CN1363689A - 化学电极型基因探针的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种化学电极型基因探针的制备方法,选择金丝或表面镀金的金属丝为电极探针的原始材料,将探测DNA固联到探针的探头上,探测DNA具有发夹结构,再修饰氧化还原指示剂,得到具有化学和生物活性的基因探针。这种基因探针避免了对目标基因的化学修饰,简化了检测、识别的过程;具有理想的高灵敏度;可实时检测;避免了荧光检测方法中容易出现的“假阳性”问题;有良好的复用性;制备工艺简单,易于使用和制作各种生物探针。可广泛用于分子生物学、细胞生物学、生物医学、生物探针、人类基因组研究,及临床诊断等方面。
Description
技术领域：本项发明属生命科学领域，涉及一种基因(DNA)探针，尤其涉及一种电极型基因探针。
背景技术：基因探针是一种尖端排布着探测基因(Probe DNA)的金属探针，一种具有对基因进行检测、识别、鉴定、诊断的生物材料。它应用于分子生物学、医学及人类基因组研究。
在目前的技术中，基因检测的方法都普遍存在一个共同的缺点，即需要对被检测的基因进行化学修饰，如荧光修饰，氧化还原修饰等。这种缺陷一方面使得检测的过程相对复杂化，另一方面严重限制了基因检测在某些方面的应用，比如基因的实时检测、活体基因的检测等。
为了实现对寡核苷酸的精确到一个碱基的检测，科学家提出了分子灯塔的方法(Sanjay Tyagi and Fred Russell Kramer，(1996)Nature Biotechnology，14：303-308)。分子灯塔是两端有一小段互补碱基序列并在末梢分别用荧光剂和淬灭剂修饰的单链DNA，在两头的互补碱基序列中间所夹的一段碱基序列作为探测基因。由于分子灯塔两端的互补碱基序列容易形成双链结构，它可以形成稳定的发夹结构。在发夹结构情况下，荧光剂与淬灭剂相距很近，荧光剂的荧光(必须经过一定波长的光的激发)可以被淬灭剂吸收，从而观测不到荧光信号。当中间的那段探测基因与目标DNA完全配对杂交后，分子灯塔的环状结构被破坏，荧光剂和淬灭剂被分离开来，从而使得淬灭剂无法淬灭荧光剂的荧光，以达到检测DNA杂交的目的。正是由于发夹结构使得利用分子灯塔设计的探针DNA具有鉴别一个错配碱基的目标DNA的能力。目前已有人将这种分子灯塔固联到固体表面(Xiaohong Fang，Xiaojing Liu，Sheldon Schuster，and Weihong Tan，(1999)J.Am.Chem.Soc，121：2921-2922)，但其检测手段仍然是荧光方法，并且没有给出其检测的灵敏度的情况，也没有表明其方法具有可复用性。
发明内容：
本发明的目的是提供一种电极型基因探针的制备方法，通过这种方法制备同时具有化学活性和生物活性的基因探针，不需要对被检测的基因进行化学修饰，从而实现对基因的实时检测、活体基因的检测和对寡核苷酸的高精度检测，并提高检测的可靠性。
本发明的化学电极型基因探针的制备方法，其步骤包括：
1)选择金丝或表面镀金的金属丝作电极探针，该电极探针包括基因检测探头部
分和接入检测电路的部分；
2)将依基因检测目的设计并合成的探测未知基因的DAN，即探测DNA在生
化缓冲容剂中配成DNA溶液：
3)将电极探针的探头浸入DNA溶液，1～10℃下静置24小时以上，将探测DNA
固联在电极探头上；
4)取出探针，清洗后浸入包含在0-～-0.6V偏压下具有氧化还原活性的分子的
氧化还原指示剂溶液中，室温下静置12小时以上，取出后即得本发明的电
极型基因探针。
本发明可先将金丝进行预处理：用铝粉打磨金表面，直到其表面光滑为止，然后先用双蒸水冲洗3-5次，并用酒精浸泡，密封后放入超声波振荡器内，清洗10～20分钟；用酒精溶液清洗3-5次后，把金丝泡入份比为7∶3的浓硫酸与双氧水的混合溶液，密闭振荡直到白沫出现5分钟后，取出金丝，用双蒸水冲洗3-5次，氮气密封保存。如选用镀金的金属丝，宜在金属丝镀金后氮气密封保存。
本发明所述生化缓冲剂宜用PH＝8的1mM的钠离子Tris-HCl缓冲液，或PH＝8的20mM的镁离子Tris-HCl缓冲液。
本发明探测DNA在探头表面的覆盖率为0.1×10-10～0.5×10-10mol/cm2。探测DNA可以具有发夹结构。
本发明所述氧化还原指示剂宜用硫肼，或亚甲基兰。
本发明在将探针的探头固联探测DNA以后，再修饰氧化还原剂前，可进行连接PDC(1，4-Phenylene Diisothiocyanate，1，4-二异硫氰基苯)步骤：探针清洗后，把探针探头浸入PDC溶液，充入氮气后密封，在室温下静置2小时以上再把探针从PDC溶液中取出并用纯的DMF(N，N-Dimethylformamide，N，N-二甲基甲酰胺)溶液清洗。
