KR101100123B1 - 이상형 프리온 단백질 결합제 및 이상형 프리온 단백질의 검출 방법 - Google Patents
이상형 프리온 단백질 결합제 및 이상형 프리온 단백질의 검출 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 프로테아제 K에 의한 효소 처리를 실시하는 일 없이 간편하게 신속 한편 고감도로 정량적으로 이상형 프리온 단백질을 정상형 프리온 단백질로부터 구별해 검출하는 방법, 및 상기 방법에서 사용되는 시약을 제공한다. 본 발명은, 락토페린을 포함하는 이상형 프리온 단백질 결합제, 및 상기 이상형 프리온 단백질 결합제를 사용하여 이상형 프리온 단백질을 검출하는 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 이상형 프리온 단백질 결합제 및 이상형 프리온 단백질의 검출 방법에 관한 것이다.
이른바 프리온병이, 큰 사회 문제가 되고 있다. 이 프리온병으로는, 전염 성해면상뇌증(Transmissible Spongiform Encephalopathies, TSEs), 예를 들면, 스크레피(Scrapie), 우해면상뇌증(Bovine Spongiform Encephalopathy, BSE), 크로이츠펠트-야콥 병(Creutzfeldt-Jakob Disease, CJD) 등이 알려져 있다.
여러가지 증거로부터, 이러한 프리온병은, 감염성 프리온 단백질(이상형 프리온 단백질)(pathogenic isoform of prion protein, PrPSc)에 의해 유발됨을 명백해졌다.
이에, 사람 및 동물의 프리온병의 전염을 예방하고, 의약품이나 식품의 안전성을 확보하기 위해서, 시료 중의 감염성 프리온 단백질(이상형 프리온 단백질)을 검출하려는 시도가 여러가지로 행해져 왔다.
그런데, 사람 및 동물은, 프리온병을 일으키지 않는 비감염성 프리온 단백질(정상형 프리온 단백질)(normal prion protein, PrPC)를 원래 생체 내에 가지고 있다. 그리고, 이 정상형 프리온 단백질은, 놀랍게도 이상형 프리온 단백질과 동일한 아미노산 서열(일차 구조)을 가지고 있으며, 이들 간에는 동일한 아미노산 서열로부터 형성된 고차 구조에만 차이점이 존재한다.
일반적으로, 2종류의 단백질을 구별해 검출하는 방법으로는, 이것들을 구별해 낼 수 있는 특이적인 항체를 사용하는 방법이 있다. 그러나, 아마도 상기한 아미노산 서열의 동일성으로 인해, 현재까지, 이상형 프리온 단백질과 정상형 프리온 단백질을 구별해 낼 수 있는 특이 항체는 얻지 못하고 있다. 즉, 시료 중의 감염성 프리온 단백질(이상형 프리온 단백질)을 특이적인 항체를 사용해 검출하는 방법은 아직도 실용화의 전망이 없다.
그 때문에, 현재까지 이상형 프리온 단백질의 검출 방법은 크게 나누어 다음의 2 종류의 방법으로 한정되어 있다.
한가지 방법은, 이상형 프리온 단백질(감염성 프리온 단백질)의 함유가 의심되는 시료를 시험 동물의 뇌내에 주입한 후 장기간의 사육을 실시해 얻을 수 있던 뇌표본에 있어서의 신경의 병리학적인 변화를 확인하는 방법이다.
이 방법은, 신뢰할 수 있는 방법이지만 유감스럽게도 과도한 시간과 비용을 필요로 하기 때문에 각종의 검출 방법의 교정시험으로서 사용되는 것 외엔, 상용되는 검출 방법이 되는데 이르지는 않았다.
또 한 가지의 방법은, 프로테아제 K를 사용한 방법이다. 아마도 그들의 고차 구조로 인해, 정상형 프리온 단백질은 프로테아제 K에 의해 분해되기 쉬운 반면, 이상형 프리온 단백질은 프로테아제 K에 의해 분해되기 어려운 것으로 알려져 있다. 이에, 이 프로테아제 K에 의한 분해에 대한 감수성의 차이를 이용하여, 예를 들면, 프로테아제 K처리를 한 후에, 처리 전과 같은 위치의 밴드의 단백질로서 폴리클로날 항체를 사용한 이뮤노블롯팅 등에 의해서 검출되면 이상형 프리온 단백질이며, 대응하는 밴드가 소실되어 있으면(검출되지 않으면) 정상형 프리온 단백질이라고 판정함으로써 검출을 수행할 수 있다.
이 프로테아제 K를 사용한 검출 방법은 현재 널리 사용되고 있으며, 많은 변형법이 제안되고 있다(특허 문헌 1：특개평 10267928호 공보, 특허 문헌 2：특개평 1132795호 공보, 특허 문헌 3：특개 2003121448호 공보).
그러나, 이 방법은 효소 처리를 실시하는 것을 필수로 하고 있어, 효소 반응에 적절한 조건을 준비해야 하는 점으로 인해 번잡하고, 효소 반응을 수행하기 위한 시간을 필요로 하여, 그 결과, 신속성이나 간이성이 부족한 점, 시약으로서 비교적 고가의 효소를 필수로 하는 점 등의 결점을 근본적으로 갖고 있다.
따라서, 프로테아제 K에 의한 효소 처리를 실시하는 일 없이, 간편하고 신속한 한편 고감도이면서 정량적으로 이상형 프리온 단백질을 정상형 프리온 단백질로부터 구별하고 검출하는 방법이 요구되고 있다.
즉, 본 발명의 목적은, 프로테아제 K에 의한 효소 처리를 실시하는 일 없이, 간편하고 신속한 한편 고감도이면서 정량적으로 이상형 프리온 단백질을 정상형 프리온 단백질로부터 구별하고 검출하는 방법, 및 상기 방법에서 사용되는 검출제를 제공하는 것에 있다.
또, 이러한 검출 방법으로 사용하기 위해서, 정상형 프리온 단백질과는 결합하지 않고, 이상형 프리온 단백질에 특이적으로 결합하는 시약(결합제)이 요구되고 있었다.
즉, 본 발명의 목적은, 정상형 프리온 단백질과는 결합하지 않고, 이상형 프리온 단백질에 특이적으로 결합하는 시약(결합제)을 제공하는 것에도 있다.
본 발명자들은 상기 목적을 위해 이상형 프리온 단백질의 특이적인 검출 방법을 열심히 연구해 왔는데, 포유동물의 젖 유래의 단백질인 락토페린이 정상형 프리온 단백질과는 결합하지 않고, 이상형 프리온 단백질에만 특이적으로 결합하는 성질을 가지고 있는 것을 찾아내고, 본 발명을 완성하였다.
