile His Ser 100 105 110 Phe Gln Asn Leu Gly Ile Gln Cys Val Lys Lys Arg Asp Leu Glu Gln 115 120 125 Ala Ile Asn Gln Arg Ile Gln Thr Asn Asn Asn Pro Phe Gln Val Pro 130 135 140 Ile Glu Glu Gln Arg Gly Asp Tyr Asp Leu Asn Ala Val Arg Leu Cys 145 150 155 160 Phe Gln Val Thr Val Arg Asp Pro Ala Gly Arg Pro Leu Arg Leu Pro 165 170 175 Pro Val Leu Ser His Pro Ile Phe Asp Asn Arg Ala Pro Asn Thr Ala 180 185 190 Glu Leu Lys Ile Cys Arg Val Asn Arg Asn Ser Gly Ser Cys Leu Gly 195 200 205 Gly Asp Glu Ile Phe Leu Leu Cys Asp Lys Val Gln Lys Glu Asp Ile 210 215 220 Glu Val Tyr Phe Thr Gly Pro Gly Trp Glu Ala Arg Gly Ser Phe Ser 225 230 235 240 Gln Ala Asp Val His Arg Gln Val Ala Ile Val Phe Arg Thr Pro Pro 245 250 255 Tyr Ala Asp Pro Ser Leu Gln Ala Pro Val Arg Val Ser Met Gln Leu 260 265 270 Arg Arg Pro Ser Asp Arg Glu Leu Ser Glu Pro Met Glu Phe Gln Tyr 275 280 285 Leu Pro Asp Thr Asp Asp Arg His Arg Ile Glu Glu Lys Arg Lys Arg 290 295 300 Thr Tyr Glu Thr Phe Lys Ser Ile Met Lys Lys Ser Pro Phe Asn Gly 305 310 315 320 Pro Thr Asp Pro Arg Pro Ala Thr Arg Arg Ile Ala Val Pro Ser Arg 325 330 335 Ser Ser Ala Ser Val Pro Lys Pro Ala Pro Gln Pro Tyr Pro Phe Thr 340 345 350 Pro Ser Leu Ser Thr Ile Asn Phe Asp Glu Phe Thr Pro Met Ala Phe 355 360 365 Ala Ser Gly Gln Ile Pro Gly Gln Thr Ser Ala Leu Ala Pro Ala Pro 370 375 380 Ala Pro Val Leu Val Gln Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Met 385 390 395 400 Ala Ser Ala Leu Ala Gln Ala Pro Ala Pro Val Pro Val Leu Ala Pro 405 410 415 Gly Leu Ala Gln Ala Val Ala Pro Pro Ala Pro Lys Thr Asn Gln Ala 420 425 430 Gly Glu Gly Thr Leu Thr Glu Ala Leu Leu Gln Leu Gln Phe Asp Thr 435 440 445 Asp Glu Asp Leu Gly Ala Leu Leu Gly Asn Asn Thr Asp Pro Thr Val 450 455 460 Phe Thr Asp Leu Ala Ser Val Asp Asn Ser Glu Phe Gln Gln Leu Leu 465 470 475 480 Asn Gln Gly Val Ser Met Pro Pro His Thr Ala Glu Pro Met Leu Met 485 490 495 Glu Tyr Pro Glu Ala Ile Thr Arg Leu Val Thr Gly Ser Gln Arg Pro 500 505 510 Pro Asp Pro Ala Pro Thr Pro Leu Gly Ala Ser Gly Leu Thr Asn Gly 515 520 525 Leu Leu Ser Gly Asp Glu Asp Phe Ser Ser Ile Ala Asp Met Asp Phe 530 535 540 Ser Ala Leu Leu Ser Gln Ile Ser Ser 545 550 <210> 17 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein encoded by the edited RELA gene <400> 17 Leu Leu Gln Leu Gln Phe Asp Ala Asp Glu Asp Leu Gly Ala Leu Leu 1 5 10 15 Gly Asn Asn Thr Asp Pro Thr Val Phe Thr Asp