CN115819553A - 一种il1rl2和/或il36a基因人源化的非人动物及其构建方法和应用 - Google Patents

一种il1rl2和/或il36a基因人源化的非人动物及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种IL1RL2和/或IL36A基因人源化的非人动物及其构建方法、一种人源化IL1RL2和/或IL36A蛋白、一种人源化IL1RL2和/或IL36A基因、一种IL1RL2和/或IL36A基因的靶向载体和其在生物医药领域的应用，利用同源重组的方式将编码人IL1RL2和/或IL36A蛋白的核苷酸序列导入非人动物基因组中，该动物体内能正常表达人或人源化IL1RL2和/或IL36A蛋白，可以作为人IL1RL2和/或IL36A信号机理研究、炎症、肿瘤或免疫相关疾病药物筛选的动物模型，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。

Description

一种IL1RL2和/或IL36A基因人源化的非人动物及其构建方法 和应用
技术领域
本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种IL1RL2和/或IL36A基因人源化的非人动物及其构建方法和在生物医药领域的应用。
背景技术
白介素36(IL36)属于IL-1家族成员，在免疫反应中充当着重要角色。人IL36亚家族由IL36A、IL36B、IL36G、IL36受体拮抗剂(IL36 Receptor antagonist，又称IL1RL2a)组成，前三者曾被称为IL1F6、IL1F8、IL1F9，2010年由Dinatello等将其统一更改为现在的名称。IL1RL2a是IL36的天然拮抗剂。IL36在体内需要与特异性受体(IL36 Receptor，又称IL1RL2)结合，招募IL1受体辅助蛋白(IL1 Receptor Accessory Protein，IL1RAcP)形成异源三聚体复合物，激活下游信号通路，通过核转录因子NF-κB启动靶基因的表达，从而发挥促炎症作用。而IL1RL2a会与IL36α、IL36β、IL36γ竞争性结合IL1RL2，但IL1RL2a与IL1RL2结合组成的复合组不能招募IL1RacP，无法激活信号转导通路而起到抗炎症作用。
IL-36、IL1RL2主要在上皮组织，如皮肤、气管、食道中表达，对树突状细胞有显著的刺激作用，可通过刺激人单核细胞源树突状细胞产生IL1、IL6、IL12、IL23、TNFα、IL6、CCL1和CXCL1等，继而增强Th1和Th17的反应，增强固有免疫反应；此外，还能促进树突状细胞的成熟，上调MHC II分子、CD83和CD86分子的表达，在机体应对组织损伤和病原体的早期免疫反应和炎性反应中发挥重要作用。其中，IL36A是最重要的基因，其过表达即可表现银屑病的典型表型，从功能上IL36A单独存在即可激活下游信号通路。小鼠体内实验证实，抗IL36A抗体可以阻断IL36信号通路(朱超英.IL-36α在咪喹莫特诱导小鼠银屑病皮损中的表达及IL-36抗体对CCL20的影响研究[D].广州:南方科技大学,2017.)。
实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。但由于动物与人类的生理结构和代谢系统本身的差异，传统的动物模型并不能很好的反映人体的真实状况，例如小鼠的IL36蛋白便不能与人的IL1RL2结合，因此，在动物体内建立更接近人类的生理特征的疾病模型是生物医药行业的迫切需求。
鉴于IL36信号通路在免疫治疗领域的巨大应用价值，为进一步探索其相关生物学特性，提高临床前期药效试验的有效性，提高研发成功率，使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域急需开发IL36相关信号通路的非人动物模型。此外，本方法得到的非人动物还可与其它基因人源化非人动物交配得到多基因人源化动物模型，用于筛选和评估针对该信号通路的人用药及联合用药的药效研究。本发明在学术和临床研究中具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的第一方面，提供了一种IL1RL2基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化IL1RL2蛋白。
优选的，所述的非人动物的内源IL1RL2蛋白表达降低或缺失。
优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2蛋白的全部或部分。
优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分。
进一步优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2蛋白的信号肽、跨膜区和/或胞外区的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2蛋白胞外区的全部或部分，优选的，包含人IL1RL2蛋白胞外区至少100个连续氨基酸，例如包含人IL1RL2蛋白胞外区至少100、200、250、300、310、311、312、313、314、315、316个连续氨基酸的人IL1RL2蛋白胞外区，进一步优选的，包含人IL1RL2蛋白胞外区316个连续氨基酸；更优选的，包含与SEQ ID NO:2的第20-335位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO:2的第20-335位所示氨基酸序列一致的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL1RL2蛋白还包含人IL1RL2蛋白的跨膜区和/信号肽的全部或部分，优选的，包含人IL1RL2蛋白信号肽至少5个连续氨基酸，例如包含人IL1RL2蛋白信号肽至少5、10、15、16、17、18、19个连续氨基酸，进一步优选的，包含人IL1RL2蛋白信号肽19个连续氨基酸；更优选的，信号肽包含与SEQ ID NO:2的第1-19位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO:2的第1-19位所示氨基酸序列一致的氨基酸序列；所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2蛋白跨膜区至少5个连续氨基酸，例如包含人IL1RL2蛋白跨膜区至少5、10、15、16、17、18、19、20、21个连续氨基酸，优选的，包含人IL1RL2蛋白跨膜区21个连续氨基酸；进一步优选的，跨膜区包含与SEQ ID NO:2的第336-356位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO:2的第336-356位所示氨基酸序列一致的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2基因的2号至9号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分，进一步优选的，包含2号至9号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合编码的氨基酸序列的全部或部分，再进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号至8号外显子的全部、9号外显子的部分编码的氨基酸序列的全部或部分，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、50、55、56、57、58、59、60、70bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含58bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸序列为止，9号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、55、60、70、75、76、77、78、79、80、90、100、110、120、130、140、144bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含77bp的核苷酸序列；优选的，所述的9号外显子的部分包含9号外显子中从第一个核苷酸开始至编码跨膜区最后一个氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白包含与SEQ ID NO:5编码的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:5编码的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL1RL2蛋白中包含的人IL1RL2蛋白的部分氨基酸序列选自下列组中的一种：
A)包含SEQ ID NO:2的第1-356位氨基酸序列的全部或部分；
B)包含与SEQ ID NO:2的第1-356位氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；
C)包含与SEQ ID NO:2的第1-356位氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或
D)包含SEQ ID NO:2的第1-356位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白还包含非人动物IL1RL2蛋白的部分，优选为非人动物IL1RL2蛋白的胞质区。
优选的，所述的胞质区来源于非人动物，所述的胞质区包含非人动物IL1RL2蛋白胞质区的全部，更优选的，包含与SEQ ID NO:1的第360-574位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列；或者，包含SEQ ID NO:1的第360-574位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO:1第360-574位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO:1第360-574位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白还包含非人动物IL1RL2基因编码的氨基酸序列的全部或部分，进一步优选的，包含为非人动物IL1RL2基因9号至11号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分，最为优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白包含与SEQ ID NO:6编码的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:6编码的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL1RL2蛋白的氨基酸序列选自下列组中的一种：
a)包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的全部或部分；
b)包含与SEQ ID NO:10氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；
c)包含与SEQ ID NO:10所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或
d)包含SEQ ID NO:10所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的非人动物基因组中包含人或人源化IL1RL2基因，所述的人源化IL1RL2基因包含人IL1RL2基因的部分。
优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含人IL1RL2基因的2号至9号外显子的全部或部分，进一步优选的，包含2号至9号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，再进一步优选的,包含2号外显子的部分、3号至8号外显子的全部、9号外显子的部分，更优选还包含2-3号内含子和/或8-9号内含子，更进一步优选的，包含2-9号外显子之间的任一内含子，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、50、55、56、57、58、59、60、70bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含58bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸序列为止，9号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、55、60、70、75、76、77、78、79、80、90、100、110、120、130、140、144bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含77bp的核苷酸序列；优选的，所述的9号外显子的部分包含9号外显子中从第一个核苷酸开始至编码跨膜区最后一个氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含与SEQ ID NO:5所示核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO:5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含编码人IL1RL2蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列；优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含编码人IL1RL2蛋白的信号肽、跨膜区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列，进一步优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含编码与SEQ ID NO:2的第1-356位的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含编码SEQ IDNO:2的第1-356位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO:2的第1-356位的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ IDNO:2的第1-356位的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含编码非人动物的胞质区的核苷酸序列，所述的胞质区包含非人动物IL1RL2蛋白胞质区的全部或部分。
优选的，所述的人源化IL1RL2基因还包含编码SEQ ID NO:1的第360-574位的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO:1的第360-574位的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO:1的第360-574位的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO:1的第360-574位的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含非人动物IL1RL2基因的1号至11号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含非人动物IL1RL2基因的9号至11号外显子的全部或部分，更优选的，包含9号至11号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，再进一步优选的,包含9号外显子的部分、10号外显子的全部、11号外显子的部分，更进一步优选的，包含9-11号外显子之间的任一内含子，其中9号外显子的部分至少包含9号外显子中编码胞质区的核苷酸序列，11号外显子的部分包含11号外显子中编码胞质区的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL1RL2基因中包含的非人动物IL1RL2核苷酸序列的部分选自下列组中的一种：
(A)包含SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的全部或部分；
(B)包含与SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的同一性至少为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
(C)包含与SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；
(D)具有SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL1RL2基因中至少还包含SEQIDNO:7、8所示核苷酸序列，或包含与SEQ ID NO:7、8具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL1RL2基因的核苷酸序列转录的mRNA选自下列组中的一种：
(a)包含SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的全部或部分；
(b)包含与SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的同一性至少为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
(c)包含与SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或
(d)包含SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL1RL2基因还包括特异性诱导物或阻遏物，进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-OffSystem/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。
优选的，所述的人源化IL1RL2基因还包含转录终止序列。进一步优选为3’UTR、polyA、WPRE、STOP或lox2中的一种或两种以上的组合。更进一步优选包含polyA序列如SEQID NO:69所示。
优选的，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入非人动物IL1RL2基因座上。
优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化IL1RL2蛋白的核苷酸序列。
B)编码人IL1RL2蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列，优选编码人IL1RL2蛋白的信号肽、胞外区和/或跨膜区的核苷酸序列的全部或部分，优选的，包含编码人IL1RL2蛋白胞外区至少100个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选还包含编码人IL1RL2蛋白的跨膜区和/信号肽的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人IL1RL2蛋白信号肽至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，优选包含编码人IL1RL2蛋白跨膜区至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选的，包含编码SEQ ID NO：2第1-356位氨基酸的核苷酸序列；
C)人或人源化IL1RL2基因的核苷酸序列；或，
D)人IL1RL2基因的1号至12号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至12号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含人IL1RL2基因的2号至9号外显子的全部或部分，更优选的，包含2号外显子的部分、3号至8号外显子的全部、9号外显子的部分，更优选还包含2-3号内含子和/或8-9号内含子，更进一步优选的，包含2-9号外显子之间的任一内含子，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、50、55、56、57、58、59、60、70bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含58bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸序列为止，9号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、55、60、70、75、76、77、78、79、80、90、100、110、120、130、140、144bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含77bp的核苷酸序列；优选的，所述的9号外显子的部分包含9号外显子中从第一个核苷酸开始至编码跨膜区最后一个氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的供体核苷酸序列包含SEQ ID NO:5和/或6所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO:5和/或6所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO:5和/或6所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO:5和/或6所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述B)中还包括编码非人动物IL1RL2蛋白的核苷酸序列，进一步优选为编码非人动物胞质区的全部或部分，更优选为编码SEQ ID NO:1的第360-574位氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的D)中还包括非人动物IL1RL2基因的部分，优选为非人动物IL12RB1基因的9号至11号外显子的全部或部分。
优选的，所述的构建方法包括用包含编码人IL1RL2蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列导入非人动物IL1RL2基因座；进一步优选的，用包含编码人IL1RL2蛋白的信号肽、跨膜区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列导入非人动物IL1RL2基因座，其中，所述的胞外区包含人IL1RL2蛋白胞外区的全部或部分，优选的，所述的胞外区包含人IL1RL2蛋白胞外区的全部，更优选的，包含与SEQ ID NO:2的第20-335位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ IDNO:2的第20-335位所示氨基酸序列；所述的信号肽包含人IL1RL2蛋白信号肽的全部或部分，优选的，所述的信号肽包含人IL1RL2蛋白信号肽的全部，更优选的，信号肽包含与SEQID NO:2的第1-19位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:2的第1-19位所示氨基酸序列；所述的跨膜区包含人IL1RL2蛋白跨膜区的全部或部分，优选的，所述的跨膜区包含人IL1RL2蛋白跨膜区的全部，更优选的，跨膜区包含与SEQ ID NO:2的第336-356位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ IDNO:2的第336-356位所示氨基酸序列，更进一步优选的，所述人IL1RL2蛋白包含编码与SEQ ID NO:2的第1-356位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含编码SEQ ID NO:2的第1-356位所示氨基酸序列。
优选的，所述的构建方法包括用包含编码非人动物IL1RL2蛋白的胞质区的全部或部分核苷酸序列导入非人动物IL1RL2基因座，进一步优选的，用包含编码非人动物IL1RL2蛋白的胞质区的全部核苷酸序列导入非人动物IL1RL2基因座，更优选的，胞质区包含与SEQID NO:1的第360-574位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO:1的第360-574位所示氨基酸序列一致的氨基酸序列。
优选的，所述的构建方法包括用从5’-3’包含人IL1RL2的部分CDS序列、小鼠IL1RL2部分CDS序列、内源IL1RL2的3’UTR序列和polyA插入至非人动物IL1RL2基因座，其中，所述人IL1RL2的部分CDS序列包含SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述的小鼠IL1RL2部分CDS序列和内源3’UTR序列直接相连，包含SEQ ID NO:6所示核苷酸序列，所述的poly A序列包含SEQ ID NO:69所示核苷酸序列。
