KR102421847B1 - Jak3 유전자 돌연변이 중증복합면역결핍 동물모델 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 JAK3 유전자 돌연변이 중증복합면역결핍 동물모델 및 그 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 JAK3 유전자 돌연변이 중증복합면역결핍 동물모델은 JAK3 유전자가 특이적으로 결핍되어 있고, 대식세포의 수와 활성을 조절하여 사이토카인의 발현이 조절되고, 종래 중증복합면역결핍 동물모델, 특히 미니돼지에서 관찰되던 흉선, 림프구, Peyer's patch가 완벽히 결손 되어 있다. 또한 본 발명의 동물모델은 JAK3 유전자 돌연변이 의해 발생된 인간 중증 복합 면역 결핍 환자에게서 나오는 유사 표현형 관찰되어 JAK3 SCID 환자의 치료 모델로 활용이 가능하고, 인공혈액 개발용, 또는 이종장기이식용으로 활용이 가능하다.
Description
본 발명은 JAK3 유전자 돌연변이 중증복합면역결핍 동물모델 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
중증 복합 면역 결핍 (Severe combined immunodeficiency; SCID)은 T, B 및 자연 살해 (natural killer; NK) 세포와 같은 주요 면역 세포의 발달 또는 기능의 이상 등의 특징으로 하는 유전적 장애를 의미한다. 인터루킨-2 수용체 감마 (interleukin-2 receptor gamma; IL2rg), 재조합 활성화 유전자 1/2 (recombination activating gene; RAG1/2) 및 야누스 키나제 3 (Janus kinase 3; JAK3)을 포함하여 12 개 이상의 유전자에서 돌연변이가 발생할 수 있다. 다른 원인에도 불구하고, 대부분의 환자 SCID는 작은 흉선이 있거나 흉선 세포, 림프절 또는 편도선이 부족하다. SCID를 치료하는 많은 방법 (예: 줄기 세포 및 골수 이식 및 효소 대체 요법)이 진행되고 있지만 현재까지도 SCID 환자는 중증 위험에 처해 있는 상황이다.
마우스에서 중증복합면역결핍 동물모델(IL2rg, JAK3, RAG1, RAG2)이 개발됐지만 기초 및 임상연구에서 사람과 상당한 면역체계의 차이를 보이는 것이 알려져 있다. 이에 사람과 면역 특성이 비슷한 돼지에서도 중증복합면역결핍 동물모델을 개발하려는 시도로 RAG1, RAG2, IL2rg 그리고 RAG1/2, RAG2/IL2rg 넉아웃 돼지들이 만드는 시도가 이루어졌다.
JAK3은 야누스 키나아제 계열 (Janus family of kinases)과 관련된 티로신 키나제(tyrosine kinase) 이며, 이는 인터루킨 (IL) 2, 4, 7, 9, 15 및 21 등의 다양한 사이토 카인 수용체의 수용체 서브 유닛으로서 면역계에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 또한 상염색체 SCID를 유발하고 인간 환자에서 SCID의 약 7 %를 차지하고 있음이 알려져 있다. 면역세포의 기능 장애에 있어서는 IL2rg의 공통 감마 사슬 (γc)이 동일한 신호 전달 경로에서 구성 요소와 연결되어 있기 때문에 T-, B+, NK- 이러한 표현형이 나타난다.
하지만 마우스의 경우에 있어서도 T 세포 발달과 관련된 IL-2 신호 전달 경로의 방해 T 세포 성숙에 관여하는 흉선 발달에 심각한 손상 및 회장 Peyer's patch 및 림프절의 부재 등 유사한 표현형에도 불구하고 일부 연구자들은 JAK3 넉아웃 마우스가 IL2rg 넉아웃 마우스와 다르다는 것을 확인하였다. 특히, JAK3 넉아웃 마우스는 IL2rg 넉아웃 마우스와 비교하여 더 심한 흉선 저형성증을 나타내고 IL2rg 넉아웃 마우스의 흉선 수질에서는 흉선 소체가 검출되었지만 JAK3 넉아웃 마우스에서는 검출되지 않는다.
따라서 본 연구팀은 유전자가위(CRISPR/Cas9) 시스템을 활용하여 미니돼지의 체세포에 JAK3 유전자를 결손 시킨 후 형질전환된 체세포를 이용하여 체세포 복제 방법을 통해 JAK3 유전자가 넉아웃된 미니돼지를 생산하고 그의 면역학적 특징을 확인하였다.
본 발명의 하나의 목적은 JAK3(Janus kinase 3) 유전자를 암호화하는 DNA에 혼성화하는 gRNA(guide RNA)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; Cas9 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및 상기 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 발현벡터을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 재조합 발현벡터가 도입된 중증복합면역결핍 동물모델 제작용 형질전환 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 형질전환 세포주를 인간을 제외한 동물로부터 수득한 탈핵된 난자에 이식하여 핵 이식란을 형성하는 단계; 및 상기 핵이식란을 인간을 제외한 동물인 대리모의 난관에 이식하는 단계를 포함하는 중증복합면역결핍 동물모델의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 JAK3(Janus kinase 3) 유전자 돌연변이 중증복합면역결핍 동물모델을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 JAK3(Janus kinase 3) 유전자를 암호화하는 DNA에 혼성화하는 gRNA(guide RNA)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; Cas9 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및 상기 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 명세서에서는 CRISPR/Cas9 시스템을 활용한 JAK3 특이적 유전자가위를 이용하여 JAK3 유전자를 넉아웃시키고, 형질전환 체세포 복제 기법의 적용에 의하여, 중증복합면역결핍의 표현형을 갖는 형질전환 동물을 생산하는 방법이 제공된다.
본 발명에서 사용되는 용어, "CRISPR/Cas9 시스템"은 Cas9 단백질과 가이드 RNA(guide RNA)로 구성되어 있는 제 3세대 유전자가위로써, 미생물의 면역체계로 알려진 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 시스템을 이용해 원하는 유전자 염기서열을 절단하도록 고안된 인공제한효소를 말한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "Cas9 단백질"은 CRISPR/Cas9 시스템에서 필수적인 단백질 요소로써, CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(trans-activating crRNA: tracrRNA)로 불리는 두 RNA와 복합체를 형성하여, 활성 엔도뉴클레아제 또는 니카아제(nickase)로 작용할 수 있다. 상기 Cas9 단백질은 스타필로코커스 (Staphylococcus) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 네이세리아 (Neisseria) 속, 파스테우렐라 (Pasteurella) 속, 프란시셀라 (Francisella) 속, 캄필로박터(Campylobacter) 속 유래인 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "가이드 RNA(guide RNA, gRNA)"는 표적 DNA에 특이적인 RNA로, gRNA는 Cas9 단백 질과 복합체를 형성할 수 있고, Cas9 단백질을 표적 DNA에 가져올 수 있다. gRNA는 crRNA 및 tracrRNA일 수 있고, 또는, crRNA와 tracrRNA가 하나로 연결된 sgRNA(single guided RNA)일 수 있다.
본 발명의 재조합 발현벡터를 이용하여 세포를 형질전환하면 세포 내에 가이드 RNA 단편을 전달할 수 있고, 전달된 가이드 RNA 단편은 JAK3 유전자를 인식할 수 있다. 상기 재조합 발현벡터는 tracerRNA를 더 포함할 수 있다. 따라서, 재조합 발현벡터를 이용하여 세포를 형질전환하면 세포 내에 가이드 RNA 단편 및 tracrRNA 단편 또는 crRNA와 tracrRNA가 하나로 연결된 sgRNA를 전달할 수 있고, 전달된 tracrRNA 단편 또는 부분은 crRNA 단편 또는 부분과 복합체 또는 결합 구조를 형성하여 Cas9 단백질이 인식할 수 있는 구조를 형성하는 역할을 할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, JAK3 (Janus kinase 3, 야누스 키나아제 3)는 단백질 키나아제의 야누스 패밀리의 멤버를 지칭한다. 이 패밀리의 다른 멤버는 실질적으로 모든 조직에 의해 발현되지만, JAK3 발현은 조혈 세포에 한정된다. 이는 다쇄 수용체에 공통적인 감마쇄와 JAK3의 비공유 결합에 의한 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 및 IL-15에 대한 수용체를 통한 신호화에서의 이의 필수적인 역할과 일치한다. XSCID 환자 개체수는 공통 감마쇄에 대한 유전적 결함을 갖거나 또는 JAK3 단백질의 심하게 감소된 수준을 갖는 것으로 확인되었는데, 이는 면역 억제가 JAK3 경로를 통한 신호화 차단으로부터 생겨야 함을 시사한다. JAK3은 B 및 T 림프구 성숙에서 중요한 역할을 할 뿐 아니라, JAK3은 T 세포 작용을 유지하는 데에 구성상 필요한 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "넉아웃"은 염기서열 중 특정 유전자가 발현될 수 없도록 이를 변형 또는 제거하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "재조합 발현벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "작동가능하게 연결된"은 유전자 발현 조절 서열과 다른 뉴클레오티드 서열사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 유전자 발현 조절 서열은 복제원점(replication origin), 프로모터 및 전사 종결 서열(terminator) 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다. 전사 종결 서열은 폴리아데닐 화 서열(pA)일 수 있으며, 복제 원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 또는 BBV 복제원점 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "프로모터"는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며, 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다.
본 발명의 일 구체예에 따른 프로모터는 특정 유전자의 전사 개시를 조절하는 전사 조절 서열 중 하나로, 약 100bp 내지 약 2500bp 길이의 폴리뉴클레오티드 단편일 수 있다. 프로모터는 세포, 예컨대, 진핵 세포(예컨대, 식물 세포, 또는 동물 세포(예를 들어, 인간, 마우스 등의 포유류 세포 등) 등)에서 전사 개시를 조절할 수 있으면, 제한 없이 사용 가능하다. 예를 들어, 프로모터는 CMV 프로모터(cytomegalovirus promoter(예를 들어, 인간 또는 마우스 CMV immediate-early 프로모터), U6 프로모터, EF1-alpha(elongation factor 1-a) 프로모터, EF1-alpha short(EFS) 프로모터, SV40 프로모터, 아데노바이러스 프로모터(major late promoter), pLλ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, HSV의 tk 프로모터, SV40E1 프로모터, 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory syncytial virus; RSV) 프로모터, 메탈로 티오닌 프로모터(metallothionin promoter), β-액틴 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터, 인간 IL-2(human interleukin-2) 유전자 프로모터, 인간 림포톡신(human lymphotoxin) 유전자 프로모터 및 인간 GM-CSF(human granulocyte-macrophage colony stimulating factor) 유전자 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따른 재조합 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 재조합 발현벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 사용되는 플라스미드(예를 들어, pcDNA 시리즈, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pUC19 등), 파지(예를 들어, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1, M13 등) 또는 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 등) 등을 기본으로 하여 제작될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 발현벡터는 하나 이상의 선택성 마커를 더 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질주입된 세포를 비형질주입 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 예를 들어, 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트암모늄(glufosinate ammonium) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 암피실린(ampicillin), 카나 마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜 (chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 발현벡터의 제작은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 gRNA는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 gRNA를 사용함으로써, JAK3를 코딩하는 아미노산 코돈 (codon)의 변화 및/또는 조기 종결 코돈(premature stop codon)의 생성을 효율적으로 유도할 수 있다. 상기 gRNA는 off-target 분석결과 JAK3 유전자만의 특이적 결손을 유발하는 효과가 있다.