Leu Ala Ser Val Asp 20 25 30 Asn Ser Glu Phe Gln Gln Leu Leu Asn Gln Gly Val Pro Met Pro Pro 35 40 45 His Thr Ala Glu Pro Met Leu Met Glu Tyr Pro Glu Ala Ile Thr Arg 50 55 60 Leu Val Thr Gly Ser Gln Arg Pro Pro Asp Pro Ala Pro Thr Pro Leu 65 70 75 80 Gly Ala Ser Gly Leu Thr Asn Gly Leu Leu Pro Asp Gly Glu Asp Phe 85 90 95 Ser Ser Ile Ala Asp Met 100 <210> 18 <211> 15 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 18 gatactgatg aggac 15 <210> 19 <211> 15 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 19 ctccgggacg acgtc 15 <210> 20 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence which prevents recutting by the SSN <400> 20 gatgcagacg aggac 15 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 21 tgcagtttga tactgatgag gac 23 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> post-introgression sequence <400> 22 tgcagtttga tgcagacgag gac 23 <210> 23 <211> 84 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein encoded by the edited RELA gene <400> 23 Ala Asp Glu Asp Leu Gly Ala Leu Leu Gly Asn Asn Thr Asp Pro Thr 1 5 10 15 Val Phe Thr Asp Leu Ala Ser Val Asp Asn Ser Glu Phe Gln Gln Leu 20 25 30 Leu Asn Gln Gly Val Pro Met Pro Pro His Thr Ala Glu Pro Met Leu 35 40 45 Met Glu Tyr Pro Glu Ala Ile Thr Arg Leu Val Thr Gly Ser Gln Arg 50 55 60 Pro Pro Asp Pro Ala Pro Thr Pro Leu Gly Ala Ser Gly Leu Thr Asn 65 70 75 80 Gly Leu Leu Pro

Claims (42)

1. RELA 유전자 내 유전자 이입(introgressed) 이종 핵산 서열을 포함하는 유전자 편집 돼지.
2. 제1항에 있어서, 상기 돼지는 가축(domestic) 돼지인, 유전자 편집 돼지.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유전자 이입 이종 핵산 서열은 이종 RELA 대립 유전자를 포함하는, 유전자 편집 돼지.
4. 제3항에 있어서, 상기 유전자 이입 이종 서열은 종간(trans-species) 이종 RELA 대립 유전자를 포함하는, 유전자 편집 돼지.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 이입 이종 핵산 서열은 야생형 RELA 대립 유전자를 그에 상응하는 혹멧돼지(warthog) RELA 대립 유전자로 전환한 것인, 유전자 편집 돼지.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 두 개 이상의 염기가 변화되어 야생형 RELA 대립 유전자 서열과 상이한 유전자 이입 RELA 대립 유전자를 포함하는, 유전자 편집 돼지.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 50개 이상의 염기 길이의 유전자 이입 이종 핵산을 포함하는, 유전자 편집 돼지.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 편집 돼지의 모든 세포들이 유전자 이입 이종 핵산 서열을 함유하는, 유전자 편집 돼지.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 이입 이종 핵산 서열이 RELA 단백질 서열을 변화시키는, 유전자 편집 돼지.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 이입 이종 핵산 서열이 RELA의 전사활성화 도메인을 인코딩하는 RELA 유전자의 영역 내 서열을 변화시키는, 유전자 편집 돼지.
