TW202223393A - 診斷及治療嚴重特殊傳染性肺炎covid-19的組成物及方法 - Google Patents
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Abstract
本揭露提供一種用於診斷及治療COVID-19的方法及組成物,其中,該COVID-19為一種由SARS-CoV-2感染所引起的疾病。更具體地說,本揭露進一步提供一種與SARS-CoV-2結合的胜肽用於作為診斷及治療的組成物,以用於診斷、治療及預防感染COVID-19或有感染COVID-19危險的個體。
Description
本揭露涉及分子生物學、蛋白質化學、免疫化學和藥理學領域,描述了用於診斷及治療嚴重特殊傳染性肺炎(COVID-19)的方法及組成物,其為由嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2型(SARS-CoV-2)感染所引起的疾病。
嚴重特殊傳染性肺炎(COVID-19)為由嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2型(SARS-CoV-2)所引起的傳染病。自2019年12月在中國湖北武漢首次發現以來,該疾病已引起全球大流行。世界衛生組織(WHO)於2020年1月30日宣布COVID-19爆發為國際關注的突發公共衛生事件(PHEIC),並於2020年3月11日宣佈為大流行病。截至2020年9月,已報告的病例超過2,910萬例,遍布188個國家和地區,死亡人數超過927,000人。
為有效遏制大流行病,準確和快速的診斷對於儘早識別患者以進行隔離很重要。標準的診斷方法為透過鼻咽拭子的即時反轉錄聚合酶鏈鎖反應(rRT-PCR)。然而,透過rRT-PCR進行檢測涉及核酸萃取和基因擴增等程序,需要訓練有素的人員、特定的化學用品和昂貴的儀器,通常僅在提供常規、集中服務的實驗室中才可進行,並且需要數小時才能提供結果。這限制可進行的
測試的數量,尤其是在發展中國家。此外,由於程序複雜,rRT-PCR的準確性會受到核酸萃取過程中樣品損失或聚合酶合成效率的影響。因此,亟需一種更快且易於管理的診斷COVID-19的方法。
此外,目前還沒有針對COVID-19的有效治療方法。針對COVID-19的有效治療或預防措施仍是全世界科學家和研究人員的共同目標。
本揭露涉及Teneurin-2(TENM2)多肽及其片段,其作為用於檢測COVID-19和鑑定感染SARS-CoV-2的受試者的診斷分子的用途。本揭露還涉及Teneurin-2(TENM2)多肽及其片段,其作為治療COVID-19的組成物的用途。另一方面,本揭露涉及使用Teneurin-2(TENM2)多肽及其片段預防SARS-CoV-2感染。
因此,本揭露提供一種方法,其用於檢測和診斷COVID-19、識別感染SARS-CoV-2的受試者、治療COVID-19和預防由SARS-CoV-2引起的感染從而預防COVID-19。
根據本揭露的方法,本揭露提供一種非天然多肽,其包含Teneurin-2(TENM2)片段。
在至少一個實施例中,本揭露中用於在有其需要的受試者中檢測SARS-CoV-2的方法包括:提供一生物樣品,其來自該受試者;使一非天然多肽與該生物樣品接觸,其中,該非天然多肽包括Teneurin-2(TENM2)片段;以及檢測該非天然多肽的結合活性。在至少一個實施例中,該非天然多肽包括TENM2的胞外域或其片段。在至少一個實施例中,TENM2的胞外域具有SEQ ID NO:6的胺基酸序列。在至少一個實施例中,該非天然多肽與TENM2的胞外域
具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性。
在至少一個實施例中,TENM2胞外域的片段包含至少一個選自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的胺基酸序列或其任何組合。在至少一個實施例中,TENM2胞外域的片段包含一種胜肽,其與SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性,且顯示出對SARS-CoV-2刺突蛋白受體結合域的結合活性。在至少一個實施例中,TENM2胞外域的片段具有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16的胺基酸序列。在至少一個實施例中,該非天然多肽與SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性。