즉, 락토페린은, 오랫동안 찾던, 정상형 프리온 단백질과는 결합하지 않고 이상형 프리온 단백질에 특이적으로 결합하는 시약(결합제)이며, 이 락토페린을 사용하면, 프로테아제 K에 의한 효소 처리를 실시하는 일 없이, 이상형 프리온 단백질을 정상형 프리온 단백질로부터 구별하고, 검출할 수 있다.
또, 락토페린의 이상형 프리온 단백질에 특이적으로 결합하는 성질을 이용하는 것에 의해서, 이상형 프리온 단백질의 특이적인 검출이 가능하게 될 뿐만 아니라, 이상형 프리온 단백질의 특이적인 분리(정제 및 농축을 포함한다), 이상형 프리온 단백질의 특이적인 고정화, 이상형 프리온 단백질의 자기 회합의 특이적인 저해가 가능하게 되어, 프로테아제 K에 의한 효소 처리에 의한 방법에서는 불가능한 새로운 용도가 제공되고 있다. 즉, 본 발명에 의한 이상형 프리온 단백질 결합제는, 이러한 유용한 용도를 가지고 있다.
따라서, 본 발명은 다음의 [1] 내지 [2]를 제공한다.
[1] 락토페린을 포함하는 이상형 프리온 단백질 결합제.
[2] 락토페린으로 이루어진 이상형 프리온 단백질 결합 부위를 가지는 이상형 프리온 단백질 결합제.
또, 락토페린을 담체에 고정화하여 사용하면, 이상형 프리온 단백질만을 정상형 프리온 단백질로부터 분리(정제 및 농축을 포함한다)하여 얻는 것, 이상형 프리온 단백질을 결합시켜 고정화하는 것, 이상형 프리온 단백질을 검출하는 것을, 특히 매우 효과적으로 수행할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 다음의 [3] 내지 [6]를 제공한다.
[3] 락토페린이 담체에 고정화된, [1] 또는 [2]에 따른 이상형 프리온 단백질 결합제.
[4] 락토페린이 이상형 프리온 단백질 결합 부위로서 담체에 고정화되어 있는, [1] 또는 [2]에 따른 이상형 프리온 단백질 결합제.
[5] 담체가 비드인, [3] 또는 [4]에 따른 이상형 프리온 단백질 결합제.
[6] 비드가 자성화 가능한 비드인, [5]에 따른 이상형 프리온 단백질 결합제
이러한 이상형 프리온 단백질 결합제는 이상형 프리온 단백질의 검출의 용도에 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 다음의 [7] 내지 [9]를 제공한다.
[7] 이상형 프리온 단백질 검출제인, [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 따른 이상형 프리온 단백질 결합제.
[8] 락토페린으로 이루어진 이상형 프리온 단백질 결합 부위를 가지는 이상형 프리온 단백질 검출제인, [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 따른 이상형 프리온 단백질 결합제.
[9] 락토페린으로 이루어진 이상형 프리온 단백질 결합 부위, 및 표지 부위를 포함하는 이상형 프리온 단백질 검출제인, [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 따른 이상형 프리온 단백질 결합제.
본 발명은 또한 이상형 프리온 단백질 결합제, 또는 이상형 프리온 단백질 검출제를 사용하여 이상형 프리온 단백질을 검출하는 방법, 결합시키는 방법, 분리하는 방법(정제 하는 방법, 및 농축하는 방법을 포함한다), 고정화하는 방법, 또는 이상형 프리온 단백질의 자기 회합을 저해하는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명은 다음의 [10] 내지 [18]을 제공한다.
[10] [3] 내지 [6] 중 어느 하나에 따른 이상형 프리온 단백질 결합제를 시료에 접촉시키는 단계;
시료에 접촉시킨 상기 이상형 프리온 단백질 결합제로부터, 결합한 성분을 분리하는 단계; 및
분리한 성분에 포함되는 이상형 프리온 단백질을 검출하는 단계
를 포함하는 이상형 프리온 단백질의 검출 방법.
[11] 분리한 성분에 포함된 이상형 프리온 단백질을 검출하는 단계가, 분리한 성분에 포함된 이상형 프리온 단백질을 면역학적 검출법에 따라 검출하는 단계인, [10]에 따른 방법.
[12] 면역학적 검출법이 웨스턴블롯법, ELISA법, 또는 면역침강법인 [11]에 따른 방법.
[13] 다음의 단계：
[3] 내지 [6] 중 어느 하나에 따른 이상형 프리온 단백질 결합제를 시료에 접촉시키는 단계; 및
시료에 접촉시킨 상기 이상형 프리온 단백질 결합제로부터 결합한 성분을 분리하는 단계
를 포함하는 이상형 프리온 단백질의 분리 방법.
[14] 락토페린이 담체에 고정화되어 있는 이상형 프리온 단백질 결합제가 락토페린 고정화 비드인, [10] 내지 [13] 중 어느 하나에 따른 방법.
[15] 이상형 프리온 단백질 결합제가 자성화 가능한 비드가 사용되는 락토페린 고정화 비드인, [10] 내지 [13] 중 어느 하나에 따른 방법.
[16] 시료가 동물 조직에 계면활성제를 첨가해 균일화하여 얻을 수 있는 액체 시료인, [10] 내지 [15] 중 어느 하나에 따른 방법.
[17] 동물 조직이 포유동물의 뇌, 척수, 눈, 및/또는 소장인, [16]에 따른 방법.
[18] 결합한 성분을 분리하는 단계가 락토페린을 함유한 용액으로 용출함으로써 수행되는 것인, [10] 내지 [17] 중 어느 하나에 따른 방법.
또한 본 발명은 다음의 [19] 내지 [22]을 제공한다.
[19] 락토페린을, 이상형 프리온 단백질에 결합시키는 단계; 및
이상형 프리온 단백질에 결합한 락토페린을 검출하는 단계
를 포함하는 이상형 프리온 단백질의 검출 방법.
[20] 표지 부위를 가지는 락토페린을 이상형 프리온 단백질에 결합시키는 단계; 및
이상형 프리온 단백질에 결합한 락토페린의 표지 부위를 검출하는 단계
를 포함하는 이상형 프리온 단백질의 검출 방법.
[21] 락토페린을 이상형 프리온 단백질에 결합시키고, 이상형 프리온 단백질의 자기 회합을 저해하는 방법.
[22] 락토페린을 포함하는 이상형 프리온 단백질의 자기 회합 저해제.
