EA004953B1 - Способ обнаружения и выделения аномального прионного белка и набор для его осуществления - Google Patents

Способ обнаружения и выделения аномального прионного белка и набор для его осуществления Download PDF

Info

Publication number
EA004953B1
EA004953B1 EA200100756A EA200100756A EA004953B1 EA 004953 B1 EA004953 B1 EA 004953B1 EA 200100756 A EA200100756 A EA 200100756A EA 200100756 A EA200100756 A EA 200100756A EA 004953 B1 EA004953 B1 EA 004953B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
prion protein
abnormal prion
biological material
solvent
lyotropic
Prior art date
Application number
EA200100756A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200100756A1 (ru
Inventor
Эндрю Дж. Алперт
Мэри Джо Шмерр
Original Assignee
Дзе Юнайтед Стейтс Оф Америка, Эз Репрезентед Бай Дзе Секретэри Оф Эгрикалчер
Эндрю Дж. Алперт
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Дзе Юнайтед Стейтс Оф Америка, Эз Репрезентед Бай Дзе Секретэри Оф Эгрикалчер, Эндрю Дж. Алперт filed Critical Дзе Юнайтед Стейтс Оф Америка, Эз Репрезентед Бай Дзе Секретэри Оф Эгрикалчер
Publication of EA200100756A1 publication Critical patent/EA200100756A1/ru
Publication of EA004953B1 publication Critical patent/EA004953B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/962—Prevention or removal of interfering materials or reactants or other treatment to enhance results, e.g. determining or preventing nonspecific binding

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к способу экстракции с помощью растворителя аномального прионного белка из биологического материала, например животной ткани или продукта. В специфическом примере аномальный прионный белок экстрагируют из гомогенизированного мозга овцы с помощью гексафтор-2-пропанола. Гексафтор-2-пропанол отделяют от водного препарата мозга путем увеличения ионной силы водного раствора. Прионный белок в извлеченной фракции растворителя можно подвергнуть дополнительной очистке. Настоящее изобретение также относится к способу обнаружения аномального прионного белка в биологическом материале, включающему анализ фракции растворителя, полученной в соответствии со способом экстракции по настоящему изобретению, с помощью метода, который позволяет детектировать наличие аномального прионного белка, например иммуноанализа. Данный способ может быть использован, например, для диагностики инфекционных губчатых энцефалопатий (ИГЭ). Настоящее изобретение также относится к наборам для осуществления способов по настоящему изобретению. Фигура изображает хроматограмму, полученную методом HILIC прионного белка. Детектирование белка осуществляли по радиоактивности, которая представлена окружностями, и по абсорбции при 280 нм, представленной непрерывной линией на графике.

Description

Область изобретения
Настоящее изобретение относится, главным образом, к способу выделения путем экстракцию аномального прионного белка из биологического материала, такого как, например, ткани животных или биологическая жидкость. Изобретение также относится к способу обнаружения вышеуказанного белка в биологическом материале, составной частью которого является процесс экстракции. Данный способ может быть использован, например, для диагностики инфекционных губчатых энцефалопатий.
Область техники
Прионные заболевания или инфекционные губчатые энцефалопатии (ИГЭ) вызывают прогрессирующие дегенеративные нарушения центральной нервной системы, приводящие к смерти (Ргикшег, Мебюа1 Векеагсй Яс\зс\\·. 16:487,1996; \Ус155шап. РЕВ8 Ьейегк, 289:3, 1996). Почесуху, овечью ИГЭ, которая является прототипом таких заболеваний, впервые описали более 200 лет назад (Райткоп, Уе1. Вес., 123:661, 1988). Для таких заболеваний нет известных методов лечения и нет известных методов обнаружения заболевания у животного до наступления смерти. Прионные заболевания вызывают конформационное изменение нормального прионного белка носителя, выражающееся в аномальной структуре, образующей агрегаты. Из-за недавнего всплеска коровьей губчатой энцефалопатии в Великобритании и взаимосвязи между этой ИГЭ и новой разновидностью, человеческой ИГЭ болезнью Крюйцфельда-Якоба (Вгисе е! а1., Να1иге, 389:498,1997), - имеется необходимость в новых способах, как чувствительных, так и точных, для диагностики ИГЭ. В идеале, такая диагностика могла бы быть использована для испытания животных до проявления клинических признаков и до того, как они попадут в цепь питания человека или в фармацевтические препараты, предназначенные для применения людьми.
Уровень техники
Большинство способов, применяемых для приготовления и очистки болезнетворных агентов ИГЭ, включают сложную последовательность обработок ферментами и детергентами и центрифугирований (Войоп е! а1., 1. У1го1., 5:596, 1985). Аномальный прионный белок плохо растворим в обычных биологических буферах. Одним способом получения очищенного аномального прионного белка является хроматография на основе гидрофильных взаимодействий (НЮС) (А1рей, 1. Сйгота1одг., 499:177, 1990), которая является инверсией обратнофазной хроматографии. Обычно начинают с 7085% органического растворителя и элюируют снижающимся градиентом концентрации. Элюирование - от наименее к наиболее популярным. Большинство органических подвижных фаз НЮС совместно с белками, не встречающимися в обычных условиях свободными в водных растворах, такими как мембранные бел ки (1епб е! а1., Апа1. Вюсйет., 215:292, 1993), βамилоидные пептиды (1-43) (А1рей е! а1., Е1дй1й 8утрокшт оГ 1йе Рго1еш 8ос1е1у, 1и1у 1994, 8ап П1едо, СА) и гистоны (Ьтбпег е! а1., 1. Сйгота1одг., А.782:55, 1997). Поверхностно-активные вещества и другие денатурирующие вещества элюируют в свободном объеме или вблизи него, тогда как белки и пептиды обычно хорошо сохраняются.
После очистки методом НЮС прионный белок можно обнаружить с помощью капиллярного электрофорезного иммуноанализа (8сйтегг апб 1еппу, Е1ес1горйогек1к, 19:409, 1998) или с помощью капиллярного изоэлектрического фокусирования (8сйтегг е! а1., 1. Сйгота1одг., А.802:135, 1998).
Как указано выше, существующие аналитические методы для детектирования аномального прионного белка обычно используют после смерти, так что требуется анализ для обнаружения аномального прионного белка в живом организме. Кроме того, требуется способ выделения аномального прионного белка без этапа ультрацентрифугирования, требующего приборное обеспечение, которое не легко доступно для ветеринарных диагностических лабораторий. Центрифугирование требует наличия аномального прионного белка в форме агрегатов, большой размер которых облегчает образование осадка в центрифужных пробирках. Такие агрегаты труднорастворимы и трудно обнаружимы на последующих этапах. Применение центрифугирования также препятствует возможности обнаружения мономерных аномальных прионных белков, потенциально снижая чувствительность любого анализа. Существует еще более насущная потребность в быстром и надежном анализе в практических условиях, таком как количественный иммуноанализ, для проверки стада на инфицированность ИГЭ. Таким образом, имеется потребность в эффективном, простом способе выделения аномального прионного белка.
Кроме того, продуцированные антитела обнаруживают аномальный прионный белок в его мономерной форме, за исключением продуцированных антител к естественному аномальному прионному белку (Кой е! а1., №1иге, 390:74, 1997). Вследствие этого, аномальный прионный белок необходимо дезагрегировать с помощью сильных детергентов или денатурирующих веществ; причем эти денатурирующие вещества необходимо затем удалить перед проведением большинства типов иммуноанализов. Таким образом, в технике имеется потребность в быстром, простом способе выделения прионного белка, свободного от детергентов или денатурирующих веществ, для иммуноанализов.
