CN113341145A

CN113341145A - 一种s1f-axl复合物、试剂盒和检测该复合物的方法及应用

Info

Publication number: CN113341145A
Application number: CN202110853708.1A
Authority: CN
Inventors: 黄若磐; 唐浩; 罗树红; 方建民; 张双喆; 朱思为
Original assignee: Reboo Guangzhou Biotechnology Co ltd
Current assignee: Reboo Guangzhou Biotechnology Co ltd; Raybiotech Inc
Priority date: 2021-07-28
Filing date: 2021-07-28
Publication date: 2021-09-03

Abstract

本发明公开了一种S1F‑AXL复合物、试剂盒和检测该复合物的方法及应用。所述试剂盒包含S1F多肽和AXL多肽，以S1F多肽、AXL多肽中的一种作为包被底物；所述S1F多肽和所述AXL多肽中至少一种为具有缀合标签的糖基化多肽，还包括具有微孔的微量滴定板、标记底物标记的抗标签特异性抗体、HRP偶联的二抗、洗涤缓冲液、标记底物反应液、反应终止液。所述检测S1F‑AXL复合物的试剂盒，通过测量标记的信号特征，检测S1F‑AXL复合物的结合亲和力，还可以用于检测来自怀疑感染了SARS‑CoV‑2(Covid‑19)的受试者的生物样品中的病毒。

Description

一种S1F-AXL复合物、试剂盒和检测该复合物的方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种S1F-AXL复合物、试剂盒和检测该复合物的方法及应用。

背景技术

2019年冠状病毒病(COVID-19)成为了一个紧迫的全球公共卫生问题，截至2020年12月，全球至少报告了7600万例病例，超过160万例死亡。尽管有几种疫苗正在进行临床试验，但感染和死亡人数在可预见的未来将继续上升，从而对社会健康和经济发展造成灾难性影响。许多药物已经过针对COVID-19的疗效测试，特别是Remdesivir.RTM等，但这些疗法中很少有人在临床试验中表现出强大的疗效。因此，对COVID-19患者的医院护理将在世界范围内变得司空见惯，治疗严重病例中的细胞因子风暴和器官衰竭等并发症将需要加强对新疗法疗效的调查。

COVID-19的病原体，严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)是冠状病毒科病毒的成员，已知会导致哺乳动物的呼吸道、肝脏、肠道和神经系统疾病。在2002年之前，冠状病毒仅被认为是人类的次要病原体，约占普通感冒的15-25%。然而，2002年由新型冠状病毒SARS-CoV引起的严重SARS暴发的出现，推动了公共卫生对冠状病毒引起的疾病的警惕。迄今为止，已知有七种人畜共患冠状病毒可引起人类疾病，其中冠状病毒MERS-CoV、SARS-CoV和SARS-CoV-2被确定为导致严重急性呼吸系统综合症的原因。

2019年的冠状病毒病(COVID-19)是由SARS-CoV-2病毒引起的。感染的关键步骤是病毒进入人类宿主细胞时，这是通过病毒颗粒表面的SARS-CoV-2Spike(S)蛋白受体结合域(RBD)与表面受体之间的相互作用实现的人体细胞。因此，识别小分子、抗体（如病毒中和抗体）或其他干扰S受体复合物形成的生物分子可能有助于开发预防或治疗COVID-19的药物。

新冠病毒SARS-CoV-2通过Spike蛋白与宿主ACE2受体结合，介导膜融合和病毒侵入。尽管SARS-CoV-2感染主要表现为呼吸系统症状，但单细胞测序数据表明，在各种人体组织中，尤其是肺和支气管组织中，总体ACE2表达较低。2021年1月8日，西湖大学李旭、黄晶及复旦大学陆路等团队研究发现酪氨酸蛋白激酶受体UFO(AXL)与SARS-CoV-2病毒Spike蛋白的N末端(NTD)存在特异性相互作用。AXL在几乎所有人体器官中广泛表达，在人的肺和支气管上皮组织和细胞中，AXL表达远高于ACE2表达。AXL以不依赖ACE2的方式促进SARS-CoV-2感染人肺上皮细胞，真实的SARS-CoV-2感染检测进一步证实了这种可能的情况。尽管如此，仍需要进一步研究以确定AXL和ACE2是否利用相同的辅因子或参与相似的感染过程，以及是否存在其他受体参与介导病毒入侵，毕竟病毒感染并没有随AXL/ACE2敲降而完全消除。