制备后的基因探针探头应当保存在氧化还原指示剂溶液中。
本发明利用发夹结构的探测DNA(分子灯塔)来修饰化学电极，从而实现将分子识别转化为微电流信号，由此带来了显著的效果：
首先，这种基因探针不需要对目标基因做任何修饰，从而大大简化了检测、识别的过程。
其次，这种基因探针具有理想的高灵敏度，能够鉴别具有一个错配碱基的基因，这是大多数基因检测方法所不及的。
第三是，只要探针尖部做得足够细，便可用于细胞实时基因检测。
第四是化学电极型基因探针的检测方法将生物信息转化为电流信号，避免了荧光检测方法中容易出现的“假阳性”问题，有利于利用现有的电子技术、计算机技术实现检测分析的自动化。
第五是化学电极型基因探针具有良好的复用性，一般可以重复使用5至10次。
第六是化学电极型基因探针制备工艺简单，易于使用，并容易用来制作各种生物探针。
本发明提供了对基因进行检测、识别、鉴定、诊断的优良生物材料，可广泛引用于分子生物学、细胞生物学、生物医学、生物探针、人类基因组研究，以至临床诊断等方面。
附图说明：
图1联结在金表面的发夹结构的探测基因的示意图
1金表面 2硫元素 3碱基A 4碱基G 5碱基C
6碱基T 9碳链
图2化学电极型基因探针的制备过程示意图
12发夹结构的探测DNA的溶液 13电极单元 14离心管
15接PDC溶液 16连接TH溶液 17探测DNA的生长区
18固化发夹结构的探测DNA的电极单元
图3化学电极型基因探针的检测系统图
19电化学工作站或线性扫描伏安仪 20电解池 21对电极
22电解液 23化学电极型基因探针 24参比电极
图4线性扫描伏安曲线图
实施例：
(1)选择金丝或表面镀金的金属丝为电极的原始材料。若选择金丝为探针的原始材料，须进行预处理，以使金表面尽可能光滑。预处理可采用如下方法：用铝粉打磨金表面，直到其表面光滑为止，然后先用双蒸水冲洗3-5次，并用酒精浸泡，密封后放入超声波振荡器内，清洗10～20分钟；用酒精溶液清洗3-5次后，把金丝泡入浓硫酸与双氧水的混合溶液(7∶3)，密闭振荡直到白沫出现5分钟后，便可取出金丝，用双蒸水冲洗3-5次，氮气密封保存。若电极原始材料为表面镀金的金属丝，不必作上述预处理，但须在金属丝镀金后氮气密封保存。
(2)固联探测DNA：将依基因检测目的设计并合成的探测未知基因的DNA配成溶液，溶剂为可以保持DNA活性的常用生化缓冲剂，推荐使用含1mM的钠离子或镁离子的20mM的Tris-HCl缓冲液(PH＝8.0)；该DNA的5′端修饰巯基。将处理好的电极的基因检测探头部分浸入DNA溶液，4摄氏度环境下静置24小时以上，实现探测DNA的固联，探测DNA在探头表面的覆盖率控制在0.1×10-10～0.5×10-10mol/cm2的范围内；
(3)修饰氧化还原指示剂：取出探针，清洗后，把探针探头浸入包含在0～-0.6V偏压下表现出氧化还原活性的分子的氧化还原指示剂溶液中，溶剂与步骤(2)中溶解DNA的溶剂相同，室温下静置12小时以上：即制得电极型基因探针。
所述制备方法中，如果要求基因检测达到鉴别一个突变碱基的精确度，则探测DNA应设计为发夹结构，如图1。
所述制备方法中，氧化还原指示剂推荐使用硫肼(Thionine)，或亚甲基兰(Methylene Blue)。
所述制备方法中，探针的探头固联探测DNA以后，还可以进行连接PDC步骤，然后再修饰氧化还原剂，以增强探头的稳定性，连接PDC的方法如下：探针清洗后，把探针探头浸入PDC(0.2％1，4-phenylenediisothiocyanate，溶剂为DMF溶液，还含有10％的吡啶)溶液，充入氮气后密封，在室温下静置2小时以上，优选的静置时间为5小时，再把探针从PDC溶液中取出并用纯的DMF溶液清洗。
制备后的探针探头应当保存在氧化还原指示剂溶液中。
本发明的使用中，所有制备及检测过程宜用同一种氧化还原指示剂和缓冲剂。
制备后的探针在使用前可以经过预检测，以确定制备是否成功，并淘汰掉没有足够化学活性的探针。预检测使用三电极系统(图3)，在40摄氏度、20摄氏度和4摄氏度下分别对探针进行线性伏安扫描，从测得的线性伏安曲线中提取ΔIpeak，如图4所示。计算S1＝(ΔIpeak(20℃)-ΔIpeak(40℃))/ΔIpeak(40℃)和S2＝(ΔIpeak(4℃)-ΔIpeak(20℃))/ΔIpeak(20℃)，计算结果S1和S2均大于10％的探针被认定为制备成功，否则该探针被淘汰。
