RU2444735C1 - Связывающее вещество патологического прионного белка и способ обнаружения патологического прионного белка - Google Patents
Связывающее вещество патологического прионного белка и способ обнаружения патологического прионного белка Download PDFInfo
- Publication number
- RU2444735C1 RU2444735C1 RU2010125235/15A RU2010125235A RU2444735C1 RU 2444735 C1 RU2444735 C1 RU 2444735C1 RU 2010125235/15 A RU2010125235/15 A RU 2010125235/15A RU 2010125235 A RU2010125235 A RU 2010125235A RU 2444735 C1 RU2444735 C1 RU 2444735C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- prion protein
- pathogenic
- isoform
- lactoferrin
- binder
- Prior art date
Links
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 title claims abstract description 291
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 title claims abstract description 291
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 title claims abstract description 90
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 71
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 title description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 241
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 claims abstract description 233
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 claims abstract description 233
- 235000021242 lactoferrin Nutrition 0.000 claims abstract description 114
- 108010063045 Lactoferrin Proteins 0.000 claims abstract description 113
- 102000010445 Lactoferrin Human genes 0.000 claims abstract description 113
- CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N l-phenylalanyl-l-lysyl-l-cysteinyl-l-arginyl-l-arginyl-l-tryptophyl-l-glutaminyl-l-tryptophyl-l-arginyl-l-methionyl-l-lysyl-l-lysyl-l-leucylglycyl-l-alanyl-l-prolyl-l-seryl-l-isoleucyl-l-threonyl-l-cysteinyl-l-valyl-l-arginyl-l-arginyl-l-alanyl-l-phenylal Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N 0.000 claims abstract description 113
- 229940078795 lactoferrin Drugs 0.000 claims abstract description 113
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 5
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 abstract description 40
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 14
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 69
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 56
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 50
- 239000000463 material Substances 0.000 description 34
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 30
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 15
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 12
- 208000024777 Prion disease Diseases 0.000 description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 11
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 10
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 10
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 10
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 10
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 9
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 9
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 9
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 7
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 7
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 7
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 7
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 239000002585 base Substances 0.000 description 3
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 3
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 2
- 208000020406 Creutzfeldt Jacob disease Diseases 0.000 description 2
- 208000003407 Creutzfeldt-Jakob Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 208000010859 Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 208000018756 Variant Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 2
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 2
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000389 anti-prion effect Effects 0.000 description 2
- 208000005881 bovine spongiform encephalopathy Diseases 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 239000012114 Alexa Fluor 647 Substances 0.000 description 1
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101000798100 Bos taurus Lactotransferrin Proteins 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 208000032274 Encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000356 anti-lactoferrin effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 229940072440 bovine lactoferrin Drugs 0.000 description 1
- ZWLQACFYTXLLEJ-UHFFFAOYSA-N butan-1-ol;methanol Chemical compound OC.CCCCO ZWLQACFYTXLLEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- -1 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 235000021277 colostrum Nutrition 0.000 description 1
- 210000003022 colostrum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000010408 film Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 208000010544 human prion disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000007121 neuropathological change Effects 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 208000008864 scrapie Diseases 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/79—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
- C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
- C07K17/08—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
- G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/79—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/28—Neurological disorders
- G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
- G01N2800/2828—Prion diseases
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины. Предложено связывающее вещество патогенной изоформы прионного белка, включающее лактоферрин. Предложены способ обнаружения и способ выделения патогенной изоформы прионного белка, включающие стадию контактирования образца со связующим веществом патогенной изоформы прионного белка и стадию отделения связанного компонента от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, приведенного в контакт с образцом. Способ обнаружения дополнительно включает стадию обнаружения патогенной изоформы прионного белка, содержащейся в компоненте, отделенной от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка. Изобретение обеспечивает быстрые, простые и высокочувствительные способы обнаружения и выделения патогенной изоформы прионного белка без его ферментативной обработки протеазой К. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
[0001] Настоящее изобретение относится к связывающему веществу патогенной (патологической) изоформы прионного белка и к способу обнаружения патогенной (патологической) изоформы прионного белка.
Предшествующий уровень развития данной области
[0002] Так называемые «прионные заболевания» являются серьезной социальной проблемой. Примеры прионных заболеваний включают трансмиссивные губчатые заболевания головного мозга (энцефалопатии, ТГЭ), такие как скрейпи, губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота (БГЭ) и болезнь Крейцфельда-Якоба (БКЯ).
[0003] На основании различных данных стало ясно, что такие прионные заболевания вызываются инфекционными прионными белками (патогенная изоформа прионного белка) (PrPSc).
[0004] Для предотвращения распространения прионных заболеваний у людей и животных и для того, чтобы обеспечить безопасность лекарственных средств и пищи, предпринимались различные попытки обнаружить в образцах инфекционный прионный белок (патогенная изоформа прионного белка).
[0005] Однако в человеческом организме и организмах животных уже содержится неинфекционный прионный белок (нормальный прионный белок) (PrPc), который не вызывает прионные заболевания. Удивительно, что обычный прионный белок имеет такую же аминокислотную последовательность (первичную структуру), что и патогенная изоформа прионного белка, и единственное различие между нормальной и патогенной изоформами прионных белков, имеющих одинаковую последовательность аминокислот, заключается в их более высокой структуре.
[0006] Обычно в случае обнаружения двух типов белков отдельно друг от друга можно использовать специфическое антитело, с помощью которого можно провести различие между данными двумя типами белка. Однако специфическое антитело, которое может отличить патогенную форму прионного белка от нормального патогенного белка, пока еще получено не было, вероятно, вследствие идентичности их последовательности аминокислот, как описано выше. То есть все еще нет возможности практического применения способа обнаружения инфекционного прионного белка (патогенной изоформы прионного белка), содержащегося в образце, с использованием специфического антитела.
[0007] Ввиду указанного способ обнаружения патогенной изоформы прионного белка ограничен, главным образом, следующими двумя типами способов.
[0008] Первый способ представляет способ, в котором образец, в котором, как предполагается, содержится патогенная изоформа прионного белка (инфекционный прионный белок), вводят в мозг тест-животных и тест-животных содержат в течение продолжительного периода времени для контроля нейропатологических изменений в образцах мозга, взятых у них.
[0009] Этот способ является надежным, но, к сожалению, является времязатратным и дорогостоящим. Соответственно такой способ используют только для калибровки других различных способов обнаружения, и он не стал общепринятым стандартным способом.
[0010] Другой способ представляет собой способ, в котором используется протеаза К. Известно, что нормальный прионный белок легко деградирует (т.е. является чувствительным) под действием протеазы К, но, с другой стороны, патогенная изоформа прионного белка трудно деградирует под действием (т.е. является устойчивой) протеазы К, возможно, из-за своей структуры более высокого порядка. Таким образом, патогенная изоформа прионного белка может быть обнаружена при использовании различия между нормальной и патогенной изоформами прионных белков в отношении чувствительности (устойчивости) к деградации протеазой К. Например, образец обрабатывают и не обрабатывают протеазой К, а затем анализируют с помощью, например, иммуноблоттинга с использованием поликлонального антитела. В том случае, если полосы белка обнаруживаются с помощью иммуноблоттинга в образце, не обработанном протеазой К, делают вывод, что полосы белка представляют собой патогенную изоформу прионного белка. С другой стороны, в том случае, когда полосы белка, обнаруживаемые с помощью иммуноблоттинга в образце, не обработанном протеазой К, исчезают (т.е. не обнаруживаются) при иммуноблоттинге образца, обработанного протеазой К, то делают вывод о том, что полосы белка относятся к нормальному прионному белку.
[0011] Этот способ с использованием протеазы К широко распространен в настоящее время, и были предложены его многочисленные варианты (см., например, патентные документы 1-3).
[0012] Однако при таком способе необходима ферментативная обработка и соответственно требуется время для проведения ферментативной реакции, и он осложнен тем, что необходимо создать условия, подходящие для ферментативной реакции. Таким образом, в принципе, этот способ имеет недостатки, связанные с недостаточной быстротой и простотой определения и с необходимостью применения в качестве реагента относительно дорогого фермента.