또한 본 발명은 이상형 프리온 단백질에 결합시키기 위한 락토페린, 표지 부위를 가지는 락토페린, 또는 담체에 고정화된 락토페린의 용도를 제공한다.
또한 본 발명은 이상형 프리온 단백질을 검출하기 위한, 락토페린, 표지 부위를 가지는 락토페린, 또는 담체에 고정화된 락토페린의 용도를 제공한다.
또한 본 발명은 이상형 프리온 단백질을 분리하기 위한, 락토페린, 표지 부위를 가지는 락토페린, 또는 담체에 고정화된 락토페린의 용도를 제공한다.
또한 본 발명은 이상형 프리온 단백질의 자기 회합을 저해하기 위한, 락토페린, 표지 부위를 가지는 락토페린, 또는 담체에 고정화된 락토페린의 용도를 제공한다.
상기 기술한 바와 같이, 본 발명은 락토페린이 정상형 프리온 단백질과는 결합하지 않고, 이상형 프리온 단백질에만 특이적으로 결합함을 처음으로 개시한다. 이러한 발견에 근거한 본 발명에 따르면, 프로테아제 K에 의한 효소 처리를 실시하는 일 없이, 간편하고 신속한 한편 고감도로 정량적으로, 이상형 프리온 단백질을 정상형 프리온 단백질로부터 구별하고, 검출할 수 있다.
즉, 본 발명에 의하면, 이상형 프리온 단백질을 정상형 프리온 단백질로부터 구별하기 위해, 프로테아제 K에 의한 효소 처리를 실시하는 것이 불필요하기 때문에, 효소 반응에 적절한 조건을 준비해야 하는 번잡함이 없고, 효소 반응을 행하기 위한 시간을 필요로 하지 않는다. 결과적으로 본 발명에 의하면, 프로테아제 K에 의한 효소 처리를 실시하는 경우에 생겼던, 신속성이나 재현성이 충분하지 않았던 점, 시약으로서 비교적 고가의 효소를 필수로 하는 점 등의 결점을 근본적으로 가지지 않는다.
따라서, 본 발명에 의하면, 동물에 유래하는 원재료를 사용한 음식품 및 의약품에 대해서 이상형 프리온 단백질(감염성 프리온 단백질)에 의한 오염의 검사를 종래보다 간편하고 신속한 한편 고감도로 정량적으로, 한층 더 저비용으로 실시할 수 있다. 또한, 사람 및 동물에 있어서의 프리온병의 진단을 종래보다 간편하고 신속한 한편 고감도로 정량적으로, 한층 더 저비용으로 실시할 수 있다.이는 사람 및 동물에의 프리온병의 감염 방지나 조기진단에 대한 사회적 요청을 충족시켜준다.
또한 본 발명에 의하면, 이상형 프리온 단백질을 정상형 프리온 단백질로부터 분리 회수해 얻을 수 있어 이것에 의해서 이상형 프리온 단백질의 분리, 농축, 및 정제가 가능해진다. 따라서, 본 발명의 이러한 측면들을 조합함으로써, 상기한 이상형 프리온 단백질(감염성 프리온 단백질)에 의한 오염의 검사, 및 사람 및 동물에 있어서의 프리온병의 진단을 한층 더 효과적으로 수행할 수 있다.
도 1은 락토페린 고정화 비드에의 이상형 프리온 단백질의 특이적인 결합을 나타내는 이뮤노블롯의 결과이다.
도 2는 종래의 방법인 프로테아제 K처리에 의한 이상형 프리온 단백질의 식별을 나타내는 이뮤노 블롯의 결과이다.
도 2는 종래의 방법인 프로테아제 K처리에 의한 이상형 프리온 단백질의 식별을 나타내는 이뮤노 블롯의 결과이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시형태에 대해 상세하게 설명한다. 다만, 본 발명은 이하의 바람직한 실시형태로 한정되지 않고, 본 발명의 범위 내에서 자유롭게 변경할 수 있다. 본 명세서에 대해 백분율은 특히 거절이 없는 한 질량에 의한 표시이다.
본 발명에 따른 이상형 프리온 단백질의 검출 방법은, 바람직한 실시태양으로서,
락토페린이 담체에 고정화되어 있는 이상형 프리온 단백질 결합제를 시료에 접촉시키는 단계;
시료에 접촉시킨 이상형 프리온 단백질 결합제로부터 결합한 성분을 분리하는 단계; 및
분리한 성분에 포함된 이상형 프리온 단백질을 검출하는 단계
을 포함한 방법으로서 실시할 수 있다.
이 방법에 의하면, 시료 중에 포함되어 있는 이상형 프리온 단백질을 이상형 프리온 결합제 중에 고정화되어 있는 락토페린에 의해 특이적으로 결합시킨 후, 이상형 프리온 결합제 중에 고정화되어 있는 락토페린과 결합한 이상형 프리온 단백질을 분리해 회수하고, 이와 같이 분리된 이상형 프리온 단백질을 검출함으로써, 이상형 프리온 단백질을 정상형 프리온 단백질과 구별하고, 검출할 수 있다.
분리한 성분에 포함된 이상형 프리온 단백질을 검출하는 단계는, 분리한 성분에 포함된 이상형 프리온 단백질을 면역학적 검출법에 따라 검출하는 단계인 것이 바람직하다.
바람직한 면역학적 검출법으로는, 웨스턴블롯법, ELISA법, 또는 면역 침강법을 들 수 있다.
분리한 성분에 포함되는 이상형 프리온 단백질을 검출하는 단계에서 수행되는 검출은, 상기 면역학적 검출법을 포함하며, 이상형 프리온 단백질을 검출할 수 있는 방법이면 되고, 이상형 프리온 단백질과 정상형 프리온 단백질을 구별할 수 없는 방법이어도 당연히 사용할 수 있다. 이는, 본 발명에 따르면, 그 이전의 단계에서, 락토페린과의 결합을 실시하는 것에 의해 이상형 프리온 단백질에 대한 특이성은 이미 확보되고 있기 때문이다. 따라서, 상기의 면역학적 검출법에 대해서는, 이상형 프리온 단백질과 정상형 프리온 단백질을 구별하지 않는 항체여도, 당연히 사용할 수 있다.
락토페린(lactoferrin：이하, LF로 약기하는 일이 있다.)이란 주로 모유 중에 포함되어 있는 분자량 약 80킬로 달톤의 철-결합성 당단백질이며, 대장균, 칸지다균, 클로스트리듐균, 포도상구균 등의 유해 미생물에 대한 항균 활성이나, 면역 조절 활성, 항종양 활성 등과 같은 다양한 활성을 가지는 유단백질로서 알려져 있다. 락토페린은 젖 유래의 당단백질이기 때문에, 안전성이 높고, 장기 연용하는 것이 가능하고, 그 자체는 대부분 무미 무취이며, 각종의 식품·의약품·사료의 첨가물로서 범용성이 높다. 그러나, 이상형 프리온 단백질과의 특이적인 결합능은 지금까지 알려지지 않았었다.