SARS-CoV-2入侵人体的又一候选受体AXL得到鉴定，其在促进人类呼吸系统的病毒感染中发挥重要作用，表明它是未来临床干预策略的潜在目标；进一步发现和阐明其具体机制，将有效推动新冠病毒诊疗方案的完善和实施。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测S1F-AXL复合物的试剂盒，用于检测刺突蛋白(S1F)与酪氨酸蛋白激酶受体UFO（AXL）之间结合形成的复合物，可以确认刺突蛋白与酪氨酸蛋白激酶受体之间的结合程度，应用于冠状病毒药物、疫苗开发和测试。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种检测S1F-AXL复合物的试剂盒，包含S1F多肽和AXL多肽，以S1F多肽、AXL多肽中的一种作为包被底物；所述S1F多肽和所述AXL多肽中至少一种为具有缀合标签的糖基化多肽，还包括具有微孔的微量滴定板、标记底物标记的抗标签特异性抗体、HRP偶联的二抗、洗涤缓冲液、标记底物反应液、反应终止液。

本发明还提供了一种S1F-AXL复合物，其是由糖基化S1F多肽与哺乳动物的ALX多肽结合后形成的复合物。

作为进一步优选的方案，本发明所述的所述糖基化S1F多肽为哺乳动物细胞表达系统表达的重组糖基化S1F多肽。

作为进一步优选的方案，本发明所述的糖基化S1F多肽为糖基化冠状病毒的刺突蛋白，例如SARS-CoV-2病毒、SARS病毒、MERS病毒等。

作为进一步优选的方案，本发明所述的试剂盒中，所述S1F多肽为哺乳动物细胞表达系统表达的重组糖基化S1F多肽，具有或包含氨基酸序列SEQIDNO：1。

作为进一步优选的方案，本发明所述的试剂盒中，所述AXL多肽为具有或者包含氨基酸序列为SEQIDNO：2或SEQ ID NO：3的多肽片段。

作为进一步优选的方案，本发明所述的试剂盒中，缀合标签为具有Fc区的IgG。

作为进一步优选的方案，本发明所述的试剂盒中，所述标记底物为辣根过氧化物酶；所述标记底物反应液为含有3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的缓冲液；所述反应终止液为0.2M硫酸。

作为进一步优选的方案，本发明所述的试剂盒还包括用于抑制S1F多肽和AXL多肽结合成复合物的抑制剂和测定稀释剂、。

本发明还提供一种利用本发明所述的试剂盒检测S1F-AXL复合物的方法，该方法包括

步骤1：将S1F多肽和AXL多肽中的一种多肽用测定稀释液稀释后用于包被微量滴定板，另一种多肽用于添加到微量滴定板的微孔中以形成S1F-AXL复合物；

步骤2：用洗涤缓冲液洗涤未结合多肽的微孔，然后将微孔进行温育；

步骤3：用标记底物标记抗标签特异性抗体，将被标记的抗标签特异性抗体递送到孔中；

步骤4：将孔温育预设时间以允许抗标签特异性抗体递送至与步骤一种形成的复合物结合；

步骤5：检测与固定在微量滴定板上的复合物结合的抗标签特异性抗体上的标记的信号特征，从而检测出S1F多肽与AXL多肽结合程度。

一种冠状病毒抑制剂的筛选方法，包括

步骤1：将冠状病毒的S1F多肽和AXL多肽中的一种多肽用测定稀释液稀释后用于包被微量滴定板，另一种多肽用于添加到微量滴定板的微孔中以形成S1F-AXL复合物；

步骤5：检测与固定在微量滴定板上的复合物结合的抗标签特异性抗体上的标记的信号特征，从而检测出S1F多肽与AXL多肽的复合物；

步骤6：将可疑S1F-AXL结合抑制剂添加到微量滴定板的微孔中，然后重复上述步骤1-步骤5，检测存在可疑S1F-AXL结合抑制剂时标记的信号特征，并与步骤5的信号强度进行对比，信号强度降低的程度表示可疑S1F-AXL结合抑制剂对S1F-AXL结合的抑制程度。