Патентный документ 1: выложенная патентная заявка Японии №10-267928
Патентный документ 2: выложенная патентная заявка Японии №11-32795
Патентный документ 3: выложенная патентная заявка Японии №2003-121448
Описание изобретения
Задачи, решаемые настоящим изобретением
[0013] Ввиду вышеизложенного существует необходимость в способе обнаружения патогенной изоформы прионного белка независимо от нормального прионного белка, который был бы быстрым, простым и количественным, с высокой чувствительностью без предварительной ферментативной обработки с использованием протеазы К.
[0014] Таким образом, задача настоящего изобретения заключается в создании способа обнаружения патогенной изоформы прионного белка независимо от нормального прионного белка, который был бы быстрым, простым и количественным, с высокой чувствительностью без предварительной ферментативной обработки с использованием протеазы К, и создании средства для обнаружения, которое могло бы использоваться в данном способе.
[0015] Кроме того, также имеется необходимость в реагенте (связующем веществе), который не связывается с нормальным прионным белком, но специфически связывается с патогенной изоформой прионного белка и который мог бы использоваться в таком способе обнаружения.
[0016] Таким образом, другая задача настоящего изобретения заключается в создании реагента (связывающего вещества), который не связывается с нормальным прионным белком, но специфически связывается с патогенной изоформой прионного белка.
Способы решения проблемы
[0017] Для достижения вышеуказанных задач авторы настоящего изобретения проводили интенсивное исследование способа специфического обнаружения патогенной изоформы прионного белка и в результате установили, что лактоферрин, который представляет собой белок, полученный из молока млекопитающих, не связывается с нормальным прионным белком, но специфически связывается с патогенной изоформой прионного белка. Данное открытие привело к осуществлению настоящего изобретения.
[0018] Таким образом, лактоферрин является долгожданным реагентом (т.е. связующим агентом, связывающим агентом, осуществляющим связывание агентом), который не связывается с нормальным прионным белком, но специфически связывается с патогенной изоформой прионного белка. Использование лактоферрина делает возможным обнаружить патогенную изоформу прионного белка независимо от нормального прионного белка без предварительной ферментативной обработки с использованием протеазы К.
[0019] Кроме того, использование свойства лактоферрина специфически связываться с патогенной изоформой прионного белка делает возможным не только специфически обнаруживать патогенную изоформу прионного белка, но также проводить специфическое разделение (включая выделение, очистку и концентрирование) патогенной изоформы прионного белка, специфическую иммобилизацию патогенной изоформы прионного белка и специфическое ингибирование самосборки патогенной изоформы прионного белка, тем самым обеспечивая возможность новому применению, которое не возможно с помощью обычного способа, включающего ферментативную обработку протеазой К. То есть связывающее вещество патогенной изоформы прионного белка по настоящему изобретению обладает таким полезным действием.
[0020] Таким образом, настоящее изобретение относится к:
(1) Связывающему веществу патогенной изоформы прионного белка (связывающий агент), включающему лактоферрин.
(2) Связывающему веществу патогенной изоформы прионного белка (связывающий агент), имеющему фрагмент, связывающий патогенную изоформу прионного белка, состоящий из лактоферрина.
[0021] Кроме того, лактоферрин может быть иммобилизован на связующем веществе (т.е. носителе, субстрате, материале носителя, материале основы). При использовании такого связывающего материала с иммобилизованным лактоферрином возможно особенно эффективно проводить отделение патогенной изоформы прионного белка от нормального прионного белка (включая выделение, очистку и концентрирование патогенной изоформы прионного белка) с получением только патогенной изоформы патогенного белка, связывания и иммобилизации патогенной изоформы прионного белка с лактоферрином и обнаружения патогенной изоформы прионного белка.
[0022] Таким образом, настоящее изобретение также относится к:
(3) Связывающему веществу патогенной изоформы прионного белка в соответствии с вышеуказанными пунктами (1) и (2), где лактоферрин иммобилизуют на связывающем материале (носителе).
(4) Связывающему веществу патогенной изоформы прионного белка в соответствии с вышеуказанными пунктами (1) и (2), где лактоферрин иммобилизуют в качестве фрагмента, связывающего патогенную изоформу прионного белка, на связывающем материале (носителе).
(5) Связывающему веществу патогенной изоформы прионного белка в соответствии с вышеуказанными пунктами (3) и (4), где связывающий материал представляет собой бусы.
(6) Связывающему веществу патогенной изоформы прионного белка в соответствии с вышеуказанным пунктом (5), где бусы представляют собой намагничиваемые бусы.
[0023] Такое связывающее вещество патогенной формы прионного белка можно использовать для обнаружения патогенной изоформы прионного белка.
Соответственно, настоящее изобретение также относится к:
(7) Связывающему веществу патогенной изоформы прионного белка в соответствии с любым из вышеуказанных пунктов (1)-(6), которое представляет собой агент для обнаружения патогенной изоформы прионного белка.
(8) Связывающему веществу патогенной изоформы прионного белка в соответствии с любым из вышеуказанных пунктов (1)-(6), которое представляет собой агент для обнаружения патогенной изоформы прионного белка, имеющий связывающий агент патогенной изоформы прионного белка, состоящий из лактоферрина.
(9) Связывающему веществу патогенной изоформы прионного белка в соответствии с любым из вышеуказанных пунктов (1)-(6), которое представляет собой агент для обнаружения патогенной изоформы прионного белка, имеющий связывающий агент патогенной изоформы прионного белка, состоящий из лактоферрина и меченого фрагмента.
[0024] Настоящее изобретение также относится к способу обнаружения патогенной изоформы прионного белка, способу связывания патогенной изоформы прионного белка, способу выделения патогенной изоформы прионного белка (включая способ очистки патогенной изоформы прионного белка, способ отделения патогенной изоформы прионного белка и способ концентрирования патогенной изоформы прионного белка), способу иммобилизации патогенной изоформы прионного белка, или способу ингибирования самосборки патогенной изоформы прионного белка, каждый из которых включает использование связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка или агента обнаружения патогенной изоформы прионного белка.
[0025] Соответственно, настоящее изобретение также относится к:
(10) Способу обнаружения патогенной изоформы прионного белка, включающему следующие стадии:
стадию контактирования образца со связующим веществом патогенной изоформы прионного белка в соответствии с любым из пунктов (3)-(6);
стадию отделения связанного компонента от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, приведенного в контакт с образцом; и
стадию обнаружения патогенной изоформы прионного белка, содержащейся в компоненте, отделенной от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка.
(11) Способу в соответствии с вышеуказанным пунктом (10), где на стадии обнаружения патогенной изоформы прионного белка, содержащейся в компоненте, отделенной от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, обнаружение патогенной изоформы прионного белка осуществляют с использованием иммуноанализа.
(12) Способу в соответствии с вышеуказанным пунктом (11), где иммуноанализ представляет собой метод вестерн-блоттинга, метод ELISA (метод твердофазного иммуноферментного анализа) или метод иммуноосаждения.
(13) Способу обнаружения патогенной изоформы прионного белка, включающему следующие стадии:
стадию контактирования образца со связующим веществом патогенной изоформы прионного белка в соответствии с любым из пунктов (3)-(6);
стадию отделения связанного компонента от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, приведенного в контакт с образцом.
(14) Способу в соответствии с любым из пунктов (10)-(13), где связывающее вещество патогенной изоформы прионного белка, полученное иммобилизацией лактоферрина на связывающем материале, представляет собой бусы с иммобилизованным лактоферрином.
(15) Способу в соответствии с любым из пунктов (10)-(13), где связывающее вещество патогенной изоформы прионного белка представляет собой бусы с иммобилизованным лактоферрином, с использованием намагничиваемых бус.
(16) Способу в соответствии с любым из пунктов (10)-(15), где образец представляет собой жидкий образец, полученный гомогенизацией смеси животной ткани и поверхностно-активного вещества.
(17) Способу в соответствии с вышеуказанным пунктом (16), где животная ткань представляет собой одну или несколько из тканей мозга млекопитающего, спинного мозга, глаза и тонкого кишечника.
(18) Способу в соответствии с любым из пунктов (10)-(17), где стадию отделения связанного компонента проводят путем элюирования раствором, содержащим лактоферрин.
[0026] Кроме того, настоящее изобретение также относится к:
(19) Способу обнаружения патогенной изоформы прионного белка, включающему стадии:
стадию связывания лактоферрина с патогенной изоформой прионного белка; и
обнаружение лактоферрина, связанного с патогенной изоформой прионного белка.