본 발명의 다른 일 양상은 상기 재조합 발현벡터가 도입된 중증복합면역결핍 동물모델 제작용 형질전환 세포주를 제공하는 것으로, 구체적으로는 JAK3(Janus kinase 3) 유전자를 암호화하는 DNA에 혼성화하는 gRNA(guide RNA)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; Cas9 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및 상기 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 발현벡터가 도입된 중증복합면역결핍 동물모델 제작용 형질전환 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어, "중증복합면역결핍(SCID; severe combined immunodeficiency) "은 효과적인 면역반응 능력이 결여된 상태를 말하며, 구체적으로, T, B 및 NK 세포의 발달 및 기능의 결실에 의해 야기된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 재조합 발현벡터가 도입된 형질전환 세포주를 제조하기 위하여, 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 당 분야에서 공지된 방법을 사용할 수 있으며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온성 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
형질전환 세포주로 사용될 세포의 종류는 동물세포 또는 동물세포 유래의 세포일 수 있고, 바람직하게는 포유류, 가장 바람직하게는 돼지 또는 미니돼지 유래의 체세포일 수 있다. 형질전환 세포주로 미니돼지 유래의 체세포를 사용할 경우, 출생 직후 미니돼지가 사망하는 문제를 개선할 수 있을 뿐만 아니라, 중증복합면역결핍을 유도할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양상은 상기 형질전환 세포주를 인간을 제외한 동물로부터 수득한 탈핵된 난자에 이식하여 핵 이식란을 형성하는 단계; 및 상기 핵이식란을 인간을 제외한 동물인 대리모의 난관에 이식하는 단계를 포함하는 중증복합면역결핍 동물모델의 제조방법을 제공하는 것으로, 구체적으로는 JAK3(Janus kinase 3) 유전자를 암호화하는 DNA에 혼성화하는 gRNA(guide RNA)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; Cas9 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및 상기 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 발현벡터가 도입된 중증복합면역결핍 동물모델 제작용 형질전환 세포주를 인간을 제외한 동물인 대리모의 난관에 이식하는 단계를 포함하는 중증복합면역결핍 동물모델의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 중증복합면역결핍 동물모델의 제조방법은 체세포 핵이식(SCNT; somatic cell nuclear transfer)에 의한 것일 수 있다. "체세포 핵이식"은 생식과정에서 일반적으로 이루어지는 감수분열 및 반수 염색체 보유 생식세포를 경유하지 않고도 자손을 탄생시킬 수 있는 유전자 조작기술로써, 성체가 가진 배수체 보유 체세포를 핵이 제거된 난자에 이식하여 수정란을 생산하고 상기 수정란을 생체 내로 이식하여 새로운 개체를 발생시키는 방법이다.
본 발명에서 사용되는 용어, "핵이식란"은 핵 공여세포가 도입 또는 융합된 난자를 말하며, "융합"은 핵 공여세포와 난자의 지질막 부분의 결합을 의미한다. 예를 들어, 지질막은 세포의 플라스마막 또는 핵막일 수 있다. 융 합은 핵공여 세포와 난자가 서로 인접하게 위치해 있는 경우 또는 핵 공여세포가 수핵난자의 주란강 (perivitelline space) 내에 위치해 있는 경우에 전기적 자극을 가함으로써 일어날 수 있다. 상기 형질전환 세포주는 핵 공여 세포로써, 핵 수용체인 난자로 핵을 전달하는 세포 또는 세포의 핵을 말한다. 난자는 바람직하게는 제2차 감수분열 중기까지 도달한 성숙난자를 말하며, 바람직하게는 돼지의 난자일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로서 상기 동물은 미니돼지인 것일 수 있다.
돼지는 해부 생리학적으로 인간과 유사성이 인정되어 이미 각종 질환의 병리학적 기전과 치료를 위한 연구에 이용되고 있으며, 특히 오랫동안 경제 동물로 가치가 인정되어 다른 중/대 동물을 질환모델로 사용할 때보다 윤리적인 문제점을 피해갈 수 있으며, 안정적인 사육 시스템이 구축되어 있어 실험동물 모델 개발 시 유지 및 관리가 용이한 장점이 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 중증복합면역결핍은 JAK3(Janus kinase 3) 넉아웃(knock-out)에 의한 것일 수 있다.
JAK3 유전자를 구성하는 염기중 일부의 치환, 결실, 또는 일부 염기의 삽입에 의한 JAK3 넉아웃에 의하여, 중증복합면역결핍 동물모델의 제조가 가능하다.
본 발명에서 사용되는 용어, "넉아웃"은 염기서열 중 특정 유전자가 발현될 수 없도록 이를 변형 또는 제거하는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 넉아웃은 서열번호 3에 해당하는 염기서열이, 서열번호 4 내지 서열번호 6로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염기서열로 돌연변이 되어 발생된 것일 수 있다.
구체적으로, 서열번호 3은 JAK 3의 엑손 2 (EXON 2)서열 중 일부이고, 전술한 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 gRNA와 혼성화되는 부분을 포함한다. 또한, 서열번호 4 내지 서열번호 6의 염기서열은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 gRNA와 유전자 가위 (Cas9)을 통해 돌연변이되어 발생된 서열로서, 1bp의 증감 또는 17bp의 결손된 것이다. 더욱 구체적으로, 서열번호 4는 서열번호 3의 25번째 위치에 'A'가 추가된 염기서열이다. 서열번호 5는 서열번호 3의 30번째 위치의 염기인 'C'가 결실된 염기서열이다. 서열번호 6은 서열번호 3의 23번째 내지 39번째 염기인 'GGACCCCCACAGCGCCT'가 결손된 염기서열이다.
본 발명의 다른 일 양상은 JAK3(Janus kinase 3) 유전자 돌연변이 중증복합면역결핍 동물모델을 제공하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어, "동물모델"은 사람의 질병과 아주 유사한 형태의 질병을 가진 동물을 말한다. 사람의 질병 연구에 있어 질환모델 동물이 의미를 갖는 것은 사람과 동물들 간의 생리적 또는 유전적인 유사성에의 한다. 질병 연구에 있어 생체의학 질환모델 동물은 질병의 다양한 원인과 발병과정 및 진단에 대한 연구용 재료를 제공해줄 수 있으므로, 질환모델 동물의 연구를 통해 질병에 관련된 유전자들을 알아내고, 유전자들 간의 상호작용을 이해할 수 있으며, 개발된 신약후보물질의 실제 효능 및 독성 검사를 통해 실용화 가능성의 여부를 판단하는 기초자료를 얻을 수 있다.
본 발명의 중증복합면역결핍 동물모델에 있어서, 전술한 내용과 중복되는 부분은 전술한 의미와 동일한 의미로 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "돌연변이"는 유전자를 이루는 염기서열의 변화로 유전정보가 변하면서 유전형질이 달라진 상태를 말하며, 이러한 돌연변이에는 점 돌연변이, 결실 돌연변이, 삽입 돌연변이, 미스센스 돌연변이 및 넌센스 돌연변이가 포함될 수 있다. 본 발명에서는 CRISPR/Cas9 시스템에 의한 JAK3 유전자의 돌연변이에 따른 JAK3 유전자의 발현이 감소된 중증복합면역결핍 동물모델이 제공된다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 동물모델은 JAK3 유전자가 넉아웃(knock-out)된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 넉아웃은 서열번호 3에 해당하는 염기서열이, 서열번호 4 내지 서열번호 6로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염기서열로 돌연변이 되어 발생된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 동물은 미니돼지인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 동물은 인공혈액 개발용, 이종장기이식용 또는 중증면역결핍 질환동물모델용인 것일 수 있다.
본 발명의 중증복합면역결핍 동물모델, 특히 미니돼지는 종래 중증복합면역결핍 마우스와 비교하여 사람과 면역 체계와 유사한 특징이 있다. 그로 인해 인간 중증 면역 결핍 환자와 유사한 표현형이 관찰되고, 인간의 JAK 3 SCID 연구를 위한 모델로서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 중증복합면역결핍 동물모델은 대식세포의 수와 활성을 조절하여 사이토카인의 발현이 조절될 뿐만 아니라, 종래 중증복합면역결핍 미니돼지인 RAG2 넉아웃 미니돼지에 비하여 흉선, 림프구, Peyer's patch가 완벽히 결손 되어 중증복합면역결핍 모델로서 적합하다.
본 발명은 JAK3 유전자만이 특이적으로 넉아웃된 동물모델을 제공할 수 있는 재조합 발현벡터, 이를 포함하는 세포주와 중증복합면역결핍 동물모델의 제조방법을 제공할 수 있고, 이에 의해 제조된 중증복합면역결핍 동물모델 도한 제공할 수 있다. 본 발명의 동물모델은 JAK3 유전자가 특이적으로 결핍되어 있고, 대식세포의 수와 활성을 조절하여 사이토카인의 발현이 조절되고, 종래 중증복합면역결핍 동물모델, 특히 미니돼지에서 관찰되던 흉선, 림프구, Peyer's patch가 완벽히 결손 되어 있다. 또한 본 발명의 동물모델은 JAK3 유전자 돌연변이 의해 발생된 인간 중증 복합 면역 결핍 환자에게서 나오는 유사 표현형 관찰되어 JAK3 SCID 환자의 치료 모델로 활용이 가능하고, 인공혈액 개발용, 또는 이종장기이식용으로 활용이 가능하다.
도 1은 본 출원 실험예 1-1에 따른 JAK3 엑손 2에 혼성화하는 CRISPR/Cas9 유전자가위의 가이드 RNA 서열 및 위치를 나타내는 그림이다.
도 2는 본 출원 실험예 1-2-1에 따른 JAK3 넉아웃 유전자가위의 돼지 JAK3 리포터 벡터, JAK3 gRNA 벡터, Cas9 벡터의 구조를 나타내는 그림이다.
도 3은 본 출원의 실험예 1-2-2에 따른 JAK3 넉아웃 유전자가위 발현 벡터 시스템의 도입 및 작동여부를 형광현미경으로 검증한 사진이다.
도 4는 본 출원의 실험예 1-2-3에 따른 JAK3 넉아웃 유전자 발현 벡터시스템의 검증을 유세포 분석으로 검증한 결과이다.
도 5는 본 출원의 실험예 1-2-4에 따른 JAK3 넉아웃 유전자 발현 벡터시스템의 검증을 T7E1 분석으로 검증한 결과이다.
도 6는 본 출원의 실험예 1-3의 방법를 도시하는 그림이다.
도 7는 본 출원의 실험예 1-3에 따른 JAK3 넉아웃 유전자 발현 벡터시스템에 의한 돌연변이를 나타내는 그림이다.
도 8는 본 출원의 실험예 1-4에 따른 JAK3 넉아웃 유전자 발현 벡터시스템의 검증을 아미노산 서열 분석으로 검증한 결과이다.
도 9 내지 11은 본 출원의 실험예 1-5에 따른 JAK3 넉아웃 유전자 발현 벡터시스템의 검증을 핵형 분석으로 검증한 결과이다.
도 12는 본 출원의 실시예 1에 따른 JAK3 유전자 결손된 형질전환 복제 미니돼지 생산 과정을 나타내는 도면이다.
도 13 및 14는 본 출원의 실시예 1에 따른 JAK3 유전자 결손된 형질전환 복제 미니돼지 생산 과정 및 생산된 미니돼지를 나타내는 사진이다.
도 15는 본 출원의 실험예 2-1에 따른 JAK3 유전자 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 JAK 3 유전자 결손을 확인한 도면이다.
도 16는 본 출원의 실험예 2-2-1에 따른 결과를 나타내는 도면으로, 구체적으로 JAK3 유전자 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 mRNA를 RT-PCR로 분석한 결과이다.
도 17는 본 출원의 실험예 2-2-2에 따른 결과를 나타내는 도면으로, 구체적으로 JAK3 유전자 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 mRNA를 western blot으로 분석한 결과이다.
도 18 및 19는 본 출원의 실험예 3-1에 따른 결과를 나타내는 것으로, 구체적으로 JAK3 유전자 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 흉선(Thymus), 비장(Spleen), 림프절(submandibular or mesenteric lymph node)의 확인한 결과이다.
도 20는 본 출원의 실험예 3-2에 따른 결과를 나타내는 것으로, 구체적으로 JAK3 유전자 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 흉선과 비장의 조직 형성을 면역조직염색으로 확인한 결과이다.
도 21 및 22는 본 출원의 실험예 3-3에 따른 결과를 나타내는 것으로, 구체적으로 비장 조직의 면역조직염색 및 유세포 분석 결과이다.
도 23 및 24는 본 출원의 실험예 3-5에 따른 결과를 나타내는 것으로, 구체적으로 면역세포 형성을 V(D)J recombination 검출 방법으로 확인한 결과이다.
도 25는 본 출원의 실험예 4-1에 따른 결과를 나타내는 것으로, 구체적으로 JAK3 유전자가 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 생존율 분석 결과이다.
도 26는 본 출원의 실험예 4-2에 따른 결과를 나타내는 것으로, 구체적으로 JAK3 유전자가 결손된 형질전환 복제 미니돼지에서의 암세포 생장 확인한 결과이다.
도 27 및 28은 본 출원의 실험예 4-3에 따른 결과를 나타내는 것으로, 구체적으로 JAK3 유전자가 결손된 형질전환 복제 미니돼지에 이식된 암세포, 조직에 면역세포 유입 면역조직염색, RT-PCR로 확인한 결과이다.
도 29는 본 출원의 실험예 5-1에 따른 결과를 나타내는 것으로, 구체적으로 JAK3 유전자가 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 혈액 분석 결과이다.