在至少一個實施例中,該非天然多肽的長度為7個胺基酸至2,000個胺基酸。在至少一個實施例中,該非天然多肽由10至120個胺基酸、10至150個胺基酸、10至200個胺基酸、20至120個胺基酸、20至150個胺基酸、20至200個胺基酸、30至160個胺基酸、30至180個胺基酸或30至200個胺基酸所組成。在至少一個實施例中,該非天然多肽由60至150個胺基酸或60至120個胺基酸組成。在至少一個實施例中,該非天然多肽由90至120個胺基酸組成。
在至少一個實施例中,用於在有其需要的受試者中檢測SARS-CoV-2的方法包括:提供一生物樣品,其來自該受試者;使一非天然多肽與該生物樣品接觸,其中,該非天然多肽包括Teneurin-2(TENM2)片段;透過電化學阻抗譜、免疫測定、反免疫電泳、放射免疫測定、放射免疫沉澱測定、酶聯免疫吸附測定、斑點印跡測定、競爭抑制測定和夾心測定中的至少一種檢測該非天然多肽與SARS-CoV-2之間的相互作用。在至少一個實施例中,檢測TENM2與SARS-CoV-2的結合活性涉及將包含Teneurin-2(TENM2)片段的非天然多肽固定到鈀奈米薄膜聚對苯二甲酸乙二醇酯(Pd NTF-PET)。
在至少一個實施例中,檢測SARS-CoV-2的方法中的生物樣品為鼻分泌物、呼吸道分泌物、糞便樣品或血液樣品。
另一方面,本揭露進一步提供一種用於檢測SARS-CoV-2的試劑盒。在至少一個實施例中,該試劑盒包含一非天然多肽,其包含用於結合SARS-CoV-2的Teneurin-2(TENM2)片段。在至少一個實施例中,該試劑盒還包括用於檢測TENM2片段與SARS-CoV-2之間結合活性的試劑。在至少一個實施例中,試劑盒中提供的非天然多肽包括TENM2的胞外域或其片段。在至少一個實施例中,非天然多肽與TENM2的胞外域具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性。在至少一個實施例中,TENM2胞外域的片段包含至少一個選自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的胺基酸序列,或其任何組合。在至少一個實施例中,TENM2胞外域的片段包含與SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少
90%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性,並顯示出對SARS-CoV-2的刺突蛋白受體結合域的結合活性。在至少一個實施例中,TENM2胞外域的片段具有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16的胺基酸序列。在至少一個實施例中,非天然多肽與SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16具有至少75%、至少80%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性。
另一方面,本揭露提供一種非天然多肽,其包含Teneurin-2(TENM2)片段,且該Teneurin-2(TENM2)片段與SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16具有至少75%的序列同一性。在至少一個實施例中,非天然多肽與SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16具有至少75%、至少80%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性。本揭露還提供一種藥物組成物,其包含非天然多肽及其藥學上可接受的載體。
本揭露的另一方面還提供上述非天然多肽在預防SARS-CoV-2感染中的用途。
透過閱讀以下實施例的描述並參考附圖,可以更全面地理解本揭露。
圖1顯示用於篩選與SARS-CoV-2刺突蛋白的受體結合域(RBD)結合的胜肽的平台和步驟。
