JP2024505084A

JP2024505084A - 送達プラットフォーム

Info

Publication number: JP2024505084A
Application number: JP2023546206A
Authority: JP
Inventors: マイケルマグワイア; シャーリーオデイ
Original assignee: アヴェクタスリミテッド
Priority date: 2021-02-01
Filing date: 2022-02-01
Publication date: 2024-02-02
Also published as: EP4284910A1; CA3206787A1; AU2022213019A1; US20240110144A1; CN117203319A; WO2022162646A1

Abstract

本主題は、細胞中へのペイロード/カーゴ化合物および組成物のベクターフリー送達および/またはウイルス送達のための細胞操作プラットフォームを提供する。本プラットフォームは、細胞への送達を、迅速にかつ簡単な使用方法で達成する。関連する装置、システム、技術、物品、および組成物も記載される。TIFF2024505084000004.tif132156

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2020年2月1日に出願された「Reversible Permeabilization Platform」と題する米国仮特許出願第63/144,136号に対して米国特許法第119条に基づく優先権を主張する。前記米国仮特許出願の全内容は特に、参照によりその全体が、本明細書に組み入れられる。

技術分野
本明細書記載の主題は、溶液ベースの細胞内送達を用いる細胞操作プラットフォームに関する。

背景
異なる細胞タイプ間および異なる細胞内送達方法間では細胞内送達効率にばらつきが生じる。細胞内送達後に十分な量の生存細胞を得るには、大規模細胞操作プラットフォームを必要とする場合があり、前記大規模細胞操作プラットフォームは、作動させるのに費用がかさむ場合があり、かつ、より多量の標的細胞および試薬培地を必要としうる。より少量の標的細胞を可逆的に透過処理することで高品質の繰り返し可能な実験データを迅速に生成することは、従来のシステムおよび方法を使うと、時間がかかり、手作業集約的になりうる。

概要
一局面において、方法は、細胞操作プラットフォームのポッドを、細胞と第1の培地との混合物で満たす工程、およびフィルターを通して第1の培地をポッドから排出し、フィルター上に堆積した細胞を残す工程を含む。細胞操作プラットフォームは、アトマイザーと、ポッドを受容するように構成されたポッドホルダーとを備える。ポッドは、細胞と培地とを保持するためのウェルを形成するフィルタープレートおよび上側部分を備える。

以下の特徴のうちの1つまたは複数が、実現可能な任意の組合せで含まれうる。例えば、透過処理剤とペイロードとを含有する送達溶液を、フィルター上に堆積した細胞上にスプレーすることができる。停止溶液を適用することができる。フィルターから細胞を再懸濁させるために、ポッドを第2の培地で満たすことができる。排出された第1の培地を第2の培地として再使用することができる。ポッドを撹拌することができる。再懸濁された細胞はポッドから取り出すことができる。ポッドを満たすことは、ポンプと制御装置とで自動的に行うことができる。細胞はポッド内で培養することができる。第1の培地をポッドから排出することは、ポッドの底部に真空を提供することによって行うことができる。ポッドからの第1の培地の排出は重力によって行うことができる。停止溶液を適用することは、細胞を洗浄するために行うことができる。ポッドを第2の培地で満たすことは、細胞洗浄プロセス、細胞濃度変更プロセス、および細胞培地変更プロセスのうちの少なくとも1つとして行うことができる。

ポッドは、解放可能にフィルタープレートに連結された下側部分を備えることができる。ポッドは、少なくとも1つのプロセスパラメータを特徴決定するデータを格納するメモリを備えることができる。前記少なくとも1つのプロセスパラメータはメモリから細胞操作プラットフォームの制御装置によって読み取ることができる。前記少なくとも1つの処理パラメータを用いる少なくとも1つの処理工程を行うことができる。ポッドは、実験識別子を特徴決定するデータを格納するメモリを備えることができる。

別の一局面において、システムは、ポッドを受容するように構成されたポッドホルダーを含む筐体であって、ポッドが、ウェルを形成するフィルタープレートおよび上側部分を含む、筐体；微粒化された送達溶液をウェルに送達するように構成された送達溶液適用装置；ディスプレイ；および少なくとも1つのプロセスパラメータを表示するように構成された回路構成を備える制御装置、を備える。

以下の特徴のうちの1つまたは複数が、実現可能な任意の組合せで含まれうる。例えばポッドホルダーは、ポッドを傾斜または振動させるように構成することができる。送達溶液適用装置はスプレーヘッドを備えることができる。ポッドは、1×10⁷個未満のT細胞を保持するサイズであることができる。システムは、微粒化された送達溶液を、ポッド内のフィルター上に形成された細胞単層に自動的に適用するように、構成することができる。送達溶液適用装置はネブライザーを備えることができる。送達溶液適用装置は、ネブライザーを作動させるためのガス流量を調節するために、質量流量制御装置または体積流量制御装置を、さらに備えることができる。送達溶液適用装置は、1回の作動で10～300マイクロリットルの送達溶液を送達するように構成される。

送達溶液は、ペイロードと濃度2パーセント（v/v）超のアルコールとを含む水溶液を含むことができる。アルコールはエタノールを含むことができる。水溶液は5％超のエタノールを含むことができる。水溶液は5～30％のエタノールを含むことができる。水溶液は12％または25％のエタノールを含むことができる。水溶液は12.5～500mMのKClを含むことができる。水溶液は106mMのKClを含むことができる。ウェルは、非接着細胞の集団を含有するように構成することができる。非接着細胞は末梢血単核球を含むことができる。非接着細胞は免疫細胞を含むことができる。非接着細胞はTリンパ球を含むことができる。ペイロードはメッセンジャーリボ核酸（mRNA）を含むことができる。mRNAは遺伝子編集組成物をコードすることができる。遺伝子編集組成物はPD-1の発現を低減することができる。mRNAはキメラ抗原受容体をコードすることができる。

本システムは、カーゴ化合物またはカーゴ組成物を哺乳動物細胞に送達するために使用することができる。非接着細胞の集団は単層を構成することができる。

別の一局面において、システムは、ベースと、システムの作動を制御するように構成された回路構成を備える少なくとも1つの制御装置と、ディスプレイとを含む、筐体を備える。本システムは、少なくとも1つのバルブと、少なくとも1つのポンプと、シリンジと、少なくとも1つの流体検出センサーとを備える、1つまたは複数の流体回路;筐体の前面から延びる関節式フレーム（articulating frame）内に受容されたチャンバーアセンブリであって、作動中は雰囲気条件から封鎖され、かつフィルターを備えている、チャンバーアセンブリ;少なくとも1つの培地容器;1つまたは複数の流体回路を介してチャンバーアセンブリに流体連結された少なくとも1つの細胞培養容器;および培地または細胞を受容するように構成された少なくとも1つの収集トレイ、をさらに備える。

以下の特徴のうちの1つまたは複数が、実現可能な任意の組合せで含まれうる。例えば関節式フレームは、チャンバーアセンブリを撹拌するように構成することができる。チャンバーアセンブリは、少なくとも1つのプロセスパラメータを特徴決定するデータを格納するメモリを備えることができる。前記少なくとも1つの制御装置は、少なくとも1つのプロセスパラメータを特徴決定するデータを、メモリから回路構成によって読み取り、かつ前記少なくとも1つの処理パラメータを用いる少なくとも1つの処理工程を回路構成によって行うように、構成することができる。チャンバーアセンブリは、実験識別子を特徴決定するデータを格納するメモリを備えることができる。

いくつかの実施形態において、システムの作動は、細胞洗浄プロセス、細胞濃度変更プロセス、および細胞培地変更プロセスのうちの少なくとも1つを含むことができる。ディスプレイは、システムの作動に関連する入力を受容するように構成されたヒューマンマシンインターフェースを備えることができる。関節式フレームは、システムが位置する水平面に対して、0～10.0、10.1～15.0、15.1～20.0、20.1～25.0、25.1～30.0、30.1～35.0、35.1～40.0、または40.1～45.0度の角度まで関節運動する（articulate）ことができる。関節式フレームは、所定の周波数またはユーザー定義の周波数で2つの角度の間を往復することができる。所定の周波数またはユーザー定義の周波数は、0～0.5kHz、0.51～1.0kHz、1.1～1.5kHz、1.51～2.0kHz、2.01～2.5kHz、または2.51kHz超であることができる。前記少なくとも1つの収集トレイは冷却要素または加熱要素を備えることができる。

いくつかの実施形態において、ベースは、前記少なくとも1つの収集トレイの下に位置するはかりを備えることができる。前記少なくとも1つの流体検出センサーは、前記1つまたは複数の流体回路のうちの少なくとも1つの流体回路に対して配置することができる。第1の流体検出センサーを、前記少なくとも1つの流体回路の第1の場所において構成することができ、第2の流体検出センサーを、前記少なくとも1つの流体回路の第2の場所において構成することができる。第1の流体検出センサーおよび第2の流体検出センサーは、前記少なくとも1つの流体回路の第1の場所と第2の場所の間の培地の体積を算出するように作動可能であることができる。前記少なくとも1つのポンプは蠕動ポンプであることができる。システムは、シリンジを保持するためのシリンジホルダーを備えることができる。シリンジホルダーは、シリンジ内の流体のレベルまたはシリンジのプランジャーの位置を決定するように構成された光学センサーを備えることができる。光学センサーは、複数の光学センサーのアレイを備えることができる。

いくつかの実施形態において、システムは、システムに機器を通信可能に連結するように構成された少なくとも1つの電気的コネクタを備えることができる。前記機器は、温度計、液体比重計、気圧計、フォトプレチスモグラフセンサー、ロードセル、生化学センサー、光学センサー、変換器、または微小電子機械のうちの少なくとも1つを備えることができる。システムは、第1のガス供給源を第1のガス回路を介してチャンバーアセンブリに連結する少なくとも1つの第1のガスコネクタを備えることができる。システムは、第2のガス供給源を第2のガス回路を介してチャンバーアセンブリに連結する第2のガスコネクタを備え、第2のコネクタは前記少なくとも1つの第1のガスコネクタとは独立して作動するように構成される。システムは、培地の供給源をチャンバーアセンブリの上に位置させるように構成された少なくとも1つのハンガーを備えることができる。ハンガーは、培地の供給源の重量を測定するためにハンガー内に構成されたはかりを備えることができる。システムはバーコードリーダーを備えることができる。システムはチューブ溶接機を備えることができる。システムは、チャンバーアセンブリを少なくとも部分的に取り囲む断熱ジャケットまたは伝導性ジャケットを備えることができる。

チャンバーアセンブリの内面は、内面への細胞の移動性または接着を支援するように構成されたコーティングまたはパターンを備えることができる。チャンバーアセンブリは、フィルターを備える下側部分から取り外し可能な上側部分を備えることができる。フィルターは、フィルターへの細胞の移動性または接着を支援するように構成されたコーティングまたはパターンを備えることができる。上側部分は、ガスを第1のガス回路から受容することができるガスポートを備えることができる。上側部分は、散気装置開口部と、散気装置開口部内に位置する散気装置とを備えることができ、散気装置は第2のガス回路に連結される。上側部分は、スプレーヘッド開口部と、スプレーヘッド開口部内に位置するスプレーヘッドとを備えることができる。スプレーヘッドは、第1のガス回路に連結されたガス注入ポート、および、ペイロードとアルコールとを含む等張水溶液の供給源に連結された流体注入ポートを備えることができる。

前記少なくとも1つの制御装置は、チャンバーアセンブリ内の圧力、温度、およびガス組成のうちの1つまたは複数を制御するように構成することができる。ガス組成物は、二酸化炭素、窒素、または酸素のうちの少なくとも1つを含むことができる。チャンバーアセンブリは加熱要素を備えることができる。システムは、細胞をインキュベートするためのバイオリアクターとして使用するために構成することができる。システムは細胞凍結保存プロセスにおいて使用するために構成することができる。システムは細胞透過処理プロセスにおいて使用するために構成することができる。システムは細胞形質導入プロセスにおいて使用するために構成することができる。システムは細胞トランスフェクションプロセスにおいて使用するために構成することができる。

さらに別の局面において、アルコールの非存在下でカーゴを細胞に送達するために使用するためのデバイスが提供される。デバイスは、ベースと、デバイスの作動を制御するように構成された回路構成を備える少なくとも1つの制御装置と、ディスプレイとを含む、筐体を備える。本システムは、少なくとも1つのバルブと、少なくとも1つのポンプと、シリンジと、少なくとも1つの流体検出センサーとを備える、1つまたは複数の流体回路;筐体の前面から延びる関節式フレーム内に受容されたチャンバーアセンブリであって、作動中は雰囲気条件から封鎖され、かつフィルターを備えている、チャンバーアセンブリ;少なくとも1つの培地容器;1つまたは複数の流体回路を介してチャンバーアセンブリに流体連結された少なくとも1つの細胞培養容器;および培地または細胞を受容するように構成された少なくとも1つの収集トレイ、をさらに備える。

本明細書に記載する主題の1つまたは複数の変形物の詳細を、添付の図面および以下の説明において述べる。本明細書に記載する主題の他の特徴および利点は以下の説明および図面ならびに特許請求の範囲から明らかになる。

本明細書に開示するいくつかの態様による送達プラットフォームの例示的一態様を図解するコンピュータ支援設計（computer aided design:CAD）図面の等角図である。図2Aは、図1に示す送達プラットフォームの側面図である。図2Bは図1に示す送達プラットフォームの正面図である。本明細書において開示するいくつかの態様による、図1に示す送達プラットフォームの別の例示的一態様の側面図である。図1に示す送達プラットフォームのベースアセンブリの例示的一態様を図解するCAD図面の等角図である。図1に示すプラットフォームのいくつかの実施形態の空気圧回路図（pneumatic diagram）である。図1に示す送達プラットフォームのスパインアセンブリの例示的一態様を図解するCAD図面の等角図である。図1に示す送達プラットフォームのトップアセンブリの例示的一態様を図解するCAD図面の等角図である。図1に示す送達プラットフォームのトップアセンブリの例示的一態様を図解するCAD図面の等角図である。図7A～7Eは、図1の送達プラットフォームの例示的エッペンドルフベース支持体を図解するCAD図面である。図8A～8Eは、図1の送達プラットフォームのクリッパード（clippard）モジュールの例示的上側装着部を図解するCAD図面である。図9A～9Hは、図1の送達プラットフォームのクリッパードモジュールの例示的下側装着部を図解するCAD図面である。図9-1の説明を参照のこと。図10A～Gは、図1の送達プラットフォームにおける使用のための例示的アトマイザーを図解している。図10-1の説明を参照のこと。図11A～11Eは、図1の送達プラットフォームの例示的スプレーヘッドベース装着プラットフォームを図解するCAD図面である。図12A～12Dは、図1の送達プラットフォームのポッド設置ネストの例示的な一態様の上側部分を図解するCAD図面である。図13～13Cは、図1の送達プラットフォームのポッド設置ネストの例示的な一態様の下側部分を図解するCAD図面である。図14A～14Fは、図1の送達プラットフォームの例示的ポッドネストカバーを図解するCAD図面である。図1に示す送達プラットフォームにおける使用のためのポッドアセンブリの例示的一態様の画像である。図16A～16Cは、図15に示すポッドアセンブリの構成要素の例示的態様の画像である。図16Dは、図15のポッドアセンブリの別の例示的一態様である。図1の送達プラットフォームのポッドネスト内のポッドアセンブリの例示的な一態様を図解するCAD図面の等角図である。図17に示す例示的な一態様の断面図である。図19A～19Cは、図15のポッドアセンブリのフィルタープレート連結部の例示的態様を図解するCAD図面である。図1の送達プラットフォームを使った細胞への送達のためのプロセスの例示的一態様を図解するフロー図である。図21A～Bは、ポッドを積み重ねて処理するための例示的フレームを図解している。いくつかの例示的実施形態による例示的スプレーガードを図解している。本明細書に開示するいくつかの態様による送達プラットフォームの別の例示的一態様の画像を示している。図23に示すプラットフォームの外観を示している。図23に示すプラットフォームの第2の外観を示している。図23に示すプラットフォームの一部分のクローズアップ像を示している。図23に示す送達プラットフォームの使い捨てアセンブリの例示的一態様の画像を示している。図27に示す使い捨てアセンブリのスプレーヘッドの例示的一態様の画像を示している。 RNPの同時送達のための実験計画法の概略図を示している。Cas9 RNP-TRAC sgRNAを、2:1の比、0.4μg/μLで調製した（1×10⁶個の細胞につき3.3μgに相当する）。S緩衝溶液を、0、5、10および15％のエタノールで、およびRNPで調製し、実験は、各エタノール濃度のS緩衝溶液を使って、SOLUPORE（登録商標）送達システムで実行した。 CD3を標的とする抗体で染色した細胞（生存集団からゲーティングしたもの）からの代表的フローサイトメトリープロットを図解している。無処理（UT）細胞はCD3に関して＞93％の陽性を示し、図1に関して図解した例示的送達プラットフォームによるTRAC RNPの送達後は、それが低減した。処理された試料には2つの明確に異なる集団が観察され、左側の集団（ゲーティングされたもの）はCD3染色に関して陰性の細胞を示している。この陰性の集団は、送達溶液中にエタノールが存在しない試料での約59％から、エタノールが存在する試料では、約67％へと増加した。Cas9タンパク質の沈殿が起こらないエタノールの存在量には限度がある（0.4μg/μL Cas9 RNPでは＞20％のエタノール）。図1に関して図解した例示的送達プラットフォームによるTRAC RNP（2:1のガイド対Cas9モル比;1×10⁶個の細胞あたり3.3μg）の送達後72時間の活性化T細胞における、1条件あたり2～3回の繰り返しからの平均CD3陰性集団（±標準偏差）を表す棒グラフである。送達溶液にカーゴと共に加えられるエタノールの濃度を増加させた。CD3編集のレベルは、エタノールの濃度を増加させると（0％EtOH-58％から15％EtOH-66％へと）わずかに増加した。「UT」は無処理対照細胞を表す。図1に関して図解した例示的送達プラットフォームによるTRAC RNPの送達後72時間における各群からのCD3陰性発現の平均、標準偏差、平均の標準誤差および変動係数を表す表である。エタノール濃度を増加させた場合の、送達前、送達後（3日目）および送達後（5日目）からなる時点における、生存百分率を図示する棒グラフである。図33Aは、エタノールを含まない水溶液の方が、エタノールを含有する溶液と比較して、同じ圧力で、より大きな小滴サイズを示すことを表す線グラフである。グラフに示されているとおり、直径がおよそ10μmである細胞（例えばヒトT細胞）と類似するスプレー粒子サイズを達成するには、過剰に大きな小滴を避けることを含めて細胞サイズに近い小滴サイズ範囲を維持するために、スプレー小滴サイズが、より高い微粒化圧力の適用を必要とする。図33Bは、エタノールを含む水溶液が（同じ圧力ならエタノールを含まない水溶液と比較して）より小さな小滴サイズを示すことを表す、線グラフである。図34Aおよび図35Bは、溶液中に12％のエタノールを使用し、2つの緩衝溶液からスクロースおよび塩化ナトリウムの比率を増加させることで、GFPトランスフェクションの増加が達成されたことを表す棒グラフである。細胞生存率も維持された。図35Aおよび図35Bは、溶液中に27％のエタノールを使用し、2つの緩衝溶液からスクロースおよび塩化ナトリウムの比率を増加させることで、GFPトランスフェクションの増加が達成されたことを表す棒グラフである。細胞生存率も維持された。さまざまな図中の類似する符号は類似する要素を示す。浸透圧ギャップがもっぱらエタノールによるものであることを、エタノール添加後の血清浸透圧測定値とエタノール添加前の血清浸透圧測定値の間の相違およびmg/dLで表した血清中エタノール濃度とに基づいて、実証する線形回帰分析を表す線グラフである。浸透圧ギャップ（mOsm/kg H2O）＝0.234（エタノール［mg/dL］）-1.427（95％CI:傾き0.226～0.243、切片-2.971～0.118）。図36は、Nguyen,M.et al「Front.Med.Is the Osmolal Concentration of Ethanol Greater Than Its Molar Concentration？Jan 8,2020、「Nguyen」、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）からの転載である。高張溶液がトランスフェクションを増加させることを表す棒グラフである。生存率に対する高張溶液の効果を表す棒グラフである。

詳細な説明
多少の進歩はあったものの、細胞中へのある特定の粒子および/または分子の送達は、今なお難しい課題である。細胞に送達されるべき分子のサイズまたは電荷などの因子が、細胞中への分子の送達を制限しおよび/または妨げうる。特に、細胞膜を横切る送達は、分子および/または細胞の膜のせいで、複雑になりうる。細胞膜または形質膜は半透性の生体膜であり、これは選択的障壁として作用する。膜は、細胞の内部化学組成を調節する。細胞にとっての選択的障壁として、膜は、ある特定の分子だけが、例えば細胞中への受動拡散によって、膜を横切って受動的に移動することを許しうる。小さな疎水性分子（例えばO₂、CO₂、およびN₂）および小さな非荷電極性分子（例えばH₂Oおよびグリセロール）は、細胞膜を横切って受動的に拡散することができる。より大きな非荷電極性分子（例えばアミノ酸、グルコースおよびヌクレオチド）とイオン（例えばH^＋、Na^＋、K^＋、およびCl^-）は、細胞膜を横切って受動的に拡散することはできない。

可逆的透過処理は、研究開発環境だけでなく、臨床の場でも、化合物の細胞内送達に使用することができる。例えば、臨床的または治療的処置方法では、細胞を、患者から取り出し、単離（例えば濃縮または富化）し、次に細胞操作方法で処理することができる。操作された細胞は増大させて、患者に戻すことができる。細胞膜を横切る送達には、ウイルスベクターを用いる方法を使用することができる。しかしウイルスベクターに基づく方法は一般に多額の費用と複雑なプロセスを必要とし、利用可能性に制限が生じ、ばらつきやすく一貫性のない結果を与える。エレクトロポレーションに基づく方法も使用することができる。しかしエレクトロポレーションに基づく方法は一般に、より高い細胞損傷をもたらし、不十分な細胞回収率および細胞機能性を与える。

本開示の目的は、細胞操作技術の費用および複雑さという難題に対処するために、溶液ベースの送達を提供することである。細胞治療のための信頼できて一貫性のある方法を提供するために、本主題は、化合物または化合物の混合物（例えばペイロード）を、細胞を、ペイロードを含有する送達溶液と接触させることにより、細胞膜を横切って細胞中に送達するための、細胞操作方法およびプラットフォームを提供することができる。細胞は浮遊細胞であるか、または接着性でありうる。いくつかの実施形態において、細胞膜を横切る細胞中へのペイロードの送達は、細胞膜を可逆的に透過処理する（これは細胞ポレーション（cell poration）プロセスということもできる）ための作用物質を溶液に含めることによって行うことができる。さらに、細胞のポレーションは、細胞膜を透過処理し、細胞膜を横切って細胞中にペイロードを送達するプロセスを指すこともできる。