도 30 및 31은 본 출원의 실험예 5-2에 따른 결과를 나타내는 것으로, 구체적으로 JAK3 유전자가 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 신장 조직 내 대식세포 관련 유전자의 발현을 확인한 결과이다.
도 32 및 33은 본 출원의 실험예 5-3에 따른 결과를 나타내는 것으로, 구체적으로 JAK3 유전자가 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 신장 조직 내 대식세포 관련 유전자 중 CD68의 발현을 확인한 결과이다.
도 34 내지 36는 본 출원의 실험예 5-4에 따른 결과를 나타내는 것으로, 구체적으로 JAK3 유전자가 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 신장 조직 내 대식세포의 분극화 관련 유전자 (M1, M2)의 발현 및 Cytokine 발현을 확인한 결과이다.
도 37 내지 도 44는 본 출원의 실험예 6-1에 따른 결과를 나타내는 것으로, 구체적으로 JAK3 넉아웃 형질전환 복제 미니돼지 (JAK3 knock out; JAK3 KO)의 폐/내장 이상을 비교, 확인한 결과이다.
도 45는 본 출원의 실험예 6-2에 따른 결과를 나타내는 것으로, 구체적으로 JAK3 넉아웃 형질전환 복제 미니돼지 (JAK3 knock out; JAK3 KO)의 내장 이상을 비교, 확인한 결과이다.
도 2는 본 출원 실험예 1-2-1에 따른 JAK3 넉아웃 유전자가위의 돼지 JAK3 리포터 벡터, JAK3 gRNA 벡터, Cas9 벡터의 구조를 나타내는 그림이다.
도 3은 본 출원의 실험예 1-2-2에 따른 JAK3 넉아웃 유전자가위 발현 벡터 시스템의 도입 및 작동여부를 형광현미경으로 검증한 사진이다.
도 4는 본 출원의 실험예 1-2-3에 따른 JAK3 넉아웃 유전자 발현 벡터시스템의 검증을 유세포 분석으로 검증한 결과이다.
도 5는 본 출원의 실험예 1-2-4에 따른 JAK3 넉아웃 유전자 발현 벡터시스템의 검증을 T7E1 분석으로 검증한 결과이다.
도 6는 본 출원의 실험예 1-3의 방법를 도시하는 그림이다.
도 7는 본 출원의 실험예 1-3에 따른 JAK3 넉아웃 유전자 발현 벡터시스템에 의한 돌연변이를 나타내는 그림이다.
도 8는 본 출원의 실험예 1-4에 따른 JAK3 넉아웃 유전자 발현 벡터시스템의 검증을 아미노산 서열 분석으로 검증한 결과이다.
도 9 내지 11은 본 출원의 실험예 1-5에 따른 JAK3 넉아웃 유전자 발현 벡터시스템의 검증을 핵형 분석으로 검증한 결과이다.
도 12는 본 출원의 실시예 1에 따른 JAK3 유전자 결손된 형질전환 복제 미니돼지 생산 과정을 나타내는 도면이다.
도 13 및 14는 본 출원의 실시예 1에 따른 JAK3 유전자 결손된 형질전환 복제 미니돼지 생산 과정 및 생산된 미니돼지를 나타내는 사진이다.
도 15는 본 출원의 실험예 2-1에 따른 JAK3 유전자 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 JAK 3 유전자 결손을 확인한 도면이다.
도 16는 본 출원의 실험예 2-2-1에 따른 결과를 나타내는 도면으로, 구체적으로 JAK3 유전자 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 mRNA를 RT-PCR로 분석한 결과이다.
도 17는 본 출원의 실험예 2-2-2에 따른 결과를 나타내는 도면으로, 구체적으로 JAK3 유전자 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 mRNA를 western blot으로 분석한 결과이다.
도 18 및 19는 본 출원의 실험예 3-1에 따른 결과를 나타내는 것으로, 구체적으로 JAK3 유전자 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 흉선(Thymus), 비장(Spleen), 림프절(submandibular or mesenteric lymph node)의 확인한 결과이다.
도 20는 본 출원의 실험예 3-2에 따른 결과를 나타내는 것으로, 구체적으로 JAK3 유전자 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 흉선과 비장의 조직 형성을 면역조직염색으로 확인한 결과이다.
도 21 및 22는 본 출원의 실험예 3-3에 따른 결과를 나타내는 것으로, 구체적으로 비장 조직의 면역조직염색 및 유세포 분석 결과이다.
도 23 및 24는 본 출원의 실험예 3-5에 따른 결과를 나타내는 것으로, 구체적으로 면역세포 형성을 V(D)J recombination 검출 방법으로 확인한 결과이다.
도 25는 본 출원의 실험예 4-1에 따른 결과를 나타내는 것으로, 구체적으로 JAK3 유전자가 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 생존율 분석 결과이다.
도 26는 본 출원의 실험예 4-2에 따른 결과를 나타내는 것으로, 구체적으로 JAK3 유전자가 결손된 형질전환 복제 미니돼지에서의 암세포 생장 확인한 결과이다.
도 27 및 28은 본 출원의 실험예 4-3에 따른 결과를 나타내는 것으로, 구체적으로 JAK3 유전자가 결손된 형질전환 복제 미니돼지에 이식된 암세포, 조직에 면역세포 유입 면역조직염색, RT-PCR로 확인한 결과이다.
도 29는 본 출원의 실험예 5-1에 따른 결과를 나타내는 것으로, 구체적으로 JAK3 유전자가 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 혈액 분석 결과이다.
도 30 및 31은 본 출원의 실험예 5-2에 따른 결과를 나타내는 것으로, 구체적으로 JAK3 유전자가 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 신장 조직 내 대식세포 관련 유전자의 발현을 확인한 결과이다.
도 32 및 33은 본 출원의 실험예 5-3에 따른 결과를 나타내는 것으로, 구체적으로 JAK3 유전자가 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 신장 조직 내 대식세포 관련 유전자 중 CD68의 발현을 확인한 결과이다.
도 34 내지 36는 본 출원의 실험예 5-4에 따른 결과를 나타내는 것으로, 구체적으로 JAK3 유전자가 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 신장 조직 내 대식세포의 분극화 관련 유전자 (M1, M2)의 발현 및 Cytokine 발현을 확인한 결과이다.
도 37 내지 도 44는 본 출원의 실험예 6-1에 따른 결과를 나타내는 것으로, 구체적으로 JAK3 넉아웃 형질전환 복제 미니돼지 (JAK3 knock out; JAK3 KO)의 폐/내장 이상을 비교, 확인한 결과이다.
도 45는 본 출원의 실험예 6-2에 따른 결과를 나타내는 것으로, 구체적으로 JAK3 넉아웃 형질전환 복제 미니돼지 (JAK3 knock out; JAK3 KO)의 내장 이상을 비교, 확인한 결과이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험예 1: JAK3 유전자가 결손된 미니돼지 체세포 구축
미니돼지의 JAK3 유전자에 혼성화될 수 있는 gRNA의 선정 및 이를 적용한 JAK3 유전자가 결손된 미니돼지 체세포를 제작하여 유용성을 확인하였다.
실험예 1-1. JAK3 유전자에 혼성화되는 gRNA 선정
돼지 JAK3 유전자의 4개 엑손 중 단백질 발현에 관련된 암호화 영역이 있는 2번 엑손을 타켓으로 유전자가위(CRISPR/Cas9)에 결합하는 gRNA를 디자인하였다.
구체적으로 도 1에서 확인되는 바와 같이 돼지 JAK3 유전자의 4개 엑손 중 2번 엑손의 유전자에 혼성화되는 gRNA 들 (sgRNA #1, sgRNA #2)을 선정/제작하였고, 이들은 각각 서열번호 1 및 서열번호 2와 같다.
실험예 1-2. JAK3 유전자에 혼성화되는 gRNA의 유용성 평가
실험예 1-1. 에서 선정/제작된 gRNA를 활용한 유전자가위(CRISPR/Cas9) 시스템을 미니돼지 체세포에 도입시킨 후 gRNA의 유용성을 확인하였다.
실험예 1-2-1. JAK3 넉아웃 유전자가위 발현 벡터 시스템
JAK3 넉아웃 유전자 가위 시스템은 총 3개의 벡터의 Surrogate Reporter system으로 제작하였다. 구체적으로, gRNA가 혼성화되는 JAK3 염기서열의 상류(upstream)에 mRFP1(monomeric red fluorescent protein1) 코딩 서열이 위치하고, sgRNA가 혼성화되는 JAK3 염기서열의 하류(downstream)에 EGFP(enhanced green fluorescent protein) 코딩 서열이 위치하는 리포터(reporter) 벡터를 제작하였다. 그리고, 실험예 1-1. 에서 선정된 gRNA를 암호화하는 서열이 위치하는 gRNA 벡터를 제작하였고, gRNA 벡터로부터 발현되어 gRNA가 혼성화되는 JAK3 염기서열에 결합된 gRNA를 인식하여 JAK3의 표적서열을 자르기 위한 Cas9 단백질을 코딩하는 서열을 삽입하여 Cas9 벡터를 제작하였다 (gRNA 별로 각 sgRNA #1 및 sgRNA #2, 도 2 참조).
JAK3 유전자 타겟 gRNA 벡터는 CRISPR을 사용하여 JAK3 암호화 영역에서 최대 넉아웃 효율을 달성하기 위해, 보다 높은 프레임 외부 점수를 갖는 4 개의 표적 특정 부위를 공개되어 있는 desing tools을 통해 생성하였으며 (http://crispr.mit.edu; https://crispr.cos.uni-heidelberg.de/; http://www.rgenome.net/cas-designer/) 이렇게 디자인된 Cas9, gRNA 및 RGS 리포터 벡터를 툴젠(ToolGen, Inc. Seoul, Korea)에서 합성 및 구입하였다.
본 발명의 유전자가위 시스템이 도입된 세포에서는 mRFP(적색형광)이 발현되므로, 본 발명의 유전자가위 시스템이 세포에 도입되었는지 여부를 검증할 수 있다. 한편, Cas9 벡터에서 발현된 Cas9 단백질에 의해 리포터 벡터에 포함된 JAK3 표적서열이 절단될 경우, 본 발명의 유전자가위 시스템이 도입된 세포에서 EGFP(녹색형광)이 발현된다. 따라서, 녹색형광의 발색 여부를 확인함으로써, 본 발명의 유전자가위 시스템이 정상적으로 작동하는지 여부를 검증할 수 있다.
실험예 1-2-2. JAK3 넉아웃 유전자가위 발현 벡터 시스템 검증 - 형광현미경 분석
JAK3 넉아웃 형질전환 복제 미니돼지 생산을 위하여, 체세포 복제를 위한 정상 미니돼지 공여세포주에, 실험예 1-2-1. 에서 제조한 JAK3 넉아웃 유전자가위 발현 벡터 시스템을 도입시킨 후, 벡터 시스템의 도입 및 작동 여부를 형광현미경 분석을 통하여 확인하였다.
구체적으로, 공여세포는 KSP 미니돼지(2 일령, 수컷) 신장 조직에서 얻었으며, 신장 조직을 분리할 때까지 10%(v/v) 페니실린/스트렙토 마이신(Penicillin/Streptomycin; Invitrogen)이 함유된 DPBS 세척 완충액에 넣어 냉장 상태로 보관하였다. 이후 멸균된 수술도구(surgical blade)를 이용하여 신장 조직을 작게 만들고 0.1% 젤라틴(Sigma-Aldrich)으로 전처리한 100-mm 배양접시(culture dish)에 올린 후 10% FBS(fetal bovine serum)(16000-044, GIBCO, Carlsbad, CA, USA), 10ng/㎖ basic fibroblast growth factor(bFGF)와 1% 페니실린/스트렙토 마이신이 함유된 DMEM(Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium)(Invitrogen)에서 공여세포를 충분히 얻을 때까지 배양하였다.
Amaxa TM P3 primary cell 4D Nucleofector TM [0091] X Kit L(Lonza)의 버퍼 100㎕에 1㎍ Cas9, 1㎍ sgRNA 및 2㎍ RGS 리포터 플라스미드 DNA와 2Х106개의 공여세포를 미리 혼합한 후, 4D Nucleofector TM (Lonza)의 프로그램 EH-113을 사 용하여 전기천공법(electroporation)에 의해 벡터 시스템을 도입하였으며, 24시간 후, 형광 현미경(Leica)으로 형광이 발현되는 세포를 확인하였다.