Данное изобретение обеспечивает новый способ экстракции аномального прионного белка всех размеров, как в агрегированной, так и в мономерной формах. Процесс экстракции представляет собой составную часть способа обнаружения аномального прионного белка по на3 стоящему изобретению. Изобретение позволяет обнаружить аномальный прионный белок в пробах, взятых от живых животных, например, с помощью иммунологических исследований. Например, диагностика может быть основана на пробах крови, что позволяет проверить живых животных и упрощает удаление инфицированных животных из стада, а также предотвращает возможность загрязнения продуктов потребления.
Краткое описание изобретения
Изобретение касается способа экстракции аномального прионного белка из биологического материала, предположительно содержащего аномальный прионный белок. Способ включает получение изотонического или гипотонического водного препарата биологического материала и инкубацию при температуре от примерно 20 до примерно 100°С смеси растворителя для экстракции и полученного изотонического или гипотонического водного препарата биологического материала при условиях, при которых эффективно происходит экстракция аномального прионного белка из биологического материала в растворитель для экстракции. Растворитель для экстракции - это полярный органический растворитель, в котором растворим аномальный прионный белок и который способен смешиваться с гипотоническим или изотоническим водным раствором, но не способен смешиваться с лиотропным водным раствором. Лиотропную активность смеси усиливают, чтобы растворитель для экстракции отделялся как различимая фаза от водного препарата биологического материала с получением фракции растворителя, содержащей аномальный прионный белок.
Данное изобретение также касается способа обнаружения аномального прионного белка у животных, включающего анализ фракции растворителя, полученной, как описано выше, с помощью способа, который позволяет детектировать наличие аномального прионного белка.
Кроме того, предложен набор реактивов для экстракции аномального прионного белка из биологического материала. Набор включает растворитель для экстракции, характеристики которого указаны выше, и лиотропную соль или водный раствор лиотропной соли, которые добавляют к водному препарату биологического материала, чтобы органический растворитель стал не смешиваемым с водным препаратом. В другом варианте реализации изобретения набор предназначен для обнаружения аномального прионного белка и включает средство для обнаружения аномального прионного белка.
Таким образом, целью изобретения является разработка быстрого способа выделения аномального прионного белка из биологического материала.
Кроме того, целью изобретения является разработка способа раннего обнаружения организмов, инфицированных аномальным прионным белком.
Кроме того, целью изобретения является разработка методики экстракции растворителем для выделения аномального прионного белка из биологического материала.
Кроме того, целью изобретения является упрощение аналитического исследования биологического материала, взятого от животных или человека, на предмет наличия аномального прионного белка.
Кроме того, целью настоящего изобретения является получение фракции растворителя, содержащей экстрагированный аномальный прионный белок, для последующих испытаний или очистки.
Эти и другие цели изобретения представлены подробнее на прилагаемых чертежах и в подробном описании изобретения.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 - хроматограмма, полученная методом НЮС, 1251-прионного белка. Детекцию осуществляли по радиоактивности (окружности) и по поглощению при 280 нм (непрерывная линия).
Фиг. 2 - связывание антителами Н1ЫСфракций 1251-прионного белка.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение касается способа экстракции аномального прионного белка из биологического материала. Экстрагированный продукт можно протестировать с помощью иммуноанализа для аномального прионного белка. Данную экстракцию аномального прионного белка в соединении с иммуноанализом можно использовать для диагностики живых организмов на предмет инфицирования ИГЭ и можно использовать повсеместно для проверки людей и животных на инфицированность ИГЭ. Таким образом, данное изобретение с успехом позволяет производить испытание на прионный белок в клинических и ветеринарных лабораториях, не обладающих дорогими центрифугами, а также позволит продолжить исследования в этой области.
Водный препарат биологического материала соединяют с растворителем для экстракции для образования смеси и полученную смесь инкубируют при температуре в диапазоне от около 20 до около 100°С. Растворитель для экстракции - это полярный органический растворитель, в котором растворим аномальный прионный белок и который смешивается с нелиотропным изотоническим водным раствором, но не смешивается с лиотропным водным раствором. В одном предпочтительном варианте реализации растворителем для экстракции является гексафтор-2-пропанол (также называемый гексафторизопропанолом или НИР). Хотя в нижеследующих примерах объемы буфера для экстракции и водного препарата биологического материала примерно одинаковы, можно применить любое соотношение, дающее две различные фазы, как описано ниже.
Смесь растворителя для экстракции и биологического материала инкубируют при условиях, эффективных для экстракции аномального прионного белка из биологического материала в растворитель для экстракции. После инкубации повышают лиотропную активность смеси так, чтобы отделить растворитель для экстракции от водного препарата. Фракцию растворителя, содержащую прионный белок, извлекают.
В соответствии с изобретением лиотропную активность смеси растворителя для экстракции с водным препаратом можно повысить путем добавления лиотропной соли. Соль можно добавить в сухом виде непосредственно в смесь или в виде концентрированного водного раствора. Предпочтительные примеры лиотропных солей включают сульфат натрия и сульфат аммония. В одном варианте реализации, описанном для примера ниже, ионную силу увеличивали путем добавления в смесь в соотношении 1:1 (по объему) 0,5М сульфата натрия.
Изобретение особенно полезно, потому что оно не требует получения материала аутопсией или некропсией. В соответствии с изобретением биологическим материалом может быть образец, взятый от живого животного. Способ согласно изобретению обеспечивает экстракцию аномального прионного белка из биологической жидкости или биопсии органа для аналитических испытаний. Альтернативно, биологический материал можно получить аутопсией или некропсией, например, животных продуктов, предназначенных в пищу или для фармацевтического, косметического и т. п. применения людьми или другими животными. В одном варианте реализации способ согласно изобретению можно использовать для удаления прионного белка из таких материалов для обеспечения того, чтобы инфицирующие прионы не передавались.
Способ экстракции по данному изобретению можно использовать для экстракции как нормального прионного белка, так и аномального прионного белка. За счет предварительной обработки биологического материала протеиназой К нормальный прионный белок может быть гидролизован. Таким образом, в случаях, когда требуется только аномальный прионный белок, водный препарат биологического материала можно предварительно обработать протеиназой К перед смешиванием его с растворителем для экстракции.
Полученную, как описано выше, фракцию растворителя, содержащую экстрагированный прионный белок, можно высушить с получением высушенного прионного белка. Прионный белок в растворе или в высушенном состоянии можно далее очистить, например, путем хроматографии на основе гидрофильных взаимодействий.
Аномальный прионный белок у животного можно обнаружить путем исследования высушенного экстрагированного материала на его присутствие. Предпочтительно, чтобы методом исследования являлся иммуноанализ для аномального прионного белка. Пробу можно обработать протеиназой К перед выделением прионного белка так, чтобы не выделять нормальный прионный белок.
В другом аспекте, изобретение касается набора для экстракции аномального прионного белка из биологического материала. В одном варианте реализации набор включает растворитель для экстракции, например гексафтор-2пропанол. Набор также включает лиотропную соль или водный раствор лиотропной соли, которые необходимо добавлять к водному препарату биологического материала, чтобы растворитель для экстракции становился не смешиваемым с водным препаратом.