本主題の一部の実施形態は、処理された細胞が高い生存率と発現を有することから、臨床グレードのトランスフェクションを提供することができる、細胞操作のためのプラットフォームを提供することができる。加えて、本送達プラットフォームは、より小規模な細胞処理を提供することができ、より少量の細胞、例えば0.5M～15M個の細胞が関与する実験計画法に使用することができる。本プラットフォームは、例えば本明細書においてさらに詳しく説明する細胞操作プロセスを行うための使い捨てポッドを使用することなどにより、使いやすくする特徴を備えることができる。いくつかの態様において、ポッドは再使用可能であることができる。いくつかの態様において、ポッドはチャンバーであることができる。本システムは、容易な実施と繰り返し可能な細胞処理とを可能にする制御特徴を備えることができる。いくつかの実施形態は、例えば研究開発作業において、とりわけ有用であることができる。本プラットフォームは、非接着細胞中へのペイロード/カーゴ化合物および組成物のベクターフリー送達にも使用することができる。

本開示のプラットフォームを使って、他の細胞操作プロセスを、送達プロセスの前および/または後に行ってもよく、それにより、生産性を有意に増強し、プロセス全体を合理化することができる。さらにまた、非ウイルストランスフェクション法だけでなく、ウイルス法も、単一のプラットフォーム内で行いうる。

本明細書記載の送達プラットフォームは、非接着細胞の集団を容易する工程、および前記細胞の集団を、ある体積の等張水溶液と接触させる工程であって、前記水溶液がペイロードを含む、工程を行うことによって、非接着細胞の形質膜を横切るペイロードの送達を達成することができる。いくつかの実施形態において、前記水溶液はアルコールを含まない（例えば前記溶液にはアルコールが存在しない（例えば0％のエタノール））。いくつかの実施形態において、前記溶液は、0.2パーセント（v/v）を上回る濃度のアルコールを含むこともできる。例えば、前記アルコールはエタノール（例えば5％超のエタノール、10％超のエタノールなど）を含む。いくつかの例において、水溶液は20～30％のエタノール、例えば27％のエタノールを含む。他の組成も可能である。

本主題は、細胞ポレーションプロセスを自動化し、細胞への送達をさまざまなスケールで行うことを可能にすることができるプラットフォームも、提供することができる。細胞をプラットフォームに手動で充填しおよび/またはプラットフォームから手動で取り出す場合、システムのスループットは制限され、臨床プロセス/処置への適用には困難が生じる。オペレーターおよび/またはさまざまな環境パラメータに依存する汚染および一貫性のないプロセスへの懸念が生じうる。プロセスの自動化により、送達プロセスを、より一貫して行うことができ、汚染への懸念が有意に低減されうるので、本システムは、より容易にスケール変更することができる。手動プロセスおよび自動プロセスによる送達プロセスを行うための送達プラットフォームの例示的な一態様を以下に説明する。

いくつかの態様による例示的ポッドを図15～19に示し、以下に、より詳しく説明する。この例示的ポットは、上側部分1605、フィルタープレート1610および下側部分1615を備える。いくつかの実施形態において、ポッドは、具体的な細胞集団および細胞サイズ用に設計されうる。例えばポッドは、培養に基づいて異なる下側部分を備えることができる。本明細書にいうポッドは、例えばチャンバー、チャンバーアセンブリ、使い捨てアセンブリ、またはディスポーザブルアセンブリと呼ぶこともできる。

いくつかの実施形態において、ポッドは、クリップで一つに留められる複数の部品を有するのではなく、単一の成形品として製造されうる。ポッドは、この単一の基材中に結合されたそのフィルターメンブレンを有しうる。ポッドは、より小さな細胞集団を処理しうるように、より小さな直径を持つフィルターを有しうる。ポッドは、フィルレベルを示すためにそこに成形された刻印を有するか、またはプラットフォーム内での配向が一貫していることを保証するための成形された特徴を有しうる。ポッドは、それがポッドホルダー内に保持されること、または装置の外側に積み重なることを可能にするための複数の特徴を有しうる。ポッドは、その中での細胞のインキュベーションを容易にするための、蓋特徴を有しうる。ポッドは、フィルターの下の空洞内に培養用培地が維持されることを可能にするために、またはポッドの使用後に細胞を懸濁状態に保つためにフィルター媒体上に培養用培地を支持するために、実装された一方向チェックバルブを有しうる。

別の一例として、一部のポッドは、フィルタープレート上から流体を引っ張るために、下側部分に設置されたハイドロスコピックフォーム（hydroscopic foam）を備えることができる。そのようなアプローチは、フィルタープレート上に形成された細胞単層から送達および/またはペイロード溶液を引っ張り、それによって細胞集団と送達および/またはペイロード溶液との接触の長さを制御するために使用することができる。例示的フォームは、3M（商標）Tegaderm（商標）フォームドレッシング（非粘着性）である。

別の一例として、下側部分は孔を含まず、平らな組織培養処理面（tissue cultured treated surface）を備えることができる。そのような実施形態は、接着細胞集団にとって、接着を増強するのに好適でありうる。平坦な面を持つそのような実施形態は、組織外植片または操作された組織への送達に用いることができる。

いくつかの実施形態において、ポッドは細胞を培養するのに好適であることができる。細胞はポッドから直ちに除去するのではなく、細胞を、ある期間、例えば数時間または数日にわたって、培養することができる。そのような実施形態では、ポッドを培養適合性材料で作ることができ、ポッドの蓋を設けることができる。

いくつかの実施形態において、ポッドは、プロセスパラメータを格納するメモリを備えることができる。例えばポッドメモリは、ポッドが細胞操作プラットフォームに挿入された時に、細胞操作プラットフォーム上の制御装置がポッドメモリからプロセスパラメータを読み取るように、プロセスパラメータをプログラムすることができる。細胞操作は、プロセス重要パラメータを使って、例えば自動的に（例えば細胞に送達される溶液の量は制御装置によって決定されうる）、またはディスプレイでユーザーに指示を表示することによって、進行しうる。送達プロセスを実行する前にプロセスパラメータがポッド上に格納されていることにより、繰り返し精度を改良することができる。なぜなら、ユーザーはプラットフォームにプロセスパラメータを入力する必要がなくなるからである。

別の一例において、プロセスパラメータはまず、細胞操作プラットフォームの制御装置に読み込まれ、それらのパラメータを使って、送達プロセスが行われる。プロセスの完了後に、細胞操作プラットフォームは、今後の参考のために、プロセスパラメータをポッドメモリに書き込むことができる。これらのプロセスパラメータには、用いられた任意のパラメータまたは細胞中へのペイロードの送達に関係すると本明細書に記載される任意のパラメータが含まれうる。例えば、溶液組成、ばく露の長さ、インキュベーション時間、洗浄サイクル、温度、スプレーの特徴、圧力、体積（例えば適用される送達溶液、導入する培地などの体積）、細胞の特徴などといった送達プロトコール。

いくつかの実施形態において、細胞操作プラットフォームは、実験識別子、日付、時間などの情報を、今後の使用および/または参考のために、ポッドメモリに書き込むことができる。いくつかの実施形態において、ポッドは互いに連通することができる。例えば、複数のポッドを保持するように適合させた容器または筐体は、容器が第1のポッドのメモリからデータを読み取り、そのデータの一部または全部を、その容器に含まれる他のポッドにコピーするように、ポッド間に接続点を備えることができる。そのようなアプローチも繰り返し精度を改良することができる。なぜなら、ひとたび第1のポッドがプロセス重要パラメータをプログラムされれば、そのデータは他のポッドに、データの一部または全部に変更を加えることなく、複製されるからである。

いくつかの実施形態において、ポッドは、メモリ、プロセッサ、および/または通信モジュール、例えば細胞操作プラットフォームおよび/または他のポッドと通信することができる近距離無線通信モジュールまたは無線周波数識別（radio frequency identification:RFID）通信モジュールを備えることができる。いくつかの実施形態において、ポッドは、ポッドが細胞操作プラットフォームに挿入された場合に細胞操作プラットフォームと通信するための電気接点を備えることができる。他の実施形態も可能である。

例1
図1は、本明細書に開示するいくつかの態様による送達プラットフォーム100の例示的一態様を図解するコンピュータ支援設計（CAD）図面の等角図である。送達プラットフォーム100は、ポッドネスト110内に受容され位置するように構成されたポッド105を備える。例示的ポッド105を図15～19に図解する。ポッド105は、上側部分1605、フィルタープレート1610および下側部分1615を備えることができる。ポッド105は、フィルタープレート1610によって処理面を提供することができ、その上に、細胞を処置および処理のために提供することができる。例えばフィルタープレート1610は、送達プラットフォーム100を使って処理される細胞の単層を形成させるのに使用するためのフィルターを受容するように構成することができる。

ポッド105は、ポッドネスト110内に受容され位置することができる。いくつかの態様において、アトマイザーネスト115は、ポッド105上の固定された距離にあることができる。アトマイザーネスト115は、ユーザーが用いことができる変数の数または自由度を減らし、それによって、使用がより容易なシステムを提供するために、ポッドネスト110から固定された距離にあることができる。例えばアトマイザーネスト115は、ポッド105の上、約75mmに固定することができる。ポッドネスト110は、ポッド105を受容するための円形開口部を備えることができる。ポッド105の下側部分1615は、下側部分1615を、ポッドネスト110の円形開口部を通って延びるフィルタープレート1610の一部分と連結することにより、フィルタープレート1610にかみ合わせることができる。ポッドネスト110は、ポッド105に支持を提供することができ、送達プラットフォーム100を使った細胞処理中に、ポッド105の位置を維持しておくことができる。例えばポッドネスト110は、ポッド105の位置を維持することで、ポッド105の処理面、例えばフィルタープレート1610が、妥当な量の送達溶液を受容するのに十分な場所に設置されることを保証することができる。

図1にさらに示すように、送達プラットフォーム100はアトマイザーネスト115を備える。アトマイザーネスト115は、送達プラットフォーム100内に構成された送達溶液源に連結されたアトマイザーを備えることができる。アトマイザーは、ポッド105のフィルタープレート上に構成させた細胞を処理または処置するために、送達溶液を微粒化して、送達溶液をポッド105に（例えばスプレーの形態で）提供することができる。アトマイザーネスト115は、クリッパードバリューコネクタ（clippard value connector）などのバルブコネクタ120を介して送達溶液源に連結することができる。アトマイザーネスト115内に構成されたアトマイザーは、ポッド105に所定の圧力で送達溶液を提供するように構成することができる。送達プラットフォーム100は、試料圧力コネクタ125および空気圧力コネクタ130も備える。バルブコネクタ120は、アトマイザーへの送達溶液の適用を制御する役割を果たす。試料圧力コネクタ125は、試料をアトマイザーに押し込むために、エッペンドルフリザーバ中の流体上のガスを加圧する。ガス圧力コネクタ130は加圧されたガスをアトマイザーに供給する。

送達プラットフォーム100は電源入力135も備える。いくつかの態様において、電源入力135は、2チャンネル直流（DC）24V電源入力135を備えることができる。電源入力135はオン/オフスイッチ140に電気的に連結されうる。送達プラットフォーム100は、ヒューマンマシンインターフェース（human machine interface:HMI）ケーブル連結部145も備える。HMIケーブル連結部145はHMI150に電気的に連結されうる。HMI150は、送達プラットフォーム100の作動を制御し、本明細書記載の送達による細胞処置方法を行うように構成された、ディスプレイ、少なくとも1つのデータプロセッサ、および入力デバイスを備えることができる。いくつかの態様において、HMI 150はタッチスクリーンインターフェースを備えることができる。いくつかの態様において、HMI 150は、プロセスガイド、実験用タイマーなどを備えることができる。HMIケーブル連結部145は、送達プラットフォーム100から離れた場所に設置されたコンピューティングデバイスにHMI 150を連結するように構成することができる。このようにして、送達プラットフォーム100にデータを出し入れすることができる。

送達プラットフォーム100は空気供給源連結部155をさらに備える。空気供給源連結部155は、送達プラットフォーム100を空気供給源に連結することができる。空気供給源は、ポッド105に送達溶液を提供するために、ある量の空気を構成するのに使用するための空気を、空気供給源連結部155を介して提供するために使用することができる。

図2Aは、図1に示す送達プラットフォーム100の側面図である。図2Aに示すように、送達プラットフォーム100はエンクロージャ205を備えることができる。エンクロージャ205は、電源入力135、HMIケーブル連結部145および空気供給源連結部155に対応するいくつかの切抜き部を備えることができる。限定するわけではないがエンクロージャ205内に追加の切抜き部を設けることができる。例えばエンクロージャ210は複数の通気口210を備えることができる。エンクロージャ205はベースプレート215に固定することができる。ベースプレート215は複数の脚220を備えることができる。いくつかの態様において、脚220はプラスチック製であることができ、送達プラットフォーム100を面に固着するために摩擦低減材を含むことができる。

図2Bは図1に示す送達プラットフォーム100の正面図である。図2Bに示すように、送達プラットフォーム100はHMI 150を備えることができ、HMI 150はディスプレイ225を備えることができる。ディスプレイ225は、送達プラットフォーム100の作動の1つまたは複数の局面に対応するデータおよびユーザーインターフェース制御の可視化を提供することができる。例えば、いくつかの態様において、ディスプレイ225は、細胞への送達方法の1つまたは複数の作動を行うように構成されたタッチスクリーン制御を提供することができる。いくつかの態様において、HMI 150はタイマーを備えることができ、そのタイマーとタイマー制御は、ディスプレイ225を介して表示されうる。

いくつかの実施形態において、送達プラットフォーム100は、微粒化（例えばスプレーしぶき）を封じ込めるためのスプレーガードデバイスを備えることができる。一例において、スプレーガードは、ポッドネストの外側輪郭と同じ内径を有する透明な半円筒系のデバイスである。いくつかの実施形態において、スプレーガードはシールされたデバイスではないが、ある程度の封じ込めを与える。スプレーガードはデバイスの前面にクリップで留められる。図22は例示的スプレーガードを図解している。

図3は、本明細書において開示するいくつかの態様による、図1に示す送達プラットフォーム100の別の例示的一態様の側面図を示す線図300である。図3に示すように、バルブは、管系の1つまたは複数の部分を介して、アトマイザーネスト115に連結することができる。空気圧フィッティング330は、例えばFesto 6mm - 6mm隔壁フィッティング（カタログ番号193951）を備えることができる。例えば管系の第1の部分305はバルブをエッペンドルフベース支持体310に連結することができる。エッペンドルフベース支持体310は、送達プラットフォーム100の上部カバー315に連結することができる。

エッペンドルフベース支持体310は、ペイロードリザーバを空間に保持するブラケットを備えることができる。例示的リザーバとして、エッペンドルフブランドの1.5mL遠心バイアルが挙げられる。リザーバは、それをエッペンドルフベース支持体310に固着するための機構として、その位置が永続的に固定されていても、固定されていなくてもよい。

管系の第2の部分320は、エッペンドルフベース支持体310をアトマイザーネスト115に連結することができる。送達溶液は、送達プラットフォーム100内の供給源から、バルブを通り、管系310を介して、エッペンドルフベース支持体310に運ばれうる。送達溶液は、管系320を介して、アトマイザーネスト115に、さらに供給されうる。アトマイザーネスト115内に受容されたら、送達溶液はポッドネスト110内に位置するポッド105に提供されうる。ポッドネスト115内に構成されるアトマイザーは、送達溶液をスプレーパターン325でポッド105に送達するように構成することができる。スプレーパターン325は、送達溶液が提供される圧力設定に基づいて構成変更可能でありうる。いくつかの態様において、スプレーパターン325は、アトマイザーネスト115内のアトマイザーの構成に関連しうる。スプレーパターン325の寸法、例えばスプレー角、被覆面積および/または中心点などは、アトマイザーネスト115の構成変更可能な局面である。

図4Aは、図1に示す送達プラットフォーム100のベースアセンブリ400の例示的一態様を図解するCAD図面の等角図である。図4Aに示すように、ベースアセンブリ400はベースプレート215および脚220を備える。各脚220は、ネジ405により、ベースプレート215に固着することができる。いくつかの態様において、ネジ405は、M4×10ステンレス鋼ネジを含むことができる。図4Aにさらに示すように、ベースアセンブリ400は垂直装着スパイン410を備える。垂直装着スパイン410は、ポッドネスト110およびアトマイザーネスト115のための支持および連結機構のベースを提供することができる。垂直装着スパイン410は、ベース215とエンクロージャ205とに連結することができる。エンクロージャ215は、1つまたは複数の支持体を介して、ベースアセンブリ400に連結することができる。例えばベースアセンブリ400は、第1の後部カバー支持体415および第2の後部カバー支持体420を備える。第2の後部カバー支持体420は、1つまたは複数のネジ425によって、ベースプレート215に連結することができる。いくつかの態様において、ネジ425はM4×16ステンレス鋼ネジであることができる。エンクロージャ215は、1つまたは複数のネジ430によって、第2の後部カバー支持体420に連結することができる。いくつかの態様において、ネジ430はM4×10極低頭ネジを含むことができる。垂直装着スパインは、1つまたは複数のネジ435によって、ベースプレート215に連結することができる。いくつかの態様において、ネジ435はM6×16ステンレス鋼ネジを含むことができる。

図4Aにさらに示すように、ベースアセンブリ400は圧力レギュレータ440を備える。圧力レギュレータ440は、1つまたは複数のネジ445によって、ベースプレート215に固着することができる。圧力レギュレータ440は、回路基板を介して、電源入力135に連結することができる。圧力レギュレータ440は、アトマイザーネスト115を介してポッド105に供給される送達溶液の圧力の量を制御するように構成することができる。

圧力レギュレータ440は、送達プラットフォーム100のいくつかの実施形態の空気圧図が含まれる図4Bに図解するように、空気圧接続点のネットワークを介して、流体源に連結される。レギュレータ440は、1MPaの最大入力圧力範囲および0.005～0.5MPaの出力範囲ならびに200LPMの最大流量を有する。

いくつかの態様において、ネジ445はM6×10穴付きキャップ（socket head cap）ネジを含むことができる。

図5は、図1に示す送達プラットフォーム100のスパインアセンブリ500の例示的一態様を図解するCAD図面の等角図である。図5に示すように、アトマイザーネスト115は、垂直装着スパイン410に連結することができる。破線の枠内に示すアトマイザーネスト115は、スプレーヘッドベース装着プラットフォーム505およびクリッパードモジュール上側装着部510を備える。複数のダウエルピン515が、クリッパードモジュール上側装着部510をスプレーヘッドベース装着プラットフォーム505に連結する。いくつかの態様において、ダウエルピン515は4×20mmであることができる。クリッパードモジュール上側装着部510は、さらに、スプレーヘッドベース装着プラットフォーム505に、ネジ520を介して連結することができる。いくつかの態様において、ネジはM6×16穴付きキャップネジであることができる。クリッパードモジュール上側装着部510は、ツマミ525を介して、エッペンドルフベース支持体310に連結されうる。いくつかの態様において、ツマミ525は刻み付きツマミ525を含むことができる。ツマミ525は、クリッパードモジュール上側装着部510をエッペンドルフベース支持体310に連結するために、M4×10mmネジなどのネジを備えることができる。

図5にさらに示すように、アトマイザーネスト115はクリッパードモジュール下側装着部530も備える。クリッパードモジュール下側装着部530は、複数の磁石535によってスプレーヘッドベース装着プラットフォーム505に連結することができる。いくつかの態様において、磁石530は6×6mmであることができる。クリッパードモジュール下側装着部535は、複数のネジ540によって、スプレーヘッドベース装着プラットフォーム505に、さらに固着することができる。いくつかの態様において、ネジ540はM3×6mm皿キャップ（flat head cap）ネジを含むことができる。

スプレーヘッドベース装着プラットフォーム505は、複数のダウエルピン545によって、垂直装着スパイン410に連結することができる。いくつかの態様において、ダウエルピン545は6×25mmであることができる。さらにネジ550が、スプレーヘッドベース装着プラットフォーム505を垂直装着スパイン410に連結する。いくつかの態様において、ネジ550はM6×20ステンレス鋼ネジを含むことができる。スパインアセンブリ500はシャフト555も備える。シャフト555は、電気および空気圧部分構成要素ベースプレートを装着するために構成することができる。いくつかの態様において、シャフト555はロータリーステップシャフト（rotary stepped shaft）555を含むことができる。

図5にさらに示すように、ポッドネスト110は、複数の套管560によって垂直装着スパイン410に連結される。いくつかの態様において、套管560は切欠き付きタイプの套管を含むことができる。ポッドネスト120は套管560上に滑り落ちるように構成することができる。ポッドネスト110は、ネジ565によっても、垂直装着スパイン410に連結することができる。いくつかの態様において、ネジ565はM6×10穴付きキャップネジを含むことができる。

図6Aは、図1に示す送達プラットフォーム100のトップアセンブリ600の例示的一態様を図解するCAD図面の等角図である。トップアセンブリ600は上部カバー315を備える。上部カバー315は、複数のネジ615によって、支持体リブ610に固着することができる。いくつかの態様において、ネジ615はM4×10極低頭ネジを含むことができる。上部カバー315は、クリッパードバルブコネクタ120、試料圧力コネクタ125および空気圧力コネクタ130のための切抜き部も備えることができる。いくつかの態様において、クリッパードバルブコネクタ120は、青色ナットで構成された2ピンソケットコネクタを備えることができる。いくつかの態様において、試料圧力コネクタ125は隔壁チューブフィッティングを備えることができる。いくつかの態様において、空気圧力コネクタ130は押し込み隔壁コネクタを備えることができる。トップアセンブリ600は、図6Bに図解されている、外側カバーの折り返し部分を中央のスパイン410に固着するように構成されたネジ620も備える。いくつかの態様において、ネジ620はM4×6ステンレス鋼ネジを含むことができる。

図6Aに示すように、垂直装着スパイン410は、複数のネジ625によって支持体リブ610に固着することができる。いくつかの態様において、ネジ625はM6×16ステンレス鋼ネジであることができる。加えて、トップアセンブリ600は1つまたは複数の支持体を備えることができる。支持体630は複数のネジによって支持体リブ610に連結することができる。支持体635は、複数のネジ640によって支持体リブ610に連結することができる。いくつかの態様において、ネジ640はM4×16ステンレス鋼ネジであることができる。支持体645も、複数のネジによって、支持体リブ610に連結することができる。

図6Aにさらに示すように、HMI 150は、ボールエンドジョイントアセンブリ650に固定することができる。ボールジョイントアセンブリ650は、送達プラットフォーム100のオペレーターが、HMI 150を見やすいように位置決めすることを可能にする。ボールエンドジョイントアセンブリ650は、図2に関連して先に述べたように、エンクロージャ205の一部分に連結することができる。ボールエンドジョイントアセンブリ650はボールジョイントソケット655を備えることができる。ボールジョイントソケット655は、ボールエンドジョイント660に連結することができる。いくつかの態様において、ボールエンドジョイント660はM8×40ステンレス鋼ネジを備えることができる。ボールエンドジョイントアセンブリ650はジョイントアセンブリ装着プレート665も備え、これはHMI装着プレート670に連結することができる。HMI装着プレート670は、複数のネジ680によってHMI前部エンクロージャ675に固着することができる。いくつかの態様において、ネジ680はM4×10ボタンステンレス鋼ネジを含むことができる。図6Aにさらに示すように、HMI装着プレート670は、HMI 150のディスプレイ155および/または回路構成が生成する熱を逃がすために、複数の切抜き部685を備えることができる。