그 결과, 실험예 1-2-1. 에서 제조한 JAK3 넉아웃 유전자가위 발현 벡터 시스템을 도입한 공여세포주에서는 적색형광 및 녹색 형광이 모두 검출되었다. 따라서, 본 발명의 벡터 시스템이 공여세포주에 도입될 수 있고, 공여세포주에서 작동 가능함을 확인하였다(도 3).
실험예 1-2-3. JAK3 넉아웃 유전자가위 발현 벡터 시스템 검증 - 유세포 분석
JAK3 넉아웃 유전자가위 발현 벡터 시스템 검증을 위하여, 체세포 복제를 위한 정상 미니돼지 공여세포주에, 실험예 1-2-1에서 제조한 JAK3 넉아웃 유전자가위 발현 벡터 시스템을 도입한 후, 벡터 시스템의 도입 및 작동 여부를 확인하기 위해, 유세포 분석을 수행하여, 전체 세포 중 적색형광 및 녹색형광이 발현되는 세포를 정량적으로 확인하였다.
구체적으로, 유세포 분석을 위하여, 공여세포에 적색형광, 녹색형광, empty 벡터를 형질주입하여 대조군 (control)을 만든 후, 적색형광과 녹색형광이 겹치는 파장대(wavelength band)를 보상(compensation) 과정을 통해 제거하고, 각각의 고유 형광이 측정되는 세팅값을 얻었다. 이후 셋팅된 조건하에서 유전자 가위 벡터 시스템이 도입된 공여세포를 이용하여 형광 발현을 확인하였다.
그 결과, 형질전환되지 않은 공여세포주에 비해 실험예 1-2-1에서 제조한 JAK3 넉아웃 유전자가위 발현 벡터 시스템을 도입한 공여세포주에서는 유전자가위의 활성이 확인되었다 (gRNA 별로 각 sgRNA #1 및 sgRNA #2). 따라서, 본 발명의 벡터 시스템이 공여세포주에 도입될 수 있고, 공여세포주에서 작동 가능함을 확인하였다 (도 4).
실험예 1-2-4. JAK3 넉아웃 유전자가위 발현 벡터 시스템 검증 - T7E1 분석
JAK3 넉아웃 유전자가위 발현 시스템의 검증여부를 확인하기 위하여, 실험예 1-2-3에서 제조한 JAK3 넉아웃 유전자가위 발현 벡터 시스템이 도입된 미니돼지 공여세포주에 대하여 T7 엔도뉴클레아제 어세이 (T7E1 분석)를 수행하여 선별된 돌연변이가 생성되었는지 여부를 확인하였다.
구체적으로, 돌연변이 후보 (gRNA 별로 각 sgRNA #1 및 sgRNA #2) 및 대조군 세포주로부터 게노믹(genomic) DNA를 분리한 후, 돌연변이 예상 부위를 PCR을 수행하여 증폭하였다. 상기 증폭된 PCR 산물들로부터 대조군 세포주 유래 산물을 각각의 돌연변이 유래 산물들과 섞어준 뒤, 최초 95℃ 에서부터 25℃까지 초당 2℃씩 낮춰 2형이중가닥(heteroduplex) 모양을 형성시키고, 형성된 2형이중가닥에 T7E1 2 유닛(unit)을 20분간 처리한 뒤 2% 아가로스 겔(agarose gel)에 전기영동하여 이를 확인하였다.
그 결과, T7E1 이 처리되지 않은 대조군, sgRNA #1 및 sgRNA#2은 모두 DNA 혼합 생산물 (DNA mixture product)의 절단이 확인되지 않으나, T7E1이 처리된 sgRNA #1 및 sgRNA#2은 DNA 혼합 생산물의 절단이 확인되었다 (도 5).
상기의 결과들을 통해 sgRNA#2가 더 높은 효율로 유전자를 결손 시킬 수 있음을 확인하였고, 이하에서는 sgRNA#2를 사용하여 실험하였다.
실험예 1-3. JAK3 유전자가 결손된 형질전환세포주 준비 및 유전자 결손 확인
체세포 복제를 위한 정상 미니돼지 공여세포주에 JAK3 넉아웃 유전자가위 벡터 시스템을 도입한 후 단일세포 (single cell)로 배양한 형질전환 미니돼지 공여세포주에 대해 염기서열분석법(sequencing analysis)을 수행하여, JAK3 넉아웃 유전자가위 벡터 시스템에 의해 gRNA가 혼성화되는 JAK3 염기서열에 돌연변이가 발생하였는지 확인하였다.
구체적으로, 녹색형광이 발현되는 세포를 FACSAria III 분류기(BD Biosciences)를 사용하여 성장 배지를 포함하는 96 웰 플레이트로 단일 세포로 분류하였다. 분류 2주 후, 96 웰 플레이트에서 선택된 단일 콜로니 세포를 계대배양 과정을 통해 6 웰 플레이트에서 배양한 다음, 각각의 클론 세포주 일부를 DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen)를 이용하여 게놈 DNA 추출하였다. JAK3 유전자의 sgRNA 주변에서 PCR 산물 크기가 500bp 정도 되도록 프라이머를 디자인하고 PCR(Applied Biosystems) 장비를 통해 유전자를 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물을 전 기영동을 통해 확인한 후 gel elution 과정을 통해 회수하였다. Indel (mutation, insertion 등 염기서열 상의 변화) 형태를 확인하기 위해 PCR 증폭에 사용된 프라이머(표 1)를 이용하여 gel elution으로 회수한 DNA의 염기 서열을 확인하였다 (도 6).
프라이머 (Product size 500bp) | 프라이머 염기서열 (5'->3') |
|
JAK3 | Forward | GCAGTATCGCTGCTCCCTAC |
Reverse | GAGAGCATCCCTTTCCACTG |
그 결과 표 2 및 도 7에서 확인되는 바와 같이, 공여세포주 중 #2, #7, #11, #12, #13 및 #17에서 sgRNA가 혼성화되는 JAK3 염기서열과 대응되는 염기서열 내에 돌연변이가 발생하는 것을 확인하였다.
구분 | 염기서열 (5'->3') | 서열번호 |
gRNA 혼성화 JAK3 서열 | C CCTCGGGGCC CTGGA CCCCC ACAGCGCCTA T | |
#2 세포주 JAK3 서열 (+1bp) | TCTGCTGCCC CCTCGGGGCC CTGGAACCCCC ACAGCGCCTA TCCTTCTCCT TTGGGGACC | 서열번호 4 |
#7 세포주 JAK3 서열 (-17bp) | TCTGCTGCCC CCTCGGGGCC CTA TCCTTCTCCT TTGGGGACC | 서열번호 6 |
#11 세포주 JAK3 서열 (+1bp) | TCTGCTGCCC CCTCGGGGCC CTGGAACCCCC ACAGCGCCTA TCCTTCTCCT TTGGGGACC | 서열번호 4 |
#12 세포주 JAK3 서열 (+1bp) | TCTGCTGCCC CCTCGGGGCC CTGGAACCCCC ACAGCGCCTA TCCTTCTCCT TTGGGGACC | 서열번호 4 |
#13 세포주 JAK3 서열 (-1bp) | TCTGCTGCCC CCTCGGGGCC CTGGA CCCC ACAGCGCCTA TCCTTCTCCT TTGGGGACC | 서열번호 5 |
#17 세포주 JAK3 서열 (-17bp) | TCTGCTGCCC CCTCGGGGCC CTA TCCTTCTCCT TTGGGGACC | 서열번호 6 |
실험예 1-4. JAK3 유전자가 결손된 형질전환세포주의 검증 - 아미노산 서열 분석
실험예 1-3에서 확인한 gRNA가 혼성화되는 JAK 염기서열 내의 염기서열 돌연변이가 JAK3 단백질의 구조에 어떻게 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 형질전환 공여세포주의 돌연변이 JAK3 코딩 서열에 의해 암호화되는 아미노산을 분석하였다.
그 결과, gRNA가 혼성화되는 JAK3 염기서열이 돌연변이된 #7(-17bp) (도 8) 형질전환 공여세포주에서, 염기서열 결손에 의하여, JAK3를 코딩하는 아미노산 코돈(codon)이 변화하였고 (frameshifting), 조기 종결 코돈 (premature stop codon)이 생성되었음을 확인하였다. 종결 코돈은 도 8에 빨간색으로 표시하였다.
실험예 1-5. JAK3 유전자가 결손된 형질전환세포주의 검증 - 핵형분석
실험예 1-3에서 확인한 gRNA가 혼성화되는 JAK3 염기서열 내의 염기서열 돌연변이가 형질전환 미니돼지 공여 세포주의 상염색체 및 성염색체에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 형질전환 공여세포주의 염색체 핵형을 G-banding 핵형분석 방법을 통해 분석하여 염색체의 안정성을 검사하였다.
구체적으로, 세포가 70 내지 80%의 confluency가 되었을 때 37의 5% CO2 배양기에서 50분 동안 0.1㎎/㎖ 콜세미드(colcemid, Sigma-Aldrich)로 처리하여 중기 단계에서 세포 분열을 정지시켰다. 분열이 정지된 세포에 0.06M KCl(Sigma-Aldrich) 저삼투압 용액으로 20℃에서 10분간 처리하여 세포를 팽창시키고 메탄올/아세트산 (3:1) 정착액에 30분 동안 고정시킨 후, 150g에서 10분간 원심 분리하였다. 고정 절차를 3번 반복한 후, 고정된 세포를 유리 슬라이드 위에 떨어 뜨려 65에서 밤새 공기 건조시켰다. 마지막으로 0.25% 트립신(trypsin)으로 전처리한 후, Giemsa 염색을 통해 염색체를 염색하여 핵형을 확인하였다.
그 결과, sgRNA가 혼성화되는 JAK3 염기서열이 돌연변이된 #7(도 9) 번 세포주의 상염색체 및 성염색체는 정상 염색체상을 나타냄을 확인하여, 형질전환 미니돼지 공여세포주에서 정상적인 이배체의 핵형이 유지됨을 확인하였다.
실험예 1-6. JAK3 유전자가 결손된 형질전환세포주의 검증 - off-target 분석
본 발명의 sgRNA#2가 JAK3 이외의 염기서열에서 작용하는지를 확인하기 위하여 off-target 분석을 수행하였다.
구체적으로, JAK3 넉아웃 형질전환 복제 미니돼지의 압사한 개체 유래 세포를 사용한 것을 제외하면 Sanger sequencing 및 Deep sequencing 방법으로, JAK3 표적서열 (sgRNA가 혼성화되는 JAK3 염기서열과 상보적인 서열)과 유사한 서열을 포함하는 유전자에 대한 염기서열을 표 3의 프라이머를 이용하여 분석하였다.