Изобретение также касается набора для обнаружения аномального прионного белка в биологическом материале. В дополнение к компонентам набора, описанным выше, набор для обнаружения включает средство для обнаружения аномального прионного белка. Предпочтительным способом детектирования аномального прионного белка является иммунологический анализ.
Хотя этот способ экстракции и набор разработали первоначально для диагностики почесухи (ИГЭ овец), они полезны и для диагностики других ИГЭ у других позвоночных, в особенности у млекопитающих и птиц, например у людей, коров, свиней, лосей, оленей, домашней птицы и грызунов. Аномальный прионный белок можно обнаружить в тканях животных и человека на ранней стадии - спустя 2 недели после заражения. Важной областью применения данного изобретения является обнаружение аномального прионного белка в крови человека. Эту методику можно также использовать для экстракции аномального прионного белка из технологических материалов, применяемых для изготовления фармацевтических изделий или иных продуктов для употребления человеком, включая пищевые добавки.
В настоящем тексте выражения приблизительно или около означают в пределах 20%, предпочтительно в пределах 10%, и наиболее предпочтительно в пределах 5% заданного значения или диапазона.
Биологические материалы
Настоящее изобретение позволяет экстрагировать прионные белки из биологического материала. Вообще, прионные белки обнаружены у позвоночных животных, как указано выше. Следовательно, в большинстве случаев, биологический материал будет от людей или животных. Прионный белок может также образовываться в процессах ферментации клеткамиэукариотами. Он может быть экспрессирован в виде рекомбинантного прионного белка. Большой интерес представляет возможность характерной экспрессии эндогенных прионных бел
Ί ков клетками, которые рекомбинантно модифицировали для экспрессии другого белка. Эта возможность более вероятна для клеток нейронного происхождения, таких как клетки РС12. В этом случае биологическим материалом может быть продукт ферментации, например рекомбинантный белок.
Примеры биологических материалов от животных включают, но никак не ограничены указанным, ткани, такие как мозг, мышечная ткань (включая сердце), печень, аппендикс, поджелудочная железа, органы пищеварительного тракта, кожа и лимфоидные ткани, такие как вилочковая железа, селезенка, миндалевидная железа, лимфоузлы и т.д. Альтернативно, биологическим материалом может быть биологическая жидкость. Термин биологическая жидкость относится к спинно-мозговой жидкости, крови, сыворотке, плазме, молоку, моче, слюне, слезе, слизистым выделениям, поту, семенной жидкости и жидкостям организма, включающим эти компоненты. Он также относится к культуральным жидкостям (или культуральным средам), применяемым для производства рекомбинантных белков или содержащим клетки в суспензии перед трансплантацией. Кроме того, термином биологические материалы обозначают продукты, приготовленные из органов или тканей животных, включая белки сыворотки (такие как альбумин или иммуноглобулин), гормоны, пища и обработанные пищевые продукты, пищевые добавки, костная мука, корм животных, внеклеточные матриксные белки, желатин и прочие побочные продукты животноводства, применяемые в производстве товаров.
В случаях, когда биологическим материалом является твердая ткань или продукт, их необходимо сначала растворить или перевести в суспензию в водном растворе, чтобы сделать пригодным для процесса экстракции. Например, мозговую ткань можно суспендировать в растворе сахарозы (например, 0,32М сахарозы) при 10% массы к объему. Другие гипотонические или изотонические растворы включают 5% декстрозу, буферный фосфатно-солевой раствор, трис-буфер, НЕРЕ8-буфер или любой вышеупомянутый буфер. Биологический материал в водном растворе можно также гомогенизировать, измельчить или иным способом раздробить для максимизации контакта между растворителем для экстракции и биологическим материалом. Однако, если биологическим материалом является биологическая жидкость, добавление жидкости, вероятно, не потребуется, кроме случаев, когда необходимо понизить ионную силу биологической жидкости для облегчения смешиваемости с растворителем для экстракции.
Прионный белок
Термин прионный белок в данном тексте означает естественный белок, выявленный в нервной ткани, в частности в мозге, и нижних отделах лимфоидных тканей, а также всех дру гих тканях. При некоторых условиях прионный белок принимает патогенную конформацию, которую здесь называют аномальным прионным белком. Определенные мутации гена рпои у некоторых индивидуумов, вероятно, повышают предрасположенность прионного белка принимать патогенную конформацию. Воздействие на организм заразного инфекционного агента, приона, также может вызвать конформационное изменение, приводящее к патологии.
Аномальный прионный белок гораздо меньше восприимчив к протеолизу, чем нормальный прионный белок. Обработка биологического материала протеиназой, в частности протеиназой К, расщепляет нормальный прионный белок, но не аномальный прионный белок.
В специфических примерах, приведенных ниже, аномальный прионный белок овцы (РгР8С) выделяют способом, составляющим суть изобретения. Однако можно также выделить другие прионные белки от других животных, в частности перечисленных выше, используя способ, составляющий суть изобретения.
В категорию аномальных прионных белков включены человеческие прионные белки, обнаруженные при нейродегенеративном заболевании Куру, болезни Крейцфельда-Якоба (БКЯ), синдроме Герстманна-Штраусслера (СГШ) и фатальной семейной бессоннице. Некоторые случаи БКЯ и СГШ связывают с известными мутациями гена рпои. БКЯ также связывают с воздействием ИГЭ. Например, как отмечено выше, БКЯ связывали с губчатой энцефалопатией коров. Настоящее изобретение впервые позволяет выделить аномальный прионный белок у пациентов до аутопсии. Обнаружение выделенного аномального прионного белка можно использовать для диагностики любого из этих заболеваний.
Почесуха (овец, коз) и губчатая энцефалопатия коров являются аномальными прионными заболеваниями у животных. Прионные белки также изолировали у кур, норок, свиней, мышей, хомяков и морских свинок. Кроме того, мыши, хомяки и морские свинки могут развить губчатую энцефалопатию в результате воздействия прионов от человека или других животных. Прионные белки от любого источника можно обнаружить или выделить способом, описанным в данном изобретении.
Растворитель для экстракции и условия
Растворитель для экстракции для применения в данном изобретении должен быть в состоянии отделиться в виде различимой фазы от воды или водного раствора при лиотропных условиях. В то же время, прионный белок должен растворяться в растворителе для экстракции. Этим критериям отвечают несколько полярных органических растворителей. Предпочтительным полярным органическим растворителем является гексафтор-2-пропанол. Другие растворители, которые можно применять, вклю9 чают изопропанол; 1,1,1-трифтор-2-пропанол (ТР1Р); 2,2,3,3-тетрафтор-1-пропанол (!е!Р1Р); перфтор-трет-бутиловый спирт (ΡΡίΒΑ); 1,1,1,3, 3,3-гексафторацетон (ΗΡΑ); трифторуксусная кислота (ТРА); 2,2,2-трифтор-1-этанол (ТРЕ); 2,2, 3,3,4,4,4,-гептафтор-2-пропанол (ΗΡΒ); 1,1,1,3,3, 4,4,4-октафтор-2-бутанол (ОР1В); 1-метил-2-пирролидинон (ΝΜΡ); (см. \УП1е е! а1., 1. Μοί. ΒίοΙ., 259:608, 1996). Можно опробовать другие растворители, включая диметилсульфоксид (ΌΜ8Ο); тетрагидрофуран и т.п. Альтернативно, можно применить растворитель, не смешиваемый с водой, но в котором растворим прионный белок.
