MX2015000074A - Animales geneticamente modificados y metodos para hacer los mismos. - Google Patents

Abstract

Se establecen composiciones y métodos para el uso de TALENs para hacer ganado y otros animales genéticamente modificados. Algunas de las modalidades de la invención se proporcionan para hacer un animal progenitor que está completamente libre de todas las modificaciones genéticas no planeadas. Algunas modalidades se dirigen a remover defectos genéticos en razas establecidas sin hacer otras alteraciones al genoma. Otras modalidades se dirigen a herramientas o procesos particulares tales como TALENs con un truncamiento preferido.

Description

ANIMALES GENÉTICAMENTE MODIFICADOS Y MÉTODOS PARA HACER LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN El campo téenico se refiere a la creación de animales modificados genéticamente, por ejemplo, animales de ganado con rasgos funcionales, y también se refiere a métodos in vitro para la fabricación de células modificadas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las secuencias del efector tipo activador de transcripción (TAL) puede ensamblarse para unir objetivos de ADN con especificidad mediante el ensamblaje de secuencias de repetición variable diresiduo (RVDS). La fusión de proteínas TAL efectoras y nucleasas (TALENs) pueden romper la doble hélice objetivo de ADN celular que pueden ser utilizados para hacer modificaciones genéticas específicas a las células. Los TALENs se han reportado como útiles para generar modificaciones estables de células madre de embriones humanos y clones de células madre pluripotentes inducidas, para generar C. elegans agénicos, y pez cebra agénicos.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Los efectores tipo activador de transcripción (TAL) (TALEs) fusionados con nucleasas (TALENs) se han reportado para su uso en la modificación genética de las células. Estos informes se han centrado generalmente en células vegetales, lineas celulares animales transformadas (inmortalizadas), o células madre embrionarias de ratón. La Fig. 1 representa algunas de las características de un sistema de ingeniería genética basada en TALEN.

Una primera modalidad de la invención es un método de fabricación de un animal modificado genéticamente, comprendiendo dicho método la exposición de los embriones o células a un ARNm codificando un TALEN, con el TALEN unido específicamente a un sitio cromosómico objetivo en los embriones o células, la clonación de las células en la madre sustituta o implantando los embriones en una madre sustituta, con la madre sustituta gestando un animal gue se ha modificado genéticamente sin un gen reportero y sólo al sitio cromosómico dirigido por TALEN.

Una segunda modalidad de la invención es un método de fabricación de una célula animal no humana modificada genéticamente o el embrión o los embriones que comprende exponer las células del animal in vitro a un ARNm que codifica un TALEN, con el TALEN específicamente unido a un sitio cromosomal objetivo en los embriones o células, con las células o embriones siendo modificados genéticamente sólo en el sitio cromosomal objetivo y con el método que se realiza sin un gen reportero.

Una tercera modalidad de la invención es un método de creación de una modificación genética que comprende exponer una célula primaria no humana en un cultivo in vitro o de un embrión no humano a un ácido nucleico que codifica un TALEN, donde el ácido nucleico codifica una porción líder N-terminal teniendo al menos 80% de homología con la SEQ ID NO: 132.

Otras modalidades se dirigen a uno o más de estos métodos, u otros materiales y métodos en el presente documento que comprende uno o más de los siguientes: La exposición de los embriones al TALEN sin un gen reportero, con más de aproximadamente el 1% de los embriones que incorporan la modificación en el sitio cromosomal objetivo; proporcionar embriones que tienen la genética conocidas por ser capaz de expresar un conjunto de rasgos y la exposición de los embriones al TALEN sin un gen reportero y la detección del animal gestado para la modificación y para la expresión del conjunto de rasgos; que comprende exponer las células al TALEN sin un gen reportero, y la clonación de las células, con más de 1% de las células clonadas que proporcionan animales que incorporan la modificación en el sitio cromosómico dirigida que comprende exponer las células a la TALEN sin un gen reportero, la creación de colonias de células clónales, y probar -un subconjunto de los miembros de las colonias para identificar las colonias que incorporan la modificación en el sitio cromosomal objetivo; en el que probar el subconjunto de los miembros de las colonias es un proceso destructivo; en el que el proceso de prueba se selecciona de entre el grupo que consiste de un ensayo de nucleolitica, secuenciación, PAGE, PCR, extensión cebador, o hibridación; en el que la modificación genética se selecciona de entre el grupo constituido por una inserción, supresión, inversión o transubicación; en el que el TALEN es un primer TALEN y el sitio cromosomal objetive es un primer sitio, con el método que comprende además un segundo TALEN dirigido a un segundo sitio cromosomal objetivo; que comprende la exposición de los embriones o células de ADN de hebra sencilla (ADN c) que contiene una secuencia exógena, con la modificación genética que comprende la secuencia exógena; en el que la secuencia exógena comprende un alelo alternativo para el TALEN dirigido al sitio cromosómico; en el que el alelo alternativo está ligado a un rasgo cuantitativo o rasgo cualitativo; en el que el alelo alternativo comprende un alelo de miostatina presente en las reses azul belga; en donde la célula o embrión pertenece a una primera raza y el alelo pertenece a una segunda raza del animal; en el que la primera raza es ganado Wagyu o Nelore y la segunda raza son reses azul belga, con la -descendencia de ser un ternero Wagyu o Nelore; en el que el alelo se selecciona de entre el grupo constituido por una inserción, una eliminación, un polimorfismo, y polimorfismo de un solo nucleótido; en el que el sitio cromosomal objetivo se elige para que una interrupción de un gen y la interrupción del gen comprende una inserción, supresión o sustitución de uno o más bases en una secuencia que codifica el gen y/o un elemento cis-regulador del mismo; en el que la modificación genética se selecciona de entre el grupo constituido por una inserción, una eliminación, un cambio en una secuencia de ácido nucleico exógeno, una inversión, una transubicación, una conversión génica para el alelo natural, una conversión génica para un alelo sintética, la migración alelo interespecies, migración alelo intraespecifica, y una conversión de genes a un nuevo alelo; que comprende el suministro de una recombinasa para la célula o embrión; en el que el ARNm TALEN se introduce directamente en la célula como ARNm; en el que la introducción directa en la célula comprende un método seleccionado de entre el grupo que consiste en electroporación, transíección, lipofección, liposoma, nucleofección, las partículas de bombardeo de partículas, nanopartículas, la transfección de lípidos, electrofusión, y la inyección directa; en el que el ARNm TALEN se introduce en la célula como un plásmido que codifica el ARNm; en el que el ADNmc se introduce en la célula después de un vector que codifica una TALEN se introduce en la célula; en el que ADNmc se introduce en la célula de entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 3 dias después de que el vector que expresa un TALEN se introduce en la célula; en el que TALEN ARNm se introduce directamente en la célula en aproximadamente el mismo tiempo que el ADNmc; en el que la célula es una célula primaria o célula madre y el método se realiza sin una etapa de selección que requiere ya sea positiva o un criterio de selección de supervivencia negativo; en donde el animal gestado se elige del grupo que consiste de cerdos, vacas, ovejas, cabras, pollos, conejos, peces, pez cebra, perro, ratón, gato, ratón, rata, y animales de laboratorio; en donde la célula se selecciona del grupo que consiste de una célula de ganado, una célula de artiodáctilos, una célula cultivada, una célula primaria, una célula somática primaria, un cigoto, una célula germinal primordial, una célula madre, y un cigoto, o en el que el embrión es un blastocisto; en el que el TALEN es un TALEN derecha y que comprende además un TALEN izquierda que se introduce con el TALEN derecho; con las células de ser células somáticas primarias o células madre; con las células siendo clonados por transferencia nuclear de células somáticas o transferencia de la cromatina; y en el que el animal es homocigótico gestado para la modificación; en donde el animal gestado es un animal progenitor.

Otras modalidades están dirigidas a un organismo (un animal modificado genéticamente, un animal progenitor transgénico, o una célula modificada genéticamente) preparado de acuerdo con uno o más de estos métodos.

Las siguientes solicitudes de patentes se incorporan aquí para referencia para todos los propósitos; en caso de conflicto, la especificación controla: US 2010/0146655, US 2010/0105140, US 2011/0059160, y US 2011/0197290.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Fig. 1 es una ilustración de un TALEN y modificaciones genéticas causadas por el mismo.

La Fig.2 es una ilustración de un TALENs que funciona a una pluralidad de ubicación de ADN.

Las Figs. 3A, 3B y 3C son la actividad TALEN en embriones bovinos. Una visión general experimental se da en la Fig.3A. Los TAELENs están diseñados para hebras objetivo de ADN de tal manera que los monómeros homodiméricos de nucleasa Fokl son capaces de dimerizar y escindir el ADN entre los dos monómeros opuestos. Cigotos de bovino producidos in vi tro se inyectan con ARNm TALEN en el día 1 (DI) y cultivadan in vitro para la formación de blastocisto.

Blastocistos individuales (blastos) se recogen en el dia 8, se someten a la amplificación del genoma entero (WGA) y se analizan para indel (inserción-eliminación) mediante amplificación por PCR y el tratamiento Cel-I (Nucleasa SURVEYOR, Transgenomics). La Fig 3B es el tratamiento Nucleasa SURVEYOR para el análisis de indels en embriones bovinos mediado por TALENs ACAN12. La longitud de amplificación y productos de escisión SURVEYOR predichos que son indicativos de indels, se muestran arriba. La Fig.3C es el tratamiento Nucleasa SURVEYOR para el análisis de indels en cigotos porcinos mediado por p65 TALENs.

La Fig.4A. son supresiones e inserciones en secuencia a partir de embriones bovinos tratados con TALENs ACAN12. La * secuencia de tipo natural se muestra con sitios de unión TALEN subrayados. Se identificaron dos eventos supresión e inserción.

La Fig.4B. son supresiones e inserciones secuenciadas a partir de embriones porcinos tratados con TALENs. La secuencia de tipo natural se muestra con sitios de unión TALEN subrayado. Se identificaron dos eventos supresión e inserción.

Las Fig.5A, 5B y 5C, son una comparación del andamiaje TALEN para la edición de gen en fibroblastos de ganado. La Fig. 5A es un diagrama de andamiaje TALEN a prueba en este experimento. Cada andamiaje (+231, Christian et al 2010 y Carlson +63, (comparar con: Miller et al 2011)) contiene una señal de localización nuclear de SV40 (NLS) y tiene una fusión C-terminal del dominio homodimero FokI. La numeración es en relación con el dominio de enlace de ADN. El aminoácido antes de la primera repetición repite el diresiduo variable (RVD) se etiqueta "-1" y el aminoácido siguiente a la última repetición RVD está marcado como "+1". La Fig. 5B es el ensayo SURVEYOR conducido en fibroblastos transfectados con pares TALEN ya sea DMDE7.1 o ACAN12. El andamiaje y temperatura de tratamiento están indicados por encima del gel y el porcentaje de NHEJ se indica debajo. Abreviaturas, NT = no tratados. La Fig.5C es la actividad de cuatro pares TALEN adicionales, ya sea con el andamiaje +231 o Carlson +63.

La Fig.6 son supresiones e inserciones secuenciadas a partir de células tratadas con TALENs ACAN12. La secuencia ACAN12 de tipo natural se muestra en cursiva y las secuencias TALEN de reconocimiento a la izquierda y la derecha están subrayadas (complementariamente). Nucleótidos insertados se resaltan en nucleótidos sin coincidencias grises se indican con texto en minúsculas.

Las Figs.7A, 7B y 7C es co-selección de transposón para el enriquecimiento indel. Una linea de tiempo experimental se muestra en la Fig. 7A. Día cero (DO), las células se transfectan con una mezcla de plásmidos, incluyendo un casete de expresión para cada TALEN, un transposón que codifica un marcador de selección, y un casete de expresión de transposasa. El plásmido TALEN es el componente principal (4 veces en exceso en masa) de cada transfección. Las células transíectadas se cultivan durante 3 días a 30 o 37 grados Celcius antes de la separación, recogida de una muestra para ensayo de SURVEYOR y re-colocado para selección de cultivo extendido +/- selección para la integración transposón. Todas las células se cultivaron a 37 grados Celsius tras día 3. Las células cultivadas durante 14+ días se recogen para el ensayo SURVEYOR y son crioconservadas para aplicaciones posteriores, es decir, transferencia nuclear de célula sencilla. La Fig. 5B se transfectaron fibroblastos utilizando lípidos catiónicos. No se observó actividad en el día 3 (debido a la baja eficiencia de transfección) de manera que sólo hay datos de poblaciones de 14+ días. Tratamiento de temperatura, selección e id TALEN (identificados por letras A-C como se indica en la Fig.5C) se muestran por encima del gel. Fig.5C Los fibroblastos fueron transfectados por Nucleofección y el porcentaje de NHEJ se midió en el día 3, y en el día 14+ poblaciones no seleccionada (NS) y (s) seleccionadas. Tratamiento de temperatura se indica encima de cada matriz. Abreviaturas: nd = no detectado; peso = amplicón tipo natural, SURVEYOR tratada.

La Fig. 8A. es una secuenciación PCR directa para la identificación de indels. Amplicones de PCR de colonias de fibroblastos individuales fueron purificados, secuenciados y comparados con la secuencia de tipo natural. La mutación de un alelo, o, las mutaciones de los dos alelos que no se traslapan resultarán en secuencia doble cerca de los sitios de reconocimiento TALEN (arriba). Mutaciones bi-alélicas traslapadas pueden ser identificadas donde las diferencias entre cada alelo pueden ser identificadas por picos dobles que flanquean el sitio de la mutación. Las colonias con mutaciones homocigóticas no exhiben picos dobles cerca del sitio indel.

La Fig. 8B es una comparación de secuencias de tipo natural y clones bi-alélicos con indels homocigotos, como en la Fig.8A.

La Fig.9A son alelos de modificación de DMD Bi-alélica. Se muestran colonias, ya sea con alelos de modificación homocigotos (es decir, los dos alelos albergan la misma mutación) o mutación bi-alélica con diferentes mutaciones en cada alelo. Para colonias con dos indels, se muestra el número de veces que cada alelo se secuenció a la derecha. En algunos casos, una tercera mutación o alelo de tipo natural solo se secuenció, lo que indica que no todas las colonias son 100% clónales. Los alelos de cambios de marco se indican y nucleótidos no emparejados se indican con texto en minúsculas.

La Fig.9B son alelos de modificación LDLR Bi-alélicos, con anotaciones como en la Fig.9A.

Las Fig 10A, 10B, 10C y 10D son supresiones e inversiones inducidas por TALEN. Un esquema de la ubicación DMD se muestra en la Fig.10A. Orientación de ADN se denota por corchetes angulares negros. TALENs dirigido a los exones 6 y 7 (puntas de flecha negras) co-transfectados en fibroblastos cerdo macho podrían resultar en un evento de fusión NHEJ entre los exones 6 y 7. Esto puede ser identificado usando los cebadores (flechas negras), resultando en amplicón de ~500 pb. La Fig. 10B es un ensayo SURVEYOR de células transfectadas simultáneamente con TALENs dirigidas a los exones 6 y 7 que revelan indels NHEJ en ambos sitios. Porcentaje NHEJ se muestra a continuación. La Fig. 10C es PCR con cebadores que flanquean el sitio de supresión de presunción proporcionando un producto de ~500 pares de bases cuando ambos TALENs de exón 6 y exón 7 se introducen simultáneamente, pero no cuando se transíectaron por separado. La Fig.10D muestra el resultado predicho de un evento de inversión de la secuencia entre los sitios objetivo TALEN. La orientación de ADN se denota por corchetes angulares negros. Los cebadores fuera de los sitios gue flanquean presuntivos en el extremo 5' y 3' de la ubicación de inversión se muestran (flechas negras) junto con el tamaño del producto predicho. Los productos de PCR se observaron en uniones tanto 5' como 3' sólo cuando ambos TALENs exón 6 y exón 7 se introducen simultáneamente.

La Fig.11 son secuencias de supresión DMD. Se muestran uniones de supresión DMD de transíecciones replicadas. Arriba, las secuencias de exones 6 y 7 están sombreadas, y se subrayan los sitios .TALEN de reconocimiento. Nucleótidos insertados están sombreados.

La Fig. 12 son secuencias de inversión de DMD. Un diagrama esquemático del alelo inversión de DMD se muestra con las uniones 5' y 3' (en caja) que se analizaron por secuenciación. A continuación, la secuencia predicha para cada fusión se muestra de fusión correspondiente en el centro de cada espaciador para los pares TALEN. Se subrayan los sitios TALEN de reconocimiento. Se muestran los alelos de inversión de secuenciado a partir de una población transfectada. El número de veces que cada alelo se secuenció se indica a la derecha y están subrayados nucleótidos insertados. Nucleótidos no alineados se denotan como texto en minúsculas.

La Figs. 13A, 13B y 13C es inducción HDR en los fibroblastos bovinos. La Fig 13A son TALENs (btGDF83.1, flecha) .y una plantilla de ADN de doble cadena (BB-HDR) que se diseñaron para introducir una supresión de 11 pares de bases en el exón 3 de GDF8 bovina (mutación Belga Azul) por recombinación homologa de doble hélice inducida por ruptura. La mitad del sitio de unión para el TALEN izquierdo se pierde en la plantilla BB-HDR y por lo tanto debe ser resistente a la escisión TALEN. La Fig. 13B es un ensayo SURVEYOR que demuestra la actividad de TALENs btGDF83.1 tanto a 37 como a 30° Celsius. El producto de PCR utilizado para este ensayo fue generado utilizando los cebadores b y b'(que se muestra en la Fig 13A). La plantilla BB-FIDR no se incluyó en estos replicados ya que podría confundir las estimaciones de actividad btGDF83.1. La Fig 13C es un PCR de alelo específico que demuestra que la inducción HDR es dependiente de la co-transfección de TALENs y la plantilla BB-HDR. El ensayo de PCR fue desarrollado para detectar específicamente alelos GDF8 modificados por HDR utilizando los cebadores c y c' (se muestra en Fig 13A). El extremo 3' del cebador c' extiende la eliminación del par de bases 11 supresión, y no puede amplificar el alelo de tipo natural (wt). Quinientos equivalentes celulares fueron incluidos en cada reacción de PCR incluyendo el control positivo "C". Porcentaje de HDR se determinó por densitometría comparativa entre las reacciones experimentales y de control.

La Fig. 14 es la confirmación de la introgresión belga azul por secuenciación. Se muestran los esquemas de Wagyu de tipo natural GDF8 y la plantilla azul belga (BB-HDR). PCR se realizó utilizando cebadores localizados fuera de los brazos de homología (c y d) en cinco colonias de PCR positivos seguidos de clonación y secuenciación con el cebador b'. La comparación con la secuencia de tipo natural revela la supresión de pares de base 11 característica del alelo azul belga (heterocigotos) en 4 de 5 colonias.

La Fig. 15 es esquemática y gel para HDR mediada por TALEN. Un par TALEN (LDLR2.1) dirigido al cuarto exón del gen del receptor de lipoproteínas de baja densidad porcina (LDLR) fue co-transfectado con el plásmido superenrollado Ldlr-E4N-paro, que contiene brazos de homología correspondiente al gen LDLR porcino y una trampa de gen que permite la expresión de neomicina fosfotransferasa en HDR.

La Fig. 16. Es información de secuencia detallada para el andamiaje Carlson +63 de la Figura 5 y la comparación a un andamiaje alternativo utilizado por Sangamo Biosciences.

La Fig.17 es una secuencia de ácido nucleico detallada para el vector usado para hacer el andamiaje Carlson +63 de la Figura 5, incluyendo las porciones no traducidas.

La Fig.18. Es el uso de una plantilla de ADN de cadena sencilla que suministra AAV emplacada para la recombinación homologa en la ubicación GDF8 bovina, a) TALENs (btGDF83.1, flecha azul) y una plantilla de recombinación homologa rAAV (AAV-BB-HDR) diseñada para introducir una supresión de 11 bp en el exón 3 del gen GDF8 de bovino (mutación belga azul) por recombinación homologa, b) PCR especifico de alelo demuestra que la inducción HR depende de la transfección btGDF83.1 TALENs y la infección con AAV defectuoso que contiene la plantilla AAV-BB-HDR. El ensayo de PCR fue desarrollado para detectar específicamente alelos GDF8 modificados HDR utilizando cebadores c y c' (se muestran en panel a). El extremo 3' del cebador C' abarca la supresión de 11 bp, y no puede amplificar el alelo de tipo natural "WT". Se incluyeron 1,000 equivalentes celulares en cada reacción de PCR y reacciones de control positivo con el número de copia indicado de una plantilla de control se utilizaron para la cuantificación comparativa de la recombinación homologa La Fig. 19. Es el uso de oligonucleótidos de cadena sencilla (ssOligos) como una plantilla para la recombinación homologa en la ubicación GDF8 bovina. TALENs (btGDF83.1, flecha) y dos ssODNs se diseñaron para introducir una supresión de 11 bp en el exón-3 del gen GDF8 bovino (mutación belga azul) por recombinación homologa. Cada ssODN fue de 76 pares de bases de longitud y eran cadenas sentido y antisentido del mismo sitio objetivo. La PCR especifica de alelo demuestra que la inducción HDR es dependiente de la transfección btGDF83.1 TALENs y la posterior transfección de ssODNs utilizando Lipofectamina LTX 24 horas más tarde. El ensayo de PCR fue desarrollado para detectar específicamente alelos GDF8 modificados por HDR utilizando los cebadores c y c'. El extremo 3' del cebador c' abarca la supresión de 11 bp, y no puede amplificar el alelo de tipo natural "WT". Se incluyeron 1,000 equivalentes celulares en cada reacción de PCR y las reacciones de control positivo con el número de copias indicado de una plantilla de control se utilizaron para la cuantificación comparativa de la recombinación homologa. BB-HDR Sentido (S) tiene la SEQ ID NO: 133 y BB-HDR anti (AS) tiene SEQ ID NO: 134.

Las Fig. 20A y 20B son la transfección de ARNms que codifica TALEN en células de ganado lo que resulta en la escisión eficiente objetivo. La Fig 20A la cantidad indicada de ARNm transfectado en fibroblastos de cerdo y células transfectadas se cultivaron a 30 o 37 grados Celsius durante tres días antes del análisis indel. La Fig 20B es el porcentaje NHEJ determinado. El porcentaje promedio de NHEJ por transfección de 4 microgramos de plásmido de ADN que codifica la DMD7.1 TALENs se muestra por líneas punteadas para células cultivadas a 30 o 37 grados Celsius.

La Fig. 21 es una transfección de TALENs que codifica ARNm que aumenta ssODN HDR. btGDF83.1 ARNm TALEN y BB-HDR sentido ssODN (SEQ ID NO: 133) se introdujeron en células Wagyu por el mecanismo especificado y HDR se midió por el ensayo de PCR descrito anteriormente. Las colonias fueron aisladas de la población de células donde tanto TALEN ARNm como ssODNs se suministran simultáneamente por nucleofección.

La Fig..22 es una introgresión de alelos de origen natural dentro de una especie utilizando TALENs que codifica ARNm y ssODNs. El alelo C313Y de miostatina piamontés se introgresó en fibroblastos Waygu por los métodos de la Figura 21. La secuencia etiquetada "oligo" tiene la SEQ ID NO:135.

La Fig.23 es el proceso de la Figura 22 repetido a una temperatura diferente (37°C).

La Fig. 24. Es una introgresión de alelos de origen natural de una especie a otra usando TALENs que codifican ARNm y ssODNs. El alelo C313Y de miostatina piamontés se introgresó en fibroblastos Ossabaw por los métodos de la Figura 25. La siguiente ssODN se utilizó ggccaattactgctctggagagtatgaattcgtatttttacaaaaataccctcacactcat cttg (SEQ ID NO: 146).

La Fig.25 es una introducción de un alelo de cambio de estructura particular en LDLR porcino utilizando TALENs qué codifica ARNm y ssODNs. Un oligo de 90 bp fue creado para introducir una inserción de 4 pares de base en el exón 2 del gen LDLR porcino. La inserción crea un sitio BamHl novedoso y se prevé que causa un alelo de cambio de estructura. Después de la co-transfección de ARNm TALEN SSLDLR2.1 (en dosis indicada en microgramos) y 0.3 nMol de células ssODN se cultivaron a 30°C durante 3 días, seguido de un día adicional a 37°C. NHEJ se midió mediante el ensayo SURVEYOR en los dias 4 y 20. El porcentaje de HDR se determinó por digestión BamHl de los productos de PCR que incluye el exón 2 de LDLR porcino y cuantificación de fragmentos de restricción (indicativa de HDR) y la comparación a los productos de tipo natural (producto superior, no HDR) por densitometria. Las colonias fueron aisladas de cada tratamiento y se analizaron por PCR y digestión con BamHl. La secuencia etiquetada "Wt" tiene SEQ ID NO:136 y la secuencia etiquetada "sentido" tiene SEQ ID NO:137.

La Fig.26 es ADN y TALENs que codifica ARNm activos en las células madre. El panel superior muestra el porcentaje de NHEJ DMD7.1 TALENs transíectados como ADN plásmido en células madre de línea germinal macho porcina (GSCs). Se evaluaron soluciones de nucleofección L, V o B. El panel inferior muestra los resultados del ensayo SURVEYOR de GSCs porcino transíectados con ARNm que codifica DMD7.1 TALENs. La cantidad de ARNm (microgramos) se indica.