本发明的基因探针的检测分析方法如下：
在检测时，杂交液采用20mM的Tris缓冲液，PH＝8.0，含50～100nM的TH，在37摄氏度下过夜杂交。杂交后，仍在三电极系统进行检测，对电极为Pt，参比电极为Ag-AgCl(图3)。电解液为20mM的Tris缓冲液，PH＝8.0，含1mM的镁离子。从杂交液中取出电极探针，将电极探针作为工作电极接入三电极系统，对探针进行线性伏安扫描。然后再将探针放回杂交液，温度调至20摄氏度，静置20～30分钟，再重复上述检测。扫描参数设置为：最低电压-0.3V，最高电压0，起始电压0，扫描速度0.1V/s，取样间隔0.001V。从测得的线性伏安曲线(图4)中提取ΔIpeak，计算S＝(ΔIpeak(20℃)-ΔIpeak(37℃))/ΔIpeak(37℃)。根据我们的科学研究结果表明，如果探测DNA与目标DNA完全配对，则S在区间(-0.05，0.05)内，否则，即使只有一个突变碱基，S也大于0.1，由此法则便可判断基因检测的结果。该检测方法不会破坏电极的检测活性，每次使用后，经过甲醛或尿素溶液洗脱后，可以反复使用多次(5～10次)。
现有一段基因序列需要检测，其序列为5′-ATGGGCGGCATGAAC-3′，其中一个碱基可能已经发生突变，变为5′-ATGGGCGTCATGAAC-3′(带下划线者为突变位点)。为了检测这种基因的突变状况，可设计如下两种发夹结构的探测基因：
(a)5′-AAAAGCTCGCGTTCATGCCGCCCATAGCGAGC-3′
(b)5′-AAAAGCTCGCGTTCATGACGCCCATAGCGAGC-3′
分别制备两种化学电极型探针，其上分别固联着上述两种探测基因。检测后，求出对应于两种探针的S值。若相应于(a)的S值在(-0.05，0.05)区间，相应于(b)的S大于0.1，则可确定被检测基因中没有突变。若相应于(a)的S值在(-0.05，0.05)区间，相应于(b)的S值也在(-0.05，0.05)区间，则可确定被检测基因中有突变，但不完全。若相应于(a)的S值大于0.1，相应于(b)的S值也在(-0.05，0.05)区间，则可确定被检测基因已完全突变。
Claims (8)
1.一种化学电极型基因探针的制备方法，其步骤包括：
1)选择金丝或表面镀金的金属丝作电极探针，该电极探针包括基因检测探头部分和接入检测电路的电极单元部分；
2)将探测DNA在生化缓冲容剂中配成DNA溶液；
3)将电极探针的探头浸入DNA溶液，1-10℃下静置24小时以上，将探测DNA固联在电极探头上；
4)取出探针，清洗后浸入包含在0-～-0.6V偏压下具有氧化还原活性的分子的氧化还原指示剂溶液中，室温下静置12小时以上，取出后即得本发明的电极型基因探针。
2.如权利要求1所述的化学电极型基因探针的制备方法，其特征在于将金丝进行预处理：用铝粉打磨金表面，直到其表面光滑为止，然后先用双蒸水冲洗3-5次，并用酒精浸泡，密封后放入超声波振荡器内，清洗10～20分钟；用酒精溶液清洗3-5次后，把金丝泡入份比为7∶3的浓硫酸与双氧水的混合溶液，密闭振荡直到白沫出现5分钟后，取出金丝，用双蒸水冲洗3-5次，氮气密封保存。
3.如权利要求1所述的一种化学电极型基因探针的制备方法，其特征在于所述生化缓冲剂选自PH＝8的1mM的钠离子Tris-HCl缓冲液或PH＝8的20mM的镁离子Tris-HCl缓冲液。
4.如权利要求1所述的化学电极型基因探针的制备方法，其特征在于探测DNA在探头表面的覆盖率为0.1×10-10～0.5×10-10mol/cm2。
5.如权利要求1或4所述的化学电极型基因探针的制备方法，其特征在于探测DNA具有发夹结构。
6.如权利要求1所述的化学电极型基因探针的制备方法，其特征在于所述氧化还原指示剂选自硫肼或亚甲基兰。
7.如权利要求1所述的化学电极型基因探针的制备方法，其特征在于探针的探头固联探测DNA以后，再修饰氧化还原剂前，进行连接PDC步骤：探针清洗后，把探针探头浸入PDC溶液，充入氮气后密封，在室温下静置2小时以上再把探针从PDC溶液中取出并用纯的DMF溶液清洗。
8.如权利要求1所述的化学电极型基因探针的制备方法，其特征在于还包括对制得的探针进行预检测：使用三电极系统，在40摄氏度、20摄氏度和4摄氏度下分别对探针进行线性伏安扫描，从测得的线性伏安曲线中提取ΔIpeak，计算S1和S2的值，当S1和S2均大于10％的探针被认定为制备成功，否则该探针被淘汰。
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