(20) Способу обнаружения патогенной изоформы прионного белка, включающему стадии:
стадию связывания лактоферрина, имеющего меченый фрагмент, с патогенной изоформой прионного белка; и
обнаружение меченого фрагмента лактоферрина, связанного с патогенной изоформой прионного белка.
(21) Способу ингибирования самосборки патогенной изоформы прионного белка за счет связывания лактоферрина с патогенной изоформой прионного белка.
(22) Ингибитору для ингибирования самосборки патогенной изоформы прионного белка, включающему лактоферрин.
[0027] Настоящее изобретение также относится к применению лактоферрина, лактоферрина, имеющего меченый фрагмент, или лактоферрина, иммобилизованного на связывающем материале, для связывания патогенной изоформы прионного белка.
[0028] Настоящее изобретение также относится к применению лактоферрина, лактоферрина, имеющего меченый фрагмент, или лактоферрина, иммобилизованного на связывающем материале, для обнаружения патогенной изоформы прионного белка.
[0029] Настоящее изобретение также относится к применению лактоферрина, лактоферрина, имеющего меченый фрагмент, или лактоферрина, иммобилизованного на связывающем материале, для выделения патогенной изоформы прионного белка.
[0030] Настоящее изобретение также относится к применению лактоферрина, лактоферрина, имеющего меченый фрагмент, или лактоферрина, иммобилизованного на связывающем материале, для ингибирования самосборки патогенной изоформы прионного белка.
Результаты изобретения
[0031] Как описано выше, в настоящем изобретении впервые описано, что лактоферрин не связывается с нормальным прионным белком, но специфически связывается с патогенной изоформой прионного белка. В соответствии с настоящим изобретением, основанным на этом обнаружении, можно просто, быстро и количественно обнаруживать патогенную изоформу прионного белка независимо от нормального прионного белка с высокой чувствительностью без осуществления ферментативной обработки с использованием протеазы К.
[0032] То есть согласно настоящему изобретению можно отличить патогенную изоформу прионного белка от нормального прионного белка, не проводя ферментативной обработки с использованием протеазы К. Это исключает необходимость проведения сложных операций для создания условий, подходящих для ферментативной реакции, и времени, требуемого для проведения ферментативной реакции. В результате, в принципе, способ по настоящему изобретению не имеет недостатков, связанных с ферментативной обработкой с использованием протеазы К, таких как низкая скорость, плохая воспроизводимость и необходимость использования относительно дорогого фермента в качестве реагента.
[0033] Следовательно, согласно настоящему изобретению можно анализировать пищу, напитки и лекарства, в которых используются полученные от животных исходные вещества, на загрязнение патогенной изоформой прионного белка (инфекционный прионный белок) более просто, быстро и количественно с высокой чувствительностью при более низкой стоимости, чем когда-либо ранее. Кроме того, также можно диагностировать прионные заболевания людей и животных более просто, быстро и количественно с высокой чувствительностью при более низкой стоимости, чем когда-либо ранее. Это отвечает потребности общества в профилактике инфекции и ранней диагностике прионных заболеваний у людей или животных.
[0034] Кроме того, согласно настоящему изобретению можно собирать патогенную изоформу прионного белка отдельно от нормального прионного белка. Это дает возможность выделения, отделения, концентрирования и очистки патогенной изоформы прионного белка. Соответственно, при комбинировании вышеуказанных аспектов настоящего изобретения можно более эффективно проводить вышеуказанное инспектирование на предмет загрязнения патогенной изоформой прионного белка (инфекционный прионный белок) и диагностику прионных заболеваний у людей и животных.
Краткое описание рисунков
[0035] Фиг.1 представляет собой фотографию, показывающую результаты иммуноблоттинга, демонстрирующую, что патогенная изоформа прионного белка специфически связывается с бусами с иммобилизованным лактоферрином.
Фиг.2 представляет собой фотографию, показывающую результаты иммуноблоттинга, демонстрирующую, что обычный способ обнаружения, включающий ферментативную обработку протеазой К, может отличать патогенную изоформу прионного белка от нормального прионного белка.
Лучший способ осуществления изобретения
[0036] Далее будут подробно описаны предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения. Однако настоящее изобретение не ограничено следующими предпочтительными вариантами и могут быть сделаны любые изменения в рамках объема настоящего изобретения. Следует отметить, что в данном описании «процент (%)» относится к «проценту (%) по массе», если не указано другого.
[0037] Предпочтительный вариант осуществления способа обнаружения патогенной изоформы прионного белка по настоящему изобретению включает стадии:
контактирование образца со связующим веществом патогенной изоформы прионного белка, полученным иммобилизацией лактоферрина на связующем веществе; отделение связанного компонента от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, приведенного в контакт с образцом; и обнаружение патогенной изоформы прионного белка, содержащегося в компоненте, отделенном от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка.
[0038] В соответствии с данным способом обнаружения патогенная изоформа прионного белка, содержащаяся в образце, может быть собрана при предоставлении патогенной изоформе прионного белка возможности специфически связываться (адсорбироваться) с лактоферрином, иммобилизованным в связующем веществе патогенной изоформы прионного белка, а затем отделения патогенной изоформы прионного белка, связанного с лактоферрином, иммобилизованным в связующем веществе патогенной изоформы прионного белка, и соответственно может быть обнаружена по отдельности от нормального прионного белка путем обнаружения патогенной изоформы прионного белка, отделенной от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка.
[0039] На стадии обнаружения патогенной изоформы прионного белка, содержащегося в компоненте, отделенном от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, обнаружение патогенной изоформы прионного белка предпочтительно осуществляют с помощью иммуноанализа.
[0040] Предпочтительные примеры такого иммуноанализа включают метод вестерн-блоттинга, метод ELISA и метод иммуноосаждения.
[0041] Способ, используемый при обнаружении патогенной изоформы прионного белка на стадии обнаружения патогенной изоформы прионного белка, содержащегося в компоненте, отделенном от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, включая указанный выше иммуноанализ, не ограничен конкретно до тех пор, пока с его помощью может быть обнаружена патогенная изоформа прионного белка, и, соответственно, способ, с помощью которого нельзя различить патогенную изоформу прионного белка и нормальный прионный белок, конечно, можно использовать. Это возможно, поскольку в соответствии с настоящим изобретением специфичность патогенной изоформы прионного белка гарантирована ранее при предоставлении возможности патогенной изоформе прионного белка связываться с лактоферрином перед стадией обнаружения патогенной изоформы прионного белка. Следовательно, в вышеуказанном иммуноанализе можно, конечно, использовать антитело, которое не способно отличать патогенную изоформу прионного белка и нормальный прионный белок.
[0042] Лактоферрин (далее иногда сокращаемый как «ЛФ») представляет собой связанный с железом гликопротеин с молекулярной массой примерно 80 кДа, главным образом присутствующий в молоке молочной железы, и он известен как молочный белок, обладающий различной активностью, такой как антибактериальная активность в отношении вредных бактерий, таких как Escherichia coli, Candida, Clostridium и Staphylococcus, иммуномодулирующая активность и противоопухолевая активность. Как описано выше, лактоферрин представляет собой гликопротеин на основе молока и, следовательно, является высокобезопасным и его можно непрерывно принимать в течение длительного промежутка времени. Кроме того, лактоферрин сам по себе практически не имеет вкуса и запаха и соответственно широко используется в качестве добавки для различных пищевых продуктов, лекарственных средств и кормов животных. Однако способность лактоферрина специфически связываться с патогенной изоформой прионного белка ранее известна не была.
[0043] Лактоферрин для использования в настоящем изобретении может быть коммерчески доступным или может быть получен путем выделения из исходного вещества, такого как молозиво, молоко (промежуточное молоко, зрелое молоко или молоко при поздней лактации) млекопитающих (например, человек, корова, коза, овца и лошадь), или продукта, полученного при переработке такого молока, такого как снятое молоко или сыворотка, посредством обычной обработки, такой как ионообменная хроматография. В частности, предпочтительно используют коммерчески доступный лактоферрин, получаемый в промышленном масштабе (например, лактоферрин, производимый Morinaga Milk Industry Co., Ltd.). Альтернативно, также можно использовать лактоферрины, продуцируемые с использованием микроорганизмов, животных клеток, трансгенных животных или тому подобного с помощью методов генной инженерии. В качестве исходного вещества для лактоферрина, используемого в настоящем изобретении, особенно предпочтительной является сыворотка, полученная из коровьего молока, поскольку ее можно стабильно получать в больших количествах в качестве побочного продукта производства молочных продуктов.