В одном варианте реализации растворитель является смешиваемым с водой, например при физиологической ионной силе (изотонический водный раствор) или при ионной силе, которая ниже физиологической (гипотонический водный раствор). Однако, когда буфер включает лиотропные соли, представленные в концентрации (или ионной силе) выше порогового значения, растворитель для экстракции нерастворим в водном растворе: две фазы разделяются на слой растворителя для экстракции и слой водного раствора. Это называют здесь лиотропными условиями. Величина ионной силы лиотропной соли водного раствора, достигающего лиотропных условий, может варьировать в зависимости от выбранного растворителя для экстракции и применяемой(мых) соли(ей). Ее могут легко определить титрованием или иным систематическим изменением концентрации лиотропной соли, испытывая на смешиваемость или несмешиваемость растворителя для экстракции с водным раствором. Здесь водный раствор с ионной силой лиотропной соли, при которой растворитель для экстракции отделяется от воды, называют лиотропным водным раствором. Водные растворы, включающие меньшие концентрации лиотропных солей или физиологических солей, такие как изотонические буферы, рассматривают как нелиотропные растворы.
Вообще, в процессе экстракции в растворитель используют примерно равные объемы растворителя для экстракции и водного препарата биологического материала. Однако отношение растворителя для экстракции к водному препарату может быть в пределах от приблизительно 5:1 до 1:5, предпочтительно от приблизительно 3:1 до 1:3.
После смешивания растворителя для экстракции с водным препаратом смесь может быть проинкубирована в течение некоторого времени при определенной температуре, чтобы усилить экстракцию прионного белка в экстракционный буфер. Время инкубации может варьировать от 1 мин до нескольких часов, что определяют анализом экстрагированного материала на наличие прионного белка. После того, как количество прионного белка в экстрагированном материале, выраженное в разрезе времени, достигнет плато, что можно проверить с помо щью методик хроматографии или иммунологических испытаний, или обеих методик, как описано в примерах, дополнительная инкубация не будет иметь никакого эффекта на выход прионного белка. В конкретном варианте реализации время инкубации составляет 5 мин.
Кроме того, можно регулировать температуру инкубации, чтобы повысить эффективность экстракции, при условии, что как растворитель для экстракции, так и водный раствор остаются жидкими при выбранной температуре. Предпочтительны повышенные температуры, т.е. выше комнатной, т.к. они усиливают растворимость прионного белка в растворителе для экстракции. Особенно пригодными являются температуры в пределах около 50-60°С. Как и с другими переменными, такими как ионная сила водного препарата и время инкубации, оптимальную температуру можно определить путем обычных экспериментов и проверок.
Разделение фаз
Для увеличения ионной силы водного раствора можно применять различные лиотропные соли, вызывая тем самым разделение фаз. Среди предпочтительных солей - сульфат натрия и сульфат аммония, являющиеся лиотропными. Обе соли применяют при концентрации гораздо ниже той, при которой осаждаются белки. Например, в конкретном варианте реализации добавляют 0,5М раствор сульфата натрия к равному объему смеси растворителя для экстракции с водным препаратом с получением конечной концентрации сульфата натрия 0,25М. Эта концентрация достаточна для того, чтобы вызвать разделение фаз гексафторизопропанола и воды. Можно также использовать другие соли, при условии, что они достигают требуемой лиотропной активности при концентрации, при которой они растворимы. Термин лиотропная активность применяют здесь для обозначения структурообразующих свойств лиотропного раствора соли. Лиотропной активности достигают путем достижения концентрации лиотропной соли, достаточной для того, чтобы вызвать фазовое разделение на органическую и водную фазы. Концентраций лиотропной соли, при которых белки осаждаются, избегают.
Лиотропные или структурообразующие соли, также называемые космотропными, способствуют упорядочиванию водного раствора, тем самым вытесняя органические растворы. Если органический раствор является растворителем для экстракции, происходит разделение фаз. Если это белок, то он высаливается из раствора. Хорошие структурообразующие соли сульфат аммония, фосфаты, цитраты и т.д. (ХУакНаЬандН аиб СоШиз, 1. Βίοί. СНет., 261:12477, 1986). (Деструктурирующие соли или хаотропы включают гуанидина гидрохлорид, перхлорат натрия, бромид натрия и т.д. Эти соли обладают противоположным эффектом: они притягивают органические растворы в водный раствор.) Ион ная сила водного раствора является функцией общего числа ионов в растворе, независимо от того, являются они структурообразующими или деструктурирующими ионами. Термин ионная сила относится к концентрации соли.
Как указано выше, лиотропную соль можно добавлять в твердом виде или в виде концентрированного раствора, с условием, что окончательная концентрация лиотропной соли будет эффективно способствовать разделению фаз. Предпочтительно, чтобы окончательное соотношение растворителя для экстракции к водной фазе (включающей водный препарат биологического материала и раствор соли) после повышения лиотропной активности смеси было в диапазоне от примерно 1:10 до 10:1, предпочтительно (и как приведено в нижеследующих примерах) от примерно 1:3 до 3:1, при условии, что при меньшем отношении растворителя для экстракции к водной фазе окончательная концентрация соли достаточна для того, чтобы способствовать разделению фаз.
После повышения лиотропной активности растворитель для экстракции, который теперь содержит все прионные белки, присутствовавшие в биологическом материале, отделяется от водного препарата. Процесс разделения занимает несколько минут и его считают завершенным, когда обе фазы прозрачны и между ними можно наблюдать отчетливую разницу. Когда две фазы полностью разделены, фракцию растворителя, содержащую теперь прионный белок, можно удалить или извлечь, например, отсасыванием с помощью пипетки или шприца или при помощи разделительной колбы.
Фракцию растворителя для экстракции, содержащую прионные белки (называемую здесь экстрактом), можно высушить, например, путем испарения, лиофилизацией или вакуумным центрифугированием, с получением высококонцентрированного или сухого экстрагированного материала. Экстракт может включать другие компоненты, например клеточные липиды, связывающиеся с липидными мембранами белки и прочие более гидрофобные компоненты клеток. При желании, прионный белок можно изолировать или очистить от этих компонентов, например, с помощью хроматографии на основе гидрофильных взаимодействий, как описано в примере ниже, или с помощью других хроматографических методов (катионно-обменная хроматография, гельпроникающая хроматография, обратнофазная хроматография и аффинная хроматография, например, на колонке с антителами).
Альтернативно, концентрированный или высушенный экстрагированный материал можно анализировать непосредственно, как описано в нижеследующем примере, для детектирования аномального прионного белка.
Методы детектирования прионного белка; иммуноанализы
Из уровня техники известны разнообразные методы детектирования прионного белка, включая методы селективного детектирования аномального прионного белка. Гель-электрофорез в капилляре доказал свою эффективность в качестве аналитического метода детектирования аномального прионного белка (8сйтетг аиб 1еииу, Е1ес!горйотек1к, 19:409, 1998). Предпочтительным методом является иммуноанализ, например, как описано у 8сйтегг и 1еииу. Иммунная сыворотка, описанная в этой связи, специфична для аномального прионного белка, потому что обнаружили, что она реагирует в иммуноблоттинге с мозгом, зараженным почесухой, но не с нормальным мозгом. Другие иммунные сыворотки, реагирующие с прионным белком, хорошо известны в технике. Предпочтительным иммуноанализом является ЕЬ18А в плате (например, Сга111\\'о111 е! а1., 1. νίτοί. Ме!1обк, 64:205, 1997).