作为进一步优选的方案，本发明所述的筛选方法中，所述可疑S1F-AXL结合抑制剂为小分子、抗体或多肽中的一种或以上。

本发明所述的试剂盒在检测冠状病毒、筛选抑制冠状病毒的药物和疫苗中的应用。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1．通过本发明所述的S1F-AXL复合物可以确认刺突蛋白与酪氨酸蛋白激酶受体之间的结合程度，应用于冠状病毒药物、疫苗开发和测试。

2．本发明所述的检测S1F-AXL复合物的试剂盒可以用于检测S1F-AXL结合的亲和力；在可以抑制剂存在的情况下，也可用于检测S1F-AXL复合物的抑制剂，还可以用于检测来自怀疑感染了SARS-CoV-2(Covid-19)的受试者的生物样品中的病毒。

3．本发明所述的试剂盒结合体外酶联免疫吸附测定可以同时测量多种试剂，例如，该试剂盒可用于筛选抑制剂活性和药物、疫苗开发和测试潜在的治疗性抗体。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1所提供的检测方法的原理示意图；

图2为实施例2所提供的检测方法的原理示意图；

图3为以不同浓度加入固定化S1F多肽（蛋白）对S1F-AXL结合的影响结果；

图4为以不同浓度加入固定化AXL多肽（蛋白）对S1F-AXL结合的影响结果；

图5为S1F-AXL结合测定中去糖基化的S1F对S1F-AXL结合的影响结果；

图6为不同的糖苷酶处理糖基化的S1F对S1F-AXL结合的影响结果；

图7为不同糖苷酶处理糖基化AXL对S1F-AXL结合的影响结果；

图8为AXL去糖基化对S1F-AXL 结合的影响结果；

图9为加入AXL抑制剂（Bemcentinib）对S1F-AXL结合的影响。

具体实施方式

在本发明中，除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。“……一种或多种”是指从所列组合中选取其中的一种或多种，并不是对数量的限制。

除非另有说明，本发明实施方案中所技术均属于采用本领域技术内现有的医学、有机化学、生物化学、分子生物学、药理学等技术。

本发明所述的“冠状病毒”包括但不限于SARS-CoV-2病毒，俗称新冠病毒，还可以包括例如SARS病毒、MERS病毒等。

本发明所出现的“样本”、“生物样本”等均是值源自血液，优选外周血（或循环血）的样本。

本发明所出现的复合物是指一种多肽分子与另一种多肽分子之间通过非共价相互作用结合而成。

本发明所述的S1F-AXL复合物，其是由糖基化刺突蛋白（S1F）多肽与哺乳动物的酪氨酸蛋白激酶受体（ALX）多肽结合后形成的复合物。具体的，本发明所述的糖基化S1F多肽为哺乳动物细胞表达系统表达的重组糖基化S1F多肽，尤其是来源于糖基化冠状病毒的刺突蛋白。优选为SARS-CoV-2病毒的刺突蛋白。

在本发明中，所述的糖基化S1F多肽具有氨基酸序列SEQIDNO：1，也可以是包含氨基酸序列SEQIDNO：1的多肽片段。所述的ALX多肽为具有氨基酸序列SEQIDNO：2或SEQ IDNO：3的多肽，也可以是包含氨基酸序列SEQIDNO：2或SEQ ID NO：3的多肽片段。

进一步的，本发明还提供了一种检测S1F-AXL复合物的试剂盒，通过测量标记的信号特征，检测S1F-AXL复合物的结合亲和力，还可以用于检测来自怀疑感染了SARS-CoV-2(Covid-19)的受试者的生物样品中的病毒。具体方案如下：