본 발명에 사용하는 락토페린은 시판의 락토페린이나, 포유동물(예를 들면, 사람, 소, 염소, 양, 말 등)의 초유, 이행유, 상유, 말기유, 또는 이러한 젖의 처리물인 탈지유, 유장 등을 원료로 하여, 예를 들면 이온 교환 크로마토그래피 등의 통상적인 방법에 의해, 상기 원료로부터 분리해 얻을 수 있는 락토페린을 이용할 수 있다. 그 중에서도, 공업적 규모로 제조되고 있는 시판의 락토페린(예를 들면, 모리나가유업사제)을 사용하는 것이 매우 적합하다. 또한, 유전공학적 방법에 의해, 미생물, 동물세포, 트랜스제닉(transgenic) 동물 등으로부터 생산한 락토페린을 사용하는 것도 가능하다. 우유 유래의 유장은 유제품 제조의 부산물로서 안정되어 대량으로 얻을 수 있는 이점이 있기 때문에, 본 발명에 사용하는 락토페린의 원료로서 특히 매우 적합하다.
여기서, 락토페린의 조제(젖 등의 원료로부터의 락토페린의 분리, 정제) 방법의 일례를 이하에 나타낸다. 우선, 이온 교환체(예를 들어 CM세파로스 FF(상품명, 아마샴파마시아사제))를 컬럼에 충전하고, 염산을 컬럼을 통해 통과시키고, 컬럼을 물로 세척하여 이온 교환체를 평형화한다. 계속하여, 4℃로 냉각한 pH 6.9의 탈지 우유를 컬럼을 통해 통과시키고, 투과액을 회수해, 재차 같은 방식으로 컬럼을 통과시킨다. 그 다음, 증류수를 컬럼에 통과시키고, 식염수를 통과시켜 이온 교환체에 흡착한 알칼리성 단백질의 용출액을 얻는다. 이 용출액에 포화도 80%의 황산암모늄을 첨가하여 단백질을 침전시키고 원심분리하여 침전물을 회수한다. 회수한 침전물을 포화도 80%의 황산암모늄 용액으로 세정하고 탈이온수를 첨가하여 용해시켰다. 그런 다음, 이 용액을 한외여과막모듈(예를 들어 SLP0053(상품명, 아사히카제이사제))을 이용해 탈염한 후, 동결건조하여, 분말상의 소 락토페린을 얻는다. 이런 방식으로, 순도가 95 질량% 이상의 소 락토페린을 얻을 수 있다. 덧붙여 본 명세서에 있어서의 락토페린의 순도는 액체 크로마토 그래프법에 의해 측정해 얻을 수 있는 값으로 한다.
많은 단백질들처럼, 락토페린 또한 종, 속, 개체 등의 차이에 따라 하나 이상의 위치에서의 하나 이상의 염기의 치환, 결실, 삽입, 부가, 또는 역위 등의 변이가 당연히 존재하므로, 이러한 변이를 가지는 유전자가 코드 하는 단백질의 아미노산에 대해도 변이가 생겨 있는 경우가 있다. 본 발명에 이용할 수 있는 락토페린에는 이상형 프리온 단백질과의 특이적인 결합성이 손상되지 않는 범위에서 이러한 변이를 포함하는 락토페린도 포함된다.
락토페린이 담체에 고정화되어 있는 이상형 프리온 단백질 결합제를 제조하기 위해서 사용할 수 있는 락토페린의 고정화의 방법은, 이상형 프리온 단백질과의 특이적인 결합성이 손상되지 않는 것이면, 통상의 고정화 방법을 사용할 수 있다. 이러한 방법으로는, 예를 들면, 폴리펩티드의 일차 아미노기에 대해서 직접 공유결합을 형성하는 방법, 폴리펩티드의 티올기에 대해서 직접 공유결합을 형성하는 방법 등을 들 수 있다.
락토페린이 담체에 고정화되어 있는 이상형 프리온 단백질 결합제에 대해서, 락토페린이 고정화되는 담체는 원하는 조건하에서 고체상으로서 조작할 수 있는 것이고, 단백질이 고정화되어 사용되는 일반적인 담체이면 사용할 수 있다. 이러한 담체로는 예를 들어, 친수성 또는 소수성의 수지를 표면에 가지는 것을 포함하며, 그러한 담체는 예를 들면, 입자(비드), 막, 섬유, 중공사, 망 등의 다양한 형상을 취할 수 있다. 그 중 바람직한 담체로는 비드(입자)의 형상의 것을 들 수 있다. 비드(입자)의 입경(직경)은 목적에 따라 선택할 수 있지만 예를 들면, 일반적으로 0.5 내지 200㎛, 바람직하게는 1.0 내지 100㎛, 보다 바람직하게는 1.0 내지 50㎛, 보다 더 바람직하게는 1.0 내지 20㎛, 보다 더욱 더 바람직하게는 1.0 내지 10㎛, 특히 바람직하게는 1.0 내지 5.0㎛의 범위의 것을 사용할 수 있다.
상기 기술한 바와 같이, 바람직하게는 담체로서 소수성 또는 친수성의 수지를 표면에 가지는 비드(입자)를 사용할 수 있다. 이 경우, 락토페린이 담체에 고정화되어 있는 이상형 프리온 단백질 결합 활성 담체란 락토페린-고정화 비드를 말한다. 이러한 담체를 사용하면 액체 중에 현탁시키고 분산시켜 이용할 수 있으며, 조작상의 필요에 따라 침강시켜 회수하는 것도 용이하다.
보다 더 바람직하게는, 담체로서 소수성 또는 친수성의 수지를 표면에 가지는 비드(입자)로서, 그 내부(중심부)에 자성화 가능한 재료를 포함하는 것을 사용할 수 있다. 이 경우, 락토페린이 담체에 고정화되어 있는 이상형 프리온 단백질 결합 활성 담체란 자성화 가능한 비드가 사용된 락토페린-고정화 비드를 말한다. 이러한 담체를 사용하면 액체 중에 현탁시키고 분산시킬 수 있으며, 조작상의 필요에 따라서 자석에 의해서 용이하게 침강 시켜 회수할 수 있다. 이러한 조작은 당업자가 작업상의 필요에 따라, 락토페린 고정화 비드를 시료에 접촉시키는 단계, 결합한 성분을 분리하는 단계 등의 단계 중에, 혹은 그 단계의 전후에 실시할 수 있다.