Gene Name | Primer sequence (5'->3') | |
JAK3 On-target (1th PCR) |
F: AGCCTGCAGTATCGCTGCTCC R: GCTCTCAATCTGGGTTCCACATA |
|
JAK3 On-target(Adaptor, Nest PCR) | F: ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCAACTGAGGTGCTGTCT CTTTCTGTGTCC R: GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCTTCTAGAGACCCA CTCACCACTGG |
|
JAK3 off-target (1th PCR) | 7SK | F: CGGGCTTTCTGTTTTCTGAC R: ATTCTGGAGGCAAGACAAGC |
NA1 | F: ACGTAAATGGGGAAGACTGC R: AAAGGGCTTTGGTGGAATCT |
|
NA2 | F: TCCTGTGCGGTTGGATTTTCAGR: TCCTCCTAGCTTCGACCTCA | |
NA3 | F: TGGGGATCAGTTTCCTTTTGR: AGAGGTTTTCAGACTCTAGAGCCCA | |
NDUFA12 | F: CTTACATCTTCACATTTCAGAGCCCR: ACCTTTTCTGTGAGGGATGC | |
SARDH | F: CTCAGAGGTGGAGCAGGTGTR: ACGTGCCCAGAGACCAGCTGTCC | |
TMEM9 | F: TCTGAAACAGGCATCTGTGCR: TGCTGGCCATGAGCCTAAACCAAC | |
Unknown1 | F: TCCTCTCCCATTTTACTCCCTTCATTR: TTGCTGGGAGCTAAGGAGAA | |
Unknown2 | F: CACAAGTGCTCAAAGGCAAAR: TCTTGCTGCTTTCAAGATTGTTCC | |
Unknown3 | F: TTGGGAGCTGAGTTTTGAGCR: GCTCAAGGGCCTGCTAATGG | |
JAK3 off-target adaptor (2nd PCR) | 7SK | F: ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCGGGCTTTCTGTT TTCTGACATCGGTCA R: GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTCTGGAGGC AAGACAAGCAAGCAG |
NA1 | F: ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTCACAGTTCAG TTTTGGACCTGTTAACTAA R: GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTGATGTTCAT TAAGACAATTACCCAGCTTAAATTTGC |
|
NA2 | F: ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTGCTCAGTGATGGAGTTTGCTTATCTATTTA R: GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGATATGGGTCC AAACCATTTTACAATCTTG |
|
NA3 | F: ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGACCAGGCCCGACTGAAATAAAGCCC R: GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAGGCCCTAGA TCTCCATGAGACCTTCAAAAG |
|
NDUFA12 | F: ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCATTCCTGACATCTTCTTCCTGTGCTC TGAR:GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGGGAACATGGAACCGCTCTGGCATCTCCA | |
SARDH | F: ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCTTGGCCTCTGACTGCAGACATCTGACTGT R: GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTTTCCTGCAT GATGTTCTGGAGGGTTTTG |
|
TMEM9 | F: ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCAGGAAGACAAGGGTCT GCCTGCGGG R: GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCTGCCCAGC CCTGGAGCTGTGTC |
|
Unknown1 | F: ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCACAGAATCCAAACCCCTACAGCTACTCA R: GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGGAGAAGTAA TGACAAATTCACGTGAGG |
|
Unknown2 | F: ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTGCTGCTCGCTGGCCTTGGCC R: GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCCTCCTTGGA GTTCATTGAACTTTCTGAAGA |
|
Unknown3 | F: ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGCAGCAGAAGAGCAGGA GGTCTCTGTGG R: GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTTTAATCCTGGACAGAGCAGTAATGGCGT |
|
RAG2 On-target (1th PCR) |
F: TTCTTTACCCAGCTGCCTGGATTT R: CTTCAGTTTGAGATGGTTATGCTTT |
|
RAG2 On-target(Adaptor, Nest PCR) | F: ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTTTAACAGGCTT TTTATGTGTGAGGGATCTAAACA R: GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGCCAGCCTTT TTGGCC AAAGAAGAAGA |
|
RAG2 off-target (1th PCR) | FGF14 | F: CCACCACGAATAGAGGGATG R: CCCCACTTTGGATGCTCTTA |
MACF1 | F: TATACCCGGAAGTGGGATTG R: GCCATCGGGTATTATGGAAA |
|
NA | F: CGGAAAGAAAGGTAAACCCTCGAGR: AAATATTTTAAGAGTTCCCTGGTGGCT | |
SRBD1 | F: TTGTGGTGGTATGAACTGAACCR: TCCCTTCCACAGAAGGGTATTATT | |
U6 | F: GCAAAATATTGGGAAACATGGR: GCAACCTACACCACAGCTCA | |
RAG2 off-target adaptor (2nd PCR) | FGF14 | F: ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCACCACGAATA GAGGGATGTAAACCTTCGTT R: GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTTTAAATAGC TGCACA GTATGGGTTCTTTCCG |
MACF1 | F: ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCGGAAGTGGGA TTGCTAGATCCTGTGGTA R: GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATCGGGTATT ATGGAAAGGTGTTCAACATCACTA |
|
NA | F: ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTCCATTCATGTGAATTTCAAGAACAGGCAA AACTG R: GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGCTCTAGTTA CGGCTGTGGTGCGGGTTG |
|
SRBD1 | F: ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACCCTCAGTATCTATGAGGCATGCCTA R: GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCCCTTCCACA GAAGGGTATTATTTGAGTAGAATAT |
|
U6 | F: ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCAAAATATTGGGAAACATGGATATAAGGC R: GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCAACGCCGG ATCGTTAACCCACTGAGCA A |
그 결과 표 4및 도 10, 11에서 확인되는 바와 같이 JAK3 서열 이외의 부분에서는 sgRNA#2가 작용하지 않음을 알 수 있어, 본 발명의 sgRNA는 JAK3 특이적 작용하는 것을 알 수 있다.
실시예 1: JAK3 유전자 결손된 형질전환 복제 미니돼지 생산
실험예 1-3에서 제작한 JAK3 넉아웃 형질전환 공여세포주 중, embryo를 이용한 체세포 핵 이식(SCNT; Somatic cell nuclear transfer)을 수행하였을 때, 배아(embryo) 발달률이 더욱 우수한 것으로 확인된 #7번 공여세포주를 사용하여 JAK3 넉아웃 형질전환 복제 미니돼지를 생산하였다.
이를 위해 도 12에서 확인되는 방법으로 수행되었다.
먼저, JAK3 넉아웃 형질전환 #7 공여세포주의 체세포의 핵을 적출된 난자(enucleated egg)에 형질전환하였다.
구체적으로, 체외성숙(IVM; in vitro maturation) 후, SCNT를 위해 눈에 보이는 최초의 극체가 있는 성숙 난자를 선택하였다. 4㎎/㎖ BSA, 75㎍/㎖ 페니실린 G, 50㎍/㎖ 스트렙토마이신 황산염 및 7.5㎍/㎖ CB가 함유된 DPBS에서 난모세포(cumulus cells)가 제거된 난모세포를 피펫을 절단하여 슬릿을 만들고 약 10%(NT-88-V3, Nikon-Narishige)가 장착된 자동화된 위상차현미경(DMI 6000B, Leica) 하에서 난모세포로부터 세포질 및 제 1 극체를 제거하였다. 공여세포는 배지를 바꾸지 않고 3일동안 배양시켜 세포주기가 G0 내지 G1 단계에서 동기화 되도록 유도하였으며, 난모세포는 전기 융합될 때까지 IVC 배지에 넣어 5% CO2, 38.5℃인큐베이터에서 유지하였다. 단일 공여세포/난모세포는 0.1mM MgSO4·7H2O와 0.01% PVA를 함유하는 280mM 만니톨(mannitol, SigmaAldrich)로 구성된 융합 배지에서 평형을 이루도록 한 다음, 부착된 두 개의 평행 전극(직경 100μm, CUY 5100- 100, Nepagene) 사이에 넣었다. 전기 세포 융합 생성기를 사용하여 23V의 하나의 직류 펄스에 의해 50μsec 동안 활성화시킨 후, 5% CO2 및 38.5℃의 인큐베이터에 넣었다. 2시간 후, 위상차 현미경 하에서 완전히 융합된 난모세포 쌍을 선택하고, 0.1mM MgSO4·7H2O, 0.1mM CaCl2·2H2O, 0.5mM HEPES 및 0.01% PVA가 함유된 10㎕ 280mM 만니톨 용액으로 중첩된 1mm 갭 와이어 챔버에 옮긴 후, 전기 퓨전 생성기(electro cell fusion generator)를 사용하여 110V DC로 50μsec 동안 활성화시켰다. 전기적 융합으로 활성화된 난모세포를 화학적으로 활성화시키기 위해 50nM 트리코스타틴 A(TSA)가 첨가된 배지에 넣고 4시간 동안 5% CO2 및 38.5℃의 인큐베이터에서 유지하였다. 4시간 후, 활성화된 배아를 50nM TSA가 보충된 IVC 배지로 옮기고 20시간 동안 배양을 지속하였다. 20 시간 후, SCNT 배아를 IVC 배지에서 세척하고 5% CO2 및 38.5℃인큐베이터에 넣었다. 그 후, 분열 및 배반 포기 형성을 각각 2일 및 6일째에 평가하고 대리모에 이식을 준비하였다.
그 다음, JAK3 넉아웃 형질전환 #7번 공여세포주의 체세포 핵으로 형질전환된 난자를 대리모에 이식하였다.
구체적으로, 융합된 복제란은 500㎕의 배양액이 들어있는 4 웰 플레이트에서 1 내지 2일간 배양한 후, 같은 배양액 2㎖이 들어있는 동결튜브에 복제란을 넣고 39로 가온되어 있는 수정란 운송 장치(Embryo transfer kit, Minitube, USA)로 수정란 이식 장소까지 운송하였다. 복제란 이식을 위한 대리모는 발정이 시작된 개체를 선별하여 준비하였고, 대리모를 세척 후, 펜토탈소듐(Pentothal Sodium, 중외제약) 0.5g을 귀정맥에 투여하여 일시 마취시켰다. 마취된 대리모를 수술대에 고정한 후, 5% 이소플로레인(Isoflurane)을 공급하여 흡입마취를 실시하였다. 마취된 대리모는 복중선을 따라 약 5cm가량 절개 후 자궁과 난소를 체외로 노출시켜 준비하였다. 이때 복제란을 카테타(Tom cat catheter, Monoject, USA)로 흡입하여 난관의 협부까지 밀어 넣어 복제란을 이식하였다. JAK3 넉아웃 형질전환 복제돼지 생산을 위하여 2마리의 대리모에 총 600개의 복제란을 이식하였다. 복제란 이식이 완료된 대리모는 30일 초음파를 이용하여 임신 검정을 실시하였고, 임신이 확인된 개체는 114일의 1-2일전에 자궁절제술(hysterectomy)되어 산자를 얻었다.
대리모는 SPF(Special Pathogen Free) 시설에서 미니돼지의 특성을 고려해 바닥제는 플라스틱을 이용하여 미니 돼지의 움직임과 동선을 편하게하여 사육하였으며, 사육케이지 바닥부분에 온도 유지용 패드 설치하여, 미니돼 지 자돈의 일정한 온도 유지에 도움을 주었다. JAK3 넉아웃 형질전환 복제 미니돼지는 출산 후 2일령부터 물 500㎖에 세이프밀키 70g, 초유스틱 1g 및 바이타민 1g을 넣은 사료를 2시간 간격으로 급이하는 인공포유를 실시하였으며, 2회에 걸쳐 철분 주사 접종을 실시하였다. 미니돼지 출산 후, 3개월간 개체별 체중 및 사료 공급량을 작성하였으며, 미생물 모니터링을 통해 사육하는 JAK3 넉아웃 미니돼지의 체계적인 유지 관리를 수행하였다.
그 결과, 도 13 및 14에서 확인되는 바와 같이, JAK3 넉아웃 미니돼지를 생산할 수 있었다.
실험예 2: JAK3 유전자 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 JAK 3 유전자 분석
실험예 2-1. JAK3 유전자 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 JAK 3 유전자 결손 확인
생산한 복제 미니돼지가 JAK3가 넉아웃된 형질전환 미니돼지인지 확인하기 위하여, JAK3 넉아웃 형질전환 복제 미니돼지의 염기서열 분석하였다.
구체적으로, 실시예 1에서 생산된 JAK3 넉아웃 형질전환 복제 미니돼지 개체 유래 세포 및 JAK3 넉아웃 형질전환 #7번 공여세포주를 사용한 것을 제외하면, 실시예 2-1의 방법과 동일한 방법으로, 염기 서열을 분석하였다.
그 결과, 도 15에서 확인할 수 있는 바와 같이, JAK3 넉아웃 형질전환 복제 미니돼지의 유산된 개체, 압사한 개체 및 생존한 개체 모두, gRNA가 혼성화되는 JAK3 염기서열은 형질전환 공여세포주 #7번의 염기서열과 동일함을 확인하여 (-17bp), 생산한 복제 미니돼지는 JAK3 넉아웃 형질전환된 복제 미니돼지임을 확인하였다.
실험예 2-2. JAK3 유전자 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 mRNA 분석
실험예
2-2-1. JAK3 유전자 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 mRNA 분석 (RT-PCR)
실시예 1에서 생산된 JAK3 넉아웃 형질전환 복제 미니돼지의 비장 또는 간에서의 JAK3의 발현을 확인하기 위하여, 정상 개체와 실시예 1에서 생산된 JAK3 넉아웃 형질전환 복제 미니돼지의 비장 및 간 조직에서 mRNA를 추출하여 이들의 발현을 분석하였다.
구체적으로, 제조사에서 제공된 방법에 따라 RNeasy plus mini kit(QIAGEN)을 사용하여 세포 및 조직에서 total RNA를 추출하였다. Total RNA(1㎍)를 PrimeScript® RT 시약 키트(TAKARA)를 사용하여 cDNA 합성에 사용하였으며, 유전자의 상대적 발현 수준은 SYBR Premix Ex Taq II(TAKARA)를 사용하여 실시간 RT-PCR로 측정하고, StepOnePlus Real-Time PCR System(Applied Biosystems)으로 분석하였다. 정량적 RT-PCR 분석을 위한 반응 변수는 95℃에서 10 분간, 95℃에서 30초, 62℃에서 30초, 72℃에서 30초, 그리고 72℃에서 5분간 최종 cycle 단계를 40 회 반복하였다. 비교 분석을 위해, mRNA 발현 수준을 GAPDH로 정량화한 다음 fold-change로 나타내었다. WT를 대조군 ΔCt(CΔCt) 값으로 사용하였고, 샘플 델타 Ct(SΔCt) 값은 GAPDH와 표적 유전자의 Ct 값 사이의 차이로부터 계산하였다. 샘플과 대조군 간의 상대적 유전자 발현 수준은 2-(SΔCt-CΔCt) 공식을 사용하여 결정하였다.