Таким образом, в ряде случаев детектирование приемного белка, и в частности аномального прионного белка, основано на биофизических и химических характеристиках прионного белка. Они включают устойчивость к протеиназе (особенно к протеиназе К) и профиль гидролиза (действуют ли протеолитические ферменты, глюколитические ферменты, химикаты, нагрев, денатуранты и т.д.). Можно оценивать эффекты таких обработок на видимую молекулярную массу и изоэлектрическую точку, а также осуществить разнообразные анализы связывания. Устойчивость к протеиназе и профиль гидролиза можно определить хроматографией, гель-электрофорезом и прочими методиками, чувствительными к молекулярной массе. Изоэлектрическую точку можно измерить с помощью изоэлектрической фокусировки (ИЭФ) в капилляре или изоэлектрической фокусировки в геле, хотя капиллярная ИЭФ способна измерить прионную р1 в 3 раза эффективнее, чем большинство гелей. Кроме того, количественное определение общего заряда (кислотность или основность) можно произвести ионообменной хроматографией. Для обнаружения прионного белка можно использовать и другие известные в технике биофизические методики.
Примеры методов детектирования прионного белка включают определение видимой молекулярной массы и изоэлектрической точки белка, в том числе после нагревания, гидролиза цианоген-бромидом, обработки нейраминидазой и т.п. (Во1!ои е! а1., 1. νίτοί., 53:596, 1985); обработку гликозидазой и определение связывания к лектину (8ошегуШе апб ВйсЫе, 1. Оеи. νίτοί., 71:883, 1990); определение устойчивости к протеиназе К (Васе е! а1., Ат. 1. Vеΐ. Век., 53:883, 1992); и иммуноанализ (Гащи^ат е! а1., 1. νίτοί. МеЛобк, 24:215, 1989).
Альтернативно, секвенирование или микросеквенирование экстрагированного и, предпочтительно, очищенного прионного белка позволяет подтвердить его идентичность.
Иммуноанализы для прионного белка можно проводить по известным в технике методикам, таким как, например, радиологическое иммунологическое исследование, ЕЬ18А (твердофазный иммуноферментный анализ), иммуноанализ типа сэндвич, иммунорадиометрические анализы, реакции гель-диффузной преципитации, методы иммунодиффузии, иммуноанализы ίη 8Йи (например, с помощью коллоидного золота, меток ферментами или радиоизотопных меток), иммуноблоттинг, реакция преципитации, агглютинация (например, агглютинация в геле, гемагглютинация), реакции связывания комплемента, иммунофлюоресцентные анализы, анализы с помощью белка А и белка С, иммуноэлектрофорезные анализы, измерение уровней в пригодных физиологических пробах и т.п. В одном варианте реализации связывание антител обнаруживают путем детектирования метки на первичном антителе. В другом варианте реализации первичное антитело обнаруживают путем детектирования связывания вторичного антитела или реагента к первичному антителу.
Способ экстракции согласно данному изобретению обеспечивает недорогой источник прионного белка, который можно использовать для выработки дополнительных антител. Кроме того, так как условия экстракции согласно изобретению значительно отличаются от обычных условий экстракции, прионный белок, экстрагированный в соответствии с данным изобретением, может обладать другой конформацией и вызывать выработку другой популяции антител при использовании для иммунизации.
Этот способ сокращает время экстракции до 1-2 ч. Кроме того, из-за его простоты его можно автоматизировать. Способ позволяет выделять прионный белок любого молекулярного размера, так что он не ограничен. Он также делает растворимым аномальный прионный белок, так что для его обнаружения можно использовать большинство типов иммуноанализов. Кроме того, и это существенно, этот способ снижает инфекциозность аномального прионного белка, делая процесс безопаснее.
Наборы
Компоненты для практического применения данного изобретения можно удобно поставлять в форме набора. В простейшем варианте реализации набор согласно изобретению включает растворитель для экстракции, предпочтительно гексафторизопропанол (ГФИП), и лиотропную соль (или концентрированный раствор лиотропной соли) для повышения лиотропной активности смеси растворитель для экстракцииводный препарат. Количества каждого компонента можно заранее рассчитать, чтобы обеспечить определенное количество исследований.
Набор может также включать протеиназу К для расщепления нормального прионного белка в биологической пробе.
Набор может также включать контейнер для образцов, предпочтительно из пластика или иного материала, обработанного с целью предотвращения неспецифического связывания прионного белка.
Применяемый здесь термин контейнер понимают в самом широком значении, т. е. как любое вместилище для хранения материала или реагента. Контейнер можно изготовить из стекла, пластика, керамического материала, металла или любого другого материала, обычно применяемого для хранения реагентов. Однако приемлемый материал не должен реагировать со своим содержимым, для которого он предназначен.
В одном варианте реализации набор включает контейнер для проб с индикатором объема для водного препарата биологического материала. В этом варианте полярный органический растворитель и лиотропную соль оптимально поставляют отмеренными количествами для применения совместно с контейнером для проб. Препарат биологического материала можно поместить в контейнер для проб. Заранее отмеренное количество растворителя для экстракции добавляют и перемешивают. Затем можно добавить заранее отмеренное количество лиотропной соли для того, чтобы вызвать фазовое разделение растворителя для экстракции и воды. В другом варианте реализации в набор включают протеиназу К для обработки водного препарата биологического образца, предпочтительно в заранее отмеренном количестве.
Набор для экстракции прионного белка из пробы ткани может включать буферный разбавитель, такой как 0,32М раствор сахарозы или буферный фосфатно-солевой раствор, для гомогенизации ткани для водного препарата биологического материала.
В другом варианте реализации, в котором набор предназначен для обнаружения аномального прионного белка в биологическом материале или образце, набор включает средство для обнаружения аномального прионного белка методом, описанным выше. Иммуноанализы, как описано выше, являются предпочтительными для обнаружения аномального прионного белка, экстрагированного в соответствии с данным изобретением.
В одном варианте реализации средство для обнаружения аномального прионного белка представляет собой иммунохроматографическую мембрану или твердый носитель. Фракцию растворителя, содержащую экстрагированный прионный белок, можно непосредственно поместить на носитель или можно поместить высушенный экстрагированный материал, например, после повторной солюбилизации. При правильных условиях прионный белок может пройти сквозь носитель. Его можно захватить, напри мер, с помощью иммобилизированных антиприонных антител и обнаружить иммобилизированный прионный белок. В изобретении можно применить множество известных в технике методов и устройств для иммунохроматографических анализов. Иммунохроматографические анализы особенно полезны в полевых условиях, когда лабораторное оборудование недоступно. Примеры таких исследований см. в патентах США №№ 5248619, 5451504, 5500375, 5624809 и 5658801.
Набор согласно данному изобретению предпочтительно включает упаковку и инструкции по применению, например, нанесенные на упаковку или вкладыш.
Данное изобретение можно лучше понять с помощью следующих нелимитирующих примеров, которые приведены в качестве примеров реализации изобретения.
Пример 1. Анализ аномального прионного белка, выделенного из мозга и лимфатических узлов инфицированной овцы.