[0044] Далее будет описан один пример способа получения лактоферрина (выделение лактоферрина из исходного вещества, такого как молоко, и его очистка). Первоначально ионообменник (например, СМ-сефароза FF, получаемая от Amersham Pharmacia) упаковывают в колонку. Через колонку пропускают соляную кислоту и колонку промывают водой для уравновешивания ионообменника. Затем снятое молоко, имеющее рН 6,9 и охлажденное до 4°С, пропускают через колонку, выделяют эффлюент с колонки и эффлюент снова пропускают через колонку таким же образом. Затем через колонку пропускают дистиллированную воду, а после этого раствор соли пропускают через колонку для получения элюата, содержащего основной белок, адсорбированный на ионообменнике. Затем к элюату добавляют 80%-ный насыщенный раствор сульфата аммония для осаждения белка и после этого элюат центрифугируют для получения осадка. Полученный осадок промывают 80%-ным насыщенным раствором сульфата аммония и затем к промытому осадку добавляют деионизированную воду для получения раствора. Затем раствор обессоливают с использованием ультрафильтрационного мембранного модуля (например, SLP0053 производства Asahi kasi Corporation) и после этого подвергают лиофильной сушке для получения порошкообразного коровьего лактоферрина. Таким образом можно получать коровий лактоферрин с чистотой 95% по массе или выше. Следует отметить, что в данном описании чистота лактоферрина представляет собой показатель, измеренный методом жидкостной хроматографии.
[0045] Как и многие белки, лактоферрин также обычно содержит мутацию, такую как замещение, делеция, вставка, дополнение или инверсия одного или нескольких оснований в одном или нескольких положениях, вследствие разницы в видах или генах или различия между индивидами, и аминокислоты белка, кодируемого геном, имеющим такую мутацию, также могут содержать мутацию. В настоящем изобретении лактоферрин, содержащий такую мутацию, также можно использовать до тех пор, пока не нарушается его способность специфически связываться с патогенной изоформой прионного белка.
[0046] Иммобилизацию лактоферрина на связывающем материале для получения связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка можно проводить с помощью обычно используемого способа иммобилизации до тех пор, пока не ухудшается способность лактоферрина специфически связываться с патогенной изоформой прионного белка. Примеры такого способа иммобилизации включают способ, в котором ковалентная связь непосредственно образуется с первичной аминогруппой полипептида, и способ, в котором ковалентная связь непосредственно образуется с сульфгидрильной группой (тиольной группой) полипептида.
[0047] Связывающий материал (т.е. носитель, субстрат, материал носителя, материал основы), используемый для иммобилизации лактоферрина для получения связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, не является особо ограниченным до тех пор, пока он представляет собой обычно используемый связывающий материал и может функционировать в качестве твердой фазы при желательных условиях и иммобилизовывать белок. Примеры такого связывающего материала включают таковые, имеющие на своей поверхности гидрофильную или гидрофобную смолу, и такому связывающему материалу можно придать различную форму, такую как частицы (бусы), пленки, волокна, полые волокна и сетки. Среди них предпочтительными являются связывающие материалы в форме бус (макрочастиц). Конкретный размер (диаметр) бус (частицы) может быть выбран подходящим образом в соответствии с целью применения, но составляет, например, обычно от 0,5 до 200 мкм, предпочтительно от 1,0 до 100 мкм, более предпочтительно от 1,0 до 50 мкм, еще более предпочтительно от 1,0 до 20 мкм, еще более предпочтительно от 1,0 до 10 мкм, особенно предпочтительно от 1,0 до 5,0 мкм.
[0048] Как описано выше, бусы (частица), имеющие на своей поверхности гидрофобную или гидрофильную смолу, предпочтительно используют в качестве связывающего материала (т.е. носителя субстрата, материала носителя, материала основы). В таком случае связывающий материал, активный в отношении связывания патогенной изоформы прионного белка, получают путем иммобилизации лактоферрина на связывающем материале, упоминаемом как бусы с иммобилизованным лактоферрином. Данные бусы, используемые в качестве связывающего материала, могут быть суспендированы и диспергированы в жидкости, и, если это необходимо в процессе эксплуатации, их легко можно осадить и собрать.
[0049] Более предпочтительно в качестве связывающего материала используют бусы, имеющие на своей поверхности гидрофобную или гидрофильную смолу и намагничиваемый материал внутри (в центре). В таком случае связывающий материал, активный в отношении связывания патогенной изоформы прионного белка, получают путем иммобилизации лактоферрина на связывающем материале, упоминаемом как бусы с иммобилизованным лактоферрином на основе намагничиваемых бус. Данные бусы, используемые в качестве связывающего материала, могут быть суспендированы и диспергированы в жидкости, и, если это необходимо в процессе эксплуатации, их легко можно осадить и собрать с использованием магнита. Если это необходимо в процессе эксплуатации, такую операцию специалист в данной области может провести во время, перед или после стадии контактирования образца с бусами с иммобилизованным лактоферрином или на стадии отделения компонента, связанного с бусами с иммобилизованным лактоферрином.
[0050] Образец не является особо ограниченным до тех пор, пока он представляет собой жидкий образец, в котором, как подозревают, содержится патогенная изоформа прионного белка (инфекционный прионный белок). Однако предпочтительно, чтобы в том случае, когда образец содержит патогенную изоформу прионного белка, патогенная изоформа прионного белка была бы в достаточной мере диспергирована в образце. В том случае, когда тестируемым объектом является животная ткань, образец предпочтительно получают с помощью солюбилизирования в достаточной мере животной ткани. Пример такого солюбилизированного образца включает жидкий образец, полученный гомогенизацией смеси животной ткани и поверхностно-активного вещества. рН такого жидкого образца не является особо ограниченным, но предпочтительно он близок к нейтральному. Более конкретно, рН обычно составляет от 5,5 до 7,8, предпочтительно от 6,0 до 7,7, особенно предпочтительно от 6,5 до 7,6. Поверхностно-активное вещество, используемое при получении такого жидкого образца, не является особо ограниченным до тех пор, пока оно представляет собой поверхностно-активное вещество, обычно используемое для солюбилизации животной ткани, но предпочтительно представляет собой неионное поверхностно-активное вещество с позиций солюбилизации животной ткани и поддержания структуры высшего порядка прионного белка. Предпочтительные примеры поверхностно-активного вещества включают Tween 20, тритон Х-100 и NP-40. Среди данных поверхностно-активных веществ Tween 20, тритон Х-100 и NP-40 являются предпочтительными, и Tween 20 и NP-40 являются особенно предпочтительными. Для того чтобы гарантировать специфическое связывание между лактоферрином и патогенной изоформой прионного белка, образец предпочтительно получают в виде жидкого образца, который можно привести в контакт с материалом, активным в отношении связывания с патогенной изоформой прионного белка, в следующих условиях.
[0051] Для того чтобы гарантировать специфическое связывание между лактоферрином и патогенной изоформой прионного белка, образец предпочтительно приводят в контакт с материалом, активным в отношении связывания с патогенной изоформой прионного белка, при рН, обычно составляющем от 5,5 до 7,8, предпочтительно от 6,0 до 7,7, особенно предпочтительно от 6,5 до 7,6, при температуре, обычно составляющей от 3 до 30°С, предпочтительно от 3 до 20°С, особенно предпочтительно от 3 до 5°С, обычно в течение от 5 до 300 минут, предпочтительно от 10 до 180 минут, особенно предпочтительно от 15 до 90 минут. Однако условия для контактирования материала, активного в отношении связывания с патогенной изоформой прионного белка, не ограничены указанным.
[0052] Животная ткань для солюбилизации не ограничена особо до тех пор, пока подозревается, что она содержит патогенную изоформу прионного белка (инфекционный прионный белок), но с позиций ранней диагностики предпочтительными являются одна или несколько из тканей мозга млекопитающего, спинного мозга, глаза и тонкого кишечника, поскольку известно, что патогенная изоформа прионного белка присутствует главным образом в данных тканях.