Las Figs 27A, 27B y 27C son DSB que median TALENs en células de pollo y pueden estimular la recombinación homologa en células germinales primordiales de pollo (PGC). La Fig. 27A es la actividad TALEN que se determinó por primera vez en transfección de linea de células de pollo inmortalizadas por DF1 y ensayo SURVEYOR. La Fig. 27B es la representación esquemática de la estrategia de focalización de la ubicación ddx4 de pollo. El gen reportero GFP/puromicina reemplazará la secuencia de codificación endógena en el segundo exón de células objetivo. La Fig.27C son PGCs transíectados con el constructo de recombinación homologa, TALENs (ya sea Tal 1.1 o Tal 7.1, vector vacío) y un transposón de selección de puromicina. Después de la selección en puromicina, las células GFP+ se podrían aislar cuando se usó Tal 1.1 TALENs (imagen de la derecha, la izquierda es de campo claro) pero no con Tal7.1 TALENs o transíecciones de vector vacío.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Programas de reproducción tradicionales basados en el apareamiento de animales o téenicas de reproducción artificial implican mezclar muchos genes con la esperanza de finalmente producir una buena combinación de genes que creen o combinen rasgos deseables. Técnicas transgénicas contienen la promesa de acelerar los procesos tradicionales de reproducción. Algunos inconvenientes de los procesos que los transgénicos son los procesos, que aun que una mejores, no obstante son lentos, costosos y requieren mucho trabajo. Baja eficiencia y la imprevisibilidad en los resultados son normales. Además, los procesos que hacen que un cambio sólo en un sitio genómico previsto no están disponibles.

Se divulga en el presente documento los procesos para que los animales transgénicos tengan cambios sólo en el sitio previsto. Además, los procesos hacen específicamente los cambios previstos en el lugar previsto. No es necesario eliminar otros cambios resultantes de problemas tales como el uso de genes reporteros ligados, o genes ligados de selección positiva y negativa, o la integración del transgén aleatorio. Además, los procesos pueden ser utilizados en la generación progenitor para hacer animales modificados genéticamente que tienen sólo el cambio deseado en el lugar previsto. Otros procesos se describen también que implican genes marcadores disociados y similares. Las téenicas preferidas utilizan TALENs.

El uso exitoso de TALENs para hacer modificaciones genéticas en los animales superiores tales como cerdos o vacas presenta considerables desafíos. Composiciones y métodos de fabricación de tales animales se exponen en el presente documento. Algunos de estos métodos implican la clonación de células primarias de artiodáctilos u otras células de ganado, que también presentan dificultades considerables. Además, se presentan métodos para identificar células o embriones que han sido modificados con TALENs, asi como los procesos para enriquecer el porcentaje de células o embriones tratados con TALEN. Inesperadamente, se observó que una modificación genética de un cromosoma por un TALEN causa a menudo la ubicación complementario de otro cromosoma también ser modificado por la maquinaria celular.

Además, también se descubrió que TALENs podría ser utilizado para hacer las supresiones cromosómicas gruesas (GCDs) en una pluralidad de sitios. La Fig.2 ilustra este enfoque, que consiste en un primer par TALEN dirigido a un primer ubicación y un segundo par TALEN dirigido a un segundo locus. También se descubrió sorprendentemente que las inversiones de grandes secuencias cromosómicas podrían ser creadas usando pares de TALENs. Uno de los usos de las inversiones es la creación de los artiodáctilos u otros animales progenitores con rasgos genéticos fijos, o la creación de supresión cepas.

Creación de ganado genéticamente modificado a través de tecnologías TALEN; verificación de modificación TALEN; co-selección co-transfeccional para la selección de células modificadas ; supresión de los genes reporteros de animales modificados geneticamente Una de las barreras para hacer ganadería u otros animales modificados en TALEN es que la eficiencia de hacer una modificación a una célula animal es sólo un pequeño porcentaje de las mejores prácticas convencionales. El logro de una supresión o una inserción en un sitio previsto no significa necesariamente éxito porque en realidad no puede crear el efecto deseado, tales como la expresión de una proteína exógena o detener la expresión de una proteína endógena. Incluso una baja eficiencia puede ser útil para la creación de los animales inferiores genéticamente modificados como moscas de la fruta o ratones, ya que tienen ciclos de reproducción cortos y prolíficos que prevén la creación, pruebas y detección de cientos de animales para determinar si hay unos pocos que se han modificado con éxito. Estos niveles de eficiencia que se logran de manera convencional, sin embargo, no son adecuados para los artiodáctilos ganaderos que tienen mucho más tiempo gestacional tiempos y comparativamente poca progenie por preñez.

Otra barrera para el uso de TALENs para modificar ganado u otros animales es que las modificaciones mediadas por TALEN de ADN en células primarias es difícil porque las células son inestables. De hecho, se muestra en este documento que la frecuencia de células modificadas por TALEN disminuye significativamente con el tiempo en ausencia de métodos de enriquecimiento o selección. Sin estar ligado a una teoría particular, se teoriza que la escisión de ADN en los sitios no previstos puede comprometer la estabilidad de la célula mediante la inducción de apoptosis o desactivación de genes no objetivo. El término célula primaria significa una célula aislada de un animal vivo, donde la célula ha sido sometida a entre 0 y 2 repeticiones desde su aislamiento del tejido.

Como resultado, las téenicas utilizadas habitualmente para crear y transformar células de ensayo para la modificación genética exitosa no se pueden utilizar en células primarias debido a su propensión a la senescencia. Las células modificadas TALEN están habitualmente destruidas para ensayar su modificación genética, o aislarse creciendo líneas clónales con muchas células idénticas de un padre. Sin embargo, las células primarias son inherentemente inestables y por lo general se someten a cambios genéticos, la senescencia y/o muerte celular cuando se hacen intentos de modificar genéticamente y ampliarlos por clonación. Las células modificadas por TALEN son aún menos estables, tal como se documenta en el presente documento por primera vez. Como resultado de ello, es razonable esperar que las altas tasas de éxito al usar los métodos convencionales que implican la modificación de una célula primaria de la transferencia nuclear de células somáticas u otra téenica de la clonación animal. Como se informó en el presente documento, sin embargo, TALENs se ha utilizado para hacer modificaciones genéticas de células primarias de artiodáctilos. Estas modificaciones son adecuadas para hacer progenitores de lineas animales modificadas genéticamente por clonación. También se describe aquí son las inyecciones directas embrionarias utilizadas para modificar cigotos, con los cigotos modificados adecuado a la implantación en hembras sustitutas para gestación y el parto de las lineas de animales progenitores.

Un enfoque típico para probar por un evento de inserción/supresión mediada por TALEN actual es secuenciar la célula o cigoto modificado, que es un proceso destructivo. Así, cuando un cigoto o embrión se modifica antes de la implantación de un sustituto, su modificación no se puede verificar con algún grado de conveniencia hasta que nazca el animal. No está convencionalmente apreciado que un proceso de producción real para la fabricación de animales modificados genéticamente mediante la clonación se beneficie de un proceso para probar la presencia de una modificación genética. Hay inventos presentados en este documento que proporcionan una indicación de la modificación genética en la célula, el cigoto, o de una sola etapa de ovocitos. Como se muestra en el presente documento, la expresión de un gen reportero que no está acoplado a la modificación TALEN es, a pesar de no ser parte de la casete de expresión del gen reportero, sin embargo, generalmente predictiva de una modificación genética deseada. Más especificamente, la expresión del gen reportero indica que los ácidos nucleicos fueron entregados de manera eficaz y que se expresa en una célula o embrión; una célula reportero que expresan o embrión es más probable que hayan sido objeto de modificación basada en TALEN.

Otra téenica para la fabricación de organismos modificados fue el uso de una técnica de co-transfección, co-selección. Las células que expresan el reportero se seleccionan para, y pueden ser utilizados para la fabricación de animales modificados genéticamente. El reportero se puede elegir para requerir la actividad transposasa. Sin estar ligado a una teoría específica, se teoriza que las células que han sido objeto de transposición 1) han sido transíectadas y 2) han sido competente para la reparación del ADN de hebra cadena, lo que aumenta la probabilidad de modificación basada en TALEN en clones seleccionados. Esto también facilita el enriquecimiento/selección de células transpuestas (y por las células de extensión modificadas por TALEN). El hecho de que el transposón este operativamente pero no físicamente ligado a la modificación TALEN permite su segregación de distancia el uno del otro por la cría. Una de las ventajas de una estrategia de co-transfección es que el reportero, o reporteros, se pueden colocar en un cromosoma que no es el mismo cromosoma que es modificado por TALENs. Este proceso prevé la creación de animales progenitores que no tienen genes reporteros. Por ejemplo, algunos animales se realizaron mediante el uso de plásmidos que llevan los genes indicadores que eran independientes de la modificación genética, que fue orquestado por separado en las células. Este esquema se basa en una teoría de la operación de que las células que incorporan nuevos genes indicadores también incorporarán las modificaciones genéticas. Por ejemplo, los datos proporcionados en este documento muestra que las células pueden ser transíectadas con cuatro plásmidos independientes y la incorporación exitosa del producto del gen de un plásmido es predictivo de la incorporación exitosa de los demás productos de genes de plásmido y también para el éxito de los cambios mediados por TALEN. La sabiduría convencional es que la transfección con tantos plásmidos no tendría éxito y cedería células enfermas. Inesperadamente, sin embargo, estas téenicas fueron eficaces.

La función TALEN en embriones de ganado se investigó el usando un preparado in vitro (IVP) de embriones bovinos y porcinos. El ejemplo 1 describe la inyección directa de TALENs (un TALEN izquierdo y un TALEN derecho) en embriones de bovinos para producir animales modificados genéticamente con una modificación en el sitio donde los TALENs están unidos específicamente. Las modificaciones incluyen modificaciones a homocigotos y heterocigotos (bi-alélicos). TALEN ARNms se inyectaron directamente en los embriones y se observaron modificaciones genéticas exitosas. El ejemplo 2 describe experimentos adicionales en los que ARNm reportero fue co-inyectado con ARNms de TALEN. La expresión del reportero fue predictivo de una modificación genética exitosa, con aproximadamente 35% de los embriones que expresan el reportero, y aproximadamente 30% de estos animales tienen un indel basado en TALEN. De los animales con indels, aproximadamente el 35% de ellos eran homocigotos o heterocigotos mutantes bi-alélicas (Fig 4A y 4B). Modificación embrión directa mediante TALENs demostró ser un enfoque viable para la modificación del genoma del ganado. Los embriones pueden ser asi preparados e implantados en hembras sustitutas para la gestación y el parto de líneas progenitoras de animales usando procedimientos bien conocidos. Además, es posible utilizar un reportero para seleccionar células (por ejemplo, células primarias, cigotos, ovocitos, blastocistos) para su uso posterior en la clonación u otros procesos.

También se desarrollaron procedimientos para la modificación mediada por TALEN genética del ganado (o el pez cebra, perros, ratones, ratas, aviar, pollo, o un animal de laboratorio) por clonación. Ejemplo 3 describe el desarrollo de TALENs adecuados y modificación TALEN de células somáticas primarias de cerdos y vacas. La eficiencia de la modificación exitosa fue algo baja y no se utilizaron los reporteros para medir el éxito de la modificación. La nucleofección es un medio para introducir ácidos nucleicos extraños en una célula con una alta eficiencia, pero es caro, se traduce en altos niveles de citotoxicidad, y no está disponible para muchos investigadores. Por lo tanto, un reactivo de transfección lipido catiónico común fue utilizado como un vehículo para la modificación genética. Como se muestra en el Ejemplo 4, a pesar de una eficacia de transfección de menos de 5% con lipidos catiónicos, niveles de modificación fueron enriquecidos significativamente por la co-selección transposón. Considerando que la modificación genética estaba por debajo de la detección en día 3 poblaciones (datos no mostrados) y el día 14 poblaciones sin selección mediada por transposón, niveles de modificación en poblaciones seleccionadas llegó a 31, 13 y 20 por ciento para DMD7.1, DMD6 y LDLR2.1 respectivamente (Figs.7A, 7B y 7C). Entonces la co-selección de transposón se aplicó a las células transíectadas por nucleofección donde la eficiencia >90% transfección es de rutina. La co-selección de transposón fue eficaz para las células transíectadas de mantenimiento modificado por nucleofección, sin embargo, con la excepción de ACAN12, nucleofección no enriqueció significativamente para las células modificadas en el día 3 niveles (Figs.7A, 7B y 7C). Por lo tanto, la co-selección de transposón es un método de enriquecimiento eficaz cuando la eficacia de transfección es baja y un método eficaz de mantenimiento cuando la eficacia de transfección es alta. Los procesos de co-selección también fueron efectivos cuando se utilizaron células de alimentación, como se demuestra en el Ejemplo 5. Una inesperadamente alta proporción de modificaciones bi-alélica (aproximadamente 17% a aproximadamente 35% dependiendo del par TALEN) se observaron.

Una modalidad de la invención es una composición y un método para utilizar TALENs para modificar genéticamente el ganado tales como artiodáctilos o pez cebra, perros, ratones, ratas, peces, aves, pollo, o un animal de laboratorio. Muchos de los problemas que hacen estos animales utilizando procesos convencionales se han discutido anteriormente. La modificación genética puede ser, por ejemplo, elegida de la lista que consiste en una inserción, una eliminación, inserción o cambiar a un fragmento de ácido nucleico exógeno, una inversión, una transubicación, la migración alelo entre especies, intraspecies alelo migración, conversión de genes a un natural, sintético, o de un nuevo alelo. Por ejemplo, una mutación no deseada en un par de cromosomas o cromosomas puede ser reemplazada con una secuencia normal..En general, un sitio de ADN objetivo se identifica y se crea un par TALEN que se unirán específicamente al sitio. El TALEN se suministra a la célula o embrión, por ejemplo, como una proteína, ARNm o por un vector que codifica al TALEN. El TALEN escinde el ADN para hacer un doble corte que se reparó entonces, a menudo resulta en la creación de un indel, o la incorporación de secuencias o polimorfismos contenidas en un ácido nucleico exógeno de acompañamiento que se conecta o se sirve de molde para la reparación de la ruptura con una secuencia modificada. El ácido nucleico exógeno término significa un ácido nucleico que se añade a la célula o embrión, independientemente de si el ácido nucleico es el mismo o distinto de secuencias de ácido nucleico natural en la célula. Una secuencia exógena se refiere a una secuencia utilizada para cambiar la célula objetivo, independientemente de si la secuencia es en realidad un ácido nucleico insertado en el ADN cromosómico o si la secuencia se utiliza como plantilla para cambiar el ADN celular. El fragmento de ácido nucleico plazo es amplia e incluye un cromosoma, casete-de expresión, el gen, el ADN, ARN, ARNm, o parte del mismo. El término incluye ADNss oligonucleótidos ss. La célula o embrión puede ser, por ejemplo, elegido de entre el grupo que consiste en ganado, un artiodáctilo, una vaca, un cerdo, una oveja, una cabra, un pájaro, un pollo, un conejo, y un pez. El término de granja: los animales domesticados que se crian como mercancías para la comida o material biológico. El término artiodáctilo significa un mamífero ungulado del orden Artiodaclyla, que incluye el ganado, ciervos, camellos, hipopótamos, ovejas y cabras, que tienen un número par de dedos de los pies, por lo general dos o cuatro veces, en cada pata.

Una modalidad se refiere a una composición o un método de fabricación de un ganado modificado genéticamente y/o artiodáctilo o un pez cebra, perros, ratones, aves, peces, aves, pollo, ratas o un animal de laboratorio que comprende la introducción de un par TALEN en una célula o un embrión que realiza una modificación genética en el ADN de la célula o embrión en un sitio que se une específicamente por el par TALEN, y la producción de ganado del animal/artiodáctilo/otro animal de la célula. La inyección directa puede ser utilizada para la célula o embrión, por ejemplo, en un cigoto, blastocisto o embrión. Alternativamente, el TALEN y/u otros factores se pueden introducir en una célula usando cualquiera de las muchas téenicas conocidas para la introducción de proteínas, ARN, ARNm, ADN, o vectores. Los animales modificados genéticamente se pueden hacer de los embriones o células de acuerdo con procedimientos conocidos, por ejemplo, la implantación del embrión en un huésped gestacional, o diversos métodos de clonación. La frase "una modificación genética en el ADN de la célula en un sitio que se une específicamente por el TALEN", o "en un sitio cromosomal objetivo", o similares, significa que la modificación genética se realiza en el sitio de corte por la nucleasa en el TALEN cuando el TALEN se une específicamente a su sitio objetivo. La nucleasa no corta exactamente donde el par TALEN se une, sino más bien en un sitio definido entre los dos sitios de unión.

Otra modalidad de este tipo implica una composición o un tratamiento de una célula que se utiliza para la clonación del animal. La célula puede ser de ganado, artiodáctilo, pescado, pez cebra, perro, ratones, rata, animal de laboratorio, aves, pescado, pollo, una célula cultivada, una célula inmortalizada, una célula primaria, una célula somática primaria, un cigoto, una célula germinal, una célula germinal primordial, un blastocito, o una célula madre. Por ejemplo, una modalidad es una composición o un método de creación de una modificación genética que comprende exponer una pluralidad de células primarias en una cultura a las proteínas TALEN o un ácido nucleico que codifica un TALEN o TALENs. Los TALENs se pueden introducir como proteínas o como fragmentos de ácido nucleico, por ejemplo, codificadas por ARNm o una secuencia de ADN en un vector.

La modificación genética de los animales también puede incluir la transfección con un reportero. Como se discutió anteriormente, se observaron células primarias a ser inestable como consecuencia de las modificaciones celulares mediadas por el TALENs y/o TALENs introducidos. Como resultado, el éxito en la modificación de las células primarias (entre otros tipos de células), y/o la creación de nuevas líneas de ganado de tales células no es razonablemente esperado usando medios convencionales. Se teoriza, sin estar ligado a una teoría específica, que las células que expresan un casete génico a partir de un primer vector también son propensas a ser modificadas con éxito por un TALEN suministrado de forma independiente por el ARNm o el otro vector. La expresión de un reportero permite la supresión de las células que no expresan el reportero. Alternativamente, se permite para las células que expresan el reportero a partir del cultivo para su uso en animales por clonación u otras téenicas de animales transgénicos en movimiento, o en un segundo cultivo para el cultivo adicional y/o expansión en el número y/o adición de otros vectores y/o ácidos nucleicos y/o TALENs y/u otras modificaciones genéticas. Selección de células en base a su expresión de un reportero que es independiente del gen de interés es un tipo de proceso de co-selección.

El término reportero, como se usa aquí, incluye los reporteros y los marcadores de selección. El término marcador de selección, tal como se utiliza aquí, se refiere a una biomolécula expresada genéticamente que confiere un rasgo que permite el aislamiento por cualquiera de los criterios de selección de supervivencia positivos o negativos. El indicador puede ser, por ejemplo, un marcador fluorescente, por ejemplo, proteina verde fluorescente y proteina fluorescente amarilla. El reportero puede ser un marcador de selección, por ejemplo, puromicina, ganciclovir, adenosina deaminasa (ADA), aminoglicósido fosfotransferasa (neo, G418, APH), dihidrofolato reductasa (DHFR), higromicina-B-phosphtransferase, timidina quinasa (TK)., o xantina fosforribosiltransferasa guanina (XGPRT). Otros marcadores fenotipicos pueden ser usados para seleccionar los animales, tales marcadores se basan en rasgos discernibles físicamente (por ejemplo, epítopos o color), tasa de crecimiento y/o viabilidad.

Las modalidades de la invención incluyen la introducción de un reportero (por ejemplo mediante el uso de un vector) y un TALEN (por ejemplo, por un vector independiente o ARNm) en una célula o embrión. La célula puede ser de ganado o artiodáctilos, bovinos, aves, pollo, pez cebra, perro, ratones, ratas o un animal de laboratorio. El TALEN y/o reportero se puede introducir directamente, por ejemplo, mediante inyección, o por otros medios, por ejemplo, con la participación de cultivo celular. Un cultivo celular se puede hacer que comprende células cultivadas (células primarias, cigotos, ovocitos, células inmortalizadas, células germinales, células germinales primordiales, células madre), un primer ácido nucleico que codifica un TALEN, por ejemplo, ARNm o un vector con ADN que codifica al TALEN, y un vector independiente que tiene una secuencia de ADN que codifica un reportero. El ARNm o primer vector no codifican ningún reportero y el segundo vector no codifica ninguna TALs y no codifica ningún TALENs.

Los vectores para el reportero, marcador de selección, y/o uno o más TALEN puede ser un plásmido, transposón, transposasa, virales, u otros vectores, por ejemplo, como se detalla en el presente documento. Las transposasas pueden utilizarse. Una modalidad que implica un transposasas proporciona un vector que codifica una transposasa. Otros vectores codifican un transposón que es reconocido por la transposasa y tiene un fragmento de ácido nucleico de interés, por ejemplo, un reportero, marcador de selección, el ácido nucleico exógeno para la inserción o como una plantilla para la modificación, o uno o más TALENs. En consecuencia, una célula o embrión se puede transfectar con un número de vectores de entre, por ejemplo, 1 y aproximadamente 6; los téenicos apreciarán inmediatamente que todos los rangos y valores dentro de los intervalos indicados expresamente se contemplan, por ejemplo, 2, 3, 4 , 5,y 6. Más vectores pueden utilizarse. El reportero puede ser utilizado para identificar células que son propensos a tener la modificación sufrida por TALENs. O un marcador de selección puede utilizarse para enriquecer la proporción de células modificadas por TALEN destruyendo las células o embriones que no expresan el marcador de selección.

Una modalidad de la invención es un cultivo de células o embrión expuesto a, o inyectado con, una pluralidad de vectores. Un primer vector comprende un TALEN o par TALEN; alternativamente, hay dos vectores TALEN que proporcionan de forma independiente un TALEN izquierdo y un TALEN derecho. Un segundo vector comprende un reportero. El indicador se puede proporcionar para la identificación no destructiva o puede ser un marcador de selección. Un vector que codifica un marcador de selección puede ser usado como una alternativa al vector reportero, o además de, el vector reportero. Un vector adicional puede codificar un ácido nucleico exógeno.

Un procedimiento para fabricar células, embriones o animales modificados por TALEN comprende evaluar una célula o embrión expuesto a un TALEN para la expresión de un reportero y el uso de esa célula o embrión en un método o composición para la fabricación de ganado modificado genéticamente y/o artiodáctilo u otro animal (pescado, pez cebra, perros, ratones, aves, pollos, ratas o un animal de laboratorio). Por ejemplo, una célula primaria puede ser removida de un cultivo de células y se utiliza para la clonación. O, una célula primaria puede ser removida del cultivo y colocada en un segundo cultivo para hacer una linea clonal o para otros procesos. O, un embrión o cigoto expresando el reportero se puede utilizar ya sea para la implantación en una madre sustituto o pueden utilizarse para la clonación, mientras que otros embriones cigotos o que no expresan el reportero no se utilizan para la clonación. En algunas modalidades, el reportero es un marcador de selección que se utiliza para seleccionar las células o embriones que expresan el marcador.

Supresiones e inversiones cromosómicas gruesas; Animales modificados genéticamente Los experimentos se realizaron con TALENs dirigidos a una pluralidad de sitios de ADN. Los sitios fueron separados por varios miles de pares de bases. Se observó que el ADN podría ser reunido con la supresión de toda la región entre los sitios. Las modalidades incluyen, por ejemplo, sitios separados por una distancia entre 1-5 megabases o entre 50% y 80% de un cromosoma, o entre aproximadamente 100 y aproximadamente 1,000,000 pares de bases; los téenicos apreciarán inmediatamente que todos los rangos y valores dentro de los intervalos indicados explícitamente se contemplan, por ejemplo, de aproximadamente 1,000 a aproximadamente 10,000 pares de bases o desde aproximadamente 500 a aproximadamente 500,000 pares de bases.

Alternativamente, se puede añadir ADN exógeno a la célula o embrión para la inserción del ADN exógeno, o la reparación basada en plantillas de ADN entre los sitios. La modificación en una pluralidad de sitios puede utilizarse para hacer células modificadas genéticamente, embriones, artiodáctilos, y ganado. El Ejemplo 6 describe la supresión de varios miles de pares de bases de ADN, con reunión de los extremos comprobados bioquímicamente.

Inesperadamente, las escisiones TALEN en sitios separados también resultaron en la inversión frecuente de toda la región entre los objetivos TALEN. Como una sorpresa adicional, como se detalla en el Ejemplo 6, estas inversiones se llevaron a cabo con gran fidelidad. Cuarenta y uno de cada 43 de las inversiones analizadas fueron positivas, tanto en las uniones 5' y 3'. Y la secuenciación de productos de PCR confirmó ambos eventos de supresión e inversión con adición o supresión de muy pocos nucleótidos en sus uniones (Fig.1 1, 12). Este resultado fue altamente sorprendente y sin precedentes. Las células o embriones con estas supresiones o inversiones tienen muchos usos como herramientas de análisis de la genética.

Estas células también son útiles para hacer animales, ganado y modelos animales. El término modelo animal incluye, por ejemplo, el pez cebra, perros, ratones, ratas u otros animales de laboratorio. Supresiones grandes proporcionan la inactivación de genes. También, por ejemplo, una cepa de supresión puede ser de células, ganado, o modelos animales. Cruzando las cepas de supresión con un organismo que lleva una mutación para la comparación con una de tipo natural ayuda a localizar e identificar la ubicación de mutación rápida y convenientemente. Las cepas de supresión son bien conocidas en estos campos e implican conjuntos de organismos hechos con una serie de supresiones en un gen. Mapeo de eliminación implica cruzar una cepa que tiene una mutación puntual en un gen con las cepas de supresión. Siempre que se produce la recombinación entre las dos cepas para producir una de tipo natural (+) gen, la mutación no puede estar dentro de la región de la supresión. Si la recombinación no puede producir ningún gen de tipo natural, entonces es razonable concluir que la mutación puntual y supresión se encuentran dentro del mismo tramo de ADN. Esto se puede utilizar por ejemplo para identificar las mutaciones causales, o para identificar polimorfismos de ubicación de rasgos cuantitativos.