Ткани мозга или лимфатических узлов от каждой из двух овец, зараженных почесухой, гомогенизировали в 10%-ном саркозиле и обрабатывали протеиназой К для гидролиза нормального прионного белка хозяина, но не измененной аномальной формы прионного белка. Равные объемы (0,5 мМ) гомогената и ΗΡΙΡ смешивали и инкубировали в течение 5 мин при 56°С. К этой смеси прибавляли 0,5 мМ 0,5М раствора Ыа28О4 и смесь инкубировали еще 5 мин. В этих условиях слой ΗΡΙΡ отделялся от водного слоя. Слой ΗΡΙΡ отсасывали и высушивали в центрифуге. Высушенные образцы ресуспендировали в 25 мкл дистиллированной воды и размешивали. Образец объемом 10 мкл смешивали с 5 мкл 20%-го ΌΌΟ-Να в буфере и кипятили в течение 5 мин при 100°С.
Проводили анализ методом иммуноблоттинга (\Уек1егп Ыо1) в 10-15% градиентном полиакриламидном геле. Белок переносили с полиакриламидного геля на нитроцеллюлозу при стандартных условиях. Нитроцеллюлозу блокировали с помощью инкубации в растворе 5%-го рыбьего желатина и промывали буфером ТрисТвин. Нитроцеллюлозу инкубировали в течение ночи с кроличьими антителами к целому прионному белку, взятыми в разведении 1:2500 (Каксак е! а1., 1ттипо1. Ιηνβδΐ., 26:259, 1997; см. также МШет е! а1., 1. Уе!. Э|адп. ИкекЕ 5:309; Каксак е! а1., 1. Упок, 59:676, 1986). После инкубации с антителом к прионному белку нитроцеллюлозу промывали с помощью Трис-Твин, а затем проводили реакцию с антикроличьим 1дС-НРВ (пероксидаза хрена) конъюгатом и инкубировали в течение часа. Нитроцеллюлозу затем интенсивно промывали и проявляли с использованием хемилюминесцентного реагента (Р1егсе И1!та 8ирет81дпа1®). Активность пероксидазы обнаруживали с помощью хемилюминесцентного фотоприемника (Сйет1-1тадет-4000; Л1р11а. 1ппо1ес11).
Экстракты от обеих зараженных почесухой овец, содержащие 2,75 мкл материала, дали полосы, указывающие на аномальный прионный белок как для тканей мозга, так и для тканей лимфатических узлов. Экстракт ткани мозга, содержавший 1,5 мкл материала от одной зараженной почесухой овцы, также дал полосу, указывающую на аномальный прионный белок. Иммуноблоттинг аналогичных экстрактов нормальной (незараженной) овцы не дал никаких полос, указывающих на аномальный прионный белок.
Пример 2. Анализ аномального прионного белка, выделенного и очищенного из мозга и лимфатических узлов инфицированной овцы.
Этот пример показывает последующую очистку и анализ аномального прионного белка (почесухи) РгРкс с помощью гидрофильной хроматографии на основе гидрофильных НЮС. Образцы тканей, включающие мозг и лимфатические узлы овцы, обрабатывали детергентом и протеиназой К, как описано выше. Полученные экстракты наносили на колонку для Н1ЫС и элюировали снижающимся градиентом ацетонитрила в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте и 50 мМ гексафтор-2-пропанола. Выход из колонки был приблизительно на уровне 75%, как определили по радиойодированному прионному белку. После высушивания собранные пиковые фракции смешивали с водой и исследовали с использованием антител, специфичных для прионного белка. Способ позволил получить эффективную очистку прионного белка, а также провести тестирование с помощью иммуноанализа, т.к. интерферирующие детергенты были удалены.
Пример 3. Анализ аномального прионного белка, выделенного из мозга инфицированной овцы.
Приготовление мозгового материала овцы
Мозг инфицированных почесухой овец получали от естественных случаев заболевания, когда был положительный результат анализа методом иммуноблоттинга на наличие аномального приона (Васе е! а1., Ат. 1. Уе!. Век., 53:883, 1992). Составляли пул из трех положительных мозгов. Один и тот же пул использовали во всех описанных здесь опытах. Нормальные мозги получали от овец из стада, не зараженного почесухой, и эти мозги показали отрицательный результат анализа методом иммуноблоттинга на наличие аномального приона. Мозговой материал готовили для хроматографии с помощью модификации метода Во1!оп е! а1., (1. У1го1., 53:596, 1985). Вкратце, отсекали стволы мозга, взвешивали и помещали в 0,32М глюкозу (10% масса/объем). Материал затем гомогенизировали в течение 60 с с помощью устройства Вппктап Ро1у!гоп (Кшетайса АО, Ьисетпе 8\\'Цхег1апб) с помощью 0,7 см генератора из нержавеющей стали при максимальной скорости. Гомогенат центрифугировали при 10000 д в течение 20 мин для удаления частиц и результирующий супернатант центрифугировали при 230000 д в течение 1 ч. Полученный осадок затем подвергали серии промывок и ультрацентрифугированию, как описано выше. Образец обрабатывали 10 мМ Трис рН 7,4, включающим 10% лаурилсульфата натрия и протеиназу К (50 мкг/мл). После последнего ультрацентрифугирования образец ресуспендировали в 10 мМ Трис рН 7,4 (0,2 мл/г первоначального образца мозга).
Хроматография на основе гидрофильных взаимодействий (Н1ЫС)
Образец солюбилизировали в 0,01М ТрисНС1, рН 8,00, включающем 2 мМ ΕΌΤΆ, 5% ОЭС-№ и 10% гексафтор-2-пропанола, при 100°С в течение 10 мин. После обработки ЭЭСΝα образец помещали в растворитель, состоящий из 100% ацетонитрила, включающий 0,1% трифторуксусной кислоты и 50 мМ гексафтор-2пропанола (буфер А), и наносили на колонку для Н1Ь1С. Все используемые колонки были производства Ро1уЬС, 1пс. (Колумбия, Мэриленд, США) размерами 200х4,6 мм; 5 мкм; 300 Ангстрем. Оценивали три набивки - Ро1у\¥АХ ЬР™ (анионообменный материал), Ро1уН¥ОРОХ¥ЕТН¥Е А™ (нейтральный материал) и Ро1у8иЬЕОЕТН¥Е А™ (сильный катионо-обменный материал) (все зарегистрированные товарные знаки принадлежат Ро1уЬС, 1пс.). Скорость потока была 0,5 мл/мин. Условия элюирования РгР8С были 100% А в течение 8 мин и затем линейный градиент до 100% воды с 0,1% трифторуксусной кислоты и 50 мМ гексафтор-2-пропанола (буфер Б) в течение 15 мин, затем 100% Б в течение 10 мин. Пиковые фракции собирали и высушивали в вакуумной центрифуге (8агап1 1п81гишеп18, 1пс., Фармингдейл, Нью-Йорк, США). Фракции смешивали с 0,01 мл деионизированной воды и фракцию, показавшую положительный результат для РгР8С в иммуноблоттировании, использовали для капиллярного электрофорезного исследования.