一种检测S1F-AXL复合物的试剂盒，包含S1F多肽和AXL多肽，以S1F多肽、AXL多肽中的一种作为包被底物；所述S1F多肽和所述AXL多肽中至少一种为具有缀合标签的糖基化多肽，还包括具有微孔的微量滴定板、标记底物标记的抗标签特异性抗体、HRP偶联的二抗、洗涤缓冲液、标记底物反应液、反应终止液。在具体的实施中，所述S1F多肽与AXL多肽其中一种为糖基化多肽，也可以两种都是糖基化多肽，这两种多肽中，可以是在S1F多肽上缀合标签，也可是在AXL多肽上缀合标签。所述缀合标签优选但不限于具有Fc区的IgG，其中“Fc区”可以结合许多效应分子和其他蛋白质，包括提供体液免疫应答和细胞介导的效应系统之间联系的细胞Fe受体，Fc1受体对IgG分子具有特异性，包括Fc3RI，Fc3RIIa，Fc3RIIb和Fc3RIII。当S1F多肽固定在微孔表面时，抗标签特异性抗体为抗AXL抗体；当AXL多肽固定在微孔表面时，抗标签特异性抗体为抗S1F抗体。

作为进一步优选的方案，本发明所述的试剂盒还包括具有微孔的微量滴定板、标记底物标记的抗标签特异性抗体、HRP偶联的二抗、洗涤缓冲液、测定稀释剂、标记底物反应液、反应终止液。

作为进一步优选的方案，本发明所述的试剂盒中，所述S1F多肽为哺乳动物细胞表达系统表达的重组糖基化S1F多肽，具有或包含氨基酸序列SEQIDNO：1。所述AXL多肽为具有或者包含氨基酸序列SEQIDNO：2或SEQ ID NO：3的多肽片段。

作为进一步优选的方案，本发明所述的试剂盒还包括用于抑制S1F多肽和AXL多肽结合成复合物的抑制剂。

一种冠状病毒抑制剂的筛选方法，包括

作为进一步优选的方案，本发明所述的筛选方法中，所述可疑S1F-AXL结合抑制剂为小分子、抗体或多肽中的一种或以上。其中“小分子”是指分子量小于约2kDa的有机化合物；“多肽”是指氨基酸的任何聚合物链；“抗体”是指与另一分子的特定空间和极性组织特异性结合并因此被定义为与另一分子的特定空间和极性组织互补的免疫球蛋白，可以是单克隆抗体，多克隆抗体或重组抗体，

以下是本发明具体的实施例。

实施例1

采用COVID-19SIF-AXL结合测定试剂盒测定SIF-AXL的结合，包括包被有重组表达的AXL的96孔板，其中AXL具有SEQIDNO：2氨基序列，然后加入标记有IgG Fc区的重组人S1F蛋白，其中S1F蛋白具有SEQIDNO：1氨基序列，通过洗涤去除未结合的S1F，并添加与S1F-AXL复合物的S1F组分结合的小鼠抗S1F抗体，然后在3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)底物的情况下将HRP偶联的抗小鼠IgG加入孔中，并与TMB溶液反应产生蓝色，其强度与结合的S1F量成正比。HRP-TMB反应在加入终止溶液后停止，导致颜色从蓝色变为黄色。然后在450nm处测量黄色的强度；反应过程参见图1。

其中试剂盒的具体组成如下

1.微孔板：用重组AXL多肽包被；

2.洗涤缓冲液：用于洗涤微孔；

3.测定稀释剂：用于稀释“测试试剂”（即潜在抑制剂）、AXL蛋白（项目F）、检测抗体和HRP偶联的IgG浓缩物；

4.COVID-19SpikeS1F蛋白；

5.检测抗体AXL；

6.HRP标记的抗小鼠IgG；

7.TMB底物溶液；

8.终止液。

实施例2

采用COVID-19SIF-AXL结合测定试剂盒测定SIF-AXL的结合，包括有重组表达具有SEQIDNO：1氨基序列的S1F的96孔板。然后在重组人AXL蛋白存在的情况下将选择的测试试剂加入孔中，其中AXL具有SEQIDNO：3氨基序列，洗涤去除未结合的AXL，并添加与Spike-AXL复合物结合的山羊抗AXL抗体。然后在3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物存在的情况下，将HRP偶联的抗山羊IgG应用到孔中。HRP偶联的抗山羊IgG与AXL抗体结合并与TMB溶液反应，产生与AXL结合量成正比的蓝色。HRP-TMB反应在加入终止溶液后停止，导致颜色从蓝色变为黄色。然后在450nm处测量黄色的强度。反应过程参见图2。

