CN1170944C - 电极阵列型基因芯片及其制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种电极阵列型基因芯片及其制作方法，属于生命科学领域，涉及一种具有对基因进行检测、识别、鉴定、诊断功能的器件。该基因芯片选用金丝或表面镀金的金属丝作为电极，电极排成阵列并固定在芯片基底上；电极的一端用作探针的探头，部分或全部探头表面生长并固化有探测基因；电极的另一端用作引脚。其制备方法为：将电极嵌入方形芯片基底形成阵列，电极的一端作探头，另一端作引脚；将依基因检测目的设计合成的探测基因配成溶液；在探头上固联探测基因、并修饰氧化还原剂。该基因芯片的电极利用探测基因修饰，使得检测过程简化，应用广泛，克服探针断裂或探针间串扰问题，提高检测可靠性。

Description

电极阵列型基因芯片及其制作方法

技术领域：

本发明属于生命科学领域，涉及一种具有对基因进行检测、识别、鉴定、诊断功能的器件。它应用于分子生物学、生物医学和人类基因组研究，以至临床诊断等方面。

背景技术：

基因(DNA)芯片是一种在固体基底上有序排布的探测基因(Probe DNA)阵列(Gene Array)。现有技术中，基因芯片有三种制备方法。其中之一是在硅片上利用掩膜光刻逐层生长基因探针(寡核苷酸)的方法(参考文献：Stephen P.A.Foder，J.Leightn Read，et.al.“Ligbt-Derected Spatially Addressed Parallel ChemicalSysthesis.”Science Vol.251：767-773 1991)。由于基因有四种碱基，每生长一层碱基就需要四个掩膜，二十个碱基长度的基因阵列就需要生长二十层碱基，用八十种掩膜进行八十次光刻。多次光刻后，光刻机所用的紫外光会导致基因探针断裂，降低可靠性，并且工艺复杂，少量生产时成本较高。现有制备方法之二为DNA液体打印技术(参考文献：D.B.Wallace“High Density Ink Jet Printhead，”U.S.Patent 5,400,064，March 21，1995.)，将各种基因探针溶液依次滴到玻璃基片或尼龙膜上。该方法的打印设备随基因探针数目的增加而趋复杂、昂贵，易形成相邻基因探针间的串扰，可靠性低。现有技术中制备方法之三(参考文献：Brian G.Healey，Robert S.Matson，and David R.Walt“Fiberoptic DNA SensorArray Capable of Detecting.Point Mutations”Analytical Biochemistry Vol.251 270-279(1997))，是以一根传像光纤为基底，用聚焦的光斑照射传像光纤的一端，在另一端产生一个光斑，将该端浸入基因探针溶液，利用光诱导技术使基因探针只在光斑处生长；从溶液中取出光纤，改变光照点的位置，重复上述操作，形成基因阵列。该方法由于光纤要浸入数百种基因探针溶液，同样存在探针间的串扰、可靠性不高且操作复杂、成本高等不足。

目前的这些基因芯片，用于基因检测时普遍存在一个共同的缺点，即需要对被检测的基因进行化学修饰。这种缺陷一方面使得检测的过程相对复杂化，另一方面严重限制了基因检测在某些方面的应用，比如基因的实时检测、活体基因的检测等。其次，为了实现对寡核苷酸的精确到一个碱基的检测，科学家提出了分子灯塔的方法(参考文献：Sanjay Tyagi and Fred Russell Kramer，(1996)Nature Biotechnology，14：303-308)。分子灯塔是两端有一小段互补碱基序列并在末梢分别用荧光剂和淬灭剂修饰的单链DNA，在两头的互补碱基序列中间所夹的一段碱基序列作为探测基因。由于分子灯塔两端的互补碱基序列容易形成双链结构，它可以形成稳定的发夹结构。在发夹结构情况下，荧光剂与淬灭剂相距很近，荧光剂的荧光(必须经过一定波长的光的激发)可以被淬灭剂吸收，从而观测不到荧光信号。当中间的那段探测基因与目标DNA完全配对杂交后，分子灯塔的环状结构被破坏，荧光剂和淬灭剂被分离开来，从而使得淬灭剂无法淬灭荧光剂的荧光，以达到检测DNA杂交的目的。正是由于发夹结构使得利用分子灯塔设计的探针DNA具有鉴别一个错配碱基的目标DNA的能力。目前已有人将这种分子灯塔固联到固体表面(参考文献：Xiaohong Fang，XiaojingLiu，Sheldon Schuster，and Weihong Tan，(1999)J.Am.Chem.Soc，121：2921-2922)，但其检测手段仍然是荧光方法，并且没有给出其检测的灵敏度的情况，也没有表明其方法具有可复用性。