Мечение приемного белка изотопом 1251
РгР8С метили изотопом 1251 с помощью ΙΟΌΟΟΕΝ'™ (Р1егсе, Рокфорд, Иллинойс, США). Меченый белок отделяли от свободного 125Ι путем пропускания через твердофазный картридж для экстракции, включающий Ро1у\¥АХ ЬР™ (Ро1уРЬС, 1пс.), который был уравновешен буфером А. Меченый РгР8с элюировали из картриджа с помощью буфера Б. Несвязанный 125Ι задерживался в картридже, который можно утилизировать как твердые радиоактивные отходы. Фракции, содержащие меченые РгР”с. высушивали в вакуумной центрифуге, растворяли в воде, разбавляли 1/10 буфером А и наносили на колонку для высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Анализ дот-блотов
0,001 мл аликвоты пиковых фракций от хроматографии Н1Б1С наносили на нитроцеллюлозную бумагу, высушивали и инкубировали в 20 мМ Трис рН 7,5, включающем 500 мМ №С1, 0,05% Твин 20 (ТТВ8) и 5%-ный рыбий желатин, в течение 1 ч. Блот промывали двукратно с помощью ТТВ8 и затем инкубировали с разведенными 1/500 антителами, выработанными к пептидам прионного белка, в течение 3 ч при 25°С (антитела кроликов к пептиду 142-154). После инкубации блот промывали двукратно с помощью ТТВ8 и затем инкубировали с биотинилированным белком О (Вю-Рай ЬаЬога1ог1е8, Геркулес, Калифорния, США) в течение 1 ч. Блот снова промывали, как описано выше. На носитель добавляли пероксидазу хрена, связанную с №и1гАу1йш™ (Р1егсе, Рокфорд, Иллинойс, США) и инкубировали в течение 1 ч при 25°С. После инкубации блот промывали шестикратно с помощью ТТВ8. После промывки блот инкубировали в системе 8ирег81дпа1® 8иЬ81га1е (Р1егсе) в течение 10 мин и затем на 15 с накладывали рентгеновскую пленку Койак Х-ОМАТ АР (Еа81шаи Койак Сотрапу, Рочестер, НьюЙорк, США).
Анализ на связывание 1251ргР8с
Содержащие 125Ι фракции с колонки Ро1у\¥АХ ЬР анализировали на связывающую активность к антителам, продуцированным к пептидам, соответствующим остаткам 142-154 прионного белка. Фракции, содержащие радиоактивность, высушивали в лабораторной вакуумной центрифуге при 42°С, ресуспендировали в 10 мкл Н2О и затем разводили буфером, содержащим соли в 0,1% БСА. РУС-плату покрывали антителами в 0,1М №ьСО3, рН 9,0. После промывки в вышеуказанном буфере 0,1 мл 1251-РгР8с инкубировали на плате при 37°С в течение 2 ч и затем оставляли на ночь при 4°С. Плату промывали, нарезали на отдельные ячейки и пересчитывали. Фоновый имп/мин вычитали из имп/мин в ячейках.
Условия капиллярного электрофореза
Капиллярный электрофорез со свободной зоной (8с1ипегг апй 1еппу, Е1ес1горкоге818, 19:409, 1998) проводили с помощью прибора Весктап Р/АСЕ 5500 (Весктап 1п81гитеп18, Фуллертон, Калифорния, США). Применили обнаружение по индуцированной лазером флюоресценции (ЫЕ) с помощью аргонового лазера с воздушным охлаждением (Весктап 1п81гитеп18) с возбуждением при 488 нм и эмиссией при 520 нм. Немодифицированные капилляры получали от Весктап 1п81гитеп18. Капилляр с длиной детектора 20 см и внутренним размером 201 мкм применяли с 200 мМ трицина, рН 8,0. Этот буфер содержал 0,1% Νоктилглюкозид (ВоеЬппдег Мап11епп ОтЬН, Индианаполис, США) и 0,1% БСА (81дта СЬетюа1 Со., Сент-Луис, Миннесота, США). При подготовке к сепарации капилляр промывали в течение 1 мин 0,25М №ОН, промывали в течение 2 мин Н2О и затем промывали в течение 2 мин буфером. Условия разделения: 30 кВ в течение минуты при 20°С. Ток составлял около мкА. Образец вносили в течение 15 с с последующим внесением в течение 5 с проточного буфера. Объем образца составил около 0,95 нл. Промывку проводили при высоком давлении, а внесение образца - при низком.
Иммунный комплекс и анализ на связывание прионов мкл меченого флюоресцеином пептида, содержащего около 2 пмолей меченого флюоресцентного пептида, смешивали с аффинноочищенными кроличьими 1дО для демонстрации связывания антител с меченным флюоресцеином пептидом. 1 мкл пиковых фракций от хроматографии НЮР добавляли для анализа. После перемешивания компонентов образцы инкубировали при 25°С в течение 10 мин.
Результаты
Хроматограмма РгРкс после очистки и иодирования показана на фиг. 1. Радиоактивность (имп/мин) от 1251-меченого прионного белка совпадает с абсорбцией при 280 нм, за исключением последнего пика, обнаруженного абсорбцией. Выход аномального белка, на основании выхода имп/мин от 1251, внесенных на колонку, равнялся приблизительно 76%. Пики радиоактивности (имп/мин) и поглощения А280 совпали с пиками, показывающими активность антител в анализе на связывание (фиг. 2). Главный пик анализа на связывание на приблизительно 25 мин совпадает с пиком поглощения А280 и 1251-РтР8с на 25 мин на фиг. 1. Аналогичные результаты получили для хроматограммы (не показано) (неочищенного) экстракта мозга инфицированной почесухой овцы.
Для аномального прионного белка в литературе сообщали о широком диапазоне значений р1 (8сНшегг аиб 1еииу, см. ссылку выше; 8аТат е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8с1. ϋδΆ, 87:6373, 1990; 8ошегуШе е! а1., 1. Оеи. У1го1., 70:25, 1989). Значение р1 этого белка должно влиять на связывание белка с материалом колонки. Не было большой разницы между временем задержания на положительно заряженной колонке Ро1у\УАХ ЬР и нейтральной колонке Ро1у НУВКОХУЕТНУЬ А. Это говорит о том, что белок мог быть кислым. Образцы аномального прионного белка, содержащие ОЭС-№1. элюировали с отрицательно заряженной колонки Ро1уНУВКОХ¥ЕТНУЬ А в широких пределах. Поэтому аномальный прионный белок, очищенный на колонке Ро1у\УАХ ЬР, повторно пропустили через колонку Ро1уНУВКОХ¥ЕТНУЬ А. Его элюирование в или вблизи нулевого объема указывает на то, что он действительно кислый. Это подтвердили как изоэлектрофокусировка в геле, так и капиллярная электрофокусировка (8сЬшетт е! а1., СЬгота!одг., А.802:135, 1998). Значения р1 варьировали от 3-6 с наибольшим представительством 3,00. Эти результаты свидетельствуют о том, что в хроматографии на основе гидрофильного взаимодействия необхо димо применять нейтральный или анионный обменный материал.
В капиллярном иммуноэлектрофорезе с применением образцов, очищенных с помощью НЮС, результирующие электроферограммы (не показаны) указывают на то, что пробы от инфицированной овцы реагировали, а пробы от нормальной овцы (неинфицированной) не реагировали. Так как ЭОС-Иа замедляет обычные иммунологические анализы, включая анализы методом капиллярного электрофореза, необходимо удалить ОПС-Иа, чтобы произвести такие анализы. После хроматографии НЮС можно провести конкурирующее испытание с помощью капиллярного электрофореза, т.к. ЭЭС-Иа элюирует в или вблизи нулевого объема (1еио е! а1., Апа1. БюсЬеш., 215:292, 1993).