시료는 이상형 프리온 단백질(감염성 프리온 단백질)의 존재가 의심되는 모든 액체 시료를 사용할 수 있지만, 이상형 프리온 단백질이 존재하고 있는 경우 시료 중에 충분히 분산되어 있는 것이 바람직하다. 검사의 대상이 동물 조직인 경우에는 이것이 충분히 가용화되어 있는 것이 바람직하다. 이와 같이 가용화 된 시료로는 예를 들면 동물 조직에 계면활성제를 첨가해 균일화함으로써 얻을 수 있는 액체 시료를 들 수 있다. 이러한 액체 시료의 pH는 바람직하게는 중성 부근이며, 일반적으로 pH 5.5 내지 7.8, 바람직하게는 pH 6.0 내지 7.7, 특히 바람직하게는 pH 6.5 내지 7.6의 범위의 pH를 매우 적합하게 사용할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 액체 시료를 제조하기 위해서 사용되는 계면활성제로서는 동물 조직을 가용화하기 위해서 일반적으로 사용되는 계면활성제이면 사용할 수 있지만, 가용화와 프리온 단백질의 고차 구조의 보관 유지의 측면상, 비이온성 계면활성제를 사용하는 것이 바람직하고, 매우 적합하게 사용 가능한 계면활성제로서는, 예를 들면 tween 20, triton X-100, NP-40, 바람직하게는, tween 20, triton X-100, NP-40, 특히 바람직하게는 tween 20, NP-40을 들 수 있다. 시료는 락토페린과 이상형 프리온 단백질과의 특이적인 결합성의 확보를 위해서, 후술한 바와 같은 조건하에서, 이상형 프리온 단백질 결합 활성 담체와 접촉할 수 있는 액체 시료로서 제조되어 있는 것이 바람직하다.
락토페린과 이상형 프리온 단백질과의 특이적인 결합성의 확보를 위해서, 이상형 프리온 단백질 결합 활성 담체와 시료와의 접촉은, 일반적으로 pH 5.5 내지 7.8, 바람직하게는 pH 6.0 내지 7.7, 특히 바람직하게는 pH 6.5 내지 7.6의 범위, 일반적으로 3 내지 30℃, 바람직하게는 3 내지20℃, 특히 바람직하게는 3 내지 5℃의 범위의 온도, 일반적으로 5 내지 300분, 바람직하게는 10 내지 180분, 특히 바람직하게는 15 내지 90 분의 범위의 접촉 시간의 조건으로, 매우 적합하게 실시할 수 있지만, 이러한 조건에 한정되는 것은 아니다.
가용화되는 동물 조직으로는, 이상형 프리온 단백질(감염성 프리온 단백질)의 존재가 의심되는 모든 동물 조직을 사용할 수 있지만, 조기진단을 위해서는, 이상형 프리온 단백질의 축적이 많은 것으로 알려져 있는 포유동물의 뇌, 척수, 눈, 및/또는 소장인 것이 바람직하다.
시료에 접촉시킨 이상형 프리온 단백질 결합제로부터 결합한 성분을 분리하는 단계에서, 단백질-단백질의 상호작용의 해리에 일반적으로 사용되는 조건 중 비교적 강한 해리 조건으로 결합한 성분을 해리시켜, 분리하고 용출시킬 수 있다. 이러한 조건으로서는, 예를 들면 중성 부근의 pH로 계면활성제를 함유 시킨 용액에 의해서 3 내지 30℃의 범위의 온도로 실시하는 조건을 들 수 있다. 다르게는, 락토페린을 함유하는 용액을 이용하여 용출에 의해 락토페린과 이상형 프리온 단백질과의 특이적인 결합을 해리시킴으로써 결합된 성분을 분리할 수 있다.
바람직한 실시의 태양으로서, 락토페린이 담체에 고정화되어 있는 이상형 프리온 단백질 결합제를 시료에 접촉시키는 단계의 다음에 있고, 시료에 접촉시킨 이상형 프리온 단백질 결합제로부터 결합한 성분을 분리하는 단계의 전에, 시료에 접촉시킨 이상형 프리온 단백질 결합제를 세정하는 단계를 마련할 수 있다. 이 세정은, 주로 비특이적인 흡착을 하고 있는 성분이 있었을 경우에, 이것을 시료에 접촉시킨 이상형 프리온 단백질 결합제로부터 제거하는 것을 목적으로 하여 수행되는 것으로, 이러한 목적으로 수행되는 일반적인 방법에 따라 실시할 수 있다. 그러한 방법으로는 예를 들면, 이상형 프리온 단백질 결합제에 접촉시키는 시료를 제조하기 위해서 사용된 용액으로서 가용화된 동물 조직 등이 포함되지 않은 용액을 사용해 세정하는 것으로 실시할 수 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 이상형 프리온 단백질의 분리 방법을 제공한다. 바람직한 실시의 태양으로, 본 발명에 따른 이상형 프리온 단백질의 분리 방법은
락토페린이 담체에 고정화되어 있는 이상형 프리온 단백질 결합제를 동물 조직이 가용화된 시료에 접촉시키는 단계; 및
시료 접촉 처리 단계를 거친 이상형 프리온 단백질 결합 활성 담체로부터 결합한 성분을 분리하는 단계
을 포함하는 방법으로서 실시할 수 있다.
이 방법에 의하면, 시료 중에 포함되어 있는 이상형 프리온 단백질을, 이상형 프리온 결합제 중에 고정화되어 있는 락토페린에 의해 특이적으로 결합시킨 후, 이상형 프리온 결합제 중에 고정화되어 있는 락토페린과 결합한 이상형 프리온 단백질을 분리해 회수할 수 있다. 이것에 의해서 이상형 프리온 단백질의 분리, 농축, 및 정제가 가능하다.
상기 본 발명에 따른 이상형 프리온 단백질의 분리 방법의 실시의 태양은, 본 발명에 따른 이상형 프리온 단백질의 검출 방법의 바람직한 실시 형태로서 설명한 단계 중, 분리한 성분에 포함된 이상형 프리온 단백질을 검출하는 단계를 제외하고는 동일한 단계를 수행함으로써 실시할 수 있다. 따라서, 이상형 프리온 단백질의 검출 방법의 바람직한 실시의 태양에 관련해 이미 언급한 내용은, 이상형 프리온 단백질의 분리 방법의 실시의 태양에 대해서도, 그대로 적용시킬 수 있다.