[0053] На стадии отделения связанного компонента от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, приведенного в контакт с образцом, связанный компонент может быть отделен и элюирован путем его диссоциации со связывающим веществом патогенной изоформы прионного белка при относительно жестких условиях диссоциации в ряду различных условий, обычно используемых для диссоциации взаимодействий белок-белок. Например, отделение связанного компонента может быть осуществлено с использованием раствора, содержащего поверхностно-активное вещество, при рН, близком к нейтральному, и температуре от 3 до 30°С. Альтернативно, отделение связанного компонента может быть осуществлено путем диссоциации специфического связывания между лактоферрином и патогенной изоформой прионного белка при элюировании с использованием раствора, содержащего лактоферрин.
[0054] Предпочтительный вариант осуществления способа обнаружения патогенной изоформы прионного белка согласно настоящему изобретению может дополнительно включать, после стадии контактирования образца со связующим веществом патогенной изоформы прионного белка, полученным иммобилизацией лактоферрина на связывающем материале, но перед стадией отделения связанного компонента от связывающего вещества патогенной формы прионного белка, приведенного в контакт с образцом, стадию промывки связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, приведенного в контакт с образцом. Стадию промывки обеспечивают главным образом в целях удаления компонента, неспецифически адсорбированного на связующем веществе патогенной изоформы прионного белка, приведенном в контакт с образцом, когда такой компонент присутствует. Стадию промывки можно проводить с помощью метода, обычно используемого для достижения описанной выше цели. Такой метод не ограничен конкретно, но, например, стадию промывки можно проводить путем промывания связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка раствором, который использовался для приготовления образца, предназначенного для контактирования со связующим веществом патогенной изоформы прионного белка, но который не содержит солюбилизированной животной ткани или тому подобного.
[0055] Кроме того, настоящее изобретение также относится к способу выделения патогенной изоформы прионного белка. Предпочтительный вариант осуществления способа выделения патогенной изоформы прионного белка согласно настоящему изобретению включает следующие стадии: контактирование образца, полученного солюбилизацией животной ткани со связующим веществом патогенной изоформы прионного белка (связующий агент), полученным иммобилизацией лактоферрина на соединительном материале (т.е. носителе, субстрате, материале носителя, материале основы); и отделение связанного компонента от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка (связывающего агента), которое было введено на стадию контактирования образца со связующим веществом патогенной изоформы прионного белка.
[0056] В соответствии с данным способом выделения патогенная изоформа прионного белка, содержавшаяся в образце, может быть собрана при предоставлении возможности патогенной изоформе прионного белка специфически связываться (адсорбироваться) с лактоферрином, иммобилизованным в связующем веществе патогенной изоформы прионного белка, и последующем отделении патогенной изоформы прионного белка, связанного с лактоферрином, иммобилизованным в связующем веществе патогенной изоформы прионного белка, что дает возможность выделять, отделять, концентрировать и очищать патогенную форму прионного белка.
[0057] Как описано выше, вариант осуществления способа выделения патогенной изоформы прионного белка согласно настоящему изобретению может быть осуществлен путем проведения тех же стадий, как и в предпочтительном варианте осуществления способа обнаружения патогенной изоформы прионного белка согласно настоящему изобретению, отличающимся на стадии обнаружения патогенной изоформы прионного белка, содержащегося в компоненте, отделенном от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка. Соответственно приведенное выше описание, сделанное со ссылкой на предпочтительный вариант осуществления способа обнаружения патогенной изоформы прионного белка согласно настоящему изобретению, также применимо к варианту осуществления способа выделения патогенной изоформы прионного белка согласно настоящему изобретению.
[0058] Связывающее вещество патогенной изоформы прионного белка согласно настоящему изобретению, включающее лактоферрин, можно использовать не только в вышеуказанных вариантах осуществления в качестве связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, полученного путем иммобилизации лактоферрина на соединительном материале, но также и в следующих вариантах осуществления.
[0059] То есть предпочтительный вариант осуществления использования связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка согласно настоящему изобретению относится к способу обнаружения патогенной изоформы прионного белка, включающему стадии: предоставление возможности лактоферрину связываться с патогенной изоформой прионного белка и обнаружение лактоферрина, связанного с патогенной изоформой прионного белка.
[0060] В соответствии с данным способом обнаружения патогенной изоформы прионного белка лактоферрин можно использовать в качестве связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка без особой модификации. Обнаружение патогенной изоформы прионного белка можно проводить путем обнаружения лактоферрина, связанного с патогенной изоформой прионного белка.
[0061] Обнаружение лактоферрина может быть осуществлено с помощью любого обычно используемого способа обнаружения. Например, можно использовать иммуноанализ с использованием антитела к лактоферрину.
[0062] Кроме того, другой предпочтительный вариант осуществления с использованием связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка согласно настоящему изобретению представляет собой способ обнаружения патогенной изоформы прионного белка, включающий стадии: предоставление возможности лактоферрину, имеющему меченый фрагмент, связываться с патогенной изоформой прионного белка и обнаружение меченого фрагмента лактоферрина, связанного с патогенной изоформой прионного белка.
[0063] В соответствии с данным способом обнаружения патогенной изоформы прионного белка лактоферрин, имеющий ранее присоединенный к нему меченый фрагмент, используют в качестве связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка. Обнаружение патогенной изоформы прионного белка может быть осуществлено путем обнаружения меченого фрагмента, присоединенного к лактоферрину.
[0064] Меченый фрагмент не ограничен особо до тех пор, пока он является одним из обычно используемых для биополимеров. Примеры такого меченого фрагмента включают флуоресцентный маркер, радиоактивный маркер и ферментативный маркер. Примеры флуоресцентного маркера включают красители Alexa Fluor (зарегистрированная торговая марка) (производитель Becton, Dickinson and Company) и красители CyDye (зарегистрированная торговая марка) (производитель Becton, Dickinson and Company). Среди данных флуоресцентных маркеров предпочтительно используют Alexa Fluor 488 (зарегистрированная торговая марка), Alexa Fluor 647 (зарегистрированная торговая марка), Cy3, Cy5.5 и Cy7. Примеры радиоактивного маркера включают 14С-меченные маркеры и 35S-меченные маркеры. Примеры ферментативного маркера включают маркеры HRP (пероксидаза хрена) и маркеры ALP (щелочная фосфатаза).
[0065] Настоящее изобретение также относится к способу ингибирования самосборки патогенной изоформы прионного белка путем использования связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка и ингибитора для ингибирования самосборки патогенной изоформы прионного белка. В настоящее время предполагается, что множество молекул патогенной изоформы прионного белка претерпевают самосборку с образованием мультимерного комплекса и что патогенность прионных заболеваний усиливается, вероятно, вследствие самосборки патогенной изоформы прионного белка. Связывающее вещество патогенной изоформы прионного белка согласно настоящему изобретению может ингибировать самосборку патогенной изоформы прионного белка посредством специфического связывания с патогенной изоформой прионного белка. Следует отметить, что не имеется риска того, что связывающее вещество патогенной изоформы прионного белка согласно настоящему изобретению будет неблагоприятно воздействовать на неизвестные биологические функции, которые, как ожидается, будет проявлять нормальный прионный белок, поскольку связывающее вещество патогенной изоформы прионного белка согласно настоящему изобретению не связывается с нормальным прионным белком.
Примеры
[0066] Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на следующие примеры, но оно ими не ограничивается
[0067] Пример 1
Обнаружение патогенной изоформы прионного белка инфицированного мозга с использованием бус с иммобилизованным лактоферрином
Обнаружение патогенной изоформы прионного белка инфицированного мозга с использованием бус с иммобилизованным лактоферрином проводили следующим образом с использованием мозга мыши, зараженной патогенной изоформой прионного белка.
[0068] Получение бус с иммобилизованным лактоферрином
1 мл тозилактивированных бус Dynabeades M-280 промывали дважды 1 мл PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор) и затем добавляли к бусам Dynabeades раствор, полученный при растворении 1 мг лактоферрина в 1 мл 0,1 М буфера борной кислоты, для смешивания с помощью инверсии в течение 24 часов при 37°С. Затем супернатант удаляли и бусы Dynabeades промывали дважды по 1 мл PBS. Затем к бусам Dynabeades добавляли 1 мл 0,2 М буфера Трис-хлористоводородная кислота (рН 8,5), содержащего 0,1% лактоферрина, для смешивания путем инверсии в течение 4 часов при 37°С.