优选的，所述的构建方法包括用包含所述人源化IL1RL2基因的核苷酸序列导入非人动物IL1RL2基因座。
优选的，所述的构建方法包括用包含编码所述人源化IL1RL2蛋白的核苷酸序列导入非人动物IL1RL2基因座。
在本发明的一个具体实施方式中，用包含编码人IL1RL2蛋白的cDNA序列导入非人动物IL1RL2基因座。
优选的，本申请中所述的导入包括但不限于插入、替换或转基因，所述的替换优选为原位替换。
优选的，所述的供体核苷酸序列在非人动物中通过调控元件进行调控。进一步优选的，所述的调控元件可以是内源或者外源的。
优选的，所述的调控元件包括但不限于内源启动子。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的内源调控元件来自非人动物IL1RL2基因。所述的外源性调控元件来自人IL1RL2基因。
优选的，所述的导入位点为IL1RL2基因的内源调控元件之后，进一步优选的，位于非人动物2号外显子起始密码子处，所述起始密码子处包含起始密码子ATG之前、之后和AT、TG之间，更优选的，导入位点位于起始密码子之前，5’UTR之后，更优选为NM_133193.4的第238-240位所示的核苷酸序列。
优选的，所述的导入的位置包括编码SEQ ID NO:1的第1位所示氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的插入为首先破坏非人动物内源IL1RL2基因的编码框，随后进行插入操作，或者所述的插入步骤既可给内源IL1RL2基因造成移码突变又可以实现插入人源序列的步骤。
进一步优选的，可在插入序列中加入辅助序列(例如终止密码子或含有终止功能的序列等)或其他方法(例如，翻转序列，或敲除序列)使得插入位点后的非人动物内源IL1RL2蛋白不能正常表达。
在本发明的一个具体实施方式中，在插入序列中加入辅助序列poly A。
优选的，所述的非人动物是纯合或者杂合的。
优选的，所述非人动物的基因组中至少一个染色体上包含人源化IL1RL2基因。
优选的，所述的非人动物中至少一个细胞表达人IL1RL2蛋白或人源化IL1RL2蛋白。
优选的，使用基因编辑技术进行非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。
优选的，使用靶向载体进行非人动物的构建。
优选的，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化IL1RL2蛋白的核苷酸序列。
B)编码人IL1RL2蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列，优选编码人IL1RL2蛋白的信号肽、胞外区和/或跨膜区的核苷酸序列的全部或部分，优选的，包含编码人IL1RL2蛋白胞外区至少100个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选还包含编码人IL1RL2蛋白的跨膜区和/信号肽的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人IL1RL2蛋白信号肽至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，优选包含编码人IL1RL2蛋白跨膜区至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选的，包含编码SEQ ID NO：2第1-356位氨基酸的核苷酸序列；
C)人或人源化IL1RL2基因的核苷酸序列；或，
D)人IL1RL2基因的1号至12号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至12号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含人IL1RL2基因的2号至9号外显子的全部或部分，更优选的，包含2号外显子的部分、3号至8号外显子的全部、9号外显子的部分，更优选还包含2-3号内含子和/或8-9号内含子，更进一步优选的，包含2-9号外显子之间的任一内含子，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、50、55、56、57、58、59、60、70bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含58bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸序列为止，9号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、55、60、70、75、76、77、78、79、80、90、100、110、120、130、140、144bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含77bp的核苷酸序列；优选的，所述的9号外显子的部分包含9号外显子中从第一个核苷酸开始至编码跨膜区最后一个氨基酸的核苷酸序列，最为优选的，所述的靶向载体包含与SEQ ID NO:5和/或6所示核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含SEQ IDNO:5和/或6所示核苷酸序列。
优选的，所述B)中还包括编码非人动物IL1RL2蛋白的核苷酸序列，进一步优选为编码非人动物胞质区的全部或部分，更优选为编码SEQ ID NO:1的第360-574位氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的D)中还包括非人动物IL1RL2基因的部分，优选为非人动物IL12RB1基因的9号至11号外显子的全部或部分。
优选的，所述的靶向载体还包含非人动物IL1RL2基因的部分；所述的非人动物IL1RL2基因的部分包含非人动物IL1RL2基因的9号至11号外显子的全部或部分，进一步优选的，包含9号至11号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，再进一步优选的,包含9号外显子的部分、10号外显子的全部、11号外显子的部分，更进一步优选的，包含9-11号外显子之间的任一内含子，其中，其中9号外显子的部分至少包含9号外显子中编码胞质区的核苷酸序列，最为优选的，所述的靶向载体包含与SEQ ID NO:6所示核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO:6所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ IDNO:6所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自非人动物IL1RL2基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000067.6的核苷酸至少具有90％同源性；进一步优选的，所述5’臂序列与SEQ ID NO:3至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO:3所示。
优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区3’端同源的DNA片段，即3’臂，其选自非人动物IL1RL2基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000067.6的核苷酸至少具有90％同源性；进一步优选的，所述的3’臂序列与SEQ ID NO:4至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO:4所示。
优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物IL1RL2基因座上，进一步优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物IL1RL2基因2号外显子上。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物细胞(优选为胚胎干细胞)中，将阳性克隆细胞导入已分离好的囊胚中，移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得IL1RL2基因人源化的非人动物。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体、靶向IL1RL2基因的sgRNA及Cas9导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为受精卵)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得IL1RL2基因人源化的非人动物。
根据本发明的一些实施例，该构建方法进一步包括：将IL1RL2基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
优选的，所述的其他基因为IL36A、PD-1、PD-L1、CD40、OX40、IL6、IL12、IL1RACP、IL23和TNF-α中的至少一种基因修饰的非人动物。
优选的，所述的非人动物还表达人或人源化的IL36A、PD-1、PD-L1、CD40、OX40、IL6、IL12、IL1RACP、IL23和TNF-α蛋白。
优选的，所述其他基因为IL36A，所述IL36A基因为人源化IL36A基因，优选的，所述的人源化IL36A基因包含人IL36A基因的1号外显子至4号外显子的全部或部分，进一步优选的，包含1号至4号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，再进一步优选的,包含1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部，更优选还包含1-2号内含子，更进一步优选的，包含1-4号外显子之间的任一内含子，其中，1号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，例如至少包含5、6、7、8、9、10、50、100、150、200、250、300、350、400、423bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含10bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸为止。
优选的，所述的人源化IL36A基因包含SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL36A蛋白包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含具有SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
优选的，所述IL1RL2基因和/或所述其他基因对于内源被替换基因座为纯合或杂合的。
本发明的第二方面，提供了一种IL1RL2基因人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达人或人源化IL1RL2蛋白。
优选的，所述的非人动物的内源IL1RL2蛋白表达降低或缺失。
优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2蛋白的全部或部分。
优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分。
进一步优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2蛋白的信号肽、跨膜区和/或胞外区的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2蛋白胞外区的全部或部分，优选的，包含人IL1RL2蛋白胞外区至少100个连续氨基酸，例如包含人IL1RL2蛋白胞外区至少100、200、250、300、310、311、312、313、314、315、316个连续氨基酸的人IL1RL2蛋白胞外区，进一步优选的，包含人IL1RL2蛋白胞外区316个连续氨基酸；更优选的，包含与SEQ ID NO:2的第20-335位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO:2的第20-335位所示氨基酸序列一致的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL1RL2蛋白还包含人IL1RL2蛋白的跨膜区和/信号肽的全部或部分，优选的，包含人IL1RL2蛋白信号肽至少5个连续氨基酸，例如包含人IL1RL2蛋白信号肽至少5、10、15、16、17、18、19个连续氨基酸，进一步优选的，包含人IL1RL2蛋白信号肽19个连续氨基酸；更优选的，信号肽包含与SEQ ID NO:2的第1-19位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO:2的第1-19位所示氨基酸序列一致的氨基酸序列；所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2蛋白跨膜区至少5个连续氨基酸，例如包含人IL1RL2蛋白跨膜区至少5、10、15、16、17、18、19、20、21个连续氨基酸，优选的，包含人IL1RL2蛋白跨膜区21个连续氨基酸；进一步优选的，跨膜区包含与SEQ ID NO:2的第336-356位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO:2的第336-356位所示氨基酸序列一致的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2基因的2号至9号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分，进一步优选的，包含2号至9号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合编码的氨基酸序列的全部或部分，再进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号至8号外显子的全部、9号外显子的部分编码的氨基酸序列的全部或部分，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、50、55、56、57、58、59、60、70bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含58bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸序列为止，9号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、55、60、70、75、76、77、78、79、80、90、100、110、120、130、140、144bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含77bp的核苷酸序列；优选的，所述的9号外显子的部分包含9号外显子中从第一个核苷酸开始至编码跨膜区最后一个氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白包含与SEQ ID NO:5编码的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:5编码的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL1RL2蛋白中包含的人IL1RL2蛋白的部分氨基酸序列选自下列组中的一种：
A)包含SEQ ID NO:2的第1-356位氨基酸序列的全部或部分；
B)包含与SEQ ID NO:2的第1-356位氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；
C)包含与SEQ ID NO:2的第1-356位氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或
D)包含SEQ ID NO:2的第1-356位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白还包含非人动物IL1RL2蛋白的部分，优选为非人动物IL1RL2蛋白的胞质区。
优选的，所述的胞质区来源于非人动物，所述的胞质区包含非人动物IL1RL2蛋白胞质区的全部，更优选的，包含与SEQ ID NO:1的第360-574位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列；或者，包含SEQ ID NO:1的第360-574位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO:1第360-574位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO:1第360-574位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白还包含非人动物IL1RL2基因编码的氨基酸序列的全部或部分，进一步优选的，包含为非人动物IL1RL2基因9号至11号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分，最为优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白包含与SEQ ID NO:6编码的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:6编码的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL1RL2蛋白的氨基酸序列选自下列组中的一种：
a)包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的全部或部分；
b)包含与SEQ ID NO:10氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；
c)包含与SEQ ID NO:10所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或
d)包含SEQ ID NO:10所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的非人动物基因组中包含人或人源化IL1RL2基因，所述的人源化IL1RL2基因包含人IL1RL2基因的部分。
优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含人IL1RL2基因的2号至9号外显子的全部或部分，进一步优选的，包含2号至9号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，再进一步优选的,包含2号外显子的部分、3号至8号外显子的全部、9号外显子的部分，更优选还包含2-3号内含子和/或8-9号内含子，更进一步优选的，包含2-9号外显子之间的任一内含子，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、50、55、56、57、58、59、60、70bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含58bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸序列为止，9号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、55、60、70、75、76、77、78、79、80、90、100、110、120、130、140、144bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含77bp的核苷酸序列；优选的，所述的9号外显子的部分包含9号外显子中从第一个核苷酸开始至编码跨膜区最后一个氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含与SEQ ID NO:5所示核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO:5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含编码人IL1RL2蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列；优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含编码人IL1RL2蛋白的信号肽、跨膜区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列，进一步优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含编码与SEQ ID NO:2的第1-356位的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含编码SEQ IDNO:2的第1-356位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO:2的第1-356位的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ IDNO:2的第1-356位的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含编码非人动物的胞质区的核苷酸序列，所述的胞质区包含非人动物IL1RL2蛋白胞质区的全部或部分。
优选的，所述的人源化IL1RL2基因还包含编码SEQ ID NO:1的第360-574位的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO:1的第360-574位的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO:1的第360-574位的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO:1的第360-574位的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含非人动物IL1RL2基因的1号至11号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含非人动物IL1RL2基因的9号至11号外显子的全部或部分，更优选的，包含9号至11号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，再进一步优选的,包含9号外显子的部分、10号外显子的全部、11号外显子的部分，更进一步优选的，包含9-11号外显子之间的任一内含子，其中9号外显子的部分至少包含9号外显子中编码胞质区的核苷酸序列，11号外显子的部分至少包含11号外显子中编码胞质区的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL1RL2基因中包含的非人动物IL1RL2核苷酸序列的部分选自下列组中的一种：
(A)包含SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的全部或部分；
(B)包含与SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的同一性至少为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
(C)包含与SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；
(D)具有SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL1RL2基因中至少还包含SEQIDNO:7、8所示核苷酸序列，或包含与SEQ ID NO:7、8具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL1RL2基因的核苷酸序列转录的mRNA选自下列组中的一种：
(a)包含SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的全部或部分；
(b)包含与SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的同一性至少为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
(c)包含与SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或
(d)包含SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL1RL2基因还包括特异性诱导物或阻遏物，进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-OffSystem/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。
优选的，所述的人源化IL1RL2基因还包含转录终止序列。进一步优选为3’UTR、polyA、WPRE、STOP或lox2中的一种或两种以上的组合。更进一步优选包含polyA序列如SEQID NO:69所示。