그 결과, JAK3 넉아웃 형질전환 복제 미니돼지에서 JAK3의 발현은 관찰되지 않았다(도 16).
실험예 2-2-2. JAK3 유전자 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 mRNA 분석 (western blot)
실시예 1에서 생산된 JAK3 넉아웃 형질전환 복제 미니돼지의 비장 또는 간에서의 JAK3의 발현을 확인하기 위하여, 정상 개체와 실시예 1에서 생산된 JAK3 넉아웃 형질전환 복제 미니돼지의 비장 조직에서 mRNA를 추출하여 이들의 발현을 분석하였다.
Western blot 분석을 위해 30-60μg의 protein lysates를 8-12 % sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels에서 분리하고 0.45μm 니트로 셀룰로스 막(nitrocellulose membranes)으로 옮겼다 (Cat # HAWP04700, EMD Millipore, Burlington, MA, USA). 멤브레인(membranes)을 10mM Tris pH 7.4, 150mM NaCl 및 0.02 % Tween-20 (TBST)에서 5 % 탈지유(skim milk, Cat # 232100, BD Biosciences) 또는 소혈청 알부민(Bovine serum albumin, Cat # A9647, Sigma-Aldrich)으로 blokcing 한 후, 이들은 1 차 항체 (JAK3, Cat #ARP54306_P050, Aviva Systems Biology, San Diego, CA, USA, 1:1000; pSTAT5, Cat #71-6900 , Thermo Fisher Scientific, 1:1000; STAT5, Cat #66459-1-Ig, Proteintech, Manchester, UK, 1:1000; GAPDH, Cat #LF-MA0038, AB Frontier, Seoul, Republic of Korea, 1:2000)와 함께 4℃에서 밤새 incubation 한다. 멤브레인을 TBST로 3 회 세척한 후 TBST에서 5 % 탈지유로 차단하고 horseradish peroxidase가 결합되어 있는 2차 항체를 이용하여 실온에서 1 시간 동안 incubation 한다. 블롯을 TBST로 세척한 후 제조업체의 지침에 따라 SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate (Cat # 34580, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 항체 결합을 확인한다. 결과는 최소 세 번의 독립적인 실험을 통해 확보하였다.
그 결과, JAK3 넉아웃 형질전환 복제 미니돼지에서 JAK3의 발현은 관찰되지 않았다(도 17).
실험예 3: JAK3 유전자가 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 표현형 분석 (1)
실험예 3-1. 흉선(Thymus), 비장(Spleen), 림프절(submandibular or mesenteric lymph node)의 확인
실시예 1에서 생산된 JAK3 넉아웃 형질전환 복제 미니돼지의 흉선, 비장 림프절을 확인하였다.
구체적으로, JAK3가 넉아웃 되지 않은 정상적인 개체 (wild type; WT), RAG2 넉아웃 형질전환 복제 미니돼지 (RAG2 knock out; RAG2 KO) 및 실시예 1의 JAK3 넉아웃 형질전환 복제 미니돼지 (JAK3 knock out; JAK3 KO)를 해부하여 흉선(Thymus), 비장(Spleen), 림프절(submandibular or mesenteric lymph node)을 육안으로 확인하였다.
그 결과, RAG2 KO미니돼지에서는 일부 흉선(파란색 화살표)이 남아 있었지만 JAK3 KO미니돼지는 전혀 관찰되지 않았으며 비장 역시 JAK3 KO미니돼지에서 RAG2 KO 미니돼지보다 훨씬 크기와 무게 감소되어 있음을 확인함. 또한 림프절에 있어서도 RAG2 KO미니돼지에서는 턱밑(submandibular), 장간막(mesenteric) 림프절이 정상개체 보다는 감소해 있지만 관찰할 수 있었다. 하지만 JAK3 KO미니돼지들에서는 전혀 관찰되지 않음을 통해 중증복합면역결핍이 더 심하게 유도되어 있음이 확인하였다 (도 18 및 도 19).
실험예 3-2. 흉선과 비장의 조직 형성 확인 (면역조직염색)
상기 실험예 3-1에서 얻은 JAK3가 넉아웃 되지 않은 정상적인 개체 (wild type; WT), RAG2 넉아웃 형질전환 복제 미니돼지 (RAG2 knock out; RAG2 KO) 및 실시예 1의 JAK3 넉아웃 형질전환 복제 미니돼지 (JAK3 knock out; JAK3 KO)의 흉선(Thymus), 비장(Spleen)을 면역 조직염색을 통해 면역세포과 관련한 조직구조를 형성하는지 여부를 확인하였다.
면역조직염색의 경우, 조직을 pH 6.8-7.2 조건에 10 % (w/v) neutral buffered formalin (Cat # 0151, BBC Biochemical, Mount Vernon, WA, USA)으로 고정한다. 그런 다음 파라핀(paraffin)에 임베딩(embedding)하고 유리 슬라이드에 조직 절편을 3-5 μm 두께로 잘라 준비했다. 퍼옥시데이지 활성 (peroxidase activity)은 먼저 10 분 동안 1 % 과산화수소로 조직 절편을 처리함으로써 차단되었다. 그런 다음 샘플을 citrate 버퍼, pH 6.0 (Cat # ab94674, Abcam Inc., Cambridge, MA, USA) 또는 항원 검색을 위해 프로 테이나 제 K (proteinase K)로 전처리하고 BSA 용액 (Sigma-Aldrich)에서 blocking 한다. 그 후, 샘플을 세척하고 1 차 항체 (보충 표 11에 표시)와 함께 밤새 인큐베이션(incubation) 한다. 인큐베이션 후, 샘플을 다시 세척한다; 그런 다음 horseradish peroxidase가 결합되어 있는 2 차 항체와 함께 인큐베이션 한다. VECTASTAIN Elite ABC 키트 (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)가 검출에 사용되고, 3, 3-Diaminobenzidine (Cat # 54-10-00, KPL, Gaithersburg, MD, USA)을 사용하여 염색 신호를 시각화 하였다. 배경 염색은 헤마톡실린 (hematoxylin)으로 염색하였다. 모든 현미경 사진은 Leica DM2500 (Leica Microsystems)을 사용하여 획득하였다.
흉선과 비장의 조직분석의 결과 RAG2와 JAK3 KO 미니돼지 모두 정상적인 면역세포들이 형성될 수 있는 조직구조를 형성하지 못함을 확인하였다 (도 20).
실험예 3-3. 비장 조직의 면역조직염색 및 유세포 분석
상기 실험예 3-2. 에서 얻은 비장 조직에서 면역조직염색 및 적혈구를 제거하여 얻은 혈액 (peripheral blood mononuclear cell; PBMC)에서 유세포 분석 방법을 통해 B, T, NK 세포를 확인하였다.
구체적으로 표 5의 항체를 사용한 것 외에 실험예 3-2와 동일하게 수행하였고, 유세포분석은 [표 6]의 항체를 사용한 것 외에 전술한 1-2-3. 과 유사한 방법으로 아래와 같이 수행 하였다.
Antigen | Target population | Clone | Isotype | Dilution | Suppler |
CD3 | Pan-T-cells | SP7 | Rabbit IgG | 1:200 | Abcam |
CD20 | B lymphocytes | EP459Y | Rabbit IgG | 1:250 | Abcam |
CD335 | NKp46 | VIV-KM1 | Mouse IgG1 | 1:200 | Invitrogen |
IgA | Plasma cells | Goat IgA | 1:50 | BETHYL |
유세포분석은, T 및 B 림프구의 확인을 위해, 안락사시킨 WT, RAG2 KO 및 JAK3 KO 돼지의 비장 부분을 10 % FBS가 첨가된 RPMI 1640 배지에 수집하였다. 그런 다음 부드러운 MACS Dissociator (Cat # 130-093-235, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)로 잘게 썰고 20 게이지 바늘을 통해 여러 번 흡인한 다음 70um 나일론 메시 셀 스트레이너 (cell strainer)를 통과시킨다. 이어서, 비장 세포 현탁액을 Pharm Lyse 용액 (BD Biosciences)과 함께 15 분 동안 인큐베이션하여 적혈구를 용해시킨 다음, 200 x g에서 5 분 동안 펠릿화했다. 상청액을 제거한 후, 펠렛을 2 % FBS (Gibco)를 포함하는 DPBS에 재현 탁하고 세포를 자동 세포 계수기 (Cat # R1 Olympus Corporation, Tokyo, Japan)에서 계수했습니다. 이어서 세포를 재현 탁하고 200 ul의 염색 완충액에서 1 x 106 세포 분량으로 나누었다. FITC- 접합된 마우스 항-돼지 CD21, 마우스 항-돼지 CD3ε 및 마우스 항-T-2 마이코 톡신 IgG1κ (이소형 대조군) (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA)를 1 x 106 세포 당 0.5 μg으로 세포에 첨가했다. 30 분 동안 4℃에서 어둠 속에서 인큐베이션 한다. 이어서 세포를 2 회 세척하고 새로운 염색 완충액에 재현탁 시킨다. 세포는 FACS (BD)로 분석되었고 데이터는 FlowJo 소프트웨어 (FlowJo, LLC, Ashland, OR, USA)를 사용하여 분석하였다.
Antigen | Conjugate | Clone | Isotype | Dilution | Suppler |
Isotype Control | PE/Cy7 | Mouse BALB/c IgG1, κ | 1:200 | BD | |
Isotype Control | Alexa647 | Mouse BALB/c IgG2a, κ | 1:200 | BD | |
Isotype Control | PE | Mouse BALB/c IgG2b, κ | 1:200 | BD | |
CD3 | PE/Cy5 | PPT3 | Mouse IgG1 | 1:200 | Abcam |
CD4a | PE/Cy7 | 74-12-04 | Mouse BALB/c IgG2b, κ | 1:200 | BD |
CD8a | Alexa647 | 76-2-11 | Mouse BALB/c IgG2a, κ | 1:200 | BD |
CD14 | FITC | MIL2 | Mouse IgG2b | 1:200 | Bio-Rad |
CD16 | PE | G7 | Mouse IgG1 | 1:200 | Bio-Rad |
CD45RA | FITC | MIL13 | Mouse IgG1 | 1:200 | AbDserotec |
CD172a | PE | 74-22-15A | Mouse BALB/c IgG2b, κ | 1:200 | BD |
그 결과 RAG2 KO 미니돼지에서는 T, B 세포가 결손 되어 있지만, NK 세포는 관찰할 수 있는 반면, JAK3 KO 미니돼지에서는 결손된 NK 세포 및 감소되어 T, B 세포를 확인하였다(노란색 화살표 + 염색) (도 21 및 도 22).
실험예 3-4. 장기 무게의 확인
실시예 1에서 생산된 JAK3 넉아웃 형질전환 복제 미니돼지의 체중, 흉선, 비장의 무게를 확인하였다.
구체적으로, JAK3가 넉아웃 되지 않은 정상적인 개체 (wild type; WT), RAG2 넉아웃 형질전환 복제 미니돼지 (RAG2 knock out; RAG2 KO) 및 실시예 1의 JAK3 넉아웃 형질전환 복제 미니돼지 (JAK3 knock out; JAK3 KO)의 체중, 흉선, 비장의 무게를 측정하였다.
그 결과, 표 7에서 확인되는 바와 같이 JAK3 넉아웃 형질전환 복제 미니돼지의 체중, 비장은 JAK3가 넉아웃 되지 않은 정상적인 개체 (wild type; WT), RAG2 넉아웃 형질전환 복제 미니돼지 (RAG2 knock out; RAG2 KO) 보다 감소하는 경향을 확인할 수 있고, 흉선의 경우 전술한 바와 같이 형성되지 않음을 확인하였다.
험예 3-5. 면역세포 형성 확인 - V(D)J recombination 검출 방법
본 발명 실시예 1의 JAK3 넉아웃 형질전환 복제 미니돼지 (JAK3 knock out; JAK3 KO)는 비장세포에서 약간의 T, B 세포가 형성되었고 (상기 3-3.), 이러한 T, B세포가 정상적인 면역세포 생성을 할 수 있는지를 확인하였다.