发明内容：

本发明的目的是提供一种电极阵列型基因芯片，该基因芯片的化学电极利用探测DNA进行修饰，使得检测过程简化，应用广泛，克服探针断裂或探针间串扰问题；如果该探测DNA为发夹结构的探测DNA(分子灯塔)，还可以提高检测可靠性，对寡核苷酸的检测达到鉴别一个错配碱基的高精度。

本发明的另一目的是提供一种制备上述电极阵列型基因芯片的方法。

本发明的技术方案如下：

本发明的电极阵列型基因芯片，选用金丝或表面镀金的金属丝作为电极，电极排成阵列并固定在芯片基底上；电极的一端整齐地暴露在芯片基底的一侧，用作探针的探头，部分或全部探头表面生长并固化有探测基因；电极的另一端整齐地暴露在芯片基底的另一侧，用作引脚；构成具有多个电极引脚和探头的可检测的基因芯片。

所述的芯片基底选自在常温(20摄氏度)下为固态的绝缘材料，如塑料、有机玻璃、硅片、树脂、合成材料等。

所述探头表面生长并固化的探测基因为发夹结构的探测基因。

本发明的电极阵列型基因芯片的制备方法如下：

(1)选择金丝或表面镀金的金属丝为电极的原始材料。若选择金丝为探针的原始材料，须进行预处理，以使金表面尽可能光滑。预处理可采用如下方法：用铝粉打磨金表面，直到其表面光滑为止，然后先用双蒸水冲洗3-5次，并用酒精浸泡，密封后放入超声波振荡器内，清洗10～20分钟；用酒精溶液清洗3-5次后，把金丝泡入浓硫酸与双氧水的混合溶液(7∶3)，密闭振荡直到白沫出现5分钟后，便可取出金丝，用双蒸水冲洗3-5次，氮气密封保存。若电极原始材料为表面镀金的金属丝，不必作上述预处理，但须在金属丝镀金后氮气密封保存。

(2)将电极嵌入方形芯片基底形成N×N的阵列，N为自然数，电极的一端整齐地暴露在芯片基底的一侧，用作探针的探头；电极的另一端整齐地暴露在芯片基底的另一侧，用作引脚，在检测时插入检测接口底座；根据检测目的，在N2个探头中选择M个探头预备分别固化M种探测基因，每个探头上只固化一种探测基因，M代表所需探测基因的种类，为小于或等于N2的自然数。如果M等于N，则可在每一行的探头上预备固化一种探测基因。

(3)将依基因检测目的设计并合成的M种探测未知基因的DNA配成溶液，溶剂为可以保持DNA活性的常用生化缓冲剂，推荐使用含1mM的钠离子或镁离子的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.0～8.0)；该DNA的5’端修饰巯基，分置于N×N的阵列微容器中，M种探测DNA溶液在阵列微容器的分布根据基因检测目的确定；

(4)固联探测DNA：对应于微容器，把芯片探头浸入探测DNA溶液，4摄氏度环境下静置12小时以上，实现探测DNA的固联，探测DNA在探头表面的覆盖率控制在0.1×10^-10～0.5×10^-10mol/cm²的范围内；