优选的，所述人或人源化IL1RL2基因的核苷酸序列可操作地连接到至少一条染色体中内源性IL1RL2基因座处的内源调控元件。
根据本发明的一些实施例，所述的非人动物进一步包含其他基因修饰，所述其他基因选自IL36A、PD-1、PD-L1、CD40、OX40、IL6、IL12、IL1RACP、IL23和TNF-α中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述人或人源化IL1RL2基因和/或所述其他基因对于内源被替换基因座为纯合或杂合。
优选的，所述其他基因为IL36A，所述IL36A基因为人源化IL36A基因，优选的，所述的人源化IL36A基因包含人IL36A基因的1号外显子至4号外显子的全部或部分，进一步优选的，包含1号至4号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，再进一步优选的,包含1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部，更优选还包含1-2号内含子，更进一步优选的，包含1-4号外显子之间的任一内含子，其中，1号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，例如至少包含5、6、7、8、9、10、50、100、150、200、250、300、350、400、423bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含10bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸为止。
优选的，所述的人源化IL36A基因包含SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物，进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物，更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物，进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子，更优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠，更进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-(NRG)小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第三方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列，优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化IL1RL2蛋白的核苷酸序列；
B)编码人IL1RL2蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人IL1RL2蛋白的信号肽、胞外区和/或跨膜区的核苷酸序列的全部或部分，优选的，包含编码人IL1RL2蛋白胞外区至少100个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选还包含编码人IL1RL2蛋白的跨膜区和/信号肽的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人IL1RL2蛋白信号肽至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，优选包含编码人IL1RL2蛋白跨膜区至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选的，包含编码SEQ ID NO：2第1-356位氨基酸的核苷酸序列；
C)人或人源化IL1RL2基因的核苷酸序列；或，
D)人IL1RL2基因的1号至12号外显子的全部或部分，进一步优选的，包含人IL1RL2基因的1号至12号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，更优选的，包含2号至9号外显子的全部或部分，再进一步优选的,包含2号外显子的部分、3号至8号外显子的全部、9号外显子的部分，更优选还包含2-3号内含子和/或8-9号内含子，更进一步优选的，包含2-9号外显子之间的任一内含子，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、50、55、56、57、58、59、60、70bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含58bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸序列为止，9号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、55、60、70、75、76、77、78、79、80、90、100、110、120、130、140、144bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含77bp的核苷酸序列；优选的，所述的9号外显子的部分包含9号外显子中从第一个核苷酸开始至编码跨膜区最后一个氨基酸的核苷酸序列，最为优选的，所述的靶向载体包含与SEQ ID NO:5所示核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO:5所示核苷酸序列。
优选的，所述B)中还包括编码非人动物IL1RL2蛋白的核苷酸序列，进一步优选为编码非人动物胞质区的全部或部分，更优选为编码SEQ ID NO:1的第360-574位氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的D)中还包括非人动物IL1RL2基因的部分，优选为非人动物IL12RB1基因的9号至11号外显子的全部或部分。
优选的，所述的靶向载体还包含非人动物IL1RL2基因的部分；所述的非人动物IL1RL2基因的部分包含非人动物IL1RL2基因的9号至11号外显子的全部或部分，进一步优选的，包含9号至11号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，再进一步优选的,包含9号外显子的部分、10号外显子的全部、11号外显子的部分，更进一步优选的，包含9-11号外显子之间的任一内含子，其中，9号外显子的部分至少包含9号外显子中编码胞质区的核苷酸序列，11号外显子的部分至少包含11号外显子中编码胞质区的核苷酸序列，最为优选的，所述的靶向载体包含与SEQ ID NO:6所示核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO:6所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自非人动物IL1RL2基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000067.6的核苷酸至少具有90％同源性；进一步优选的，所述5’臂序列与SEQ ID NO:3至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO:3所示。
优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区3’端同源的DNA片段，即3’臂，其选自非人动物IL1RL2基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000067.6的核苷酸至少具有90％同源性；进一步优选的，所述的3’臂序列与SEQ ID NO:4至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO:4所示。
优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物IL1RL2基因座上，进一步优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物IL1RL2基因2号外显子上。
优选的，所述靶向载体用于IL1RL2基因人源化的非人动物的构建。
优选的，所述的靶向载体还包含标记基因，进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因，更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因，进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统，进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)，所述的特异性重组系统为具有两个Frt重组位点，分别连接在抗性基因的两侧。
更优选的，所述靶向载体还包含SEQ ID NO:7、8、11、12所示核苷酸序列，或包含与SEQ ID NO:7、8、11、12具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物，进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物，更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物，进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子，更优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠，更进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-(NRG)小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第四方面，提供了一种包含上述靶向载体的细胞。
本发明的第五方面，提供了上述靶向载体，或者上述的细胞在IL1RL2基因修饰中的应用，优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换。
本发明的第六方面，提供了一种人源化IL1RL2蛋白，所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2蛋白的全部或部分。
优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分。
进一步优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2蛋白的信号肽、跨膜区和/或胞外区的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2蛋白胞外区的全部或部分，优选的，包含人IL1RL2蛋白胞外区至少100个连续氨基酸，例如包含人IL1RL2蛋白胞外区至少100、200、250、300、310、311、312、313、314、315、316个连续氨基酸，进一步优选的，包含人IL1RL2蛋白胞外区316个连续氨基酸；更优选的，包含与SEQ ID NO:2的第20-335位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO:2的第20-335位所示氨基酸序列一致的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL1RL2蛋白还包含人IL1RL2蛋白的跨膜区和/信号肽的全部或部分，优选的，包含人IL1RL2蛋白信号肽至少5个连续氨基酸，例如包含人IL1RL2蛋白信号肽至少5、10、15、16、17、18、19个连续氨基酸，进一步优选的，包含人IL1RL2蛋白信号肽19个连续氨基酸；更优选的，信号肽包含与SEQ ID NO:2的第1-19位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO:2的第1-19位所示氨基酸序列一致的氨基酸序列；所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2蛋白跨膜区至少5个连续氨基酸，例如包含人IL1RL2蛋白跨膜区至少5、10、15、16、17、18、19、20、21个连续氨基酸的人IL1RL2蛋白跨膜区，优选的，包含人IL1RL2蛋白跨膜区21个连续氨基酸的人IL1RL2蛋白跨膜区；进一步优选的，跨膜区包含与SEQ ID NO:2的第336-356位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO:2的第336-356位所示氨基酸序列一致的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2基因的2号至9号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分，进一步优选的，包含2号至9号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合编码的氨基酸序列的全部或部分，再进一步优选的,包含2号外显子的部分、3号至8号外显子的全部、9号外显子的部分编码的氨基酸序列的全部或部分，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、50、55、56、57、58、59、60、70bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含58bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸序列为止，9号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、55、60、70、75、76、77、78、79、80、90、100、110、120、130、140、144bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含77bp的核苷酸序列；优选的，所述的9号外显子的部分包含9号外显子中从第一个核苷酸开始至编码跨膜区最后一个氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白包含与SEQ ID NO:5编码的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:5编码的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL1RL2蛋白中包含的人IL1RL2蛋白的部分氨基酸序列选自下列组中的一种：
A)包含SEQ ID NO:2的第1-356位氨基酸序列的全部或部分；
B)包含与SEQ ID NO:2的第1-356位氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；
C)包含与SEQ ID NO:2的第1-356位氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或
D)包含SEQ ID NO:2的第1-356位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白还包含非人动物IL1RL2蛋白的部分，优选为非人动物IL1RL2蛋白的胞质区。
优选的，所述的胞质区来源于非人动物，所述的胞质区包含非人动物IL1RL2蛋白胞质区的全部，更优选的，包含与SEQ ID NO:1的第360-574位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列；或者，包含SEQ ID NO:1的第360-574位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO:1第360-574位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO:1第360-574位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白还包含非人动物IL1RL2基因编码的氨基酸序列的全部或部分，进一步优选的，包含为非人动物IL1RL2基因9号至11号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分，最为优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白包含与SEQ ID NO:6编码的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:6编码的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL1RL2蛋白的氨基酸序列选自下列组中的一种：
a)包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的全部或部分；
b)包含与SEQ ID NO:10氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；
c)包含与SEQ ID NO:10所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或
d)包含SEQ ID NO:10所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物，进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物，更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物，进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子，更优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠，更进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-(NRG)小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第七方面，提供了一种人源化IL1RL2基因，所述的人源化IL1RL2基因包含人IL1RL2基因的部分。
优选的，所述的人源化IL1RL2基因编码本发明所述的人源化IL1RL2蛋白。
优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含人IL1RL2基因的2号至9号外显子的全部或部分，进一步优选的，包含2号至9号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，再进一步优选的,包含2号外显子的部分、3号至8号外显子的全部、9号外显子的部分，更优选还包含2-3号内含子和/或8-9号内含子，更进一步优选的，包含2-9号外显子之间的任一内含子，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、50、55、56、57、58、59、60、70bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含58bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸序列为止，9号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、55、60、70、75、76、77、78、79、80、90、100、110、120、130、140、144bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含77bp的核苷酸序列；优选的，所述的9号外显子的部分包含9号外显子中从第一个核苷酸开始至编码跨膜区最后一个氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含与SEQ ID NO:5所示核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO:5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含编码人IL1RL2蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列；优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含编码人IL1RL2蛋白的信号肽、跨膜区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列，进一步优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含编码与SEQ ID NO:2的第1-356位的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含编码SEQ IDNO:2的第1-356位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO:2的第1-356位的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ IDNO:2的第1-356位的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含编码非人动物的胞质区的核苷酸序列，所述的胞质区包含非人动物IL1RL2蛋白胞质区的全部或部分。
优选的，所述的人源化IL1RL2基因还包含编码SEQ ID NO:1的第360-574位的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO:1的第360-574位的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO:1的第360-574位的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO:1的第360-574位的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含非人动物IL1RL2基因的1号至11号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含非人动物IL1RL2基因的9号至11号外显子的全部或部分，更优选的，包含9号至11号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，再进一步优选的,包含9号外显子的部分、10号外显子的全部、11号外显子的部分，更进一步优选的，包含9-11号外显子之间的任一内含子，其中9号外显子的部分至少包含9号外显子中编码胞质区的核苷酸序列，11号外显子的部分至少包含11号外显子中编码胞质区的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL1RL2基因中包含的非人动物IL1RL2核苷酸序列的部分选自下列组中的一种：
(A)包含SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的全部或部分；
(B)包含与SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的同一性至少为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
(C)包含与SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；
(D)具有SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL1RL2基因中至少还包含SEQIDNO:7、8所示核苷酸序列，或包含与SEQ ID NO:7、8具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL1RL2基因的核苷酸序列转录的mRNA选自下列组中的一种：
(a)包含SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的全部或部分；
(b)包含与SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的同一性至少为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
(c)包含与SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或
(d)包含SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL1RL2基因还包括特异性诱导物或阻遏物，进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-OffSystem/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。