其中试剂盒的具体组成如下

1.微孔板：用重组COVID-19S1F结构域包被；

2.洗涤缓冲液：用于洗涤微孔；

4.COVID-19SpikeS1F蛋白；

5.检测抗体AXL；

6.HRP标记的抗小鼠IgG；

7.TMB底物溶液；

8.终止液。

实施例3

为了了解不同浓度加入固定化S1F蛋白与检测信号之间的关系，进行AXL-S1F结合检测的实验：使用AXL-his蛋白（125ng/ml）包被微量滴定板的孔，制备平板后，将不同浓度的S1F-his蛋白加入孔中（从250ng/ml开始连续稀释至7.8ng/ml）并在室温下孵育1小时；洗涤后，加入mAB（RaybiotechCat#130-10868，1:5000稀释）并孵育一小时，然后洗涤并添加小鼠二抗（1:5000稀释）；加入TMB并孵育30分钟，然后测量450nm处的吸光度；相对于S1F蛋白质空白对照（即没有S1F）计算倍数变化，如图3所示。

实施例4

为了了解不同浓度加入固定化AXL蛋白与检测信号之间的关系，进行AXL-S1F结合检测的实验：

使用S1F-his蛋白（125ng/ml）包被微量滴定板的孔；制备平板后，将不同浓度的AXL-his蛋白加入平板中（从250ng/ml开始连续稀释至7.8ng/ml），并在室温下孵育1小时。洗涤后，加入mAB（R&D；Cat#MAB3870，1:1000稀释）并孵育一小时，然后洗涤并添加小鼠二抗（1:5000稀释）。加入TMB并孵育30分钟，然后测量450nm处的吸光度。相对于AXL蛋白质空白对照（无S1F）计算倍数变化，如图4所示。

实施例5

本实施例用于进行实验的重组SARS-CoV-2S蛋白为人HEK293T培养细胞表达的重组SARS-CoV-2S蛋白，本实施例所涉及的去糖基化处理指的是PNGaseF，O-糖苷酶，α2-3、6、8、9神经氨酸酶A，β1-4个半乳糖苷酶S，β-N-乙酰基己糖胺和EndoHF。在该实施例中具体包括3个对比实验。

对比实验（1）：在经去糖基化处理的S1F包被96孔微量滴定板，向不同的微量滴定板中分别加上未经糖基化处理的AXL，进行AXL/S1F结合反应，结果参见图5。

对比实验（2）：为了进一步研究哪些聚糖键在AXL与S1F结合中起作用，用特异性靶向不同糖基化键的去糖基化酶处理了S1F。利用使用不同的去糖基化酶处理S1F蛋白，所采用的去糖基化酶包括：PNGaseF，O-糖苷酶，α2-3、6、8、9神经氨酸酶A，β1-4个半乳糖苷酶S，β-N-乙酰基己糖胺和EndoHF。将未去糖基化经处理和利用不同的去糖化酶进行去糖基化的S1F蛋白分别包被在不同的96孔板上。将AXL蛋白加入上述96孔板的孔中，并使用抗AXL抗体和HRP偶联的二抗检测结合的AXL蛋白，结果参见图6。

对比实验（3）：为了进一步研究哪些聚糖键在AXL与S1F结合中起作用，用特异性靶向不同糖基化键的去糖基化酶处理了AXL。利用使用不同的去糖基化酶处理AXL蛋白，所采用的去糖基化酶包括：PNGaseF，O-糖苷酶，α2-3、6、8、9神经氨酸酶A，β1-4个半乳糖苷酶S，β-N-乙酰基己糖胺和EndoHF。将未去糖基化经处理和利用不同的去糖化酶进行去糖基化的AXL蛋白分别包被在不同的96孔板上。将S1F蛋白加入上述96孔板的孔中，并使用抗S1F抗体和HRP偶联的二抗检测结合的S1F蛋白，结果参见图7。