(5)修饰氧化还原指示剂：取出芯片，清洗后，把芯片探头浸入包含在0～-0.6V偏压下表现出氧化还原活性的分子的氧化还原指示剂溶液中，溶剂与步骤(3)中溶解DNA的溶剂相同，推荐使用含0.1mM的镁离子的Tris缓冲液(pH＝7.0～8.0)；室温下静置12小时以上；即制得电极阵列型基因芯片。

所述制备方法中，芯片基底选自在常温(20摄氏度)下为固态的绝缘材料，如塑料、有机玻璃、硅片、树脂、合成材料等。

所述制备方法中，如果要求基因检测达到鉴别一个突变碱基的精确度，则探测DNA应设计为发夹结构，该DNA的3′端可修饰氨基。如附图1所示。

所述制备方法中，芯片探头固联探测DNA时，在探测DNA溶液中静置的时间为24小时以上。

所述制备方法中，氧化还原指示剂推荐使用硫肼(Thionine)，或亚甲基兰(Methylene Blue)。

所述制备方法中，芯片的探头固联探测DNA以后，还可以进行连接PDC步骤，然后再修饰氧化还原指示剂，以增强探头的稳定性，连接PDC的方法如下：芯片清洗后，把芯片探头浸入PDC(0.2％1，4-phenylene diisothiocyanate，溶剂为DMF溶液，还含有10％的吡啶)溶液，充入氮气后密封，在室温下静置2小时以上，优选的静置时间为5小时，再把芯片从PDC溶液中取出并用纯的DMF溶液清洗。

制备后的芯片探头应当保存在氧化还原指示剂溶液中。

本发明的使用中，所有制备及检测过程均应使用同一种氧化还原指示剂和缓冲剂。

本发明的电极阵列型基因芯片检测分析方法如下：

在检测时，杂交液采用20mM的Tris缓冲液，pH＝8.0，含50～100nM的TH，在37摄氏度下适度杂交。杂交后，在三电极系统中进行检测。对电极为Pt电极，参比电极为Ag-AgCl电极。电解液为20mM的Tris缓冲液，pH＝8.0，含1mM的镁离子。扫描参数设置为：最低电压-0.3V，最高电压0V，起始电压0V，扫描速度0.1V/s，取样间隔0.001V。

从杂交液中取出基因芯片，将基因芯片插入检测接口底座，对探针阵列进行逐行线性伏安扫描，取得每个电极引脚的ΔI_peak(37℃)值，ΔI_peak如附图6所示。然后再将基因芯片从检测接口底座上拔出，放回杂交液，温度调至20摄氏度，静置20～30分钟，再重复上述检测，同样取得相应的ΔI_peak(20℃)值，由此可以得到每个电极引脚的S值，这些标志量被采集到计算机中可供基因芯片分析软件分析。其中，S＝(ΔI_peak(20℃)-ΔI_peak(37℃))/ΔI_peak(37℃)。根据我们的科学研究结果表明，如果探测DNA与目标DNA完全配对，则S在区间(-0.05，0.05)内，否则，S大于0.1。由此法则便可判断基因检测的结果。

上述检测方法不会破坏电极引脚的检测活性，每次使用后，经过甲醛或尿素溶液洗脱后，可以反复使用5～10次。

本发明的巧妙之处在于利用探测DNA尤其是发夹结构的探测DNA(分子灯塔)来修饰电极，然后将这些电极按要求组装成阵列，并固定在芯片基底，得到本发明的电极阵列型基因芯片。由此带来了如下优点和积极效果：首先，这种基因芯片不需要对目标基因做任何修饰，从而大大简化了检测、识别的过程；其次，这种基因芯片具有理想的高灵敏度，能够鉴别具有一个错配碱基的基因，这是大多数基因检测方法所不及的；第三，这种芯片使相邻的基因探针尖不会形成串扰，因而用此芯片对基因进行检测、识别、鉴定、诊断会得出准确可信的结果，即高可靠性；第四，这种基因芯片具有良好的复用性，一般可以重复使用5至10次。