优选的，所述的人源化IL1RL2基因还包含转录终止序列。进一步优选为3’UTR、polyA、WPRE、STOP或lox2中的一种或两种以上的组合。更进一步优选包含polyA序列如SEQID NO:69所示。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物，进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物，更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物，进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子，更优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠，更进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-(NRG)小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第八方面，提供了一种IL36A基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化IL36A蛋白。
优选的，所述的非人动物的内源IL36A蛋白表达降低或缺失。
优选的，所述的人源化IL36A蛋白包含人IL36A蛋白的全部或部分。
优选的，所述的人源化IL36A蛋白包含人IL36A基因的1号至4号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分，进一步优选的，包含1号至4号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合编码的氨基酸序列的全部或部分，再进一步优选的,包含1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部编码的氨基酸序列的全部或部分，最为优选的，所述的人源化IL36A蛋白包含与SEQ ID NO:33编码的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:33编码的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL36A蛋白中包含的人IL36A蛋白的部分氨基酸序列包含下列组中的一种：
A)包含SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的全部或部分；
B)包含SEQ ID NO:30所示氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；
C)包含SEQ ID NO:30所示所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或，
D)包含SEQ ID NO:30所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的非人动物基因组中包含人或人源化IL36A基因，所述的人源化IL36A基因包含人IL36A基因的部分。
优选的，所述的人源化IL36A基因包含人IL36A基因的1号外显子至4号外显子的全部或部分，进一步优选的，包含1号至4号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，再进一步优选的,包含1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部，更优选还包含1-2号内含子，更进一步优选的，包含1-4号外显子之间的任一内含子，其中，1号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，例如至少包含5、6、7、8、9、10、50、100、150、200、250、300、350、400、423bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含10bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸为止。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL36A基因包含SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ IDNO:33所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL36A基因包含编码人IL36A蛋白的全部或部分核苷酸序列；进一步优选的，包含编码与SEQ ID NO:30具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含编码SEQ ID NO:30的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO:30的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO:30的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL36A基因中至少包含SEQ IDNO:34所示核苷酸序列，或包含与SEQ ID NO:34具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL36A基因还包含非人动物IL36A基因的全部或部分。进一步优选包含非人动物IL36A基因的1号至6号外显子的全部或部分，更优选包括非人动物IL36A基因的1号外显子的全部、2号外显子的部分、5号外显子的部分和/或6号外显子的全部。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL36A基因转录的mRNA选自下列组中的一种：
(a)包含SEQ ID NO:35所示核苷酸序列的全部或部分；
(b)包含与SEQ ID NO:35所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
(c)包含与SEQ ID NO:35所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，
(d)包含SEQ ID NO:35所示的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入非人动物IL36A基因座。
优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化IL36A蛋白的核苷酸序列；
B)人或人源化IL36A基因的核苷酸序列；或，
C)人IL36A基因的1号至4号外显子的全部或部分，优选的，包含1号至4号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，进一步优选的，包含1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部，更优选还包含1-2号内含子，更进一步优选的，包含1-4号外显子之间的任一内含子，其中，1号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，例如至少包含5、6、7、8、9、10、50、100、150、200、250、300、350、400、423bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含10bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸为止。
优选的，包含与SEQ ID NO:33具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或SEQ ID NO:33所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ IDNO:33所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ IDNO:33所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的构建方法包括用包含编码人IL36A蛋白的全部或部分核苷酸序列导入非人动物IL36A基因座，进一步优选的，用包含编码与SEQ ID NO:30的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性或者包含编码SEQ ID NO:30的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO:30的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ IDNO:30的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列导入非人动物IL36A基因座。
在本发明的一个具体实施方式中，用包含编码人IL36A蛋白的cDNA序列导入非人动物IL36A基因座。
优选的，本申请中所述的导入包括但不限于插入、替换或转基因，进一步优选的，所述的替换为原位替换。
优选的，所述的供体核苷酸序列在非人动物中通过调控元件进行调控。进一步优选的，所述的调控元件可以是内源或者外源的。
优选的，所述的调控元件包括但不限于内源启动子。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的内源调控元件来自非人动物IL36A基因。所述的外源性调控元件来自人IL36A基因。
优选的，所述的导入非人动物IL36A基因座包括替换非人动物相应区域，优选为替换非人动物基因组中编码SEQ ID NO:29的核苷酸序列。
优选的，替换非人动物IL36A基因的1号外显子至6号外显子的全部或部分，进一步优选的，非人动物的2号外显子的部分、3号外显子至4号外显子的全部和5号外显子的部分被替换。
优选的，所述的插入为首先破坏非人动物内源IL36A基因的编码框，随后进行插入操作，或者所述的插入步骤既可给内源IL36A基因造成移码突变又可以实现插入人源序列的步骤。
优选的，所述非人动物的基因组中至少一个染色体上包含人源化IL36A基因。
优选的，所述的非人动物中至少一个细胞表达人IL36A蛋白或人源化IL36A蛋白。
优选的，使用基因编辑技术进行非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。
优选的，使用靶向载体进行非人动物的构建。
优选的，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化IL36A蛋白的核苷酸序列；
B)人或人源化IL36A基因的核苷酸序列；或，
C)人IL36A基因的1号至4号外显子的全部或部分核苷酸序列；进一步优选的，包含1号至4号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，再进一步优选的,包含1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部，更优选还包含1-2号内含子，更进一步优选的，包含1-4号外显子之间的任一内含子，其中，1号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，例如至少包含5、6、7、8、9、10、50、100、150、200、250、300、350、400、423bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含10bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸为止，优选的，所述的靶向载体包含与SEQ ID NO:33具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ IDNO:33所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自非人动物IL36A基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000068.7的核苷酸至少具有90％同源性；进一步优选的，所述5’臂序列与SEQ ID NO:31或38至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO:31或38所示。
优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区3’端同源的DNA片段，即3’臂，其选自非人动物IL36A基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000068.7的核苷酸至少具有90％同源性；进一步优选的，所述的3’臂序列与SEQ ID NO:32或39至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO:32或39所示。
优选的，所述的靶向载体还包含SEQ ID NO:34、36和/或37。
优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物IL36A基因座上，进一步优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物IL36A基因2号至5号外显子上。
优选的，所述的靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为2个，分别装在抗性基因的两侧。
优选的，为提高重组效率，还可以使用靶向IL36A基因的sgRNA与上述靶向载体一起进行非人动物的构建，其中，所述的sgRNA靶向非人动物IL36A基因，同时所述sgRNA的序列在待改变的IL36A基因上的靶序列上。
优选的，所述sgRNA的靶位点位于IL36A基因的2号外显子至5号外显子序列上。
优选的，所述sgRNA的5’端靶位点位于IL36A基因的2号外显子至3号外显子序列上。
优选的，所述sgRNA的3’端靶位点位于IL36A基因的5号至6号外显子序列上。
优选的，所述sgRNA序列靶向的5’端靶位点序列如SEQ ID NO：40-44任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：45-49任一项所示。
进一步优选的，所述sgRNA序列靶向的5’端靶位点序列如SEQ ID NO：41所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：47所示。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体、上述的靶向IL36A基因的sgRNA及Cas9导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为受精卵)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得IL36A基因人源化的非人动物。
根据本发明的一些实施例，该构建方法进一步包括：将IL36A基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
优选的，所述的其他基因为IL1RL2、PD-1、PD-L1、CD40、OX40、IL6、IL12、IL1RACP、IL23和TNF-α中的至少一种。
优选的，所述的非人动物还表达人或人源化的IL1RL2、PD-1、PD-L1、CD40、OX40、IL6、IL12、IL1RACP、IL23和/或TNF-α蛋白。
优选的，所述的IL1RL2基因为人源化IL1RL2基因，所述的人源化IL1RL2基因选自上述的人源化IL1RL2基因。
优选的，所述的人源化的IL1RL2蛋白选自上述的人源化IL1RL2蛋白。
优选的，所述人或人源化IL36A基因和/或所述其他基因对于内源被替换基因座为纯合或杂合的。
本发明的第九方面，提供了一种IL36A基因人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达人或人源化IL36A蛋白。
优选的，所述的人源化IL36A蛋白包含人IL36A蛋白的全部或部分。
优选的，所述的人源化IL36A蛋白包含人IL36A基因的1号至4号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分，进一步优选的，包含1号至4号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合编码的氨基酸序列的全部或部分，再进一步优选的,包含1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部编码的氨基酸序列的全部或部分，最为优选的，所述的人源化IL36A蛋白包含与SEQ ID NO:33编码的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:33编码的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL36A蛋白中包含的人IL36A蛋白的部分氨基酸序列包含下列组中的一种：
A)包含SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的全部或部分；
B)包含SEQ ID NO:30所示氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；
C)包含SEQ ID NO:30所示所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或，
D)包含SEQ ID NO:30所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的非人动物的内源IL36A蛋白表达降低或缺失。
优选的，所述的非人动物基因组中包含人或人源化IL36A基因，所述的人源化IL36A基因包含人IL36A基因的部分。
优选的，所述的人源化IL36A基因包含人IL36A基因的1号外显子至4号外显子的全部或部分，进一步优选的，包含1号至4号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，再进一步优选的,包含1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部，更优选还包含1-2号内含子，更进一步优选的，包含1-4号外显子之间的任一内含子，其中，1号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，例如至少包含5、6、7、8、9、10、50、100、150、200、250、300、350、400、423bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含10bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸为止。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL36A基因包含SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ IDNO:33所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL36A基因包含编码人IL36A蛋白的全部或部分核苷酸序列；进一步优选的，包含编码与SEQ ID NO:30具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含编码SEQ ID NO:30的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO:30的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO:30的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL36A基因中至少包含SEQ IDNO:34所示核苷酸序列，或包含与SEQ ID NO:34具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL36A基因还包含非人动物IL36A基因的全部或部分。进一步优选包含非人动物IL36A基因的1号至6号外显子的全部或部分，更优选包括非人动物IL36A基因的1号外显子的全部、2号外显子的部分、5号外显子的部分和/或6号外显子的全部。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL36A基因转录的mRNA选自下列组中的一种：
(a)包含SEQ ID NO:35所示核苷酸序列的全部或部分；
(b)包含与SEQ ID NO:35所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
(c)包含与SEQ ID NO:35所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，
(d)包含SEQ ID NO:35所示的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述人或人源化IL36A基因的核苷酸序列可操作地连接到至少一条染色体中内源性IL36A基因座处的内源调控元件。
根据本发明的一些实施例，所述的非人动物进一步包含其他基因修饰，所述其他基因选自IL1RL2、PD-1、PD-L1、CD40、OX40、IL6、IL12、IL1RACP、IL23和TNF-α中的至少一种。
优选的，所述其他基因为IL1RL2，所述IL1RL2基因为人源化IL1RL2基因，进一步优选的，所述的人源化IL1RL2基因如上述的人源化IL1RL2基因。
优选的，所述的包含IL1RL2修饰的非人动物选自上述的IL1RL2基因人源化的非人动物或上述的构建方法制备的非人动物。
根据本发明的一些实施例，所述人或人源化IL36A基因和/或所述其他基因对于内源被替换基因座为纯合或杂合。
优选的，所述的人源化IL36A基因还包括特异性诱导物或阻遏物，进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-OffSystem/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物，进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物，更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物，进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子，更优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠，更进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-(NRG)小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第十方面，提供了一种靶向载体，优选的，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化IL36A蛋白的核苷酸序列；
B)人或人源化IL36A基因的核苷酸序列；或，
C)人IL36A基因的1号至4号外显子的全部或部分核苷酸序列；进一步优选的，包含1号至4号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，再进一步优选的,包含1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部，更优选还包含1-2号内含子，更进一步优选的，包含1-4号外显子之间的任一内含子，其中，1号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，例如至少包含5、6、7、8、9、10、50、100、150、200、250、300、350、400、423bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含10bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸为止，优选的，所述的靶向载体包含与SEQ ID NO:33具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ IDNO:33所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自非人动物IL36A基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000068.7的核苷酸至少具有90％同源性；进一步优选的，所述5’臂序列与SEQ ID NO:31或38至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO:31或38所示。
优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区3’端同源的DNA片段，即3’臂，其选自非人动物IL36A基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000068.7的核苷酸至少具有90％同源性；进一步优选的，所述的3’臂序列与SEQ ID NO:32或39至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO:32或39所示。
