CN113391065A - 一种用于检测新型冠状病毒的受体试剂及其应用 - Google Patents
一种用于检测新型冠状病毒的受体试剂及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于检测新型冠状病毒的受体试剂及其应用。所述受体包含够与活性氧反应产生可检测的化学发光信号的受体微球;所述受体微球的内部填充有化学发光剂,且所述受体微球的表面连接有新型冠状病毒抗体1。包含所述受体试剂的试剂盒利用双抗体夹心法检测新型冠状病毒,可以有效缩短窗口期,且检测结果快,30min以内报告结果;检测通量大,可达到200‑500测试/小时,适合于大规模样本检测,同时可减少高危病毒的污染。
Description
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域,具体涉及一种用于检测新型冠状病毒的受体 试剂及其应用。
背景技术
冠状病毒是一组有包膜的正义单链RNA病毒,属巢病毒目(Nidovirales)、冠 状病毒科、冠状病毒亚科,已知26种,并根据不同的抗原交叉反应和遗传组成 被分为4个属(α、β、γ和δ),其中只有α-属和β-属含有对人致病的毒株。长 期以来,冠状病毒作为重要的动物病原体,可引发哺乳动物和鸟类的呼吸道及肠 道疾病。已知冠状病毒中,有6种可引发人类疾病,包括:HCoV-229E、 HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV。其中,前 4种为局部流行性疾病,主要引起轻度自限性疾病,而后两种可引发重症。2002 年和2012年发现的SARS-CoV和MERS-CoV属于β-冠状病毒,并由于其对人类 的高威胁性被列入WHO高威胁清单。冠状病毒引发的高患病率对人类健康构成 持续威胁。新型冠状病毒(2019-nCoV)成为第七个能够引发人类疾病的离散冠 状病毒种属,表征为β-冠状病毒。
目前,2019-nCoV病毒感染在中国尚未得到全面控制,核酸检测(PCR)作 为唯一的确认感染的金标准得到广泛的应用。然而,由于2019-nCoV分布于下呼 吸道分泌物中,在采集咽拭子标本时需要受试者深咳才能获得理想的标本,采集 过程对于医护人员暴露风险极大。此外,医护人员获得标本后需要立即送检分离 核酸进行检测。核酸检测采用多聚酶链式反应(PCR)技术,技术的复杂性远高 于免疫学检测方法,核酸检测不易在一般实验室开展。
而针对2019-nCoV抗体的检测窗口期较长(病毒感染人体后到人体产生抗 体),容易造成假阴性的判断同时耽搁病情。因此,目前临床实验室亟需要提供 一种针对2019-nCoV血清学检测的体外诊断试剂盒。
发明内容
本发明针对现有技术的不足,提供了一种用于检测新型冠状病毒的受体试剂 及其应用,采用包含所述受体试剂的试剂盒检测新型冠状病毒时可有效缩短窗口 期,且操作简便、精密性和特异性好,检测速度快、检测通量大。
为此,本发明第一方面提供了一种用于测新型冠状病毒的受体试剂,其包含 够与活性氧反应产生可检测的化学发光信号的受体微球;所述受体微球的内部填 充有化学发光剂,且所述受体微球的表面连接有新型冠状病毒抗体1。
在本发明的一些实施方式中,所述受体微球的表面不包被多糖。
在本发明的另一些实施方式中,所述受体微球的表面包被有多糖,所述新型 冠状病毒抗体1与多糖相连,且每毫克所述受体微球的总糖含量不低于25微克; 优选地,每毫克所述受体微球的总糖含量不低于30微克;进一步优选地,每毫 克所述受体微球的总糖含量不低于35.1微克;更进一步优选地,每毫克所述受体 微球的总糖含量不低于45.8微克。
在本发明的一些实施方式中,所述总糖含量是通过蒽酮法检测的;
优选地,所述糖选自含有三个或更多个未修饰或修饰的单糖单元的碳水化合 物,优选选自葡聚糖、淀粉、糖原、菊粉、果聚糖、甘露聚糖、琼脂糖、半乳聚 糖、羧基葡聚糖和氨基葡聚糖;更优选选自葡聚糖、淀粉、糖原和聚核糖。
在本发明的另一些实施方式中,所述受体微球在受体试剂中的Zeta电位在 -5mV至-45mV电位之间;优选在-5mV至-43.4mV电位之间;更优选在-25.2mV 至-30.6mV电位之间。
本发明第二方面提供了一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒,其包括:
受体试剂,所述受体试剂如本发明第一方面所述;
捕获试剂,所述捕获试剂包含与新型冠状病毒抗体2连接的特异性配对成员 中的一员;
所述新型冠状病毒抗体2与受体试剂中受体微球上连接的新型冠状病毒抗体 1能同时与待测新型冠状病毒特异性结合。
在本发明的一些实施方式中,所述新型冠状病毒抗体1与新型冠状病毒抗体 2所针对的抗原表位为N抗原、S抗原或N+S融合抗原;优为N抗原。
在本发明的另一些实施方式中,所述N抗原、S抗原和N+S融合抗原为相应 抗原的全长片段或部分片段。
在本发明的一些实施方式中,所述S抗原包括S1蛋白、S1-RBD蛋白和S2 蛋白。
在本发明的另一些实施方式中,所述特异性配对成员选自抗体、抗体片段、 配体、寡核苷酸、寡核苷酸结合蛋白、凝集素、半抗原、抗原、免疫球蛋白结合 蛋白、抗生物素蛋白、亲和素或生物素组成的一对物质;优选地,所述特异性配 对成员为生物素-亲和素。
在本发明的一些实施方式中,所述生物素选自带有不同活化基团的生物素, 优选选自能与氨基反应的带NHS活化基团的生物素,更优选为NHS-LC-LC-生物 素。
本发明第三方面提供了一种利用如本发明第二方面所述试剂盒检测待测样 本中新型冠状病毒的方法,其包括:首先制备包括受体微球-新型冠状病毒抗体 1-新型冠状病毒-新型冠状病毒抗体2-供体微球的复合物;然后利用能量或者活性 化合物处理上述复合物,激发供体微球产生活性氧,受体微球与接收到的活性氧 反应生成可检测的化学发光信号;最后分析所述化学发光信号情况,判断待测样 本中是否存在新型冠状病毒以及新型冠状病毒的含量。
在本发明的一些实施方式中,当所述化学发光信号的值≥定性参考样品的化 学发光信号值时,则待测样本为阳性样本;当所述化学发光信号的值<定性参考 样品的化学物发光信号值时,则待测样本为阴性样本。
在本发明的一些实施方式中,所述待测样本选自人血清、鼻咽拭子或咽拭子。
本发明的有益效果为:针对新型冠状病毒的检测,核酸检测因取样手法等原 因,容易造成假阴性;而利用对2019-nCoV抗体的检测的窗口期较长,同样容易 造成假阴性的判断同时耽搁病情。本发明含有所述受体试剂的试剂盒利用双抗体 夹心法检测新型冠状病毒,可以有效缩短窗口期,且检测结果快,30min以内报 告结果;检测通量大,可达到200-500测试/小时,适合于大规模样本检测。利用 所述试剂盒进行新型冠状病毒的检测,可采用LiCA 500系统,免清洗,一次性 TIP头,无需污水处理,减少高危病毒的污染。
具体实施方式
为使本发明容易理解,下面将详细说明本发明。但在详细描述本发明前,应 当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解,本文中使用的术语仅为 了描述具体实施方式,而并不表示限制性的。
在提供了数值范围的情况下,应当理解所述范围的上限和下限和所述规定范 围中的任何其他规定或居间数值之间的每个居间数值均涵盖在本发明内。这些较 小范围的上限和下限可以独立包括在较小的范围中,并且也涵盖在本发明内,服 从规定范围中任何明确排除的限度。在规定的范围包含一个或两个限度的情况 下,排除那些包括的限度之任一或两者的范围也包含在本发明中。
除非另有定义,本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的 通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方 法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用,但是现在描述了优选的方法和材 料。
Ⅱ.具体实施方案
下面将详细说明本发明。
本发明包含所述受体试剂的试剂盒,其通过双抗体夹心进而均相化学发光检 测新型冠状病毒。光激化学发光属于均相化学发光,其是由光激发诱导的一个连 续的化学反应和发光反应过程,供体微球和受体微球之间可借助抗原-抗体结合相 互靠近,为能量传递创造条件,在激光照射情况下产生光信号。相反,如未发生 抗原-抗体结合,供体微球和受体微球之间有一定距离,受体微球不满足接受能量 诱导发光的条件,故不产生光信号。因此,在不分离洗涤的情况下,直接检测光 信号,光信号强度与抗原-抗体结合呈正相关。光激化学发光分析是一种均相发光 免疫分析,基于光激化学发光和抗原-抗体结合的原理而建立的微量物质定量分析 技术。全程无分离洗涤过程,简单快速,特点是采用“双球”和“双标“独特方式, 固相微球的悬浮性能好,更利于微球均匀扩散,以及微球表面抗原或抗体分子与 待检抗体或抗原的相互碰撞结合。