図7A～7Eは、図1の送達プラットフォーム100の例示的エッペンドルフベース支持体を図解するCAD図面である。図7A～7Eに示すエッペンドルフベース支持体は、図3および図5に示すエッペンドルフベース支持体310に対応する。図7A～7Eに示すエッペンドルフベース310の寸法は例示であり、エッペンドルフベース支持体310のサイズまたは構成を限定しようとするものではない。エッペンドルフベース支持体310は、ペイロードリザーバを空間に保持するブラケットを備える。ペイロードリザーバは決まった場所に固着されるのではなく、ユーザーは、いかなるクランプ機構も解除することなく、ペイロードリザーバを自由にブラケットから取り出すことができる。

図7Aは、エッペンドルフベース310の第1の末端の水平断面図を示す。図7Aからわかるように、エッペンドルフベース310は複数の孔705とスロット710とを備える。孔705はクランプ機構を使用するための特徴である。スロット710は、アセンブリ115の部品としてのブラケット510にクリッパードピンチバルブをネジで固着することを容易にし、ピンチバルブとアトマイザーの間の距離を変化させることを可能にする。

図7Aにさらに示すように、エッペンドルフベース310は、図5に関連して示し説明したツマミ525のネジ部分を受容するように構成された孔715を備える。

図7Bにエッペンドルフベース310の見下ろし図を示す。エッペンドルフベース310は、装着面720と、装着面720から延びるフランジ部分725を備える。装着面720は、エッペンドルフベース310を上部カバー315に装着するように構成された複数の孔705を備えることができる。装着面720は、開口部730のうち、フランジ725に最も近い場所に、切欠き735を持つように構成された、開口部730を備える。開口部730は、開口部730の一部のまわりを周方向に延びる凹部740を備えることができる。ペイロードリザーバは開口部730に置かれる。切欠き735は、ペイロードリザーバのシール形成とリザーバからアトマイザーへの流体の移動とを容易にするElveflow部分構成要素（図示していない）のための位置決め特徴である。

図7Cに装着面720の側面図を示す。凹部740を装着面720の上面に形成させることができ、円形開口部730は装着面720を通って延びることができる。

図7Dにエッペンドルフベース310の側面図を示す。エッペンドルフベース310は、フランジ725に対して直角に配置された装着面720を備えることができる。

図7Eに、図7Bに示す詳細区域「C」の見下ろし図を示す。図7Eに示すように、詳細区域「C」は、円形開口部730のまわりに配置された複数の孔705を図解している。孔705は、円形開口部730のまわりに正方形状の隊形に配置されているが、孔705は、限定されることなく、円形開口部730のまわりに任意のさまざまな構成で配置することができる。切欠き735は装着面720を通って延びるように構成することができる。

図7Fはエッペンドルフベース310の等角図を表す図である。

図8A～8Eは、図1の送達プラットフォーム100のクリッパードモジュール上側装着部510の一例を図解するCAD図面である。図8A～8Eに示すクリッパードモジュール上側装着部510は、図5に示すクリッパードモジュール上側装着部510に対応する。図8A～8Eに示すクリッパードモジュール上側装着部510は例示であり、クリッパードモジュール上側装着部510のサイズまたは構成を限定しようとするものではない。

図8Aに示すように、クリッパードモジュール上側装着部510は、スロット805を備えることができる。スロット805は、アトマイザーに対するクリッパードピンチバルブの装着位置、すなわちピンチバルブとアトマイザーの間のチューブの長さの調節を、容易にすることができる。

クリッパードモジュール上側装着部510はスロット810も備えることができ、このスロットの両端は閉じていることができる。図5に示すツマミ525は、スロット810を通って延びて、クリッパードモジュール上側装着部510をエッペンドルフベース310と連結するように構成することができる。

図8Bにクリッパードモジュール上側装着部510の側面図を示す。クリッパードモジュール上側装着部510は、そこに構成された1つまたは複数の凹面を備えることができる。図8Cは、クリッパードモジュール上側装着部510の装着面815の端面図である。装着面815は、図5に示すように、1つまたは複数のダウエルピン515によって、スプレーヘッドベース装着プラットフォーム505に連結することができる。ダウエルピン515は、図8Bに示すように孔820内に受容されうる。孔825は、図5に示すネジ520を受容するように構成されたネジ孔であることができる。

図8Dは、クリッパードモジュール上側装着部510の鉛直断面図であり、スロット805および810、ならびにクリッパードモジュール上側装着部510上に構成された凹面を示している。

図8Eはクリッパードモジュール上側装着部510の等角図を表す図である。

図9A～9Gは、図1の送達プラットフォーム100の例示的クリッパードモジュール下側装着部530を図解するCAD図面である。図9A～9Gに示すクリッパードモジュール下側装着部530は、図5に示すクリッパードモジュール下側装着部530に対応する。図9A～9Gに示すクリッパードモジュール下側装着部530の寸法は例示であり、クリッパードモジュール下側装着部530のサイズまたは構成を限定しようとするものではない。

図9Aはクリッパードモジュール下側装着部530の下面905を示している。下面905は複数の孔910を備えることができる。孔910は、図5に示す磁石535を受容するように構成することができる。クリッパードモジュール下側装着部530は、孔910内に位置する磁石535によって、スプレーヘッドベース装着プラットフォーム505に連結することができる。図9Aに示すように、複数の孔910は、下面905内に形成させた円形凹部915のまわりに配置することができる。孔910は円形凹部915のまわりに正方形状の隊形で配置されているが、孔905は、限定されることなく、円形凹部915のまわりに任意のさまざまな構成で配置することができる。スロット920は、クリッパードモジュール下側装着部530を通って延びることができる。スロット920は、図9Hに図解するように、そのクランプ装着部を通って、アトマイザーの後端が突出することを容易にする。

図9Bは、図9Aに示す線A-Aの視点からのクリッパードモジュール下側装着部530の断面図を表す。図9Cは、図9Aに示す線B-Bの視点からのクリッパードモジュール下側装着部530の断面図を表す。図9Cは、クリッパードモジュール下側装着部530の側面図を表し、下面905および上面925を示している。上面925ははす縁（beveled edge）930を備えることができる。

図9Eにクリッパードモジュール下側装着部530の上面図を示す。スロット920は、クリッパードモジュール下側装着部530のおよそ中程まで伸びるサイズにすることができる。はす縁930は、上面925の円周全体にわたることができる。図9Fは、クリッパードモジュール下側装着部530の上面925の等角図を表す図である。図9Gは、クリッパードモジュール下側装着部530の下面905の等角図を表す図である。

図10A～10Cは、スプレー処理プロセスのためのアトマイザー1100の例示的な一態様を表す。図10A～10Cに関して、アトマイザー1100は、その下面に液体オリフィス1101とガスオリフィス1102とを備える（図10A）。アトマイザー1100の上面には、液体管系入口1103および空気管系入口1104を形成させうる（図10B）。したがって、図10Cに示すとおり、液体オリフィス1101は、液体管系入口1103を通して液体リザーバに接続され、ガスオリフィス1102は、空気管系入口1104を通してガスリザーバに接続される。ガスリザーバは空気シリンダーまたは空気ポンプであってよく、バルブを備えてもよい。

いくつかの実施形態では、LB-100ネブライザーを用いることができる。いくつかの実施形態において、ネブライザーが使用される値は、体積約10～300μlの細胞送達溶液の微粒化を伴う。例示的なネブライザーは米国特許第5,411,208号または米国特許第6,634,572号に記載されており、これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ネブライザーは、例えばDuraMist（商標）ネブライザー（Sigma-Aldrich GXARG1DM04-1EA）、ネブライザーOneNebシリーズ2不活性同軸型ネブライザーまたはICP-OESでの使用（Agilent Technologies G8010-60293）など、他にも市販されている。諸態様において、ネブライザーは超音波ネブライザーまたは振動メッシュネブライザーであることができる。インプットチューブおよびアウトプットチューブは溶接するか、またはHospiraスピニングスプレス（Spinning Spires）閉端コネクタを用いることができる。図10D～Gは、別の例示的アトマイザーを図解している。他のアトマイザー設計および形状も可能である。

いくつかの実施形態では、アトマイザーの方向を調節することができるアトマイザーアダプタを備えることができる。例えば一部のアトマイザーは、それぞれの主軸から1～5度外れた方向にスプレーする場合がある。方向を調節して、例えばアトマイザーが、微粒化された溶液を、ポッド105フィルタープレート1610の面に垂直な方向に向かわせるように、アトマイザーを保持するアダプタを備えることができる。

図11A～11Eは、図1の送達プラットフォーム100の例示的スプレーヘッドベース装着プラットフォーム505を図解するCAD図面である。図11A～11Eに図示するスプレーヘッドベース装着プラットフォーム505は、図5に示すスプレーヘッドベース装着プラットフォーム505に対応する。図11A～11Eに示すスプレーヘッドベース装着プラットフォーム505の寸法は例示であり、スプレーヘッドベース装着プラットフォーム505のサイズまたは構成を限定しようとするものではない。

図11Aは、スプレーヘッドベース装着プラットフォーム505の上面1105の上面図である。図11Aに示すように、スプレーヘッドベース装着プラットフォーム505は、円形開口部1115および凹面1120に対して構成された複数の孔1110を備える。図11Aに示すように、複数の孔1110は、円形開口部1115および凹面1120のまわりに配置することができる。孔1110は、円形開口部1115のまわりに正方形状の隊形に配置されているが、孔1110は、限定されることなく、円形開口部1115および/または凹面1120のまわりに任意のさまざまな構成で配置することができる。孔1110は、クリッパードモジュール下側装着部530をスプレーヘッドベース装着プラットフォーム505に連結するのに使用するために、図5に示すネジ540を受容することができる。

図11Bに、図11Aに示す線A-Aの視点からの、スプレーヘッドベース装着プラットフォーム505の水平断面図を示す。図11Bに示すように、円形開口部1115は、下面1125にフランジ付き部分を備えることができる。スプレーヘッドベース装着プラットフォーム505は、それを通る孔1130も備える。孔1130は、クリッパードモジュール上側装着部510をスプレーヘッドベース装着プラットフォーム505に固着するのを支援するために、図5に示すネジ520を受容するように構成することができる。

図11Cに、スプレーヘッドベース装着プラットフォーム505の端面図を示す。図11Cに示すように、図5に示すダウエルピン545を受容するように、孔1135を設けることができる。孔1140は、スプレーヘッドベース装着プラットフォーム505を垂直装着スパイン410に連結するために、ネジ550を受容するように構成することができる。

図11Dに、図11Aに示す線B-Bの視点からの、スプレーヘッドベース装着プラットフォーム505の断面図を示す。孔1105は、ネジ540を受容するために、皿穴部分を備えることができる。

図11Eは、スプレーヘッドベース装着プラットフォーム505の等角図である。図11Eに示すように、凹面1120を囲む壁には、複数の切欠き1145を形成させることができる。切欠き1145は、複数の試験アトマイザーの放射配向を固定するための特徴である。孔1150は、図5に示すように、スプレーヘッドベース装着プラットフォーム505を垂直装着スパイン410に連結するために、ダウエルピン515を受容するように構成することができる。

図12A～12Dは、図1の送達プラットフォーム100の例示的な一態様の例示的ポッドネスト1205を図解するCAD図面である。図12A～12Dに示すポッドネスト1205の寸法は例示であり、ポッドネスト1205のサイズまたは構成を限定しようとするものではない。

図13A～13Cは、図1の送達プラットフォーム100の例示的な一態様の別の例示的ポッドネスト1305を図解するCAD図面である。図13A～13Cに示すポッドネスト1305の寸法は例示であり、ポッドネスト1305のサイズまたは構成を限定しようとするものではない。

図13Aにポッドネスト1305の上面図を示す。ポッドネスト1305は円形ポッド受容区域1310を備える。ポッド105はポッド受容区域1310内に受容されうる。ポッドネスト1305は、図5に示す套管560と連結するように構成された複数の孔1315を備えることができる。ポッドネスト1305は、図5に示すネジ565を受容するように構成された孔1320も備える。ポッドネスト1305は、套管560およびネジ565によって垂直装着スパイン410に固着することができる。

図13Bに、図13Aに示す線A-Aの視点からのポッドネスト110の下側部分1305の横断側面図を示す。

図13Cに、円形ポッド受容区域1310を備えるポッドネスト1305の等角図を示す。いくつかの態様において、ポッドネスト1305はセンサー1325を備えることができる。センサー1325は、カメラ、無線周波数（RF）識別（ID）スキャナ、またはIRセンサーを備えることができる。センサー1325は、ポッド105からの送達溶液の十分な排出などといったイベントを決定するように構成することができる。このようにして、細胞内送達に関連するイベント駆動型のワークフローを、送達プラットフォーム100を使って達成することができる。いくつかの実施形態では、ポッド105内に、例えば上側部分1605、フィルタープレート1610および/または下側部分1615内に、センサーを備えうる。そのような実施形態では、センサーに接続するために、例えば電力を提供するためおよび/またはセンサー測定を行うために、電気的接続点をポッド105およびポッドネスト110に含めることができる。

いくつかの態様において、ポッドネスト110、1205、1305は、ポッド内で細胞を単層に沈降させるのを支援するために、またはポッド内からの細胞の回収を支援するために、振動するように構成することができる。振動機能は、ポッドネスト上またはポッドネスト中に付加された振動要素により、ポッドネスト110に直接的に付加しうる。振動要素の例としては、偏心モーターまたは線形共振変位（liner resonant displacement:LRD）デバイスが挙げられる。（前記デバイスに接続された）ポッドネストの機械的共振特性については、プロセス工程中に振動摂動を加えうる。周波数範囲50Hz～2500Hzにおける振動摂動および2mmの物理的偏位（例えば振幅）は、適当な混合または撹拌をもたらしうる。ポッドネスト110は、撹拌を容易にするためにゴムマウントまたはエラストマーマウントと機械的に連結しうる。撹拌は、信号発生器により、LRDデバイスを使って、X、YまたはZ平面において独立して適用されうる。

図14A～14Fは、図1の送達プラットフォーム100の例示的ポッドネストカバー1405を図解するCAD図面である。図14A～14Fに示すポッドネストカバー1405の寸法は例示であり、ポッドネストカバー1405のサイズまたは構成を限定しようとするものではない。例示的ポッドネストカバー1405は、部材1415をポッドネスト1205内の嵌合孔にはめ込むことによってポッドネスト1205と係合するように構成される。

図14Aにポッドネストカバー1405の上面図を示す。ポッドネストカバー1405は、半円形切抜き部1410を備え、その中に、ポッドネスト110内に置かれたポッド105を受容することができる。

図14Bにポッドネストカバー1405の側面図を示す。ポッドネストカバー1405は、ポッドネストカバー1405の底から突き出した複数の伸張部1415を備えることができる。

図14Cに、図14Aに示す線B-Bの視点からの、ポッドカバー1405の水平断面図を示す。伸張部1415は、ポッドネストカバー1405をポッドネスト1205に強固に固定するために、雌ネジを切ったM4（tapped M4）を含むことができる。この強固な固定は、ポッドネスト1205の下側から2本のネジを、ポッドネスト1205上のザグリ孔と嵌合することによって達成することができる。

図14Dに、図14Aに示す線A-Aの視点からの、ポッドカバー1405の鉛直断面図を示す。

図14Eにポッドカバー1405の等角図を示す。図14Fにポッドカバー1405の底面の等角図を示す。図14Fに示すように、ポッドカバー1405の底面は、底面から突き出した伸張部1415を備える。ポッドカバー1405の底面は、ポッド105がポッドネスト1205の外に持ち上がるのを防ぐために、ポッド105の縁を覆うように半円形切抜き部1410のまわりをポッドカバー1405の底面から離れて周方向に延びるフランジ1420も備える。

図15は、図1に示す送達プラットフォーム100における使用のためのポッドアセンブリ1500の例示的一態様の画像である。ポッドアセンブリ1500は複数の嵌合可能な構成要素を備えることができ、それらは、送達プラットフォーム100を使って細胞への送達を行う間に、連結して連結を解くことができる。いくつかの態様において、ポッドアセンブリ1500の一部は、送達プラットフォーム100と共に使用するために構成することができる。いくつかの態様において、ポッドアセンブリ1500の一部は、送達プラットフォーム100と共に繰り返し使用するために構成することができる。

いくつかの実施形態において、ポッド105は、デバイスに隣接したまたはデバイスに接続されたフレーム上に、一時的に積み重ねうる。フレームは、少数のポッド、手動でまたは自動で挿入する準備が整った、例えば6個または12個のポッド105をまとめて、保持することができる。フレーム内に保持されたポッド105は、フレーム内に保持したまま、前処理されうるか、または細胞をプレロードされうる。ポッド105は、実験またはデバイス使用の前後に、限られた時間、フレーム内にあることができる。いくつかの実施形態において、実験の進行中は、オペレーターが手動でポッドをフレームからポットネスト（pot nest）に移し、その部品内で細胞をトランスフェクトし、それらを、トランスフェクション後のポッドを保持するための第2のフレームに移動させうる。このプロセスは自動的に実施することもできる。フレームは、清掃可能性を支援するために、開放型構造を有しうる。フレームは、例えば図21Aに図解するフレーム2105によって示されるように、手動であってもよいか、またはフレームは、例えば図21Bに図解するフレーム2110によって示されるように、プレートスタッカーと共に使用するように構成されていてもよい。市販のプレートスタッカーは、米国ニュージャージー州スプリングフィールド・タウンシップのHudson Robotics,Inc.から入手することができる。いくつかの実施形態において、フレームは、センサーおよび/またはポッドと通信するための通信手段を備えることができる。フレームは位置センサーおよび/またはタイマーを備えることができる。

図16A～16Cは、図15に示すポッドアセンブリ1500の構成要素の例示的態様の画像である。図16Aはポッドアセンブリ1500の保持リング1605を示している。図16Bはポッドアセンブリ1500のフィルタープレート1610を示している。図16Cは、ポッドアセンブリ1500のフィルタープレート連結部1615を示している。送達プラットフォーム100内で使用している間、ポッド105は、保持リング1605とフィルタープレート1610とを備えるように構成することができる。使用のいくつかの局面の間、例えば送達溶液を排出する際などには、ポッド105からの排出経路を提供するために、フィルタープレート連結部1615を、フィルタープレート1610を介して、ポッド105に連結することができる。

図16Aに示すように、保持リング1605は、ポッド105内で適切な流体レベルを維持するように構成されたリング状の構成要素である。ポッドが使い捨て用のディスポーザブルポッドとして構成される実施形態など、いくつかの実施形態において、保持リング1605は、予形成され、ポッドの残りの部分と一体化されていることができる。保持リング1605の材料は、ポッド基体の他の局面の材料と同様であることができる。

図16Bに示すように、フィルタープレート1610は、流体がそこを通って流れ出ることを可能にするために、複数の孔を備えることができる。いくつかの態様において、フィルタープレート1610は、フィルターを受容することができ、ペイロードを送達するために、そのフィルターの上に、細胞を提供することができる。複数の孔または穴は、十分な細胞の保持と溶液の排出とを提供するのに適した種々の非限定的パターンで形成させることができる。例えば、穴は、フィルタープレートの外径のまわりに、および/またはフィルタープレートの複数の放射方向に沿って、整列させうる。いくつかの態様において、フィルタープレート1610は、細胞の保持および溶液の排出を助けるために、フィルタープレート1610の表面に形成された溝を備えることができる。いくつかの態様において、溝は同心円パターンを形成することができる。

いくつかの実施形態では、下側部分1615を介して陰圧をポッド105に適用する。これにより、細胞をフィルター表面上に収集しつつ、細胞懸濁培地および/または送達溶液を、孔および下側部分1615を通して排出することができる。

いくつかの態様において、ポッド105は、ポッド105内に提供された細胞または流体の温度またはpHを測定するように構成された1つまたは複数のセンサーを備えることができる。実験内で使用された培地の色、色素または指示薬を読み取るために、比色用変換器を導入してもよい。特別な較正用ポッドは、ポッド上の細胞表面に降りかかる微粒化された試薬の力を測定するための力センサーを持ちうる。さらなる較正用ポッドは、微粒化スプレーを評価するために、指示薬試験紙（例えばリトマス試験紙）またはティージェイ試験紙（TeeJay paper）を有してもよい。センサーは、例えば上側部分1605、フィルタープレート1610および/または下側部分1615の上または中に位置することができる。いくつかの態様において、ポッド105は、メモリおよび/または通信モジュール、例えばポッド105の処理に関連する実験データを伝送することができる近距離無線通信モジュールを備えることができる。

いくつかの実施形態において、ポッドは、ポッドがデバイス内にあった時間を測定するためのマイクロプロセッサまたは制御装置を備えることができる。マイクロプロセッサは、ポッドの通し番号を格納し、それを入れたデバイスの通し番号を記憶する。2つ以上のデバイス、複数のデバイスがあって、ポッドがデバイス間を移動して逐次的な導入作用を受ける場合、マイクロプロセッサは、そのシーケンスおよび通し番号、タイミング、ならびにデバイスからポッドに伝達された他の情報を格納することができる。使用するデバイスが1つであっても複数であっても、デバイスは、所与の実験に関するプロセスパラメータを、環境条件、時間/日付などと共に、ポッドに転送することができる。固定記憶装置（例えばEEPROM）に格納された情報は、別のデバイスかポッドリーダーのいずれかによって読み取ることができる。

図16Cに示すように、フィルタープレート連結部1615は、フィルタープレート連結部1615の円周のまわりに構成された把持面を備えることができる。フィルタープレート連結部1615は、フィルタープレート1610の底面と連結するためのフランジ付き部分も備えることができる。加えて、フィルタープレート連結部1615は、流体がポッド105からそこを通って流れ出すための孔1620を備えることができる。

図16Dに、上側部分1605、フィルタープレート1610が一体化している別の例示的ポッド実施形態を示す。チューブ1625は、フィルタープレート連結部1615の下側にある開口部特徴、例えば図16Cに示す孔1620に取り付けられる。

図17は、図1の送達プラットフォーム100のポッドネスト内のポッドアセンブリの例示的な一態様を図解するCAD図面の等角図である。

図18は、図17に示す例示的な一態様の断面図である。

図19A～19Cは、図15に示すポッドアセンブリ1500のフィルタープレート連結部の例示的態様を図解するCAD図面である。図19A～19Cに示すフィルタープレート連結部1615は、図16Cに示すフィルタープレート連結部1615に対応する。図19A～19Cに示すフィルタープレート連結部1615の寸法は例示であり、フィルタープレート連結部1615のサイズまたは構成を限定しようとするものではない。