实验结果如下：

如图5所示，对比实验（1）中，使用去糖基化的S1F蛋白包被的96孔板中，随着AXL蛋白（包括未经去糖基化处理以及经过去糖基化处理的AXL）的加入，检测到AXL/S1F的结合信号值相比起未去糖基化S1F的结合抑制率的降低。另一方面，由图3也可以说明，S1F的去糖基化对AXL/S1F结合的影响极大。综上，S1F蛋白糖基化对于AXL/S1F的结合是必不可少的。

如图6所示，对比实验（2）中在参试的去糖化酶中，O-糖苷酶，α2-3、6、8、9神经氨酸酶A，β1-4个半乳糖苷酶S，β-N-乙酰基己糖胺和EndoHF能显著降低AXL与S1F的结合亲和力。由此说明S1F蛋白的糖基化对于AXL/S1F的结合必不可少。

如图7所示，对比实验（3）中在参试的去糖化酶中，PNGase酶处理切割S1F中，O-糖苷酶和EndoHF能显着降低AXL与S1F的结合亲和力。由此说明AXL蛋白的糖基化对于AXL/S1F的结合必不可少。

实施例6

在该实施例中，为了了解AXL去糖基化对S1F-AXL结合的影响，用S1F蛋白(125ng/ml)包被微量滴定孔。加入不同浓度的嵌合AXL-Fc-H6蛋白（CatNo.154-AL（R&DSystems，明尼苏达州）（糖基化或去糖基化）并孵育1.5小时，然后在1:2000(1mg/ml)并以1:5000添加小鼠IgG二级。添加TMB和终止溶液后测量OD450。结果参见图8。

实施例7

在该实施例中，为了了解AXL抑制剂（Bemcentinib）对S1F-AXL结合的影响，将S1F蛋白(125ng/ml)包被微量滴定孔,加入AXL及AXL抑制剂孵育1.5小时，然后加入HRP标记的二抗，添加TMB和终止溶液后测量OD450。结果参见图9。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

序列表

<110> 瑞博奥（广州）生物科技股份有限公司

<120> 一种S1F-AXL复合物、试剂盒和检测该复合物的方法及应用

<130> 2021.07.13

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1273

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

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20 25 30

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50 55 60

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr

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Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

165 170 175

Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe

180 185 190

Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr

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Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu

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Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr

225 230 235 240

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245 250 255

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Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala

275 280 285

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290 295 300

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340 345 350

Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu

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Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

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Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys

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565 570 575

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595 600 605

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725 730 735

Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu

740 745 750

Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr

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Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln

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Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly

820 825 830

Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp

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Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu

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Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile

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225 230

Claims

1.一种检测S1F-AXL复合物的试剂盒，其特征在于，包含S1F（刺突蛋白）多肽和AXL（酪氨酸蛋白激酶受体）多肽，以S1F多肽、AXL多肽中的一种作为包被底物；所述S1F多肽和所述AXL多肽中至少一种为具有缀合标签的糖基化多肽，还包括具有微孔的微量滴定板、标记底物标记的抗标签特异性抗体、HRP偶联的二抗、洗涤缓冲液、标记底物反应液、反应终止液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述S1F多肽为哺乳动物细胞表达系统表达的重组糖基化S1F多肽，具有或包含氨基酸序列SEQIDNO：1。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述AXL多肽为具有或者包含氨基酸序列为SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的多肽片段。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述缀合标签为具有Fc区的IgG，所述Fc区具有氨基酸序列SEQIDNO：4。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述标记底物为辣根过氧化物酶；所述标记底物反应液为含有3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的缓冲液；所述反应终止液为0.2M硫酸。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于抑制S1F多肽和AXL多肽结合成复合物的抑制剂和测定稀释剂。

7.一种冠状病毒抑制剂的筛选方法，其特征在于，包括

8.根据权利要求7所述的筛选方法，其特征在于，所述可疑S1F-AXL结合抑制剂为小分子、抗体或多肽中的一种或两种以上。

9.一种如权利要求1-6所述的试剂盒在筛选抑制冠状病毒的药物和疫苗中的应用。