在本发明的试剂盒中,首先选择一对特异性抗体分别包被受体微球(FG-Ag) 和标记生物素(Bio-Ag),分别为受体试剂(R1)和捕获试剂(R2);用亲和素(如中性亲和素)包被供体微球,作为通用溶液(供体试剂)。其次,于微孔内 分别加入R1和R2,以及待检样品和质控品,启动第一阶段温浴后,于受体微球 表面形成双抗体夹心复合物;无需洗涤直接加入通用溶液,启动第二阶段温浴, 生物素结合亲和素,两种微球相互靠近;此时,用激光束激发,诱导光激化学发 光反应产生光信号。
因此,本发明第一方面所涉及的用于检测新型冠状病毒的受体试剂,其包含 够与活性氧反应产生可检测的化学发光信号的受体微球;所述受体微球的内部填 充有化学发光剂,且所述受体微球的表面连接有新型冠状病毒抗体1。
在本发明的一些实施方式中,所述受体微球的表面不包被多糖。
在本发明的另一些实施方式中,所述受体微球的表面包被有多糖,所述新型 冠状病毒抗体1与多糖相连,且每毫克所述受体微球的总糖含量不低于25微克; 优选地,每毫克所述受体微球的总糖含量不低于30微克;进一步优选地,每毫 克所述受体微球的总糖含量不低于35.1微克;更进一步优选地,每毫克所述受体 微球的总糖含量不低于45.8微克。
在本发明的一些具体实施方式中,每毫克所述受体微球的总糖含量可以为25 微克、30微克、35微克、35.1微克、40微克、45.8微克、50微克、80微克、 100微克、150微克或200微克。
在本发明的一些实施方式中,所述总糖含量是通过蒽酮法检测的;
优选地,所述糖选自含有三个或更多个未修饰或修饰的单糖单元的碳水化合 物,优选选自葡聚糖、淀粉、糖原、菊粉、果聚糖、甘露聚糖、琼脂糖、半乳聚 糖、羧基葡聚糖和氨基葡聚糖;更优选选自葡聚糖、淀粉、糖原和聚核糖。
在本发明的另一些实施方式中,所述受体微球在受体试剂中的Zeta电位在 -5mV至-45mV电位之间;优选在-5mV至-43.4mV电位之间;更优选在-25.2mV 至-30.6mV电位之间。在本发明的一些具体实施方式中,所述受体微球在受体试 剂中的Zeta电位可以为-5mV、-10mV、-15mV、-20mV、-25.2mV、-30mV、 -30.6mV、-40mV、-43.4mV、或-45mV。本申请的发明人发现,精确控制受体微 球在受体试剂中的Zeta电位在合适范围内,能够使试剂盒具有抗干扰能力强、测 试性能佳的优点。
本发明所述的Zeta电位值是指受体微球在PH为6~9的分散体系中的电位 值。微球的Zeta电位(Zeta potential)是指微球在剪切面处的电位;即连续相与 附着在微球上的流体稳定层之间的电势差。由于分散粒子表面带有电荷而吸引周 围的反号离子,这些反号离子在两相界面呈扩散状态分布而形成扩散双电层。根 据Stern双电层理论可将双电层分为两部分,即Stern层和扩散层。Stern层定义 为吸附在电极表面的一层离子(IHP orOHP)电荷中心组成的一个平面层,此平 面层相对远离界面的流体中的某点的电位称为Stern电位。稳定层(Stationary layer) (包括Stern层和滑动面slipping plane以内的部分扩散层)与扩散层内分散介质 (dispersion medium)发生相对移动时的界面是滑动面(slipping plane),该处对远离 界面的流体中的某点的电位称为Zeta电位或电动电位(ζ-电位),即Zeta电位是 连续相与附着在分散粒子上的流体稳定层之间的电势差。它可以通过电动现象直 接测定。目前测量Zeta电位的方法主要有电泳法、电渗法、流动电位法以及超声 波法,其中以电泳法应用最广。
本发明所述用语“受体微球”是指含有能够与活性氧反应可以产生可检测信 号的化合物的微球。供体微球被能量或者活性化合物诱导激活并释放高能态的活 性氧,该高能态的活性氧被近距离的受体颗粒俘获,从而传递能量以激活所述受 体微球。所述受体微球可以选择不同官能团,如醛基、羧基、氨基等,优选可以 和蛋白质游离氨基偶联的醛基受体微粒和羧基受体微粒,更优选醛基受体微粒。 所述受体微球本身可以不包糖或包糖,优选包被多糖涂层的受体微球,更优选包 被有至少两个连续多糖涂层的受体微球。