Las células, embriones, ganado, artiodáctilos, y modelos animales con las inversiones también son útiles para la fijación de un rasgo genético en la progenie de un organismo o de una raza línea de animal o animal. Recombinaciones ocurren típicamente entre regiones homologas de juego cromosomas durante la meiosis. La inversión de una región cromosó ica destruye homología y suprime la recombinación meiótica. Métodos y composiciones descritas en este documento pueden ser usados para hacer tales organismos o animales. Por ejemplo, el ADN en un bovino somática o célula porcina se puede cortar en una pluralidad de ubicaciones por TALENs, y las células con una inversión puede ser aislado, o células que expresan los reporteros se puede utilizar como probables candidatos para inversiones exitosas. Las células se pueden usar para clonar animales que albergan las regiones cromosómicas que son incapaces de recombinaciones meióticas.

Alternativamente, se espera que también se producirá inversiones en las frecuencias razonables en los embriones tratados con múltiples pares TALEN en una pluralidad de sitios. Una modalidad de este método es la identificación de una región de ADN que codifica un rasgo genético y el corte de un ADN en una célula o embrión en cada lado del rasgo codificado a sitios utilizando una pluralidad de TALENs. La célula o embrión modificado se pueden usar para crear un animal genéticamente modificado. El método puede comprender el aislamiento de un animal modificado genéticamente que tiene la inversión.

Movimiento de alelos Algunos rasgos de ganado están relacionados con alelos tales como polimorfismos (grandes o pequeñas), polimorfismos de nucleótido único, supresiones, inserciones, u otras variaciones. Por ejemplo, un alelo de miostatina (una supresión de 11 bp) de reses azul belga es bien conocida para causar un,fenotipo de doble musculatura. Ejemplo 7 muestra, utilizando el alelo azul belga, cómo transferir precisamente alelos específicos de una raza de ganado a otro mediante la reparación dependiente de la homología (HDR). Fibroblastos de la especie bovina recibieron el alelo y fácilmente pueden ser usados para hacer el ganado transgénicos. Este alelo no interfiere con el desarrollo normal y los métodos enseñados en el presente documento colocar el alelo con precisión y sin interrupción de otros genes o la incorporación de genes exógenos. Como ya se ha discutido, los resultados presentados en este documento muestran que la frecuencia de conversión alelo en fibroblastos de ganado es alta cuando se utilizan las cromátidas hermanas para una plantilla de HDR, por lo tanto alelo introgresión en una cromátida hermana se pueden anticipar con frecuencia para resultar en homocigosidad.

Una modalidad de esta invención es un método de transferencia de un alelo de una primera linea de ganado o raza a una segunda linea de ganado o raza, que comprende el corte del ADN con un par de TALENs en una célula o embrión de la segunda línea de ganado/raza en una presencia de un ácido nucleico que contiene el alelo de la primera línea de ganado/raza. El embrión o célula se pueden usar para crear un animal de segunda línea/raza que tiene el alelo de la primera línea/raza. El ADN que contiene el alelo proporciona una plantilla para la reparación dependiente de la homología. Como una plantilla, que tiene homología con porciones del ADN en cada lado del corte y también contiene el alelo deseado.

Las modalidades de la invención comprenden mover una pluralidad de alelos de una raza a otra raza. Por ejemplo, los alelos se pueden desplazar de ganado Wagyu o Nelore para las reses azul belga, o viceversa. Como se expone en otra parte en el presente documento, el TALENs se puede suministrar una proteina o codificada por un ácido nucleico, por ejemplo, un ARNm o un vector. Un reportero también puede transíectarse en la célula o embrión y se utiliza como una base para la selección de células modificadas por TALEN. El reportero se puede ensayar de forma no destructiva y/o puede comprender un marcador de selección. El término raza significa un grupo de animales domésticos o plantas con un aspecto homogéneo, comportamiento y otras características que lo distinguen de otros animales o plantas de la misma especie. Los animales que pertenezcan a una raza en particular son conocidos por los téenicos que ejercen en éste campo. Del mismo modo, la migración alelo puede ponerse en práctica en un modelo animal.

Una población o especies de organismos incluyen típicamente múltiples alelos en cada ubicación entre varios individuos. La variación alélica en una ubicación es medible como el número de alelos (polimorfismos) presente, o la proporción de heterocigotos en la población. Por ejemplo, en la ubicación de genes para los antígenos ABO carbohidratos tipo de sangre en los seres humanos, la genética clásica reconoce tres alelos, IA, IB, y 10, que determinan la compatibilidad de las transfusiones de sangre. Un alelo es un término que significa uno de dos o más formas de un gen.

En el ganado, muchos alelos se sabe que están vinculados a diversos rasgos como los rasgos de producción, los rasgos de tipo, características de capacidad de trabajo y otros rasgos funcionales. Los téenicos están acostumbrados a la vigilancia y la cuantificación de estas características, por ejemplo, Vimccher et al., Ganadería Ciencia, 40 (1994) 123- 137, US 7.709.206, US 2001/0016315, US 201 1/0023140, y US 2005/0153317. En consecuencia, el alelo que se transfiere puede estar vinculado a un rasgo o elige entre un rasgo en el grupo que consiste de un rasgo de producción, un tipo de rasgo, un rasgo capacidad de trabajo, un rasgo de la fertilidad, un rasgo de la maternidad, y un rasgo de resistencia a la enfermedad.

El alelo natural del término en el contexto de la modificación genética significa un alelo encontrado en la naturaleza en la misma especie de organismo que se está modificando. El alelo novela término significa un alelo no natural. Un alelo humano colocado en una cabra es un nuevo alelo. El término alelo sintético significa un alelo que no se encuentra en la naturaleza. Así, un alelo natural es una variación ya existente dentro de una especie que puede ser entrecruzado. Y un nuevo alelo es uno que no existe dentro de una especie que se puede cruzarse. Movimiento de un alelo interespecies significa de una especie animal a otra y movimiento intraespecies significa movimiento entre animales de la misma especie.

Mover un alelo de una raza a otra por procesos convencionales de mejoramiento implica el canje de muchos alelos entre las razas. La recombinación durante la meiosis intercambia inevitablemente ubicaciones genéticas entre las razas. En contraste, el ganado modificado en TALENs y otros animales están libres de cambios genéticos que resultan de eventos de recombinación meiótica ya que las células o embriones se modifican en un momento cuando las células son exclusivamente mitótico. Como resultado, un animal modificado en TALEN fácilmente se puede distinguir de un animal creado por reproducción sexual.

Los procesos aquí descritos proporcionan para la edición de los genomas de animales existentes. El animal tiene un fenotipo fijo y la clonación del animal, por ejemplo, mediante la clonación de células somáticas, preserva eficazmente el fenotipo. Hacer un cambio o cambios específicos en el genoma celular durante la clonación permite un fenotipo conocido por ser alterado. Procesos en el presente documento proporcionan alternativamente para alterar el genoma de un embrión que todavía tiene que convertirse en un animal con rasgos fijos. Los embriones con la genética de sonido, sin embargo, no pueden expresar todos los rasgos que están dentro del potencial genético de su genética, es decir, los animales no siempre expresan los rasgos para los que su linea fue criada. Las modalidades incluyen proporcionar embriones que tienen la genética conocida por ser capaz de expresar un conjunto de rasgos y la exposición de los embriones al TALEN (opcionalmente sin un gen reportero y/o marcador de selección) y la detección del animal gestado para la modificación y para la expresión del conjunto de rasgos. En consecuencia, la introgresión de 'alelos deseables en el ganado se puede lograr mediante la edición de los genomas de animales previamente determinada para ser de valor genético significativo mediante la modificación de células somáticas y la clonación, o mediante la edición de los genomas de los animales antes de la determinación de su valor genético implícita por tratamiento/inyección de embriones. En el caso de la clonación, genéticamente animales superiores pudieron ser identificados y se sometieron a la edición de genes para la corrección de una pérdida del alelo función o la introgresión de alelos deseables que no están ya presentes. Este enfoque proporciona un resultado controlado y caracterizado en cada paso del proceso, ya que sólo las células que albergan los cambios deseados se clonan.

La edición también podría ser aplicada por el tratamiento directo de embriones. Los embriones de mérito genético desconocido serian tratados y el cribado de la descendencia puede consistir en análisis para el cambio deseado y análisis de valor genético del animal, por ejemplo, análisis para el cambio además del análisis de diversos rasgos que el animal expresa. Un aspecto beneficioso de este enfoque es que se puede aplicar simultáneamente con la mejora genética por selección asistida por marcadores que la clonación de los resultados en la pérdida de los intervalos 1+ de generación. La eficiencia de tales modificaciones tendría que ser lo suficientemente alta para compensar las pérdidas en la tasa reproductiva engendrada por tratamiento embrión. En el caso de inactivación de genes sencilla, la frecuencia de éxito es muy alta (75%), con incluso la modificación de homocigotos en el 10-20% de los embriones (Ejemplos 1 y 9). Las modalidades incluyen la exposición de los embriones (o células) a un TALEN (opcionalmente sin un gen reportero y/o sin un gen marcador con más de aproximadamente el 1% de los embriones que incorporan la modificación en el sitio cromosómico orientada TALEN (homocigotos o heterocigotos); los téenicos apreciarán inmediatamente que todos los rangos y valores dentro de los intervalos indicados explícitamente se contemplan, por ejemplo, de aproximadamente 1% a aproximadamente 85%), o al menos aproximadamente 5% o al menos aproximadamente 10%. Las células pueden de manera similar tener TALENs introducidos con éxito con eficiencias muy altas, con los mismos intervalos que se contemplan, es decir, más de aproximadamente el 1%. Los procesos convencionales alcanzan un porcentaje inferior. Además, la edición del genoma de precisión también se puede utilizar para introducir alelos que no existen actualmente dentro de una especie por sustitución alélica homología impulsada.

Animales modificados genéticamente sin ninguno de los reporteros ; Técnicas TALENs; Migraciones Alélicas Ciertas modalidades de la invención se dirigen a procesos de modificación de células o embriones sin el uso de reporteros y/o marcadores de selección. En general, se observó que la frecuencia de células modificadas por TALEN disminuye significativamente con el tiempo en ausencia de métodos de enriquecimiento o de selección tales como el uso de genes indicadores. Esta observación conduce a los enfoques tales como la técnica de co-transfección, co-selección reportada en el presente documento que involucra genes reporteros.

Se ha descubierto, sin embargo, que la modificación de TALENs se puede realizar con una eficiencia que es tan grande que los reporteros no son necesarios y su uso simplemente retrasa la creación de líneas de animales transgénicos. Sin estar ligado a una teoría en particular, un número de factores contribuyeron independientemente a la invención de las modalidades reportero libre. Una de ellas es la constatación de que TALENs tienden a actuar de forma rápida y con un elevado rendimiento. Sin embargo, las modificaciones TALENs tendían a ser inestable sobre un marco de tiempo de varios días tales que las eficiencias pueden parecen ser de baja dependiendo de la hora del muestreo. Además, es la sabiduría convencional de que los organismos modificados de manera estable sólo deben ser utilizados para hacer animales transgénicos de manera que hay poco incentivo para comprender modificaciones a corto plazo. Hay un incentivo para utilizar los genes de supervivencia celular para seleccionar para su incorporación estable, como se hace convencionalmente en otros sistemas. Otro factor es que el ARN TALENs es inesperadamente eficaz en comparación con vectores que expresan TALENs. La introducción directa de TALENs que codifica ARNm es, en general, útil, y se utilizó en los Ejemplos 13 a 18.

Otro factor es que, cuando una plantilla de HDR se desea, la introducción directa de ADNss, por ejemplo, oligonucleótidos monocatenarios (ss), es útil, como se demuestra en el Ejemplo 12. A efecto de confusión es que el momento de el suministro de ADNss era importante. En el Ejemplo 12, el suministro de los oligonucleótidos ss al mismo tiempo que el TALENs codificado a partir del plásmido de ADN no era eficaz, pero retrasar la introducción de los oligonucleótidos ss durante 24 horas resultó en una alta eficiencia. Por otro lado, el Ejemplo 16 mostró que la introducción simultánea de patrones de oligonucleótidos y TALENs ARNm fue eficaz. Ya que TALENs se introdujeron en el Ejemplo 12 como casetes de expresión de ADN plásmido, puede haber habido 12 o más horas de retraso entre la transfección y la acumulación de suficiente proteina TALEN comenzar escindir el objetivo. Tal vez los oligonucleótidos introducidos con el TALENs en el Ejemplo 12 fueron degradados por las células o de lo contrario no disponibles (compartimentadas o en complejo con las proteínas) para actuar como molde para la HR, al mismo tiempo que TALENs surcaba activamente el objetivo. Otro factor de confusión, sorprendentemente, era que los nucleótidos ss tienen un efecto bifásico (Ejemplo 16). Es decir, muy poco o demasiado resultados de oligonucleótidos ss en una baja frecuencia de HDR. Las modalidades de la invención incluyen aquellas en las que el ADNss se introduce en la célula después de un vector que codifica un TALEN se introduce en la célula, por ejemplo, entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 7 días después; los téenicos apreciarán inmediatamente que todos los rangos y valores dentro de los intervalos indicados explícitamente se contemplan, por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 días horas. Las modalidades de la invención incluyen aquellos en los que el ADNss se introduce en la célula en aproximadamente el mismo tiempo que codifica un ARNm TALENs se introduce directamente, con el término "aproximadamente al mismo tiempo", es decir dentro de menos de aproximadamente 7 horas uno del otro.

Otro factor que contribuye al descubrimiento de modalidades libres de reportero fue que existe una sinergia inesperada entre ADNss (oligonucleótido me) plantillas y actividad TALENs. La base para esta sinergia no se conoce. Por ejemplo, el suministro de 0.5-10 microgramos TALEN ARNms que codifican para 500,000-750,000 células por nucleofección seguido por 3 días de cultivo a 30 grados centígrados resultados en niveles consistentes de modificación. Pero la administración de suplementos de estas mismas condiciones con 0.2 a 1.6 nmol de ssODN condujo a un aumento en la actividad TALENs, como se observa por el aumento de NHEJ como se ensayó mediante el ensayo de SURVEYOR (Ejemplo 16). Típicamente, una transfección consta de 1-4 microgramos de ARNm TALEN y 0.2-0.4 nMol de ADNss. Las modalidades incluyen la introducción a una célula o un embrión, una cantidad de TALEN ARNm que es más de aproximadamente 0.05 mg por 500,000 células, o en un intervalo de aproximadamente 0.05 mg a aproximadamente 100 pg por 500,000 células; los téenicos apreciarán inmediatamente que todos los rangos y valores dentro de los intervalos indicados expresamente se contemplan. Las modalidades incluyen la introducción de más ADNss a una concentración de más de aproximadamente 0.02 nMol o en un intervalo de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 10 nmol de ADNss.

El término introducción directa, por ejemplo, la introducción directa de ARNm, se refiere a la introducción de material ARNm. En contraste, la introducción por medio de un vector que codifica el ARNm se denomina introducción indirecta. Muchos procesos de introducción directa se conocen, por ejemplo, electroporación, transfección, lipofección, liposoma, nucleofección, partículas biolísticas, nanopartículas, transfección de lípidos, electrofusión, e inyección directa.

Los animales progenitores se pueden crear de inmediato a partir de células o embriones modificados sin la necesidad de crear animales modificados inicialmente que posteriormente son criados para crear la base de una nueva línea transgénica. El término progenitor o animal progenitor se utiliza para referirse a un animal transgénico ("F0") de primera generación que desarrolla directamente de la célula clonada o embrión tratado/inyectado que se modifica. Métodos presentados en este documento proporcionan para la creación de los progenitores genéticamente modificados sólo en el sitio objetivo cromosómica, y sin pasos intermedios de cria y/o endoga ia. Además, las modalidades incluyen progenitores que son homocigotos para la modificación. Los progenitores se pueden preparar sin exposición de las células y/o embriones de genes reporteros (y/o genes marcadores de selección).

Las modalidades incluyen un método de fabricación de un animal modificado genéticamente, comprendiendo dicho método la exposición de los embriones o células a un ARNm que codifican un TALEN, con el TALEN unido específicamente a un sitio objetivo cromosómico en los embriones o células, la clonación de las células en una madre sustituta o implantación de los embriones en una madre sustituto, con la madre sustituto en gestación un animal que se ha modificado genéticamente sin un gen reportero y sólo en el sitio objetivo cromosómico obligado por el TALEN. El animal puede estar libre de todos los genes indicadores o puede estar libre de marcadores de selección, por ejemplo, está libre de marcadores de selección, pero tiene un indicador tal como una proteína fluorescente. Opciones incluyen introducir directamente el TALENs como ARNm y/o un oligonucleótido ss que proporciona una plantilla para una modificación genética, por ejemplo, un alelo.

Un método de fabricación de un animal modificado genéticamente comprende introducir TALENs y/o vectores en células cultivadas, por ejemplo, células primarias de ganado. Los TALENs se dirigen a sitios cromosómicos específicos y causan una alteración genética en el sitio. Una plantilla de HDR también se puede introducir en la célula, por ejemplo, un vector de doble hebra, ADN de hebra sencilla, o directamente como un nucleótido ss. Las células cultivadas se cultivaron posteriormente para formar colonias de células clónales. Las colonias son probadas por PCR y/o secuenciadas, o de lo contrario se ensayaron para una modificación genética, preferiblemente sin un gen reportero y/o sin un marcador de selección. Las células se toman a partir de colonias que son modificados genéticamente en el sitio previsto y se utilizan en la clonación. Por ejemplo, de 10 a 50,000 células se utilizan para hacer de 10 a 50,000 embriones que se implantan en sustitutos, por ejemplo, en grupos de 1-500 embriones por sustituto; los téenicos apreciarán inmediatamente que todos los rangos y valores dentro de los intervalos indicados expresamente se contemplan. Las modalidades comprenden exponer las células al TALEN sin un gen reportero, la creación de colonias de células clónales, y prueba de un subconjunto de los miembros de las colonias para identificar colonias que incorporan la modificación en el sitio objetivo cromosómico.

Se conocen procesos para elaboración de colonias de células clónales a partir de células cultivadas. Uno de tales métodos implica dispersar las células de un primer cultivo en un segundo cultivo en el que las diversas células no están en contacto unas con otras, por ejemplo, mediante la dilución de las células en placas de paredes múltiples o en una placa con una superficie relativamente grande para el número de células colocado en el mismo. Las células se cultivan durante un periodo de tiempo que permite que las células se multipliquen. Las células que se multiplican se cultivan en condiciones en las que no puedan moverse lejos de su ubicación original. Como resultado, un usuario puede observar las células después del periodo de tiempo y ver diversas colonias que están hechas de una sola célula y su progenie. Un subconjunto de las células en la colonia puede ser muestreada sin destruir las otras células en la colonia.

Los ensayos para una modificación genética pueden incluir ensayos destructivos, es decir, un ensayo que destruye la célula que se prueba para determinar si tiene una cierta propiedad. Ensayos destructivos proveen una oportunidad para rápidamente, a fondo, y probar directamente un medicamento. Ensayos destructivos se practican con una toma de una muestra ,de una colonia clonal. Muchos de estos ensayos son altamente eficientes, en particular cuando se conoce la modificación buscada. Por ejemplo, la PCR se puede realizar para identificar indels o desajustes en las secuencias de pre-existentes, o para detectar una secuencia de una plantilla de HDR. O, por ejemplo, el ADN celular se puede ensayarse nucleoliticamente, por ejemplo, para determinar si una secuencia nucleasa objetivo ha sido introducida con éxito o inactivada. El Ejemplo 18 utiliza un ensayo destructivo nucleolítico. Otros procesos pueden ser utilizados que implican, por ejemplo, la secuenciación o SDS-PAGE para encontrar una banda que es indicativa de una modificación. Otros procesos pueden ser utilizados que implican, por ejemplo, la secuenciación o SDS-PAGE para encontrar una banda que es indicativa de una modificación. Procesos de prueba pueden ser, por ejemplo, seleccionado de entre el grupo que consiste de un ensayo nucleolítico, secuenciación, PAGE, PCR, extensión del cebador, o hibridación.

La migración alelo tiene muchas aplicaciones importantes. La tabla de migración alélica, a continuación, describe ciertos genes y sus aplicaciones. Los téenicos que leen esta aplicación podrán realizar y utilizar las migraciones y las células y los animales resultantes. Los técnicos pueden aplicar fácilmente los procesos establecidos en este documento para el uso de estos alelos como plantillas u objetivos para la interrupción. Las modalidades incluyen la fabricación de una célula modificada genéticamente o animal (por ejemplo, un animal de laboratorio, un progenitor F0, o la linea de origen animal) que tiene un genoma que ha recibido un gen de la tabla, por ejemplo, mediante la inserción o la migración alelo basado en plantillas. Se reportan alelos para algunos genes para proporcionar ventajas de producción de ganado, pero son a frecuencias muy bajas o están ausentes en algunas razas o especies (ver artículos 1-9). La introgresión de estos alelos puede ser de gran valor para las características de producción. Por ejemplo, el alelo por sondeo (punto 1) de razas de carne resulta en animales que no tienen cuernos, mientras que las razas lecheras no tienen este alelo tienen cuernos y necesitan descornarse como una práctica de producción. La migración alelo de razas de carne en razas de cuernos (lácteos) dará lugar a las vacas lecheras sin cuernos que se tiene valor para la producción y el bienestar de los animales. Otros ejemplos se refieren a los alelos que pueden aumentar o mejorar características de los productos agrícolas, tales como la carne (puntos 4-6) y leche (artículos 7-8). El punto 9 es útil para la resistencia a las enfermedades.

Muchas razas de animales comerciales y de uso común han sido criadas cuidadosamente para establecer rasgos deseables, pero, en el proceso de la cria, han acumulado errores genéticos que reducen su éxito reproductivo debido a las pérdidas en la fertilidad o por el aumento de abortos involuntarios. Los alelos deletéreos para algunos genes presentes en las poblaciones animales. Como se explica en este documento, las téenicas inventivas proporcionan el cambio de alelos sólo en un lugar deseado en un animal de destino, sin otras modificaciones resultantes de herramientas genéticas o de recombinaciones meióticas. Por lo tanto, por primera vez, es posible limpiar los errores genéticos que se han acumulado en el ganado y animales de razas sin interrumpir el genoma de los animales y, en consecuencia, interrumpiendo rasgos o causar consecuencias no deseadas. Los alelos para algunos genes se pueden utilizar para controlar la fertilidad de los animales para el control genético de animales de cria (puntos 2-3).

Muchos modelos animales útiles se pueden hacer. Ciertos alelos son útiles, ver artículos 10 a 39. Algunos de ellos se establecieron en animales. Otros de los genes son conocidos por causar enfermedades humanas, por lo que la introgresión de estos alelos en animales de granja, animales de laboratorio, o de otros animales es útil para crear modelos biomédicos de enfermedades humanas.

Las modalidades de la invención incluyen un método de fabricación de un animal modificado genéticamente, comprendiendo dicho método la exposición de los embriones o células a un ARNm que codifica un TALEN, con el TALEN enlazados específicamente a un sitio cromosómico objetivo en los embriones o células, la clonación de las células en una madre sustituto o implantación de los embriones en una madre sustituía, con la madre sustituía por ello en gestación de un animal que se ha modificado genéticamente sin un gen reportero y sólo en el TALEN dirigido al sitio cromosómico en el que el alelo es un miembro del grupo que consiste en (a) ubicación descornado (b) un gen recesivo para defectos de fertilidad, por ejemplo, CWC15 y/o ApaFl (c) genes para mejorar un rasgo de ganado, por ejemplo, la producción de carne (GDF8, IGF2, SOCS2, o una combinación de los mismos) y/o producción de leche (DGAT1 y/o ABCG2) (d) un gen de resistencia a la fiebre porcina africana (P65/RELA) (e) un gen para la reducción de tamaño de los animales (GHRITR) (f) genes que potencian el crecimiento tumoral (por ejemplo, TP53, APC, PTEN, RB1, Smad4, BUB1B, BRCA1, BRCA2, ST14 o una combinación de los mismos) (g) oncogenes humanos para modelos animales de cáncer (por ejemplo, AKT1, EGF, EGFR, KRAS, PDGFRA/B o una combinación de los mismos) (h) genes en modelos animales para la hipercolesterolemia (para inducir la aterosclerosis, accidente cerebrovascular y modelos de enfermedad de Alzheimer), por ejemplo, LDLR, ApoE, ApoB o una combinación de los mismos (i) enfermedad inflamatoria intestinal, por ejemplo, N0D2 (j) espina bifida, por ejemplo, VANGL1 y/o VANGL2 (k) hipertensión pulmonar, por ejemplo, miR-145 (1) genes para defectos cardiacos, por ejemplo, BMP10, S0S1, PTPN11, Nrgl, Kir6.2, GATA4, Hand2, o una combinación de los mismos y (m) genes de enfermedad celiaca, por ejemplo, HLA-DQA1.

Tabla de migración alélica Composiciones y Kits La presente invención también proporciona composiciones y kits que contienen, por ejemplo, moléculas de ácido nucleico que codifican TALENs, polipéptidos TALEN, composiciones que contienen tales moléculas de ácidos nucleicos o polipéptidos, o líneas celulares que producen por ingeniería TALEN. Tales artículos se pueden utilizar, por ejemplo, como herramientas de investigación, o terapéuticamente.