本发明提供了对基因进行检测、识别、鉴定、诊断的优良生物材料，可广泛引用于分子生物学、生物医学、人类基因组研究，以至临床诊断等方面。

附图说明：

图1为联结在金表面的发夹结构的探测基因的示意图

1  金表面

2  硫元素

3  碱基A

4  碱基G

5  碱基C

6  碱基T

9  碳链

图2为电极阵列型基因芯片的结构示意图

(a)基因芯片的垂直投影图

12  芯片基底

13  电极单元

14  芯片方位标识

(b)基因芯片的侧面投影图

15  电极单元用于接入检测系统的引脚

16  电极单元用于检测基因的探头

图3为用于制备生物芯片的阵列型微容器结构示意图

(a)阵列型微容器的垂直投影图

17  容器基底

18  微容器阵列

(b)阵列型微容器的侧面投影图

19  溶液

图4为电极型阵列型基因芯片的制备过程示意图

(a)组装发夹结构的DNA

20  发夹结构的DNA的溶液

(b)连接PDC

21  PDC溶液

(c)修饰氧化还原剂TH

22  TH溶液

图5为电极阵列型基因芯片的检测系统示意图

(a)检测基因芯片的接口底座及电路

23  电路

24  基因芯片引脚的插槽

25  底座的基底

26  联至电化学工作站或线性扫描伏安仪

27  逐行扫描逻辑控制电路模块

(b)检测示意图

28  计算机

29  电化学工作站或线性扫描伏安仪

31  被检测的基因芯片

32  电解池

33  电解液

34  检测基因芯片的接口底座

35  对电极

36  基因芯片上的基因探头

37  参比电极

图6为线性扫描伏安曲线图

实施例1：

如图2所示，为以金丝为电极材料的4×4化学电极阵列型基因芯片的示意图，其中(a)为基因芯片的垂直投影图，(b)为基因芯片的侧面投影图，电极阵列型基因芯片由电极单元13排成阵列，芯片基底上有电极单元13和芯片方位标识14，电极单元13上有用于接入检测系统的引脚15和用于检测基因的探头16。如图1所示，化学电极金表面1生长并固化有发夹结构的探测基因，形成具有多个电极引脚和探头的可检测的芯片。

实施例2：

制备实施例1中的电极阵列型基因芯片的方法如下：

(1)选择金丝为电极的原始材料，用铝粉打磨金表面，直到其表面光滑为止，然后先用双蒸水洗上3-5次，并用酒精浸泡，密封后放入超声波振荡器内，清洗10～20分钟；用酒精溶液清洗3-5次后，把金丝泡入浓硫酸与双氧水的混合溶液(7∶3)，密闭振荡直到白沫出现5分钟后，便可取出金丝，用双蒸水洗上3-5次，氮气密封保存；

(2)如图2所示，将电极嵌入方形芯片基底形成4×4的阵列，每一行的探头上预备固化一种探测基因。电极的一端整齐地暴露在芯片基底的一面，用作探头；电极的另一端整齐地暴露在芯片基底的另一面，用作引脚，在检测时插入检测接口底座。

(3)将事先设计并合成的4种发夹结构的探测DNA配成溶液，溶剂为含1mM的镁离子的Tris缓冲液，pH＝8.0，该DNA的3′端修饰氨基，5′端修饰巯基，分置于如图3所示的4×4的阵列型微容器中，图3(a)为阵列型微容器的垂直投影图，图3(b)为阵列型微容器的侧面投影图，阵列型微容器型基底17上有微容器阵列18，每行容器加入一种探测基因的溶液19。

(4)如图4(a)所示，组装发夹结构的DNA：对应于阵列型微容器，把芯片的电极阵列探头浸入发夹结构的探测DNA溶液20中，4摄氏度环境下静置24小时，实现DNA的固联组装，将DNA在金表面的覆盖率控制在0.1×10^-10～0.5×10^-10mol/cm²的范围内。