Затем супернатант удаляли и бусы Dynabeades промывали один раз 1 мл PBS, содержащим 0,1% лактоферрина, и дополнительно промывали один раз PBS, содержащим 0,1% Tween.
Затем супернатант удаляли и бусы Dynabeades промывали один раз 1 мл PBS, содержащим 0,1% лактоферрина. Затем супернатант удаляли и полученные таким образом бусы Dynabeades со связанным лактоферрином (далее также упоминаемые как «бусы со связанным лактоферрином» или «бусы с иммобилизованным лактоферрином») хранили в 1 мл PBS, содержащего 0,1% лактоферрина.
[0069] Получение образца солюбилизированной ткани мозга (гомогенат мозга)
Мозг получали от мышей, инфицированных патогенной изоформой прионного белка. Мозг мыши, инфицированной патогенной изоформой прионного белка (далее для простоты упоминаемый также как «инфицированный мозг»), помещали в BioMasher и центрифугировали при 10000·g в течение 2 минут для получения осадка. Затем к осадку добавляли NP-40 RIPA для получения 10% (вес./об) гомогената мозга. Гомогенат мозга инкубировали в течение 15 минут при 4°С, перемешивали и центрифугировали при 10000·g в течение 2 минут для получения супернатанта. Затем к супернатанту добавляли NP-40 RIPA для получения 2% (вес./об) гомогената мозга (т.е. солюбилизированного образца ткани мозга). Таким образом получали гомогенат инфицированного мозга (далее также упоминаемый как «гомогенат инфицированного мозга»).
[0070] Выделение патогенной изоформы прионного белка с помощью бус с иммобилизованным лактоферрином
20 мкл бус Dynabeades со связанным лактоферрином добавляли к 500 мкл гомогената мозга и смешивали путем инверсии в течение 1 часа при 4°С. Затем бусы Dynabeades промывали 1 мл NP-40 RIPA в течение 10 минут три раза и дополнительно промывали 1 мл NP-40 RIPA в течение ночи.
Промытые бусы Dynabeades со связанным лактоферрином собирали и добавляли к ним 20 мкл нейтрального буфера (буфер для образцов NuPAGE LDS (4×) производитель Invitrogen). Полученную смесь нагревали в течение 10 минут при 95°С для получения тест-образца.
Следует отметить, что бусы Dynabeades являются магнитными и, соответственно, если необходимо с точки зрения эксплуатации, бусы Dynabeades собирали с помощью магнита во время проведения процесса.
[0071] Обнаружение с помощью иммуноблоттинга
Прионный белок, содержащийся в полученном тест-образце, обнаруживали с помощью иммуноблоттинга.
Более конкретно, тест-образец подвергали электрофорезу на геле NuPAGE (при постоянном токе 40 мА в течение 70 минут) и затем белки в геле переносили на мембрану PVDF c помощью резервуарного блоттера (при постоянном токе 220 мА в течение 60 минут).
После завершения переноса мембрану PVDF блокировали с помощью BlockAce (производства Dainippon Pharmaceutial Co., Ltd.) в течение 30 минут при 4°С. Затем к мембране PVDF добавляли раствор, содержащий моноклональное антитело (T2-HRP) против прионного белка, конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP), разведенное в соотношении 1/5000 с использованием BlockAce, содержащего 0,1% Tween 20, и мембрану PVDF инкубировали в течение 1 часа при 4°С.
Мембрану PVDF после взаимодействия с антителом промывали PBS, содержащим 0,1% Tween 20, в течение 10 минут три раза и затем проявляли реагентом для обнаружения хемолюминесценции для обнаружения хемолюминесценции с использованием анализатора изображения.
[0072] Сравнительный пример 1
Обнаружение патогенной изоформы прионного белка из неинфицированного мозга с использованием бус с иммобилизованным лактоферрином
Обнаружение патогенной изоформы прионного белка с использованием бус с иммобилизованным лактоферрином проводили следующим образом с использованием мозга нормальной мыши (далее также упоминаемого как «нормальный мозг» или «неинфицированный мозг»).
[0073] Получение бус с иммобилизованным лактоферрином
Бусы с иммобилизованным лактоферрином получали таким же образом, как описано в примере 1.
[0074] Получение образца солюбилизированной ткани мозга (гомогенат мозга)
Гомогенат нормального мозга (далее также упоминаемый как «гомогенат нормального мозга» или «гомогенат неинфицированного мозга») получали таким же образом, как в примере 1, за исключением того, что использовали мозг, полученный от нормальной мыши (неинфицированной мыши), вместо мозга мыши, инфицированной патогенной изоформой прионного белка.
[0075] Выделение патогенной изоформы прионного белка с помощью бус с иммобилизованным лактоферрином
Тест-образец получали таким же образом, как в примере 1, за исключением того, что использовали гомогенат неинфицированного мозга вместо гомогената инфицированного мозга.
[0076] Обнаружение с помощью иммуноблоттинга
Обнаружение прионного белка проводили таким же образом, как в примере 1, за исключением того, что использовали тест-образец, полученный из гомогената неинфицированного мозга, вместо тест-образца, полученного из гомогената инфицированного мозга.
[0077] Результаты
Фиг.1 представляет собой фотографию, показывающую результаты иммуноблоттинга, проведенного в примере 1 и сравнительном примере 1. Все полосы представляют образцы, не обработанные протеазой К (РК-).
[0078] Дорожки 1, 2 и 3 относятся к тест-образцу, полученному в примере 1, при проведении разделения патогенной изоформы прионного белка с помощью бус с иммобилизованным лактоферрином на гомогенате инфицированного мозга. Более конкретно, дорожка 2 относится к тест-образцу, разведенному в 10 раз по сравнению с дорожкой 1, а дорожка 3 относится к тест-образцу, разведенному в 100 раз по сравнению с дорожкой 1. С другой стороны, дорожка 4 относится к тест-образцу, полученному в сравнительном примере 1, при проведении разделения патогенной изоформы прионного белка с помощью бус с иммобилизованным лактоферрином на гомогенате неинфицированного мозга.
[0079] В дорожках 1-3 наблюдались концентрационно-зависимые полосы прионного белка. Даже в дорожке 3, представляющей собой тест-образец, разведенный в 100 раз по сравнению с образцом дорожки 1, четко наблюдались полосы прионного белка. Как описано выше, поскольку тест-образец, использованный в дорожках 1-3, был получен из гомогената инфицированного мозга, полосы прионного белка, наблюдавшиеся в дорожках 1-3, относятся к полосам патогенной изоформы прионного белка. Это показывает, что патогенная изоформа прионного белка, полученного из инфицированного мозга, была выделена и обнаружена с помощью связывания с бусами с иммобилизованным лактоферрином.
[0080] С другой стороны, в дорожке 4 полосы прионного белка не наблюдались, несмотря на тот факт, что концентрация тест-образца в дорожке 4 при проведении анализа была на том же уровне, что и в тест-образце дорожки 1. Это показывает, что нормальный прионный белок, полученный из неинфицированного мозга, не связывался с бусами с иммобилизованным лактоферрином и соответственно не был собран и обнаружен.
[0081] На основании описанных выше результатов было установлено, что патогенная изоформа прионного белка, полученная из инфицированного мозга, специфически связывается с бусами с иммобилизованным лактоферрином, но нормальный прионный белок, полученный из неинфицированного мозга, не связывается с бусами с иммобилизованным лактоферрином. Кроме того, также было установлено, что патогенная изоформа прионного белка может быть собрана отдельно от нормального прионного белка при использовании бус с иммобилизованным лактоферрином, тем самым предоставляя возможность обнаружения патогенной изоформы прионного белка.
[0082] Сравнительный пример 2
Обнаружение патогенной изоформы прионного белка с использованием протеазы К
Эксперимент, цель которого заключалась в обнаружении патогенной изоформы прионного белка отдельно от нормального прионного белка, проводили общепринятым способом с использованием протеазы К следующим образом.