Recombinasas Las modalidades de la invención incluyen la administración de una TALEN o TALENs con una recombinasa u otra proteína de unión al ADN asociado con la recombinación del ADN. Una recombinasa forma un filamento con un fragmento de ácido nucleico y, en efecto, busca en el ADN celular para encontrar una secuencia de ADN sustancialmente homologa a la secuencia. Una modalidad de una modalidad TALEN-recombínasa comprende combinar una recombinasa con una secuencia de ácido nucleico que sirve como una plantilla para ITDR. La secuencia de plantilla HDR tiene homología sustancial a un sitio que está dirigido para el corte por el par TALEN/TALEN. Como se describe aquí, la plantilla de HDR proporcionada para un cambio en el ADN nativo, mediante la colocación de un alelo, la creación de un indel, la inserción de ADN exógeno, o con otros cambios. El TALEN se coloca en la célula o embrión mediante los métodos descritos en el presente documento como una proteína, ARNm, o mediante el uso de un vector. La recombinasa se combina con la plantilla de HDR para formar un filamento y se coloca en la célula. La recombinasa y/o plantilla HDR que se combina con la recombinasa se pueden colocar en la célula o el embrión como una proteína, un ARNm, o con un vector que codifica la recombinasa. La divulgación de Pub US 2011/0059160 (US N° de Serie 12/869,232) se incorporan a la presente por referencia a todos los efectos; en caso de conflicto, la especificación está controlando. El término recombinasa se refiere a una enzima que cataliza la recombinación genética enzimáticamente, en una célula, la unión de piezas relativamente cortas de ADN entre dos hebras de ADN relativamente más largas. Las recombinasas incluyen recombinasa Cre, la recombinasa Hin, RecA, RAD51, Cre, y FLP. La recombinasa Cre es una topoisomerasa de tipo I de bacteriófago PI que cataliza la recombinación específica de sitio de ADN entre los sitios loxP. La recombinasa Hin es una proteína 21kD compuesta de 198 aminoácidos que se encuentra en la bacteria Salmonella. Hin pertenece a la familia de serina recombinasa invertasas de ADN en el que se basa en la serina del sitio activo para iniciar la división del ADN y la recombinación. RAD51 es un gen humano. La proteina codificada por este gen es un miembro de la familia de la proteina RAD51 que ayudan en la reparación de ADN de doble filamento se rompe. Miembros de la familia RAD51 son homólogos a los genes bacterianos RecA y Rad51 de levadura. La recombinasa Cre es una enzima que se utiliza en experimentos para eliminar secuencias especificas que están flanqueados por sitios loxP. FLP se refiere a flipasa enzima de recombinación (FLP o Flp) derivado de 2m plásmido de levadura de panadería Saccharomyces cerevísiae.

RecA es conocida por su actividad recombinasa para catalizar el intercambio de cadenas durante la reparación de roturas de doble hebra por recombinación homologa (McGrew, 2003) Radding, et al., 1981; Seitz et al., 1998). RecA también se ha demostrado catalizar la proteólisis, por ejemplo, de LexA y proteínas represoras l, y que poseen actividad ATPasa dependiente de ADN. Después de un descanso de doble cadena se produce a partir de la radiación o algún otro insulto ionizante, exonucleasas mastican de nuevo el ADN termina 5'a 3', exponiendo así una cadena del ADN (McGrew, 2003; Cox, 1999). El ADN de hebra sencilla se estabiliza por la proteína de unión de una sola cadena (SSB). Después de la unión de SSB, RecA se une al ADN de hebra sencilla (e) y forma un filamento de nucleoproteína helicoidal (referido como un filamento o un filamento presináptico). Durante la reparación del ADN, las funciones de búsqueda de homologia-RecA dirigen el filamento de ADN homologan y catalizan el emparejamiento de bases homologa y la linea de cambio. Esto da como resultado la formación heterodúplex de ADN. Después de la invasión, ADN polimerasa alarga el ADNss basado en la plantilla de ADN homologa a reparar la ruptura del ADN, y las estructuras de cruce o cruces Holliday se forman. RecA también muestra una función de motor que participa en la migración de las estructuras de cruce (Campbell y Davis, 1999).

La actividad recombinasa comprende un número de diferentes funciones. Por ejemplo, las secuencias de polipéptido que tiene actividad recombinasa son capaces de unirse de una manera de secuencia no especifica al ADN de hebra sencilla para formar un filamento de nucleoproteina. Tales filamentos de nucleoproteina recombinasa unida son capaces de interactuar de una manera no especifica de la secuencia con una molécula de ADN de doble cadena, la búsqueda de secuencias en la molécula de doble cadena que son homologas a las secuencias en el filamento, y, cuando tales secuencias se encuentran, desplazan una de las hebras de la molécula de doble cadena para permitir el apareamiento de bases entre las secuencias en el filamento y secuencias complementarias en una de las cadenas de la molécula de doble cadena. Estos pasos son denominados colectivamente "sinapsis".

Proteínas RecA y similares a RecA (llamadas Rad51 en muchas especies eucariotas) han sido examinadas para estimular la orientación de genes y la recombinación homologa én una variedad de sistemas eucariotas. En células de tabaco, la expresión de RecA bacteriana que contiene una señal de localización nuclear (NLS) aumenta la reparación del daño del ADN inducido por mitomicina C-por recombinación homologa y recombinación intracromosómica somática (recombinación entre cromosomas homólogos) de tres a diez veces (Reiss, 1996). Expresión de NLSRecA en el tabaco también puede estimular intercambio de cromátidas hermanas 2.4 veces más de los niveles de tipo natural (Reiss, 2000). En células de mamíferos somáticas, la sobreexpresión de NLSRecA estimula al gen de la orientación por recombinación homologa 10 veces (Shcherbakova, 2000). Sin embargo, en las células humanas, la sobreexpresión de un homólogo humano de RecA, 1ÍRAD51, sólo estimula la recombinación de 2 a 3 dobleces sobre los niveles de tipo natural en virtud de la selección de antibióticos (Yanez, 1999). En el pez cebra, una forma mutante de la proteína fluorescente verde potenciada (EGFP) se corrigió a baja frecuencia mediante la inyección de los filamentos de RecA-ADNss directamente (Cui, 2003). Rad52, un miembro del grupo de epistasis Rad51, también promueve el recocido de un solo capitulo y bajo nivel de interrupción de genes en el pez cebra utilizando oligonucleótidos mutados (Takahashi, 2005). Tomados en conjunto, estos estudios indican que la expresión ectópica de RecA o Rad51 resultados en una modesta estimulación de la recombinación homologa, pero no aumenta los niveles suficientemente para ser útil al gen de la orientación.

Asi, las actividades de recombinasa incluyen, pero no se limitan a, ADN de hebra sencilla de unión, la sinapsis, la búsqueda de homología, la invasión dúplex por el ADN de hebra sencilla, la formación de heterodúplex, hidrólisis de ATP y la proteólisis. La recombinasa prototípica es la proteína RecA de E. coli . Véase, por ejemplo, la Patente de E.U.A. No. 4,888,274. Proteínas RecA-similares procariotas también se han descrito en Salmonella, especies Bacillus y Proteus. Una proteína RecA termoestable, de Thermus aquaticus, se ha descrito en la Patente de E.U.A. N° 5,510,473. Un homólogo de RecA bacteriófago T4, la proteína UvsX, ha sido descrita. Mutantes RecA, habiendo alterado actividades de recombinasa, se han descrito, por ejemplo, en las Patentes de E.U.A. N° 6,774,213; 7,176,007 y 7,294,494. Plantas homologas de RecA se describen en, por ejemplo, las Patentes de E.U.A. N° 5,674,992; 6,388,169 y 6,809,183. Fragmentos que contienen la actividad recombinasa RecA se han descrito, por ejemplo, en la Patente de E.U.A. No.5,731, 411. Proteínas RecA mutante que tiene una mayor actividad de la recombinasa tal como, por ejemplo, RecA803 se han descrito. Véase, por ejemplo, Madiraju et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.85: 6592 a 6596.

Un homólogo eucariota de RecA, también posee actividad recombinasa, es la proteína Rad51, primero identificado en la levadura Saccharomyces cerevisiae. Ver Bishop et al, (1992) Cell 69: 439-56 y Shinohara et al, (1992) Cell:. 457-70 Aboussekhra, et al, (1992) Mol. Cell. Biol. 72, 3224-3234.

Basile et al., (1992) Mol. Cell. Biol. 12, 3235-3246. secuencias de plantas Rad51 se describen en las Patentes de E.U.A. N° 6,541,684; 6,720,478; 6,905,857 y 7,034,117. Otra proteina de levadura que es homologa a la proteina RecA es DMCL. Homólogos de RecA/Rad51 en organismos distintos de E. coli y S. cerevisiae se han descrito. Morita et al (1993) Proc. Nati Acad. Sci. US.90: 6,577-6,580; Shinohara et al. (1993) Nature Genet: 4: 239-243; Hcyer (1994) Experientia 50: 223-233; Maeshima et al. (1995) Gen 160: 195- 200; Patentes US. Nos.6.541, 684 y 6,905,857. En este documento, "proteina RecA" "RecA" o se refiere a una familia de proteínas de recombinación RecA-al igual que tiene ,esencialmente la totalidad o la mayor parte de las mismas funciones, en particular: (i) la capacidad de colocar correctamente los oligonucleótidos o polinúcleótidos en sus objetivos homologas de prórroga posterior por polimerasas de ADN; (ii) la capacidad topológicamente para preparar dúplex de ácido nucleico para la síntesis de ADN; y, (iii) la capacidad de RecA/oligonucleótido o complejos/RecA de polinúcleótidos de manera eficiente para encontrar y unirse a secuencias complementarias. La mejor proteína RecA es caracterizada a partir de E. colí; Además de la forma alélica de la prateína original de una serie de proteínas RecA-similares mutantes han sido identificadas, por ejemplo, RecA803. Además, muchos organismos tienen proteínas de transferencia de cadena de RecA como incluyendo, por ejemplo, levadura, Drosophila, mamíferos incluyendo seres humanos, y plantas. Estas proteínas incluyen, por ejemplo, de película, de Rec2, Rad51, Rad51B, Rad51 C, RAD51D, Rad51E, XRCC2 y DMC1. Una modalidad de la proteína de recombinación es la proteína RecA de E. coli . Alternativamente, la proteína RecA puede ser el mutante de proteína RecA-803 de E. coli, una proteína RecA de otra fuente bacteriana o una proteína de recombinación homologa de otro organismo.

Descripciones adicionales de proteínas que tienen actividad recombinasa se encuentran, por ejemplo, en Fugisawa et al. (1985) Nucí. Acids Res.13:7473; Hsieh et al. (1986) Cell 44:885; Hsieh et al. (1989) J Biol Chem. 264:5089; Fishel et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:3683; Cassuto et al. (1987) Mol. Gen. Genet.208:10; Ganea et al. (1987) Mol. Cell Biol.7:3124; Moore et al. (1990) J Biol. Chem, 11108; Keene et al (1984) Nucí. Acids Res. 12:3057; Kimiec (1984) Coid Spring Harbor Symp. 48:675; Kimeic (1986) Cell 44:545; Kolodner et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:5560; Sugino et al. (1985) Proc. Nati.

Acad, Sci, USA 85: 3683; Halbrook et al. (1989) J Biol. Chem. 264:21403; Eisen et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:7481; McCarthy et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5854; y Lowenhaupt et al. (1989) J Biol. Chem.264:20568, que se incorporan en este documento por referencia. Ver también Brendel et al. (1997) J. Mol. Evol.44:528.

Ejemplos de proteínas que tienen actividad recombinasa incluyen recA, recA803, uvsX, y otros mutantes recA y recombinasas recA-similares (Roca (1990) Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol, 25:415), (Kolodner et al. (1987) Proc. Nati.

Acad. Sci. U.S.A. 84:5560; Tishkoff et al. (1991) Molec. Cell. Biol.11 :2593), RuvC (Dunderdale et al. (1991) Nature 354:506), DST2, KEM1 and XRN1 (Dykstra et al (1991) Molec. Cell. Biol 11 :2583), STPa/DSTl (Clark et al, (1991) Molec. Cell. Biol, 11 :2576), HPP-1 (Moore et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S 88:9067), otras recombinasas eucarióticas (Bishop et al, (1992) Cell 69: 439; y Shinohara et al (1992) Cell 69:457);. incorporada aquí como referencia. En proteínas n/7/O- evolucionados que tienen actividad recombinasa se han descrito en la Patente de E.U.A. N° 6,686,515. Otras publicaciones relacionadas con recombinasas incluyen, por ejemplo, la Patentes de E.U.A. Nos. 7,732,585, 7,361,641, 7,144,734. Para una revisión de recombinasas, ver Cox (2001) Proc. Nail. Acad. Sci. USA 98:8173 hasta 8180.

Un filamento de nucleoproteína, o "filamento" se puede formar. El término filamento, en el contexto de formar una estructura con una recombinasa, es un término conocido por los téenicos en estos campos. El filamento de nucleoproteína así formado puede entonces estar, por ejemplo, en contacto con otro ácido nucleico o introducido en una célula. Métodos para la formación de filamentos de nucleoproteína, en el que los filamentos comprenden secuencias de polipéptidos que tienen actividad recombinasa y un ácido nucleico, son bien conocidos en el campo. Véase, por ejemplo, Cui et al. (2003) Marine Biotechnology. 5:174-184 y la Patente de E.U.A. n° 4,888,274; 5,763,240; 5,948,653 y 7,199,281, cuyas descripciones se incorporan por referencia para los fines de la divulgación de técnicas ejemplares para recombinasas a los ácidos nucleicos de unión para formar filamentos de nucleoproteína.

En general, una molécula de actividad recombinasa que se pone en contacto con una lineal, monocatenario de ácido nucleico. El ácido nucleico lineal, de cadena sencilla puede ser una sonda. Se conocen los métodos de preparación de tales ácidos nucleicos de cadena sencilla. La mezcla de reacción contiene típicamente un ion de magnesio. Opcionalmente, la mezcla de reacción está taponada y opcionalmente también contiene ATP, dATP o un análogo de ATP no hidrolizable, tal como, por ejemplo, g-tio-ATP (ATR-g-S) o g-tio-GTP (GTP-yS). Las mezclas de reacción pueden contener también opcionalmente un sistema de generación de ATP. Moléculas de ADN de doble cadena se pueden desnaturalizar (por ejemplo, por el calor o álcali) ya sea antes de, o durante, la formación de filamentos. La optimización de la relación molar de recombinasa al ácido nucleico está dentro de la experiencia del campo. Por ejemplo, una serie de diferentes concentraciones de recombinasa se puede añadir a una cantidad constante de ácido nucleico, y la formación de filamentos se ensayó mediante la movilidad en un gel de agarosa o acrilamida. Debido a que la proteína unida retarda la movilidad electroforética de un polinucleótido, la formación de filamentos se pone de manifiesto por la movilidad retardada del ácido nucleico. Cualquier máximo grado de retraso, o la cantidad máxima de ácido nucleico que migran con una movilidad retardada, se puede utilizar para indicar relaciones de recombinasa:ácido nucléico óptimas. Asociación de proteínas de ADN también se pueden cuantificar midiendo la capacidad de un polinucleótido de unirse a nitrocelulosa.

TALENs El término TALEN, como se usa aquí, es amplia e incluye un TALEN monomérico que puede escindir ADN de doble hebra, sin la ayuda de otro TALEN. El término TALEN también se utiliza para referirse a uno o ambos miembros de una pareja de TALENs que están diseñados para trabajar juntos para escindir el ADN en el mismo sitio. TALENs que trabajan juntos se puede denominar como TALEN izquiedo y TALEN derecho, que hace referencia al uso de las manos de ADN o un par TALEN.

Miller et al. (Miller et al (201 1) Nature Biotechnol. 29: 143) informó hacer TALENs para la arquitectura nucleasa específica de sitio mediante la vinculación truncada TAL variantes para el dominio catalítico de nucleasa FokI. Los TALENs resultantes se muestran para inducir la modificación qenética en células humanas inmortalizadas por medio de las dos principales vías de reparación del ADN eucariota, de extremos no homólogos (NHEJ) y homología dirigida reparación. El TALENs puede diseñarse para la unión específica. La unión específica, tal como el término se utiliza comúnmente en las artes biológicos, se refiere a una molécula que se une a un objetivo con una afinidad relativamente alta en comparación con los tejidos no objetivo, y por lo general implica una pluralidad de interacciones no covalentes, tales como interacciones electrostáticas, interacciones de van der Waals, enlaces de hidrógeno, y similares. Interacciones de unión especifica caracterizan antigeno-anticuerpo de unión, la unión enzima-sustrato, y unirse específicamente las interacciones de los receptores de la proteína.

El sistema de cifrado para TALs ha informado (Solicitud PCT WO 2011/072246) en la que cada repetición de unión a ADN es responsable para el reconocimiento de un par de bases en la secuencia de ADN objetivo. Los residuos se pueden ensamblar para apuntar a una secuencia de ADN, con: (a) HD para el reconocimiento de C/G; (b) de NI para el reconocimiento de A/T; (c) MAL para el reconocimiento de T/A; (d) NS para el reconocimiento de C/G o A/T o T/A o G/C; (e) NN 30 para el reconocimiento de G/C o A/T; (f) IG para el reconocimiento de T/A; (g) N para el reconocimiento de C/G; (h) HG para el reconocimiento de C/G o T/A; (i) H para el reconocimiento de T/A; y (j) NK para el reconocimiento de G/C. En resumen, un sitio objetivo para la unión de un TALEN se determina y una molécula de fusión que comprende una nucleasa y una serie de RVDS que reconocen el sitio de destino se crea. Tras la unión, las rompe la nucleasa de ADN para que la maquinaria de reparación celular puede operar para hacer una modificación genética en los extremos cortados. El término TALEN significa una proteina que comprende un dominio de enlace al efector de transcripción activador-similar (TAL) y un dominio nucleasa e incluye TALENs monoméricos que son funcionales per se, asi como otras que requieren la dimerización con otro monómero TALEN. La dimerización puede resultar en un TALEN homodimérico cuando tanto monomérico TALEN son idénticos o puede dar lugar a una TALEN heterodimero cuando monomérico TALEN son diferentes.

En algunas modalidades, un TALEN monomérico se puede utilizar. TALEN típicamente funciona como atenuantes a través de un sitio de reconocimiento bipartito con un espaciador, de tal manera que dos dominios efectores TAL cada uno se fusionan a un dominio catalítico de la enzima de restricción Fokl, los sitios de reconocimiento de ADN para cada TALEN resultante están separados por una secuencia espad adora, y unión de cada monómero TALEN al sitio de reconocimiento permite Fokl para atenuar y crear un salto de hebra doble en el espaciador. TALENs monomérico también puede ser construidos, sin embargo, de tal manera que los efectores TAL individuales se fusionan con una nucleasa que no requiere la dimerización para funcionar. Uno de tales nucleasa, por ejemplo, es una variante de una sola cadena de Fokl en el que los dos monómeros se expresan como un único polipéptido. Otro origen natural o nucleasas monoméricas de ingeniería también se puede servir a este papel. El dominio de reconocimiento de ADN utilizado para un TALEN monomérico se puede derivar de un efector TAL de origen natural. Alternativamente, el dominio de reconocimiento de ADN puede diseñarse para reconocer un objetivo de ADN específico. De una sola cadena TALENs Diseñado puede ser más fácil de construir y desplegar, ya que requieren un único dominio de reconocimiento de ADN de ingeniería. Un ADN dimérico secuencia específica de nucleasa puede ser generado utilizando dos dominios de unión de ADN diferente (por ejemplo, dominio de enlace de un efector TAL y un dominio de enlace de otro tipo de molécula). TALENs puede funcionar como dímeros a través de un sitio de reconocimiento bipartito coñ un espaciador. Esta arquitectura nucleasa también se puede utilizar para nucleasas específicas del objetivo generadas a partir de, por ejemplo, un monómero TALEN y un monómero de nucleasa de dedo de zinc. En tales casos, los sitios de reconocimiento de ADN para el TALEN y monómeros de nucleasa de dedos de zinc pueden estar separados por un espaciador de longitud apropiada. La unión de los dos monómeros puede permitir Fokl a atenuar y crear un doble capítulo de ruptura dentro de la secuencia espaciadora.

Dominios de unión de ADN distintas de dedos de zinc, tales como hcmeodomains, repeticiones myb o cremalleras de leucina, también pueden fusionarse con Fokl y sirven como un socio con un monómero TALEN para crear una nucleasa funcional.

En algunas modalidades, un efector TAL se puede utilizar para dirigirse a otros dominios de la proteina (por ejemplo, dominios de la proteina no nucleasa) a secuencias de nucleótidos especificas. Por ejemplo, un efector TAL puede estar vinculado a un dominio de proteina a partir de, sin limitación, una enzima de la interacción ADN 20 (por ejemplo, una metilasa, una topoisomerasa, una integrasa, una transposasa, o una ligasa), activadores o represores de transcripción, o una proteina que interactúa con o modifica otras proteínas como las histonas. Las aplicaciones de tales fusiones TAL efectoras incluyen, por ejemplo, creación o modificación de elementos reguladores epigenéticos, haciendo inserciones específicas de sitio, supresiones, o reparaciones en el ADN, el control de la expresión génica, y modificación de estructura de la cromatina.

El espaciador de la secuencia objetivo se puede seleccionar o variarse para modular TALEN especificidad y actividad. La flexibilidad en la longitud del espaciador indica que la longitud del espaciador puede ser elegido a secuencias objetivo particulares con alta especificidad.

Además, la variación en la actividad se ha observado para diferentes longitudes espaciadores que indican que la longitud del espaciador puede ser elegido para lograr un nivel deseado de actividad TALEN.

Los TALENs descritos en el presente documento como Carlson +63 se encontraron sorprendentemente ser muy eficiente en uso. Una comparación al TALENs similar se muestra en las Figuras 16 y 18. Con referencia a la Figura 16 y usando los números de posición en el mismo, hay una porción N-terminal que va desde aproximadamente 1 a aproximadamente 42, una porción 5' de aproximadamente 43 a aproximadamente 178, y la porción de RVD desde aproximadamente 179 a aproximadamente 197, un dominio +63 de aproximadamente 198 a aproximadamente 261, y una porción de Fokl desde aproximadamente 262 hasta el final a aproximadamente 400. Un número de residuos son diferentes entre las secuencias, por ejemplo, en cerca de 10 posiciones que tienen un circulo en la Figura 16. La porción líder N-terminal también es diferente, con el Carlson +63 TALEN es aproximadamente 20 residuos más corto y tiene alrededor de 16 otras diferencias. Las modalidades de la porción líder N-terminal son secuencias de entre aproximadamente 10 a aproximadamente 30 residuos; los téenicos apreciarán inmediatamente que todos los rangos y valores dentro de los intervalos indicados expresamente se contemplan.

La Figura 17 proporciona una lista de secuencias para el vector utilizado con la secuencia de Carlson +63. Algunas partes del vector que se indican en la figura: el sitio de unión del cebador T3, un 5'UTR, TALEN 5' para Carlson +63, un fragmento LacZ-staffer (ver Cermak et al 2011 para la detección blanco azul de los clones), un homodimero Fokl, un 3 'TALEN +18-+63 (tenga en cuenta que el 3' TALEN +1-17 proporcionada por última repetición TALEN en el paso final de clonación), un 3' UTR-poliA, y un Poli-C que potencialmente protege el ARNm de la degradación. En el uso, como es conocido por los téenicos, los aminoácidos que proporcionan unión específica se insertan entre las porciones etiquetados como la porción 5 'y la secuencia de RVD medio. La Figura 17 muestra el Carlson +63 TALEN andamiaje con varias características para la producción de ARNm. El vector tiene algunas características en común con un plásmido pT3TS anteriormente descrito (Hyatt, T. M. & Ekker, S. C. Vectors and techniques for ectopic gene expression in zebrafish. Methods Cell Biol 59, 117-126 (1999)). Una mejora significativa al vector de Hyatt et al. fue hecha por la supresión de un promotor LacZ que anteriormente se encuentra 5'de la secuencia del promotor T3 indica en la Figura 17. La supresión del promotor LacZ se encontró que se requiere para la clonación fiable de gen específico TALENs y la propagación del plásmído. El vector Carison +63 tiene un sitio T3 para la transcripción de ARNm con T3 ARNm polimerasa. Las características incluyen un sitio de unión a promotor de T3 a partir del cual se puede iniciar la transcripción, 5' y 3' UTR secuencia del gen b-globina Xenopus, y un tramo poli-C. Las porciones 5' y 3' porciones de flanco andamiaje TALEN un fragmento LacZ embutidora que se elimina cuando las secuencias RVD específicos de genes se clonan cómo se describe en Cermak, T. et al. El diseño eficiente y montaje de costumbre TALEN y otras los constructos basadas efector TAL para la focalización de ADN. Nucleic Acids Research 39, e82 (2011).