구체적으로, TCR 및 BCR V (D) J 재배열의 분석은 먼저 WT, RAG2 KO 및 JAK3 KO 돼지의 흉선, 비장 및 골수에서 DNA 샘플은 추출하였다. 그 다음 표 8 에 나열되어 프라이머를 이용하여 PCR을 진행하였다. TCR 재조합은 Premixed Ex-Taq (Cat # RR005A, Takara Bio Inc)을 사용하여 다음의 PCR 조건에 의해 분석하였다: 98 ºC에서 5 분 동안 초기 변성(denaturation); 98℃ 에서 10 초, 68℃에서 30초, 68 ℃에서 1분의 30 사이클; 그리고 68℃에서 7 분 동안 최종 신장(synthesis)과정을 거쳐 재배열된 TCR 밴드를 확인하였다. 또한 BCR IgH 유전자의 재배열 확인은 FR1 및 JH 프라이머를 사용하여 사전에 혼합된 Ex-Taq을 사용하여 PCR을 수행했다. PCR 조건은 다음과 같다: 94℃에서 5 분 동안 초기 변성; 98℃에서 30 초, 64℃에서 30초, 72℃에서 30초의 30 사이클; 72℃에서 7 분 동안 최종 신장을 거쳐 재배열된 BCR 밴드를 확인하였다.
Gene Name | Accession No. | Primer sequence (5'->3') | Product size |
TCR D1J1 | AB513625 | F: GCTGCTCTGGTGGTTTCTCAC R: CACCAGTGCCCAAGTCTTAGC |
1399 bp (germinal) |
1162 bp (rearrangement 1) | |||
788 bp (rearrangement 2) | |||
701 bp (rearrangement 3) | |||
464 bp (rearrangement 4) | |||
BCR | AB079894.1 | F: CTGAGAACTCACGTCCAGTGC R: CTGGCCCTAGACCTTTAGACC |
1691 bp (germinal) |
F: GAGGAGAAGCTGGTGGAGT R: TGAGGACACGACGACTTCAA |
436 bp (rearrangement) | ||
442 bp (rearrangement) |
그 결과, RAG2 KO 미니돼지에서는 T, B 세포가 모두 rearrangement가 형성되지 않지만 JAK3 KO 미니돼지에서는 T 세포에서는 형성되지 않지만 B 세포는 약간의 rearrangement가 형성됨을 확인하였다 (도 23 및 도 24). 이러한 결과를 통해 RAG2 KO미니돼지는 기존 알려진 대로 T-, B-, NK+ 이지만, JAK3 KO 미니돼지는 T-, B low, NK- 임을 확인하였다.
실험예 4: JAK3 유전자가 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 표현형 분석 (2)
실험예 4-1. JAK3 유전자가 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 생존율 분석
전술한 바와 같이 JAK3 유전자가 결손될 경우 면역기능에 이상이 발생되기 때문에 생존에 영향을 줄 것으로 판단하여, SPF 시설에서 사육되는 본 발명 실시예 1의 JAK3 넉아웃 형질전환 복제 미니돼지 (JAK3 knock out; JAK3 KO)의 생존율을 확인하였다.
구체적으로, JAK3가 넉아웃 되지 않은 정상적인 개체 (wild type; WT), RAG2 넉아웃 형질전환 복제 미니돼지 (RAG2 knock out; RAG2 KO) 및 실시예 1의 JAK3 넉아웃 형질전환 복제 미니돼지 (JAK3 knock out; JAK3 KO)의 생존율을 비교하였다.
그 결과 유의적으로 JAK3 KO 미니돼지가 생존율이 RAG2 KO 미니돼지 보다 낮음을 확인하였다 (표 9, 도 25).
실험예 4-2. JAK3 유전자가 결손된 형질전환 복제 미니돼지에서의 암세포 생장 확인
전술한 바와 같이 JAK3 유전자가 결손될 경우 면역기능에 이상이 발생되기 때문에 외래 세포, 구체적으로 암의 도입 시 면역 반응 없는 지 확인하였다.
구체적으로, 종양 형성능 분석을 위해, WT 와 SCID 돼지에 인간 흑색종 세포주(human melanoma cell line, LOX-IMVI)를 1-10 Х 105 세포로 돼지의 오른쪽과 왼쪽 피하 부분에 종양세포를 1ml 주사기를 이용하여 주사 한 후 종양이 형성이 보이는 16 일에 안락사 후 종양을 채취하였다.
그 결과, SCID는 면역기능에 이상이 있기 때문에 외부에서 넣어준 암세포가 JAK3 KO 미니돼지와 RAG2 KO 미니돼지 모두에서 자랄 수 있음을 확인하였다. 반면, WT에서는 형성되지 않음을 확인할 수 있었다 (도 26).
실험예 4-3. JAK3 유전자가 결손된 형질전환 복제 미니돼지에 이식된 암세포, 조직에 면역세포 유입 확인-면역조직염색, RT-PCR
상기 실험예 4-2.에서 동물모델에 이식된 암세포가 형성시킨 종양 조직에 T, B, NK 면역세포의 유입을 면역조직염색 및 RT-PCR로 확인하였다.
구체적으로 표 11.에 있는 항체를 이용하여 채취한 종양의 일부분을 4 % (w/v) 포름 알데히드에 고정하고 파라핀(paraffin)에 임베딩(embedding)하고 종양의 다양한 유형의 조직을 식별하기 위해 유리 슬라이드의 5μm 섹션에서 조직 화학적 및 면역 조직 화학적 분석을 수행했다. 추가적으로 이식된 암세포에 의해 종양이 형성되었음을 확인하기 위해 증식하는 세포에 반응하는 PCNA 항체를 이용하여 검증하였다.
종양의 일부는 유전자의 발현을 유해 mRNA 추출하고 표 12에 있는 프라이머를 이용하여 T, B 및 NK 세포 마커에 대한 qRT-PCR로 증폭하여 인간 세포가 주입된 돼지에서 발생한 종양에 돼지의 T, B, NK 세포가 유입되었음을 확인하였다.
Antigen | Target population | Clone | Isotype | Dilution | Suppler |
CD3 | Pan-T-cells | SP7 | Rabbit IgG | 1:200 | Abcam |
CD20 | B lymphocytes | EP459Y | Rabbit IgG | 1:250 | Abcam |
CD335 | NKp46 | VIV-KM1 | Mouse IgG1 | 1:200 | Invitrogen |
PCNA | Proliferating cells | PC10 | Mouse IgG2b | 1:250 | Dako |
IgA | Plasma cells | Goat IgA | 1:50 | BETHYL |
Gene Name | Accession No. | Primer sequence (5'->3') | Product size |
TBX212 | NM_001315722.1 | F: CCTGTACGTCCACCCAGATT R: TCTGGCTCACCATCATTGAC |
189 bp |
EOMES | XM_005669315.3 | F:ACTCCATGTACACCGCTTCCR: AAGAAGGACTGAACGCCGTA | 109 bp |
NKG2D (KLRK1) | NM_213813.2 | F:TGTGGAGAAAACCCATCTCCR: TTGGAGCCTCTTGGTTGAAT | 130 bp |
NKp46 (NCR1) | NM_001123143.1 | F:CTCCTGGTCAAAGGAGATGGR: GATCGGGGTGTCTACGGTTA | 105 bp |
NKp44 (NCR2) | XM_021098670.1 | F:AGTCCGTGAGGTTCCATCTGR: AGGGTGGAGTTTTCTTGCTG | 160 bp |
GAPDH | NM_001206359.1 | F:CCCTGAGACACGATGGTGAAR: GGAGGTCAATGAAGGGGTCA | 127 bp |
그 결과, 면역조직염색으로 RAG2 KO 미니돼지에서는 NK 세포가 암세포에 유입된 것을 확인하였고, JAK3 KO 미니돼지에서는 약간의 B 세포가 유입된 것을 확인할 수 있다 (도 27). RT-PCR로 NK 세포의 마커 유전자를 확인한 결과 또한 JAK3 KO 미니돼지에 비해 RAG2 KO 미니돼지에서는 NK 세포의 마커 유전자가 확인되었다 (도 28).
이러한 결과를 통해 본 발명의 JAK3 유전자가 결손된 미니돼지의 경우 면역기능이 저하된 것과 암연구에도 활용할 수 있음을 알 수 있다.
실험예 5: JAK3 유전자가 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 표현형 분석 (3)
실험예 5-1. JAK3 유전자가 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 혈액 분석
JAK3 유전자가 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 혈액 (Lymphosyte, Monocyte 및 Platelet)을 확인하였다.
구체적으로, 혈액분석은 6 가지 유형의 백혈구 기반 혈액 세포의 수 (백혈구, 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구 및 호염기구), 7 가지 유형의 적혈구 기반 혈액 세포의 수 (적혈구, 헤모글로빈, 헤마토크릿, 평균 적혈구 용적, 평균 적혈구 헤모글로빈, 평균 적혈구 헤모글로빈 농도, 적혈구 분포 폭) 두 가지 유형의 혈소판 기반 혈액 세포 수 등을 자동 혈구계 HEMAVET 시스템 (Cat #HV 950, FS, Drew Scientific, Miami Lakes, FL, USA)을 사용하여 측정하였다.
그 결과 림프구 (lymphocytes)뿐만 아니라 단핵구(monocyte)와 혈소판(platelet)의 감소가 JAK3 KO 미니돼지에서 관찰되었으며 적혈구를 비롯한 다른 혈액학적 지표에서는 차이가 없음을 확인하였다 (도 29).
실험예 5-2. JAK3 유전자가 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 신장 조직 내 대식세포 관련 유전자 발현 확인 (1)
JAK3 유전자가 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 신장 조직 내 대식세포 관련 유전자의 발현을 확인하였다.
구체적으로, 다음 표 13 의 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 실시하였다.
Gene Name | Accession No. | Primer sequence (5'->3') | Product size |
F4/80 (ADGRE) | XM_021083951.1 | F: CCTTCTCTTTTGGGGGTGTT R: CGGACACATGGTGGTATCTG |
112 bp |
CD68 | NM_001291776.1 | F:TGGGGCATCTCTGTACTGAACR: CTGTGGCTGCTGCTTGAATC | 126 bp |
CD169 | XM_021077303.1 | F:GTGCAGTATGCCCCCAAGR: GAACTGACCTGAGGGTTGCT | 119 bp |
LGALS3 | NM_001097501.2 | F:GGTTTTTCGCTTAACGATGCR: GGATAGGAAGCCCCTGGATA | 116 bp |
CD64 | NM_001033011.1 | F:AATTCTGCTCCTTTGCGTTCR: ATGGGGTCCCTCACATTGTA | 127 bp |
GAPDH | NM_001206359.1 | F:CCCTGAGACACGATGGTGAAR: GGAGGTCAATGAAGGGGTCA | 127 bp |
ELISA 분석 방법은 CD169 발현 대식세포는 돼지 CD169/SIGLEC1 키트 (Cat # MBS9331706, MyBioSource)를 이용하였으며 제조업체에서 제공되는 분석 방법에 의해 평가하였다. 샘플은 필요한 경우 DPBS/1 % BSA에서 희석되었고 Molecular Devices VersaMax Absorbance Microplate Reader (Molecular devices, San Jose, CA, USA)를 사용하여 450nm의 파장에서 20 분 이내에 플레이트를 판독했다. 결과의 평가는 SoftMax® Pro Software (Molecular Devices)를 사용하여 데이터를 분석하였다.
신장(kidney) 조직에서 대식세포(macrophage)에 관련된 유전자들의 RT-PCR 측정 결과, WT 보다 RAG2 KO 미니돼지에서 F4/80, CD68, CD169, LGALS3 및 CD 64의 발현이 유의적으로 증가하였고, JAK3 KO 미니돼지에서는 RAG2 KO 미니돼지보다 F4/80, CD68, CD169, LGALS3 및 CD 64의 발현이 감소된 결과를 확인하였고, WT 보다는 CD68, CD169, LGALS3 및 CD 64의 발현이 감소된 것을 확인하였다 (도 30).
또한, 신장 조직에서 대식세포(macrophage)에 관련된 CD169를 ELISA로 측정한 결과 RT-PCR에서 감소한 결과와 같이 WT 보다 RAG2 KO 미니돼지에서 CD169 발현이 유의적으로 증가하였지만 JAK3 KO 미니돼지에서는 WT 및 RAG2 KO 미니돼지 보다 감소된 결과를 확인하였다 (도 31).