본 발명에 따른 락토페린이 포함되어 있는 이상형 프리온 단백질 결합제는, 락토페린이 담체에 고정화되어 있는 이상형 프리온 단백질 결합제로서 상기 언급한 바와 같은 실시예 태양에 대해 사용할 수 있는 것 외에도 다음과 같은 실시의 태양에 대해서도 사용할 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 이상형 프리온 단백질 결합제의 매우 적합한 사용의 태양으로서,
락토페린을 이상형 프리온 단백질에 결합시키는 단계; 및
이상형 프리온 단백질에 결합한 락토페린을 검출하는 단계
를 포함하는 이상형 프리온 단백질의 검출 방법을 들 수 있다.
상기 이상형 프리온 단백질의 검출 방법에 의하면, 락토페린은 특별한 수식(modification) 없이도 이상형 프리온 단백질 결합제로서 사용할 수 있다. 이상형 프리온 단백질의 검출은 결합한 락토페린의 검출에 의해서 수행할 수 있다.
락토페린의 검출법으로는 일반적으로 사용되는 모든 검출 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 락토페린에 대한 항체를 사용한 면역학적인 검출법을 사용할 수 있다.
또, 본 발명에 따른 이상형 프리온 단백질 결합제의 매우 바람직한 태양으로서,
표지 부위를 가지는 락토페린을 이상형 프리온 단백질에 결합시키는 단계; 및
이상형 프리온 단백질에 결합한 락토페린의 표지 부위를 검출하는 단계
를 포함하는 이상형 프리온 단백질의 검출 방법을 들 수 있다.
상기 이상형 프리온 단백질의 검출 방법에 의하면, 락토페린은 미리 표지 부위를 교부해 두어 이 표지 부위를 가지는 락토페린을 이상형 프리온 단백질 결합제로서 사용한다. 이상형 프리온 단백질의 검출은, 락토페린에 결합된 표지 부위의 검출에 의해서 수행할 수 있다.
표지 부위로는, 생체고분자(biopolymer)에 대해서 일반적으로 사용되는 표지 부위이면 어떠한 것이든 사용할 수 있다. 이러한 표지 부위로서 예를 들면, 형광 표지, 방사선 표지, 효소 표지를 들 수 있다. 형광 표지로는, 예를 들면, Alexa Fluor(등록상표)(베크톤디킨손사제) 시리즈의 색소, 및 CyeDye(등록상표)(베크톤디킨손사제) 시리즈의 색소를 들 수 있다. 바람직하게는 이들 형광 표지 중 예를 들면, Alexa Fluor(등록상표) 488및 Alexa Fluor(등록상표) 647, 혹은 Cy3, Cy5.5및 Cy7를 사용할 수 있다. 방사선 표지로서는, 예를 들면, 14C 및 35S를 사용한 표지를 들 수 있다. 효소 표지로서는, 예를 들면, 호오스래디쉬 퍼옥시다아제 (HRP, HorseRadish Peroxydase) 혹은 알칼라인 포스파타아제(ALP, Alkaline Phosphatase)를 사용한 표지를 들 수 있다.
본 발명은 또한 이상형 프리온 단백질 결합제를 사용하여 이상형 프리온 단백질의 자기 회합을 저해하는 방법, 및 이상형 프리온 단백질의 자기 회합 저해제를 제공한다. 현재, 이상형 프리온 단백질은 다수의 분자가 자기 회합 해 다량체를 형성하고, 아마도 그에 따라 프리온병의 병원성이 향상되는 것으로 여겨지고 있다. 본 발명에 따른 이상형 프리온 단백질 결합제는 이상형 프리온 단백질에 특이적으로 결합함으로써 이 자기 회합을 저해할 수 있다. 한편, 본 발명에 따른 이상형 프리온 단백질 결합제는 정상형 프리온 단백질에는 결합하지 않기 때문에, 정상형 프리온 단백질이 가지고 있다고 여겨지는 미지의 생체 기능에 악영향을 줄 우려가 없다.
[실시예]
이하 실시예를 들어 본 발명을 상세하게 설명하나, 본 발명이 이하의 실시예로 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
[락토페린 고정화 비드에 의한 감염뇌로부터의 이상형 프리온 단백질의 검출]
이상형 프리온 단백질 감염 마우스 뇌를 사용하여, 아래와 같이 락토페린 고정화 비드에 의한 이상형 프리온 단백질의 검출을 수행하였다.
(락토페린 고정화 비드의 제작)
1 mL 의 Dynabeads M-280 Tosylactivated 를 1 mL의 PBS로 2회 세정한 후, 0.1M 붕산 완충액 1 mL에 1 mg 의 락토페린을 용해시킨 용액을 여기에 가하고 37℃에서 24시간 동안 전도 혼화시켰다. 상청액을 제외한 Dynabeads를 1 mL의 PBS로 2회 세정해, Dynabeads에 0.1% 락토페린을 포함한 0.2 M트리스 염산 완충액(pH 8.5) 1 mL을 가하여 37℃에서 4시간 동안 전도 혼화시켰다.
그런 다음, 상청액을 제외한 Dynabeads를 1 mL의 0.1%락토페린을 포함한 PBS로 1회 세정한 후, 0.1% Tween 20 을 포함한 PBS로 1회 세정하였다.
다음으로, 상청액을 제외한 Dynabeads를 1 mL의 0.1% 락토페린을 포함한 PBS로 1회 세정한 후, 상청액을 제외하고, 이와 같이 하여 얻을 수 있던 락토페린 결합 Dynabeads(이하에, 락토페린 결합 비드, 또는 락토페린 고정화 비드라고도 한다)를 1 mL의 0.1% 락토페린을 포함한 PBS로 보존하였다.
(뇌조직을 가용화한 시료(뇌유제)의 조제)
이상형 프리온 단백질에 감염한 마우스로부터 뇌를 꺼냈다. 이상형 프리온 단백질 감염 마우스뇌(이하에, 감염뇌라고도 한다)를 BioMasher 에 넣고 10,000×g로 2분간 원심분리한 후, 회수한 펠렛에 NP-40 RIPA를 더해 10%(w/v) 뇌유제(brain homogenate)를 제조하였다. 이것을 4℃로 15분 동안 인큐베이션 한 후, 교반 혼화하여, 10,000×g로 2분간 원심분리하고, 상청액을 회수하였다. 회수한 상청액에 NP-40 RIPA를 더해 2%(w/v) 뇌유제(뇌조직을 가용화한 시료)를 제조하였다. 이러한 방식으로, 감염뇌에 의한 뇌유제(이하, 감염뇌유제라고도 한다)를 얻었다.