本发明所述用语“活性氧”是指机体内或者自然环境中由氧组成,含氧并且 性质活泼的物质的总称,主要为一种激发态的氧分子,包括氧的一电子还原产物 超氧阴离子(O2·-)、二电子还原产物过氧化氢(H2O2)、三电子还原产物羟基自由 基(·OH)以及一氧化氮和单线态氧(1O2)等。
在本发明的一些具体实施方式中,所述活性氧为单线态氧。
本发明第二方面涉及一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒,其包括:
受体试剂,所述受体试剂如本发明第一方面所述;
捕获试剂,所述捕获试剂包含与新型冠状病毒抗体2连接的特异性配对成员 中的一员;
所述新型冠状病毒抗体2与受体试剂中受体微球上连接的新型冠状病毒抗体 1能同时与待测新型冠状病毒特异性结合。
在本发明的一些实施方式中,所述新型冠状病毒抗体1与新型冠状病毒抗体 2所针对的抗原表位为N抗原、S抗原或N+S融合抗原;优为N抗原。
在本发明的一些实施方式中,所述N抗原、S抗原和N+S融合抗原为相应抗 原的全长片段或部分片段。
在本发明的一些实施方式中,所述S抗原包括S1蛋白、S1-RBD蛋白和S2 蛋白。
本发明中,针对N抗原的抗体(如,单克隆抗体)是指可以和N抗原特异 性结合的抗体(如,单克隆抗体)。
本发明所述用语“N抗原”为新型冠状病毒核衣壳蛋白(Nucleocapsid),是冠 状病毒中含量最丰富的蛋白。在病毒体组装过程中,N蛋白与病毒RNA结合并 导致螺旋核衣壳的形成。核衣壳蛋白是一种高度免疫原性的磷蛋白,与病毒基因 组复制和调节细胞信号通路有关。由于N蛋白的序列保守性(与SARS同源性 94%)和强大的免疫原性,N蛋白常被作为冠状病毒诊断检测工具。本发明所述 用语“S抗原”为新型冠状病毒棘突蛋白(Spikeprotein),是冠状病毒最重要的 表面膜蛋白,含有两个亚基(subunit),S1和S2。其中S1主要包含有受体结 合区(receptorbinding domain,RBD),负责识别细胞的受体。S2含有膜融合过 程所需的基本元件。S蛋白与SARS同源性约75%(S1同源性68%,S2同源性 94%)。因N抗原免疫原性较强且产量较大,检测其抗体具有较高的敏感性,但 因其序列较为保守,其特异性相对较差。S抗原(尤其S1蛋白),因其序列同源 性较低,具有较好的特异性。
在本发明的一些实施方式中,所述新型冠状病毒抗体1与新型冠状病毒抗体 2各自独立地选自单克隆抗体和多克隆抗体中的至少一种;优选为单克隆抗体。 本发明中,理论上可以采用单克隆抗体和多克隆抗体共同包被受体微粒或将单克 隆抗体和多克隆抗体包被的受体微粒混合作为受体试剂;同时可以采用单克隆抗 体和多克隆抗体同时标记生物素作为捕获试剂。
在本发明的一些实施方式中,所述试剂盒还包括供体试剂,所述供体试剂包 括供体微球,所述供体微球能够在激发状态下生成活性氧;优选地,所述供体试 剂与特异性配对成员中的另一员结合。
本发明所述用语“供体微球”是指含有通过能量或者活性化合物的激活后能 够产生与受体微球反应的诸如活性氧的活性中间体的敏化剂的微球。供体微球可 以是光活化的(如染料和芳香化合物)或者化学活化的(如酶、金属盐等)。在 本发明一些具体实施例中,所述供体微球为填充有光敏剂的高分子微球,所述光 敏剂可以是本领域已知的光敏剂,优选相对光稳定且不与单线态氧有效反应的化 合物,其非限定性的例子包括例如美国专利US5709994(该专利文献在此全文引 为参考)公开的亚甲基蓝、玫瑰红、卟啉、酞菁和叶绿素等化合物,以及这些化 合物的具有1-50个原子取代基的衍生物,所述取代基用于使得这些化合物更具有 亲脂性或更具有亲水性、和/或作为连接至特异性结合配对成员的连接基团。本领 域技术人员已知的其他光敏剂的例子也可以在本发明中使用,例如美国专利US6406913中记载的内容,该专利文献并入本文以供参考。
本发明所述用语“特异性配对成员”是指能够相互特异性结合的一对物质。 本发明所述用语“特异性结合”,是指两种物质之间的相互辨别和选择性结合反 应,从立体结构角度上说就是相应的反应物之间构象的对应性。