圖2說明透過基於電化學阻抗譜(EIS)的生物感測平台對SARS-CoV-2與候選SARS-CoV-2結合胜肽之間的結合測試,其中,候選SARS-CoV-2結合胜肽固定於聚對苯二甲酸乙二醇酯(Pd NTF-PET)基材的鈀奈米薄膜上。
圖3顯示在不同濃度SARS-CoV-2刺突蛋白下SARS-CoV-2與T2胜肽結合的結果。y軸上的△Rct比值為EIS生物感測平台採集的阻抗讀數,表明SARS-CoV-2刺突蛋白與T2胜肽之間的結合。
圖4顯示用於檢測SARS-CoV-2偽病毒的T2胜肽的西方墨點分析。
圖5顯示加入SARS-CoV-2偽病毒後,螢光素酶活性的量作為OECM1細胞中SARS-CoV-2偽病毒水平的指標,在沒有或不同量的結合胜肽T2的情況下培育。
以下藉由特定的具體實施例說明本揭露的實施方式。基於說明書所揭示的內容,本領域技術人員可輕易地瞭解本揭露的優點及功效。本揭露亦可藉由其它不同的實施方式加以施行或應用。本說明書中的各項細節亦可基於不同觀點與應用,在不悖離本揭露所揭示的範圍下賦予不同的修飾與變更。
在此使用的包括描述性或技術性術語在內的所有術語都應被解釋為具有對本領域技術人員而言顯而易見的含義。然而,根據本領域技術人員的意圖、案例先例或新技術的出現,此些術語可能具有不同的含義。此外,申請
人可以任意選擇一些術語,在這種情況下,將在本揭露的描述中詳細描述所選擇的術語的含義。因此,在此使用的術語必須基於術語的含義以及貫穿整個說明書的描述來定義。
進一步注意,如在本揭露中使用的,單數形式「一(a)」、「一(an)」和「該(the)」除非明確地限於一個指代物,否則包括複數指代物。除非上下文另有明確指示,否則術語「或」與術語「及/或」可互換使用。
此外,當一個部件「包括(comprises)」或「包含(includes)」一個部件或一個步驟時,除非有與之相反的特定描述,該部件還可以包括其他部件或其他步驟,不排除其他部件或其他步驟。
如本文中所使用,關於一個或多個元素的列表的短語「至少一個(at least one)」應理解為意指選自元素列表中的任何一個或多個元素的至少一個元素,但不一定包括元素列表中列出的每個元素中的至少一個,並且不排除元素列表中元素的任何組合。該定義還允許除了短語「至少一個(at least one)」所指的元素列表中標識的元素之外的元素可以選擇地存在,無論與那些標識的元素相關或不相關。因此,作為非限制性示例,「A和B中的至少一個」(或等同地,「A或B中的至少一個」,或等同地,「A及/或B中的至少一個」)在一個實施例中,可以是指至少一種,任選地包括多於一個,A,不存在B(並且任選地包括除B之外的元素);在另一個實施例中,至少一個,任選地包括多於一個,B,不存在A(並且任選地包括除A之外的元素);在又一個實施例中,至少一個,可選地包括多於一個,A,和至少一個,可選地包括多於一個,B(和可選地包括其他元素)。
本文中端點引用的數字範圍包括包含在該範圍內的所有數字和分數(例如,1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.90、4和5)。還應理解的是,假定
其所有數字和分數都被術語「約(about)」修飾。術語「約」是指所提及的數字的正負0.1%至50%、5%至50%、10%至40%、10%至20%或10%至15%。
本文所使用的術語「胜肽(peptide)」是指含有一種以上胺基酸單體的短鏈,其中一種以上胺基酸單體透過醯胺鍵相互連接。需要說明的是,本揭露胜肽中使用的胺基酸單體不限於天然胺基酸,胜肽的胺基酸序列還可以包括非天然胺基酸、結構相似的化合物或缺乏胺基酸。
術語「多肽(polypeptide)」和「胜肽(peptide)」在本文中可互換使用,以指任何長度的胺基酸的聚合物。聚合物可以是線性的或分支的,其可包含修飾的胺基酸,並且可以被非胺基酸中斷。該術語還包括已被修飾的胺基酸聚合物,例如,二硫鍵形成、醣基化、脂化、乙醯化、磷酸化或任何其他修飾,例如與標記組分結合(conjugation)。多肽可以從天然來源分離,也可以透過重組技術從真核或原核宿主產生,或者可以是合成過程的產物。