Modalidades alternativas utilizan polimerasas de ARNm alternativas y afines sitios de unión tales como T7 o SP6. Otras modalidades se refieren a la utilización de cualquiera de varias alteraciones de las secuencias UTR; estos podrían beneficiar la traducción del ARNm. Algunos ejemplos son: la adición de un elemento de poliadenilación citoplasmática sitio de unión en el 3' UTR, o sustituyendo las UTR-b globina de Xenopus con UTR secuencias de humano, cerdo, vaca, oveja, cabra, pez cebra, genes que incluyen B-globina. UTRs de genes pueden ser seleccionados para la regulación de la expresión en el desarrollo embrionario o en las células. Algunos ejemplos de UTRs que pueden ser útiles incluyen b-actina, DEAH, TPT1, ZF42, SKP1, TKT, TP3, DDX5, eIF3a, DDX39, GAPDH, CDK1, Hsp90abl, Ybxl f Eíf4B Rps27a Stral3, yc, FPAT y Foxol, o CHUK. Tales vectores o mejoras ARNm podrían usarse para dirigir la expresión especial o temporal de TALENs ectópicos para el estudio del agotamiento del gen en las etapas de desarrollo deseado. TALEN ARNm producido por estos vectores son generalmente útiles como se describe en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, para la creación de líneas de células o animales con inactivación o reemplazo para generar modelos de la· enfermedad, la mejora de los animales o para la detección de genes que interactúan con los estímulos ambientales (ejemplo; fármacos, calor, frío, luz UV, factores de crecimiento, estrés).

Las modalidades incluyen un vector que comprende una secuencia que tiene 85% a 100% de identidad con el vector Carlson +63 o TALEN; los téenicos apreciarán inmediatamente que todos los rangos y valores dentro de los intervalos indicados explícitamente se contemplan, por ejemplo, 85%, 90% y 95%. Las modalidades incluyen un Carlson +63 TALEN con un número de sustituciones conservadoras que van desde 1 a 50; los técnicos apreciarán inmediatamente que todos los rangos y valores dentro de los intervalos indicados expresamente se contemplan, por ejemplo, de 5 a 10, del 1 al 20, o alrededor de 12. Los técnicos inmediatamente apreciarán que las porciones RVD de estas secuencias deben ser excluidas de estas comparaciones ya que las secuencias de RVD se van a cambiar de acuerdo con el objetivo previsto por un usuario. Las modalidades un TALEN que comprende al menos una porción de una Carlson +63 TALEN elegido del grupo que consiste de la porción líder N-terminal, porción 5', y +63 de dominio (y%> variaciones/sustituciones de los mismos). El Carlson +63 TALEN tiene una secuencia de 22 residuos N-terminal líder del MASSPPKKKRKVSWKDASGWSR (SEQ ID NO: 132). Las modalidades incluyen un vector TALEN o ARNm que comprende al menos una porción de un vector Carlson +63 TALEN seleccionado de entre el grupo que consta de sitio 3' de cebador de unión, 5'UTR, fragmento de relleno lacZ, 3' TALEN, 3'UTR, Polyc, y ácidos nucleicos que codifican la porción +63 Carlson N-terminal líder, 5' de la porción, o +63 dominio (y variaciones/sustituciones de los mismos). Alternativamente, una secuencia puede ser ensamblado utilizando una o más de las alternativas indicadas anteriormente, por ejemplo, por T7 o SP6 o cualquiera de los diversos UTRs alternativos. Las modalidades incluyen secuencias con entre 85% y 100% de identidad o a la misma, así como un número de sustituciones conservadoras que van de 0 a 50.

El término nucleasa incluye exonucleasas y endonucleasas. El término se refiere a cualquier endonucleasa de tipo natural o variante de la enzima capaz de catalizar la hidrólisis (escisión) de los enlaces entre los ácidos nucleicos dentro de una molécula de ADN o ARN, preferiblemente una molécula de ADN. Los ejemplos no limitantes de endonucleasas de tipo II incluyen endonucleasas de restricción tales como FokI, H al, HindIII, NotI, BbvCl, EcoRl, BglII, y Alwl . Endonucleasas comprenden también raro-corte endonucleasas al tener típicamente un sitio de reconocimiento de polinucleótido de aproximadamente 12 a 45 pares de bases (bp) de longitud, más preferiblemente de 14-45 bp. Endonucleasas De corte raro inducen rupturas de doble hebra de ADN (DSBs) en un lugar definido. Las endonucleasas de corte raro pueden ser por ejemplo un refugio de endonucleasa, una nucleasa de dedos de zinc quimérica (ZFN) resultante de la fusión de dominios de dedos de zinc de ingeniería con el dominio catalítico de una enzima de restricción tal como una endonucleasa de FokI o química. En endonucleasas químicas, una cuchilla química o peptídico conjuga ya sea a un polímero de ácidos nucleicos o a otro ADN que reconoce una secuencia objetivo específica, apuntando de esta manera la actividad de escisión a una secuencia específica. Las endonucleasas químicas también abarcan nucleasas sintéticas como conjugadas de ortofenantrolina, una molécula que corta ADN y oligonucleótidos que forman un triple (OFT), conocidos por unirse a secuencias especificas de ADN. Tales endonucleasas químicas están comprendidas en el término "endonucleasa", de acuerdo con la presente invención. Los ejemplos de tales endonucleasa incluyen I-See I , I-Chu L I-Cre 1, I-Csm I, PI-See L PI-Tti L PI-Mtu I, I-Ceu I, I See IL 1 - See III , HO, PI-Civ I, PI-Ctr L PI-Aae I , PI-Bsu I, P-Dha I, PI-Dra L PI-Mav L PI-Meh I, PI-Mfu L PI-Mfl I, PI-Mga L PI-Mgo I, PI-Mín L PI-Mka L PI-Mle I, PI-Mma I, PI-30 Msh L PI-Msm I, PI-Mth I, PI-Mtu I, PI-PI-Mxe I, PI-Npu I, PI-Pfu L PI-Rma I, PI-Spb I, PI-Ssp L PI-Fae L PI-Mja I, PI-Pho L PI-Tag L PI-Thy I , PI-Tko I, PI-Tsp I, I-Msol .

Muchos ejemplos de trabajo para introducción de TALENs en las células o embriones, y la formación de los animales de los mismos se proporcionan en este documento. Las células para el tratamiento por TALENs incluyen una célula cultivada, una célula inmortalizada, una célula primaria, una célula somática primaria, un cigoto, una célula germinal, una célula germinal primordial, un blastocito, o una célula madre. El Ejemplo 19 (Figura 26) detalla los resultados experimentales para la modificación de las células madre de espermatogenias. Estas células ofrecen otro método para la modificación genética de los animales, por ejemplo, ganado. La modificación o ediciones genéticas pueden ejecutarse in vitro en células madre de espermatogonias (células madre de linea germinal masculina, en este documento abreviado de GSC) aislado de los testículos de los donantes. Las células modificadas se trasplantan en células germinales testículos agotadas de un destinatario. Células madre de espermatogenias implantados producen espermatozoides que llevan a la modificación(s) genética que puede emplearse para la cría a través de la inseminación artificial (AI) o fertilización in vitro (IVF) para derivar animales progenitores. Este método tiene ventajas más allá de la generación de los progenitores modificados genéticamente. Una de tales ventajas es evidente cuando los progenitores para un modelo de .enfermedad en particular no son saludables y no es adecuado para el crecimiento de la edad reproductiva. Las mismas modificaciones introducidas en GSC de este modo podrían ser implantados en los testículos de un individuos sanos que permiten la propagación de la línea de un animal sano para generar modelos de enfermedad en los lechones recién nacidos.

La posibilidad y la eficiencia de la generación de indels mediadas TALEN en las células madre de espermatogonias fue explorado por primera vez por la transfección de plásmidos que codifican TALENs dirigidos al exón 7 de la ubicación Duchene distrofia muscular porcina (DMD). Pruebas de varias condiciones nuclefección, cantidades de plásmido y la temperatura de incubación produjo una eficiencia máxima del 19% NHEJ a pesar de una tasa de transfección de células germinales de 25%, como se muestra en la Fig. 26. La actividad TALEN fue mayor en las repeticiones se cultivó a 30°C. GSCs permaneció viable después de más de 5 dias de cultivo a 30°C, aunque en general, la supervivencia de las células germinales fue superior a 37°C. La transfección de TALEN que codifica ARNm, en comparación con ADN de plásmido, dio como resultado tanto una mayor actividad y viabilidad de las células somáticas y GSCs de ganado. Cabe destacar que, mientras que la actividad pico de ARNm de transfección no excedió de transfección de ADN plásmido en este experimento, se requiere una cantidad significativamente menor de ARNm para alcanzar el mismo nivel de modificación. El Ejemplo 20 detalla HDR estimulado por TALEN exitoso en las células germinales primordiales (aviar).

Animales genéticamente modificados Diversas téenicas conocidas en el campo pueden ser utilizadas para introducir los constructos de ácidos nucleicos en animales no humanos para producir animales progenitores, en el que el constructo de ácido nucleico se integra en el genoma. Tales técnicas incluyen, sin limitación, microinyección pronuclear (Patente de E.U.A. No. 4,873,191), transferencia génica mediada por retrovirus en lineas germinales (Van der Putten et al. (1985) Proc. Nati.

Acad. Sci. USA 82, 6148-1652), orientación de genes en células madre embrionarias (Thompson et al. (1989) Cell 56, 313-321), electroporación de embriones (Lo (1983) Mol. Cell. Biol. 3, 1803-1814), transferencia de genes mediada por esperma (Lavitrano et al. (2002) Proc. Nati Acad. Sci. USA 99, 14230-14235; Lavitrano et al. (2006) Reprod. Pert. Develop. 18, 19-23), y en la transformación in vitro de las células somáticas, tales como células del cumulus o células mamarias, o adultas, fetales, o madre embrionarias, seguida de trasplante nuclear (Wilmut et al. (1997) Nature 385, 810-813; y Wakayama et al. (1998) Nature 394, 369- 374). Microinyección pronuclear, transferencia génica mediada por esperma, y la transferencia nuclear de células somáticas son téenicas particularmente útiles, asi como la inyección citoplásmica, primordial el trasplante de células germinales (Brinster), y la producción guimera blastocisto mediante el cual una célula germinal se propaga en un embrión.

Típicamente, en la microinyección pronuclear, una construcción de ácido nucleico se introduce en un óvulo fertilizado; 1 o 2 células fertilizadas se utilizan como los pronúcleos que contienen el material genético de la cabeza del espermatozoide y el óvulo son visibles en el protoplasma. Huevos fertilizados en etapa pronuclear pueden obtenerse in vitro o in vivo (es decir, recuperado quirúrgicamente del oviducto de los animales donantes). Huevos fertilizados In vitro pueden producirse como sigue. Por ejemplo, los ovarios de cerdos se pueden recoger en un matadero, y se mantuvieron a 22-28°C durante el transporte. Los ovarios se pueden lavar y se aislaron para la aspiración folicular, y los folículos que van desde 4-8 mm pueden ser aspiradas en tubos de centrifugado cónico de 50 mi utilizando agujas de calibre 18 y bajo vacío. Líquido folicular y ovocitos aspirados pueden enjuagar a través de pre-filtros comerciales TL-HEPES (Minitube, Verona, WI). Los ovocitos rodeados por una masa cu ulus compacto pueden ser seleccionados y colocados en TCM-199 maduración de ovocitos MEDIO (Minitube, Verona, WI) suplementado con 0.1 mg/nL cisteína, 10 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico, 10% de fluido folicular porcino, 50 mM 2-mercaptoetanol, 0.5 mg/ml de AMPc, 10 Ul/ml de cada uno de gonadotropina de suero de yegua embarazada (PMSG) y gonadotropina coriónica humana (hCG) durante aproximadamente 22 horas en el aire humidificado a 38.7°C y 5% de CO2. Posteriormente, los ovocitos se pueden mover a un medio de maduración TCM-199 fresco, que no contendrá cAMP, PMSG o hCG y se incubaron durante 22 horas adicionales. Ovocitos madurados pueden ser despojados de sus células del cumulus por agitación en 0.1% de hialuronidasa durante 1 minuto.

Para los cerdos, los ovocitos maduros pueden ser fertilizados en un 500m1 Minitube PORCPRO IVF MEDIUM SYSTEM (Minitube, Verona, WI) en Minitube 5-pozos platos de fertilización. En preparación para la fertilización in vitro (FIV), semen porcino recién recogido o congelados pueden ser lavadas y resuspendidas en medio PORCPRO FIV a 4X105 esperma. Las concentraciones de esperma pueden ser analizados por un sistema de análisis de semen asistido por computadora (SpermVision, Minitube, Verona, WI). La inseminación final in vitro se puede realizar en un volumen 10m1 a una concentración final de aproximadamente 40 espermatozoides móviles/ovocito, dependiendo del cerdo. Incubar todos los ovocitos fertilizados a 38.7°C en 5.01 CO2 en ambiente durante 6 horas. Seis horas después de la inseminación, presuntos cigotos se pueden lavar dos veces en NCSU-23 y se trasladaron a 0.5 mi del mismo medio. Este sistema puede producir un 20-30% blastocitos forma rutinaria en la mayoría de los cerdos con un 10 a 30%) Tasa de inseminación poliespérmica.

Los constructos de ácido nucleico linealizados se pueden inyectar en uno de los pronúcleos, o, por ejemplo, pueden utilizarse transposones o inyección citoplasmática. A continuación, los óvulos inyectados se pueden transferir a una hembra receptora (por ejemplo, en los oviductos de una hembra receptora) y dejar desarrollarse en la hembra receptora para producir los animales transgénicos. En particular, en los embriones fecundados in vitro se puede centrifugar a 15,000 X g durante 5 minutos para sedimentar los lipidos que permite la visualización del pronúcleo. Los embriones pueden ser inyectados con el uso de un inyector Eppendorf FemtoJet y puede ser cultivado hasta la formación del blastocisto. Las tasas de escisión de embriones y la formación de blastocisto y la calidad se pueden grabar.

Los embriones se pueden transferir quirúrgicamente en úteros de receptores asincronos. Típicamente, 100-200 (por ejemplo, 150 a 200), los embriones pueden ser depositados en la unión ampolla-istmo del oviducto utilizando un catéter TOMCAT® de 14cm. Después de la cirugía, puede realizarse un examen de ultrasonido en tiempo real de preñez.

En la transferencia nuclear de células somáticas, una célula artiodactil transgénica (por ejemplo, una célula de cerdo transgénico o célula bovina) tal como un blastómero embrionario, fibroblastos fetales, adultos oído fibroblastos, o células granulosa que incluye una construcción de ácido nucleico descrita anteriormente, se puede introducir en un ovocito enucleado para establecer una celda combinada. Los ovocitos se pueden enucleados por disección parcial de la zona cerca del cuerpo polar y presionando a cabo citoplasma en el área de disección. Normalmente, una pipeta de inyección con una punta afilada biselada se utiliza para inyectar la célula transgénica en un ovocito enucleado detenido en la meiosis 2. En algunos convenios, los ovocitos detenidos en la meiosis 2 se denominan "huevos". Después de producir un embrión porcino o bovino (por ejemplo, mediante la fusión y la activación del ovocito), el embrión se transfiere a los oviductos de una hembra receptora, alrededor de 20 a 24 horas después de la activación. Véase, por ejemplo. Cibelli et al. (1998), Science 280,1256-1258 y en la Patente de E.U.A. No. 6,548,741. Para los cerdos, las hembras receptoras se puede verificar si el preñez de aproximadamente 20 a 21 dias después de la transferencia de los embriones.

Téenicas de reproducción estándar se puede utilizar para crear animales que son homocigóticos para el ácido nucleico objetivo de los animales progenitores iniciales heterocigotos. La condición de homocigoto puede no ser necesaria, sin embargo. Cerdos transgénicos descritos en este documento pueden ser criados con otros cerdos de interés.

En algunas modalidades, un ácido nucleico de interés y un marcador seleccionable se pueden proporcionar en transposones separados y proporcionarse a los embriones o células en cantidad desigual, donde la cantidad de transposones que contiene el marcador seleccionable supera con creces (5-10 veces en exceso) el transposón que contiene el ácido nucleico de interés. Células transgénicas o animales que expresan el ácido nucleico de interés se puede aislar basándose en la presencia y expresión del marcador seleccionable. Debido a que los transposones se integrarán en el genoma de una manera precisa y no enlazados (eventos de transposición independientes), el ácido nucleico de interés y el marcador seleccionable no están ligados genéticamente y pueden ser fácilmente separados por segregación genética a través de cria estándar. Por lo tanto, los animales transgénicos pueden producir que no se restringe a retener marcadores seleccionables en las generaciones posteriores, un tema de preocupación desde la perspectiva de la seguridad pública.

Una vez el animal transgénico se han generado, la expresión de un ácido nucleico objetivo se puede evaluar utilizando téenicas estándar. La selección inicial se puede lograr mediante análisis de transferencia Southern para determinar si o no integración del constructo ha tenido lugar. Para una descripción de análisis Southern, consulte las secciones 9.37-9.52 de Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edición, Coid Spring Harbor Press, Plainview; NY. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) también se puede utilizar en el cribado inicial. PCR se refiere a un procedimiento o técnica en la que se dirigen a ácidos nucleicos se amplifican. Generalmente, la información de secuencia de los extremos de la región de interés o más allá se emplea para diseñar cebadores de oligonucleótidos que son idénticos o similares en secuencia a las cadenas opuestas del molde a amplificar. PCR puede usarse para amplificar secuencias especificas de ADN asi como ARN, incluyendo secuencias de ADN genómico total o ARN celular total. Los cebadores son típicamente 14 a 40 nucleótidos de longitud, pero pueden variar de 10 nucleótidos a cientos de nucleótidos de longitud. PCR se describe en, por ejemplo, PCR Primer: A Laboratory Manual, ed. Dieffenbach and Dveksler, Coid Spring Harbor Laboratory Press, 1995. Los ácidos nucleicos también se pueden amplificar por reacción en cadena de la ligasa, amplificación por desplazamiento de cadena, replicación de secuencia auto-sostenida, o secuencia de ácido nucleico basados en amplificado. Ver, por ejemplo, Lewis (1992) Genetic Engineering News 12: 1 ; Guatelli et al (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 1874; y Weiss (1991) Science 254: 1292. En la etapa de blastocisto, los embriones se pueden procesar de forma individual para el análisis mediante, por ejemplo, PCR, hibridación de Southern y splinkerette PCR (véase, por ejemplo, Dupuy et al. Proc Nati Acad Sci USA (2002) 99:4495).

La expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido en los tejidos de cerdos transgénicos se puede evaluar usando téenicas que incluyen, por ejemplo, análisis de transferencia Northern de muestras de tejido obtenidas del animal, análisis de hibridación in situ, análisis Western, inmunoensayos tales como enzima enzimoinmunoensayos y PCR transcriptasa inversa (RT-PCR). Vectores y ácidos nucleicos Una variedad de ácidos nucleicos se puede introducir en el artiodáctilo u otras células, para fines de alogénicos, o para obtener la expresión de un gen para otros fines. Los constructos de ácido nucleico que se pueden utilizar para producir animales transgénicos incluyen una secuencia de ácido nucleico objetivo. Como se usa en este documento, el término ácido nucleico incluye ADN, ARN y análogos de ácidos nucleicos, y los ácidos nucleicos que son de doble cadena o de cadena sencilla (es decir, un sentido o una sola hebra antisentido). Análogos de ácidos nucleicos pueden modificarse en el resto base, resto de azúcar, o esqueleto de fosfato para mejorar, por ejemplo, la estabilidad, hibridación, o solubilidad del ácido nucleico. Las modificaciones en el resto de base incluyen desoxiuridina por desoxitimidina, y 5-metil-2' desoxicitidina y 5-bromo-2'-desoxicitidina para doxycytidine. Las modificaciones del resto de azúcar incluyen la modificación de la hidroxilo 2' del azúcar ribosa para formar de 2'-0-metilo o 2'-0-alil azúcares. El esqueleto de fosfato de ·desoxirribosa se puede modificar para producir morfolino ácidos nucleicos, en el que cada resto de base está ligado a un seis miembros, anillo morfolino, o ácidos nucleicos peptidicos, en el que la columna vertebral deoxyphosphate se sustituye por un esqueleto pseudopeptidico y se conservan las cuatro bases. Véase, Summerton and Weller (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev.7(3): 187; and Hyrup et al. (1996) B100rgan. Med, Chem.4:5. Además, la columna vertebral deoxyphosfato puede ser reemplazada con, por ejemplo, un fosforotioato o fosforoditioato columna vertebral, una fosforamidita, o una cadena principal de alquil fosfotriéster.

La secuencia de ácido nucleico objetivo puede unirse operativamente a una región reguladora tal como un promotor. Las regiones reguladoras pueden ser regiones reguladoras de porcino o pueden ser de otras especies. Como se usa en este documento, operativamente unido se refiere a la colocación de una región reguladora en relación con una secuencia de ácido nucleico de una manera tal como para permitir o facilitar la transcripción del ácido nucleico objetivo.

Cualquier tipo de promotor puede estar unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico objetivo. Ejemplos de promotores incluyen, sin limitación, promotores específicos de tejido, promotores constitutivos, y promotores que responden o que no responden a un estímulo particular. Promotores específicos de tejidos adecuados pueden resultar en la expresión preferencial de un transcrito de ácido nucleico en las células beta e incluyen, por ejemplo, el promotor de la insulina humana. Otros promotores específicos de tejido pueden resultar en la expresión preferente en, por ejemplo, hepatocitos o tejido del corazón y pueden incluir los promotores de cadena pesada de albúmina o alfa-miosina, respectivamente. En otras modalidades, un promotor que facilita la expresión de una molécula de ácido nucleico sin tejido- significativo o temporal especificidad se puede utilizar (es decir, un promotor constitutivo). Por ejemplo, un promotor de beta-actina como el gen promotor beta-actina de pollo, promotor de ubiquitina, promotor miniCAGs, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), el promotor o 3-fosfoglicerato quinasa (PGK), el promotor se pueden utilizar, así como promotores virales tales como el herpes simple timidina quinasa del virus (HSV-TK), el promotor de SV40 o un promotor de citomegalovirus (CMVj . En algunas modalidades, una fusión del promotor del gen de actina beta de pollo y el promotor de CMV se utiliza como un promotor. Véase, por ejemplo, Xu et al. (2001) Hum. Gene Ther.12:563; y Kiwaki et al. (1996) Hum. Gene Ther.7:821.

Un ejemplo de un promotor inducible es el sistema promotor (tet)-on tetracielina, que se puede utilizar para regular la transcripción del ácido nucleico. En este sistema, un represor de Tet mutado (TetR) se fusiona con el dominio de activación de virus de herpes simple VP 16 proteina traris-activador para crear un activador transcripcional controlado por tetraciclina (tTA), que está regulado por tet o doxiciclina (dox). En ausencia de antibiótico, la transcripción es mínima, mientras que en la presencia de tet o dox, la transcripción se induce. Sistemas inducibles alternativos incluyen los sistemas de ecdisona o rapamicina. Ecdisona es una hormona de la muda de insectos cuya producción está controlada por un heterodímero del receptor de ecdisona y el producto del gen ultraspiracle (USP). Expresión es inducida por el tratamiento con ecdisona o un análogo de ecdisona tales como muristerona A. El agente que se administra al .animal para activar el sistema inducible se refiere como un agente de inducción.

Regiones reguladoras adicionales que pueden ser útiles en los constructos de ácidos nucleicos, incluyen, pero no se limitan a, secuencias de poliadenilación, secuencias de control de la traducción (por ejemplo, un segmento de entrada de ribosoma interno, IRES), potenciadores , elementos inducibles, o intrones. Tales regiones reguladoras pueden no ser necesarias, aunque pueden aumentar la expresión por transcripción que afecta, la estabilidad del ARNm, eficiencia de traducción, o similares. Tales regiones reguladoras pueden ser incluidas en un constructo de ácido nucleico como se desee para obtener la expresión óptima de los ácidos nucleicos en la célula(s). Expresión suficiente, sin embargo, a veces puede ser obtenido sin tales elementos adicionales.

Un constructo de ácido nucleico puede ser utilizado para codificar péptidos señal o marcadores seleccionadles. Los péptidos señal pueden ser utilizados de manera que un polipéptido codificado se dirige a una localización celular particular (por ejemplo, la superficie de la célula). Los ejemplos no limitantes de marcadores seleccionadles incluyen puromicina, ganciclovir, adenosina desaminasa (ADA), aminoglicósido fosfotransferasa (neo, G418, APH), la dihidrofolato reductasa (DHFR), higromicina-B-phosphtransferase, timidina quinasa (TK), y xantina-guanina fosforribosiltransferasa (XGPRT). Tales marcadores son útiles para la selección de transformantes estables en cultivo. Otros marcadores seleccionables incluyen polipéptidos fluorescentes, tales como la proteina fluorescente verde o proteina fluorescente amarilla.

En algunas modalidades, una secuencia que codifica un marcador seleccionable puede ser flanqueado por secuencias de reconocimiento para una recombinasa tal como, por ejemplo, Cre o Flp. Por ejemplo, el marcador seleccionable puede estar flanqueado por sitios loxP de reconocimiento (sitios de reconocimiento de 34 pb reconocidas por la recombinasa Cre) o sitios de reconocimiento de FRT tales que el marcador seleccionable se puede escindir a partir del constructo. Véase, Orban, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (1992) 89:6861, para una revisión de la teenología Cre/lox, y Brand and Dymecki, Dev. Ce11 (2004) 6:7. Un transposón que contiene un transgén Cre o Flp-activable interrumpido por un gen marcador seleccionable también se puede utilizar para obtener animales transgénicos con la expresión condicional de un transgén. Por ejemplo, una- expresión promotor de conducción del marcador/transgén puede ser ubióua o especifica de tejido, lo que darla lugar a la expresión ubicua o especifica de tejido del marcador en animales F0 (por ejemplo, cerdos). La activación especifica de tejido del transgén se puede lograr, por ejemplo, por el cruce de un cerdo que expresa de forma ubicua un transgén interrumpido por marcadores a un cerdo que expresa Cre o Flp en una manera especifica de tejido, o cruzando un cerdo que expresa un marcador interrumpido transgén en un tejido de manera especifica a un cerdo que expresa de forma ubicua Cre o Flp recombinasa. Expresión controlada del transgén o escisión controlada del marcador permite la expresión del transgén.