(5)组装完毕后，取出电极芯片，先用双蒸水清洗3次，再用酒精清洗3次后，如图4(b)所示，连接PDC：把电极芯片探头浸入PDC溶液(0.2％1，4-phenylene diisothiocyanate，溶剂为DMF溶液，还含有10％的吡啶)21中，充入氮气后密封，在室温下静置5小时。

(6)把芯片从PDC溶液21中取出后，先用纯的DMF溶液清洗3-5次，再用双蒸水清洗3-5次，如图4(c)所示，修饰氧化还原剂TH：把芯片探头浸入TH(硫肼，Thionine)溶液22中，溶剂为含0.1mM的镁离子的Tris缓冲液，pH＝8.0，室温下静置12小时以上。即制得一个4×4电极阵列型基因芯片。

实施例3：

为用于检测人类P53基因突变，可以设计一个带有4×4的引脚和探头的电极阵列型基因芯片，16个电极探头中选择15个作为检测探头。该15个电极单元所带的基因探针均设计为癌症高发的基因突变区。使用时将被测人的血液进行处理，提取DNA并经过PCR扩增后，加入变性剂升温至95摄氏度，放入冰块冷却，将双链DNA变性为单链DNA。在室温下将芯片浸入样品，进行杂交。杂交液采用20mM的Tris缓冲液，pH＝8.0，含50～100nM的TH，在37摄氏度下适度杂交。在检测时，杂交液采用20mM的Tris缓冲液，pH＝8.0，含50～100nM的TH，在37摄氏度下适度杂交。

杂交结束后，从杂交液中取出基因芯片，采用如图5所示的三电极系统中进行检测。如图5(b)所示，为检测系统示意图，被检测的基因芯片31的引脚插入检测基因芯片的接口底座34上的插槽24中，接口底座34通过逐行扫描逻辑控制电路模块27联至电化学工作站或线性扫描伏安仪29，被检测的基因芯片31的基因探头36浸入盛有电解液33的电解池32中。对电极35为Pt电极，参比电极37为Ag-AgCl电极。电解液33为20mM的Tris缓冲液，pH＝8.0，含1mM的镁离子。检测基因芯片的接口底座及电路如图5(a)所示，底座的基底25上有基因芯片引脚的插槽24，通过电路23与逐行扫描逻辑控制电路模块27连接。

对电极阵列进行逐行线性伏安扫描，扫描参数设置为：最低电压-0.3V，最高电压0V，起始电压0V，扫描速度0.1V/s，取样间隔0.001V，得到如图6所示的线性扫描伏安曲线，从而获得每个电极引脚的ΔI_peak(37℃)值。然后再将基因芯片从检测接口底座上拔出，放回杂交液，温度调至20摄氏度，静置20～30分钟，再重复上述检测，同样取得相应的ΔI_peak(20℃)值，由此可以得到每个电极引脚的S值，这些标志量被采集到计算机28中可供基因芯片分析软件分析。其中，S＝(ΔI_peak(20℃)-ΔI_peak(37℃))/ΔI_peak(37℃)。正常P53基因可完全杂交，15个探头的S值都在(-0.05，0.05)区间。若某电极引脚的S值大于0.1，则对应的基因片段存在突变位点，有癌变的可能。该方法可用于癌症早期诊断。

实施例4：

现有四种基因需要精确到一个碱基的检测，其序列如下：

(a)5′-ATGGGCGGCATGAAC-3′

(b)5′-ACTGGCCAAGACCTG-3′

(c)5′-TCTGG-CCACTCCTCAG-3′

(d)5′-CATGAACATGGGCGG-3′.