在本发明的一些具体实施方式中,所述特异性配对成员选自抗体、抗体片段、 配体、寡核苷酸、寡核苷酸结合蛋白、凝集素、半抗原、抗原、免疫球蛋白结合 蛋白、抗生物素蛋白、亲和素或生物素组成的一对物质;优选地,所述特异性配 对成员为生物素-亲和素。本发明中,所述亲和素可以为链霉亲和素或中性亲和素。
在本发明的一些实施方式中,所述生物素选自带有不同活化基团的生物素, 优选选自能与氨基反应的带NHS活化基团的生物素,更优选为NHS-LC-LC-生物 素。
本发明所述用语“生物素”广泛存在于动植物组织中,其分子上有两个环状 结构,分别为咪唑酮环和噻吩环,其中咪唑酮环是与链霉亲和素结合的主要部位。 活化的生物素可以在蛋白质交联剂的介导下,与已知的几乎所有生物大分子偶 联,包括蛋白质、核酸、多糖和脂类等。
本发明所述试剂盒除了包含上述试剂外,还可以任选地包括阴性对照:去激 素人血清,阳性对照:含2019-nCoV-Ag的去激素人血清,以及参考样品(质控 品):含2019-nCoV-Ag的去激素人血清。
本发明第三方面涉及一种利用如本发明第二方面所述试剂盒检测待测样本 中新型冠状病毒的方法,其包括:首先制备包括受体微球-新型冠状病毒抗体1- 新型冠状病毒-新型冠状病毒抗体2-供体微球的复合物;然后利用能量或者活性化 合物处理上述复合物,激发供体微球产生活性氧,受体微球与接收到的活性氧反 应生成可检测的化学发光信号;最后分析所述化学发光信号情况,判断待测样本 中是否存在新型冠状病毒以及新型冠状病毒的含量。
在本发明的一些实施方式中,当所述化学发光信号的值≥定性参考样品的化 学发光信号值时,则待测样本为阳性样本;当所述化学发光信号的值<定性参考 样品的化学物发光信号值时,则待测样本为阴性样本。本发明中,检测待测样本 时形成的化学发光信号的值可以表示为S,定性参考样品的化学物发光信号值可 以表示为CO,因此当S/CO≥1判定为有反应性(即待测样本为阳性样本),S/CO <1判定为无反应性(即待测样本为阴性样本)。
本发明所述用语“定性参考样品”是指临界阳性样品,根据其发光信号值判 断待测样本是否为阳性样品。当待测样本的发光信号值不低于定性参考样品的发 光信号值时,待测样本为阳性样本。相反,当待测样本的发光信号值低于定性参 考样品的发光信号值时,待测样本为阴性样本。
本发明中,制备包括受体微球-新型冠状病毒抗体1-新型冠状病毒-新型冠状 病毒抗体2-供体微球的复合物所采用的试剂盒为如本发明第二方面所述的试剂 盒。
在本发明的一些实施方式中,所述方法具体包括以下步骤:
S1,将待测样本、受体试剂和捕获试剂混合,得到第一混合物;
S2,将供体试剂与第一混合物混合,得到第二混合物;
S3,用能量或者活性化合物处理第二混合物,激发供体微球产生活性氧,受 体与活性氧反应生成可检测的化学发光信号;
S4,分析所述化学发光信号情况,判断待测样本中是否存在新型冠状病毒以 及新型冠状病毒的含量。
上述受体试剂为如本发明第一方面所述的受体试剂,或如本发明第二方面所 述试剂盒中的受体试剂;上述捕获试剂和供体试剂为如本发明第二方面所述试剂 盒中的捕获试剂和供体试剂。
本发明所述方法中,所述试剂混合后均可以根据需要进行温育。具体地,所 述温育的温度可以是35-40℃,时间可以是10-20min;优选地,所述温育的温度 可以选自36℃、37℃、38℃、39℃或40℃;温育的时间可以选自10min、12min、15min、18min或20min;更优选的所述温育的温度为37℃,步骤S1的温育时间 为15min,步骤S2的温育时间为10min。
本发明中,所述待测样本、受体试剂和捕获试剂的加样量各自独立地为 15-35μL;优选地,所述待测样本、受体试剂和捕获试剂的加样量各自独立地为 15μL、18μL、20μL、22μL、25μL、28μL、30μL或35μL。更优选地,所述待测 样本、受体试剂和捕获试剂的加样量均为25μL。
在本发明的一些实施方式中,所述待测样本选自人血清、鼻咽拭子或咽拭子。
实施例
为使本发明更加容易理解,下面将结合实施例来进一步详细说明本发明,这 些实施例仅起说明性作用,并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原 料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
下述实施例中采用的原料分别如下:
原料组1(检测S蛋白):
Ab1:Genscript:SARS-CoV-2棘突S1亚基抗体;
Ab2:北京义翘神州:2019-nCoV棘突抗体,兔单克隆抗体;
Ag:北京义翘神州:SARS-Cov-2(2019-nCoV)棘突蛋白(S1亚基,His tag)。
原料组2(检测N蛋白):
Ab1:北京义翘神州:SARS-CoV-2(2019-nCoV)核衣壳蛋白/N抗体;
Ab2:北京义翘神州:2019-nCoV核衣壳蛋白/N抗体,兔单克隆抗体;
Ag:Genscript:2019-nCoV核衣壳蛋白
实施例1:受体微球的制备
1.1聚苯乙烯乳胶微球的合成
准备100mL的三口烧瓶,加入40mmol苯乙烯、3mmol甲基丙烯酸、10mL 水,搅拌10min后通N2 30min;
1)称取0.11g过硫酸铵和0.2g氯化钠,溶于40mL水中配制成水溶液。将该 水溶液加入到步骤1)的反应体系中,继续通N2 30min;
2)将反应体系升温至70℃,反应15小时;
3)将反应完成后的乳液冷却至室温,用合适的滤布过滤。得到的乳液用去 离子水多次离心沉降清洗,直至离心初的上清液的电导率接近去离子水,然后用 水稀释,以乳液形式保存。
1.2.化学发光剂的填充过程
1)准备25mL的圆底烧瓶,加入0.1g二甲基噻吩衍生物和0.1g铕(Ⅲ)配 合物(MTTA-EU3+),10mL 95%乙醇,磁力搅拌,水浴升温至70℃,获得配合 物溶液;
2)准备100mL的三口烧瓶,加入10mL 95%乙醇、10mL水和10mL浓度为 10%、步骤1.1中获得的聚苯乙烯乳胶微球,磁力搅拌,水浴升温至70℃;
3)将步骤1)中的配合物溶液缓慢滴加至步骤2)中的三口烧瓶中,70℃反 应2小时后停止搅拌,自然冷却;
4)将上述乳液离心1小时,30000G,离心后弃去上清液,得到填充有化学 发光剂的聚苯乙烯微球,即受体微球。用20mM HEPES缓冲液定容,使其终浓 度为20mg/mL。
1.3受体微球的表面包被葡聚糖
1)取50mg氨基葡聚糖固体于20mL圆底烧瓶中,加入5mL 50mM/pH=10 碳酸盐缓冲液,30℃避光搅拌溶解;
2)取100mg已制备好的填埋有发光组合物的聚苯乙烯微球,加入到氨基葡 聚糖溶液中搅拌2h;
3)将10mg硼氢化钠溶于0.5mL 50mM/pH=10碳酸盐缓冲液后滴加到上述反 应液中,30℃避光反应过夜;
4)将反应后的混合液30000G离心后弃去上清液,加入50mM/pH=10碳酸 盐缓冲液超声分散。重复离心清洗三次后用50mM/pH=10碳酸盐缓冲液定容,使 其终浓度为20mg/mL;
5)取100mg醛基葡聚糖固体于20mL圆底烧瓶中,加入5mL 50mM/pH=10 碳酸盐缓冲液,30℃避光搅拌溶解;
6)将上述微球加入到醛基葡聚糖溶液中搅拌2h;
7)将15mg硼氢化钠溶于0.5mL 50mM/pH=10碳酸盐缓冲液后滴加到上述反 应液中,30℃避光反应过夜;
8)将反应后的混合液30000G离心后弃去上清液,加入50mM/pH=10碳酸 盐缓冲液超声分散。重复离心清洗三次后用50mM/pH=10碳酸盐缓冲液定容,使 其终浓度为20mg/mL。
9)由纳米粒度仪测得此时微球粒径的Gaussian分布平均粒径为241.6nm, 变异系数(C.V)=14%。
实施例2:试剂盒的制备
2.1受体试剂的制备
1)抗体处理:将SARS-CoV-2棘突S1亚基抗体(或SARS-CoV-2(2019-nCoV) 核衣壳蛋白/N抗体)进行透析,更换为包被缓冲液,并测定蛋白浓度;
2)受体微球处理:将实施例1制备的受体微球通过离心,超声等过程更换 为包被缓冲液;
3)偶联:将处理好的受体微球及处理后的2019-nCoV抗体1混合反应,经 还原,封闭等过程后,得到受体微球-2019-nCoV抗体1,使用保存液进行定容并 保存,获得受体试剂。
2.2捕获试剂的制备
1)抗体处理:将2019-nCoV棘突抗体(或2019-nCoV核衣壳蛋白/N抗体) 进行透析,更换为标记缓冲液,并测定蛋白浓度;
2)标记反应:将处理好的2019-nCoV抗体2与活化生物素混合反应,进行 标记;
3)透析:将标记后的生物素-2019-nCoV抗体2进行透析,以去除未标记的 游离生物素;
4)保存:将透析后的生物素-2019-nCoV抗体2测定蛋白浓度,加入甘油后 保存,获得捕获试剂。