可以理解的是,多肽可能具有有限數量的變化或修飾,這些變化或修飾可以在多肽的某個部分進行,與其活性或功能無關,但仍會產生具有可接受水平的等效或相似生物活性或功能的變體。術語「可接受的水平(acceptable level)」可以是指在標準中測試的參考蛋白質水平的至少20%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%本領域已知的測定。因此,生物功能變體多肽在本文中定義為其中某些胺基酸殘基可以被取代的那些多肽。可根據本揭露內容製備和使用具有不同取代的多肽。可以在這些多肽的結構中進行修飾和改變,並且仍然獲得具有相似功能的分子。例如,某些胺基酸可以被胜肽/多肽結構中的其他胺基酸取代而沒有明顯的活性損失。可以根據本領域普通技術人員已知的改變多肽序列的方法製備變體,例如在編纂此類方法的參考文獻中發現的那些,例如「分子選殖:實驗室手冊」,J.Sambrook等編輯,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New
York,1989。例如,胺基酸的保守置換包括在以下組中的胺基酸之間進行的置換:(i)Ala、Gly;(ii)Ser、Thr;(iii)Gln、Asn;(iv)Glu、Asp;(v)Met、Ile、Leu、Val;(vi)Phe、Tyr、Trp;(vii)Lys、Arg、His。
本文所使用的胜肽可以從多種來源分離,例如從人類組織類型或其他來源,或透過重組或合成方法,或透過這些和類似技術的任何組合來製備。胜肽變體包括胜肽,其包含與天然胜肽的胺基酸序列充分相同或源自天然胜肽的胺基酸序列,其中,該天然胜肽包括比天然胜肽少的胺基酸。胜肽的部分或片段可以是例如3至5、8至10、10、15、15至20、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、150、200、300或更多個胺基酸的長度的胜肽。多肽區域缺失的部分或片段可透過重組技術製備,並且可以評估一種或多種功能活性,例如形成對胜肽具有特異性的抗體的能力。胜肽的部分或片段可包含天然胜肽的結構域或這種結構域的部分或片段。
如本文中所使用,術語「序列同一性(sequence identity)」或例如包含「具有80%序列同一性的序列」,如本文中所使用,是指序列在逐個核苷酸的基礎上或胺基酸上相同的程度,如在一個比較窗口中逐個胺基酸的基礎。因此,「序列同一性百分比」可以透過在比較窗口內比較兩個最佳比對序列,確定相同核酸鹼基(例如,A、T、C、G、I)或相同的胺基酸殘基(例如,Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)出現在兩個序列產生匹配位置的數量,將匹配位置的數量除以比較窗口中的位置總數(即窗口大小),並將結果乘以100以產生序列同一性的百分比。包括與本文所述的任何參考序列具有至少約80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%序列同一性的核苷酸和多肽(參見例如序列表),通常其中多肽變體保持參考多肽的至少一種生物學活性或功能。
術語「檢測(detect)」、「檢測(detecting)」或「檢測(detection)」包括測定或以其他方式確定靶分子、蛋白質結構域、亞基或試劑結合靶的組合等的存在或不存在。
術語「受試者(subject)」、「患者(patient)」和「個體(individual)」在本文中可互換使用,是指溫血動物,例如患有或懷疑患有、有風險或易患以下疾病的哺乳動物,或正在篩檢病毒感染,包括實際或疑似SARS-CoV-2感染。這些術語包括但不限於家養動物、運動動物、靈長類動物和人類。例如,此術語指的是人。
術語「生物樣品(biological sample)」是指待透過本文所述的任何方法分析的樣品,其可為從待檢測的受試者獲得的任何類型的樣品。本文使用的生物樣品包括但不限於:鼻涕、呼吸道分泌物、血液、血清、血漿、尿液、痰、唾液、腦脊液、間質液、黏液、汗液、糞便萃取物、糞便、滑膜液體、眼淚、精液、腹膜液、乳頭抽吸物、乳汁、陰道液或其任何組合。在一些實施例中,血液樣品可以是全血或其部分,例如血清或血漿,肝素化或經EDTA處理以避免血液凝固。
如本文中所使用,術語「療法(therapies)」和「療法(therapy)」可指可用於治療的任何方案、方法、組成物、製劑及/或藥劑,其用於預防或治療疾病或與之相關的症狀。在至少一個實施例中,術語「療法(therapies)」和「療法(therapy)」是指生物療法、支持療法及/或其他可用於預防或治療所屬技術領域中具有通常知識者已知的疾病或與其相關的症狀的療法。