(락토페린 고정화 비드에 의한 이상형 프리온 단백질의 분리)
뇌유제 500㎕에 락토페린-결합 Dynabeads를 20㎕ 가하고 4℃에서 1시간 동안 전도 혼화 하였다. 그 후, 비드를 1 mL의 NP-40 RIPA에서 10분간 3회 세정하고, 1 mL의 NP-40 RIPA 중에서 밤새 세정하였다.
세정한 락토페린-결합 Dynabeads를 회수해, 20㎕ 중성 완충액(NuPAGE LDS 샘플 버퍼(4×, Invitrogen 사제)를 가하고, 95℃에서, 10분간 가열하여 시험 시료로 하였다.
덧붙여 비드는 자성체의 비드이기 때문에, 비드의 회수는 조작 중에 적당한 자석을 이용하여 회수하였다.
(이뮤노블롯에 의한 검출)
조제한 시험 시료에 포함된 프리온 단백질은 이뮤노블롯법에 의해 검출되었다.
즉, 시험 시료를, NuPAGE 겔을 이용해 전기 영동(40 mA 정전류, 70분 )한 후, 탱크식 전사 장치를 이용해 PVDF막에 겔 중의 단백질을 전사(220 mA 정전류, 60분 )하였다.
전사 후의 PVDF막을 블록 에이스(다이니혼 제약)를 이용해 4℃에서, 30분간 블로킹한 후, 0.1% Tween20를 포함한 블록 에이스로 5,000배 희석한 HRP 결합 항프리온 단백질 단일 클론 항체(T2-HRP)를 포함한 용액을 PVDF막에 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
항체와 반응시킨 PVDF막은, 0.1% Tween 20을 포함한 PBS로 10분간, 3회 세정하고, 화학 발광 검출 시약으로 막을 전개해, 화상 해석 장치를 이용하여 화학 발광을 검출하였다.
[비교예 1]
[락토페린 고정화 비드에 의한 비감염뇌로부터의 이상형 프리온 단백질의 검출]
정상적인 마우스뇌(이하에, 정상뇌, 또는 비감염뇌라고도 한다)를 사용하여, 이하와 같이 락토페린 고정화 비드에 의한 이상형 프리온 단백질의 검출을 수행하였다.
(락토페린 고정화 비드의 제작)
실시예 1과 동일하게 수행하였다.
(뇌조직을 가용화한 시료(뇌유제)의 조제)
이상형 프리온 단백질에 감염한 마우스를 대신하여 정상적인 마우스(비감염 마우스)로부터 꺼낸 뇌를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 수행하여, 정상뇌에 의한 뇌유제(이하에 정상뇌유제, 또는 비감염뇌유제라고도 한다)를 얻었다.
(락토페린 고정화 비드에 의한 이상형 프리온 단백질의 분리)
감염뇌유제를 대신하여 비감염뇌유제를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 수행하여, 시험 시료를 얻었다.
(이뮤노블롯에 의한 검출)
감염뇌유제에 유래하는 시험 시료를 대신하여 비감염뇌유제에 유래하는 시험 시료를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 수행하였다.
(결과)
도 1은 실시예 1및 비교예 1에 대해 얻을 수 있던 이뮤노블롯의 결과를 나타낸 것이다. 어느 레인에서도 프로테아제 K처리는 이루어지지 않았다(PK-).
레인 1, 2및 3은, 감염뇌유제에 대해서 락토페린 고정화 비드에 의한 이상형 프리온 단백질의 분리를 실시해 얻을 수 있던 시험 시료에 의한 것(실시예 1)이다. 레인 1의 시료를 10배 희석해 이뮤노블롯한 레인이 레인 2이며, 레인 1의 100배 희석이 레인 3이다. 레인 4는, 비감염뇌유제에 대해서 락토페린 고정화 비드에 의한 이상형 프리온 단백질의 분리를 실시해 얻을 수 있던 시험 시료에 의한 것(비교예 1)이다.
레인 1, 2및 3에서 농도 의존적으로 프리온 단백질의 밴드가 관찰되었으며, 레인 1의 시료를 100배 희석하여 사용한 레인 3에서도, 명료하게 프리온 단백질의 밴드가 관찰된다. 이것은 시료의 유래로부터 이상형 프리온 단백질을 나타내고 있다. 즉, 락토페린 고정화 비드와의 결합에 의해서, 감염뇌에 유래하는 이상형 프리온 단백질이 분리되어 검출되었다.
한편, 레인 4에서는 레인 1의 시험 시료와 동일한 정도의 농도로 조작된 시료임에도 불구하고, 프리온 단백질의 밴드는 관찰되지 않는다. 즉, 락토페린 고정화 비드와의 결합에 따라서는 비감염뇌에 유래하는 정상형 프리온 단백질은 회수될 것이 없고, 검출될 것이 없었다.
이상으로부터, 감염뇌에 유래하는 이상형 프리온 단백질은 락토페린 고정화 비드에 특이적으로 결합하는 반면, 비감염뇌에 유래하는 정상형 프리온 단백질은 락토페린 고정화 비드에 결합하지 않는 것을 알 수 있었다. 또한 락토페린 고정화 비드를 사용하여 이상형 프리온 단백질을 정상형 프리온 단백질로부터 분리 회수해 얻을 수 있어 이것에 의해서 이상형 프리온 단백질을 검출할 수 있는 것을 알 수 있었다.
[비교예 2]
[프로테아제 K를 사용한 이상형 프리온 단백질의 검출]
프로테아제 K를 사용해 실시하는 종래의 방법에 의해 이상형 프리온 단백질을 정상형 프리온 단백질로부터 구별해 검출하는 실험(비교예 2)을 아래와 같이 수행하였다.
(뇌유제의 조제)
이상형 프리온 단백질에 감염된 마우스의 뇌(이하, 감염뇌라고도 한다), 및 비감염 마우스(정상 마우스)의 뇌(이하, 비감염뇌 또는 정상뇌라고도 한다)를 준비해, 이러한 마우스 뇌를 각각 BioMasher 에 넣어 10,000×g로 2분간 원심분리한 후, 회수한 펠렛에 NP-40 RIPA를 더해 10%(w/v) 뇌유제를 제조하였다. 이것을, 4℃에서 15분 동안 인큐베이션 한 후, 교반 혼화하여, 10,000×g로 2분간 원심분리하고, 상청액을 회수하였다. 회수한 상청액에 NP-40 RIPA를 더해 0.5%(w/v) 뇌유제로 조정하고, 감염뇌유제, 및 비감염뇌유제를 얻었다.