优选的，所述的靶向载体还包含SEQ ID NO:34、36和/或37。
优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物IL36A基因座上，进一步优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物IL36A基因2号至5号外显子上。
优选的，所述靶向载体用于IL36A基因人源化的非人动物的构建。
优选的，所述的靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为2个，分别装在抗性基因的两侧。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物，进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物，更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物，进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子，更优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠，更进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-(NRG)小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第十一方面，提供了一种包含上述靶向载体的细胞。
本发明的第十二方面，提供了上述靶向载体，或者上述的细胞在IL36A基因修饰中的应用，优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换。
本发明的第十三方面，提供了一种sgRNA，所述的sgRNA靶向非人动物IL36A基因，同时所述sgRNA的序列在待改变的IL36A基因上的靶序列上。
优选的，所述sgRNA的5’端靶位点位于IL36A基因的2号外显子至3号外显子序列上。
优选的，所述sgRNA的3’端靶位点位于IL36A基因的5号至6号外显子序列上。
优选的，所述的sgRNA的5’端靶位点序列如SEQ ID NO:40-44任一项所示。
优选的，所述的sgRNA的3’端靶位点序列如SEQ ID NO:45-49任一项所示。
本发明的第十四方面，提供了一种编码上述sgRNA的DNA分子。优选的，所述的DNA分子双链分别为上述sgRNA的上下游序列，或者加入酶切位点后的正反向寡核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的DNA分子双链分别为SEQ ID NO:50和SEQID NO:52，SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:53。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的DNA分子双链分别为SEQ ID NO:54和SEQID NO:56，SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:57。
本发明的第十五方面，提供了一种sgRNA载体，所述的sgRNA载体包含上述sgRNA。
本发明的第十六方面，提供了一种包含上述靶向载体、上述sgRNA、上述DNA分子或上述sgRNA载体的细胞。
本发明的第十七方面，提供了一种上述靶向载体、上述sgRNA、上述DNA分子、上述sgRNA载体或上述的细胞在IL36A基因修饰中的应用。优选包含在敲除、插入或替换IL36A基因中的应用。
本发明的第十八方面，提供了一种人源化IL36A基因，所述的人源化IL36A基因包含人IL36A基因的部分。
优选的，所述的非人动物体内包含人IL36A基因的1号外显子至4号外显子的全部或部分，进一步优选的，包含1号至4号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，再进一步优选的,包含1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部，更优选还包含1-2号内含子，更进一步优选的，包含1-4号外显子之间的任一内含子，其中，1号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，例如至少包含5、6、7、8、9、10、50、100、150、200、250、300、350、400、423bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含10bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸为止。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL36A基因包含SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ IDNO:33所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL36A基因包含编码人IL36A蛋白的全部或部分核苷酸序列；进一步优选的，包含编码与SEQ ID NO:30具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含编码SEQ ID NO:30的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO:30的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO:30的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL36A基因中至少包含SEQ IDNO:34所示核苷酸序列，或包含与SEQ ID NO:34具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL36A基因还包含非人动物IL36A基因的全部或部分。进一步优选包含非人动物IL36A基因的1号至6号外显子的全部或部分，更优选包括非人动物IL36A基因的1号外显子的全部、2号外显子的部分、5号外显子的部分和/或6号外显子的全部。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL36A基因转录的mRNA选自下列组中的一种：
(a)包含SEQ ID NO:35所示核苷酸序列的全部或部分；
(b)包含与SEQ ID NO:35所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
(c)包含与SEQ ID NO:35所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，
(d)包含SEQ ID NO:35所示的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL36A基因还包括特异性诱导物或阻遏物，进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-OffSystem/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物，进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物，更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物，进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子，更优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠，更进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-(NRG)小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第十九方面，提供了一种人源化IL36A蛋白，所述的人源化IL36A蛋白由上述的人源化IL36A基因编码获得。
优选的，所述的人源化IL36A蛋白包含人IL36A蛋白的全部或部分。
优选的，所述的人源化IL36A蛋白包含人IL36A基因的1号至4号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分，进一步优选的，包含1号至4号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合编码的氨基酸序列的全部或部分，再进一步优选的,包含1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部编码的氨基酸序列的全部或部分，最为优选的，所述的人源化IL36A蛋白包含与SEQ ID NO:33编码的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:33编码的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL36A蛋白中包含的人IL36A蛋白的部分氨基酸序列包含下列组中的一种：
A)包含SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的全部或部分；
B)包含SEQ ID NO:30所示氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；
C)包含SEQ ID NO:30所示所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或，
D)包含SEQ ID NO:30所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
本发明的第二十方面，提供了一种多基因修饰的非人动物的构建方法，所述的多基因修饰包括多基因人源化，优选的，所述的多基因修饰非人动物表达人或人源化IL1RL2和IL36A蛋白。
优选的，所述的构建方法包括如下步骤：
将非人动物之间进行交配或体外授精；
或者非人动物进行基因编辑获得多基因修饰非人动物。
优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白选自上述的人源化IL1RL2蛋白。
优选的，所述的人源化IL36A蛋白选自上述的人源化IL36A蛋白。
优选的，所述的非人动物进一步包含其他基因修饰，所述的其他基因包括PD-1、PD-L1、CD40、OX40、IL6、IL12、IL1RACP、IL23和TNF-α中至少一种。
优选的，所述的多基因修饰的非人动物为双基因人源化非人动物、三基因人源化非人动物、四基因人源化非人动物、五基因人源化非人动物、六基因人源化非人动物、七基因人源化非人动物、八基因人源化非人动物或九基因人源化非人动物。
优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中人源化的多个基因中的每一个基因均可以是纯合或杂合的。
本发明的第二十一方面，提供了一种上述的构建方法获得的非人动物或其子代。
本发明的第二十二方面，提供了一种IL1RL2基因缺失的非人动物，所述的非人动物缺失IL1RL2基因的全部或部分核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物缺失IL1RL2基因的2号外显子的全部或部分。更进一步优选的，缺失2号外显子的起始密码子。
本发明的第二十三方面，提供了一种IL36A基因缺失的非人动物，所述的非人动物缺失IL36A基因的全部或部分核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物缺失IL36A基因的2号至5号外显子的全部或部分。进一步优选的，缺失2号外显子的部分、3-4号外显子的全部和5号外显子的部分，优选还缺失2-3号内含子和/或4-5号内含子，更进一步优选的，缺失2-5号外显子之间的任一内含子，其中缺失的2号外显子的部分至少包含2号外显子中编码氨基酸的核苷酸序列，缺失的5号外显子的部分包含5号外显子中编码氨基酸的核苷酸序列。
优选的，采用上述靶向IL36A基因的sgRNA制备IL36A基因缺失的非人动物。
本发明的第二十四方面，提供了一种动物模型，所述的动物模型来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物或者上述的非人动物或其子代。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。
本发明的第二十五方面，提供了一种动物模型的构建方法，包括上述构建非人动物、非人动物或其子代、基因缺失的动物或者多基因修饰的非人动物的构建方法。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。
本发明的第二十六方面，提供了来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述构建的多基因修饰的非人动物在制备动物的模型中的应用。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。
本发明的第二十七方面，提供了上述的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的构建方法获得的非人动物或上述的动物模型在制备治疗免疫相关疾病、肿瘤和/或炎症的药物中的应用。
本发明的第二十八方面，提供了一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的动物模型。
本发明的第二十九方面，提供了一种组织或器官或其培养物，所述组织或器官或其培养物来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的动物模型。
本发明的第三十方面，提供了一种荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的动物模型。
本发明的第三十一方面，提供了一种IL36A和/或IL1RL2基因人源化的细胞，所述的细胞表达人或人源化IL36A蛋白，和/或，人或人源化IL1RL2蛋白。优选的，所述的细胞表达上述的人源化IL36A蛋白和/或上述的人源化IL1RL2蛋白。
优选的，所述的细胞的基因组中包含人IL36A和/或IL1RL2基因的部分。进一步优选的，所述的细胞包含上述的人源化IL36A基因和/或上述的人源化IL1RL2基因。
本发明的第三十二方面，提供了一种IL1RL2基因缺失的细胞，所述的细胞缺失IL1RL2基因的全部或部分核苷酸序列。
优选的，所述的细胞缺失IL1RL2基因的2号外显子的全部或部分。更进一步优选的，缺失2号外显子的起始密码子。
本发明的第三十三方面，提供了一种IL36A基因缺失的细胞，所述的细胞缺失IL36A基因的全部或部分核苷酸序列。
优选的，所述的细胞缺失IL36A基因的2号至5号外显子的全部或部分。进一步优选的，缺失2号外显子的部分、3-4号外显子的全部和5号外显子的部分，优选还缺失2-3号内含子和/或4-5号内含子，更进一步优选的，缺失2-5号外显子之间的任一内含子，其中缺失的2号外显子的部分至少包含2号外显子中编码氨基酸的核苷酸序列，缺失的5号外显子的部分包含5号外显子中编码氨基酸的核苷酸序列。
优选的，采用上述靶向IL36A基因的sgRNA制备IL36A基因缺失的细胞。
本发明的第三十四方面，提供了一种表达上述的人源化IL36A蛋白和/或上述的人源化IL1RL2蛋白的构建体。
优选的，所述的构建体包含上述的人源化IL36A基因和/或上述的人源化IL1RL2基因。
本发明的第三十五方面，提供了一种包含上述构建体的细胞。
本发明的第三十六方面，提供了一种包含上述细胞的组织。
本发明的第三十七方面，提供了一种IL1RL2基因人源化非人动物的基因组。
优选的，所述的基因组中包含人或人源化IL1RL2基因的全部或部分，和/或，包含编码人或人源化IL1RL2蛋白的全部或部分的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL1RL2基因为上述的人源化IL1RL2基因。
优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白为上述的人源化IL1RL2蛋白。
优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源IL1RL2基因座处用人IL1RL2基因的基因组片段(优选编码人IL1RL2的信号肽、胞外区和/或跨膜区的全部或部分序列)，和/或，非人动物IL1RL2基因的基因组片段(优选编码非人动物IL1RL2的胞质区的全部或部分序列)，导入非人动物IL1RL2基因的基因组片段以形成经修饰的IL1RL2基因。
优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源IL1RL2基因座处用人源化IL1RL2基因导入非人动物IL1RL2基因的基因组片段以形成经修饰的IL1RL2基因。
所述的经修饰的IL1RL2基因编码人源化IL1RL2蛋白。
优选的，所述的导入为插入或替换。
优选的，所述的插入为插入非人动物IL1RL2基因的2号外显子处。
优选的，所述的经修饰的IL1RL2基因的表达受到非人动物内源调控元件的控制。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
本发明的第三十八方面，提供了一种IL36A基因人源化非人动物的基因组。
优选的，所述的基因组中包含人或人源化IL36A基因的全部或部分，和/或，包含编码人或人源化IL36A蛋白的全部或部分的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL36A基因为上述的人源化IL36A基因。
优选的，所述的人源化IL36A蛋白为上述的人源化IL36A蛋白。
优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源IL36A基因座处用人IL36A基因的基因组片段，和/或，非人动物IL36A基因的基因组片段，导入非人动物IL36A基因的基因组片段以形成经修饰的IL36A基因。
优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源IL36A基因座处用人源化IL36A基因导入非人动物IL36A基因的基因组片段以形成经修饰的IL36A基因。
所述的经修饰的IL36A基因编码人源化IL36A蛋白。
优选的，所述的导入为插入或替换。
优选的，所述的插入为插入非人动物IL36A基因的内源调控元件之后。
优选的，所述的替换为替换非人动物IL36A基因的2号外显子的部分、3号至4号外显子的全部和5号外显子的部分。
优选的，所述的经修饰的IL36A基因的表达受到非人动物内源调控元件的控制。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
本发明的第三十九方面，提供了包含上述IL1RL2和/或IL36A基因人源化非人动物的基因组的细胞、组织或器官。
优选的，上述任一细胞、组织或器官或荷瘤后的瘤组织包括可以发育为动物个体或不能发育为动物个体的细胞、组织或器官或荷瘤后的瘤组织。
本发明的第四十方面，提供了来源于上述的人源化IL36A蛋白、上述的人源化IL36A基因、上述的人源化IL1RL2蛋白、上述的人源化IL1RL2基因、上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的荷瘤或炎症模型、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官或其培养物、上述的荷瘤后的瘤组织、上述的细胞、上述的构建体、上述的细胞或上述的组织的应用，所述的应用包含：
A)涉及人类细胞的与IL36相关的免疫过程的产品开发中的应用；
B)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与IL36相关的模型系统中的应用；
C)涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与IL36相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发治疗策略中的应用；
D)在体内研究人IL36信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；或者，
E)研究IL36基因功能，研究针对人IL36靶位点的药物、药效，研究与IL36相关的免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的应用。
优选的，所述应用包括疾病的治疗和/或诊断方法，或，非疾病的治疗和/或诊断方法。
本发明的第四十一方面，提供了一种人IL36A和/或IL1RL2特异性调节剂的筛选方法，所述的筛选方法包括向植入肿瘤细胞的个体施加调节剂，检测肿瘤抑制性；其中，所述的个体选自上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的动物模型。
优选的，所述的调节剂选自CAR-T、药物；优选的，所述的药物为抗体。
优选的，所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。
优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。
优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。
优选的，所述人IL36A和/或IL1RL2特异性调节剂的筛选方法包括治疗和非治疗方法。
在一个具体实施方式中，该方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
本发明的第四十二方面，提供了一种干预方案的评价方法，所述的评价方法包括向个体植入肿瘤细胞，向植入肿瘤细胞的个体施加干预方案，对施加干预方案后的个体进行肿瘤抑制效果检测和评价；其中，所述的个体选自上述的非人动物，上述的构建方法获得的非人动物，上述的非人动物或其子代或者上述的动物模型。
优选的，所述的干预方案选自CAR-T、药物治疗。进一步优选的，所述的药物为抗原结合蛋白。所述的抗体结合蛋白为抗体。
优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。
优选的，所述干预方案的评价方法包括治疗和非治疗方法。
在一个具体实施方式中，该评价方法对干预方案的效果进行检测和评价，以确定该干预方案是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
本发明的第四十三方面，提供了一种来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的动物模型在制备人IL36A和/或IL1RL2特异性调节剂中的用途。
本发明的第四十四方面，提供了一种来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的动物模型在制备治疗肿瘤、炎症或免疫相关疾病的药物中的用途。
本发明的第四十五方面，提供了一种人用药物筛选或评价的方法，所述的方法包括构建疾病动物模型个体，向疾病动物模型个体给予候选药物，对给予候选药物的个体进行药效检测和/或比较。其中，所述的个体选自上述的构建方法获得的IL36A和/或IL1RL2基因人源化的非人动物、上述的IL36A和/或IL1RL2基因人源化的非人动物、上述的构建方法获得的多基因修饰的非人动物、上述的多基因修饰的非人动物或其子代或者上述的动物模型。
优选的，所述药物筛选或评价的方法包括治疗和非治疗方法。
在一个具体实施方式中，该方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
优选的，所述候选药物包括靶向药物。进一步优选的，所述的靶向药物为抗原结合蛋白。在本发明的一个具体实施方式中，所述的抗原结合蛋白为抗体。
优选的，所述候选药物为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率；优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。
优选的，上述任一的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，上述任一的非人动物还可以选自猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
本发明制备的IL36A基因人源化的非人动物，其体内可以正常表达人或人源化IL36A蛋白，且表达的人或人源化IL36A蛋白可以特异性结合人IL36A抗体。本发明制备的IL1RL2基因人源化的非人动物，其体内可以正常表达人或人源化IL1RL2蛋白，且表达的人或人源化IL1RL2蛋白可以特异性结合人IL1RL2抗体。本发明制备的IL36A和IL1RL2基因双人源化的非人动物，其体内可以正常表达人或人源化IL36A蛋白和人或人源化IL1RL2蛋白，且表达的蛋白可以特异性结合IL36A或IL1RL2抗体。本申请制备的非人动物可以诱导制备多种疾病模型，例如银屑病等。并可用于针对人IL36通路靶位点的药物筛选、药效评估，筛选或评估治疗免疫相关疾病、炎症或肿瘤的药物。本申请制备的IL36A或IL1RL2基因双人源化的非人动物，无论是在制备疾病动物模型还是在筛选、评估治疗免疫相关疾病、炎症或肿瘤的抗体时，均具有相当的优势。