術語「治療(treatment)」、「治療(treat)」和「治療(treating)」是指逆轉、減輕、延遲本文所述疾病的發作或抑制其進展。在一些實施例中,治療可以在疾病的一種或多種體徵或症狀已經發展或已經被觀察
到之後進行。在其他實施例中,治療可以在不存在疾病的體徵或症狀的情況下進行。例如,可以在症狀出現之前(例如,根據症狀史及/或根據暴露於病原體)對易感對象施用治療以延遲或預防疾病發生。在症狀消失後也可以繼續治療,例如,延遲或預防復發。
如本文中所使用,術語「預防(preventing)」或「預防(prevention)」是指對疾病或疾病症狀或病症的預防或避免措施,包括但不限於向患有以下疾病的受試者施用或投予一種或多種活性劑,亦包括尚未被診斷為患有該疾病或該疾病的症狀或狀況但可能易感或易患該疾病的患者。預防措施用於避免、預防或推遲疾病的發生或疾病的症狀或狀況。
本文提供的試劑盒採用合適的包裝。合適的包裝包括但不限於小瓶、瓶子、廣口瓶、軟包裝等。還考慮了與醫療裝置例如吸入器、鼻給藥裝置或輸液裝置結合使用的包裝。試劑盒可以具有無菌接入端口(例如,容器可以是靜脈內溶液袋或具有可被皮下注射針刺穿的塞子的小瓶)。容器還可具有無菌存取口。試劑盒可以選擇性地提供附加組件,例如緩衝液和解釋性資訊。一般而言,試劑盒包括容器和在容器上或與容器相關聯的標籤或仿單。在一些實施例中,本揭露提供包含上述試劑盒的內容物的製品。
如本文中所使用,術語「藥物組成物(pharmaceutical composition)」或「藥物組合(pharmaceutical combination)」可以根據本領域已知的用於製造藥物的任何方法來製備。這種組成物或組合可包含甜味劑、調味劑、著色劑和防腐劑。製劑可以與適合製造的無毒藥學上可接受的賦形劑混合。非限制性製劑可以包含一種或多種稀釋劑、乳化劑、防腐劑、緩衝劑、賦形劑等,並且可以以諸如液體、粉末、乳液、凍乾粉劑、噴霧劑、霜劑、洗劑、控釋製劑、片劑、丸劑、凝膠劑、錠劑、小包、錠劑、酏劑(elixir)、混
懸劑、溶液、糖漿、軟和硬明膠膠囊、栓劑、無菌注射液、包裝粉末、貼劑、植入物等。
如本文中所使用,藥學上可接受的載體,包括緩衝劑,是本領域眾所周知的,並且可以包括磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸;抗氧化劑,包括抗壞血酸和蛋胺酸;防腐劑;低分子量多肽;蛋白質,例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白;胺基酸;疏水聚合物;單醣;雙醣;和其他碳水化合物;金屬複合物;生理鹽水;無菌水;等滲劑;及/或非離子表面活性劑。參見,例如,Remington:The Science and Practice of Pharmacy第20版(2000)Lippincott Williams和Wilkins,Ed.K.E.Hoover。
實施例
已透過許多示例來說明本揭露。以下實施例不應限制本揭露的範圍。
實施例1:篩選與SARS-CoV-2刺突蛋白受體結合域結合的胜肽
為了篩選與SARS-CoV-2刺突蛋白(SARS-CoV-2刺突蛋白RBD)的受體結合域(RBD)結合的胜肽,採用了一種名為噬菌體展示的技術。噬菌體展示是一種從人工隨機胜肽庫中快速發現與靶蛋白結合的新型胜肽的技術。這裡使用的噬菌體庫包括隨機排列的12個胺基酸的胜肽片段,其來自新英格蘭生物實驗室公司。
如圖1所示,SARS-CoV-2刺突蛋白RBD首先由大腸桿菌表現並純化,在室溫下固定在酵素連結免疫吸附分析(ELISA)盤上2至3小時。然後,將含有人工隨機胜肽集合的噬菌體庫混合物加入塗有SARS-CoV-2刺突蛋白RBD
的ELISA盤。噬菌體庫混合物滴度達到107至108個噬菌體/mL。噬菌體和刺突蛋白RBD在4℃下淘選12小時後,將多餘的噬菌體混合物從盤孔中丟棄,每個盤孔以磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)加0.1% Tween 20洗滌。重複洗滌程序3次。然後,與刺突蛋白RBD結合的噬菌體以0.5M甘胺酸緩衝液從每個盤孔中洗提。隨後,將洗提的噬菌體與大腸桿菌XL1藍(OD600約0.5)混合,於37℃培育8小時。然後,將大腸桿菌細胞離心,並以1.5倍體積的2%聚乙二醇(PEG)600加250mM氯化鈉緩衝液濃縮細菌培養基。如此獲得的濃縮培養基含有1輪淘選噬菌體。使用獲得的1輪淘選噬菌體再次與固定化刺突蛋白RBD的新ELISA盤結合。重複該過程共3次,得到3輪淘選噬菌體。