図20は、図1の送達プラットフォーム100を使って細胞にペイロードを送達するためのプロセスの例示的一態様を図解するフロー図である。

作動時には、標的細胞を特定の濃度で培地に混合しうる。例えば約6000万個の細胞を約60mLの培地に混合しうる。調製された細胞含有培地は、ディスポーザブルチューブセットおよび/または滅菌ニードル/カニューレを介してポッド105に導入されうる。充填手順は、上述のように、手動で行うか、またはポンプ（例えば蠕動ポンプまたは容積式ポンプ）と制御装置とを使って、自動的に行いうる。同様に、バルブ操作は手動で行うか、または例えばソレノイドバルブと制御装置とを使って、自動的に行いうる。バルブを閉じた後に、いくつかの実施形態では、培地が、重力により、ポッド105のフィルターを通って排除される。いくつかの実施形態では、真空圧が、下側部分のポートを通して、ポッド15の下側部分1615に供給される。したがって培地は、フィルターを通って排除され、それにより、フィルター表面上に標的細胞（例えばT細胞）を堆積させる。例えばポッドネスト110の下で培地を収集するなどの目的で、ビーカーその他の容器を使用しうる。いくつかの実施形態において、フィルター上の細胞堆積物を調節/再配置するために、培地の排出中に、ポッドの下側部分に陽圧と真空圧を交互に供給してもよい。

次に、ペイロード（例えばカーゴ）を含有する送達溶液が、アトマイザーによってスプレーされる。制御装置は、スプレーの量および持続時間を制御しうる。例えば送達溶液は約300msにわたってスプレーされうる。送達溶液をスプレーするために、カーゴを、マイクロバイアルによってスプレーヘッドに導入するか、または再シール可能な注入ポートを介して注入しうる。

送達溶液がスプレーされた後に、ディスポーザブルチューブセットおよび/または滅菌プラスチックニードル/カニューレを介して、停止溶液を導入することができる。停止溶液は、手動で供給するか、またはポンプと制御装置とを使って自動的に供給しうる。所望の量の停止溶液がチャンバーに導入される。例えば約10mLの停止溶液を約20秒にわたって導入しうる。いくつかの実施形態では、停止溶液は細胞に導入されない。

停止溶液の導入後は、細胞が再懸濁される。再懸濁のために、約60mLの培地をシリンジまたはポンプによって導入することができ、この培地は、使用済み培地、新しい培地、または以前にチャンバーから排出された培地でありうる。再懸濁工程の持続時間は約1分間でありうる。再懸濁を改良するために、プラットフォームの傾斜、撹拌（例えばプラットフォームの振動）など、さまざまな方法を、再懸濁プロセス中または再懸濁プロセス後に使用しうる。

細胞を培地に再懸濁した後に、操作された細胞をさらなるプロセスのために収集する。ポッドは、このプロセス後に、以降の手順のためにフラッシングまたは洗浄しうる。上記に代えてまたは上記に加えて、ポッド全体またはポッドの部品を、使用後は処分して新しいもので置き換えることができるディスポーザブルユニットとして作ってもよい。図20は例示的なプロセス2000を表している。ただし、プロセス2000は図20に示す操作に限定されるわけではなく、培地の量（体積）、細胞の数、濃度、各工程の持続時間などといったプロセスパラメータは、適用に依存して変動しうる。

図20に関して、2005では、滅菌ポッドをプラットフォームに装填することができる。2010では、ポッドに基本培地を注入することができ、重力によってポッドから排液させることができる。2015では、残存する培地を除去するために、ポッドベースをブロッティングすることができる。220では、細胞をポッドに充填することができる。2025では、重力濾過によって細胞単層を形成させることができる。2030では、残存する培地を除去するために、ポッドベースをブロッティングすることができる。2035では、ポッドをプラットフォームに再装填することができる。2040では、プラットフォームを使って、細胞に送達溶液をスプレーすることができる。2045では、ポッドアセンブリの下側部分を接続することができる。2050では、終了溶液をポッドに加えることができる。2055では、下側部分から回収培地を適用することができる。2060では、細胞をポッドから取り出すことができる。

例1の項に記載する例示的な態様では、1回のトランスフェクションで約50万～1500万個の細胞をトランスフェクトすることができる。本プラットフォームでは、T細胞への例えばmRNAなどのカーゴの、一貫性のある送達が可能になる。本システムは、滅菌操作のために、生物学的安全キャビネット内に収めてもよい。本システムの作動は手動または自動で行いうる。自動作動のために、流体ハンドリングシステムを、制御装置と制御ソフトウェアとによって、自動的に制御することができる。本プラットフォームは、清掃および洗浄後に再使用することができる複数回使用システムとして構成しうる。いくつかの実施形態において、本プラットフォームは、ディスポーザブルポッドなどのディスポーザブル部品を含む、使い捨てのディスポーザブルシステムとして構成しうる。

例2
図23は、本明細書に開示するいくつかの態様による送達プラットフォーム2300の別の例示的一態様の画像を示している。いくつかの実施形態において、送達プラットフォーム2300は、汚染のリスクが低下した無菌の密閉された環境内で細胞処理実験および生産を行うことができる閉鎖系として、作動することができる。いくつかの態様において、送達プラットフォーム2300は、図20に関して示し説明したように、細胞への送達のためのプロセス2000の工程の一部または全部を行うように構成することができる。そのような態様において、ポッド105は、チャンバーアセンブリ2325内に構成されたフィルター2715と等価であるとみなすことができる。

図23に示すように、いくつかの実施形態において、送達プラットフォーム2300は、ベースに装着された機器筐体を備えることができる。ベースは、送達プラットフォーム2300を作業台、排気フード作業空間、卓上、仕事台などに設置または装着することを可能にする。いくつかの態様において、送達プラットフォーム2300は、送達プラットフォーム2300をある場所から別の場所に移動させることができるように構成された可搬型ベースに装着することができる。可搬型構成など、送達プラットフォーム2300のいくつかの構成は、例えば細胞体積を患者から直接的により容易に受容するために、および/または潜在的に汚染を導入する可能性がある複数のハンドリング工程を必要とすることなく、ペイロードの送達を受けた細胞を患者に直接提供するために、患者の近くに置くことができる。

図23に示すように、送達プラットフォーム2300は、ヒューマンマシンインターフェース（HMI）2310を提供するディスプレイ2305を備えることができる。HMI 2310は、送達プラットフォーム2300の作動に関連するユーザー入力を受け取り、送達プラットフォーム2300の作動に関連する出力を提供するように構成することができる。いくつかの態様において、HMI 2310は、ユーザーによるHMI 23210との対話に基づいて、開始、実施および/または停止することができる1つまたは複数のワークフローを持つように構成することができる。個々の処理ワークフローは、特定の細胞タイプ、特定の試薬培地および/または実験の適用もしくは目的に関連する、より幅広いユーザー定義のワークフローに基づいて、さまざまな非限定的シーケンスで行うことができる。HMI 2310は、送達プラットフォーム2300内に構成された1つまたは複数の制御装置に電気的に連結することができる。送達プラットフォーム2300は、送達プラットフォーム2300の作動に関連する1つまたは複数の状況を表示するために、1つまたは複数の光または視覚的インジケータ2315を備えることができる。図23に示すように、光2315は、送達プラットフォーム2300の作動に関連する1つまたは複数の工程または手順に関して、個別に作動させることができる複数の光を含むことができる。いくつかの態様において、HMI 2310は、送達プラットフォーム2300の作動に関連する1つまたは複数のエラーまたは作動コードを表示することができ、光2315は、それらのコードに対応する視覚的表示をユーザーに提供することができる。

図23にさらに示すように、送達プラットフォーム2300は停止ボタン2320を備えることができる。停止ボタン2320は、送達プラットフォーム2300を作動させている時に、ユーザーエラーまたは作動エラーが起きた場合に、送達プラットフォーム2300の作動を中止することができる。

図23にさらに示すように、送達プラットフォーム2300は、フレーム2330内に装着されたチャンバーアセンブリ2325を備えることができる。有利なことに、チャンバーアセンブリ2325は、再使用可能なアセンブリで起こりうる汚染のリスクを伴わずに、さまざまな実験的プロセスで、実験を行うことを可能にする。例えば実験プロセスは、細胞洗浄プロセス、細胞濃度変更プロセス、および細胞培地変更プロセスを含むことができる。したがって、再使用可能なアセンブリを用いるシステムと比較して、異なる細胞処理プロセスについて、実験結果の正確性が、改良されうる。チャンバーアセンブリ2325は、シールされた滅菌包で、使用のために提供することができる。チャンバーアセンブリ2325は、フィルターを備えることができ、ペイロードの送達のためにその上に細胞を提供し、送達後に収集することができる。いくつかの態様において、フィルターはガス透過性かつ液体透過性フィルターであることができる。いくつかの態様において、新鮮な試薬培地は、例えば洗浄ワークフロー中に、フィルターの下から導入することができる。チャンバーアセンブリ2325は、フレーム2330内に構成することができる。いくつかの態様において、フレーム2330は、半円形フレームまたは「C」字型フレームであることができる。フレーム2330は、送達プラットフォーム2300から延びるシャフトに装着することができる。フレーム2330は、図23では水平配向で示されているが、シャフトの回転により、上向きまたは下向き垂直方向に傾斜するように構成することができる。例えばいくつかの態様において、フレーム2330は、図23に示した水平配向から0～10、5～15、10～20、15～25、20～30または25～45度傾斜するように構成することができる。いくつかの態様において、シャフトは、フレーム2330の角度傾斜の量に関して往復運動的にフレーム2330を傾斜させるように構成することができる。例えばフレーム2330を＋30度まで傾斜させ、次にフレーム2330が、その＋30度配向に対して正の角度配向（例えば＋1度）と負の角度配向（例えば-1度）の間を往復することで、フレーム2330が＋31度と＋29度の間を往復することになるようにすることができる。フレーム2330は、2つの角度配向の間を所定の周波数またはユーザー定義の周波数で往復することができる。いくつかの態様において、フレーム2330は、0.5kHz、1kHz、1.5kHz、2kHz、2.5kHz、またはそれ以上の周波数で往復することができる。いくつかの態様において、シャフトおよび/またはフレーム2330は、シャフトおよび/またはフレーム2330を振動させるように構成されたサーボモーターに連結することができる。

フレーム2330を往復および/または振動させることで、ペイロードの送達後に収集される細胞の量を、吸引に基づく収集方法と比べて、有利に増加させることができる。吸引に基づく収集方法では、チャンバーアセンブリ2325内での収集培地の適用と抜き取りを繰り返す必要がある。加えて、吸引に基づく収集方法を使って細胞を収集する場合には、繰り返される流体圧力および流動力へのばく露によって、収集された細胞の生存率が低下しうるが、フレーム2330を往復および/または振動させることで、収集された細胞の生存率を有利に増加させることもできる。

図23にさらに示すように、送達プラットフォーム2300は、廃棄物収集トレイ2335を備えることができ、チャンバーアセンブリ2325から排出された試薬および/または培地は、ここで収集することができる。いくつかの態様において、廃棄物収集トレイ2335は、送達プラットフォーム2300から取り出すことができる。図23にさらに示すように、送達プラットフォーム2300は細胞収集トレイ2340も備えることができ、ペイロードの送達を受けた細胞はここで収集することができる。いくつかの態様において、細胞収集トレイ2340は送達プラットフォーム2300から取り出すことができる。いくつかの態様において、細胞収集トレイ2340は、細胞を所望の温度に維持するために、冷却要素および/または加熱要素を備えることができる。いくつかの態様において、細胞収集トレイ2340に付随する加熱要素および/または冷却要素は、送達プラットフォーム2300のベース内に構成することができる。いくつかの態様において、ベースは、廃棄物収集トレイ2335および/または細胞収集トレイ2340の下に設置されたはかりを備えることができる。このようにして、送達プラットフォーム2300は、収集された培地材料および収集された細胞の重量を測定することができる。いくつかの態様において、収集トレイ2340は、培地材料または収集された細胞を保持し、細胞生存率を改良するために動きのある状態で維持することができる間接式架台を備えることができる。

図23にさらに示すように、送達プラットフォーム2300は、1つまたは複数の培地材料2345を備えることができる。培地材料2345は、1つまたは複数の流体回路を介して、チャンバー2330に流体連結することができる。送達プラットフォーム2300は、1つまたは複数の流体回路を介して提供される培地の量を制御するように構成された1つまたは複数のバルブ2350も備えることができる。いくつかの態様において、前記1つまたは複数のバルブ2350はピンチバルブを含むことができる。送達プラットフォームは、対応する流体回路に対して直列に構成された1つまたは複数の流体検出センサー2355を備えることができる。流体検出センサー2355は、送達プラットフォーム2300のプライミング（priming）ならびに較正を支援するように構成することができる。加えて、流体検出センサー2355は、流体回路内の2つの場所の間の培地の体積を算出するための測定システムとして構成することができる。図23にさらに示すように、送達プラットフォーム2300は、細胞培養用培地をチャンバーアセンブリ2325中にポンプ送出するための1つまたは複数のポンプ2360を備えることができる。フレーム2330を振動および/または傾斜させながら、細胞培養用培地を周期的にチャンバーアセンブリ2325の中にまたはチャンバーアセンブリ2325から外にポンプ送出することにより、非傾斜非振動細胞収集操作と比較して、細胞収集量を増加させることができる。いくつかの態様において、ポンプ2360は蠕動ポンプを含むことができる。他の例示的ポンプタイプとしては、シリンジポンプ、プランジャーレスシリンジポンプ、クローズドシリンジタイプ、バッグ圧搾式ポンプなどを挙げることができる。送達プラットフォーム2300は超音波流量検出器2365も備えることができる。

図23にさらに示すように、送達プラットフォーム2300はシリンジ2370を備えることができる。いくつかの態様において、シリンジ2370はプランジャーレスシリンジを含むことができる。培地2345をチャンバーアセンブリ2325に提供するには、シリンジ2370に空気を適用することができる。送達プラットフォーム2300は、シリンジ2370のホルダー内または送達プラットフォーム2300そのもの内に構成された光学センサー2375も備えることができる。光学センサー2375は、シリンジ2370内の流体のレベルまたはシリンジ2370のプランジャーもしくは栓（bung）の位置を検出することができる。光学センサー2375は、垂直アレイとして線状に配置された赤外線検出器などの光学センサーのアレイを備えることができる。光学センサー2375は、ポンプ2360と組み合わせて、較正作業において使用することができる。いくつかの態様において、シリンジ2370は、シリンジ2370の出口に設置されたチェックバルブに連結することができる。光学センサー2375は、チャンバーアセンブリ2325に供給される培地の量を制御するためのバルブ2380に連結することができる。

図24は、図23に示す送達プラットフォーム2300の外観を示している。図24に示すように、送達プラットフォーム2300は、バルブ2410を保持するように構成されたバルブホルダー2405を備えることができる。バルブホルダー2405は、チャンバーアセンブリ2325の配向に対してある角度でバルブ2410を保持するように構成することができる。

図25は、図23に示す送達プラットフォームの第2の外観を示している。図25に示すように、送達プラットフォーム2300は1つまたは複数の電気的コネクタ2505を備えることができる。いくつかの態様において、電気的コネクタ2505は、外部機器設備を送達プラットフォーム2300に接続する機器コネクタであることができる。外部機器としては、例えば電気温度計、液体比重計、気圧計、フォトプレチスモグラフセンサー、ロードセル、生化学センサー（例えばアルコールセンサー）、光学センサー、振動を測定するための変換器（例えば振動メンブレン微小電子機械（MEM））などを挙げることができる。

送達プラットフォーム2300は、1つまたは複数のガスコネクタ2510も備えることができる。ガスコネクタ2510は、ガス供給源を受容し、チャンバーアセンブリ2325とガス供給源とを連結するガス回路を介して、所望の圧力条件下で、ガスをチャンバーアセンブリ2325に供給することができる。いくつかの態様において、ガスコネクタ2510は、例えばチャンバーアセンブリ2325をパージまたは排気する時に、チャンバーアセンブリ2325からのガスを受容することができる。いくつかの実施形態において、ガスコネクタ2510はソフトウェアによって独立に制御することができ、各ガスコネクタ2510は圧力の静的または動的ヘッド（例えば圧力設定点）を提供するように構成することができる。いくつかの実施形態において、ガスコネクタ2510は、異なるガス（例えば医療用ガス、窒素ガスなど）で作動することができ、ソフトウェア構成変更可能であることができ、指定された圧力で槽中に連続的気流を提供することができるなどである。圧力は、流量制御レギュレータ、または圧力レギュレータ、または流量変換器、圧力変換器などによって提供することができる。圧力は、プランジャーレスシリンジ中の栓を押し出すなどの目的で、アトマイザー、シャワーヘッド、エッペンドルフニードルなどといった他の構成要素に提供することができる。各ガスコネクタ2510は、独立にソフトウェア構成変更可能であり、多岐管の一部ではない。

バルブ2350は（図24に示すように）ガスコネクタ2510のうちの1つに付随するガス回路に連結することができ、チャンバーアセンブリ2325に供給されるガスの量を制御することができる。送達プラットフォーム2300は、チャンバーアセンブリ2325と共に使用するように構成されたホースの一部を固着するためのホースクランプ2515を備えることができる。送達プラットフォーム2300は、培地2345を保持するための1つまたは複数のハンガー2520も備えることができる。いくつかの態様において、ハンガー2520は、培地2345の重量を測定するためのはかりを持つように構成することができる。

図25に示すように、送達プラットフォーム2300はバーコードリーダー2525を備えることができる。バーコードリーダー2525は、バーコード化された媒体、送達プラットフォーム2300のオペレーターに関連するバッジ、および/またはチャンバーアセンブリ2325が入っているバーコード化された梱包をスキャンするように構成することができる。いくつかの態様において、バーコードリーダー2525はリニアバーコードリーダーまたは2-Dバーコードリーダーを含むことができる。いくつかの態様において、バーコードリーダー2525は手持ち型バーコードリーダーであることができる。いくつかの態様において、HMI 2310は、バーコードリーダー2525と通信可能に連結することができる。加えて、送達プラットフォーム2300は、送達プラットフォーム2300の管系、例えば培地2345に連結された1つまたは複数の流体回路に付随して使用される管系を、固定または溶接するように構成されたチューブ溶接機2530を備えることができる。いくつかの態様において、HMI 2310はチューブ溶接機2530に通信可能に連結することができる。

図26は、図23に示す送達プラットフォームの一部分のクローズアップ像を示している。図26に示すように、チャンバーアセンブリ2325およびフレーム2330は、図23に示す水平配向に対して約＋30度の角度配向で傾斜している。この位置において、フレーム2330は、チャンバーアセンブリ2325の底に構成された排液口2605を介した細胞の収集を支援するために、この＋30度の角度配向から正および負の角運動で往復することができる。いくつかの態様において、チャンバーアセンブリ2325は、チャンバーアセンブリ2325に加熱または冷却を提供するために、断熱ジャケットまたは伝導性ジャケットで、少なくとも部分的に、包むことができる。

図27は、図23に示す送達プラットフォームのチャンバーアセンブリ2325の例示的一態様の画像を示している。いくつかの態様において、チャンバーアセンブリ2325の1つまたは複数の内面または領域は、細胞の移動性および/または接着を支援するようにコーティングするか、またはパターンを付けることができる。例えばチャンバーアセンブリ2325は、チャンバーアセンブリ2325内の1つまたは複数の表面または領域上に形成された1つまたは複数の三次元構造を備えることができる。さらなる例示的三次元構造としては、隣接するリブとの間に溝を形成する円周リブ、らせん、放射状リブ、隆起、くぼみ、ハッチパターンなどが挙げられる。いくつかの実施形態において、円周リブは、各辺が約500ミクロンの三角形の輪郭を有し、溝間の間隔が2mmである、リブを有することができる。

いくつかの実施形態において、パターンは、濾過プロセス時の培養用培地中の細胞の流れを制御することができる。そのようなパターンは、中央部におけるフィルターの隆起を引き起こしがちな流体力を減殺し、フィルター表面上に堆積した細胞の濃度を一様にするために、フィルター表面上の区域に向かってまたはフィルター表面上の区域から離れるように、流れを向かわせることができる。

さまざまな非限定的コーティング材をチャンバーアセンブリ2325の内面に適用しうる。このようにして、チャンバーアセンブリ2325は、細胞接着のための表面を提供することができ、それは、送達、透過処理、および/または細胞収集の支援になりうる。いくつかの実施形態において、内部チャンバー表面は疎水性（例えば視認しやすいようにポリカーボネート製）であってよく、フィルターは親水性である。いくつかの態様において、チャンバーアセンブリ2325は、使用中または不使用時に交換することができる1つまたは複数の取り外し可能かつ取り替え可能な部分を備えることができる。例えば、フィルターメンブレンの露出部分を小さくするために、マスクとして作用する取り外し可能な部分を、チャンバー内で交換することができる。そうすることの恩恵としては、小数の、例えば10＾6個未満、2×10＾6個未満、5×10＾6個未満および/または10＾7個未満の、細胞のトランスフェクションが可能になることを挙げることができる。恩恵を受けうる細胞タイプとしては、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、ヒト幹細胞（HSC）および誘導多能性幹（IPS）細胞が挙げられる。

図27に示すように、チャンバーアセンブリ2325は、上側部分2705および下側部分2710を備えることができる。上側部分2705は下側部分2710から取り外し可能であることができる。下側部分2710はフィルター2715を備え、その上に細胞を堆積させ、透過処理し、そこから収集することができる。いくつかの態様において、フィルター2715は、フィルター2715への細胞の接着を支援するためにコーティングされるか、フィルター2715への細胞の接着を支援するのに適したパターンを持つ材料を含むことができる。例えばコーティング材は、浮遊細胞の接着性を低減し、フィルター表面を横切る細胞の移動性を増加させるのに有益でありうる。これは、トランスフェクション後にフィルター表面からより容易に回収することができる細胞の生存率（および収量）を増加させるのに有益である。高い水和性（wet-ability）はカーゴおよび溶液を表面全体に広げるので、より多くの細胞が接触し、トランスフェクションを増加させることになる。コーティング材の例としては、材料の上に湿潤剤として堆積させたポリビニルピロリドン（PVP）が挙げられる。そのような作用物質は、チャンバー内で、培地中の細胞の濡れおよび展着を可能にする（より容易に可能にする）。同様の結果は、Au（金）スパッタリング、酸素プラズマ処理、表面荷電の低減、またはフィルター表面をより親水性にするための他の戦略でも達成しうる。同様に、MSC、IPS、A549、HEK293およびマクロファージなどの接着細胞でも、フィルター表面を親水性にすることには利益がありうる。

チャンバーアセンブリ2325内では、細胞タイプおよび/または実験的もしくは治療的適用に応じて、さまざまな非限定的フィルター2715を使用することができる。上側部分2705は、ガスコネクタ2510を介してガスを受容するように構成されたガスポート2720を備えることができる。上側部分2705は、ガスコネクタ2510に連結された散気装置を受容するように構成された散気装置開口部2725も備えることができる。散気装置は、チャンバーアセンブリ2325内の静的空気条件を変化させ、閉鎖系として使用するためにチャンバーアセンブリ2325を加圧するように構成することができる。散気装置は、さまざまな温度条件および圧力条件下で、チャンバーアセンブリ2325中にガスまたはガスの組合せを供給することができる。例えば散気装置は、特定の濃度のCO₂ガスを含むガスを提供することができる。図27にさらに示すように、上側部分2705は、スプレーヘッドをその中に受容するように構成されたスプレーヘッド開口部2730を備えることができる。