(프로테아제 K에 의한 효소 분해 처리)
이러한 뇌유제 500㎕에, 프로테이나제 K를 최종 농도 20 ㎍/ml가 되도록 첨가하고 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 반응 완료 후, 5 ㎕의 프로테이나제 K 저해제(Pefablock)를 가한 다음, 250㎕의 Buthanol-Methanol solution을 가하여 교반 혼화한 후, 20,000×g로 10분간 원심분리하였다. 원심분리 후, 펠렛에 50㎕의 중성 완충액(NuPAGE LDS 샘플 버퍼(4×, Invitrogen 사제)를 가해 95℃에서 10분간 가열하고, 각각 감염뇌유제 유래의 시료, 및 비감염뇌유제 유래의 시료를 얻었다.
(이뮤노블롯에 의한 검출)
상기와 같이 하여 얻은, 프로테아제 K에 의한 효소 분해 처리를 실시한 감염뇌유제(프로테아제 K 처리 감염뇌유제), 프로테아제 K에 의한 효소 분해 처리를 실시한 비감염뇌유제(프로테아제 K 처리 비감염뇌유제), 그리고 프로테아제 K에 의한 효소 분해 처리를 실시하지 않은 감염뇌유제(원래의 감염뇌유제), 프로테아제 K에 의한 효소 분해 처리를 실시하지 않은 비감염뇌유제(원래의 비감염뇌유제)의 4 종류의 시료에 대해서, 이뮤노블롯법에 의해, 프리온 단백질의 검출을 실시하였다.
즉, 시료를 NuPAGE 겔을 이용하여 전기 영동(40 mA 정전류, 70분 )한 다음, 탱크식 전사 장치를 이용해 PVDF막에 겔 중의 단백질을 전사(220 mA 정전류, 60분 )하였다.
전사 후의 PVDF막은 블록 에이스(다이니혼 제약)를 이용해 4℃, 30분간 블로킹 한 다음, 0.1% Tween20를 포함한 블록 에이스로 5,000배 희석한 HRP 결합항프리온 단백질 단일 클론 항체(T2-HRP)를 포함한 용액을 PVDF막에 첨가하여, 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
항체와 반응시킨 PVDF막은 0.1% Tween 20을 포함한 PBS로 10분간 3회 세정하고, 화학 발광 검출 시약으로 막을 전개하여, 화상 해석 장치를 이용해 화학 발광을 검출하였다.
(결과)
도 2는 비교예 2에 대해 얻을 수 있던 이뮤노블롯의 결과를 나타낸 것이다. 레인 1및 2는 프로테아제 K에 의한 효소 분해 처리를 실시하지 않은 레인(PK)이며, 레인 3및 4는 프로테아제 K에 의한 효소 분해 처리를 실시한(PK＋) 레인이다.
레인 1은 프로테아제 K에 의한 효소 분해 처리를 실시하지 않은 감염뇌유제(원래의 감염뇌유제)를 시료로 한 레인이다. 레인 2는 프로테아제 K에 의한 효소 분해 처리를 실시하지 않은 비감염뇌유제(원래의 비감염뇌유제)를 시료로 한 레인이다. 레인 3은 프로테아제 K에 의한 효소 분해 처리를 실시한 감염뇌유제(프로테아제 K처리 감염뇌유제)를 시료로 한 레인이다. 레인 4는 프로테아제 K에 의한 효소 분해 처리를 실시한 비감염뇌유제(프로테아제 K처리비감염뇌유제)를 시료로 한 레인이다.
레인 1및 2에서는 이뮤노블롯에 의해 프리온 단백질의 밴드가 검출되고 있어 프로테아제 K미처리 상태에서는 이상형 프리온 단백질(레인 1)이든 정상형 프리온 단백질(레인 2)이든 간에 모두 검출되는 것으로 나타나고 있다. 이에 반해, 레인 3및 4에서는, 이뮤노블롯에 의해 이상형 프리온 단백질(레인 3)에만 밴드가 검출되고 정상형 프리온 단백질(레인 4)에는 밴드가 검출되어 있지 않아, 프로테아제 K처리에 의해 이상형 프리온 단백질과 정상형 프리온 단백질을 구별해 이상형 프리온 단백질만을 검출할 수 있음이 나타나고 있다.
이상으로 나타난 비교예 2의 결과(도 2)를, 실시예 1및 비교예 1으로 얻을 수 있던 결과(도 1)와 비교해 다음을 알 수 있었다. 즉, 락토페린 고정화 비드에 의한 이상형 프리온 단백질과 정상형 프리온 단백질과의 식별은, 프로테아제 K를 사용한 종래의 방법과 동일한 정도 이상으로, 확실성과 신뢰성이 있는 것을 알 수 있었다.
본 발명에 의하면, 동물에 유래하는 원재료를 사용한 음식품 및 의약품에 대해서, 이상형 프리온 단백질(감염성 프리온 단백질)에 의한 오염의 검사를 종래보다 간편하고 신속한 한편 고감도로 정량적으로, 한층 더 저비용으로 수행할 수 있다. 또, 사람 및 동물에 있어서의 프리온병의 진단을 종래보다 간편하고 신속한 한편 고감도로 정량적으로, 한층 더 저비용으로 수행할 수 있다. 이것에 의해서 사람 및 동물에의 프리온병의 감염 방지나 조기진단이라고 하는 사회의 요청에 응할 수 있다. 본 발명은 이와 같이 산업상의 이용 가능성을 가지는 것이다.
Claims (6)
- 락토페린을 포함하는 이상형 프리온 단백질 결합제.
- 제1항에 있어서,
상기 락토페린은 담체에 고정화되어 있는 것인 이상형 프리온 단백질 결합제.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 이상형 프리온 단백질 결합제는 이상형 프리온 단백질 검출제인 이상형 프리온 단백질 결합제.
- 제2항의 이상형 프리온 단백질 결합제를 시료와 접촉시키는 단계;
시료에 접촉시킨 상기 이상형 프리온 단백질 결합제로부터 결합한 성분을 분리하는 단계; 및
상기 분리한 성분에 포함된 이상형 프리온 단백질을 검출하는 단계
를 포함하는 이상형 프리온 단백질의 검출 방법.
- 제4항에 있어서,
상기 분리한 성분에 포함된 이상형 프리온 단백질을 검출하는 단계가, 분리한 성분에 포함된 이상형 프리온 단백질을 면역학적 검출법에 의해 검출함으로써 수행되는 것인 방법.
- 제2항의 이상형 프리온 단백질 결합제를 시료에 접촉시키는 단계; 및
시료에 접촉시킨 상기 이상형 프리온 단백질 결합제로부터 결합한 성분을 분리하는 단계
를 포함하는 이상형 프리온 단백질의 분리 방법.
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