11. 제10항에 있어서, 상기 유전자 이입 이종 핵산 서열이 RELA의 448 내지 531 아미노산을 인코딩하는 RELA 유전자의 영역을 변화시키는, 유전자 편집 돼지.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, RELA 유전자의 유전자 이입 종간 대립 유전자를 포함하는, 유전자 편집 돼지.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 이입 혹멧돼지 RELA 유전자를 포함하는 가축 돼지인, 유전자 편집 돼지.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돼지는 유전자 이입 RELA 대립 유전자에 대하여 이중 대립 유전자인, 유전자 편집 돼지.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 가축 돼지이고, 상기 유전자 이입 이종 핵산 서열이 RELA의 다음 아미노산 중 하나 이상의 변화를 일으키는, 유전자 편집 돼지:
    - T448;
    - S485; 및
    - S531.
16. 제15항에 있어서, 세 개의 아미노산 모두가 변화된, 유전자 편집 돼지.
17. 제15항 또는 제16항에 있어서, RELA에 대하여 T448A, S485P, 및 S531P 아미노산 중 적어도 하나의 변화를 포함하는, 유전자 편집 돼지.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, RELA에 대하여 T448A, S485P, 및 S531P 아미노산의 변화를 일으키는, 유전자 이입 이종 핵산 서열을 포함하는 가축 돼지인, 유전자 편집 돼지.
19. 제18항에 있어서, 유전자 이입 이종 핵산에 의해, RELA의 T448A, S485P, 및 S531P 외의 아미노산의 변화가 유발되지 않는, 유전자 편집 돼지.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 나타낸 서열을 인코딩하도록 RELA 유전자가 편집된 가축 돼지인, 유전자 편집 돼지:
    LLQLQFDADEDLGALLGNNTDPTVFTDLASVDNSEFQQLLNQGVPMPPHTAEPMLMEYPEAITRLVTGSQRPPDPAPTPLGASGLTNGLLPDGEDFSSIADM (서열번호 17).
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 이입 이종 핵산 서열로부터 생긴 ASFV 감염에 대한 향상된 저항력을 가지는 가축 돼지인, 유전자 편집 돼지.
22. RELA 유전자 내 유전자 이입 이종 핵산 서열을 포함하는 돼지의 세포 핵, 생식 세포, 줄기 세포, 배우자, 배반포, 배아, 태아 및/또는 공여 세포.
23. 유전자 이입 혹멧돼지 RELA 대립 유전자를 포함하는, 제11항에 따른 돼지의 세포 핵, 생식 세포, 줄기 세포, 배우자, 배반포, 배아, 태아 및/또는 공여 세포.
24. 다음 단계를 포함하는 RELA 유전자 내 유전자 이입 이종 핵산 서열을 가지는 유전자 편집 돼지의 생산 방법:
    - 돼지 접합체를 제공하는 단계;
    - 상기 접합체로 위치-특이적 핵산가수분해효소를 도입하는 단계로서, 핵산가수분해효소는 편집될 RELA 유전자 내 바람직한 게놈 서열을 표적하고, 이중 가닥 절단을 도입하기 위하여 개작된 것인 단계;
    - 이종 핵산 서열을 포함하는 주형 핵산을 RELA 유전자에 유전자 이입되도록 도입시키는 단계로서, 상기 이종 서열은 게놈 RELA 서열에 상동인 서열로 측면에 배치된 것인 단계;
    - 위치-특이적 핵산가수분해효소에 의한 게놈의 절단 및 상동 직접 수선에 의한 RELA 유전자로의 상기 이종 핵산 서열의 유전자 이입을 가능하게 하기 위한 적절한 조건 하에서 상기 접합체를 배양하는 단계; 및
    - 상기 접합체로부터 동물을 생성하는 단계.
25. 제24항에 있어서, 상기 돼지는 가축 돼지인, 방법.
26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 위치-특이적 핵산가수분해효소는 RELA의 전사 활성화 도메인을 인코딩하는 RELA 유전자 영역 내에서 표적하고 절단하기 위해 개작된 것인, 방법.
27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 위치-특이적 핵산가수분해효소는 RELA 유전자의 엑손 9 내에서 표적하고 절단하기 위해 개작된 것인, 방법.