实施例3:利用蒽酮法检测糖含量
3.1微球样品预处理:
分别取实施例2中含有1mg受体微球的受体试剂在20000G离心40min,倒 去上层清液后用纯化水超声分散,重复离心分散三次后各自用纯化水定容至 1mg/mL作为待检样品。
3.2葡萄糖标准溶液的配制:
用纯化水将1mg/mL葡萄糖储备液配制成0mg/mL、0.025mg/mL、0.05mg/mL、0.075mg/mL、0.10mg/mL、0.15mg/mL的标准溶液曲线。
3.3蒽酮溶液的配制:用80%硫酸溶液配制成2mg/mL。
3.4向离心管分别加入0.1mL各浓度的葡萄糖标准溶液及待测样本,每管各 加1mL蒽酮试液。
3.5 85℃孵育30min。
3.6将样品反应管15000G离心40min,移液器枪头从管底吸取澄清液体进行 吸光度的测定,避免将上部悬浮物吸出。
3.7恢复至室温,测量620nm的吸光度。
3.8以标准品浓度为X值,吸光度为Y值,进行一次直线回归,得到如表1 所示的标准曲线吸光度数值,并以此检测每毫克受体微球的糖含量为50μg。
表1
序号 | 浓度mg/mL | 吸光度A | 吸光度B | 吸光度均值 |
1 | 0.15 | 0.415 | 0.411 | 0.4130 |
2 | 0.1 | 0.293 | 0.302 | 0.2975 |
3 | 0.075 | 0.214 | 0.227 | 0.2205 |
4 | 0.05 | 0.146 | 0.153 | 0.1495 |
5 | 0.025 | 0.101 | 0.098 | 0.0995 |
6 | 0 | 0.032 | 0.031 | 0.0315 |
实施例4:本发明所述试剂盒的使用方法
1)将实施例2中制备的受体试剂和捕获试剂分别使用缓冲液稀释至 50μg/mL和0.8μg/mL,制备得试剂R1和试剂R2;
2)向微孔板中分别加入25μL待测样本,25μL试剂R1和25μL试剂R1 溶液,37℃温育15min;
实施例5:受体微球不同糖含量对上机检测信号水平影响测试
按照实施例1中给出的方法,制备一系列包含不同糖含量的受体微球的试剂 盒(如下表所示),然后利用实施例4中所示方法检测各试剂盒针对同一批样本, 在博阳生物科技(上海)有限公司生产的HT光激化学发光仪器上比较信 号水平,结果如表2所示。
表2
测试结果显示,每毫克所述受体颗粒中的糖含量≥25μg时,上机检测信号水 平较高。
实施例6:受体试剂中受体微球的ZETA电位对上机检测信号水平影响测试
用NICOMP 380Z3000仪器,先经标准品标定后,对受体试剂进行ZETA电 位的测定,制备一系列不同ZETA电位的受体试剂,然后利用实施例4中所示方 法检测各试剂盒针对同一批样本,在博阳生物科技(上海)有限公司生产的 HT光激化学发光仪器上比较信号水平,结果如表3所示。
表3
结果显示,所述受体微球在受体试剂中的ZETA电位在-5mV至-45mV电位 之间时上机检测信号平均水平较高,并且ZETA电位在-25mV至-31mV电位之 间时上机检测信号平均水平更高。
实施例7:试剂盒的样本检测效果测试
将新型冠状病毒的重组抗原使用阴性血清进行梯度稀释,使用上述试剂盒进 行检测,检测结果见表4。
表4:检测重组抗原
结果显示,重组抗原浓度为0.8ng/mL时,依然可以检测为有反应性。说明试 剂盒的检测灵敏度较高。
使用上述试剂盒对94份正常阴性血清进行检测,检测结果见表5。
表5:正常阴性血清检测结果
表5结果显示,94例正常阴性随机血清中,未出现假阳性结果,特异性为 100%(95%CI:95.1%-100%),说明试剂盒有较好的特异性。
使用上述试剂盒对低高值质控进行检测,以测试试剂盒的精密性,检测结 果见表6。
表6:精密性检测结果
从表6的结果可知,低高值质控的CV分别为1.10%和1.56%,说明本发明 所述试剂盒具有较好的精密度。
应当注意的是,以上所述的实施例仅用于解释本发明,并不构成对本发明的 任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述,但应当理解为其中所用的 词语为描述性和解释性词汇,而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求 的范围内对本发明作出修改,以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行 修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例,但是并不意味着 本发明限于其中公开的特定例,相反,本发明可扩展至其他所有具有相同功能的 方法和应用。