チャンバーアセンブリ2325は、さまざまな非限定的サイズおよび容積で構成することができる。いくつかの態様において、チャンバーアセンブリ2325は約1Lの容積を有することができる。いくつかの態様において、下側部分2710は約300～500mlの容積を有することができる。

図28は、図23に示す使い捨てアセンブリのスプレーヘッドの例示的一態様の画像を示している。図28に示すように、スプレーヘッド2805はガス注入ポート2810および流体注入ポート2815を備えることができる。ガス注入ポート2810は、チャンバーアセンブリ2325内に加圧ガスを供給するために、ガスコネクタ2510のいずれかに連結することができる。流体注入ポート2815は、ペイロードを含む等張水溶液の供給源に連結することができる。加圧スプレーをスプレーヘッド2805内で形成させ、出口2820を介してチャンバーアセンブリ2325中に送達することができる。

プロセスの自動化により、本細胞操作プラットフォームは、トランスフェクションなどの細胞処理および操作プロセスを、より一貫して行うことができ、カーゴ送達をより容易に行うことができる。したがって、本細胞操作プラットフォームは、信頼できるベクターフリー送達方法を提供して、細胞操作技術の費用と複雑さとを低減することができる。

上記でいくつかのバリエーションを詳述したが、他の変更態様または追加態様も可能である。例えばデザイン変形物は、他の形状の、例えば長方形、正方形または楕円形などの、チャンバーアセンブリ2325またはフィルター2715を備えることができる。加えて、さまざまなトポグラフィーを持つチャンバーアセンブリ2325またはフィルター2715は、微視的または巨視的特徴を持つ凸形、凹形およびざらざらの表面を備えることができる。また、円形標的と環状標的の両方を含む標的構成も想定される。諸態様において、変更態様または追加態様は、スプレー標的下の細胞堆積を最適化することができる。チャンバーアセンブリ2325または使い捨てアセンブリという用語が本明細書では使用されるが、いくつかの実施形態において、チャンバーアセンブリ2325は再使用可能であることができる（例えば、複数の細胞集団を処理するために、2回以上使用することができる）。

本明細書記載の主題は、多くの技術的利点を提供する。例えば、本明細書記載のチャンバーアセンブリは、滅菌の必要を回避し、患者試料間の交差汚染のリスクを著しく低減し、サンプラーバリデーションプロセスを可能にする。別の利点は、本明細書記載のチャンバーアセンブリにより、単一のスプレーヘッドによる同時送達による複数のカーゴの送達が可能になることである。さらにまた、本明細書記載の主題は、速く、簡単であり、穏やかな細胞処理により、細胞の健康状態が維持され、ナイーブ細胞集団の操作を可能にする。

例3
いくつかの実施形態において、送達プラットフォーム2300は、ペイロードの送達（例えばトランスフェクション）に加えて、細胞処理機能のためにも用いることができる。例えば、送達プラットフォーム2300は、チャンバーアセンブリ2325を使ってさまざまな上流および/または下流細胞処理ワークフローを可能にするために用いることができる。本明細書にいう上流細胞処理には、上述のプロセス（例えば細胞集団をペイロード含有溶液と（例えばスプレーによって）接触させること）を使ったペイロードの送達の前に行われるプロセスが含まれ、下流細胞処理には、上述のプロセス（例えば細胞集団をペイロード含有溶液と（例えばスプレーによって）接触させること）を使ったペイロードの送達後に行われるプロセスが含まれる。一例として、チャンバーアセンブリ2325は、上述の送達プロセス（例えば細胞集団をペイロード含有溶液と（例えばスプレーによって）接触させること）を行った後に細胞の集団を細胞培養（例えばインキュベーション）するためのバイオリアクターとして用いることができる。追加の細胞処理工程のためにチャンバーアセンブリ2325を用いることにより、細胞生存率を改良することができる。

送達プラットフォーム2300をインキュベーターとして用いるために、送達プラットフォーム2300は、インキュベーションに有利な人工的環境内に細胞の集団を維持するための環境制御を提供することができる。理想的な培養条件は異なる細胞タイプでは幅広く変動しうるが、細胞が培養される人工的環境は、フィルターを基体とする槽としてのチャンバーアセンブリ2325を含むことができ、および/または必須の栄養素（アミノ酸、炭水化物、ビタミン、ミネラルなど）、成長因子、ホルモンおよびガス（酸素（O₂）、二酸化炭素（CO₂）、窒素（N₂）など）を供給し、物理化学的環境（pH、浸透圧、温度）を調節する追加の培地を適用することができる。

送達プラットフォーム2300は、ユーザー定義の圧力および温度設定下での滅菌ガスの導入と制御を可能にすることができる閉鎖チャンバーとして構成されたチャンバーアセンブリ2325を備えることができる。例えば、送達プラットフォーム2300は、閉鎖されシールされたチャンバー内でガスおよびガスの組成物を導入し、循環させ、排出するように構成することができる。ガスおよびガスの組成物の例としては、医療用空気、窒素、ならびに送達プラットフォーム2300を使ったペイロードの送達を受けた細胞を収集し、保存しおよび/または生産するためのワークフローに関連するガスおよびガスの組合せを挙げることができる。閉鎖チャンバー内の温度も、閉鎖チャンバーに供給されるガスの温度を調節することおよび/または閉鎖チャンバーへの外からの熱の適用により、ユーザー定義の設定に従って制御することができる。送達プラットフォーム2300は、ユーザー定義の手順による閉鎖チャンバーの運動または不動を、さらに提供することができる。このように、生存細胞の数を増加させるために、送達プラットフォーム2300の閉鎖されシールされた構成で、いくつかの実験および生産パラメータを調節することができる。

環境制御には、環境のガス組成、環境の温度、環境の運動、および環境中に導入される培地の組成を制御することが含まれうる。送達プラットフォーム2300は、例えばガスの適当な混合物をガス拡散器でチャンバーアセンブリ2325に適用することによって、環境のガス組成を制御することができる。例えば送達プラットフォーム2300は、二酸化炭素（CO₂）、窒素（N₂）および酸素（O₂）などのガスの濃度を制御することを含めて、特定の組成を有するようにチャンバーアセンブリ2325内の環境を制御することができる。使い捨てアセンブリに含まれる所与の成長培地に関して、成長培地は、培養のpHを制御し、pHの変化に対する緩衝作用を培養中の細胞に与える。この緩衝作用は、有機系緩衝剤（例えばHEPES）またはCO₂-炭酸水素イオン系緩衝剤を含めることによって達成することができる。培地のpHは溶存二酸化炭素（CO₂）と炭酸水素イオン（HCO₃ ^-）のバランスに依存するので、雰囲気CO₂の変化は培地のpHを変化させうる。したがって送達プラットフォーム2300は、CO₂-炭酸水素イオン系緩衝剤で緩衝化された培地を使えば、環境CO₂濃度を制御することができる。空気中、1％～10％、5～7％、または4～10％CO2のCO₂濃度を提供することができる。例えばCO2濃度は1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10％に維持することができる。

送達プラットフォーム2300は細胞の集団を適切な温度に維持することができる。これは、例えばチャンバーアセンブリ2325内に加熱要素を備えることによって達成することができる。加熱要素は、例えば電気加熱要素など、任意の適切なタイプであることができる。いくつかの実施形態において、熱移動と細胞集団を一様な温度に維持することを支援するために、伝導性スリーブを含めることができる。温度は、特定の適用および細胞の集団に基づいて、さまざまでありうる。例えば細胞集団の温度は、その細胞が単離された宿主の体温に維持することができ、それほどではないが、温度の解剖学的変動（例えば皮膚の温度は骨格筋の温度より低いと考えられる）にも依存しうる。細胞培養にとって過剰加熱は過少加熱よりも重大な問題になりうるので、いくつかの細胞培養プロトコールでは、温度を最適温度よりわずかに低く設定しておくことができる。多くのヒト細胞株および哺乳動物細胞株は最適な成長のために36℃～37℃に維持されるが、他の温度も考えうる。いくつかの実施形態において、温度は、環境中に導入されたガスの温度を制御することによって制御することができる。

送達プラットフォーム2300は環境の運動を制御することができる。例えば、送達プラットフォーム2300は、上で詳述したように、チャンバーアセンブリ2325を揺動または往復運動させることができる。揺動または往復運動は、細胞培養の継続時間にわたって行うか、または所与の細胞処理プロトコールによる要求に応じて行うことができる。

送達プラットフォーム2300は、チャンバーアセンブリ2325内に含まれる培地を制御することができる。例えば、有機系緩衝液（例えばHEPES）またはCO₂-炭酸水素イオン系緩衝液などの培地を、ポートを介して、チャンバーアセンブリ中に導入することができる。いくつかの実施形態では、チャンバーアセンブリ2325に培地（例えば培地2345）を提供するために、シリンジ2370によって培地を導入することができる。いくつかの実施形態では、培養用培地がチャンバーアセンブリ2325から流れ出すのを防ぐために、アセンブリ中の培地がより長い期間にわたって維持されるように、使い捨てアセンブリの下の管系上にピンチバルブまたはクリップを備えることができる。

チャンバーアセンブリ2325を細胞培養のために用いる場合は、成長が可能になるような密度で細胞を播種することができる。

いくつかの実施形態では、細胞代謝産物を細胞培養中に分析することができる。例えばグルコース、グルタミン、乳酸およびCO2を、細胞培養プロセス中の培養用培地の変化を制御することの一部として、監視することができる。いくつかの実施形態では、異なる培養用培地を、所望どおりに導入し、および/または除去することができる。

いくつかの実施形態では、例えば培養プロセス中の試験のために、細胞試料を細胞の集団から取り出すことができる。細胞培養中の細胞の取り出しを可能にすることにより、追加の測定および/または試験を、細胞培養に対して、ある期間にわたって行うことができる。いくつかの実施形態では、細胞を取り出して、外部のバイオリアクター（例えば細胞培養に適した別のポッドまたはチャンバー）に入れることができる。いくつかの実施形態において、細胞の取り出しは、1つまたは複数のチューブを通した取り出しによって達成することができる。

いくつかの実施形態では、細胞培養中に細胞を撹拌することができる。いくつかの実施形態において、撹拌は手動で行うことができる。いくつかの実施形態において、撹拌は、送達プラットフォーム2300によって、例えばチャンバーアセンブリ2325を往復運動させることなどによって行うことができる。周波数範囲50Hz～2500Hzにおける振動摂動および2mmまたはそれ以上の物理的偏位（例えば振幅）は、適当な混合または撹拌をもたらしうる。いくつかの実施形態では、これより低いまたは高い周波数（例えば1～50Hzまたは2500～5000Hz）およびこれより大きな振幅（例えば2～20mm）を使用することができる。

下流プロセスの別の一例であり、それを行うために送達プラットフォーム2300を構成することができるものとして、送達プラットフォーム2300は、凍結保存プロセスを行うために用いることができる。例えば、培養された細胞を凍結保存することは、完全培地中、ジメチルスルホキシド（DMSO）またはグリセロールなどの凍結保護作用物質の存在下に、液体窒素中で、それらを貯蔵することを含みうる。凍結保護作用物質は、培地の凝固点を低下させると共に、冷却速度の減速を可能にして、細胞を損傷し細胞死を引き起こす可能性がある氷晶形成のリスクを著しく低下させる。したがって、細胞の集団（例えば上述のプロセスのうちの1つまたは複数、例えば透過処理剤を使ったペイロードの送達（例えばトランスフェクション）、ウイルスベースの形質導入、細胞培養などを受けた後の細胞）の凍結保護を支援するために、DMSOなどの凍結保護作用物質を、チャンバーアセンブリ2325中に、例えばチャンバーアセンブリ2325のポートを使って、提供することができる。

いくつかの態様において、送達プラットフォーム2300は、細胞を培養または共培養するための閉鎖チャンバー内のある体積の細胞にウイルス構成要素を導入すること（例えば細胞形質導入プロセス）が可能になるように構成することができる。例えば、上述の送達プロセス（例えば細胞集団をペイロード含有溶液と（例えばスプレーによって）接触させること）を行う前または行った後に、標的細胞に導入しようとする遺伝物質を含有する複製欠損性ウイルスを、細胞集団に加えることができる。

送達プラットフォーム2300は、さらに、洗浄、収穫および凍結保存などの下流処理のために構成することができる。いくつかの態様において、送達プラットフォーム2300は、他の実験用または治療用のデバイス、プラットフォーム、またはシステムに、容易に接続することができる。例えば、送達プラットフォーム2300は、専用のまたは従来の透過処理または細胞処理プラットフォーム、例えばエッペンドルフリアクターに流体連結することができる。

送達プラットフォーム2300は、閉鎖チャンバー内の細胞および/またはビーズの活性化、ならびに形質導入および/またはトランスフェクションワークフロー中の細胞のプライミングなどといった、上流処理をすぐに容易にすることができる。細胞の洗浄および体積低減は、上流処理工程として行うことができる。他の上流プロセスも使用することができる。

送達プラットフォーム2300は、制御可能な閉鎖環境を、有利に提供することができ、前記閉鎖環境は、実験特異的および適用特異的設定で容易に構成されており、かつ、作動させるのに高価で複雑な機械装置または自動化機構を必要としない。交換可能な培地および収集槽の構成は、送達プラットフォーム2300の無菌的な汚染されない作動を維持しつつ、適用特異的または実験特異的な、融通のきく調節可能なワークフローまたはプロセスループを可能にすることができる。多くの場合、汚染は開放系またはプラットフォームの移動/移転によって導入されうる。汚染は、細胞および/または試薬培地を導入するかまたは取り出すのに複数の流体チャネルまたは導管の接続と切断を必要とする系にも導入されうる。

本明細書記載の主題は、多くの技術的利点を提供する。例えば、細胞培養を行うために送達プラットフォーム2300を用いることにより、いくつかの実施形態は、細胞の正常な生理学および生化学（例えば代謝研究、加齢）、細胞に対する薬物および毒性化合物の効果、ならびに変異生成および発がんを研究するための優れたモデル系を提供することができる。薬物のスクリーニングと開発や、生物学的化合物（例えばワクチン、治療用タンパク質）の大規模製造でも、これを使用することができる。細胞培養を行うために送達プラットフォーム2300を用いることにより、結果の一貫性と再現性が改良されうる。さらにまた、細胞培養を行うために送達プラットフォーム2300を用いることにより、細胞を使い捨てアセンブリから別の槽または培養ウェルに移動させる必要がなくなり、それにより、生存率を改良し、汚染を低減することができる。

本明細書では上流処理および下流処理という用語を使用したが、本主題のいくつかの実施形態は、任意のプロセス工程を任意の所望の順序で実施することができる。例えば、プロセスはユーザー定義されることができ、（工程が上流で行われるか下流で行われるかを問わず）任意の順序で定義されることができる。

例示的送達プロトコールの態様
本発明は、細胞を、送達しようとする化合物（例えばペイロード）を含有する溶液と接触させることによって、化合物または化合物の混合物（組成物）が真核細胞の細胞質中に送達されるという、驚くべき発見に基づく。好ましくは、溶液はスプレーの形態で、例えば水性粒子の形態で、細胞に送達される（例えば参照により本明細書に組み入れられるPCT/US2015/057247およびPCT/IB2016/001895を参照されたい）。例えば細胞はスプレーで被覆されるが、送達化合物含有溶液に浸漬または沈漬されることはない。いくつかの実施形態において、送達溶液は、細胞膜を透過性にするかまたは溶解する作用物質を含むことができる。この作用物質は、ペイロードの送達に影響を及ぼすためには必要でない場合があるが、この作用物質は送達を強化しうる。真核細胞膜を透過または溶解する例示的作用物質として、アルコールおよび洗浄剤、例えばそれぞれエタノールおよびTriton X-100が挙げられる。他の例示的洗浄剤、例えば界面活性剤として、ポリソルベート20（例えばTween 20）、3-［（3-コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］-1-プロパンスルホネート（CHAPS）、3-［（3-コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホネート（CHAPSO）、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）およびオクチルグルコシドが挙げられる。

被覆された細胞の集団の被覆を達成するための条件の一例は、微粒子スプレーの送達を含み、例えばかなりの数の細胞がボーラス体積の流体によって浸漬または沈漬されるような、細胞へのボーラス体積の溶液の滴下またはピペッティングは、この条件からは除外される。したがってミストまたはスプレーは、細胞体積に対して、ある比率の流体体積を含む。あるいは、条件は、露出細胞面積に対して、例えば細胞が実質的に平坦な表面に、例えばマイクロタイター組織培養プレートなどの組織培養プレートのウェルなどといった組織培養槽の底に、コンフルエントな層または実質上コンフルエントな層として存在する場合に、露出している細胞膜の面積に対して、ある比率のミスト体積またはスプレー体積を含む。

「カーゴ」または「ペイロード」とは、細胞形質膜を横切って細胞の内部へと、水溶液として送達される化合物または組成物を記載するために使用される用語である。

一局面において、細胞の形質膜を横切るペイロードの送達は、細胞の集団を提供し、その細胞の集団をある体積の水溶液と接触させることを含む。水溶液はペイロードを含む。いくつかの実施形態において、水溶液はアルコールを含まない。いくつかの実施形態において、水溶液は濃度0.2パーセント超のアルコール含量を含む。いくつかの実施形態において、水溶液はペイロードおよび濃度5パーセント超のアルコール含量を含む。水溶液の体積は、細胞の集団の露出表面積の関数でありうるか、細胞の集団中の細胞の数の関数でありうる。

別の一局面において、細胞の形質膜を横切ってペイロードを送達するための組成物は、ペイロード、および46mM超の塩、121mM未満の糖、および19mM未満の緩衝剤を含む水溶液を含む。いくつかの実施形態において、水溶液はアルコールを全く含まない。いくつかの実施形態において、水溶液は濃度0.2パーセント超のアルコールを含む。例えばアルコール、例えばエタノールの濃度は、2パーセント超、5パーセント超であり、および/または50％を超えない。

以下の特徴のうちの1つまたは複数が、考えうる任意の組合せで含まれうる。細胞に送達される溶液の体積は、複数単位、例えばスプレー、例えば水性粒子上の複数の小滴である。体積は、個々の細胞との比較で記載されるか、コンフルエントまたは実質的にコンフルエント（例えば少なくとも75％、少なくとも80％コンフルエント、例えば85％、90％、95％、97％、98％、100％コンフルエント）な細胞集団の露出表面積との比較で記載される。例えば、体積は細胞1個あたり6.0×10^-7マイクロリットル～細胞1個あたり7.4×10^-4マイクロリットルであることができる。体積は細胞1個あたり4.9×10^-6マイクロリットル～細胞1個あたり2.2×10^-3マイクロリットルである。体積は細胞1個あたり9.3×10^-6マイクロリットル～細胞1個あたり2.8×10^-5マイクロリットルであることができる。体積は細胞1個あたり約1.9×10^-5マイクロリットルであることができ、約とは10％以内である。体積は細胞1個あたり6.0×10^-7マイクロリットル～細胞1個あたり2.2×10^-3マイクロリットルである。体積は、露出表面積1平方マイクロメートルあたり2.6×10^-9マイクロリットル～露出表面積1平方マイクロメートルあたり1.1×10^-6マイクロリットルであることができる。体積は露出表面積1平方マイクロメートルあたり5.3×10-8マイクロリットル～露出表面積1平方マイクロメートルあたり1.6×10^-7マイクロリットルであることができる。体積は露出表面積1平方マイクロメートルあたり約1.1×10^-7マイクロリットルであることができる。約は10％以内であることができる。

細胞のコンフルエンシーとは表面上で互いに接触している細胞を指す。例えば、コンフルエンシーは推定（または計数）された百分率として表現することができ、例えば10％コンフルエントとは、表面の、例えば組織培養槽の表面の、10％が細胞で覆われていることを意味し、100％とは表面が完全に覆われていることを意味する。例えば接着細胞は組織培養ウェル、プレートまたはフラスコの表面上で二次元的に成長する。非接着細胞は遠沈させるか、真空によって沈降させるか、組織培養用培地を細胞集団の上部から吸引除去するか、槽の底部からの吸引または真空除去によって除去することができる。

細胞の集団と前記体積の水溶液との接触は、ガスにより、水溶液を噴射してスプレーを形成させることによって行うことができる。このガスは、窒素、周囲空気または不活性ガスを含むことができる。スプレーは、直径が1nm～100μm、例えば30～100μmの範囲にある、不連続な体積の単位を含むことができる。スプレーは、約30～50μmの直径を持つ不連続な体積の単位を含む。総体積20μlの水溶液を、スプレーとして、約1.9cm²の細胞占有面積に、例えば24ウェル培養プレートの1ウェルに、送達することができる。総体積10μlの水溶液が、約0.95cm²の細胞占有面積に、例えば48ウェル培養プレートの1ウェルに、送達される。通例、水溶液は、細胞膜を横切って細胞中に送達されるべきペイロードを含み、第2の体積は、ペイロードを含有しない緩衝液または培養用培地（例えば、停止溶液）である。あるいは、第2の体積（緩衝液または培地）もペイロードを含有することができる。いくつかの態様において、水溶液はペイロードおよびアルコールを含み、第2の体積はアルコールを含有しない（そして任意でペイロードを含有しない）。細胞の集団は、第2の体積の緩衝液または培養用培地を加えて細胞の集団を沈漬または懸濁させる前に、0.1 10分間、前記水溶液と接触することができる。緩衝液または培養用培地はリン酸緩衝食塩水（PBS）であることができる。細胞の集団は、第2の体積の緩衝液または培養用培地を加えて細胞の集団を沈漬または懸濁させる前に、2秒～5分間、前記水溶液と接触することができる。細胞の集団は、第2の体積の緩衝液または培養用培地、例えばペイロードを含まないものを加えて細胞の集団を沈漬または懸濁させる前に、前記水溶液、例えばペイロードを含有する水溶液と、30秒～2分間、接触することができる。細胞の集団は、第2の体積の緩衝液または培養用培地を加えて細胞の集団を沈漬または懸濁させる前に、約1～2分間、スプレーと接触することができる。細胞のスプレー処理と緩衝液または培養用培地の添加との間の時間中、細胞はスプレー体積からの水分の層によって水和されたままである。

水溶液は5～30％のエタノール濃度を含むことができる。水溶液は、75～98％のH₂O、2～45％のエタノール、6～91mMのスクロース、2～500mMのKCl、2～35mMの酢酸アンモニウム、および1～14mMの（4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸）（HEPES）のうちの1つまたは複数を含むことができる。例えば、送達溶液は10⁶mMのKClおよび27％のエタノールを含有する。