28. 제27항에 있어서, 상기 위치-특이적 핵산가수분해효소는 T448 아미노산을 인코딩하는 RELA 유전자의 영역의 상류(upstream)를 표적하고 절단하기 위해 개작된 것인, 방법.
29. 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 위치-특이적 핵산가수분해효소는 서열번호 15의 염기 1200 및 1341 사이에 있는 RELA 유전자의 서열을 표적하고 절단하기 위해 개작된 것인, 방법.
30. 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 위치-특이적 핵산가수분해효소는 협동 위치-특이적 핵산가수분해효소의 한 쌍을 포함하고, 쌍 중 하나의 표적 위치는 GATACTGATGAGGAC (서열번호 18)이고, 쌍 중 다른 하나의 표적 위치는 CTCCGGGACGACGTC (서열번호 19)인, 방법.
31. 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산가수분해효소를 인코딩하는 mRNA가 상기 접합체에 도입된, 방법.
32. 제24항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 핵산 서열의 유전자 이입이 단일 세포 단계의 접합체 내에서 완료되는, 방법.
33. 제24항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 주형 핵산은 상동 서열에 의해 각 측면에 배치된 이종 핵산 서열을 포함하는 영역을 포함하는, 방법.
34. 제24항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 주형 구조체는 50개 이상의 염기 길이의 이종 핵산 서열을 포함하는, 방법.
35. 제24항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 주형 핵산은 SSN에 대한 표적 위치에서 상응하는 게놈 핵산 서열과 비교하여 두 개 이상의 염기 변화를 포함하는, 방법.
36. 제26항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 주형 핵산은 상동 서열에 의해 각 측면에 배치된 혹멧돼지 RELA 단상형(haplotype)을 포함하는 영역을 포함하는, 방법.
37. 제26항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, RELA에 대한 T448A, S485P 및 S531P 아미노산의 변화를 유발하는 이종 핵산 서열을 유전자 이입하는 것을 포함하는, 방법.
38. 제26항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 주형 핵산은 상동 영역에 의해 측면에 배치된, 다음 단백질 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 251개 이상의 뉴클레오티드 길이의 혹멧돼지 RELA를 포함하는 영역을 포함하는, 방법:
    ADEDLGALLGNNTDPTVFTDLASVDNSEFQQLLNQGVPMPPHTAEPMLMEYPEAITRLVTGSQRPPDPAPTPLGASGLTNGLLP (서열번호 23).
39. 제26항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 주형 핵산은 이중 가닥인, 방법.
40. 제26항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 주형 핵산은 플라스미드에 제공되는, 방법.
41. 제26항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 주형은 626 bp 및 799 bp의 상동 위치(homology arm)에 의해 측면에 배치된 혹멧돼지 RELA 단상형을 포함하는 251 bp 영역을 포함하는 플라스미드인, 방법.
42. 제24항에 있어서, 다음 단계를 포함하는, 방법:
    - 돼지 접합체를 제공하는 단계;
    - 상기 접합체로 한 쌍의 협동 위치-특이적 핵산가수분해효소를 도입하는 단계로서, 핵산가수분해효소는 20bp의 T448A를 인코딩하는 서열 내 영역에서 RELA 유전자를 표적하고, 이중 가닥 절단을 도입하기 위하여 개작된 것인 단계;
    - 돼지의 게놈 RELA 서열에 상동인 서열에 의해 측면에 배치된 상응하는 혹멧돼지 RELA 단상형을 인코딩하는 서열을 포함하는 이종 핵산 서열을 포함하는 주형 핵산을 도입시키는 단계;
    - 위치-특이적 핵산가수분해효소에 의한 게놈의 절단 및 상동 직접 수선에 의한 RELA 유전자로의 상기 이종 핵산 서열의 유전자 이입을 가능하게 하기 위한 적절한 조건 하에서 상기 접합체를 배양하는 단계; 및
    - 상기 접합체로부터 동물을 생성하는 단계.

Images