本发明所述的“细胞”可以为受精卵细胞或者其他体细胞，优选包括但不限于血小板、单核细胞、小胶质细胞和内皮细胞、中性粒细胞、活化的巨噬细胞、B细胞前体、树突状细胞、自然杀伤细胞、晚期B细胞或浆细胞等等。因此，根据细胞来源的不同，本申请所述的细胞一部分可以发育为动物个体，一部分不能发育为动物个体。
本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于过敏、哮喘、银屑病、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。在本发明的一个具体实施方式中，可以为银屑病。
本发明所述的“炎症”可以为各个组织或器官的炎症，包括急性和慢性。优选为变质性炎症、渗出性炎症(例如浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、坏死性炎、卡他性炎、增生性炎症、特异性炎症(例如结核、梅毒、麻疯、淋巴肉芽肿等)。在本发明的一个具体实施方式中，可以为溃疡性结肠炎或强直性脊柱炎等等。
本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、非小细胞肺癌、宫颈癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、脑胶质瘤、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤为结肠癌、直肠癌、胃癌、卵巢癌或前列腺癌。
本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。
本发明所述的“人源化IL36A蛋白”，包含来源于人IL36A蛋白的部分和非人IL36A蛋白的部分。
其中，所述的“人源化IL36A蛋白”包含连续或间隔的5-575(优选为10-356)个氨基酸序列与人IL36A蛋白的氨基酸序列一致或与人IL36A蛋白的氨基酸序列具有70％以上同源性。
本发明所述的“人源化IL1RL2蛋白”，包含来源于人IL1RL2蛋白的部分和非人IL1RL2蛋白的部分。
其中，所述的“人源化IL1RL2蛋白”包含连续或间隔的5-158个氨基酸序列与人IL1RL2蛋白的氨基酸序列一致或与人IL1RL2蛋白的氨基酸序列具有70％以上同源性。
本发明所述的“人源化IL36A基因”，包含来源于人IL36A基因的部分和非人IL36A基因的部分。
其中，所述的“人源化IL36A基因”包含连续或间隔的20bp-55938bp(优选为20-2173bp或20-477bp)个核苷酸序列与人IL36A基因的核苷酸序列一致或与人IL36A基因的核苷酸序列具有70％以上同源性。
本发明所述的“人源化IL1RL2基因”，包含来源于人IL1RL2基因的部分和非人IL1RL2基因的部分。
其中，所述的“人源化IL1RL2基因”包含连续或间隔的20bp-5613bp(优选为20-1068bp)个核苷酸序列与人IL1RL2基因的核苷酸序列一致或与人IL1RL2基因的核苷酸序列具有70％以上同源性。
本发明所述的“xx号至xxx号外显子”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，例如所述的“1号至2号外显子”包含1号外显子、1-2号内含子、2号外显子的全部核苷酸序列。
本发明所述的“x-xx号内含子”表示x号外显子与xx号外显子之间的内含子。例如“1-2号内含子”表示1号外显子与2号外显子之间的内含子。
本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段DNA片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“IL36A基因座”表示IL36A基因1号至11号外显子上的任选一段的DNA片段。在本发明的一个具体实施方式中，被插入或替换的IL36A基因座可以是IL36A基因1号至11号外显子上的任选一段的DNA片段。在本发明的一个具体实施方式中，被替换的IL36A基因座可以是IL36A基因2号外显子上的任选一段的DNA片段。
本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、sgRNA、tRNA。
本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗(treating)”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。
本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。
本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。
在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科或鼠总科超家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠。
除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，FritschandManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelsonand M.Simon，eds.inchief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。
下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：小鼠IL1RL2基因和人IL1RL2基因座对比示意图(非按比例)；
图2：小鼠IL1RL2基因人源化改造部分示意图(非按比例)；
图3：IL1RL2基因打靶策略及靶向载体V1设计示意图(非按比例)；
图4：IL1RL2重组后细胞Southern blot结果，其中WT为野生型对照，1-C01、1-C02、1-C03、1-E11、1-H03、2-A01、2-B02、2-B06、2-C03、2-D09、2-G01为克隆编号；
图5：人源化IL1RL2小鼠FRT重组过程示意图(非按比例)；
图6：IL1RL2人源化小鼠F1代鼠尾基因型鉴定结果，其中，M为Marker，WT为野生型，H2O为水对照，PC为阳性对照，F1-01、F1-02、F1-03为鼠尾编号；
图7：RT-PCR检测结果，其中+/+为C57BL/6野生型小鼠，H/H为IL1RL2基因人源化纯合子小鼠，H2O为水对照；
图8：小鼠各组织IHC检测结果；
图9：小鼠IL36A基因和人IL36A基因座对比示意图(非按比例)；
图10：小鼠IL36A基因人源化改造示意图(非按比例)；
图11：IL36A基因打靶策略及靶向载体V2设计示意图(非按比例)；
图12：IL36A基因打靶策略及靶向载体V3设计示意图(非按比例)；
图13：sgRNA1-sgRNA8活性检测结果，其中，Con为阴性对照，PC为阳性对照；
图14：IL36A人源化小鼠F0代鼠尾基因型鉴定结果，其中，M为Marker，WT为野生型，H2O为水对照，PC为阳性对照，F0-01、F0-02为鼠尾编号；
图15：IL36A人源化小鼠F1代Southern blot检测结果，其中WT为野生型对照，F1-01、F1-02、F1-03、F1-04、F1-05、F1-06、F1-07、F1-08为小鼠编号；
图16：IL36A基因人源化纯合子小鼠RT-PCR检测结果，其中+/+为C57BL/6野生型小鼠，H/H为IL1RL2基因人源化纯合子小鼠，H2O为水对照；
图17：Western Blot检测结果，其中+/+为C57BL/6野生型小鼠，H/H为IL36A基因人源化纯合子小鼠，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶内参；
图18：IL1RL2基因人源化纯合子小鼠脾脏中CD45+细胞亚型(A)和T细胞亚型(B)百分比；
图19：IL1RL2基因人源化纯合子小鼠淋巴结中CD45+细胞亚型(A)和T细胞亚型(B)百分比；
图20：IL1RL2基因人源化纯合子小鼠血液中CD45+细胞亚型(A)和T细胞亚型(B)百分比；
图21：使用IL1RL2基因人源化纯合子小鼠进行银屑病体内药效研究中对照组(G1)、造模组(G2)和给药组(G3-G5)小鼠体重统计图；
图22：使用IL1RL2基因人源化纯合子小鼠进行银屑病体内药效研究中对照组(G1)、造模组(G2)和给药组(G3-G5)小鼠银屑病样皮损处红疹评分统计图；
图23：使用IL1RL2基因人源化纯合子小鼠进行银屑病体内药效研究中对照组(G1)、造模组(G2)和给药组(G3-G5)小鼠的银屑病样脱屑评分统计图；
图24：使用IL1RL2基因人源化纯合子小鼠进行银屑病体内药效研究中对照组(G1)、造模组(G2)和不同浓度的抗人IL1RL2抗体给药组(G3-G5)小鼠的PASI综合评分统计图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
C57BL/6小鼠和Flp工具鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心。
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4购自Sigma，货号：L2630；
Attune Nxt Acoustic Focusing Cytometer购自Thermo Fisher，型号AttuneNxt；
PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit购自TAKARA，型号6110A；
HeraeusTM FrescoTM 21Microcentrifuge购自Thermo Fisher，型号Fresco 21；
SpeI、EcoRV、StuI、BglII、AseI、BbsI酶购自NEB，货号分别为R0133M、R0195M、R0187M、R0144M、R0526、R0539L；
UCA试剂盒来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司，货号BCG-DX-001；
Ambion体外转录试剂盒购自Ambion，货号AM1354；
Cas9mRNA来源SIGMA，货号CAS9MRNA-1EA；
重组Anti-IL36 alpha/IL-1F6抗体[EPR23152-241]购自Abcam，货号ab269274；
重组Anti-IL36 alpha/IL-1F6抗体[EPR23089-87]购自Abcam，货号ab269271；
GAPDH Mouse Monoclonal Antibody购自碧云天，货号AF5009；
Anti-IL-36R抗体购自Abcam，货号ab180894；
Purified anti-mouse CD16/32Antibody购自Biolegend，货号101302；
Zombie NIRTM Fixable Viability Kit购自Biolegend，货号423106；
Brilliant Violet 510TM anti-mouse CD45 Antibody购自Biolegend，货号103138；
PerCP anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr-1)Antibody购自Biolegend，货号108426；
Brilliant Violet 421TM anti-mouse CD4 Antibody购自Biolegend，货号100438；
FITC anti-mouse F4/80Antibody购自Biolegend，货号123108；
PE anti-mouse CD8a Antibody购自Biolegend，货号100708；
PE/CyTM 7Mouse anti-mouse NK1.1 Antibody购自BD Pharmingen，货号552878；
APC anti-mouse/rat Foxp3 Antibody购自eBioscience，货号17-5773-82；
FITC anti-Mouse CD19 Antibody购自Biolegend，货号115506；
PerCP/Cy5.5 anti-mouse TCRβchain购自Biolegend，货号109228；
Brilliant Violet 605TManti-mouse CD11c Antibody购自Biolegend，货号117334；
PE anti-mouse/human CD11b Antibody购自Biolegend，货号101208。
实施例1IL1RL2基因人源化小鼠的制备
小鼠IL1RL2基因(NCBI Gene ID：107527，Primary source：MGI：1913107，UniProtID：Q9ERS7，位于1号染色体NC_000067.6的第40324589至40367555位，基于转录本NM_133193.4及其编码蛋白NP_573456.1(SEQ ID NO:1))和人IL1RL2基因(NCBI GeneID：8808，Primary source：HGNC:5999，UniProt ID：Q9HB29，位于2号染色体NC_000002.12的第102186973至102242910位，基于转录本NM_003854.4及其编码蛋白NP_003845.2(SEQ IDNO:2))对比示意图如图1所示。
为了达到本发明的目的，可在小鼠内源IL1RL2基因座上插入人IL1RL2蛋白编码序列，或用人IL1RL2编码序列替换小鼠相应序列，使得该小鼠表达人或人源化IL1RL2蛋白。以插入人IL1RL2蛋白部分编码序列为例，用基因编辑技术对小鼠细胞进行修饰，在小鼠内源IL1RL2调节元件控制下，将人IL1RL2蛋白信号肽、跨膜区和胞外区的编码序列和小鼠胞内区编码序列插入小鼠2号外显子的起始密码子处，并在小鼠胞内区编码序列后插入内源3’UTR和polyA，得到小鼠人源化IL1RL2基因座，其部分示意图如图2所示。
进一步设计如图3所示的打靶策略示意图，图中的靶向载体V1上含有5’同源臂(SEQ ID NO:3)、3’同源臂(SEQ ID NO:4)以及包含人IL1RL2(hIL1RL2)序列(SEQID NO:5)和小鼠IL1RL2(mIL1RL2)序列(SEQ ID NO:6)的A1片段，其中5’同源臂与NCBI登录号为NC_000067.6的第40322546-40326494位核苷酸序列相同；3’同源臂与NCBI登录号为NC_000067.6的第40326498-40330768位核苷酸序列相同。A1片段上，人IL1RL2序列片段、小鼠IL1RL2序列片段、polyA从5’到3’方向顺序连接，其中，人IL1RL2序列与NCBI登录号为NM_003854.4的第77-1144位核苷酸序列相同，小鼠IL1RL2序列与NCBI登录号为NM_133193.4的第1315-4072位核苷酸序列相同；polyA序列如SEQ ID NO:69所示；人IL1RL2序列上游与小鼠的连接设计为5’-TACTTCTACCATTGTCCTCTCTTTTCCTTTGTAGCCTGAG
Figure BDA0003908356210000531
GTCCTTGCTGCTCTGCGGGTTGTCCATCGCCCTTC-3’(SEQ ID NO:7)内，其中序列“CTGAG”的最后一个“G”是小鼠的最后一个核苷酸，序列
Figure BDA0003908356210000532
的“A”是人的第一个核苷酸；小鼠IL1RL2序列下游与POLYA的连接设计为5’-CAGTACATTGACATTTTAAATAAAGTATATTTTAATAAAA
Figure BDA0003908356210000533
TACCGTCGACCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAG-3’(SEQ ID NO:8)，其中序列“TAAAA”的最后一个“A”是小鼠的最后一个核苷酸，序列
Figure BDA0003908356210000534
的第一个“A”是polyA的第一个核苷酸。改造后的人源化小鼠IL1RL2的mRNA序列及其编码的蛋白序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。
靶向载体V1上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。其中Neo盒5’端与polyA的连接设计为5’-AGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGA
Figure BDA0003908356210000535
CGAATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAG-3’(SEQ ID NO:11)内，其中序列“GGGGA”的“A”是polyA序列的最后一个核苷酸，序列
Figure BDA0003908356210000536
的“G”是Neo盒的第一个核苷酸；Neo盒3’端与小鼠的连接设计为5’-ATAGGAACTTCATCAGTCAGGTACATAATTAGGTGGATCC
Figure BDA0003908356210000537
TACATCTTTGCTCTTCTGTGGGGTGTTTTTCCTGC-3’(SEQ ID NO:12)内，其中序列“GATCC”的最后一个“C”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列
Figure BDA0003908356210000538
的“T”是鼠的第一个核苷酸。此外，还在重组载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。
靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接、直接合成等。构建好的重组载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的重组载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞，经PCR鉴定为阳性的克隆再进行Southern Blot(分别用SpeI或EcoRV或StuI消化细胞DNA并使用3个探针进行杂交，具体探针及目的片段的长度如表1所示)检测，Southern Blot结果如图4所示。检测结果表明，鉴定为阳性的11个克隆中，经测序进一步验证，除2-B02外，其它10个为阳性杂合且无随机插入，具体编号为1-C01、1-C02、1-C03、1-E11、1-H03、2-A01、2-B06、2-C03、2-D09、2-G01。
表1：具体探针及目的片段长度
限制性内切酶 探针 野生型片段大小 重组序列片段大小
SpeI 5’Probe 5.3kb 9.4kb
EcoRV 3’Probe 14.7kb 8.4kb
StuI Neo Probe — 5.8kb
PCR测定包括下述引物：
CL-F1：5’-CTGAGGCTCTGTGGTGCTGGTTATC-3’(SEQ ID NO:13)，
CL-R1：5’-TGTCCTTGCATCCATCTGCTGTGACAG-3’(SEQ ID NO:14)；
CL-F2：5’-GCTCGACTAGAGCTTGCGGA-3’(SEQ ID NO:15)，
CL-R2：5’-GTCAAGCAAGATGCGGCTTAGAAGG-3’(SEQ ID NO:16)。
Southern Blot检测包括如下探针引物：
5’探针(5’Probe)：
5’Probe-F：5’-CTAACCATCTTCTTTCTGCAGATGAC-3’(SEQ ID NO:17)，
5’Probe-R：5’-GCTAGTTTTCCAGACGGCTGTCCAT-3’(SEQ ID NO:18)；
3’探针(3’Probe)：
3’Probe-F：5’-CTGGTTCTCCTAATCCCTTTGTTTG-3’(SEQ ID NO:19)，
3’Probe-R：5’-CTTTCAGTATTTACATTCTCTTCAATACAC-3’(SEQ ID NO:20)；
Neo探针(Neo Probe)：
Neo Probe-F：5’-GGATCGGCCATTGAACAAGAT-3’(SEQ ID NO:21)，
Neo Probe-R：5’-CAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3’(SEQ ID NO:22)。
将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图5)后，再通过互相交配即可得到人源化IL1RL2基因纯合子小鼠。可通过PCR鉴定子代小鼠体细胞的基因型(引物如表2所示)，示例性的F1代小鼠(已去除Neo标记基因)的鉴定结果见图6，其中，编号为F1-01、F1-02、F1-03的3只小鼠均为阳性杂合小鼠。
表2：引物名称及具体序列
Figure BDA0003908356210000551
表明使用本方法能构建出可稳定传代且无随机插入的IL1RL2人源化基因工程小鼠。
通过常规检测方法可确认小鼠体内人源化IL1RL2 mRNA的表达情况，例如RT-PCR。具体来说，分别选取8周龄雄性C57BL/6野生型小鼠和本实施例制得的IL1RL2基因人源化纯合子小鼠各1只，脱颈安乐死后取肺部组织，研磨制备细胞悬液，按照TRIzol试剂盒说明书抽提细胞RNA，反转录成cDNA后使用表3所示的引物进行RT-PCR检测，结果如图7所示。从图中可以看出，在C57BL/6野生型小鼠(+/+)体内仅检测到鼠IL1RL2mRNA(图7B)；在IL1RL2基因人源化纯合子小鼠(H/H)体内仅检测到人源化IL1RL2mRNA(图7A)。
表3 RT-PCR引物序列及目的片段
Figure BDA0003908356210000552
Figure BDA0003908356210000561
进一步地，使用咪喹莫特(IMQ)对9周龄雌性C57BL/6野生型小鼠和IL1RL2基因人源化纯合子小鼠进行银屑病造模后，采用进行IHC染色检测小鼠体内人IL1RL2蛋白的表达情况。具体来说，分别选取9周龄C57BL/6野生型小鼠4只和本实施例制备的IL1RL2基因人源化纯合子小鼠2只，分为对照组(G1)和模型组(G2、G3)。实验前3天用剃毛器去除小鼠背部毛发，露出2cm×4cm的皮肤区域。3天后(D0)，模型组使用10mg/cm2 IMQ乳膏每天对小鼠背部皮肤区域进行涂抹，连续涂抹5天，对照组小鼠涂抹凡士林。具体分组情况及造模方式如表4所示。第6天造模结束后对各组小鼠进行安乐死。取小鼠背部皮肤、小肠、肝脏、脑组织进行OCT包埋冰冻切片处理，使用人鼠IL1RL2蛋白交叉识别抗体Anti-IL-36R抗体(ab180894)检测各组织中人源化IL1RL2蛋白的表达情况，染色结果如图8所示，IHC评分结果如表5所示。评分项目包括染色强度及阳性细胞百分比。染色强度评分标准为：无色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；阳性细胞百分比评分标准：阴性为0分，≤10％为1分，11％～50％为2分，51％～75％为3分，＞75％为4分；总分值为将染色强度的分值与阳性细胞百分比的分值相乘，0分为无阳性染色，1～3分为可疑阳性，4～6分为弱阳性，7～9分为中等阳性，10～12分为强阳性。
表4：小鼠分组情况及造模方式
Figure BDA0003908356210000562
表5：小鼠各组织IHC评分总分值
Figure BDA0003908356210000563
IHC染色结果显示，G1组2只小鼠各组织均为阴性检测结果，未检测出IL1RL2蛋白的表达；G2组小鼠的小肠与皮肤组织中检测出IL1RL2蛋白；G3组2只小鼠的小肠与皮肤组织中均检测出IL1RL2蛋白，而且其中1只小鼠的肝脏组织中也检出IL1RL2蛋白的表达。由于检测抗体Anti-IL-36R抗体(ab180894)可交叉识别人鼠IL1RL2蛋白，结合图7的RT-PCR检测结果可知，G2组检出的为鼠IL1RL2蛋白，G3组检出的为人源化IL1RL2蛋白。结果表明，本方法制备的IL1RL2基因人源化小鼠可成功表达人源化IL1RL2蛋白。
更进一步地，通过流式细胞鼠检测IL1RL2基因人源化纯合子小鼠体内免疫分型情况。具体来说，分别选取7周龄雌性C57BL/6野生型小鼠(+/+)和本实施例制备的IL1RL2基因人源化纯合子小鼠(H/H)各3只，脱颈安乐死后收集脾脏、淋巴结和血液组织，分别使用抗鼠CD16/CD32抗体Purified anti-mouse CD16/32Antibody、Zombie NIRTM FixableViability Kit、Brilliant Violet 510TM anti-mouse CD45Antibody、PerCP anti-mouseLy-6G/Ly-6C(Gr-1)Antibody、Brilliant Violet 421TM anti-mouse CD4 Antibody、FITCanti-mouse F4/80Antibody、PE anti-mouse CD8a Antibody、PE/CyTM 7Mouse anti-mouseNK1.1 Antibody、APC anti-mouse/rat Foxp3 Antibody、FITC anti-Mouse CD19Antibody、PerCP/Cy5.5 anti-mouse TCRβchain、APC Hamster Anti-Mouse TCRβChain、Brilliant Violet 605TManti-mouse CD11c Antibody或PE anti-mouse/human CD11bAntibody识别染色后进行流式检测。脾脏、淋巴结和血液中淋巴细胞(特征为CD45+)亚型和T细胞亚型检测结果分别如图18、图19和图20所示。数据显示，IL1RL2基因人源化小鼠脾脏、淋巴结和血液组织中白细胞亚型，包括T细胞(T cells)、B细胞(B cells)、NK细胞(NKcells)、CD4+T细胞(CD4+T cells)、CD8+T细胞(CD8+T cells)、粒细胞(granulocytes)、树突细胞(Dendritic cells)、巨噬细胞(Macrophages)、单核细胞(Monocytes)百分比与C57BL/6野生型小鼠淋巴细胞亚型百分比基本一致；IL1RL2基因人源化小鼠脾脏、淋巴结和血液组织中T细胞亚型，包括CD4+T细胞、CD8+T细胞和Treg细胞百分比同样与C57BL/6野生型小鼠基本一致。结果表明，IL1RL2基因人源化改造没有影响小鼠体内白细胞和T细胞的分化、发育和在淋巴组织中的分布。