En algunas modalidades, el ácido nucleico objetivo codifica un polipéptido. Una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido puede incluir una secuencia de etiqueta que codifica una "etiqueta" diseñado para facilitar la posterior manipulación del polipéptido codificado (por ejemplo, para facilitar la localización o detección). Secuencias de etiqueta se pueden insertar en la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de tal manera que la etiqueta codificada se encuentra ya sea en el carboxilo o amino terminal del polipéptido. Los ejemplos no limitantes de etiquetas codificadas incluyen glutatión S-transferasa (GST) y la etiqueta FLAG™ (Kodak, New Haven, CT).

En otras modalidades, la secuencia de ácido nucleico objetivo induce la interferencia de ARN contra un ácido nucleico objetivo de tal manera que la expresión del ácido nucleico objetivo se reduce. Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico objetivo puede inducir la interferencia de ARN en contra de un ácido nucleico que codifica una conductancia transmembrana de la fibrosis quistica regulador (CFTR) polipéptido. Por ejemplo, el ARN de doble cadena interferente pequeño (ARNsi) o ARN de horquilla corta (ARNsh) homólogo a un ADN CFTR se pueden utilizar para reducir la expresión de ese ADN. Constructos para ARNsi pueden ser producidos como se describe, por ejemplo, en Fire et al. (1998) Nature 391 :806; Romano and Masino (1992) Mol. Microbiol.6:3343; Cogoni et al. (1996) EMBO J 15:3153; Cogoni and Masino (1999) Nature 399: 166; Misquitta and Paterson (1999) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96: 1451; y Kennerdell and Carthew (1998) Cell 95: 1017. Los constructos para shRNA puede ser producido como se describe por Mclntyre and Fanning (2006) BMC Biotechnology 6: 1. En general, los ARNsh se transcriben como una molécula de ARN de una sola hebra que contiene regiones complementarias, que puede hibridarse y formar horquillas cortas.

Los constructos de ácido nucleico puede ser metilado usando un metilasa SSSL CpG (New England Biolabs, Ipswich, MA). En general, el constructo de ácido nucleico puede ser incubado con S-adenosilmetionina y SSSL CpG-metilasa en amortiguador a 37°C. La hipermetilación puede ser confirmado mediante la incubación del constructo con una unidad de HwPlI endonucleasa durante 1 hora a 37°C y ensayando por electroforesis en gel de agarosa.

Los constructos de ácido nucleico pueden introducirse en embrionarias, o células fetales artiodáctilos adulto de cualquier tipo, incluyendo, por ejemplo, las células germinales, tales como un ovocito o un huevo, una célula progenitora, un adulto o de células madre embrionarias, una célula germinal primordial, una célula de riñón tal como una célula PK-15, una célula isleta, una célula beta, una célula del hígado, o un fibroblasto tal como un fibroblastos dérmicos, usando una variedad de téenicas. Los ejemplos no limitantes de las técnicas incluyen el uso de sistemas de transpcsón, virus recombinantes que pueden infectar células, o liposomas u otros métodos no virales tales como electroporación, microinyección, o precipitación de fosfato de calcio, que son capaces de administrar ácidos nucleicos a las células.

En los sistemas de transposón, la unidad de transcripción de un constructo de ácido nucleico, es decir, la región reguladora unida operativamente a una secuencia de ácido nucleico objetivo, está flanqueada por una repetición invertida de un transposón. Varios sistemas de transposón, incluyendo, por ejemplo, Sleeping Beauty (véase, Patente E.U.A. No. 6,613,752 y Publicación E.U.A. No.2005/0003542); Tol2 (Kawakami (2007) Genome Biology 8(Suppl. 1):S7; Minos (Pavlopoulos et al. (2007) Genome Biology 8(Suppl. 1):S2); Hsmarl (Miskey et al. (2007)) Mol Cell Biol. 27:4589); y Pasaporte han sido desarrollados para introducir ácidos nucleicos en células, incluyendo ratones, humanos y células de cerdo. Los transposones Sleeping Beauty y Passport son particularmente útiles. Una -transposasa se puede entregar como una proteína, codificada en la misma construcción de ácido nucleico del ácido nucleico objetivo, se puede introducir en una construcción de ácido nucleico separada, o proporcionados como un ARNm (por ejemplo, transcripciones y corona in vitro ARNm).

Elementos aisladores también--pueden incluirse en una construcción de ácido nucleico para mantener la expresión del ácido nucleico objetivo y para inhibir la transcripción no deseada de genes del huésped. Véase, por ejemplo, publicación E.U.A. N° 2004/0203158. Típicamente, un elemento aislante flanquea cada lado de la unidad transcripcional y es interna a la repetición invertida del transposón. Los ejemplos no limitantes de elementos aislantes incluyen la región de unión de matriz (MAR) escriba elementos aislantes y elementos aislantes de tipo frontera. Véase, por ejemplo, Patentes de E.U.A. Nos. 6,395,549, 5,731,178, 6,100,448 y 5,610,053, y publicación E.U.A. N° 2004/0203158.

Los ácidos nucleicos pueden incorporarse en vectores. Un vector es un término amplio que incluye cualquier segmento específico de ADN que está diseñado para pasar de un portador en un ADN objetivo. Un vector puede ser referido como un vector de expresión, o un sistema de vector, que es un conjunto de componentes necesarios para llevar a cabo la inserción de ADN en un genoma u otra secuencia de ADN específica tal como un episoma, plásmído, o incluso virus/fago segmento de ADN. Sistemas de vectores tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus, virus adeno-asociado y la integración de los virus de fago), y vectores no virales (por ejemplo, transposones) utilizados para el suministro de genes en animales tienen dos componentes básicos: 1) un vector compuesto de ADN (o ARN que se transcribe de forma inversa en un ADNc) y 2) una transposasa, recombinasa, u otra enzima integrasa que reconoce tanto el vector y una secuencia objetivo de ADN y se inserta el vector en la secuencia de ADN objetivo. Los vectores más a menudo contienen uno o más casetes de expresión que comprenden una o más secuencias de control de expresión, en el que una secuencia de control de expresión es una secuencia de ADN que controla y regula la transcripción y/o traducción de otra secuencia de ADN o ARNm, respectivamente.

Se conocen muchos tipos diferentes de vectores. Por ejemplo, plásmidos y vectores virales, por ejemplo, vectores retrovirales, son conocidos. Plásmidos de expresión de mamíferos tienen típicamente un origen de replicación, un promotor adecuado y un potenciador opcional, y los sitios de unión también cualquier ribosoma necesario, un sitio de poliadenilación, donante de empalme y sitios aceptores, secuencias de terminación de la transcripción, y 5' secuencias flanqueantes no transcritas. Los ejemplos de vectores incluyen: plásmidos (que también puede ser un portador de otro tipo de vector), adenovirus, virus adeno-asociado (AAVj, lentivirus (por ejemplo, el V1H-1, SIV o FIV), retrovirus (por ejemplo, ASV, ALV o MoMLV), y transposones (por ejemplo, Sleeping Beauty , elementos P, Tol-2, Frog Prince, piggyBac) .

Como se usa en este documento, el término ácido nucleico se refiere tanto a ARN y ADN, incluyendo, por ejemplo, ADNc, ADN genómico, ADN sintético (por ejemplo, sintetizado químicamente), así como de origen natural y ácidos nucleicos químicamente modificados, por ejemplo, bases sintéticas o columnas alternativas. Una molécula de ácido nucleico puede ser de doble cadena o de cadena sencilla (es decir, un sentido o una sola hebra antisentido). El término transgénico se utiliza ampliamente en el presente documento y se refiere a un organismo modificado genéticamente o mediante ingeniería genética organismo cuyo material genético ha sido modificado mediante téenicas de ingeniería genética. A artiodáctilo alogénico es por lo tanto transgénico independientemente de si o no genes exógenos o ácidos nucleicos se expresan en el animal o su progenie.

Las secuencias de ácidos nucleicos establecidas en el presente documento están destinadas a representar las dos secuencias de ADN y ARN, de acuerdo con la práctica convencional de permitir que la abreviatura "T" significa "T" o "U", según el caso puede ser, por ADN o ARN. Los polinucleótidos son moléculas de ácido nucleico de al menos tres subunidades de nucleótidos. Análogos de polinucleótidos o ácidos polinucleicos se hayan modificado químicamente polinucleótidos o ácidos polinucleicos. En algunas modalidades, los análogos de polinucleótidos se pueden generar mediante la sustitución de porciones de la cadena principal de azúcar-fosfato de un polinucleótido con grupos funcionales alternativos. Los polinucleótidos modificados por morfolino, denominado aquí como "morfolinos, " son análogos de polinucleótidos en los que las bases están unidas por una cadena principal de morfolino-fosforodiamidato (véase, por ejemplo, las Patentes E.U.A Nos. 5,142,047 y 5,185,444). Además de morfolinos, otros ejemplos de análogos de polinucleótidos incluyen análogos en los que las bases están unidas por una cadena principal de polivinilo, ácidos nucleicos peptídicos (PNA) en el que las bases están unidas por enlaces amida formados por pseudopeptídicos grupos 2-aminoetil-glicina, análogos en que las subunidades de los nucleósidos están unidos por grupos metilfosfonato, análogos en los que los residuos de fosfato enlazan subunidades de nucleósidos se sustituyen por grupos fosforoamidato, y ADN fosforotioado, análogos que contienen restos de azúcar que tienen 2' del grupo O-metilo). Los polinucleótidos de la invención pueden producirse a través de la téenica bien conocida y se utiliza de forma rutinaria de la síntesis en fase sólida. Alternativamente, otros métodos adecuados para dicha síntesis se pueden utilizar (por ejemplo, la clonación molecular común y las técnicas de síntesis de ácidos nucleicos químicos). Técnicas similares también pueden ser utilizados para preparar los análogos de polinucleótidos tales como morfolinos o derivados de fosforotioato. Además, los polinucleótidos y análogos de polinucleótidos se pueden obtener comercialmente. Para los oligonucleótidos, los ejemplos de composiciones farmacéuticamente aceptables son sales que incluyen, por ejemplo, (a) sales formadas con cationes tales como sodio, potasio, amonio, etc.; (b) sales de adición de ácido formadas con ácidos inorgánicos, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico (c) sales formadas con ácidos orgánicos, por ejemplo, por ejemplo, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico; y (d) sales formadas a partir de aniones elementales, por ejemplo, cloro, bromo y yodo.

Polipéptidos Hay una variedad de cambios conservadores que se pueden hacer en general a una secuencia de aminoácidos sin alterar la actividad. Estos cambios se denominan sustituciones o mutaciones conservadoras; es decir, un aminoácido que pertenece a un grupo de aminoácidos que tienen un tamaño o característica particular puede ser sustituido por otro aminoácido. Los sustitutos para una secuencia de aminoácidos se pueden seleccionar de otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido. Por ejemplo, los no polares (hidrófobos) aminoácidos incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y tirosina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los ácidos cargados negativamente (ácidos) amino incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. No se espera que estas alteraciones afecten sustancialmente el peso molecular aparente determinado por electroforesis en gel de poliacrilamida o punto isoeléctrico. Sustituciones conservativas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, Lys para Arg y viceversa para mantener una carga positiva; Pegamento para Asp y viceversa para mantener una carga negativa; Ser por Thr de manera que se mantiene un -OH libre; y Gin para Asn mantener un NH2 libre. Por otra parte, las mutaciones puntuales, eliminaciones e inserciones de las secuencias de polipéptidos o secuencias de ácidos nucleicos correspondientes pueden en algunos casos ser hechas sin una pérdida de la función del polipéptido o fragmento de ácido nucleico. Las sustituciones pueden incluir, por ejemplo, 1, 2, 3, o más residuos. Los residuos de aminoácidos descritos en este documento emplean ya sea el designador de aminoácido de letra sencilla o la abreviatura de tres letras. Las abreviaturas utilizadas en este documento están de acuerdo con la nomenclatura de polipéptido estándar, J. Biol. Chem., (1969), 243, 3552-3559. Todas las secuencias de residuos de aminoácidos se representan en el presente documento por fórmulas con orientación izquierda y derecha en la dirección convencional del extremo amino al extremo carboxi-terminal.

En algunos casos puede ser necesaria una determinación del porcentaje de identidad de un péptido a una secuencia expuesta en este documento. En tales casos, el porcentaje de identidad se mide en términos del número de residuos del péptido, o una porción del péptido. Un polipéptido de, por ejemplo, 90% de identidad, también puede ser una parte de un péptido más grande. Las modalidades incluyen dichos polipéptidos que tienen la identidad indicada y/o sustitución conservadora de secuencia expuesta en este documento.

El término purificado como se usa en el presente documento con referencia a un polipéptido se refiere a un polipéptido que, o bien no ocurren naturalmente una contraparte (por ejemplo, un peptidomimético), o se ha sintetizado químicamente y es por tanto sustancialmente no contaminada por otros polipéptidos, o se ha separado o purificado a partir de la mayoría de los otros componentes celulares mediante el cual se acompaña de forma natural (por ejemplo, otras proteínas, polinucleótidos, o componentes celulares celulares). Un ejemplo de un polipéptido purificado es uno que es al menos 70%, en peso seco, libre de las proteínas y moléculas orgánicas de origen natural con la que se asocia naturalmente. Una preparación de un polipéptido purificado, por tanto, puede ser, por ejemplo, al menos 80%, al menos 90%, o al menos 99%, en peso seco, el polipéptido. Los polipéptidos también pueden ser diseñados para contener una secuencia de etiqueta (por ejemplo, una etiqueta de polihistidina, una etiqueta myc o una etiqueta FLAG®) que facilita el polipéptido a purificar o marcados (por ejemplo, capturado en una matriz de afinidad, se visualizaron bajo un microscopio). Por lo tanto una composición purificada que comprende un polipéptido se refiere a un polipéptido purificado a menos que se indiqué lo contrario.

Los polipéptidos pueden incluir una modificación química; un término que, en este contexto, se refiere a un cambio en la estructura química de origen natural de los aminoácidos. Tales modificaciones pueden ser hechas a una cadena lateral o un terminal, por ejemplo, cambiando el amino-terminal o carboxilo terminal. En algunas modalidades, las modificaciones son útiles para la creación de grupos químicos que se pueden usar convenientemente para enlazar los polipéptidos a otros materiales, o para unir un agente terapéutico.

Herramientas de Investigación e Investigación Los procedimientos de modificación de células y embriones en el presente documento son aplicables a una amplia variedad de herramientas de investigación. Las células o embriones en sí también son útiles para la investigación. Por ejemplo, los programas de mejoramiento tradicional a menudo son muy dependientes de tener una comprensión de los componentes genéticos de los animales que se crían. Los animales con rasgos deseables son criados para fomentar las razas. Estos rasgos son muy dependientes de los animales, genes y combinaciones de genes. La colocación de los genes en las células o .embriones, o la modificación de sus genes proporciona información valiosa sobre cómo los genes interactúan para producir rasgos que son de interés. Las células o embriones pueden cultivarse durante un tiempo adecuado y luego probados. Los embriones pueden ser destruidos antes de lograr cualquier etapa de desarrollo significativo, mientras que, sin embargo, proporciona ideas útiles.

En consecuencia, varias modalidades de la invención se expresan como sigue. 1. Un método de fabricación de una célula animal no humano modificado genéticamente o el embrión, que comprende exponer las células o los embriones del animal in vitro a un ARNm que codifica un TALEN, con el TALEN específicamente enlazado a un sitio cromosomal objetivo en los embriones o células, con las células o embriones siendo modificados genéticamente sólo en el sitio cromosomal objetivo y con el método que se realiza sin un gen reportero.2. El método de 1 que comprende las células, y que comprende además el cultivo de las células y el aislamiento de colonias de las células.3. El método de 1 o 2 con el método que se realiza sin aditivos que crean una positiva o una presión de selección negativa para seleccionar células modificadas genéticamente. 4. El método de cualquiera de 1-3, que comprende además la exposición de los embriones o células del animal in vitro a una sola cadena de ADN que contiene una secuencia exógena.4. El método de cualquiera de 1 o 3-4 que comprende las células, y que comprende además el cultivo de las células y el aislamiento de colonias de las células, en el que una célula de prueba se toma de una colonia aislada y prueba de la célula de prueba para determinar cómo era la célula modificado.5. El método de la 4 en el que la prueba es un proceso destructivo que destruye la célula de prueba. 6. El método de 1 donde la célula es una célula primaria.7. El método de la 6 en el que la célula primaria es una célula seleccionado de entre el grupo que consiste de cerdos, vacas, ovejas, cabras, pollos, conejos, peces, pez cebra, perro, ratón, gato, ratón, rata, y animales de laboratorio.8. El método de cualquiera de 1-7 que comprende exponer una célula primaria no humano en un cultivo in vitro o de un embrión no humano a un ácido nucleico que codifica un TALEN, donde el ácido nucleico codifica una porción líder N-terminal que tiene por lo menos 80% de homología con SEQ ID NO:132.9. El método de cualquiera de 1-8 que comprende exponer las células al TALEN sin un gen reportero, con más de 1% de las células que incorporan la modificación en el sitio cromosomal objetivo.10. El método de cualquiera de 1-9 exponer las células al TALEN sin un gen reportero, la creación de colonias de células clónales, y prueba de un subconjunto de los miembros de las colonias para identificar colonias que incorporan la modificación en el sitio cromosomal objetivo.11. El método de cualquiera de 1-10 en el que la modificación genética se selecciona de entre el grupo constituido por una inserción, supresión, inversión o transubicación. 12. El método de cualquiera de 1- 1 1 en el que el TALEN es una primera TALEN y el sitio cromosomal objetivo es un primer sitio, con el método que comprende además un segundo TALEN dirigido a un segundo sitio cromosomal objetivo. 13. El método de cualquiera de 1-12, que comprende además la exposición de los embriones o células de ADN de hebra sencilla (ADNss) que contiene una secuencia exógena, con la modificación genética que comprende la secuencia exógena. 14. El método de cualquiera de 1-13 en el que la secuencia exógena comprende un alelo alternativo para el sitio cromosómico dirigido por TALEN.15. El método de 14 en el que el alelo alternativo comprende un alelo de miostatina presente en las reses azul belga. 16. El método de cualquiera de 1-15 en el que el alelo se selecciona de entre el grupo constituido por una inserción, una eliminación, un polimorfismo, y polimorfismo de un solo nucleótido. 17. El método de cualquiera de 1-16 en el que el sitio cromosomal objetivo se elige para que una interrupción de un gen, en el que la interrupción del gen comprende una inserción, supresión o sustitución de uno o más bases en una secuencia que codifica el gen y/o un elemento cis-regulador de los mismos. 18. El método de cualquiera de 1-17, que comprende además el suministro de una recombinasa para la célula o embrión.19. El método de cualquiera de 1-18 en el que el ARNm TALEN se introduce directamente en la célula como ARNm.20. El método de cualquiera de 1-19 en el que el TALEN ARNm se introduce en la célula como un plásmido que codifica el ARNm.21. El método de 20 en el que el ADNss se introduce en la célula después de un vector que codifica una TALEN se introduce en la célula. 22. El método de 20 o 21 en el que ADNss se introduce en la celda de entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 3 dias después de que el vector que expresa un TALEN se introduce en la célula.23. El método de cualquiera de 20, 21, o 22 en el que TALEN ARNm se introduce directamente en la célula o menos al mismo tiempo que el ADNss.24. El método de cualquiera de 1-23 con las células de ser células somáticas primarias o células madre.25. Un método de creación de una modificación genética que comprende: exponer una célula primaria no humano en un cultivo in vitro o de un embrión no humano a un ácido nucleico que codifica un TALEN, donde el ácido nucleico codifica una porción líder N-terminal que tiene por lo menos 80% de homología con SEQ ID NO:132.26. El método de 25 en el que la porción líder N-terminal tiene la homología de 80% a la porción de secuencia de 22 residuos de la SEQ ID NO:132 y un total de no más de aproximadamente 30 residuos. 27. El método de 25 o 26 con el ácido nucleico que tiene al menos 90% de homología con SEQ ID NO:132.28. Una célula hecha por, o utilizado en, un método de cualquier proceso establecido dentro de la aplicación.

EJEMPLOS Ejemplo 1 ganado genéticamente modificado artiodáctilo (bovino) producido por la inyección directa de TALENs.

Tres pares TALEN fueron diseñados y ensamblados según se describe en el Cermak. al. (2011) Nuc. Acids Res . 39:e82 (Fig. 3) y ARNm se inyecta en el citoplasma de embriones bovinos en alrededor de 19 horas después de la fertilización. Embriones inyectados se cultivaron in vitro y se recogieron en la etapa de blastocistos (Figs.3A, 3B y 3C). Blastocisto ADN genómico individual fue amplificado por la amplificación del genoma (WGA) (Carlson et al. (2011) transgénicos Res. 20:29) y se tamiza para indels utilizando el ensayo de nucleasa Surveyor (Figs.3A, 3B y 3C, 4A y 4B). Los productos de escisión indicativos de la actividad TALEN se observaron en 10% de los embriones inyectados (por ejemplo, las Figs.3A, 3B y 3C, 4A, y 4B). Las mutaciones en la región predicho se confirmaron en 2 blastocistos inyectados, ya sea con ACAN11 o pares ACAN12 TALEN (Figs. 3A, 3B y 3C). No se observó una disminución significativa en la competencia de desarrollo de los embriones inyectados con TALEN. Una segunda ronda de inyecciones fue entonces realizó usando el par de ACAN12 TALEN en dosis de ARNm gue van desde 10-100 ng/ml.

Comparación de la tasa de formación de blastocistos entre las rondas 1 (33%) y 2 (5%) (condiciones de 10 ng/ml) reveló la mala calidad del embrión. A pesar de la mala calidad de los embriones, 12 mutantes putativos (27% inyectada) se identificaron utilizando el ensayo de SURVEYOR. Se analizaron los genotipos de cada embrión SURVEYOR positiva con 14 lecturas de secuenciación a partir de productos de PCR clonados. La secuenciación reveló mosaicismo en la modificación de genes. Indels fueron identificados positivos en 4 SURVEYOR embriones y de estos, secuencia positiva indel lee representaron el 29.7% del total lee para cada embrión. Procesos para la creación de lineas progenitoras de animales basados en la transferencia de embriones son bien conocidos. Embriones tratados con TALEN fueron transferidos con éxito a las vacas sustitutas para establecer la preñez. Estos resultados demostraron que TALENs funcionó en embriones de artiodáctilos . La modificación genética de embriones con nucleasas Zing Einger (ZFNs) y TALENs ha sido reportado en organismos modelo de inyección directa de ZFN o TALEN ARNm que codifican un par nucleasa, Geurts et al. (2009) Ciencia 325: 433; Carbery et al, (2010) Genetics 186: 451; Mashimo et al. (2010) PLoS One 5: E8870; Tesson et al. (2011) Nature Biotechnol.29: 695.

Ejemplo 2 Ganado artiodáctilo genéticamente modificado (porcino) producida por la inyección directa de TALENs.

También se realizó una sola serie de inyecciones en embriones PIV porcinos utilizando TALENs dirigidos al gen porcino RELA (p65) para los que se ha propuesto un alelo de tolerancia para la Peste Porcina Africana (Palgrave et al (2011) J. Virol.85:6008). Dos grupos informaron de mejora en la actividad TALEN usando variantes truncadas de los andamiajes TALE nativas (Mussolino et al (2011) Nucleic Acids Res. 39:9283; Miller et al (2011) Nature Biotechnol 29:143. Por lo tanto, en contraste para experimentos anteriores que utilizaron el andamiaje +231 (fragmento BamttI , Christian et al (2010) Genetics 186:757), el andamiaje p65 TALEN fue elegido para truncar para estar más cerca en secuencia para la versión +63 descrita Miller et. al.2011 ( op cit) (véase también las Figs.5A, 5B y 5C). Los cigotos fueron inyectados con una mezcla de ARNm incluyendo 5ng/pL cada uno para los TALENs izquierda y derecha junto con 5ng/pL ARNm EGFP como un indicador de la inyección de éxito. Setenta y cinco cigotos positivas EGFP fueron identificados (de 214 inyectada, 35%) y se sometieron a análisis de indel WGA. La amplificación por PCR fue exitosa de 56 de los embriones positivos EGFP, y 16 de ellos (29%) reveló indels por ensayo SURVEYOR (Fig.3) o análisis de la secuencia. El mosaicismo parece reducirse en los cigotos porcinos en comparación con el ganado, de hecho, un tercio de los mutantes (6/16) eran, o bien mutantes alélicas bi- homocigotos o heterocigotos (Figs. 4A y 4B). Estos resultados demostraron gue TALENs funcionó en embriones de artiodáctilos. Procesos para la creación de lineas progenitoras de animales basados en la transferencia de embriones son bien conocidos. Embriones tratados TALEN se implantaron en cerdas sustitutas y como resultado el establecimiento de la preñez.

Ejemplo 3 Ganado artiodáctilo genéticamente modificado producido por modificación genética de células somáticas bovina y porcina.