細胞の集団は、接着細胞または非接着細胞を含むことができる。接着細胞は、初代間葉系幹細胞、線維芽細胞、単球、マクロファージ、肺細胞、神経細胞、線維芽細胞、ヒト臍帯静脈（HUVEC）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、およびヒト胎児腎臓（HEK）細胞または不死化細胞、例えば細胞株のうちの少なくとも1つを含むことができる。好ましい態様において、細胞の集団は非接着細胞を含み、例えば集団中の非接着細胞率は、少なくとも50％、60％、75％、80％、90％、95％、98％、99％、または100％の非接着細胞である。非接着細胞は、初代細胞ならびに不死化細胞（例えば細胞株の細胞）である。例示的な非接着/浮遊細胞として、初代造血幹細胞（HSC）、T細胞（例えばCD3＋細胞、CD4＋細胞、CD8＋細胞）、ナチュラルキラー（NK）細胞、サイトカイン誘導性キラー（CIK）細胞、ヒト臍帯血CD34＋細胞、B細胞、またはJurkat T細胞などの細胞株が挙げられる。

ペイロードは、小さい化学分子、ペプチドもしくはタンパク質、または核酸を含むことができる。小さい化学分子は1,000Da未満であることができる。化学分子は、MitoTracker（登録商標）Red CMXRos、ヨウ化プロピジウム、メトトレキサート、および/またはDAPI（4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）を含むことができる。ペプチドは約5,000Daであることができる。ペプチドは、エカランチド（商標Kalbitorと知られ、これは遺伝性血管浮腫の処置および心胸郭手術における失血防止のための60アミノ酸ポリペプチドである）、リラグルチド（商品名Victozaとして販売されてII型糖尿病の処置に使用されており、また商品名Saxendaとして肥満処置用に販売されている）およびイカチバント（商標Firazyer、遺伝性血管浮腫の急性発作を処置するためのペプチドミメティック）を含むことができる。低分子干渉リボ核酸（siRNA）分子は約20～25塩基対の長さであるか、約10,000～15,000Daであることができる。siRNA分子は、例えばグリセルアルデヒド-3リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）siRNA、GAPDH siRNA-FITC、シクロフィリンB siRNA、および/またはラミンsiRNAなど、任意の遺伝子産物の発現を低減することができ、例えば臨床上重要なターゲット遺伝子またはモデル遺伝子の遺伝子発現をノックダウンすることができる。タンパク質治療薬は、ペプチド、酵素、構造タンパク質、受容体、細胞タンパク質もしくは循環タンパク質、またはそれらのフラグメントを含むことができる。タンパク質またはポリペプチドは約100～500,000Da、例えば1,000～150,000Daである。タンパク質は、任意の治療用、診断用または研究用タンパク質またはペプチド、例えばβ-ラクトグロブリン、卵白アルブミン、ウシ血清アルブミン（BSA）、および/またはセイヨウワサビペルオキシダーゼを含むことができる。他の例では、タンパク質はがん特異的アポトーシスタンパク質、例えば腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘発タンパク質（TRAIL）を含むことができる。

抗体は一般に分子質量が約150,000Daである。抗体は、抗アクチン抗体、抗GAPDH抗体、抗Src抗体、抗Myc ab、および/または抗Raf抗体を含むことができる。抗体は、緑色蛍光タンパク質（GFP）プラスミド、GLucプラスミド、およびBATEMプラスミドを含むことができる。DNA分子は5,000,000Da超であることができる。いくつかの例において、抗体は、マウス由来のモノクローナル抗体、例えばイブリツモマブチウキセチン（ibritumomab tiuxetin）、ムロモマブ-CD3（muromomab-CD3）、トシツモマブ、ヒト抗体またはヒト化マウス（または他の種に由来する）抗体であることができる。他の例において、抗体はキメラモノクローナル抗体、例えばアブシキシマブ、バシリキシマブ、セツキシマブ、インフリキシマブ、またはリツキシマブであることができる。さらに別の例において、抗体は、ヒト化モノクローナル抗体、例えばアレムツザマブ（alemtuzamab）、ベバシズマブ、セルトリズマブペゴール、ダクリズマブ、ゲンツブマブオゾガマイシン（gentuzumab ozogamicin）、トラスツズマブ、トシリズマブ、イピリムマンブ（ipilimumamb）、またはパニツムマブであることができる。抗体は、抗体フラグメント、例えばアバテセプト（abatecept）、アフリベルセプト、アレファセプト、またはエタネルセプトを含むことができる。本発明は、インタクトなモノクローナル抗体だけでなく、免疫学的に活性な抗体フラグメント、例えばFabまたは（Fab）2フラグメント、改変一本鎖Fv分子、またはキメラ分子、例えばマウスなどに由来する抗体の結合特異性と、ヒトなどに由来する別の抗体の残りの部分とを含有する抗体も包含する。

ペイロードは治療用作用物質を含むことができる。治療用作用物質、例えば薬物または活性作用物質は、治療目的または診断目的に役立つ任意の化合物を意味することができ、この用語は、ある状態の処置のために患者に投与される任意の化合物を意味すると理解することができる。したがって治療用作用物質は、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体フラグメントおよび小分子を含むことができる。本明細書に記載の方法では、米国特許第7,667,004号（参照により本明細書に組み入れられる）に記載の治療用作用物質を使用することができる。治療用作用物質は、シスプラチン、アスピリン、スタチン類（例えばピタバスタチン、アトルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、プロマジンHCl、クロロプロマジンHCl、チオリダジンHCl、硫酸ポリミキシンB、クロロキシン、ベンフルオレクスHClおよびフェナゾピリジンHCl）、およびフルオキセチンのうちの少なくとも1つを含むことができる。ペイロードは診断用作用物質を含むことができる。診断用作用物質は、検出可能な標識またはマーカー、例えばメチレンブルー、パテントブルーVおよびインドシアニングリーンのうちの少なくとも1つを含むことができる。ペイロードは蛍光分子を含むことができる。ペイロードは検出可能なナノ粒子を含むことができる。ナノ粒子は量子ドットを含むことができる。

非接着細胞の集団は、例えば75％コンフルエントを上回るなど、実質的にコンフルエントであることができる。細胞のコンフルエンシーとは表面上で互いに接触している細胞を指す。例えば、コンフルエンシーは推定（または計数）された百分率として表現することができ、例えば10％コンフルエントとは、表面の、例えば組織培養槽の表面の、10％が細胞で覆われていることを意味し、100％とは表面が完全に覆われていることを意味する。例えば接着細胞は組織培養ウェル、プレートまたはフラスコの表面上で二次元的に成長する。非接着細胞は遠沈させるか、真空によって沈降させるか、組織培養用培地を細胞集団の上部から吸引除去するか、槽の底部からの吸引または真空除去によって除去することができる。細胞の集団は細胞の単層を形成することができる。

アルコールは、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノール、およびベンジルアルコールから選択することができる。塩は、NaCl、KCl、Na₂HPO₄、KH₂PO₄、およびC₂H₃O₂NHから選択することができる。好ましい態様において塩はKClである。糖はスクロースを含むことができる。緩衝剤は4-2-（ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸を含むことができる。

本主題は形質膜を横切って分子を送達するための方法に関する。本主題は細胞内送達の分野において役立ち、例えば細胞、組織または器官などのターゲット部位への分子生物学的および薬理学的治療用作用物質の送達における用途を有する。本主題の方法は、マトリックスを形成させるために水性組成物に分子を導入する工程、マトリックスをスプレーに微粒化する工程およびマトリックスを形質膜と接触させる工程を含む。

この本主題は、形質膜を横切って分子を送達するのに使用される組成物に関する。本主題は細胞内送達の分野において役立ち、例えば細胞、組織または器官などのターゲット部位への分子生物学的および薬理学的治療用作用物質の送達における用途を有する。本主題の組成物は、アルコール、塩、糖、および/または緩衝剤を含む。

いくつかの実施形態では、分子および細胞のタイプとは無関係に分子の細胞内送達を容易にする送達技術が示される。ナノ粒子、小分子、核酸、タンパク質、および他の分子は、初代細胞および幹細胞を含むインサイチューの浮遊細胞または接着細胞に低い細胞毒性で効率よく送達されることができ、この技術はハイスループットおよび自動化細胞ベースアッセイに適合する。

本明細書に記載するいくつかの例示的方法はペイロードを含み、ペイロードはアルコールを含む。「アルコール」という用語は、少なくとも1つの炭素原子に結合したヒドロキシル（-OH）官能基を含む多原子有機化合物を意味する。アルコールは一価アルコールであってよく、メタノールなど、少なくとも1つの炭素原子を含みうる。アルコールは少なくとも2つの炭素原子を含みうる（例えばエタノール）。別の局面において、アルコールは少なくとも3つの炭素を含む（例えばイソプロピルアルコール）。アルコールは少なくとも4つの炭素原子（例えばブタノール）または少なくとも7つの炭素原子（例えばベンジルアルコール）を含みうる。例示的ペイロードは、50％（v/v）以下のアルコールを含むことができ、より好ましくは、ペイロードは、2～45％（v/v）のアルコール、5～40％のアルコール、および10～40％のアルコールを含む。ペイロードは20～30％（v/v）のアルコールを含みうる。

いくつかの実施形態において、ペイロード送達溶液は25％（v/v）のアルコールを含む。あるいはペイロードは2～8％（v/v）のアルコールまたは2％のアルコールを含むことができる。アルコールはエタノールを含むことができ、ペイロードは、5％、10％、20％、25％、30％、および最大40％または50％（v/v）のエタノール、例えば27％のエタノールを含む。例示的方法はアルコールとしてメタノールを含むことができ、ペイロードは5、10、20、25、30、または40％（v/v）のメタノールを含みうる。ペイロードは2～45％（v/v）のメタノール、20～30％（v/v）または25％（v/v）のメタノールを含みうる。好ましくはペイロードは20～30％（v/v）のメタノールを含む。さらにあるいは、アルコールはブタノールであり、ペイロードは2、4、または8％（v/v）のブタノールを含む。

本主題のいくつかの局面において、ペイロードは等張溶液または等張緩衝液である。

本主題によれば、ペイロードは少なくとも1つの塩を含みうる。塩は、NaCl、KCl、Na₂HPO₄、C₂H₃O₂NH₄、およびKH₂PO₄から選択されうる。例えばKCl濃度は2mM～500mMの範囲にある。いくつかの好ましい態様において濃度は100mMを上回り、例えば106mMである。

本主題の例示的方法によれば、ペイロードは糖（例えばスクロースまたは二糖）を含みうる。例示的方法によれば、ペイロードは121mM未満の糖、6～91mMまたは26～39mMの糖を含む。さらにペイロードは32mMの糖（例えばスクロース）を含む。任意で糖はスクロースであり、ペイロードは6.4、12.8、19.2、25.6、32、64、76.8、または89.6mMスクロースを含む。

本主題の例示的方法によれば、ペイロードは緩衝剤（例えば弱酸または弱塩基）を含みうる。緩衝剤は双性イオンを含みうる。例示的方法によれば、緩衝剤は4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸である。ペイロードは、19mM未満の緩衝剤（例えば1～15mMまたは4～6mMまたは5mMの緩衝剤）を含みうる。例示的方法によれば、緩衝剤は4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸であり、ペイロードは1、2、3、4、5、10、12、14mMの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸を含む。さらに好ましくはペイロードは5mMの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸を含む。

本主題の例示的方法によれば、ペイロードは酢酸アンモニウムを含む。ペイロードは46mM未満の酢酸アンモニウム（例えば2～35mM、10～15mM、または12mMの酢酸アンモニウム）を含みうる。ペイロードは、2.4、4.8、7.2、9.6、12、24、28.8、または33.6mMの酢酸アンモニウムを含みうる。

水溶液を噴射するガスによって行われる水溶液の体積は、圧縮空気（例えば周囲空気）を含みうる。他の実施形態は不活性ガス、例えばヘリウム、ネオン、およびアルゴンを含みうる。

本主題のある特定の局面において、細胞の集団は、接着細胞（例えば肺、腎臓、マクロファージなどの免疫細胞）または非接着細胞（例えば浮遊細胞）を含みうる。

本主題のある特定の局面において、細胞の集団は、実質的にコンフルエントであることができ、実質的に75パーセントコンフルエントを上回りうる。好ましい実施形態において、細胞の集団は単一の単層を形成しうる。

例示的方法によれば、送達されるべきペイロードは、最大20,000,000Daの平均分子量を有する。いくつかの例において、送達されるべきペイロードは、最大2,000,000Daの平均分子量を有することができる。いくつかの実施形態において、送達されるべきペイロードは最大150,000Daの平均分子量を有しうる。さらなる実施形態において、送達されるべきペイロードは、最大15,000Da、5,000Da、または1,000Daの平均分子量を有しうる。

細胞の形質膜を横切って送達されるべきペイロードは、小さい化学分子、ペプチドまたはタンパク質、多糖または核酸またはナノ粒子を含みうる。小さい化学分子は1,000Da未満であることができ、ペプチドは約5,000Daの分子量を有することができ、siRNAは15,000Da前後の分子量を有することができ、抗体は約150,000Daの分子量を有することができ、DNAは5,000,000Da超または5,000,000Daの分子量を有することができる。好ましい態様においてペイロードはmRNAを含む。

例示的方法によれば、ペイロードは、3.0～150.0μMの送達されるべき分子、より好ましくは6.6～150.0μMの送達されるべき分子（例えば3.0、3.3、6.6、または150.0μMの送達されるべき分子）を含む。いくつかの実施形態において、送達されるべきペイロードは最大15,000Daの平均分子量を有し、ペイロードは3.3μMの送達されるべき分子を含む。

例示的方法によれば、送達されるべきペイロードは最大15,000Daの平均分子量を有し、ペイロードは送達されるべき6.6μMを含む。いくつかの実施形態において、送達されるべきペイロードは最大1,000Daの平均分子量を有し、ペイロードは送達されるべき150.0μMを含む。

本主題のさらなる局面によれば、形質膜を横切って複数の分子量の分子を送達するための方法が提供され、本方法は、複数の分子量の分子を水溶液に導入する工程および水溶液を形質膜と接触させる工程を含む。

いくつかの実施形態において、本方法は、第1の分子量を有する第1の分子および第2の分子量を有する第2の分子をペイロードに導入する工程を含み、ここで、第1の分子および第2の分子は異なる分子量を有しうるか、第1の分子および第2の分子は同じ分子量を有しうる。例示的方法によれば、第1の分子および第2の分子は異なる分子でありうる。

いくつかの実施形態において、送達されるべきペイロードは、治療用作用物質または診断用作用物質、例えばシスプラチン、アスピリン、種々のスタチン類（例えばピタバスタチン、アトルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、プロマジンHCl、クロロプロマジンHCl、チオリダジンHCl、硫酸ポリミキシンB、クロロキシン、ベンフルオレクスHCl、およびフェナゾピリジンHCl）、およびフルオキセチンを含みうる。他の治療用作用物質として、抗微生物薬（アミノグリコシド（aminoclycloside）（例えばゲンタマイシン、ネオマイシン、ストレプトマイシン）、ペニシリン類（例えばアモキシシリン、アンピシリン）、糖ペプチド（例えばアボパルシン、バンコマイシン）、マクロライド（例えばエリスロマイシン、チルミコシン、タイロシン）、キノロン類（例えばサラフロキサシン、エンロフロキシン（enrofloxin））、ストレプトグラミン類（例えばビギニアマイシン（viginiamycin）、キヌプリスチン-ダルホプリシチン（dalfoprisitin））、カルバペネム、リポペプチド、オキサゾリジノン、シクロセリン、エタンブトール、エチオンアミド、イソニアズリド（isoniazrid）、パラアミノサリチル酸、およびピラジナミド）が挙げられる。いくつかの例において、抗ウイルス薬（例えばアバカビル、アシクロビル、エンフビルチド、エンテカビル、ネルフィナビル、ネビラピン、ネクサビル（Nexavir）、オセルタミビルラルテグラビル、リトナビル、スタブジン、およびバラシクロビル）。治療薬は、さまざまな疾患、例えばがん、感染性疾患、血友病、貧血、多発性硬化症、およびB型またはC型肝炎を処置するためのタンパク質ベースの治療を含みうる。

さらなる例示的ペイロードは、検出可能なマーカーまたは標識、例えばメチレンブルー、パテントブルーV、およびインドシアニングリーンも含むことができる。

本明細書に記載する方法は、検出可能な部分または検出可能なナノ粒子（例えば量子ドット）を含むペイロードも含みうる。検出可能な部分は、蛍光分子または放射性作用物質（例えば¹²⁵I）を含みうる。蛍光分子を適正な波長の光に曝露すると、蛍光によってその存在を検出することができる。最もよく使用される蛍光標識化合物には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、p-フタルデヒド（p-phthaldehyde）、およびフルオレサミンがある。分子は、¹⁵²Euまたはランタニド系列の他の元素などといった蛍光発光金属によって検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（DTPA）またはエチレンジアミン四酢酸（EDTA）などの金属キレート基を使って分子に取り付けることができる。分子は、それを化学発光化合物に連結することによって、検出可能に標識することもできる。その場合、化学発光タグ付き分子の存在は、化学反応の過程で生じるルミネセンスの存在を検出することによって判定される。特に有用な化学発光標識化合物の例はルミノール、イソルミノール、テロマティック（theromatic）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルである。

さらなる態様において、送達されるべきペイロードは、ゲノムDNAを編集する組成物（すなわち遺伝子編集ツール）を含みうる。例えば遺伝子編集組成物は、ゲノムDNAを切断し、ゲノムDNAにニックを入れ、ゲノムDNAをスプライスし、再編成し、移動させ、組換え、または他の形で改変する化合物または複合体を含みうる。上記に代えて、または上記に加えて、遺伝子編集組成物は、（i）ゲノムDNAを切断し、ゲノムDNAにニックを入れ、ゲノムDNAをスプライスし、再編成し、移動させ、組換え、または他の形で改変する遺伝子編集複合体に含まれうる化合物、または（ii）ゲノムDNAを切断し、ゲノムDNAにニックを入れ、ゲノムDNAをスプライスし、再編成し、移動させ、組換え、または他の形で改変する遺伝子編集複合体に含まれる化合物にプロセシングまたは改変されうる化合物を含みうる。さまざまな態様において、遺伝子編集組成物は、（a）遺伝子編集タンパク質、（b）RNA分子、および/または（c）リボヌクレオタンパク質（RNP）のうちの1つまたは複数を含む。

いくつかの態様において、遺伝子編集組成物は遺伝子編集タンパク質を含み、遺伝子編集タンパク質はジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、Casタンパク質、Creリコンビナーゼ、Hinリコンビナーゼ、またはFlpリコンビナーゼである。さらなる態様において、遺伝子編集タンパク質は、ホーミングエンドヌクレアーゼをTALENのモジュラーDNA結合ドメインと組み合わせた融合タンパク質（megaTAL）でありうる。例えばmegaTALをタンパク質として送達するか、あるいはmegaTALタンパク質をコードするmRNAを細胞に送達することができる。

さまざまな態様において、遺伝子編集組成物はRNA分子を含み、RNA分子はsgRNA、crRNA、および/またはtracrRNAを含む。

ある特定の態様において、遺伝子編集組成物はRNPを含み、RNPはCasタンパク質およびsgRNAまたはcrRNAおよびtracrRNAを含む。本主題の諸局面は、特定の遺伝子編集化合物がいつまたはどのくらい長く細胞中に存在するかを制御するのに特に有用である。

本主題のさまざまな実施形態において、遺伝子編集組成物は、細胞の集団またはその子孫において、（a）細胞の集団を水溶液と接触させた後、約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、24、48、60、72、0.5～2、0.5～6、6～12、または0.5～72時間にわたって、または（b）細胞の集団を水溶液と接触させた後、約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、24、48、60、72、0.5～2、0.5～6、6～12、または0.5～72時間未満にわたって、検出可能である。

いくつかの態様において、細胞の集団中の細胞またはその子孫のゲノムは、Creリコンビナーゼ、Hinリコンビナーゼ、またはFlpリコンビナーゼのための部位特異的組換え部位を、少なくとも1つは含む。

本発明の諸局面は、1つの遺伝子編集化合物を含む細胞と、その細胞に別の遺伝子編集化合物を挿入することに関する。例えば、RNPの1つの構成要素を、RNPの別の構成要素を発現するか、他の形で既に含有する細胞に導入することができる。例えば細胞の集団中の細胞またはその子孫は、sgRNA、crRNA、および/またはtracrRNAを含みうる。いくつかの態様において、細胞の集団またはその子孫は、sgRNA、crRNA、および/またはtracrRNAを発現する。上記に代えてまたは上記に加えて、細胞の集団中の細胞またはその子孫はCasタンパク質を発現する。

本明細書における主題のさまざまな実施形態はCasタンパク質を含む。いくつかの態様において、Casタンパク質はCas9タンパク質またはその変異体である。例示的なCasタンパク質（Cas9およびCas9変異体の非限定的な例を含む）を、本明細書に記載する。

さまざまな局面において、Cas9タンパク質の濃度は約0.1～約25μgの範囲をとりうる。例えばCas9の濃度は約1μg、約5μg、約10μg、約15μg、または約20μgでありうる。あるいは、Cas9の濃度は、約10ng/μL～約300ng/μL、例えば約10ng/μL～約200ng/μlまたは約10ng/μL～約100ng/μlまたは約10ng/μL～約50ng/μlの範囲をとりうる。

ある特定の態様において遺伝子編集組成物は、（a）第1のsgRNA分子および第2のsgRNA分子を含み、ここで第1のsgRNA分子の核酸配列は第2のsgRNA分子の核酸配列とは異なるか、（b）第1のsgRNAを含む第1のRNPおよび第2のsgRNAを含む第2のRNPを含み、ここで第1のsgRNA分子の核酸配列は第2のsgRNA分子の核酸配列とは異なるか、（c）第1のcrRNA分子および第2のcrRNA分子を含み、ここで第1のcrRNA分子の核酸配列は第2のcrRNA分子の核酸配列とは異なるか、（d）第1のcrRNA分子および第2のcrRNA分子を含み、ここで第1のcrRNA分子の核酸配列は第2のcrRNA分子の核酸配列とは異なり、さらにtracrRNA分子を含むか、または（e）第1のcrRNAおよびtracrRNAを含む第1のRNPならびに第2のcrRNAおよびtracrRNAを含む第2のRNPを含み、ここで第1のcrRNA分子の核酸配列は第2のcrRNA分子の核酸配列とは異なる。

諸局面において、Cas9タンパク質とガイドRNAとの比は、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、または1:10でありうる。

諸態様において、細胞が送達プロセスを経る回数を増やすと（あるいは投与回数を増やすと）編集率が増大しうる。いくつかの態様では、投与回数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10回の投与を含みうる。

さまざまな態様において、第1および第2のsgRNAまたは第1および第2のcrRNA分子は全体として、遺伝子、エクソン、イントロン、染色体外配列、またはゲノム核酸配列に隣接するターゲット配列に対して相補的な核酸配列を含み、ここで遺伝子、エクソン、イントロン、染色体外配列、またはゲノム核酸配列は、約1、2、3、4、5、6、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、1～100キロベース長であるか、少なくとも約1、2、3、4、5、6、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、1～100キロベース長である。いくつかの態様において、第1および第2のsgRNAまたは第1および第2のcrRNA分子を含むRNPのペアの使用は、遺伝子、エクソン、イントロン、染色体外配列またはゲノム核酸配列を含むポリヌクレオチド分子を生成するために使用しうる。