为了检测这些基因，可设计如下四种发夹结构的探测基因：

(a’)5′-AAAA GCTCGCGTTCATGCCGCCCATA GCGAGC-3′

(b’)5′-AAAA CGACGCAGGTCTTGGCCAGT GCTCG-3′

(c’)5′-AAAA GCACGCTGAGGAGGGGCCAGA CGTGC-3′

(d’)5′-AAAA GCTCGCCCGCCCATGTTCATGA GCGAGC-3′

故可设计带有4×4的引脚和探头的电极阵列型基因芯片(图2)，第一行的四个探头均固联(a’)种发夹结构的探测基因，第二行的四个探头均固联(b’)种发夹结构的探测基因，第三行的四个探头均固联(c’)种发夹结构的探测基因，第四行的四个探头均固联(d’)种发夹结构的探测基因。检测后，求出每个电极单元的S值。正常情况下，9个S值都应在(-0.05，0.05)区间，若某行四个电极单元的S值在全部大于0.1，则说明此行对应的待检测基因不存在于被检测溶液中，即该基因片段存在突变位点。检测过程同实例3。

Claims (10)

1.电极阵列型基因芯片，其特征在于选用金丝或表面镀金的金属丝作为电极，电极排成阵列并固定在芯片基底上；电极的一端整齐地暴露在芯片基底的一侧，用作探针的探头，部分或全部探头表面生长并固化有探测基因；电极的另一端整齐地暴露在芯片基底的另一侧，用作引脚；构成具有多个电极引脚和探头的可检测的基因芯片。

2.如权利要求1所述的电极阵列型基因芯片，其特征在于芯片基底选自在常温下为固态的绝缘材料。

3.如权利要求1所述的电极阵列型基因芯片，其特征在于探头表面生长并固化的探测基因为发夹结构的探测基因。

4.制备如权利要求1所述的电极阵列型基因芯片的方法，步骤包括：

(1)选择经预处理的金丝或表面镀金的金属丝为电极的原始材料；

(2)将电极嵌入方形芯片基底形成N×N的阵列，N为自然数，电极的一端整齐地暴露在芯片基底的一侧，用作探针的探头；电极的另一端整齐地暴露在芯片基底的另一侧，用作引脚，在检测时插入检测接口底座；

(3)将依基因检测目的设计并合成的M种探测未知基因的DNA配成溶液，溶剂为含1mM的钠离子或镁离子的Tris缓冲液，pH＝7.0～8.0；该DNA的5’端修饰巯基，分置于N×N的阵列微容器中，M种探测DNA溶液在阵列微容器的分布根据基因检测目的确定；M为自然数，代表探测DNA的种类，M≤N²；

(4)固联探测DNA：对应于微容器，把芯片探头浸入探测DNA溶液，4摄氏度环境下静置12小时以上，实现探测DNA的固联，探测DNA在探头表面的覆盖率控制在0.1×10^-10～0.5×10^-10mol/cm²的范围内；

(5)修饰氧化还原指示剂：取出芯片，清洗后，把芯片探头浸入包含在0～-0.6V偏压下表现出氧化还原活性的分子的氧化还原指示剂溶液中，溶剂为含0.1mM的镁离子的Tris缓冲液，pH＝7.0～8.0，室温下静置12小时以上；即制得电极阵列型基因芯片。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于芯片基底选自在常温下为固态的绝缘材料。

6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于探测DNA为发夹结构的探测DNA，该DNA的3′端还修饰氨基。

7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于芯片探头固联探测DNA时，在探测DNA溶液中静置的时间为24小时以上。

8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于氧化还原指示剂为硫肼或亚甲基兰。

9.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于芯片的探头固联探测DNA以后，还要进行连接PDC步骤，然后再修饰氧化还原指示剂，连接PDC的方法如下：芯片清洗后，把芯片探头浸入PDC(0.2％1，4-phenylene diisothiocyanate，溶剂为DMF溶液，还含有10％的吡啶)溶液，充入氮气后密封，在室温下静置5小时以上，再把芯片从PDC溶液中取出并用纯的DMF溶液清洗。

10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于芯片的探头连接PDC时，在室温下静置时间为5小时以上。

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