Varios pares TALEN adicionales se ensamblaron para los objetivos de cerdos y ganado elegidos en base a cualquiera de relevancia biomédica o agrícola. Dominios de unión de seis pares TALEN se colocaron en el contexto de dos andamiajes TALEN descrito previamente (+231, Christian et. Al.2010 (op cit) y Carlson +63, ver Miller et. al.201 1 (op cit) ) (Figs. 5A, 5B y 5C). Cada par TALEN se transfectó en fibroblastos primarios de ganado, y la modificación del genoma se midió en 3 días por el ensayo de Surveyor (Guschin, et al (2010) Methods Mol Biol 649:247 Los pares TALEN más activos, y DMDE7.1 y ACAN12, muestra la escisión del 38% y el 25% de los cromosomas, respectivamente, y la secuenciación de Sanger reveló un surtido de característica indels de NHEJ de reparación del ADN mediada (Figs.5A, 5B y 5C y Fig.6). El andamiaje TALENs tuvo un efecto significativo sobre la actividad en los fibroblastos. En total, 4 de 6 ubicaciones dirigidas con la isoforma +63 escinde en 3.5% o más, mientras que sólo el par DMDE7.1 TALEN escinde por encima de 1% en el andamiaje +231 (Figs.5A, 5B y 5C). Como se ha observado en estudios previos Doyon et al., (2010) Nature Methods 8:74; Miller, (2011) op cit) , una incubación de 72 horas a 30°C después de la transfección también tuvo un efecto positivo sobre la actividad, y se requiere para la actividad de 3 pares TALEN. La tasa de éxito para generar pares Carlson +63 TALEN activos ha sido alta. Los datos recogidos hasta el momento de la presentación muestra que 23 de 36 (64%) pares TALEN eran detectable activa (> 1.0% NHEJ) a los 15 genes repartidos por todo el genoma del cerdo y de vaca, en autosomas y tanto los cromosomas X e Y. Tres cuartas partes de los pares activos escindidos con alta eficiencia (19- 40%) con un nivel medio de la modificación de 25%. Los procesos clónales para la creación de líneas progenitoras de animales basados en fibroblastos modificados son bien conocidos.

Ejemplo 4 Cultivo Extendido y enriquecimiento indel por co-transfección de transposón.

Pares TALEN se transfectaron en fibroblastos y células cultivadas durante 14+ dias con o sin transposón de co-selección antes de la medición de los niveles de modificación. Los resultados se resumen en la Figs. 7A, 7B y 7C. En el dia cero (DO), las células se transfectaron con una mezcla de plásmidos que incluye un casete de expresión para cada TALEN (dos plásmidos), un transposón que codifica un marcador de selección (tercer plásmido, que codifica la puromicina, y un casete de expresión de la transposasa- (cuarto plásmido). los plásmidos TALEN son el componente principal (exceso de 4 veces en masa) de cada transíección . Transíectadas las células se cultivan durante 3 días a 30 o 37 grados Celsius antes de la separación, recogida de una muestra de ensayo de SURVEYOR y re-implantación para la cultura extendida +/- selección para la integración transposón. Todas las células se cultivan a 37 grados Celsius tras dia 3. Las células cultivadas durante 14+ dias se recogen para el ensayo SURVEYOR y crioconservadas para aplicaciones posteriores, es decir, SCNT. Para la comparación, otros fibroblastos fueron transíectadas porcentaje de Nucleofeccion y NHEJ se midió en el día 3, y en el día 14+ no seleccionada (NS) y (S) poblaciones seleccionadas. Para la comparación, los fibroblastos también se transfectaron usando catiónicos-lípidos .

Ejemplo 5 Aislamiento de clones de reemplazo mono- y bi-alélicos.

Los fibroblastos primarios transgénicos pueden expandirse y aislarse como colonias eficazmente cuando se blindan con fibroblastos no transgénicos (enlace de células) a densidades estándar (> 150 células/cm) y se sometieron a la selección de medicamentos usando la téenica de co-selección de transposón aplicada anteriormente (Carlson et al., (2011) Transgenic Res. 20:1125). Para evaluar este enfoque, se aislaron colonias puromycin de células resistentes tratadas con seis pares TALEN y sus genotipos evaluados mediante el ensayo de inspector o la secuenciación directa de productos de PCR que abarcan el sitio objetivo (Figs. 8A y 8B). En general, la proporción de clones positivos indel fue similar a las predicciones hechas sobre la base de día 3 niveles de modificación. Se identificaron clones alogénicos bi-alélicos para 6 de 7 diferentes pares TALEN, se presentan hasta en un 35 por ciento de células positivas indel (Tabla 1). En la mayoría de los ejemplos, indels eran homocigotos (misma indel en cada alelo) en lugar de indels únicas en cada alelo que sugieren que la reparación en plantilla cromátida hermana es común (Figs. 9A y 9B). En particular, entre los clones modificados, la frecuencia de modificación bi-alélica (17-60%) para la mayoría de los pares TALEN excede predicciones basadas en dias 3 niveles de modificación (10-17%) si las divisiones de cromosomas son tratadas como eventos independientes. Estudios anteriores con ZFN (Kim et al (2009) Genome Res.19:1279; Lee et al (2010) Genome Res 20:81; Perez et al (2008) Nature Biotechnol 26:808) son en apoyo de estos resultados. Estos estudios previos sugirieron que la modificación bi-alélica se produce en casi un tercio de las células modificadas independientes del nivel de actividad nucleasa.

TABLA 1 Co-selección de transposón habilita aislamiento de colonias modificadas Distribución de genotipo en clones de fibroblasto Par TALEN Mod Día 3 % predicho % predicho Clones mod Mod b¡- de clones de mod b¡- observados alélico mod alélico (%) observado (%) LDLRE2.1 Cerdo 3 19 34.5 10.5 30/81 (37) 5/26 (19) LDLRE2.1 Cerdo $ 21.5 38.3 . 12 23/76 (30) 8/23 (35)† LDLRE2.1 Cerdo $ 14.4 28.7 7.7 12/94 (13) 2/12 (³17)A LDLRE2.1-2x“ Cerdo 19.7 35.5 10.9 8/24 (33) 2/8 (³25)A LDLRE4.2 Cerdo S 20 36 11.1 4/48 (8.3) 1/4 (25) A LDLRE4.2 Cerdo $ 19 34.4 10 8/47 (17) 0/8A DMDE6 Cerdo 25 43.8 15.6 17/35 (49) NA DMDE7.1 Cerdo 27 47 15.6 12/29 (41) 3/10 (30) DMDE7.1-2x Cerdo 22 39.2 12.4 22/41 (54) 7/22 (>32)A† GHRHR2.3 Cerdo 29 50 17 26/43 (60) 15/26 (³58)°† ACAN 12 Vaca 29 50 17 27/35 (77) 2/6 (NA)° btGDF83.1 Vaca 17 31 9.3 7/24 (29) 0/7 Se identificaron alogénicos bi-alélicos por secuenciado de productos PCR. Sólo pueden identificarse eliminaciones traslapadas u homocigóticas usando esta téenica.

B Se transfectaron fibroblastos y recuperaron dos veces dentro de dos semanas con el mismo par TALEN 0 Se confirmaron 5/15 colonias como alelos de cambio de estructura dobles 0 Se analizaron sólo colonias con eliminaciones gruesas distinguibles en el amplicón PCR. † -95% de intervalo de confianza excede la hipótesis nula bi-alélica Ejemplo 6 supresiones e inversiones cromosómicas con TALENs.

Se planteó la hipótesis de que la entrega simultánea de dos pares TALEN apuntando al mismo cromosoma podría inducir grandes supresiones cromosómicas. Estos se lograron y, además, grandes inversiones fueron descubiertas incidentalmente. Los pares TALEN, DMDE6 y DMDE7.1 fueron probados por su alta actividad y el hecho de que un alto porcentaje de la distrofia muscular de Duchenne que es causada por supresiones gruesas (Blake, 2002) de forma que un modelo porcino se correspondería a la condición humana. Los resultados se resumen en la Figs.10A, 10B, 10C y 10D. Día 3 niveles de modificación de genes altos para cada par TALEN (24% para DMDE6 y 23% DMDE7.1), aunque ligeramente menor que cuando el par TALEN se transfectó de forma individual (Figs. 10A, 10B, 10C y 10D). Para determinar si se ha suprimido la secuencia entre los dos pares TALEN, la PCR se trató con cebadores que abarcan los sitios objetivo TALEN. Si la secuencia de 6.5 kb había sido retirado, se esperaba que una banda de -500 pb, mientras que la banda de tipo natural de 7 kb no se amplificó con las condiciones de PCR seleccionados. Se observó una banda cerca de 500 pb en repeticiones en el que se introducen los dos pares TALEN, pero estaba ausente cuando el par TALEN se introdujo solo (Figs.10A, 10B, 10C y 10D).

A continuación, la población celular se ensayó para inversión de eventos por PCR a través de presunción nuevas uniones 5' y 3'. Los productos se observaron en el tamaño esperado tanto para las uniones 5' y 3' de la inversión de presunción sólo cuando ambos pares TALEN se introdujeron (Figs. 10A, 10B, 10C y 10D). A fin de validar que las inversiones, las colonias se generaron utilizando la estrategia de selección co-transposón y examinados para supresión eventos e inversión. Ambos eventos de supresión y de inversión se recuperaron con alta frecuencia (10.3% y 4.1%, respectivamente; n> 1000). Supresión eventos e inversión se produjeron con notable fidelidad. Cuarenta y uno de cada 43 de las colonias positivas de inversión fueron positivos tanto en las uniones 5' y 3'. Por último, la secuenciación de productos de PCR confirmó ambos eventos de supresión e inversión con adición o supresión de muy pocos nucleótidos en sus uniones (Figs.11, 12).

Ejemplo 7 Recombinación homologa inducida por TALEN elimina la necesidad de marcadores de selección enlazados.

Un alelo miostatina mutante (una supresión de 11 pb) de las reses azul belga se colocó en el genoma de tipo natural ganado Wagyu (Grobet et al. (1997) Nature Genet. 17:71) (Figs. 13A, 13B y 13C). Con·solo transíectados, el par btGDF8.1 TALEN escinde hasta 16% de los cromosomas en la ubicación objetivo (Figs. 13A, 13B y 13C). TALENs (btGDF83.1) y una plantilla de ADN de doble cadena (BB-HDR) se diseñaron para introducir una supresión de 11 bp en el exón-3 de GDF8 bovina (mutación belga azul) por recombinación DSB homologa inducida. La mitad de la zona de unión de la izquierda TALEN faltaba en la plantilla BB-HDR, para hacerla resistente a la escisión TALEN. Un ensayo SURVEYOR demostró actividad de btGDF83.1 TALENs tanto a 37 y 30° Celsius. El producto de PCR utilizado para este ensayo fue generado utilizando los cebadores B y B' (mostrado en la Fig. 13A). La plantilla BB-ITDR no se incluyó en estas repeticiones ya que confunden las estimaciones de actividad btGDF83.1. Alelo especifico PCR demostró que HDR inducido era dependiente de co-transfección de TALENs y la plantilla BB-HDR. El ensayo de PCR fue desarrollado para detectar específicamente HDR alelos GDF8 modificado usando los cebadores c y c' (mostrado en la Fig. 13A). El extremo 3' del cebador c' abarcó la supresión de 11 bp, y no puede amplificar el alelo de tipo natural "wt". Quinientos equivalentes celulares fueron incluidos en cada reacción de PCR incluyendo el control positivo "C". el porcentaje de HDR se determinó por densitometría comparativa entre las reacciones experimentales y de control. Co-transfección con un molde de ADN superenrollado que alberga un fragmento de ADN 1623bp de las reses azul belga resultó en una frecuencia de conversión génica (HDR) de 0.5% a 5% según lo sugerido por PCR semicuantitativo en el día 3, sin selección para el evento deseado (Figs. 13A, 13B y 13C).

Estos resultados demostraron que TALENs se puede utilizar para colocar eficazmente secuencias de ácidos nucleicos exógencs en el ganado, incluyendo alelos, y sin marcadores.

Para evaluar la frecuencia de la colocación en colonias individuales, la estrategia de selección co-transposón se implemento para aislar y expandir las colonias individuales para la secuenciación de ADN. Se detectó la conversión de genes utilizando la plantilla de las reses azul belga en 5 colonias de 366 examinados por PCR. La amplificación con cebadores fuera de la plantilla y la secuenciación Azul Belga HDR confirmó la presencia de la supresión de 11 pb esperado en 4 de las colonias (Fig. 14). Un segundo experimento de repetición se realizó con resultados consistentes, con aproximadamente 1% de todas las colonias probadas siendo positivo para la conversión bi-alélica y aproximadamente 0.5% a aproximadamente el 1% de todas las colonias probadas son heterocigotos para el alelo de conversión.

Ejemplo 8 Escisión de ADN mediada por TALEN como un objetivo para HDR en las células de ganado.

Un par TALEN (LDLR4.2) dirigido al cuarto exón del gen receptor de lipoproteinas de baja densidad porcina (LDLR) fue co-transfectado con el plás ido superenrollado Ldlr-E4N-paro, que contiene brazos de homología correspondiente al gen LDLR porcina y una trampa de gen que permiten la expresión de neomicina fosfotransferasa sobre HDR (Figura 15) . Después de 3 días de cultivo análisis PCR reveló que, incluso sin selección antibiótica, una banda correspondiente a un evento HDR puede ser detectado en la ubicación específico (carril 4) a 30°C. Selección de poblaciones de células cultivadas durante 14 días con geneticina (G418) resultó en emieliment significativa de células HDR (carriles 11 y 13).

Ejemplo 9 actividad TALEN en cigotos bovinos.

Este ejemplo compara los resultados obtenidos con el Carlson +63 TALENS a un conocido previamente andamiaje +231. Se siguieron los métodos descritos en el Ejemplo 1. La Tabla 2 resume los resultados utilizando el par GDF83.1 TALEN dirigida al exón 3 de la ubicación GDF8 bovina 5, con el GDF83.1 se basan en el Carlson +63 andamiaje. La frecuencia de mutación utilizando el CARLSON 63 TALENs significativamente superó inyecciones previas. Seis de 14 blastocistos (43%) inyectados con una dosis baja ARNm (ng/ml) muestran indels sin una reducción significativa en la tasa de desarrollo. Tres de cuatro blastocistos en el grupo de dosis alta (10ng/pl) muestran indels, con modificación bi-alélica en 2 de 310 blastocistos mutantes (Tabla 3).

Tabla 2: actividad TALEN en cigotos bovinos.

TOPOGRAFIA l Candidatos i i l i . - - l . i - l a- 3 indels en un embrión b- ARNm eGFP se agregó a la concentración final de 2ng/pl c- Modificación de dos bi-alelos ACAN-Agrecano, candidato para modelo de acondroplasia congénita PRNP- Principal protefna priónica, implicada en la encefalopatía espongiforme GDF8- Factor 8 de diferenciación de crecimiento (miostatina), regulador del crecimiento muscular SEQ ID NOS SECUENCIAS 147 Wt. ACTCCACAGAATCTCGATGCTGTCGTTACCCTCTAACTGTGGATT 148 la. ACTCCACAG AATCTCGATGCT:: :GTTACCCTCTAACTGTGGATT X9 135 lb. ACTCCACAGAATCTCGATG:::::::::::CTCTAACTGTGGATT X2 136 le. ACTCCACAGAATCTCGATGC::::::TACCCTCTAACTGTGGATT XI 137 2a. ACTCCACAGAAT: : :: : :: : : : : : : :: : :CCTCTAACTGTGGATT X3 138 2b. ACTCC ACAGA ATCTCGATGCT : : :GTTACCTCTAACTGTGGATT XI 139 2c. ACTCCACAGAATCTCG ATGCT:TCGTTACCCTCTA ACTGTGGATT X2 2/9Bi-alélicas Ejemplo 10 Clonación de células TALEN-modificadas.

Las células del Ejemplo 5 que se modificaron con pares LDLR2 TALEN se cultivaron como clones. Transposón coseleccionado Ossabaw colonias porcinas con mono- y bi-alélica 5 modificación de la Clase A de dominio 1 del gen LDLR se agruparon de forma desproporcionada (agrupados A - 4 genotipos, B - 3 genotipos y C - 5 genotipos) y se clonó por cromatina transferencia. La preñez se estableció en 9.7 transferencias (1/2 para el agrupado A, 2/3 para el grupo B, y 4/4 para el agrupado C). Siete de las 9 cerdas quedaron embarazadas, y 6 de las 7 cerdas gestantes tenido nacidos vivos. 17 lechones nacieron que parecen estar en buen estado de salud con el propósito de elevar a 10 la madurez. Los lechones tenían diversos genotipos, referido como Bl, B2, CI y C2 en la Tabla 4, a continuación. Dos de los genotipos fueron supresiones, uno era una sola inserción base .y un genotipo tenido modificaciones de ambos alelos, una inserción en un alelo y la supresión en la otra.

Tabla 4 SEQ ID SECUENCIAS NO 140 Wt: CTCCTACAAGTGGATTGTOATGGGAACACCGAGTGCAAGGACGGGTCCG Bl: (289_290INS34; 285_287delATG) 10 nacidos; 9 vivos 141 1. CTCCT ACAAGTGG ATTTGTG ATGGGA i34 ACACCGAGTGCAAGGACGGGTCCG 142 2. CTCCTACAAGTGGATTTGTG:::GGAACACCGAGTGCAAGGACGGGTCCG B2: (21 l_292dell28)Uno sigue vivo 143 1. AGGGAGTATGGTCAC:::::::A128::ACCGAGTGCAAGGACGGGTCCG C1 : (289_290del 10)3 Nacidos (uno sigue vivo, uno se aplicó eutanasia debido a los defectos de clonación) 144 1. CTCCTACAAGTGGATTTGTGATGGG::::::::::GCAAGGACGGGTCCG C2: (289 290ins A) 8 nacidos; 8 vivos 145 I . CTCCTACAAGTGGATTTGTGATGGGAAACACCGAGTGCAAGG ACGGGTCCG Ejemplo 11 Un virus adeno-asociado (AAV) es una plantilla eficaz para TALEN recombinación homologa estimulada(HR).

En otro estudio, similar al del Ejemplo 7, hubo un intento experimental para la introgresión de un alelo mutante de la miostatina (1 LBP supresión) de las reses azul belga en el genoma de tipo natural ganado Wagyu (Grobet, 1997, Kambadur, 1997) (Fig. 18). Cuatro microgramos de plásmidos que codifican TALEN se transíectaron en células Wagyu y 24 horas más tarde, un virus adeno-asociado (AAV-BB-HDR) que alberga al fragmento de ADN 623bp de las reses azul belga se añadió. La PCR semi-cuantitativa en tres dias sugiere una frecuencia de conversión alelo de hasta 5% solamente cuando se añadieron tanto GDF8 TALENs y el vector AAV. Para evaluar la frecuencia de introgresión en colonias individuales, la estrategia de selección co-transposón se implemento para aislar y expandir las colonias individuales para .la secuenciación de ADN. El trece por ciento de las colonias aisladas fueron PCR positiva para la introgresión del alelo BB. Estos resultados demuestran que TALENs y una plantilla de recombinación homologa AAV es un método eficaz para la introgresión alelo especifico en el ganado y representa una mejora significativa sobre la plantilla de recombinación homologa de plásmido superenrollado para la misma ubicación (Ejemplo 7).

Ejemplo 12 ADN de hebra sencilla para crear plantillas.

La Figura 19 resume los resultados. Se encontraron oligodesoxinucleótidos de cadena sencilla (ssODNs) para ser una plantilla eficaz para HR que estimula TALEN. Recientemente se ha demostrado que la nucleasa dedo de zinc que induce rupturas de hebra doble puede estimular HR con un ssODNs a alta frecuencia {Chen, 2011}. No se sabia si TALENS podría igualmente estimular la recombinación homologa en las células, en particular células primarias, y en particular las células de ganado primaria con ssODNs como la plantilla de HR. Se direccionaron las mismas ubicaciones como anteriormente (Ejemplos 7 y 11) para la introgresión de mutación de reses azul belga de 11 pares de bases en las células Wagyu. Dos ssODNs de 76 pares de bases fueron diseñados para imitar la cadena ya sea sentido o antisentido del gen BB GDF8 incluyendo la supresión de 11 pares de base. Cuatro microgramos de plásmidos que codifican TALEN se transíectaron en células Wagyu, y 0.3 nmol de ssODNs fueron ya sea co-transfectadas con TALENS (N) o suministradas 24 horas después de nucleofección TALEN por ya sea reactivo MirusLTl (M) o reactivo Lipofectamina LTX (L). La PCR semi-cuantitativa en tres días sugiere una frecuencia de conversión alelo de hasta 5% en condiciones donde ssODNs fueron suministrados con reactivo LIPOFECTAMINE LTX 24 horas después de la transfección TALEN. No se observó ninguna diferencia en la señal de PCR entre ssODNs sentido y antisentido diseñados contra el objetivo.

Ejemplo 13 La transfección de células de ganado con ARNm que codifica TALENs resulta en escisión objetivo eficiente.

Las Figs. 20A y 20B resumen los resultados. Los cADNs TALEN (pares TALEN P6511.1 y DMD7.1) fueron clonados cadena abajo del promotor T3 en el vector de clonación pT3TS transcrito como se ha descrito previamente (Carlson, 2010) y se purificó utilizando el kit de purificación MINELUTE PCR (Qiagen) antes de la síntesis de ARNm utilizando el kit MMESSAGE MACHINE T3(Applied Biosciences) según el protocolo de los fabricantes. El ARNm modificado se sintetiza a partir de los mismos vectores con el kit MMESSAGE MACHINE T3 (Applied Biosciences) sustituyendo un cóctel ribonucleótido que consiste de análogo de tapa 3'-0-Me-m7G(5')ppp(5')G de ARN (New England Biolabs), trifosfato de 5-metilcitidina trifosfato pseudouridina (TriLink Bioteenologías, San Diego, CA) y dos ribonucleótidos estándar, trifosfato de adenosina y trifosfato de guanosina. Las reacciones de síntesis de ARNm fueron tratadas con ADNasa antes de la purificación mediante el uso del kit MEGACLEAR REACTION CLEANUP (Applied Biosciences), a) Las cantidades indicadas de p6511.1 TALENs se transfectaron en fibroblastos de cerdo (500,000-750,000 células por replicado) usando el sistema nucleofección NEON (Life Technologies) con los siguientes valores: 1 pulso, 1800 v; 20 ms de ancho y una punta de 100 ul. Las células transfectadas se cultivaron 3 dias a 30 o 37 grados Celsius antes de análisis indel por el ensayo SURVEYOR (Transgenomic). El porcentaje NHEJ se calculó como se describe en Guischin et. al., 2010, y se*representa en el gráfico. Cuatro microgramos de ADN plásmido (pADN) que codifican P6511.1 TALENs también se transfectaron en las mismas condiciones para la comparación de % de NHEJ. b) la estructura de ARNm, composición o esquema de reacción de síntesis in vitro tienen poco efecto sobre la actividad TALEN. ARNm que codifica DMD7.1 TALENs se sintetizó ya sea por separado (TALENs "I" izquierda y derecha en una reacción separada) o en la misma reacción ("D" Doble) usando ribonucleótidos estándar o modificados. Las reacciones fueron luego divididas en dos replicados, a uno de los cuales se añadió un extremo de poliA adicional usando el kit de Poli(A) de la extremidad (Ambion) según el protocolo de los fabricantes.

La expresión de TALENs a partir de ADN plásmido ha sido un método eficaz para la inducción de indels mediados por TALEN en células de ganado; sin embargo, la integración de los plásmidos que codifican TALEN en los genomas de las células es posible. En contraste, el ARNm no puede integrarse en los genomas de las células huésped. Para evitar la integración de plásmidos que codifican TALEN, se realizó un experimento para determinar si los niveles similares de actividad TALEN podrían lograrse mediante transfección de TALENs que codifican ARNm. Se generó ARNm para TALENs que codifica el par p6511.1 TALEN utilizando ribonucleótidos ya sea estándar o modificados. Dos cantidades de cada preparación de ARNm TALEN se transíectaron en fibroblastos de cerdo por nucleofección, cultivado 3 días a 30 o 37 grados Celsius antes del análisis de indels. El porcentaje de NHEJ fue similar para todas las transíecciones de ARNm incubadas a 30 grados Celsius mientras que una respuesta a la dosificación podría observarse para células transíectadas incubadas a 37 grados Celsius. Una diferencia significativa en porcentaje de NHEJ entre ribonucleótidos modificados y estándar no se pudo detectar en este replicado, sin embargo, no se utilizaron cantidades equivalentes. En particular, la transfección de ARNm en todos los grupos incubados a 30 grados C superó significativamente los P6511.1 TALENs transíectados como ADN plásmido en las mismas condiciones.

Se realizó otro experimento para examinar la influencia de ARNm sintetizado de nucleótido modificados frente a estándar en una segunda ubicación, DMD porcino. Este experimento también se evaluó si la adición de una cola poliA tiene influencia en la actividad TALEN, y si cada monómero TALEN (monómeros izquierdo y derecho) podría ser sintetizados en la misma reacción de transcripción (Doble) o si debe ser sintetizado individualmente y mezclarse antes de la transfección. Uno o cuatro microgramos de DMD7.1 TALEN ARNm se transíectaron en fibroblastos de cerdos y se cultivaron 3 días a 30 o 37 grados Celsius. Como con p6511.1 TALENs, se observó poca diferencia en la actividad TALEN en células cultivadas a 30 grados Celsius lo que sugiere que ni los nucleótidos modificados, la poliadenilación in vitro de los ARNm o la transcripción doble de ARNm tiene una influencia en la actividad. Una respuesta a la dosificación podría observarse de nuevo en los replicados cultivados a 37 grados como 4 g de ARNm que supera transíecciones de 1 gg. Además, los ARNms poliadenilados parecen superar ARNms no adenilados en replicados a 37 grados .