最後,以3輪淘選噬菌體的混合物感染大腸桿菌XL1藍並培育3小時。然後,將細菌接種在含有1mM異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和20μg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-GAL)的Luria-Bertani(LB)瓊脂上。培育過夜後,挑取藍色菌落,純化噬菌粒,然後檢查噬菌粒的模式一致性。然後,對噬菌粒進行定序以確認刺突蛋白RBD結合胜肽。
實施例2:SARS-CoV-2刺突蛋白RBD結合胜肽的鑑定
按照上述噬菌體展示方法,展示胜肽的噬菌粒被鑑定為與SARS-CoV-2刺突蛋白RBD結合的胜肽,其中該胜肽具有
(SEQ ID NO:1)的胺基酸序列。在該胜肽片段中,胺基酸序列為TAAATITQSTIP(SEQ ID NO:2)的胜肽片段被鑑定為與SARS-CoV-2刺突蛋白RBD結合的胜肽片段。從這個與SARS-CoV-2刺突蛋白RBD結合的胜肽片段中,具有TITQSTIP(SEQ ID NO:
3)胺基酸序列的胜肽在國家生物技術信息中心(NCBI)網站上針對已知蛋白質比對,發現其與人Teneurin-2蛋白(TENM2)的胞外域的序列片段,即TMTQSTVP(SEQ ID NO:17)具有75%的序列同一性。
基於對TENM2序列保守區域的比較,獲得了其他具有相似胺基酸序列和功能的TENM2片段,包括:
TQIVQESIQIPGSDLHLTYQSSQASGYLSIVRMRLTAETIPPTLTHVHVGVEIEGALHVKTYEADPSLVHTFAWNKRNVYRQKVYGVTVARISVGY(SEQ ID NO:11);
SQVIQESLQIPGTGLNLVYHSSRAAGYLSTIKLQLTPDVIPTSLHLIHLRITIEGILFERIFEADPGIKFTYAWNRLNIYRQRVYGVTTAVVKVGYQY(SEQ ID NO:12);以及
TQVLHEEIELPGSNVKLRYLSSRTAGYKSLLKITMTQSTVPLNLIRVHLMVAVEGHLFQKSFQASPNLAYTFIWDKTDAYGQRVYGLSDAVVSVGF(SEQ ID NO:16)。
實施例3:T2胜肽與SARS-CoV-2刺突蛋白的結合試驗
使用本領域技術人員熟知的細菌蛋白質表現方法,以大腸桿菌表現T2胜肽。然後,純化胜肽,並將其固定在鈀奈米薄膜聚對苯二甲酸乙二醇酯(Pd NTF-PET)上,該薄膜是為電化學阻抗譜(EIS)而開發的,如圖2所示。胜肽被固定在Pd NTF-PET的電極上15分鐘內完成,透過測量與SARS-CoV-2刺突蛋白結合後的阻抗變化,其每次生物傳感靈敏度測試於1μL中低至0.1ng。如圖3所示,透過EIS,T2胜肽在低至0.0001nM的濃度下顯示出與SARS-CoV-2刺突蛋白的結合活性。
圖4顯示使用T2胜肽對抗SARS-CoV-2刺突蛋白RBD的西方墨點結果,表明T2胜肽與刺突蛋白RBD和刺突蛋白RBD的二聚體之間的結合。
實施例4:T2胜肽抑制SARS-CoV-2感染
為了測試T2胜肽對SARS-CoV-2感染的抑制能力,將具有螢光素酶活性的SARS-CoV-2的nCoV-S Luc偽病毒與T2胜肽在不同的相對光單位(RLU)下培育1小時,然後添加到OECM1細胞中。nCoV-S Luc偽病毒來自台灣中央研究院國家RNAi核心設施,該設施使用pCMVdeltaR8.91和pcDNA3.1在偽病毒表面表現S蛋白。偽病毒的進入可以透過轉移載體pLAS2w.FLuc.Ppuro中編碼的螢光素酶所發出的光來識別。
分析了OECM1細胞的螢光素酶活性,其代表了由SARS-CoV-2偽病毒所引起的感染。如圖5所示,與未預先與T2胜肽溫育的偽病毒相比,向5,000和10,000RLU的偽病毒添加T2胜肽顯著抑制OECM1細胞的感染。
雖然以上已經詳細描述本揭露的一些實施例,但熟習此項技藝的人士均可在不違背本揭露的範圍下,對上述實施例進行修飾與改變而基本上不背離本揭露的教導和優點。此類修飾與改變涵蓋於如所附申請專利範圍中所闡述的本揭露的範圍內。
<110> 銀武生醫有限公司(PD BIOMEDICAL CO.,LTD.)