另外，选取8周龄雌性野生型C57BL/6小鼠(+/+)和IL1RL2人源化纯合小鼠(H/H)各20只，取外周血进行血常规和血生化检测。血常规检测指标包括：白细胞计数(WBC)，红细胞计数(RBC)，红细胞压积(HCT)，血红蛋白(HGB)，红细胞平均体积(MCV)，红细胞平均血红蛋白(MCH)，红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)，血小板计数(PLT)，淋巴细胞(LYMPH)，单核细胞(MONO)，中性粒细胞(NEUT)。血生化检测指标包括谷丙转氨酶(ALT)，谷草转氨酶(AST)，白蛋白(ALB)，血糖(GLU)，尿素(UREA)，血清肌酐(CREA)，胆固醇(CHOL)，甘油三酯(TG)。血常规检测结果(均值)如表6所示，血生化检测结果如表7所示。
表6血常规检测结果
Figure BDA0003908356210000581
表7血生化检测结果
Figure BDA0003908356210000582
由表6和表7可知，IL1RL2基因人源化改造没有影响小鼠体内血细胞的组成和形态，并且改造后小鼠的肝功能状态与野生型小鼠基本一致。
实施例2IL36A基因人源化小鼠的制备
小鼠IL36A基因(NCBI Gene ID：54448，Primary source：MGI：1859324，UniProt：Q9JLA2，位于2号染色体NC_000068.7的第24215417至24225701位，基于转录本NM_019450.3及其编码蛋白NP_062323.1(SEQ ID NO:29))和人IL36A基因(NCBI GeneID：27179，Primarysource：HGNC：15562，UniProt ID：Q9UHA7，位于2号染色体NC_000002.12的第113005459至113011071位，基于转录本NM_014440.3及其编码蛋白NP_055255.1(SEQ ID NO:30))对比示意图如图9所示。
为了达到本发明的目的，可在小鼠内源IL36A基因座引入编码人IL36A蛋白的核苷酸序列，使得该小鼠表达人IL36A蛋白。具体来说，可以通过基因编辑技术，在小鼠内源IL36A调节元件的控制下，如将至少包含小鼠2号外显子至5号外显子约8.8kb的序列用对应的人DNA序列替换，得到小鼠人源化IL36A基因座，示意图如图10所示。
设计如图11所示的打靶策略，图中显示了靶向载体V2上含有小鼠IL36A基因上游和下游的同源臂序列，以及包含人IL36A序列的A2片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO:31)与NCBI登录号为NC_000068.7第24212600-24215846位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO:32)与NCBI登录号为NC_000068.7第24226002-24229603位核苷酸序列相同；A2片段上包含的人IL36A序列(SEQ ID NO:33)与NCBI登录号为NC_000002.12的第113005872-113008044位核苷酸序列相同；人IL36A序列下游与小鼠的连接设计为5’-AGCCAACACTACTGACTTTGGGTTAACTATGCTGTTTTAA
Figure BDA0003908356210000591
GTCTTGTAATGGGTGCTGCTTCCCAAGCAGAGAAC-3’(SEQ ID NO:34)，其中序列“TTTAA”中的最后一个“A”是人的最后一个核苷酸，序列
Figure BDA0003908356210000592
Figure BDA0003908356210000593
中的第一个“G”是小鼠的第一个核苷酸。改造后的人源化小鼠IL36A的mRNA序列如SEQ ID NO:35所示，其编码的蛋白序列如SEQ ID NO:30所示。
靶向载体V2上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因Neo盒。其中Neo盒5’端与小鼠的连接设计为5’-AGCTGGTGTAGCTAGCCAGCTTGCTCATAGAGAACTCTGT
Figure BDA0003908356210000594
Figure BDA0003908356210000595
TCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCAGGTCT-3’(SEQ ID NO:36)内，其中序列“TCTGT”的最后一个“T”是小鼠的最后一个核苷酸，序列
Figure BDA0003908356210000596
的第一个“G”是NE O盒的第一个核苷酸；NEO盒3’端与小鼠的连接设计为5’-CCCTTCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC
Figure BDA0003908356210000597
CCTTCAGAGGTATGGGATTACAAATGGGACGCACG-3’(SEQ ID NO:37)内，其中序列“ACTTC”的最后一个“C”是NEO盒的最后一个核苷酸，序列
Figure BDA0003908356210000598
的第一个“C”是小鼠的第一个核苷酸。此外，还在重组载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。
靶向构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入野生型小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR检测外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞(黑色鼠)后，按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型小鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因后，再通过互相交配即可得到IL36A基因人源化纯合子小鼠。
此外，还可引入CRISPR/Cas系统进行基因编辑实现小鼠IL36A基因的人源化改造。设计如图12所示的打靶策略，图中显示了靶向载体V3上含有小鼠IL36A基因上游和下游的同源臂序列，以及包含人IL36A序列的A3片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ IDNO:38)与NCBI登录号为NC_000068.7第24213960-24215846位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO:39)与NCBI登录号为NC_000068.7第24224598-24225577位核苷酸序列相同；A3片段上包含的人IL36A序列与图11的A2片段中的人IL36A序列相同。
靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体用于后续实验。
靶序列决定了sgRNA的靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA表达载体的前提。设计并合成识别5’端靶位点(sgRNA1-sgRNA5)、3’端靶位点(sgRNA9-sgRNA13)的sgRNA序列。5’端靶位点和3’端靶位点分别位于IL36A基因的2-3号外显子和5-6号外显子序列上，各sgRNA在IL136A基因上的靶位点序列如下：
sgRNA1靶位点序列(SEQ ID NO:40)：5’-TCCTGAACATGTCTAAGCGAAGG-3’
sgRNA2靶位点序列(SEQ ID NO:41)：5’-AGGATCTTAGTAGTCGTGTGTGG-3’
sgRNA3靶位点序列(SEQ ID NO:42)：5’-ACCTTCGCTTAGACATGTTCAGG-3’
sgRNA4靶位点序列(SEQ ID NO:43)：5’-CTTTCCTTGGGACTGCAGTGAGG-3’
sgRNA5靶位点序列(SEQ ID NO:44)：5’-ACCATAATGAATAAGGAGAAAGG-3’
sgRNA9靶位点序列(SEQ ID NO:45)：5’-CACTGACTTCGAGATGATTGTGG-3’
sgRNA10靶位点序列(SEQ ID NO:46)：5’-GGCTGCAGACTCAAATGTAGAGG-3’
sgRNA11靶位点序列(SEQ ID NO:47)：5’-GTTCTTGGGTCAGAATGAGTGGG-3’
sgRNA12靶位点序列(SEQ ID NO:48)：5’-CATTAAGGTCAGTCTTGTAATGG-3’
sgRNA13靶位点序列(SEQ ID NO:49)：5’-GAGATGATTGTGGTACATTAAGG-3’
表8 UCA检测结果
Figure BDA0003908356210000601
利用UCA试剂盒检测多个sgRNA的活性，从结果可见各sgRNA具有不同活性，检测结果见表8和图13。从中选择sgRNA2和sgRNA11进行后续实验。在其5’端及互补链上分别加上酶切位点得到正向寡核苷酸和反向寡核苷酸(如表9所示)，退火后将退火产物分别连接至pT7-sgRNA质粒(质粒先用BbsI线性化)，获得表达载体pT7-IL36A-2和pT7-IL36A-11。
表9 sgRNA2和sgRNA11序列列表
Figure BDA0003908356210000611
pT7-sgRNA载体由质粒合成公司合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA(SEQ ID NO:58)并依次通过酶切(EcoRI及BamHI)连接至骨架载体(来源Takara，货号3299)上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。
取小鼠的原核期受精卵，例如C57BL/6小鼠，利用显微注射仪将pT7-IL36A-2、pT7-IL36A-11质粒的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)、打靶载体与Cas9 mRNA预混好后注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》(安德拉斯·纳吉，化学工业出版社，2006)中的方法进行受精卵的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，将获得的小鼠(F0代)通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的IL36A基因人源化小鼠品系。
可通过常规检测方法(如PCR分析)鉴定F0代小鼠体细胞的基因型，部分F0代小鼠的示例性鉴定结果见图14，图中编号为F0-01和F0-02的2只小鼠为阳性小鼠，经测序进一步验证这2只小鼠为阳性小鼠且无随机插入。PCR分析引物如表10所示。
表10：引物名称及具体序列
Figure BDA0003908356210000621
其中，引物L-GT-F位置位于IL36A的5’同源臂左侧，R-GT-R位于IL36A的3’同源臂右侧，L-GT-R、R-GT-F、Mut-F、Mut-R均位于人源序列上。
将F0鉴定为阳性的IL36A人源化小鼠与野生型小鼠交配得到F1代小鼠。可使用同样的PCR方法对F1代小鼠进行基因型鉴定，鉴定为阳性的小鼠进行Southern blot检测，确认是否存在随机插入。剪取鼠尾提取基因组DNA，选用BglII酶或AseI酶消化基因组，转膜，杂交。探针5’Probe、3’Probe分别位于人源序列和3’同源臂右侧，具体探针及目的片段的长度见表11。
表11具体探针及目的片段的长度
限制性内切酶 探针 野生型片段大小 重组序列片段大小
BglII 3’Probe 4.6kb 7.7kb
AseI 5’Probe —— 3.9kb
探针合成引物如下：
3’Probe-F(SEQ ID NO:65)：5’-ACTCTCGTTTTCATACTTGAGCAGCA-3’，
3’Probe-R(SEQ ID NO:66)：5’-GAAGAGCCTCTCCATATAAGAGAGTGAA-3’；
5’Probe-F(SEQ ID NO:67)：5’-GCTTAAGGGAGACTGAAGGGTCAGC-3’，
5’Probe-R(SEQ ID NO:68)：5’-CCGACTTTAGCACACATCAGGCAGA-3’。
Southern blot检测结果见图15。综合5’Probe和3’Probe的结果，并进一步经测序验证，8只小鼠均无随机插入，证实这8只小鼠为阳性杂合小鼠且不存在随机插入。这表明使用本方法能构建出可稳定传代，且无随机插入的IL36A基因人源化小鼠。
可通过常规方法检测IL36A基因人源化小鼠体内IL36A mRNA及蛋白的表达情况。具体来说，分别取8周龄雄性C57BL/6野生型小鼠和本实施例制得的IL36A基因人源化纯合子小鼠各1只，脱颈安乐死后取胃部组织，研磨制备细胞悬液，按照TRIzol试剂盒说明书抽提细胞RNA，反转录成cDNA后使用表12所示的引物进行RT-PCR检测，结果如图16所示。从图中可以看出，在C57BL/6野生型小鼠(+/+)体内仅检测到鼠IL36AmRNA；在IL36A基因人源化纯合子小鼠(H/H)体内仅检测到人源化IL36A mRNA。
表12 RT-PCR引物序列及目的片段
Figure BDA0003908356210000631
进一步通过Western Blot方法检测IL36A基因人源化小鼠体内IL36A蛋白的表达情况。具体来说，分别取8周龄雄性C57BL/6野生型小鼠和本实施例制得的IL36A基因人源化纯合子小鼠各1只，脱颈安乐死后取皮肤组织，使用人鼠IL36A交叉识别抗体重组Anti-IL36alpha/IL-1F6抗体[EPR23152-241](ab269274)或抗人IL36A重组Anti-IL36alpha/IL-1F6抗体[EPR23089-87](ab269271)进行Western Blot检测，结果如图17所示。从图中可以看出，在C57BL/6野生型小鼠(+/+)和IL36A基因人源化小鼠(H/H)体内同时检测到人/鼠IL36A蛋白(h/mIL36A)的表达，仅在IL36A基因人源化小鼠体内检测到人IL36A蛋白(hIL36A)的表达。结果表明，本方法制备的IL36A基因人源化小鼠可成功表达人IL36A蛋白。
实施例3药效验证
选取9周龄雌性IL1RL2基因人源化纯合子小鼠30只，随机分组，设置对照组G1、造模组G2和给药组G3-G5(n＝6)。实验开始前2天用剃毛器去除小鼠背部毛发，露出2cm×4cm的皮肤区域。实验开始第0-5天，造模组和给药组小鼠背部皮肤区域涂抹5％咪喹莫特(Imiquimod，IMQ)乳膏(10mg/cm2)进行银屑病造模；对照组小鼠背部皮肤区域涂抹凡士林(10mg/cm2)，连续涂抹6天。实验过程中，G1组不给药处理，G2组腹腔注射市售IgG1-kappa(购自CrownBio,货号C0001)，G3-G5组腹腔注射抗人IL1RL2抗体(Ab1，常规方法制得)。G2-G5组小鼠在实验第0天和第3天给药，共给药2次，全部实验周期为9天。具体给药量和给药方式如表13所示：
表13给药方式
Figure BDA0003908356210000632
Figure BDA0003908356210000641
分组后每天称量小鼠体重，对小鼠进行拍照并观察小鼠背部情况，并对小鼠发病情况进行临床评分。评分项目包括小鼠皮损处红疹及脱屑。每项根据严重程度分为0-4分，PASI评分标准如下：0-无；1-轻度；2-中度；3-重度；4-极重度。对各组小鼠每项评分和两项总分取平均值后进行比较。
从小鼠体重随时间的变化情况(图21)可知，对照组(G1)整个实验周期内体重平稳；造模组(G2)和给药组(G3-G5)体重趋势一致，均从分组后0天开始先下降，2天左右降至最低，再缓慢上升，实验过程中两组体重差异不大，实验终点时所有组小鼠体重接近且无明显差异。如图22-24所示的背部皮肤红疹、脱屑和综合PASI评分结果表明，对照组无一小鼠发病，而造模组和给药组表现出不同程度的疾病。对比造模组和给药组而言，给药组的小鼠皮肤PASI评分明显低于造模组，说明对银屑病模型小鼠给予抗人IL1RL2抗体治疗对银屑病具有治疗作用，其中，G5组使用抗人IL1RL2抗体Ab1剂量为10mg/kg的效果最好。
上述结果证明，本发明的人源化小鼠可以用于建立银屑病模型以评估针对人IL1RL2/IL36A信号通路的药物的体内药效和剂量筛选。
实施例4IL1RL2/IL36A双重人源化小鼠的制备
将实施例1制备得到的IL1RL2基因人源化小鼠与实施例2制备获得的IL36A基因人源化小鼠进行交配繁殖，通过阳性子代小鼠的筛选，最终得到IL1RL2/IL36A基因双人源化小鼠。
实施例5IL1RL2和/或IL36A多重人源化小鼠的制备
利用本方法或制得的IL1RL2和/或IL36A人源化小鼠还可以制备双人源化或多人源化小鼠模型。如，前述实施例1中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于含有PD-1、PD-L1、CD40、OX40、IL6、IL12、IL23、IL1RACP、TNF-α等其它基因修饰的小鼠，或者，也可在人源化IL1RL2和/或IL36A小鼠的基础上，利用分离小鼠ES胚胎干细胞和基因重组打靶技术，获得IL1RL2和/或IL36A与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的IL1RL2和/或IL36A小鼠纯合子或杂合子与其它基因修饰的纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定机率得到人源化IL1RL2和/或IL36A与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子。
利用上述小鼠可以诱导制备多种人类疾病模型，包括银屑病、多发性硬化等模型，可以用于测试人特异性抗体的体内药效。例如，IL1RL2和/或IL36A基因人源化小鼠可用于评估人特异性IL36信号通路药物的药效、药代动力学及在本领域已知的各种疾病模型中的体内治疗功效。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (49)

1.一种IL1RL2基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化IL1RL2蛋白，所述的非人动物基因组包含人或人源化IL1RL2基因。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2蛋白的部分，优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2蛋白胞外区的全部或部分，更优选的，包含人IL1RL2蛋白胞外区至少100个连续氨基酸。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化IL1RL2蛋白还包含人IL1RL2蛋白的跨膜区和/信号肽的全部或部分，优选的，包含人IL1RL2蛋白信号肽至少5个连续氨基酸；和/或，包含人IL1RL2蛋白跨膜区至少5个连续氨基酸。
4.根据权利要求1-3任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化IL1RL2蛋白包含SEQ ID NO：2第1-356位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-356位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-356位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-356位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
5.根据权利要求1-4任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化IL1RL2蛋白还包含非人动物IL1RL2蛋白的部分，优选为非人动物IL1RL2蛋白的胞质区的全部或部分，进一步优选的，包含与SEQ ID NO:1的第360-574位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列；或者，包含SEQ ID NO:1的第360-574位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO:1第360-574位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO:1第360-574位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
6.根据权利要求1-5任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化IL1RL2蛋白的氨基酸序列选自下列组中的一种：
a)包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的全部或部分；
b)包含与SEQ ID NO:10氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；
c)包含与SEQ ID NO:10所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或
d)包含SEQ ID NO:10所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
7.根据权利要求1-6任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化IL1RL2基因包含人IL1RL2基因的部分，优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含人IL1RL2基因的2号至9号外显子的全部或部分，进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号至8号外显子的全部、9号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，9号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，更优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含与SEQ ID NO:5所示核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO:5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
8.根据权利要求1-7任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化IL1RL2基因包含非人动物IL1RL2基因的1号至11号外显子的全部或部分，优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含非人动物IL1RL2基因的9号至11号外显子的全部或部分，进一步优选的，包含9号外显子的部分、10号外显子的全部、11号外显子的部分，更优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含与SEQ ID NO:6所示核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO:6所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQID NO:6所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
9.根据权利要求1-8任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入非人动物IL1RL2基因座。
10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化IL1RL2蛋白的核苷酸序列；
B)编码人IL1RL2蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列，优选编码人IL1RL2蛋白的信号肽、胞外区和/或跨膜区的核苷酸序列的全部或部分，进一步优选的，包含编码人IL1RL2蛋白胞外区至少100个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选还包含编码人IL1RL2蛋白的跨膜区和/信号肽的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人IL1RL2蛋白信号肽至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，优选包含编码人IL1RL2蛋白跨膜区至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选的，包含编码SEQ ID NO：2第1-356位氨基酸的核苷酸序列；