ある特定の態様において、sgRNAまたはcrRNAのターゲット配列は約12～約25、または約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、17～23、または18～22ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、ターゲット配列は20ヌクレオチド長または約20ヌクレオチド長である。

さまざまな態様において、第1および第2のsgRNAまたは第1および第2のcrRNA分子は、発現ベクター内にある染色体外配列に隣接する配列に対して相補的である。

本主題の諸局面は、遺伝子編集複合体の複数の構成要素の送達に関し、ここでそれら複数の構成要素は互いに複合体を形成していない。いくつかの態様において、遺伝子編集組成物は、少なくとも1つの遺伝子編集タンパク質および少なくとも1つの核酸を含み、ここで遺伝子編集タンパク質と核酸は互いに結合したり複合体を形成したりしていない。

本主題は、高い細胞生存率を維持しつつ、高い遺伝子編集効率を可能にする。いくつかの態様において、細胞の集団のうちの少なくとも約10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99％、1～99％、もしくはそれ以上、またはその子孫が、水溶液との接触後に遺伝子改変体になる。さまざまな態様において、細胞の集団のうちの少なくとも約10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99％、1～99％、もしくはそれ以上、またはその子孫が、水溶液との接触後も生存可能である。

ある特定の態様において、遺伝子編集組成物は細胞内のDNAにおける一本鎖切断または二本鎖切断を誘発する。いくつかの態様において、遺伝子編集組成物は修復テンプレートポリヌクレオチドをさらに含む。さまざまな態様において、修復テンプレートは、（a）一本鎖切断または二本鎖切断の一方の側にある約40～約90塩基対に相補的な配列のヌクレオチドを含む第1の隣接領域および一本鎖切断または二本鎖切断の他方の側にある約40～約90塩基対に相補的な配列のヌクレオチドを含む第2の隣接領域を含むか、（b）一本鎖切断または二本鎖切断の一方の側にある少なくとも約20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、または90塩基対に相補的な配列のヌクレオチドを含む第1の隣接領域および一本鎖切断または二本鎖切断の他方の側にある少なくとも約20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、または90塩基対に相補的な配列のヌクレオチドを含む第2の隣接領域を含む。CRISPR-Casシステムを使った遺伝子編集（修復テンプレートを含む）に関する非限定的な説明は、Ran et al.（2013）Nat Protoc.2013 Nov; 8（11）:2281-2308において議論されており、この文献の全内容は参照により本明細書に組み入れられる。修復テンプレートが関与する態様はCRISPR-Casシステムを含むものに限定されない。

本主題のさまざまな実施形態において、水溶液の体積は、スプレーの形態で細胞の集団に送達される。いくつかの態様において、体積は細胞1個あたり6.0×10^-7マイクロリットル～細胞1個あたり7.4×10^-4マイクロリットルである。ある特定の態様において、スプレーは、10nm～100μmの直径を含むコロイド粒子またはサブ粒子を含む。さまざまな態様において、体積は、露出表面1平方マイクロメートルあたり2.6×10^-9マイクロリットル～露出表面積1平方マイクロメートルあたり1.1×10^-6マイクロリットルである。

いくつかの態様において、RNPは、およそ100Å×100Å×50Å、すなわち10nm×10nm×5nmのサイズを有する。さまざまな態様において、スプレー粒子のサイズは、スプレー粒子1個あたり少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ以上のRNPを収容するように調節される。

例えば、細胞の集団を上記体積の水溶液と接触させる工程は、水溶液を噴射してスプレーを形成させるガスによって行いうる。ある特定の態様において、細胞の集団は、第2の体積の緩衝液または培養用培地を加えて細胞の集団を沈漬または懸濁させる前に、0.01～10分間（例えば0.1 10分間）、前記水溶液と接触する。

さまざまな態様において、細胞の集団は、初代細胞または不死化細胞のうちの少なくとも1つを含む。例えば細胞の集団は、間葉系幹細胞、肺細胞、神経細胞、線維芽細胞、ヒト臍帯静脈（HUVEC）細胞およびヒト胎児腎臓（HEK）細胞、初代または不死化造血幹細胞（HSC）、T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、サイトカイン誘導性キラー（CIK）細胞、ヒト臍帯血CD34＋細胞、B細胞を含みうる。T細胞の非限定的な例として、CD8＋またはCD4＋T細胞を挙げることができる。いくつかの局面では、CD3^＋T細胞のCD8＋部分集団が使用される。CD8^＋T細胞は、抗CD8ビーズを使ったポジティブ単離によってPBMC集団から精製されうる。いくつかの局面では、初代NK細胞をPBMCから単離して、プラットフォーム送達技術によってGFP mRNAを送達することができる（すなわち24時間で3％の発現および96％の生存率）。さらなる局面では、例えばNK92などのNK細胞株を使用しうる。

細胞タイプは、治療有効性を高めるために既に改変されている細胞、例えばT細胞、NK細胞およびMSCも含み、かつ、3次元培養、組織外植片、皮膚移植片、操作組織などに使用される。例えば、キメラ抗原受容体を発現するT細胞またはNK細胞（それぞれCAR T細胞、CAR NK細胞）;改変T細胞受容体（TCR）を発現するT細胞;先天的な特性を補完する治療用タンパク質を過剰発現するようにウイルスを使ってまたは非ウイルス的に改変されたMSC（例えばレンチウイルスベクターを使ったEpoの送達またはAAV-6を使ったBMP-2の送達）（Park et al, Methods, 2015 Aug;84-16に概説されている）;有効性を強化してターゲティングを外から調節するためにそれぞれ非ペプチド薬または磁気ナノ粒子でプライミングされたMSC（Park et al., 2015）;酵素修飾（例えばフコシルトランスフェラーゼ）、化学コンジュゲーション（例えばN-ヒドロキシ-スクシンイミド（NHS）化学を使ったMSC上のSLeXの修飾）または非共有結合的相互作用（例えばその後の抗体コンジュゲーションにとって疎水性アンカーとして作用するパルミチン酸化タンパク質（palmitated protein）による細胞表面の工学的改変）を使って治療部位へのホーミングを増強するためにターゲティング部分で機能化されたMSC（Park et al., 2015）。例えば、キメラ抗原受容体を発現するように改変されたT細胞、例えば初代T細胞またはT細胞株（CAR T細胞）は、CARをコードする遺伝子を編集し、それによって改変T細胞におけるCARの発現を低減するためまたは停止させるために、本発明に従って、遺伝子編集タンパク質および/またはCARコード配列に特異的なガイド核酸を含有する複合体で、さらに処理することができる。

本発明の諸局面は、細胞および組織への遺伝子編集化合物および遺伝子編集複合体の発現ベクターフリー送達、例えば初代ヒトT細胞、造血幹細胞（HSC）および間葉系間質細胞（MSC）におけるゲノム編集のためのCas-gRNAリボヌクレオタンパク質の送達に関する。いくつかの例では、上述のタンパク質をコードするmRNAが細胞に送達される。

CRISPR-Casシステムのさまざまな局面は当技術分野において公知である。このシステムの非限定的な局面は、例えば2015年5月5日に発行された米国特許第9,023,649号、2015年7月7日に発行された米国特許第9,074,199号、2014年4月15日に発行された米国特許第8,697,359号、2015年1月13日に発行された米国特許第8,932,814号、2015年8月27日に公開されたPCT国際特許出願公報番号WO 2015/071474、Cho et al.,（2013）Nature Biotechnology Vol 31 No 3 pp 230-232（補足情報を含む）、およびJinek et al.,（2012）Science Vol 337 No 6096 pp 816-821に記載されており、これらの文献のそれぞれの内容はすべて参照により本明細書に組み入れられる。

Casタンパク質の非限定的な例には、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9（Csn1およびCsx12としても公知である）、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、それらのホモログ、またはそれらの改変型が含まれる。これらの酵素は公知である。例えば化膿レンサ球菌（S.pyogenes）Cas9タンパク質のアミノ酸配列は、SwissProtデータベースにアクセッション番号Q99ZW2として、またNCBIデータベースにアクセッション番号Q99ZW2.1として見いだしうる。UniProtデータベースアクセッション番号A0A0G4DEU5およびCDJ55032は、Cas9タンパク質アミノ酸配列の別の例である。別の非限定的な例はストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）Cas9タンパク質であり、そのアミノ酸配列はUniProtデータベースにアクセッション番号Q03JI6.1として見いだしうる。いくつかの態様において、Cas9など、無改変のCRISPR酵素は、DNA切断活性を有する。ある特定の態様において、CRISPR酵素はCas9であり、化膿レンサ球菌または肺炎レンサ球菌（S.pneumoniae）由来のCas9でありうる。さまざまな態様において、CRISPR酵素は、ターゲット配列の場所、例えばターゲット配列内および/またはターゲット配列の相補鎖内において、一方または両方の鎖の切断を指示する。いくつかの態様において、CRISPR酵素は、ターゲット配列の一番目のヌクレオチドまたは最後のヌクレオチドから約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500、またはそれ以上の塩基対内で、一方または両方の鎖の切断を指示する。いくつかの態様において、ベクターは、対応する野生型酵素と比較して突然変異型CRISPR酵素がターゲット配列を含有するターゲットポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を切断する能力を欠くように突然変異させたCRISPR酵素をコードする。例えば、化膿レンサ球菌由来のCas9のRuvC I触媒ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニンへの置換は、Cas9を、両方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本の鎖を切断する）へと変換する。Cas9をニッカーゼにする突然変異の他の例として、H840A、N854A、およびN863Aが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。本発明の諸局面において、ニッカーゼは相同組換えによるゲノム編集に使用しうる。

ある特定の態様において、Cas9ニッカーゼは、ガイド配列と組み合わせて、例えばDNAターゲットのセンス鎖とアンチセンス鎖をそれぞれターゲットとする2つのガイド配列と組み合わせて、使用しうる。この組合せは両方の鎖にニックを入れてNHEJの誘発に使用することを可能にする。

さらなる一例として、すべてのDNA切断活性を実質的に欠く突然変異型Cas9を生成するために、Cas9の2つまたはそれ以上の触媒ドメイン（RuvC I、RuvC II、およびRuvC III）を、突然変異させることができる。すべてのDNA切断活性を実質的に欠く突然変異型Cas9を生成するために、D10A突然変異を、H840A、N854A、またはN863A突然変異のうちの1つまたは複数と組み合わせうる。ある特定の態様において、CRISPR酵素は、突然変異型酵素のDNA切断活性が、非突然変異型と比較して約25％、10％、5％、1％、0.1％、0.01％未満であるか、またはそれより低い場合は、すべてのDNA切断活性を実質的に欠くと見なされる。他の突然変異も役立ちうる。Cas9または他のCRISPR酵素が化膿レンサ球菌以外の種に由来する場合、対応するアミノ酸における突然変異を、類似する効果を達成するために導入しうる。

ある特定の態様において、送達されるタンパク質（例えばCasタンパク質またはその変種）は、細胞内局在化シグナルを含みうる。例えばRNP内のCasタンパク質は細胞内局在化シグナルを含みうる。文脈に依存して、例えばCas9および核局在化シグナルを含む融合タンパク質を、本明細書では、核局在化シグナルが含まれていることを明記することなく「Cas9」と呼びうる。いくつかの態様において、ペイロード（RNPなど）は、局在化シグナルを含む融合タンパク質を含む。例えば、融合タンパク質は、核局在化シグナル、核小体局在化シグナルまたはミトコンドリアターゲティングシグナルを含有しうる。そのようなシグナルは当技術分野において公知であり、非限定的な例は、Kalderon et al.,（1984）Cell 39（3 Pt 2）:499-509、Makkerh et al.,（1996）Curr Biol.6（8）:1025-7、Dingwall et al.,（1991）Trends in Biochemical Sciences 16（12）:478-81、Scott et al.,（2011）BMC Bioinfomatics 12:317（7頁）、Omura T（1998）J Biochem. 123（6）:1010-6、Rapaport D（2003）EMBO Rep.4（10）:948-52およびBrocard＆Hartig（2006）Biochimica et Biophysica Acta（BBA）-Molecular Cell Research 1763（12）:1565-1573に記載されており、これらの文献のそれぞれの内容は参照により本明細書に組み入れられる。さまざまな態様において、Casタンパク質は、複数の局在化シグナル、例えば2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上の核局在化シグナルを含みうる。いくつかの態様では、局在化シグナルがCasタンパク質のN末端にあり、別の態様では局在化シグナルがCasタンパク質のC末端にある。

いくつかの態様において、CRISPR酵素をコードする酵素コード配列は、真核細胞などの特定の細胞における発現に関してコドン最適化される。真核細胞は、例えば限定するわけではないがヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、または非ヒト霊長類を含む哺乳動物などといった特定の生物のものであるか、それら特定の生物に由来しうる。一般に、コドン最適化とは、関心対象の宿主細胞における発現を強化するために、ネイティブ配列の少なくとも1つのコドン（例えば、約1、2、3、4、5、10、15、20、25、50個、もしくはそれ以上の数または約1、2、3、4、5、10、15、20、25、50個、もしくはそれ以上を上回る数のコドン）を、ネイティブアミノ酸配列を維持しつつ、当該宿主細胞の遺伝子中でより高頻度にまたは最も高頻度に使用されているコドンで置き換えることによって核酸配列に変更を加えるプロセスを指す。さまざまな種が、特定のアミノ酸のある特定のコドンに対して、特定のバイアスを呈する。コドンバイアス（生物間でのコドン使用頻度の相違）は、多くの場合、メッセンジャーRNA（mRNA）の翻訳効率と相関し、そしてそれは、なかんずく、翻訳されるコドンの特性におよび特定のトランスファーRNA（tRNA）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞における選ばれたtRNAの優位性は一般にペプチド合成に最も高頻度に使用されるコドンの反映である。

したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現に適合させることができる。コドン使用頻度表は例えば「Codon Usage Database」などで容易に入手することができ、これらの表はいくつかの方法で適合させることができる。Nakamura, Y., et al.“Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000”Nucl. Acids Res.28:292（2000）参照。Gene Forge（Aptagen、ペンシルバニア州ジェイコバス）など、特定の配列を特定の宿主細胞における発現に関してコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムも用いることができる。いくつかの態様では、CRISPR酵素をコードする配列中の1つまたは複数のコドン（例えば1、2、3、4、5、10、15、20、25、50個、もしくはそれ以上のコドンまたはすべてのコドン）が、特定のアミノ酸に関して最も高頻度に使用されるコドンに対応する。

一般に、ガイド配列は、ターゲット配列とハイブリダイズし、ターゲット配列へのCRISPR複合体の配列特異的結合を指示するのに十分な、ターゲットポリヌクレオチド配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。いくつかの態様において、ガイド配列とその対応ターゲット配列との間の相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを使って最適にアラインメントした場合に、約50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％、もしくはそれ以上であるか、または約50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％、もしくはそれ以上を上回る。いくつかの態様において、相補性の程度は100％である。最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の適切なアルゴリズムを使って決定することができ、そのようなアルゴリズムの非限定的な例として、Smith-Watermanアルゴリズム、Needleman-Wunschアルゴリズム、Burrows-Wheeler変換に基づくアルゴリズム（例えばBurrows Wheeler Aligner）、ClustalW、Clustal X、BLAT、Novoalign（Novocraft Technologies、ELAND（Illumina、カリフォルニア州サンディエゴ）、SOAP（soap.genomics.org.cnで利用可能）およびMaq（maq.sourceforge.netで利用可能）が挙げられる。いくつかの態様において、ガイド配列は、約5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75個、もしくはそれ以上の長さ、または約5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75個、もしくはそれ以上を上回る長さである。ある特定の態様において、ガイド配列は、約75、50、45、40、35、30、25、20、15、12ヌクレオチド長未満、またはそれらをさらに下回る長さである。ターゲット配列へのCRISPR複合体の配列特異的結合を指示するガイド配列の能力は、任意の適切なアッセイによって評価しうる。例えば、試験しようとするガイド配列を含むCRISPR複合体を形成させるのに十分なCRISPRシステムの構成要素を、例えばCRISPR配列の構成要素をコードするベクターによるトランスフェクションなどによって、対応ターゲット配列を有する宿主細胞に与え、次にターゲット配列内での優先的切断の評価を、例えば本明細書に記載のSurveyorアッセイによって行うことができる。同様に、ターゲットポリヌクレオチド配列の切断は、ターゲット配列、試験しようとするガイド配列を含むCRISPR複合体の構成要素、および試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を提供し、ターゲット配列における結合または切断率を、試験ガイド配列反応と対照ガイド配列反応との間で比較することによって、試験管内で評価することができる。

広範な細胞タイプにおけるゲノム工学を容易にするCRISPR-Cas技術が急速に発展している。Cas9-gRNA編集ツールをリボヌクレオタンパク質（RNP）の形態で送達すると、Cas9およびgRNAをコードするプラスミドの送達と比較して、いくつかの利益が得られることが、最近明らかにされた。利益には、より速くより効率的な編集、より少ないオフターゲット効果およびより少ない毒性が含まれる。RNPは、リポフェクションおよびエレクトロポレーションによって送達されてきたが、これらの送達方法では、特にある特定の臨床上重要な細胞タイプに関して、毒性および低効率を含む制約が、依然として残っている。したがって、生物学的に重要なペイロード、例えばRNPを、形質膜を横切って細胞中に送達するために、ベクターフリーの、例えばウイルスベクターフリーのアプローチを提供する必要がある。「カーゴ」または「ペイロード」とは、細胞形質膜を横切って細胞の内部へと、水溶液として送達される化合物または組成物を記載するために使用される用語である。

本主題は、広範なペイロードを細胞に低い毒性で送達することを容易にする送達技術に関する。ゲノム編集は、本主題のいくつかの局面を使って細胞にRNPを送達することによって達成しうる。その後、レベルは、Cas9がもはや検出不能になるまで低下する。送達技術それ自体は、Jurkat T細胞および初代T細胞の生存率または機能性に有害な影響を及ぼさない。本主題は、臨床上重要な細胞タイプにおけるCas9 RNPによる遺伝子編集を最小限の毒性で可能にする。

Casおよび/またはgRNAなどのCRISPR/Cas構成要素の一過性直接送達には、発現ベクターによる送達と比較して利点がある。例えば、発現ベクターの使用と比較して、ある量のCas、gRNA、またはRNPを、より的確なタイミングで限られた長さの時間にわたって加えることができる。ベクターから発現される構成要素はさまざまな量でさまざまな長さの時間にわたって生産されうるが、そのことが、オフターゲット編集を伴わない首尾一貫した遺伝子編集の達成を困難にしている。加えて、CasとgRNAの予め形成された複合体（RNP）は、発現ベクターでは送達することができない。

一局面において、本主題は、固形支持体（例えばストリップ、ポリマー、ビーズまたはナノ粒子）に取り付けられた細胞を記載する。支持体またはスキャフォールドは、多孔性または非多孔性の固形支持体でありうる。周知の支持体または担体として、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および変性セルロース、ポリアクリルアミド、斑れい岩および磁鉄鉱が挙げられる。本主題の目的にとって、担体の性質はある程度可溶性であるか、不溶性であることができる。支持体材料は、事実上任意の考えうる構造的構成を有しうる。したがって支持体の構成は、ビーズの場合のような球状、または試験官の内面もしくは棒の外面の場合のような円柱状でありうる。あるいは、表面は、例えばシートまたは試験ストリップなど、平坦であってもよい。好ましい支持体としてポリスチレンビーズが挙げられる。

別の局面において固形支持体はポリマーを含み、細胞はそこに化学結合、固定化、分散または会合される。ポリマー支持体はポリマーのネットワークであってよく、（例えば懸濁重合によって）ビーズ状に調製しうる。そのようなスキャフォールド上の細胞には、スキャフォールドの細胞質に所望の化合物を送達するために、本発明のペイロード含有水溶液をスプレーすることができる。例示的なスキャフォールドとしてステントおよび他の埋め込み可能な医用デバイスまたは医用構造物が挙げられる。

例4
図1および図23に図解する例示的送達プラットフォームによる送達後のRNP（リボヌクレオタンパク質）編集効率に対するアルコールの効果。

図1および図23に図解する例示的送達プラットフォームを使った送達後のRNP編集効率に対してアルコール（例えばエタノール）が有する効果を判定するための実験を行った。加えて、図1および図23に図解する例示的送達プラットフォームによるRNPの送達後の編集にとっての最適エタノール濃度を確かめるための実験も行った。例えば、最適なCas9誘導的編集を可能にする最大エタノール濃度を決定した。エタノールの増加は、細胞へのより多くのカーゴ送達を可能にし、それによって、より高い編集効率を可能にした。

Cas9 RNP-TRAC（T細胞受容体α定常（T cell receptor alpha constant））sgRNA（一本鎖ガイドRNA）を2:1の比、0.4μg/μLで、調製した（1×10⁶個の細胞につき3.3μgに相当する）。S緩衝溶液（32.5mMスクロース;106mM塩化ナトリウム;5mM HEPES）を、0、5、10および15％のエタノールで、およびRNPで調製し、実験は、各エタノール濃度のS緩衝溶液を使って、図1および図23に図解した例示的送達プラットフォームで実行した。TRACガイドRNA配列:

。諸態様では、少なくとも2つの外因性カーゴが同時に送達される。つまり、それら2つの外因性カーゴは一度に送達される（例えば二重送達）。例えば免疫細胞（外因性カーゴを含むもの）は第2の外因性カーゴを含むように操作されうる。実験計画法を図29に示す。

「S緩衝液」は、低張生理緩衝溶液（78mMのスクロース、30mMのKCl、30mMの酢酸カリウム、12mMのHEPES）を4℃で5分間含む（Medepalli K.et al.,Nanotechnology 2013;24（20）、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。いくつかの例では、S緩衝液中の酢酸カリウムが酢酸アンモニウムで置き換えられる。S緩衝液は、国際出願WO2016/065341の例えば段落［0228］～［0229］に、さらに詳しく記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。例えば、本明細書に記載する一連の実験で使用したS緩衝液は、32.5mMのスクロース、106mMの塩化カリウムおよび5mMのHEPESを含んだ。

結論:図1および図23に図解する例示的送達プラットフォームを使った送達後に、各エタノール濃度におけるCD3（分化抗原群3）編集効率（例えばTRAC RNPをモニタリングする）を調べた。CD3を標的とする抗体で染色した細胞（生存集団からゲーティングしたもの）からの代表的フローサイトメトリープロットを図示する図30と、図31とを参照されたい。

図31Aに、エタノール濃度の増加に伴ってわずかに増加したCD3編集のレベル（0％EtOHおよび58％CD3編集対 15％EtOHおよび66％CD3編集）を表す棒グラフを示す。これらの結果を図31Bの表にさらに要約する。エタノール濃度を増加させた場合の、送達前、送達後（3日目）および送達後（5日目）からなる時点における、生存百分率を、図32の棒グラフに要約する。

例5
図33Aおよび図33Bに、例示的送達プラットフォームについて、0％EtOH送達溶液を使用した場合（図33A、アルコールなし）および12.5％アルコールを使用した場合（図33B）の、小滴サイズ対微粒化の圧力を図解する。図33Aおよび図33Bにおいて、DV90は、この値より小さい直径を持つ粒子の割合が90％であることを示し、DV50はこの値より小さい直径を持つ粒子の割合が50％であることを示し、DV10はこの値より小さい直径を持つ粒子の割合が10％であることを示す。