Cabe destacar que cuando el ADN plásmido que codifica DMD7.1 TALENs se transfectó en fibroblastos de cerdo, una reducción significativa (40-60%) en los niveles de % NHEJ medido el día 3 frente a las células cultivadas el día 14 se notificó (Ejemplo 4). No se observó tal reducción en el % NHEJ para ninguno de los replicados transfectados de ARNm mostrados aquí, los datos no se muestran para los niveles de modificación del día 14. Así la transfección de ARNm parece ser superior a la transfección de ADN no sólo para la actividad TALEN, sino también para mantener una alta proporción de células modificadas después de un período prolongado en cultivo. Sin estar ligado a una teoría particular, se cree -que este resultado se debe a la mejora de la viabilidad celular cuando se transfecta con el ARNm en comparación con el ADN plásmido.

Ejemplo 14 Análisis de colonias creadas por transfección de ARNm sin selección.

Los resultados de este ejemplo se resumen en la Tabla 5. Se añadieron una a cuatro microgramos de ARNm que codifica TALENs, como en el Ejemplo 13, a fibroblastos bovinos o porcinos primarios. Las células se cultivaron a 30°C durante tres días después de la exposición a TALENs y las células se enumeraron y se sembraron en una gama de densidades de 1-20 células/cm2 en placas de 10 cm. Las células se cultivaron durante 10-15 días hasta que se pudieron observar colonias individuales de 3-4 mm de diámetro. Las colonias se aspiraron con una pipeta P-200 bajo aspiración suave y expulsados en un pozo de la placa de 24 pocilios con 500 ml de medio de crecimiento (Carlson, 2011). Las placas con colonias claramente definidos (~10-30/placa) fueron elegidos para la aspiración colonia para limitar la posibilidad de aspirar las células a partir de múltiples colonias. Una vez que una colonia alcanza 70-90 por ciento de confluencia en el plato de 24 pozos, una porción se recogió para el análisis de indel y el resto fue crioconservada . Los resultados del análisis de indel se encuentran en las últimas cinco lineas de la Tabla 5. Estos resultados demuestran que las colonias se pueden aislar fácilmente a partir de fibroblastos transíectados con ARNm TALEN sin el uso de marcadores de selección. La frecuencia de mutación en los clones analizados se predijo con exactitud los niveles de modificación de la población de origen en el día 3. Los clones con modificaciones bi-alélica también podrían ser fácilmente identificados .

Tabla 5: Distribución de genotipos en los clones de fibroblastos.

Clones Bi-alélicos ' Día 3 % Predicho % Predícho observados observados Par TALEN Selección Mod Clones Mod Bi-alélicos Mod Mod (%) Mod (%) LDLRE2.1 Puro Cerdo 3 19 34.5 10.5 30/81 (37) 5/26 (19) LDLRE2.1 Puro Cerdo ? 21.5 38.3 12 23/76 (30) 8/23(35)† LDLRE2.1 Puro Cerdo 3 14.4 26.7 7.7 12/94 (13) 2/12(³17)A LDLRE2.1-2xB Puro Cerdo 19.7 35.5 10.9 8/24 (33) 2/8 (³25)A LDLRE4.2 Puro Cerdo 20 36 11.1 4/48(8.3) ¼(25)A LDLRE4.2 Puro Cerdo 2 19 34.4 10 8/47 (17) 0/8A DMDE6 Puro Cerdo 25 43.8 15.6 17/35 (49) NA DMDE7.1 Puro Cerdo 27 47 15.6 12/29 (41) 3/10 (30) DMDE7.1-2xB Puro Cerdo 22 39.2 12.4 22/41 (54) 7/22 (>32)A† GHRHR2.3 G-418 Cerdo 29 50 17 26/43 (60) 15/26 (³58)c† ACAN12 Puro Vaca 29 50 17 27/35 (77) 2/6 (NA)D btGDF83.1 Puro Vaca ·)7 31 9.3 7/24 (29) 0/7 GHRHR2.3 None Cerdo 3 32.5 55 19.4 21/25 (84) 6/21 (³29)A GHRHR2.3 None Cerdo ? 35 58 21 13/13 (100) 3/13 (³23)A LDLR2.1 None Cerdo 2 34 57 20 88/166 (53) 5/16(31%) btGDF83.1 None Vaca 29 50 17 23/45 (51) 2/23 (³9)E btGDF83.1 None Vaca 35 58 21 23/41 (56) 7/23 (³30)E A se Identificación inactivaciones bi-alélicas por secuenciación de los productos de PCR. Sólo supresiones superpuestas o homocigotos pueden ser identificados usando esta téenica.

B Los fibroblastos se transfectaron y se recuperó dos veces en dos semanas, con el mismo par TALEN. c Se confirmaron 5/15 colonias bi-alélicas como alelos de doble marco.

D Sólo se analizaron colonias con supresiones gruesas distinguibles en la amplificación de PCR.

E Se identificaron colonias de inactivación bi-alélicas por análisis de fusión de alta definición. Sólo modificaciones homocigotos pueden ser identificados. † - excede espera Intervalo de confianza del 95% bi-alélica hipótesis nula Ejemplo 15 Co-transfección de TALENs que codifica ARNm y ssODNs mejora HDR.

La Figura 21 presenta una sintesis de los resultados experimentales para la modificación de las células Wagyu con una combinación de codificación ARNm TALENs y oligonucleótidos de cadena sencilla. Las células fueron células Waygu y el alelo fue de azul belga. La experimentación, tipo de célula y ubicación evaluada fue la misma que en el Ejemplo 12 con la excepción de que ARNm que codifica TALEN (2 ug) fue suministrado en el lugar de TALENs que codifican ADN (donde se indica) y sólo se usó ssODN sentido. No hay marcadores de selección introducidos en estas células en cualquier etapa. El análisis de población el dia tres reveló HDR en las células transíectadas tanto ADN como ARNm cuando el ssODN se introdujo 24 horas después de TALENs. Se observó actividad pico (~10%) en las células co-transfectadas con el ssODN y TALEN ARNm por nucleofección. Este resultado contrasta el resultado anterior con TALENs que codifica ADN que eran incapaces de estimular HDR a una frecuencia medible. Entre las colonias individuales, preparadas como en el Ejemplo 13, la introgresión tando de heterocigotos como homocigotos del alelo azul belga se pudo observar en 5 y 2 por ciento, respectivamente.

Ejemplo 16 Introducción de alteraciones de base sencilla utilizando ssODNs y TALENs que codifican ARNm.

Las Figuras 22 y 23 representan los resultados de otro estudio en el que un polimorfismo de un solo nucleótido se replicó. Este polimorfismo se sabe que causa un cambio de codificación para la ubicación GDF8 bovina, C313Y, conocido por causar hipermuscularidad en el ganado piamontés (Kambadur, 1997; Genome Res 19977: 910-915 Un SNP adicional se introdujo en el ssODN para crear un sitio EcoRI silente para ayudar en la detección y/o cuantificación de HDR. ARNm y ssODNs se introdujeron simultáneamente por nucleofección como se indica en los Ejemplos 12 y 14 con las cantidades relativas indicadas. Las Figuras 22 y 23 muestran los resultados cuando las células transíectadas se incubaron a 30 y 37 grados Celsius durante tres dias. Los niveles de pico de recombinación homologa fueron significativamente superiores a los 30 grados Celsius (11.3%) que a 37 (1.7%), a pesar de una actividad similar de TALENs. Los datos muestran que a partir de aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.4nmol ADNss es eficaz para recombinación homologa tanto a 30 como a 37 grados Celsius. Sorprendentemente, se observó efecto bifásico, con una concentración/cantidad demasiado grande de oligonucleótido que abóle la recombinación. No se usaron marcadores de selección en estas células en ninguna etapa.

Ejemplo 17 Alelos introducidos en células de cerdo (Ossabaw) utilizando oligo HDR.

La Figura 24 expone un resumen de los resultados experimentales para la modificación de las células con una combinación de TALENs que codifican ARNm y oligonucleótidos de hebra sencilla para colocar un alelo que se produce naturalmente en una especie a otra especie (migración interespecifica). Se eligió piamontesa GFD8 SNP C313Y, como en el Ejemplo 16, como un ejemplo y se introdujo en células porcinas Ossabow. Los experimentos se realizaron como en el Ejemplo 16 con células porcinas Ossabaw sustituidas por células Wagyu. No se usaron marcadores en estas células en ninguna etapa. Se observó un pico similar en HDR entre células de cerdo y ganado a 0.4 nmol ssODN, (Fig.22, 23), sin embargo, HDR no se extinguió por las concentraciones más altas de ssODN en fibroblastos Ossabaw.

Ejemplo 18 Clonación de alelos introducidos en las células utilizando oligo HDR.

La Fig. 25 expone un resumen de los resultados experimentales para la modificación de las células con una combinación de TALENs que codifican ARNm y oligonucleótidos de hebra sencilla para colocar un alelo en células para la clonación de animales. Un nuevo alelo (BamHl) se introdujo en células porcinas Ossabaw diseñadas para introducir una inserción de 4 pares de base que podrían tanto crear alelo de cambio de marco como introducir un nuevo sitio BamHl. Se introdujo 2 o 1 microgramo de ssLDLR2.1 TALEN mRNA y 0.3 mnol de ssODN en células Ossabaw como en los Ejemplos 12 y 14. Sorprendentemente, no hubo sinergia entre ssODNs y la actividad TALEN como el máximo anterior para este par TALEN sin ssODN fue 25% NHEJ. Esta sinergia fue inesperada y no predecible con base en el conocimiento actual de los mecanismos moleculares pertinentes. Se detectó HDR mediante digestión de restricción de amplicones de PCR con BamHl. Los niveles de HDR fueron similares a los niveles de NHEJ lo que sugiere que la mayoría de las rupturas que indicen TALEN fueron reparadas con ssODN. El análisis de colonias individuales, generadas, como en el ejemplo 14, reveló modificación de heterocigotos y homocigotos de hasta 30 y 2.5 por ciento, respectivamente. No se usaron marcadores de selección en estos animales en ninguna etapa. Las células tratadas con TALEN fueron clonadas por transferencia de cromatina, implantadas en cerdas sustitutas y resultando en el establecimiento de preñez.

Ejemplo 19 TALENs que codifican ADN y ARNm son activos en células madre espermatogoniales.

Los resultados se resumen en la Fig. 26. Se aislaron células germinales porcinas jabalíes de 10 semanas de edad, y se enriquecen por diferencial. Los plásmidos que codifican eGFP y DMD - TALENs específicos fueron transfectados en células germinales utilizando el sistema AMAXA NUCLEOFECTOR A axa soluciones "V" - y "L" y "B" utilizando programas X-001 y X-005. Cada reacción de transfección se realizó con 106 de células germinales enriquecidas, e indica los microgramos de ADN plásmido que codifica TALEN. Los mismos métodos se utilizan para suministrar ARNms que codifican DMD7.1 TALENs. Después de la nucleofección, se cultivaron durante 5 dias en atmósfera de C02 al 5% a 37°C o 30°C. La eficacia de transfección se evaluó por análisis de inmunofluorescencia para la co-localización de la expresión de GFP y UCH-L1. La viabilidad celular se evaluó mediante exclusión con azul de tripano.

Ejemplo 20 HDR estimulado con TALEN en células germinales primordiales.

El HDR estimulado con TALEN también se probó en células germinales primordiales de pollo (PGC) en la ubicación Ddx4 pollo. Dos pares TALEN se construyeron, en un intrón 1 (Tall.l) y exón 7 (Tal7.1) y su función se verificó en células de pollo DF1, ver Figuras 27A, 27B y 27C. Véase también el Ejemplo 8. Posteriormente, cada par TALEN fue co-transfectados con el vector objetivo donador diseñado para fusionar GFP con el Exón 2 del gen Ddx4 (Fig.27B). Como se espera la escisión con recombinación homologa estimulada con Tal 1.1 (Fig.27C) mientras que Tal 7., que se encuentra fuera de la secuencia homologa en el vector objetivo donador, no estimula HDR.

Referencias Las solicitudes de patentes, patentes, publicaciones y artículos de revistas establecidos en este documento se incorporan aquí por referencia a todos los efectos; en caso de conflicto, la especificación está controlando.

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Claims (76)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un método de fabricación de un animal modificado genéticamente, caracterizado porque el método comprende exponer los embriones o células a un ARNm que codifica un TALEN, con el TALEN uniéndose específicamente a un sitio cromosómico objetivo en los embriones o células, la clonación de las células en una madre sustituta o implantación de los embriones en una madre sustituta, con la madre sustituta gestando de ese modo un animal que se ha modificado genéticamente sin un gen reportero y sólo en el sitio cromosomal objetivo a TALEN.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende la exposición de los embriones al TALEN sin un gen reportero, con más de aproximadamente el 1% de los embriones que incorporan la modificación en el sitio cromosomal objetivo.

3. El método dé conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque comprende proporcionar embriones que tienen genética conocida por ser capaz de expresar un conjunto de rasgos y la exposición de los embriones al TALEN sin un gen reportero y la selección del animal gestado para la modificación y para la expresión del conjunto de rasgos.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende exponer las células a la TALEN sin un gen reportero, y la clonación de las células, con más de 1% de las células clonadas gue proporcionan animales que incorporan la modificación en el sitio cromosomal objetivo.

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3, caracterizado porque comprende exponer las células al TALEN sin un gen reportero, la creación de colonias de células clónales, y probar un subconjunto de los miembros de las colonias para identificar colonias que incorporan la modificación en el sitio cromosomal objetivo.

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque probar el subconjunto de los miembros de las colonias es un proceso destructivo.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el proceso de prueba se elige del grupo que consiste de un ensayo nucleolitico, secuenciación, PAGE, PCR,·extensión del cebador, o hibridación.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque la modificación genética se elige del grupo que consiste en una inserción, supresión, inversión o transubicación.

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque el TALEN es un primer TALEN y el sitio cromosomal objetivo es un primer sitio, con el método que comprende además un segundo TALEN dirige a un segundo sitio cromosomal objetivo.

10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque comprende además la exposición de los embriones o células al ADN de hebra sencilla (ADNss) que contiene una secuencia exógena, con la modificación genética que comprende la secuencia exógena.

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la secuencia exógena comprende un alelo alternativo para el sitio cromosómico objetivo TALEN.

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el alelo alternativo está ligado a un rasgo cuantitativo o rasgo cualitativo.

13. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el alelo alternativo comprende un alelo de miostatina presente en las reses Azul Belga .

14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque la célula o embrión pertenece a una primera raza y el alelo pertenece a una segunda raza del animal.

15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la primera raza es ganado Wagyu o Nelore y la segunda raza es ganado Azul Belga, con la descendencia siendo un ternero Wagyu o Nelore.

16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-15, caracterizado porque el alelo se elige del grupo que consiste en una inserción, una eliminación, un polimorfismo, y polimorfismo de un solo nucleótido.

17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, caracterizado porque el alelo alternativo provee un rasgo mejorado al ganado, y se elige del grupo que consiste de un ubicación descornada, un gen recesivo para defectos de fertilidad, un gen para mejorar la producción de carne, un gen para mejorar la producción de leche, un gen de resistencia a la fiebre porcina africana, y combinaciones de los mismos; o proporciona un modelo animal, y se elige del grupo que consiste de un gen para la reducción del tamaño del animal, un gen que potencia el crecimiento tumoral, un oncogén, genes hipercolesterolemia, un gen de la enfermedad inflamatoria del intestino, un gen de la espina bifida, un gen de la hipertensión pulmonar, un gen que causa defectos cardiacos, y un gen de la enfermedad celiaca.

18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, caracterizado porque el sitio cromosomal objetivo se elige para que una interrupción de un gen, en el que la interrupción de los genes comprende una inserción, supresión o sustitución de uno o más bases en una .secuencia que codifica el gen y/o un elemento cis-regulador de los mismos.

19. El método de conformidad con cualquiera de las' reivindicaciones 1-18, caracterizado porque la modificación genética se selecciona de entre el grupo constituido por una inserción, una eliminación, un cambio en una secuencia de ácido nucleico exógeno, una inversión, una transubicación, una conversión génica para el alelo natural, una conversión génica para un alelo sintético, la migración alelo interespecies, la migración alelo intraespecies, y una conversión génica a un nuevo alelo.

20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, caracterizado además porque comprende el suministro de una reco binasa para la célula o embrión.

21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, caracterizado porque el ARNm TALEN se introduce directamente en la célula como ARNm.

22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la introducción directa en la célula comprende un método seleccionado de entre el grupo que consiste en electroporación, transíección, lipofección, liposoma, nucleofección, partículas biolísticas, nanopartículas, transfección de lípidos, electrofusión, e inyección directa.

23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-21, caracterizado porque el ARNm TALEN se introduce en la célula como un plásmido que codifica el ARNm.

24. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el ADNss se introduce en la célula después de que un vector que codifica un TALEN se introduce en la célula.

25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el ADNss se introduce en la célula de entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 3 días después de que el vector que expresa un TALEN se introduce en la célula.

26. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el TALEN ARN ·se introduce directamente en la célula más o menos al mismo tiempo que el ADNss.

27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque la célula es una célula primaria o célula madre y el método se realiza sin una etapa de selección que requiere un criterio de selección de supervivencia ya sea positivo o negativo.

28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-27, caracterizado porque el animal gestado se elige del grupo que consiste de cerdos, vacas, ovejas, cabras, pollo, conejo, pez, pez cebra, perro, ratón, gato, ratón, rata, y animales de laboratorio.

29. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-28, caracterizado porque la célula se selecciona del grupo que consiste de una célula de ganado, una célula de artiodáctilos, una célula cultivada, una célula primaria, una célula somática primaria, un cigoto, una célula germinal primordial, una célula madre, y un cigoto, o en donde el embrión es un blastocisto.

30. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-29, caracterizado porque el TALEN es un TALEN derecho y comprende además un TALEN izquierdo que se introduce con el TALEN derecho.

31. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-30, caracterizado porque las células son células somáticas primarias o células madre.

32. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-31, caracterizado porque las células son clonadas por transferencia nuclear de células somáticas o transferencia de cromatina.

33. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32, caracterizado porque el animal gestado es homocigótico para la modificación.

34. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-33, caracterizado porque el animal gestado es un animal progenitor.

35. Un animal modificado genéticamente, caracterizado porque es preparado de acuerdo con el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-34.

36. Un animal progenitor, caracterizado porque es hecho por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-34.

37. Un método de fabricación de una célula o embrión animal no humano modificado genéticamente, caracterizado porque comprende la exposición de los embriones o células del animal in vitro a un ARNm que cbdifica un TALEN, con el TALEN uniéndose específicamente a un sitio cromosomal objetivo en los embriones o células, con las células o embriones siendo modificados genéticamente sólo en el sitio cromosomal objetivo y con el método que se realiza sin un gen reportero.

38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque comprende las células, y comprende además el cultivo de las células y aislado de colonias de las células.

39. El método de conformidad con la reivindicación 37 o 38, caracterizado porque el método se realiza sin aditivos que crean una presión de selección positiva o negativa para seleccionar células modificadas genéticamente.

40. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-39, caracterizado además porque comprende la exposición de los embriones o células del animal in vitro a un ADN de hebra sencilla que contiene una secuencia exógena.

41. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37 o 39-40, caracterizado porque comprende las células, y comprende además el cultivo de las células y aislado de las colonias de las células, en donde una célula de prueba se toma de una colonia aislada y se prueba la célula de prueba para determinar cómo la célula fue modificada.

42. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque la prueba es un proceso destructivo que destruye la célula de prueba.

43. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la célula es una célula primaria.

44. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la célula es una célula primaria elegida del grupo que consiste de cerdos, vacas, ovejas, cabras, pollos, conejos, peces, pez cebra, perro, ratón, gato, ratón, rata, y animales de laboratorio.

45. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-44, caracterizado porque comprende exponer una célula primaria no humana en un cultivo in vitro o un embrión no humano a un ácido nucleico que codifica un TALEN, en donde el ácido nucleico codifica una porción líder N-terminal que tiene al menos 80% de homología con SEQ ID NO:132.

46. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-45, caracterizado porque comprende exponer las células a la TALEN sin un gen reportero, con más del 1% de las células que incorporan la modificación en el sitio cromosomal objetivo.

47. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-46, caracterizado porque se exponen las células a la TALEN sin un gen reportero, la creación de colonias de células clónales, y prueba de un subconjunto de los miembros de las colonias para identificar colonias que incorporan la modificación en el sitio cromosomal objetivo.

48. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-47, caracterizado porque la modificación genética se elige del grupo que consiste en una inserción, supresión, inversión o transubicación.

49. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-48, caracterizado porque el TALEN es un primera TALEN y el sitio cromosomal objetivo es un primer sitio, con el método que comprende además un segundo TALEN dirigido a un segundo sitio cromosomal objetivo.

50. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-49, caracterizado además porque comprende la exposición de los embriones o células al ADN de hebra sencilla (ADNss) que contiene una secuencia exógena, con la modificación genética que comprende la secuencia exógena.

51. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-50, caracterizado porque la secuencia exógena comprende un alelo alternativo para el sitio cromosomal objetivo TALEN.

52. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el alelo alternativo comprende un alelo de miostatina presente en las reses Azul Belga .

53. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-52, caracterizado porque el alelo se elige del grupo que consiste en una inserción, una eliminación, un polimorfismo, y polimorfismo de un solo nucleótido.

54. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-53, caracterizado porque el sitio cromosomal objetivo se elige para una interrupción de un gen, en donde la interrupción de los genes comprende una inserción, supresión o sustitución de una o más bases en una secuencia que codifica el gen y/o un elemento cis-regulador de los mismos.

55. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-54, caracterizado además porque comprende el suministro de una reco binasa a la célula o embrión.

56. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-55, caracterizado porque el ARNm TALEN se introduce directamente en la célula como ARNm.

57. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-56, caracterizado porque el ARNm TALEN se introduce en la célula como un plásmido que codifica el ARNm.

58. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el ADNss se introduce en la célula después de un vector que codifica un TALEN se introduce en la célula.

59. El método de conformidad con la reivindicación 50 o 58, caracterizado porque el ADNss se introduce en la célula de entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 3 días después de que el vector que expresa un TALEN se introduce en la célula.

60. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 50, 58, o 59, caracterizado porque el TALEN ARNm se introduce directamente en la célula más o menos al mismo tiempo que el ADNss.

61. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-60, caracterizado porque las células son células somáticas primarias o células madre.

62. Un animal modificado genéticamente, caracterizado porque el animal es un progenitor que comp'rende una secuencia de ácido nucleico exógeno en un sitio pretendido y está libre de todas las demás modificaciones genéticas.

63. El animal de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico exógeno es un alelo y el sitio pretendido es un homólogo del alelo.

64. El animal de conformidad con la reivindicación 61 o 62, caracterizado porque el animal es homocigótico para el alelo.

65. Un método de crear una modificación genética, caracterizado porque comprende: exponer una célula primaria no humana en un cultivo in vitro o un embrión no humano a un ácido nucleico que codifica un TALEN, en donde el ácido nucleico codifica una porción líder N-terminal tiene al menos 80% de homología con SEQ ID NO: 132.

66. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque la porción líder N-terminal tiene 80% de homología a la porción de secuencia de 22 residuos de la SEQ ID NO: 132 y un total de no más de aproximadamente 30 residuos.

67. El método de conformidad con la reivindicación 65 o 66, caracterizado porque el ácido nucleico que tiene al menos 90% de homología con SEQ ID NO: 132.

68. Una célula, caracterizada porque es hecha por, o utilizada en, un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-67.

69. Un animal, una célula, o un embrión, caracterizado porque es preparado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-34, 37-61, o 65-67.

70. El animal, la célula, o el embrión de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque es preparado para el tratamiento de un animal para producir descendencia con rasgos deseables, descendencia con una resistencia a las enfermedades, descendencia que adquiere una enfermedad, o descendencia libre de un defecto genético.

71. El animal, la célula, o el embrión de conformidad con la reivindicación 69 o 70, caracterizado porque es para el tratamiento de un animal para producir descendencia con rasgos deseables, en donde el rasgo deseable se selecciona del grupo que consiste de un rasgo de producción, un tipo de rasgo, un rasgo capacidad de trabajo, un rasgo de fertilidad, un rasgo maternal, el aumento de la producción de carne, la carencia de cuernos, el aumento de la producción de leche, tamaño del animal, y la reducción del tamaño de los animales.

72. El animal, la célula, o el embrión de conformidad con la reivindicación 69 o 70, caracterizado porque es para el tratamiento de un animal para producir descendencia con una resistencia a las enfermedades, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en gen de resistencia a la peste porcina africana, cáncer, hipercolesterolemia, enfermedad inflamatoria del intestino, y enfermedad cardiaca.

73. El animal, la célula, o el embrión de conformidad con la reivindicación 69 o 70, caracterizado porque es para el tratamiento de un animal para producir descendencia que adquiere una resistencia a las enfermedades, en donde la enfermedad se selecciona entre el grupo constituido por cáncer, hipercolesterolemia, enfermedad inflamatoria intestinal, espina bífida, hipertensión pulmonar, trastorno cardiaco, y enfermedad celiaca.

74. El animal, la célula, o el embrión de conformidad con la reivindicación 69 o 70, caracterizado porque es para tratar a un animal para producir descendencia libre de un defecto genético, en donde el defecto genético es una reducción de la fertilidad.

75. Un uso de una célula o embrión fabricado de acuerdo con un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37- 61, o 65-67.

76. El uso de la célula o el embrión de la reivindicación 75 para producir descendencia con un rasgo deseable, descendencia con una resistencia a las enfermedades, descendencia que adquieran una enfermedad, o descendencia libre de un defecto genético.