C)人或人源化IL1RL2基因的核苷酸序列；或，
D)人IL1RL2基因的1号至12号外显子的全部或部分，优选的，包含2号至9号外显子的全部或部分，再进一步优选的,包含2号外显子的部分、3号至8号外显子的全部、9号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，9号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，进一步优选的，所述的供体核苷酸序列包含与SEQ ID NO:5和/或6所示核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO:5和/或6所示核苷酸序列。
11.根据权利要求9-10任一所述的构建方法，其特征在于，所述的导入为替换或插入，所述的导入非人动物IL1RL2基因座的导入位置包含非人动物IL1RL2基因的2号外显子，优选的，导入位置为非人动物的2号外显子起始密码子处。
12.根据权利要求1-11任一所述的构建方法，其特征在于，使用靶向载体进行非人动物的构建，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化IL1RL2蛋白的核苷酸序列；
B)编码人IL1RL2蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列，优选编码人IL1RL2蛋白的信号肽、胞外区和/或跨膜区的核苷酸序列的全部或部分，优选的，包含编码人IL1RL2蛋白胞外区至少100个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选还包含编码人IL1RL2蛋白的跨膜区和/信号肽的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人IL1RL2蛋白信号肽至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，优选包含编码人IL1RL2蛋白跨膜区至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选的，包含编码SEQ ID NO：2第1-356位氨基酸的核苷酸序列；
C)人或人源化IL1RL2基因的核苷酸序列；或，
D)人IL1RL2基因的1号至12号外显子的全部或部分，优选的，包含人IL1RL2基因的2号至9号外显子的全部或部分，进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号至8号外显子的全部、9号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，9号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，更优选的，所述的靶向载体包含与SEQ ID NO:5和/或6所示核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO:5和/或6所示核苷酸序列。
13.根据权利要求12所述的构建方法，其特征在于，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂，优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000067.6的核苷酸至少具有90％同源性，进一步优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO：3所示；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000067.6的核苷酸至少具有90％同源性；进一步优选的，所述3’臂序列如SEQ ID NO：4所示。
14.根据权利要求1-13任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将IL1RL2基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物，优选的，所述的其他基因选自IL36A、PD-1、PD-L1、CD40、OX40、IL6、IL12、IL1RACP、IL23和TNF-α中的至少一种。
15.根据权利要求14所述的构建方法，其特征在于，所述其他基因为IL36A，所述IL36A基因为人源化IL36A基因，优选的，所述的人源化IL36A基因包含人IL36A基因的1号外显子至4号外显子的全部或部分，进一步优选的，包含1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部，其中，1号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，更优选的，所述的人源化IL36A基因包含SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
16.一种靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列，优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化IL1RL2蛋白的核苷酸序列；
B)编码人IL1RL2蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人IL1RL2蛋白的信号肽、胞外区和/或跨膜区的核苷酸序列的全部或部分，优选的，包含编码人IL1RL2蛋白胞外区至少100个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选还包含编码人IL1RL2蛋白的跨膜区和/信号肽的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人IL1RL2蛋白信号肽至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，优选包含编码人IL1RL2蛋白跨膜区至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选的，包含编码SEQ ID NO：2第1-356位氨基酸的核苷酸序列；
C)人或人源化IL1RL2基因的核苷酸序列；或，
D)人IL1RL2基因的1号至12号外显子的全部或部分，优选的，包含人IL1RL2基因的2号至9号外显子的全部或部分，进一步优选的,包含2号外显子的部分、3号至8号外显子的全部、9号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，9号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，更进一步优选的，所述的靶向载体包含与SEQ ID NO:5和/或6所示核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO:5和/或6所示核苷酸序列。
17.根据权利要求16所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体还包含5’臂，优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000067.6的核苷酸至少具有90％同源性；进一步优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO:3所示；和/或，所述的靶向载体还包含3’臂，优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000067.6的核苷酸至少具有90％同源性；进一步优选的，所述的3’臂序列如SEQ ID NO:4所示。
18.一种人源化IL1RL2蛋白，其特征在于，所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2蛋白的全部或部分。
19.根据权利要求18所述的人源化IL1RL2蛋白，其特征在于，所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分，优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2蛋白的胞外区的全部或部分，优选的，包含人IL1RL2蛋白的胞外区至少100个连续氨基酸。
20.根据权利要求18或19所述的人源化IL1RL2蛋白，其特征在于，所述的人源化IL1RL2蛋白还包含人IL1RL2蛋白的跨膜区和/或信号肽的全部或部分，优选的，包含人IL1RL2蛋白信号肽至少5个连续氨基酸，和/或，包含人IL1RL2蛋白跨膜区至少5个连续氨基酸。
21.根据权利要求18-20任一所述的人源化IL1RL2蛋白，其特征在于，所述的人源化IL1RL2蛋白包含SEQ ID NO:2的第1-356位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO:2的第1-356位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO:2的第1-356位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO:2的第1-356位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
22.根据权利要求18-21任一所述的人源化IL1RL2蛋白，其特征在于，所述的人源化IL1RL2蛋白还包含非人动物IL1RL2蛋白的部分，优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白还包含非人动物IL1RL2蛋白的胞质区的全部或部分，优选包含SEQ ID NO:1第360-574位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO:1第360-574位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO:1第360-574位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQID NO:1第360-574位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
23.根据权利要求18-22任一所述的人源化IL1RL2蛋白，其特征在于，所述的人源化IL1RL2蛋白的氨基酸序列选自下列组中的一种：
a)包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的全部或部分；
b)包含与SEQ ID NO:10氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；
c)包含与SEQ ID NO:10所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或
d)包含SEQ ID NO:10所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
24.一种人源化IL1RL2基因，其特征在于，所述的人源化IL1RL2基因包含人IL1RL2基因的部分。
25.根据权利要求24所述的人源化IL1RL2基因，其特征在于，所述的人源化IL1RL2基因编码权利要求18-23任一所述的人源化IL1RL2蛋白。
26.根据权利要求24或25所述的人源化IL1RL2基因，其特征在于，所述的人源化IL1RL2基因包含人IL1RL2基因的2号至9号外显子的全部或部分，优选的，包含2号外显子的部分、3号至8号外显子的全部、9号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，9号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，进一步优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
27.根据权利要求24-26任一所述的人源化IL1RL2基因，其特征在于，所述的人源化IL1RL2基因还包含非人动物IL1RL2基因的部分，优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含非人动物IL1RL2基因的1号至11号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含非人动物IL1RL2基因的9号至11号外显子的全部或部分，更优选的，包含9号外显子的部分、10号外显子的全部、11号外显子的部分，更进一步优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
28.根据权利要求24-27任一所述的人源化IL1RL2基因，其特征在于，所述的人源化IL1RL2基因的核苷酸序列转录的mRNA选自下列组中的一种：
(a)转录的mRNA为SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的全部或部分；
(b)转录的mRNA与SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的同一性至少为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
(c)转录的mRNA与SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列
(d)转录的mRNA具有SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或，
(e)包含SEQ ID NO:7和/或8所示核苷酸序列。
29.一种IL36A基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化IL36A蛋白，所述的非人动物基因组包含人或人源化IL36A基因。
30.根据权利要求29所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化IL36A蛋白包含人IL36A蛋白的部分，优选的，所述的人源化IL36A蛋白包含SEQ ID NO：30所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：30所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：30所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：30所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
31.根据权利要求29或30所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化IL36A基因包含人IL36A基因的部分，优选的，所述的人源化IL36A基因包含人IL36A基因的1号外显子至4号外显子的全部或部分，其中，1号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，进一步优选的，所述的人源化IL36A基因包含SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
32.根据权利要求29-31任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化IL36A基因还包含非人动物IL36A基因的全部或部分，优选包含非人动物IL36A基因的1号至6号外显子的全部或部分，进一步优选包括非人动物IL36A基因的1号外显子的全部、2号外显子的部分、5号外显子的部分和/或6号外显子的全部。
33.根据权利要求29-32任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入非人动物IL36A基因座。
34.根据权利要求33所述的构建方法，其特征在于，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化IL36A蛋白的核苷酸序列；
B)人或人源化IL36A基因的核苷酸序列；或，
C)人IL36A基因的1号至4号外显子的全部或部分，优选的，包含1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部，其中，1号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，进一步优选的，所述的供体核苷酸序列包含与SEQ ID NO:33所示核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO:33所示核苷酸序列。
35.根据权利要求33-34任一所述的构建方法，其特征在于，所述的导入非人动物IL36A基因座包括替换非人动物相应区域，优选的，替换非人动物IL36A基因的1号外显子至6号外显子的全部或部分，进一步优选的，替换非人动物的2号外显子的部分、3号外显子至4号外显子的全部和5号外显子的部分。
36.根据权利要求29-35任一所述的构建方法，其特征在于，使用靶向载体进行非人动物的构建，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化IL36A蛋白的核苷酸序列；
B)人或人源化IL36A基因的核苷酸序列；或，
C)人IL36A基因的1号至4号外显子的全部或部分核苷酸序列；优选的，包含1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部，其中，1号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，进一步优选的，所述的靶向载体包含与SEQ ID NO:33具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
37.根据权利要求36所述的构建方法，其特征在于，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂，优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000068.7的核苷酸至少具有90％同源性，进一步优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO：31或38所示；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000068.7的核苷酸至少具有90％同源性；进一步优选的，所述3’臂序列如SEQ ID NO：32或39所示。
38.根据权利要求29-37任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将IL36A基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物，优选的，所述的其他基因选自IL1RL2、PD-1、PD-L1、CD40、OX40、IL6、IL12、IL1RACP、IL23和TNF-α中的至少一种。
39.根据权利要求38所述的构建方法，其特征在于，所述其他基因为IL1RL2，所述IL1RL2基因为人源化IL1RL2基因，优选的，所述的人源化IL1RL2基因为权利要求24-28任一所述的人源化IL1RL2基因。
40.一种靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列，优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化IL36A蛋白的核苷酸序列；
B)人或人源化IL36A基因的核苷酸序列；或，
C)人IL36A基因的1号至4号外显子的全部或部分核苷酸序列；优选的,包含1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部，其中，1号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，优选的，所述的靶向载体包含与SEQ ID NO:33具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQID NO:33所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
41.根据权利要求40所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体还包含5’臂，优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000068.7的核苷酸至少具有90％同源性；进一步优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO:31或38所示；和/或，所述的靶向载体还包含3’臂，优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000068.7的核苷酸至少具有90％同源性；进一步优选的，所述的3’臂序列如SEQ ID NO:32或39所示。
42.一种人源化IL36A基因，其特征在于，所述的人源化IL36A基因包含人IL36A基因的部分。
43.根据权利要求42所述的人源化IL36A基因，其特征在于，所述的非人动物体内包含人IL36A基因的1号外显子至4号外显子的全部或部分，优选的，包含1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部，其中，1号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，优选的，所述的人源化IL36A基因包含SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
44.根据权利要求42-43任一所述的人源化IL36A基因，其特征在于，所述的人源化IL36A基因还包括非人动物IL36A基因的1号外显子的全部、2号外显子的部分、5号外显子的部分和/或6号外显子的全部。
45.根据权利要求42-44任一所述的人源化IL36A基因，其特征在于，所述的人源化IL36A基因的核苷酸序列转录的mRNA选自下列组中的一种：
(a)转录的mRNA为SEQ ID NO:35所示核苷酸序列的全部或部分；
(b)转录的mRNA与SEQ ID NO:35所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
(c)转录的mRNA与SEQ ID NO:35所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；
(d)转录的mRNA具有SEQ ID NO:35所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或，
(e)包含SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列。
46.一种人源化IL36A蛋白，其特征在于，所述的人源化IL36A蛋白由权利要求42-45任一所述的人源化IL36A基因编码。
47.一种细胞、组织或器官，其特征在于，所述的细胞、组织或者器官的基因组中包含权利要求24-28任一所述的人源化IL1RL2基因和/或权利要求42-45任一所述的人源化IL36A基因，所述的细胞、组织或器官表达权利要求18-23任一所述的人源化IL1RL2蛋白和/或权利要求46任一所述的人源化IL36A蛋白，或者，所述的细胞、组织或器官来源于权利要求1-15和29-39任一所述的构建方法获得的非人动物。
48.一种瘤组织，其特征在于，所述的瘤组织表达权利要求18-23任一所述的人源化IL1RL2蛋白和/或权利要求46任一所述的人源化IL36A蛋白，或者，所述的瘤组织的基因组包含权利要求24-28任一所述的人源化IL1RL2基因和/或权利要求42-45任一所述的人源化IL36A基因，或者，所述的瘤组织来源于权利要求1-15和29-39任一所述的构建方法获得的非人动物。
49.一种权利要求18-23任一所述的人源化IL1RL2蛋白、权利要求46任一所述的人源化IL36A蛋白、权利要求24-28任一所述的人源化IL1RL2基因、权利要求42-45任一所述的人源化IL36A基因或权利要求1-15和29-39任一所述的构建方法获得的非人动物、权利要求47所述的细胞、组织或器官或权利要求48所述的瘤组织的应用，其特征在于，所述的应用包含：
A)涉及人类细胞的与IL36相关的免疫过程的产品开发中的应用；
B)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与IL36相关的模型系统中的应用；
C)涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与IL36相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发治疗策略中的应用；
D)在体内研究人IL36信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；或者，
E)研究IL36基因功能，研究针对人IL36靶位点的药物、药效，研究与IL36相关的免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的应用。
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