Claims (14)
1.一种用于检测新型冠状病毒的受体试剂,其包含够与活性氧反应产生可检测的化学发光信号的受体微球;所述受体微球的内部填充有化学发光剂,且所述受体微球的表面连接有新型冠状病毒抗体1。
2.根据权利要求1所述的受体试剂,其特征在于,所述受体微球的表面不包被多糖。
3.根据权利要求1所述的受体试剂,其特征在于,所述受体微球的表面包被有多糖,所述新型冠状病毒抗体1与多糖相连,且每毫克所述受体微球的总糖含量不低于25微克;优选地,每毫克所述受体微球的总糖含量不低于30微克;进一步优选地,每毫克所述受体微球的总糖含量不低于35.1微克;更进一步优选地,每毫克所述受体微球的总糖含量不低于45.8微克。
4.根据权利要求3所述的受体试剂,其特征在于,所述总糖含量是通过蒽酮法检测的;
优选地,所述糖选自含有三个或更多个未修饰或修饰的单糖单元的碳水化合物,优选选自葡聚糖、淀粉、糖原、菊粉、果聚糖、甘露聚糖、琼脂糖、半乳聚糖、羧基葡聚糖和氨基葡聚糖;更优选选自葡聚糖、淀粉、糖原和聚核糖。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的受体试剂,其特征在于,所述受体微球在受体试剂中的Zeta电位在-5mV至-45mV电位之间;优选在-5mV至-43.4mV电位之间;更优选在-25.2mV至-30.6mV电位之间。
6.一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒,其包括:
受体试剂,所述受体试剂如权利要求1~5中任意一项所述;
捕获试剂,所述捕获试剂包含与新型冠状病毒抗体2连接的特异性配对成员中的一员;
所述新型冠状病毒抗体2与受体试剂中受体微球上连接的新型冠状病毒抗体1能同时与待测新型冠状病毒特异性结合。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述新型冠状病毒抗体1与新型冠状病毒抗体2所针对的抗原表位为N抗原、S抗原或N+S融合抗原;优为N抗原。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述N抗原、S抗原和N+S融合抗原为相应抗原的全长片段或部分片段。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒,其特征在于,所述S抗原包括S1蛋白、S1-RBD蛋白和S2蛋白。
10.根据权利要求6-9中任意一项所述的试剂盒,其特征在于,所述特异性配对成员选自抗体、抗体片段、配体、寡核苷酸、寡核苷酸结合蛋白、凝集素、半抗原、抗原、免疫球蛋白结合蛋白、抗生物素蛋白、亲和素或生物素组成的一对物质;优选地,所述特异性配对成员为生物素-亲和素。
11.根据权利要求10所述的试剂盒,其特征在于,所述生物素选自带有不同活化基团的生物素,优选选自能与氨基反应的带NHS活化基团的生物素,更优选为NHS-LC-LC-生物素。
12.一种利用如权利要求6-11中任意一项所述的试剂盒检测待测样本中新型冠状病毒的方法,其包括:首先制备包括受体微球-新型冠状病毒抗体1-新型冠状病毒-新型冠状病毒抗体2-供体微球的复合物;然后利用能量或者活性化合物处理上述复合物,激发供体微球产生活性氧,受体微球与接收到的活性氧反应生成可检测的化学发光信号;最后分析所述化学发光信号情况,判断待测样本中是否存在新型冠状病毒以及新型冠状病毒的含量。
13.根据权利要求12所述的方法,其特征在于,当所述化学发光信号的值≥定性参考样品的化学发光信号值时,则待测样本为阳性样本;当所述化学发光信号的值<定性参考样品的化学物发光信号值时,则待测样本为阴性样本。
14.根据权利要求12或13所述的方法,其特征在于,所述待测样本选自人血清、鼻咽拭子或咽拭子。
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