실험예 5-3. JAK3 유전자가 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 유전자 발현 확인 (2)
JAK3 유전자가 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 신장 조직 내 대식세포 관련 유전자 중 CD68의 발현을 확인하였다.
구체적으로, 표 14에 있는 항체를 이용하여 면역조직 염색을 실시한 후 DAB (3,3시약을 통해 CD68에 염색(positive staining, CD68+)되는 세포를 갈색으로 발색 시킨 후 CD68+세포를 수기로 counting 하여 정량화 하였다.
Antigen | Target population | Clone | Isotype | Dilution | Suppler |
CD68 | Monocyte/ Macrophage | MAC387 | Mouse IgG1 | 1:100 | LSBio |
IgA | Plasma cells | Goat IgA | 1:500 | BETHYL |
그 결과, 전술한 실험예 5-2의 결과와 유사하게 WT 보다 RAG2 KO 미니돼지에서 CD68+ 세포가 유의적으로 증가하였고, JAK3 KO 미니돼지에서는 WT 및 RAG2 KO 미니돼지보다 CD68+ 세포가 유의적으로 감소된 결과를 확인하였다 (도 32의 노란색 화살표 + 염색 및 33 참조).
실험예 5-4. JAK3 유전자가 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 유전자 발현 확인 (3)
JAK3 유전자가 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 신장 조직 내 대식세포의 분극화 관련 유전자 (M1, M2)의 발현 및 Cytokine 발현을 확인하였다.
구체적으로, 다음 표 15 의 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 실시하였다.
Gene Name | Accession No. | Primer sequence (5'->3') | Product size |
IL1β | NM_001302388.2 | F: CTCCTCACAGGGGACTTGAA R: GGGTGGGTGTGTCATCTTTC |
148 bp |
TNFα | NM_214022.1 | F:CCCAGAAGGAAGAGTTTCCAGR: ATACCCACTCTGCCATTGGA | 149 bp |
iNOS (NOS2) | XM_013981166.2 | F:CCAAAGGGGATCTTGCTTGR: AGCTCGTCTGGTGGGGTAG | 106 bp |
MCP-1(CCL2) | NM_214214.1 | F:TCTCCAGTCACCTGCTGCTAR: ATACCCACTCTGCCATTGGA | 117 bp |
CXCL10 | NM_001008691.1 | F:TGGAACTCAAGGAATACCTCTCTCR: CAACATGTGGGCAAGATTGA | 131 bp |
IL6 | NM_214399.1 | F:TTCACCTCTCCGGACAAAACR: TCTGCCAGTACCTCCTTGCT | 122 bp |
CD80 | XM_021068533.1 | F:GGTGCTGGTTGGTCTTTTTGR: CCTTTTGCCAGTATATTCGGACT | 137 bp |
MRC1 (CD206) | NM_001255969.1 | F:CCTGCAGCTCTTGGACACTAR: GAATTTCTGGGCCTCATTGT | 127 bp |
ARG1 | NM_214048.2 | F:CTCCTTTCTCCAAGGGTCAGR: CAGGTCCCCGTAATCTTTCA | 122 bp |
MMP9 | NM_001038004.1 | F:GGTGTTAAGGAGCACGGAGAR: GAAGTAGGTCGGAACCACGA | 156 bp |
CD163 | XM_021091120.1 | F:TGGTGCTACATGAAAACTCTGGR: GCTCCTTGTCTTTTCCTCCA | 135 bp |
IL10 | NM_214041.1 | F:CACATGCTCCGGGAACTCR: GCAACCCAGGTAACCCTTAAA | 126 bp |
GAPDH | NM_001206359.1 | F:CCCTGAGACACGATGGTGAAR: GGAGGTCAATGAAGGGGTCA | 127 bp |
ELISA 분석 방법은 IL1β (Cat # ARG81288 arigobio, Hsinchu City, Taiwan), IL2 (Cat # ARG81289 arigobio), IL10 (Cat # ARG81286, arigobio), IL12 (Cat # GR106161, arigobio) 및 CXCL10 (Cat # ARG81289 arigobio)의 돼지 사이토 카인 Duoset ELISA 키트 구입 # MBS706897, MyBioSource)를 이용하였으며 제조업체에서 제공되는 분석 방법에 의해 평가하였다. 샘플은 필요한 경우 DPBS/1 % BSA에서 희석되었고 Molecular Devices VersaMax Absorbance Microplate Reader (Molecular devices, San Jose, CA, USA)를 사용하여 450nm의 파장에서 20 분 이내에 플레이트를 판독했다. 결과의 평가는 SoftMax® Pro Software (Molecular Devices)를 사용하여 데이터를 분석하였다.
그 결과, 대식세포의 분극화 관련 유전자 (M1, M2)의 RT-PCR 및 Cytokine에 대한 ELISA 측정 결과 모두 WT 보다 RAG2 KO 미니돼지에서 유의적으로 발현들이 증가하였지만 JAK3 KO 미니돼지에서는 발현이 감소된 결과를 확인하였다 (도 34 내지 36).
실험예 6 : JAK3 유전자가 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 표현형 분석 (4)
실험예 6-1. JAK3 유전자가 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 폐/내장 이상 확인
상기 실시예 1의 JAK3 넉아웃 형질전환 복제 미니돼지 (JAK3 knock out; JAK3 KO)의 폐/내장 이상을 비교, 확인하였다.
구체적으로, JAK3가 넉아웃 되지 않은 정상적인 개체 (wild type; WT), 상태가 나빠져 안락사 시킨 RAG2 KO 미니돼지와 실시예 1의 JAK3 KO 미니돼지를 부검하여 폐/내장 염증을 H&E 염색, 면역조직염색 및 육안으로 확인하였다.
그 결과, JAK3가 넉아웃 되지 않은 정상적인 개체 (wild type; WT) 및 JAK3 KO 미니돼지에서는 별다른 폐 염증이 확인되지 않았으나, RAG2 KO 미니돼지에서는 폐렴을 비롯한 염증성 질환들이 주로 관찰되었다 (도 37, RAG2 KO lung 사진의 화살표).
한편, JAK3가 넉아웃 되지 않은 정상적인 개체 (wild type; WT) 및 RAG2 KO 미니돼지에서는 별도의 내장 이상이 확인되지 않았으나, JAK3 KO 미니돼지에서는 내장 이상이 확인되었다 (도 38).
구체적으로 H&E 염색과 면역조직염색을 확인한 결과, 장의 면역기관인 Peyer's patch(검은색 화살표)가 RAG2 KO 미니돼지의 장에서는 감소되어 있지만 일부 관찰할 수 있는데 비해 JAK3 KO 미니돼지에서는 Peyer's patch가 전혀 존재하지 않음을 확인하였다. 또한 장의 융모(villi)의 길이도 정상보다 매우 짧았으며 세포증식에 특이적으로 염색되는 PCNA(Proliferating cell nuclear antigen) 항체를 이용한 면역염색에서도 정상적이면 장의 줄기세포가 존재하는 크립트(crypt)에서만 특이적으로 염색되어야 하는데 JAK3 KO 미니돼지의 장에서는 비특이적으로 융모에까지 염색되는 결과를 확인하였다 (도 39 및 도 44).
또한, 장의 점액질을 분비하는 술잔세포(goblet cells)를 특이적으로 염색하는 mucicamine 특수염색에 있어서도 JAK3 KO 미니돼지의 장에서는 유의적으로 크게 감소한 결과를 확인하였다 (도 40 내지 도 43).
그리고, 장의 형질세포(plasma cells)에서 분비하는 IgA(immunoglobulin A)는 B 세포가 없는 RAG2 KO 미니돼지의 장에서는 전혀 관찰할 수 없었지만 JAK3 KO 미니돼지의 장에서는 WT보다 감소되어 염색되는 것을 확인하였다 (도 40).
이러한 결과를 통해 JAK3 KO 미니돼지는 장의 분화가 제대로 이루어 지지 않는 다는 것을 알 수 있다.
실험예 6-2. JAK3 유전자가 결손된 형질전환 복제 미니돼지의 내장 확인
상기 실시예 1의 JAK3 넉아웃 형질전환 복제 미니돼지 (JAK3 knock out; JAK3 KO)의 내장 이상을 비교, 확인하였다.
구체적으로, JAK3가 넉아웃 되지 않은 정상적인 개체 (wild type; WT), 상태가 나빠져 안락사 시킨 RAG2 KO 미니돼지와 실시예 1의 JAK3 KO 미니돼지를 부검하여 내장 염증을 육안으로 확인하였다.
그 결과 JAK3 KO 미니돼지의 장은 내출혈성 소견 (JAK3 KO의 파란색 화살표)과 장간막 혈관(mesenteric vessel)이 충혈되어 있음 (JAK3 KO의 노란색 화살표)을 확인하고 조직분석 결과 장간막 혈관들이 탄력을 소실하고 확장되어 있음을 확인하였다. 이러한 증상은 자궁적출후 분유나 사료를 섭취하는 모든 JAK3 개체에서 발견되었기 때문에, 이러한 결과는 제대로 장의 분화 형성이 이루어지지 않아 장에 이상이 발생한 것을 알 수 있다 (도 45).
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY
<120> JAK3 GENE MUTATION SEVERE COMBINED IMMUNODEFICIENCY ANIMAL MODEL
AND METHOD FOR PREPARING THE SAME
<130> PN200124
<160> 6
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA #1
<400> 1
tgctgttctg ctgccccctc gg 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA #2
<400> 2
ataggcgctg tgggggtcca ggg 23
<210> 3
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Part of JAK 3 CDS Exon 2
<400> 3
tctgctgccc cctcggggcc ctggaccccc acagcgccta tccttctcct ttggggacc 59
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Part of mutated JAK 3 CDS Exon 2 (+1bp)
<400> 4
tctgctgccc cctcggggcc ctggaacccc cacagcgcct atccttctcc tttggggacc 60
60
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Part of mutated JAK 3 CDS Exon 2 (-1bp)
<400> 5
tctgctgccc cctcggggcc ctggacccca cagcgcctat ccttctcctt tggggacc 58
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Part of mutated JAK 3 CDS Exon 2 (-17bp)
<400> 6
tctgctgccc cctcggggcc ctatccttct cctttgggga cc 42
Claims (12)
- JAK3(Janus kinase 3) 유전자를 암호화하는 서열번호 3 의 DNA에 혼성화하는 gRNA(guide RNA)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열;
Cas9 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및
상기 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 발현벡터.
- 제 1 항에 있어서, 상기 gRNA는 서열번호 1 또는 서열번호 2 의 염기서열로 이루어진 것인 재조합 발현벡터.
- 제 1 항의 재조합 발현벡터가 도입된 중증복합면역결핍 동물모델 제작용 형질전환 세포주.
- 제 3 항의 형질전환 세포주를 인간을 제외한 동물로부터 수득한 탈핵된 난자에 이식하여 핵 이식란을 형성하는 단계; 및
상기 핵 이식란을 인간을 제외한 동물인 대리모의 난관에 이식하는 단계를 포함하는 중증복합면역결핍 동물모델의 제조방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 동물은 미니돼지인 것인 중증복합면역결핍 동물모델의 제조방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 중증복합면역결핍은 JAK3(Janus kinase 3) 넉아웃(knock-out)에 의한 것인 중증복합면역결핍 동물모델의 제조방법.
- 제 6 항에 있어서, 상기 상기 넉아웃은 서열번호 3 에 해당하는 염기서열이, 서열번호 4 내지 서열번호 6로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염기서열로 돌연변이되어 발생된 것인 중증복합면역결핍 동물모델의 제조방법.
- 제1항의 발현벡터로 JAK3(Janus kinase 3) 유전자가 돌연변이된 중증복합면역결핍 동물모델.
- 제 8 항에 있어서, 상기 동물모델은 JAK3 유전자가 넉아웃(knock-out)된 것인 JAK3 유전자 돌연변이 중증복합면역결핍 동물모델.
- 제 9 항에 있어서, 상기 넉아웃은 서열번호 3 에 해당하는 염기서열이, 서열번호 4 내지 서열번호 6로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염기서열로 돌연변이되어 발생된 것인 JAK3 유전자 돌연변이 중증복합면역결핍 동물모델.
- 제 8 항에 있어서, 상기 동물은 미니돼지인 것인 JAK3 유전자 돌연변이 중증복합면역결핍 동물모델.
- 제8항에 있어서, 상기 동물은 인공혈액 개발용, 이종장기이식용 또는 중증면역결핍 질환동물모델용인 JAK3 유전자 돌연변이 중증복합면역결핍 동물모델.
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