[0083] Получение гомогената мозга
Получали мозг мыши, инфицированной патогенной изоформой прионного белка (далее также упоминаемый как «инфицированный мозг»), и мозг неинфицированной мыши (нормальная мышь) (далее также упоминаемый как «неинфицированный мозг» или «нормальный мозг») и каждый мозг мыши помещали в BioMasher и центрифугировали при 10000·g в течение 2 минут для получения осадка. Затем к осадку добавляли NP-40 RIPA для получения 10% (вес./об) гомогената мозга. Гомогенат мозга инкубировали в течение 15 минут при 4°С, перемешивали и центрифугировали при 10000·g в течение 2 минут для получения супернатанта. Затем к супернатанту добавляли NP-40 RIPA для получения 0,5% (вес./об) гомогената мозга. Таким образом получали гомогенат инфицированного мозга и гомогенат неинфицированного мозга.
[0084] Ферментативное разложение с помощью протеазы К
Протеиназу К добавляли к 500 мкл каждого из гомогенатов мозга таким образом, что конечная концентрация протеиназы К составляла 20 мкг/мл, и затем полученную смесь инкубировали в течение 30 минут при 37°С. После завершения реакции к смеси добавляли 5 мкл ингибитора протеиназы К (Pefablock) и затем 250 мкл раствора бутанол-метанол, перемешивали и центрифугировали при 20000·g в течение 10 минут для получения осадка. После завершения центрифугирования к осадку добавляли 50 мкл нейтрального буфера (буфер для образцов NuPAGE LDS (4×) производитель Invitrogen) и полученную смесь нагревали в течение 10 минут при 95°С. Таким образом получали образец, полученный из гомогената инфицированного мозга, и образец, полученный из гомогената неинфицированного мозга.
[0085] Обнаружение с помощью иммуноблоттинга
Обнаружение прионного белка проводили с помощью иммуноблоттинга для полученных таким образом четырех видов образцов, т.е. гомогенат инфицированного мозга, подвергнутый ферментативному разложению с использованием протеазы К (обработанный протеазой К гомогенат инфицированного мозга), гомогенат неинфицированного мозга, подвергнутый ферментативному разложению с использованием протеазы К (обработанный протеазой К гомогенат неинфицированного мозга), гомогенат инфицированного мозга, не подвергнутый ферментативному разложению с использованием протеазы К (первоначальный гомогенат инфицированного мозга), и гомогенат неинфицированного мозга, не подвергнутый ферментативному разложению с использованием протеазы К (первоначальный гомогенат неинфицированного мозга).
Более конкретно, образцы подвергали электрофорезу на геле NuPAGE (при постоянном токе 40 мА в течение 70 минут) и затем белки в геле переносили на мембрану PVDF c помощью резервуарного блоттера (при постоянном токе 220 мА в течение 60 минут).
После завершения переноса мембрану PVDF блокировали с помощью BlockAce (производства Dainippon Pharmaceutial Co., Ltd.) в течение 30 минут при 4°С. Затем к мембране PVDF добавляли раствор, содержащий моноклональное антитело (T2-HRP) против прионного белка, конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP), разведенное в соотношении 1/5000 с использованием BlockAce, содержащего 0,1% Tween 20, и мембрану PVDF инкубировали в течение 1 часа при 4°С.
Мембрану PVDF после взаимодействия с антителом промывали PBS, содержащим 0,1% Tween 20, в течение 10 минут три раза и затем проявляли реагентом для обнаружения хемолюминесценции для обнаружения хемолюминесценции с использованием анализатора изображения.
[0086] Результаты
Фиг.2 представляет собой фотографию, показывающую результаты иммуноблоттинга, проведенного в сравнительном примере 2. Дорожки 1 и 2 относятся к образцам, не подвергнутым ферментативному разложению с помощью протеазы К (РК-), а дорожки 3 и 4 относятся к образцам, подвергнутым ферментативному разложению с помощью протеазы К (РК+).
[0087] Более конкретно, дорожка 1 относится к гомогенату инфицированного мозга, который не подвергали ферментативному разложению с помощью протеазы К (т.е. первоначальный гомогенат инфицированного мозга), и дорожка 2 относится к гомогенату неинфицированного мозга, который не подвергали ферментативному разложению с помощью протеазы К (т.е. первоначальный гомогенат неинфицированного мозга). С другой стороны, дорожка 3 относится к гомогенату инфицированного мозга, подвергнутому ферментативному разложению с помощью протеазы К (т.е. обработанный протеазой К гомогенат инфицированного мозга), и дорожка 4 - к гомогенату неинфицированного мозга, подвергнутому ферментативному разложению с помощью протеазы К (т.е. обработанный протеазой К гомогенат неинфицированного мозга).
[0088] Как показано на фиг.2, в обоих дорожках 1 и 2 полосы прионного белка были обнаружены с помощью иммуноблоттинга. Это показывает что, когда не проводят ферментативную обработку с помощью протеазы К, обнаруживаются как патогенная изоформа прионного белка (дорожка 1), так и нормального прионного белка (дорожка 2). С другой стороны, в дорожках 3 и 4 полосы прионного белка (патогенная изоформа прионного белка) были обнаружены посредством иммуноблоттинга только в дорожке 3, и полосы прионного белка (нормальный прионный белок) не обнаружены в дорожке 4. Это указывает на то, что ферментативная обработка протеазой К дает возможность различать патогенную изоформу прионного белка и нормальный прионный белок и обнаруживать только патогенную изоформу прионного белка.
[0089] Результаты, показанные на фиг.2 (сравнительный пример 2), сравнивали с результатами, показанными на фиг.1 (пример 1 и сравнительный пример 1), и в результате было установлено, уровень точности и достоверности при распознавании патогенной изоформы прионного белка и нормального прионного белка с использованием бус с иммобилизованным лактоферрином такой же или выше, чем достигаемый общепринятым способом с использованием протеазы К.
Промышленная применимость
[0090] В соответствии с настоящим изобретением можно инспектировать продукты питания, напитки и лекарственные средства с использованием исходных материалов животного происхождения для обнаружения загрязнения патогенной изоформой прионного белка (инфекционный прионный белок) более просто, быстро и количественно с более высокой чувствительностью при более низкой стоимости, чем когда-либо ранее. Кроме того, также возможно диагностировать прионные заболевания у людей и животных более просто, быстро и количественно с более высокой чувствительностью при более низкой стоимости, чем когда-либо ранее. Это предоставляет возможность удовлетворения социальных требований в области предотвращения инфекции и ранней диагностики прионных заболеваний у людей и животных. Как описано выше, настоящее изобретение обладает промышленной применимостью.
Claims (6)
1. Связывающее вещество патогенной изоформы прионного белка, включающее лактоферрин.
2. Связывающее вещество патогенной изоформы прионного белка по п.1, где лактоферрин иммобилизован на связывающем материале.
3. Связывающее вещество патогенной изоформы прионного белка по п.1 или 2, которое представляет собой агент для обнаружения патогенной изоформы прионного белка.
4. Способ обнаружения патогенной изоформы прионного белка, включающий стадии:
контактирование образца со связующим веществом патогенной изоформы прионного белка по п.2;
отделение связанного компонента от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, приведенного в контакт с образцом; и
обнаружение патогенной изоформы прионного белка, содержащейся в компоненте, отделенной от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка.
контактирование образца со связующим веществом патогенной изоформы прионного белка по п.2;
отделение связанного компонента от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, приведенного в контакт с образцом; и
обнаружение патогенной изоформы прионного белка, содержащейся в компоненте, отделенной от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка.
5. Способ по п.4, где на стадии обнаружения патогенной изоформы прионного белка, содержащейся в компоненте, отделенной от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, обнаружение патогенной изоформы прионного белка осуществляют посредством иммуноанализа.
6. Способ выделения патогенной изоформы прионного белка, включающий стадии:
контактирование образца со связующим веществом патогенной изоформы прионного белка по п.2; и
отделение связанного компонента от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, приведенного в контакт с образцом.