いくつかの実施形態において、エタノールなしの水溶液は（溶液を微粒化するための所与の圧力で）より大きな小滴サイズを示し、そのため、トランスフェクションのためにカーゴによる細胞の最適なスプレー被覆率を得るには、プロセス条件のさらなる考慮が必要であった。

いくつかの実施形態において、プラットフォームが、0％のエタノール送達溶液を用いている場合には、追加の洗浄工程を省略することができる。スプレー送達のオン/オフ切り替え速度は一定のままであることができる。同様に、このプルームおよびノズル設計は、エタノール溶液にもエタノールなしの溶液にも使用することができる。例6に詳述するように、本システムは、高張溶液（例えば送達溶液中のはるかに高い塩濃度）を使った送達にも対応することができる。

直径がおよそ10μmの細胞（例えばヒトT細胞）の場合、図33Aおよび図33Bは、過剰に大きい小滴を避けることを含めて細胞サイズに近い小滴サイズ範囲を維持するために、スプレー小滴サイズが、より高い微粒化圧力の適用を必要としたことを表す線グラフである。小滴サイズは、Malvern Mastersizer 3000レーザー回折装置（英国MalvernのMalvern Panalytical Ltd.から入手可能;（＜https://www.malvernpanalytical.com/en/products/product-range/mastersizer-range/mastersizer-3000＞参照）を使って、D90として測定された。いくつかの実施形態において、この例示的送達プラットフォームは、スプレー小滴（例えば粒子）サイズ分布の分布が、D90が細胞サイズの5倍以下であるサイズ範囲、D90が3.3×細胞サイズ以下である範囲、および/またはD90が約2×細胞サイズ以下である範囲を含みうる圧力を用いることができる。

例6
図34および図34B、図35Aおよび図35B、図36～38に図解する高張送達システムの効果。

以下の表に示すさまざまな体積比のスクロース緩衝液（45％スクロース、約175mOsm/kg）とリン酸緩衝食塩水（PBS）（約300mOsm/kg）の送達溶液において、0％EtOHを含むさまざまなエタノール濃度を使って、送達溶液の浸透圧を増加させること（例えば高張溶液の効果）を検討した。

（表１）さまざまなエタノール濃度における送達溶液浸透圧の増加

結果:図34Aおよび図34Bならびに図35Aおよび図35Bは、2つの緩衝溶液からスクロースと塩化ナトリウムの比率を増加させた溶液において12％および27％のエタノールを使って達成されるGFPトランスフェクションの増加を示した。図34A、34Bならびに図35Aおよび35Bでは、細胞の生存率も維持された。血清中のエタノールの効果を測定することによって実証されるとおり、エタノールは浸透圧に対して、より強い影響を有した（例えばNguyen,M.et al「Front.Med.Is the Osmolal Concentration of Ethanol Greater Than Its Molar Concentration？Jan 8,2020、「Nguyen」を参照されたい。これは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。参照文献Nguyenの図1を本明細書に転載するが（図36）、これは、エタノール添加後の血清浸透圧測定値とエタノール添加前の血清浸透圧測定値の間の相違およびmg/dLで表した血清中エタノール濃度とに基づいて、浸透圧ギャップがもっぱらエタノールによるものであることを物語る線形回帰を図解している。

本明細書に記載し検討する高張溶液もトランスフェクションを増加させた（図37）。

高張溶液はトランスフェクションを増加させることができると共に、生存率を減少させうる。高張溶液は、好ましくは、スクロースなどの有機構成要素またはデキストロース、グルコース、ソルビトール、マンニトールのような他の薬学的に許容される糖類と、無機塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウムまたは他の薬学的に許容される塩とを、どちらも含有する。エタノールを含まないこの複合送達溶液は、300mosm/kg未満、または300mosm/kg超、例えば400mosm/kg、または500mosm/kgまでの浸透圧を使用することができる。次に、この溶液を、50％までのさまざまな量のエタノールと混合することができる。糖類と無機塩の相対量は水性緩衝剤混合液の浸透圧の最大50％が、糖類（またはその無機塩との組合せ）から生じるように変化させてよく、好ましい範囲は糖類として40％未満であり、最も好ましくは糖類として33％未満である。別の例では、水性緩衝剤混合液の浸透圧の40％まで、35％まで、34％まで、33％まで、32％まで、31％までまたは30％までが、糖類（またはその無機塩との組合せ）から生じる。

いくつかの態様において、送達溶液は高張性であり、溶液の浸透圧は、糖類（例えばスクロース、デキストロース、グルコース、ソルビトール、マンニトール、および他の薬学的に許容される糖類）と無機塩（例えば塩化ナトリウム、塩化カリウムまたは他の薬学的に許容される塩）の組合せによる影響を受ける。いくつかの例において、送達溶液は、2種類以上の糖類の混合物と2種類以上の無機塩の混合物とを含むことができる。

水性緩衝液の浸透圧の50％も糖類の混合物から生じうる。例えば好ましい範囲としては40％未満が挙げられ、より好ましくは、浸透圧の33％未満が糖類から生じる（例えば水溶液の浸透圧は、糖類またはその糖類の混合物によって与えられる）。

別の態様においては、送達溶液（アルコールなし、ただし少なくとも1種類の糖類および無機塩を含む）は、300mOsm/kg未満、300mOsm/kgもしくは約300mOsm/kg、400mOsm/kgまで、または500mOsm/kgまでの浸透圧を有することができる。別の例において、送達溶液（アルコールなし、ただし少なくとも1種類の糖類および1種類の有機塩を含む）は、約300mOsm/kg、または約350mOsm/kg、または約400mOsm/kg、または約450mOsm/kg、または約500mOsm/kgの浸透圧を有することができる。別の例において、送達溶液（アルコールなし、ただし少なくとも1種類の糖類および1種類の有機塩を含む）は、約320mOsm/kg、約330mOsm/kg、約340mOsm/kg、約350mOsm/kg、約360mOsm/kg、約370mOsm/kg、約380mOsm/kg、約390mOsm/kg、約400mOsm/kg、約410mOsm/kg、約420mOsm/kg、約430mOsm/kg、約440mOsm/kg、約450mOsm/kg、約460mOsm/kg、約470mOsm/kg、約480mOsm/kg、約490mOsm/kg、または約500mOsm/kgの浸透圧を有することができる。

他の態様
上記の説明および特許請求の範囲では、「のうちの少なくとも1つ」または「のうちの1つまたは複数」などの語句を、要素または特徴の連結的リスト（conjunctive list）と共に使用する場合がある。2つまたはそれ以上の要素または特徴のリストでは、「および/または」という用語が使用される場合もある。これらの語句は、それが使用される文脈と暗にまたは明示的に矛盾する場合を除き、列挙された要素または特徴のいずれかを個別に意味するか、具陳された要素または特徴のいずれかを具陳された他の要素または特徴のいずれかとの組合せとして意味するものとする。例えば「AおよびBのうちの少なくとも1つ」、「AおよびBのうちの1つまたは複数」ならびに「Aおよび/またはB」は、それぞれに「Aのみ、Bのみ、またはAとBを一緒に」を意味する。3つまたはそれ以上の項目を含むリストについても同様に解釈されるものとする。例えば「A、BおよびCのうちの少なくとも1つ」、「A、BおよびCのうちの1つまたは複数」ならびに「A、Bおよび/またはC」は、それぞれに「Aのみ、Bのみ、Cのみ、AとBを一緒に、AとCを一緒に、BとCを一緒に、またはAとBとCを一緒に」を意味する。加えて、上記および特許請求の範囲における「に基づく」という用語の使用は、具陳されていない特徴または要素も許容されるように、「に少なくとも部分的には基づく」を意味するものとする。

本明細書記載の主題は、所望の構成に応じて、システム、装置、方法、および/または物品に具体化することができる。上記の説明で述べた実施形態は、本明細書記載の主題と合致するすべての実施形態を表すわけではない。むしろそれらは記載した主題に関連する局面と合致する例の一部であるに過ぎない。上記でいくつかのバリエーションを詳述したが、他の変更態様または追加態様も可能である。具体的には、本明細書で述べたものの他にも、さらなる特徴および/または変形物が提供されうる。例えば、上述の実施形態は、開示する特徴のさまざまな組合せおよび副組合せならびに/または上記で開示したいくつかのさらなる特徴の組合せおよび副組合せに向けられうる。加えて、添付の図面に図示されおよび/または本明細書に記載された論理の流れは、望ましい結果を達成するために、示された特定の順序または逐次的順序を必ずしも必要としない。他の実施形態は以下の請求項の範囲内に含まれうる。

Claims

細胞操作プラットフォームのポッドを、細胞と第1の培地との混合物で満たす工程、および
フィルターを通して前記第1の培地を前記ポッドから排出し、前記フィルター上に堆積した前記細胞を残す工程
を含む、方法であって、
前記細胞操作プラットフォームが、
アトマイザー、および
前記ポッドを受容するように構成されたポッドホルダー
を備え、かつ
前記ポッドが、細胞と培地とを保持するためのウェルを形成するフィルタープレートおよび上側部分を備える、
前記方法。
前記フィルター上に堆積した前記細胞に、ペイロードを含有する送達溶液をスプレーする工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
チャンバーに停止溶液を適用する工程をさらに含む、請求項2記載の方法。
前記フィルターから前記細胞を再懸濁させるために、前記ポッドを第2の培地で満たす工程をさらに含む、請求項3記載の方法。
排出された前記第1の培地が前記第2の培地として再使用される、請求項4記載の方法。
前記ポッドを撹拌する工程をさらに含む、請求項4記載の方法。
再懸濁された前記細胞を前記ポッドから取り出す工程をさらに含む、請求項4記載の方法。
前記ポッドを満たす工程がポンプと制御装置とで自動的に行われる、請求項4記載の方法。
前記ポッド内で前記細胞を培養する工程をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
前記第1の培地を前記ポッドから排出することが、前記ポッドの底部に真空を提供することによって行われる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
前記第1の培地を前記ポッドから排出することが重力によって行われる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
前記停止溶液を適用する工程が前記細胞を洗浄するために行われる、請求項3記載の方法。
前記チャンバーを前記第2の培地で満たす工程が、細胞洗浄プロセス、細胞濃度変更プロセス、および細胞培地変更プロセスのうちの少なくとも1つとして行われる、請求項4記載の方法。
前記ポッドが、解放可能に前記フィルタープレートに連結された下側部分を備える、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
前記ポッドが、少なくとも1つのプロセスパラメータを特徴決定するデータを格納するメモリを備える、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
前記細胞操作プラットフォームの制御装置によって、前記少なくとも1つのプロセスパラメータを前記メモリから読み取る工程、および
前記少なくとも1つの処理パラメータを用いて少なくとも1つの処理工程を行う工程
をさらに含む、請求項15記載の方法。
前記ポッドが、実験識別子を特徴決定するデータを格納するメモリを備える、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
前記ポッドがチャンバーを含む、請求項1～17のいずれか一項記載の方法。
ポッドを受容するように構成されたポッドホルダーを含む筐体であって、前記ポッドが、ウェルを形成するフィルタープレートおよび上側部分を含む、前記筐体；
微粒化された送達溶液を前記ウェルに送達するように構成された送達溶液適用装置；
ディスプレイ；および
少なくとも1つのプロセスパラメータを表示するように構成された回路構成を備える制御装置
を備える、システム。
前記ポッドホルダーが、前記ポッドを傾斜または振動させるように構成されている、請求項19記載のシステム。
前記送達溶液適用装置がスプレーヘッドを備える、請求項19～20のいずれか一項記載のシステム。
前記ポッドが、1×10⁷個未満のT細胞を保持するサイズである、請求項19～21のいずれか一項記載のシステム。
微粒化された送達溶液を、前記ポッド内のフィルター上に形成された細胞単層に自動的に適用する
ように構成されている、請求項19～22のいずれか一項記載のシステム。
前記送達溶液適用装置がネブライザーを備える、請求項19～23のいずれか一項記載のシステム。
前記送達溶液適用装置が、前記ネブライザーを作動させるためのガス流量を調節するために、質量流量制御装置または体積流量制御装置をさらに備える、請求項24記載のシステム。
前記送達溶液適用装置が、1回の作動で10～300マイクロリットルの前記送達溶液を送達するように構成されている、請求項19～25のいずれか一項記載のシステム。
ペイロードを含む水溶液を含む前記送達溶液を収容するリザーバをさらに備える、請求項19～26のいずれか一項記載のシステム。
前記水溶液が、濃度0.2パーセント（v/v）超のアルコールを含み、かつ前記アルコールがエタノールを含む、請求項27記載のシステム。
前記水溶液が、5％超のエタノールを含む、請求項28記載のシステム。
前記水溶液が、5～30％のエタノールを含む、請求項28記載のシステム。
前記水溶液がアルコールを含まない、請求項27記載のシステム。
前記水溶液が、12.5～500mMのKClを含む、請求項27記載のシステム。
前記水溶液が、106mMのKClを含む、請求項27記載のシステム。
前記ウェルが、非接着細胞の集団を含有するように構成されている、請求項19～33のいずれか一項記載のシステム。
前記非接着細胞が末梢血単核球を含む、請求項34記載のシステム。
前記非接着細胞が免疫細胞を含む、請求項34記載のシステム。
前記非接着細胞がTリンパ球を含む、請求項34記載のシステム。
前記ペイロードがメッセンジャーリボ核酸（mRNA）を含む、請求項19～27のいずれか一項記載のシステム。
前記mRNAが遺伝子編集組成物をコードする、請求項38記載のシステム。
前記遺伝子編集組成物がPD-1の発現を低減する、請求項39記載のシステム。
前記mRNAがキメラ抗原受容体をコードする、請求項38記載のシステム。
カーゴ化合物またはカーゴ組成物を哺乳動物細胞に送達するために使用するために構成されている、請求項19～41のいずれか一項記載のシステム。
前記非接着細胞の集団が単層を構成する、請求項19～42のいずれか一項記載のシステム。
前記ポッドが、前記少なくとも1つのプロセスパラメータを特徴決定するデータを格納するメモリを備える、請求項19～43のいずれか一項記載のシステム。
前記制御装置が、
前記少なくとも1つのプロセスパラメータを特徴決定する前記データを、前記メモリから前記回路構成によって読み取り、かつ
前記少なくとも1つの処理パラメータを用いる少なくとも1つの処理工程を、前記回路構成によって行う
ようにさらに構成されている、請求項44記載のシステム。
前記ポッドが、実験識別子を特徴決定するデータを格納するメモリを備える、請求項19～45のいずれか一項記載のシステム。
ベースと、
システムの作動を制御するように構成された回路構成を備える、少なくとも1つの制御装置と、
ディスプレイと
を含む、筐体；
少なくとも1つのバルブと、少なくとも1つのポンプと、シリンジと、少なくとも1つの流体検出センサーとを備える、1つまたは複数の流体回路；
前記筐体の前面から延びる関節式フレーム（articulating frame）内に受容されたチャンバーアセンブリであって、作動中は雰囲気条件から封鎖され、かつフィルターを備えている、前記チャンバーアセンブリ；
少なくとも1つの培地容器；
前記1つまたは複数の流体回路を介して前記チャンバーアセンブリに流体連結された少なくとも1つの細胞培養容器；および
培地または細胞を受容するように構成された少なくとも1つの収集トレイ
を備える、システム。
前記関節式フレームが、前記チャンバーアセンブリを撹拌するように構成されている、請求項47記載のシステム。
前記チャンバーアセンブリが、少なくとも1つのプロセスパラメータを特徴決定するデータを格納するメモリを備える、請求項47～48のいずれか一項記載のシステム。
前記少なくとも1つの制御装置が、
前記少なくとも1つのプロセスパラメータを特徴決定する前記データを、前記メモリから前記回路構成によって読み取り、かつ
前記少なくとも1つの処理パラメータを用いる少なくとも1つの処理工程を、前記回路構成によって行う
ように構成されている、請求項49記載のシステム。
前記チャンバーアセンブリが、実験識別子を特徴決定するデータを格納するメモリを備える、請求項47～50のいずれか一項記載のシステム。
前記システムの作動が、細胞洗浄プロセス、細胞濃度変更プロセス、および細胞培地変更プロセスのうちの少なくとも1つを含む、請求項47～51のいずれか一項記載のシステム。
前記ディスプレイが、前記システムの作動に関連する入力を受容するように構成されたヒューマンマシンインターフェースを備える、請求項47～52のいずれか一項記載のシステム。
前記関節式フレームが、前記システムが位置する水平面に対して、0～10.0、10.1～15.0、15.1～20.0、20.1～25.0、25.1～30.0、30.1～35.0、35.1～40.0、または40.1～45.0度の角度まで関節運動する（articulate）ように構成されている、請求項47～53のいずれか一項記載のシステム。
前記関節式フレームが、所定の周波数またはユーザー定義の周波数で2つの角度の間を往復するように構成されている、請求項47～54のいずれか一項記載のシステム。
前記所定の周波数またはユーザー定義の周波数が、0～0.5kHz、0.51～1.0kHz、1.1～1.5kHz、1.51～2.0kHz、2.01～2.5kHz、または2.51kHz超である、請求項55記載のシステム。
前記少なくとも1つの収集トレイが冷却要素または加熱要素を備える、請求項47～56のいずれか一項記載のシステム。
前記ベースが、前記少なくとも1つの収集トレイの下に位置するはかりを備える、請求項47～57のいずれか一項記載のシステム。
前記少なくとも1つの流体検出センサーが、前記1つまたは複数の流体回路のうちの少なくとも1つの流体回路に対して配置されている、請求項47～58のいずれか一項記載のシステム。
第1の流体検出センサーが、少なくとも1つの前記流体回路の第1の場所において構成されており、かつ第2の流体検出センサーが、少なくとも1つの前記流体回路の第2の場所において構成されており、前記第1の流体検出センサーおよび前記第2の流体検出センサーが、少なくとも1つの前記流体回路の前記第1の場所と第2の場所の間の前記培地の体積を算出するように作動可能である、請求項59記載のシステム。
前記少なくとも1つのポンプが蠕動ポンプである、請求項47～60のいずれか一項記載のシステム。
前記システムが、前記シリンジを保持するためのシリンジホルダーを備え、前記シリンジホルダーが、前記シリンジ内の流体のレベルまたは前記シリンジのプランジャーの位置を決定するように構成された光学センサーを備える、請求項47～61のいずれか一項記載のシステム。
前記光学センサーが、複数の光学センサーのアレイを備える、請求項62記載のシステム。
前記システムに機器を通信可能に連結するように構成された少なくとも1つの電気的コネクタを備える、請求項47～63のいずれか一項記載のシステム。
前記機器が、温度計、液体比重計、気圧計、フォトプレチスモグラフセンサー、ロードセル、生化学センサー、光学センサー、変換器、または微小電子機械のうちの少なくとも1つを備える、請求項64記載のシステム。
第1のガス供給源を第1のガス回路を介して前記チャンバーアセンブリに連結する少なくとも1つの第1のガスコネクタを備える、請求項47～65のいずれか一項記載のシステム。
前記システムが、第2のガス供給源を第2のガス回路を介して前記チャンバーアセンブリに連結する第2のガスコネクタを備え、前記第2のコネクタが、前記少なくとも1つの第1のガスコネクタとは独立して作動するように構成されている、請求項66記載のシステム。
前記培地の供給源を前記チャンバーアセンブリの上に位置させるように構成された少なくとも1つのハンガーを備える、請求項47～67のいずれか一項記載のシステム。
前記ハンガーが、前記培地の供給源の重量を測定するために前記ハンガー内に構成されたはかりを備える、請求項68記載のシステム。
バーコードリーダーを備える、請求項47～69のいずれか一項記載のシステム。
チューブ溶接機を備える、請求項47～70のいずれか一項記載のシステム。
前記チャンバーアセンブリを少なくとも部分的に取り囲む断熱ジャケットまたは伝導性ジャケットを備える、請求項47～71のいずれか一項記載のシステム。
前記チャンバーアセンブリの内面が、前記内面への細胞の移動性または接着を支援するように構成されたコーティングまたはパターンを備える、請求項47～72のいずれか一項記載のシステム。
前記チャンバーアセンブリが、前記フィルターを備える下側部分から取り外し可能な上側部分を備える、請求項47～73のいずれか一項記載のシステム。
前記フィルターが、前記フィルターへの細胞の移動性または接着を支援するように構成されたコーティングまたはパターンを備える、請求項47～74のいずれか一項記載のシステム。
前記上側部分が、ガスを前記第1のガス回路から受容するガスポートを備える、請求項66～74のいずれか一項記載のシステム。
前記上側部分が、散気装置開口部と、前記散気装置開口部内に位置する散気装置とを備え、前記散気装置が、前記第2のガス回路に連結されている、請求項67～76のいずれか一項記載のシステム。
前記上側部分が、スプレーヘッド開口部と、前記スプレーヘッド開口部内に位置するスプレーヘッドとを備える、請求項74～77のいずれか一項記載のシステム。
前記スプレーヘッドが、前記第1のガス回路に連結されたガス注入ポート、および、ペイロードとアルコールとを含む等張水溶液の供給源に連結された流体注入ポートを備える、請求項66～78のいずれか一項記載のシステム。
前記少なくとも1つの制御装置が、前記チャンバーアセンブリ内の圧力、温度、およびガス組成のうちの1つまたは複数を制御するように構成されている、請求項47～79のいずれか一項記載のシステム。
ガス組成物が、二酸化炭素、窒素、または酸素のうちの少なくとも1つを含む、請求項80記載のシステム。
前記チャンバーアセンブリが加熱要素を備える、請求項47～81のいずれか一項記載のシステム。
細胞をインキュベートするためのバイオリアクターとして使用するために構成されている、請求項47～82のいずれか一項記載のシステム。
細胞凍結保存プロセスにおける使用のために構成されている、請求項47～83のいずれか一項記載のシステム。
細胞透過処理プロセスにおける使用のために構成されている、請求項47～84のいずれか一項記載のシステム。
細胞形質導入プロセスにおける使用のために構成されている、請求項47～85のいずれか一項記載のシステム。
細胞トランスフェクションプロセスにおける使用のために構成されている、請求項47～86のいずれか一項記載のシステム。
アルコールの非存在下で細胞にカーゴを送達するために使用するためのデバイスであって、
ベースと、
前記デバイスの作動を制御するように構成された回路構成を備える、少なくとも1つの制御装置と、
ディスプレイと
を含む、筐体；
少なくとも1つのバルブと、少なくとも1つのポンプと、シリンジと、少なくとも1つの流体検出センサーとを備える、1つまたは複数の流体回路；
前記筐体の前面から延びる関節式フレーム内に受容されたチャンバーアセンブリであって、作動中は雰囲気条件から封鎖され、かつフィルターを備えている、前記チャンバーアセンブリ；
少なくとも1つの培地容器；
前記1つまたは複数の流体回路を介して前記チャンバーアセンブリに流体連結された少なくとも1つの細胞培養容器；および
培地または細胞を受容するように構成された少なくとも1つの収集トレイ
を備える、前記デバイス。