<120> 診斷及治療嚴重特殊傳染性肺炎COVID-19的組成物及方法
<130> 210696US
<150> US 63/088503
<151> 2020-10-07
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 一種設計用於在噬菌體上展示的人工胜肽
<400> 1
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工噬菌體展示胜肽片段
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<213> 人工序列
<220>
<223> 噬菌體展示胜肽片段
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<400> 4
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 設計用於結合靶標的胜肽
<400> 5
<210> 6
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<400> 17
Claims (17)
- 一種檢測SARS-CoV-2的方法,包括:提供一生物樣品,其來自有其需要的受試者;使一非天然多肽與該生物樣品接觸,其中,該非天然多肽包括Teneurin-2(TENM2)片段;以及檢測該非天然多肽的結合活性。
- 如請求項1所述的方法,其中,該非天然多肽包括TENM2的胞外域或其片段。
- 如請求項2所述的方法,其中,該非天然多肽與TENM2的胞外域具有至少75%的序列同一性。
- 如請求項2所述的方法,其中,該TENM2的胞外域具有SEQ ID NO:6的胺基酸序列。
- 如請求項2所述的方法,其中,該TENM2胞外域的片段包含至少一個選自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的胺基酸序列或其任何組合,並顯示出對SARS-CoV-2刺突蛋白受體結合域的結合活性。
- 如請求項2所述的方法,其中,該TENM2胞外域的片段包含一種胜肽,其與SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15具有至少75%序列同一性,且顯示出對SARS-CoV-2刺突蛋白受體結合域的結合活性。
- 如請求項1所述的方法,其中,該非天然多肽與SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16具有至少75%的序列同一性。
- 如請求項7所述的方法,其中,該非天然多肽具有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16的胺基酸序列。
- 如請求項1所述的方法,其中,該非天然多肽由10至200個胺基酸組成。
- 如請求項1所述的方法,其中,該檢測結合活性包括透過電化學阻抗譜、免疫測定、反免疫電泳、放射免疫測定、放射免疫沉澱測定、酶聯免疫吸附測定、斑點印跡測定、競爭抑制測定和夾心測定中的至少一種檢測非天然多肽與SARS-CoV-2之間的相互作用。
- 如請求項1所述的方法,其中,該生物樣品為鼻分泌物、呼吸道分泌物、黏液、糞便或血液。
- 如請求項1所述的方法,其中,該非天然多肽被固定在鈀奈米薄膜聚對苯二甲酸乙二醇酯(Pd NTF-PET)。
- 一種用於檢測樣品中SARS-CoV-2的試劑盒,該試劑盒包含一非天然多肽,其包含用於結合SARS-CoV-2的Teneurin-2(TENM2)片段。
- 如請求項13所述的試劑盒,其中,該非天然多肽包括TENM2的胞外域或其片段。
- 一種非天然多肽,其與SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16具有至少75%序列同一性,並顯示出對SARS-CoV-2刺突蛋白受體結合域的結合活性。
- 一種藥物組成物,其包含如請求項15所述的非天然多肽及其藥學上可接受的載體。
- 一種在有其需要的受試者中預防或治療SARS-CoV-2感染的方法,其包括向該受試者投予如請求項15所述的非天然多肽及其藥學上可接受的載體。
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