контактирование образца со связующим веществом патогенной изоформы прионного белка по п.2; и
отделение связанного компонента от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, приведенного в контакт с образцом.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007-300388 | 2007-11-20 | ||
| JP2007300388A JP4246777B1 (ja) | 2007-11-20 | 2007-11-20 | 異常型プリオン蛋白質結合剤および異常型プリオン蛋白質の検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2010125235A RU2010125235A (ru) | 2011-12-27 |
| RU2444735C1 true RU2444735C1 (ru) | 2012-03-10 |
Family
ID=40612059
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010125235/15A RU2444735C1 (ru) | 2007-11-20 | 2008-11-20 | Связывающее вещество патологического прионного белка и способ обнаружения патологического прионного белка |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8263348B2 (ru) |
| EP (1) | EP2224240A4 (ru) |
| JP (1) | JP4246777B1 (ru) |
| KR (1) | KR101100123B1 (ru) |
| CN (1) | CN101868726A (ru) |
| AU (1) | AU2008327433B2 (ru) |
| CA (1) | CA2705871A1 (ru) |
| NZ (1) | NZ584946A (ru) |
| RU (1) | RU2444735C1 (ru) |
| WO (1) | WO2009066454A1 (ru) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101351597B1 (ko) * | 2012-05-18 | 2014-01-16 | 전북대학교산학협력단 | 초유유래의 락토페린을 이용한 변형 프리온 단백질에 의해 유도되는 세포자멸사의 억제방법 |
| CN104109204B (zh) * | 2013-04-16 | 2017-11-07 | 武汉禾元生物科技股份有限公司 | 一种从水稻种子中分离纯化重组人乳铁蛋白的方法 |
| EP3056746B1 (en) | 2015-02-13 | 2019-04-10 | G.P. Consulting di Giuseppe Pritelli & C. S.a.s. | Method for the application of metalware to hollow-cored wood panels and structure of inserts for the implementation of said method |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2309410C2 (ru) * | 2002-02-28 | 2007-10-27 | Майкроусенс Байофейдж Лимитед | Связывание патологических форм прионовых белков |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10267928A (ja) | 1997-03-28 | 1998-10-09 | Norin Suisansyo Kachiku Eisei Shikenjo | 微量異常プリオン蛋白質もしくはその部分分解断片の検出方法 |
| JPH1132795A (ja) | 1997-07-18 | 1999-02-09 | Sangi Co Ltd | 病原性プリオン蛋白質の検出方法及びその濃縮方法 |
| US6172040B1 (en) | 1999-05-28 | 2001-01-09 | A. Satyanarayan Naidu | Immobilized lactoferrin antimicrobial agents and the use thereof |
| ATE312848T1 (de) * | 2000-05-23 | 2005-12-15 | Blood Transfusion Ct Of Sloven | Antikörper zum selektiven nachweis von prion prp sc isoformen |
| AU2002241909A1 (en) | 2001-01-19 | 2002-07-30 | Baxter Healthcare S.A. | Method of detecting prp protein and kits therefor |
| US20030096736A1 (en) * | 2001-05-09 | 2003-05-22 | Kruzel Marian L. | Lactoferrin for age related disorders in humans |
| JP3568198B2 (ja) | 2001-10-15 | 2004-09-22 | 独立行政法人農業・生物系特定産業技術研究機構 | 異常プリオンタンパク質の検出方法 |
| DE10155693A1 (de) * | 2001-11-07 | 2003-05-15 | Florian Schweigert | Verfahren zum Nachweis von apathogenen Partikeln und deren pathogenen Varianten im Organismus |
| WO2005070968A1 (ja) | 2004-01-21 | 2005-08-04 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 蛋白質の固定化方法及び定量方法 |
-
2007
- 2007-11-20 JP JP2007300388A patent/JP4246777B1/ja not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-11-20 WO PCT/JP2008/003396 patent/WO2009066454A1/ja active Application Filing
- 2008-11-20 CN CN200880116624A patent/CN101868726A/zh active Pending
- 2008-11-20 CA CA2705871A patent/CA2705871A1/en not_active Abandoned
- 2008-11-20 EP EP08853136A patent/EP2224240A4/en not_active Withdrawn
- 2008-11-20 AU AU2008327433A patent/AU2008327433B2/en not_active Ceased
- 2008-11-20 NZ NZ584946A patent/NZ584946A/en not_active IP Right Cessation
- 2008-11-20 US US12/742,169 patent/US8263348B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-11-20 KR KR1020107011561A patent/KR101100123B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2008-11-20 RU RU2010125235/15A patent/RU2444735C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2309410C2 (ru) * | 2002-02-28 | 2007-10-27 | Майкроусенс Байофейдж Лимитед | Связывание патологических форм прионовых белков |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| NEGREDO С.et al.: «A novel real-time ultrasonic method for prion protein detection using plasminogen as a capture molecule», BMC Biotechnology, BioMed Central Ltd., GB, 20.07.2007, 7:43. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101868726A (zh) | 2010-10-20 |
| JP2009128042A (ja) | 2009-06-11 |
| US20100221745A1 (en) | 2010-09-02 |
| AU2008327433B2 (en) | 2011-11-03 |
| RU2010125235A (ru) | 2011-12-27 |
| AU2008327433A1 (en) | 2009-05-28 |
| KR101100123B1 (ko) | 2011-12-29 |
| EP2224240A1 (en) | 2010-09-01 |
| US8263348B2 (en) | 2012-09-11 |
| EP2224240A4 (en) | 2011-01-19 |
| JP4246777B1 (ja) | 2009-04-02 |
| WO2009066454A1 (ja) | 2009-05-28 |
| NZ584946A (en) | 2011-10-28 |
| CA2705871A1 (en) | 2009-05-28 |
| KR20100086007A (ko) | 2010-07-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA004953B1 (ru) | Способ обнаружения и выделения аномального прионного белка и набор для его осуществления | |
| ES2564293T5 (es) | Enlazamiento de formas patológicas de proteínas priónicas | |
| Sailer et al. | Immunolocalization of BK channels in hippocampal pyramidal neurons | |
| JP4842478B2 (ja) | 生物学的試料における非通常伝達因子株によって引起こされる亜急性伝達性海綿状脳症の診断方法 | |
| US20020004586A1 (en) | Prion-binding activity in serum and proteins | |
| AU2015356180A1 (en) | Tim protein-bound carrier, methods for obtaining, removing and detecting extracellular membrane vesicles and viruses using said carrier, and kit including said carrier | |
| Kang et al. | A combined transgenic proteomic analysis and regulated trafficking of neuroligin-2 | |
| JP2824150B2 (ja) | スペクトリン又はその崩壊生成物の分析による細胞壊死検出 | |
| KR102424212B1 (ko) | 보르나바이러스 감염의 진단 방법 | |
| Tilley et al. | Histone H3 clipping is a novel signature of human neutrophil extracellular traps | |
| Tokuda et al. | Immunochemical characterization on pathological oligomers of mutant Cu/Zn-superoxide dismutase in amyotrophic lateral sclerosis | |
| RU2444735C1 (ru) | Связывающее вещество патологического прионного белка и способ обнаружения патологического прионного белка | |
| JP4422396B2 (ja) | ヒト起源の病原性プリオンを特異的に検出する抗体およびその体を用いて実施される検出方法 | |
| Yu et al. | Alpha-synuclein oligomerization increases its effect on promoting NMDA receptor internalization | |
| Silva | Using small molecule reagents to selectively modify epitopes based on their conformation | |
| Li et al. | Identification of antigens in the Trichinella spiralis extracellular vesicles for serological detection of early stage infection in swine | |
| JP3931625B2 (ja) | 異常型プリオン免疫測定用試薬を用いた異常型プリオンの免疫測定方法 | |
| EP1435521B1 (en) | Detection and diagnosis of transmissible spongiform encephalopathies | |
| JP2010523977A (ja) | プリオンアッセイ | |
| Didier et al. | Cellular prion protein in mammary gland and milk fractions of domestic ruminants | |
| Jankovicova et al. | Benefits of immunomagnetic separation for epitope identification in clinically important protein antigens: A case study using ovalbumin, carbonic anhydrase I and Tau protein | |
| KR20060051862A (ko) | 프리온 식별용 펩타이드 | |
| WO2013056841A1 (en) | A method for diagnosing tse | |
| CN113341145A (zh) | 一种s1f-axl复合物、试剂盒和检测该复合物的方法及应用 | |
| JP4769925B2 (ja) | 異常型プリオン蛋白質の濃縮方法、および除去方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20131121 |