Пример 4. Анализ аномального приемного белка, выделенного из крови зараженной овцы.
Полученные в результате центрифугирования фракции с лейкоцитарной пленкой от проб крови овцы, зараженной ИГЭ, разбавляли трис-буфером (10% ткани:90% буфер). Пробы затем обрабатывали протеиназой К для гидролиза нормального прионного белка-хозяина, но не измененной аномальной формы прионного белка. После гидролиза обработанный образец смешивали с равным объемом гексафтор-2пропанола (НИР) и инкубировали при 56°С в течение 5 мин. Добавляли равный объем 0,5М сульфата натрия и давали фазам разделиться. Слой, включающий НИР, удаляли и пробу высушивали в вакуумной центрифуге.
Осадок ресуспендировали в воде и помещали суспензию в органическую подвижную фазу для хроматографии, включающую 95% ацетонитрила, 5% воды, 0,1% трифторуксусной кислоты и 50 мМ НИР. Подвижную фазу применяли к твердофазному картриджу для экстракции Ро1уНУЭВОХУЕТНУБ АкрайашИе™ (Ро1уЬС, 1пс.). Аномальный прионный белок элюировали с этой основы с помощью 100% воды, 0,1% трифторуксусной кислоты и 50 мМ НИР, а затем высушивали и смешивали с водой.
Наличие аномального прионного белка обнаруживали капиллярным иммуноэлектрофорезом. Аномальный прионный белок на электроферограммах контрольных образцов крови, не инфицированной ИГЭ, не обнаружили.
Пример 5. Анализ аномального прионного белка, выделенного из крови инфицированного оленьего мула.
Повторяли процедуру примера 4 с пробами крови оленьего мула, инфицированного ИГЭ. Наличие аномального прионного белка обнаруживали капиллярным электрофорезом. Аномальный прионный белок на электроферограммах контрольных образцов крови, не инфицированной ИГЭ, не обнаружили.
Пример 6. Анализ аномального прионного белка, выделенного из крови инфицированного лося.
Повторяли процедуру примера 4 с пробами крови лося, инфицированного ИГЭ. Наличие аномального прионного белка обнаруживали капиллярным электрофорезом. Аномальный прионный белок на электроферограммах контрольных образцов крови, не инфицированной ИГЭ, не обнаружили.
Все патенты, патентные заявки, протоколы испытаний и публикации, процитированные выше, включены тем самым по ссылке во всей полноте.
Настоящее изобретение не ограничено рамками специфических вариантов реализации, описанных здесь. На самом деле, квалифицированным специалистам будут ясны различные модификации изобретения в дополнение к описанным здесь благодаря предыдущему описанию и прилагаемым рисункам. Такие модификации должны находиться в пределах приложенной формулы изобретения.

Claims (2)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ экстракции аномального прионного белка из биологического материала, предположительно содержащего аномальный прионный белок, включающий (а) получение изотонического или гипотонического водного препарата биологического материала;
    (б) инкубацию при температуре от примерно 20 до примерно 100°С смеси растворителя для экстракции и указанного изотонического или гипотонического водного препарата биологического материала, причем указанный растворитель для экстракции является полярным органическим растворителем, в котором растворим указанный аномальный прионный белок и который смешивается с нелиотропным водным раствором, но не смешивается с лиотропным водным раствором; и (в) увеличение лиотропной активности смеси путем добавления лиотропной соли для отделения указанного растворителя, содержащего аномальный прионный белок, от водного препарата биологического материала с получением фракции растворителя, содержащей аномальный прионный белок.
    2. Способ по п.1, в котором указанный растворитель является гексафтор-2-пропанолом.
    3. Способ по п.1, в котором указанный биологический материал является тканью или биологической жидкостью позвоночного животного.
    4. Способ по п.3, в котором указанная ткань является мозговой тканью.
    5. Способ по п.3, в котором указанную биологическую жидкость выбирают из группы, включающей спинно-мозговую жидкость, кровь, плазму и сыворотку.
    6. Способ по п.3, в котором указанная биологическая жидкость является человеческой кровью.
    7. Способ по п.1, в котором инкубацию проводят при 56°С.
    8. Способ по п.1, в котором лиотропную активность повышают прибавлением к указанной смеси в соотношении примерно 1:1 (объем/объем) 0,5М сульфата натрия.
    9. Способ по п.1, в котором до смешивания с растворителем для экстракции указанный биологический материал в указанном изотоническом или гипотоническом водном препарате биологического материала обрабатывают протеиназой К.
    10. Способ по п.1, дополнительно включающий сушку растворителя для получения высушенного аномального прионного белка.
    11. Способ по п.10, дополнительно включающий растворение указанного высушенного аномального прионного белка в воде и очистку указанного аномального прионного белка.
    12. Способ по п.11, в котором указанную очистку осуществляют способом, выбранным из группы, включающей хроматографию на основе гидрофильного взаимодействия и капиллярного электрофореза.
    13. Способ обнаружения аномального прионного белка в биологическом материале, включающий следующие этапы:
    (а) получение изотонического или гипотонического водного препарата биологического материала;
    (б) инкубацию при температуре от примерно 20 до примерно 100°С смеси растворителя для экстракции изотонического или гипотонического водного препарата биологического материала, причем указанный растворитель для экстракции является полярным органическим растворителем, в котором растворим указанный аномальный прионный белок и который смешивается с нелиотропным водным раствором, но не смешивается с лиотропным водным раствором;
    (в) увеличение лиотропной активности смеси путем добавления лиотропной соли для отделения указанного растворителя от указанного водного препарата биологического материала с получением фракции растворителя, содержащей аномальный прионный белок; и (г) анализ фракции растворителя, содержащей аномальный прионный белок, с помощью способа, который позволяет детектировать наличие указанного аномального прионного белка.
    14. Способ по п.13, в котором указанный анализ представляет собой иммуноанализ аномального прионного белка.
    15. Способ по п.13, в котором биологическим материалом является ткань или биологическая жидкость позвоночного животного.
    16. Способ по п.15, в котором указанная ткань является мозговой тканью.
    17. Способ по п.15, в котором указанную биологическую жидкость выбирают из группы, включающей спинно-мозговую жидкость, кровь, плазму и сыворотку.
    18. Способ по п.15, в котором указанная биологическая жидкость является человеческой кровью.
    19. Способ экстракции аномального прионного белка из биологического материала, предположительно содержащего аномальный прионный белок, включающий (а) получение изотонического или гипотонического водного препарата биологического материала;
    (б) инкубацию при температуре от примерно 20 до примерно 100°С смеси приблизительно равных количеств гексафтор-2пропанола и указанного изотонического или гипотонического водного препарата биологического материала;
    (в) добавление приблизительно равного объема раствора 0,5М сульфата натрия к указанной смеси для отделения указанного гексафтор-2-пропанола, содержащего аномальный прионный белок, от водного препарата биологического материала с получением фракции растворителя, содержащей аномальный прионный белок.
    20. Набор для экстракции аномального прионного белка из биологического материала, включающий (а) растворитель для экстракции, представляющий собой полярный органический растворитель, в котором растворим указанный аномальный прионный белок и который смешивается с нелиотропным водным раствором биологического материала, но не смешивается с лиотропным водным раствором; и (б) лиотропную соль или водный раствор лиотропной соли для добавления к водному препарату биологического материала, чтобы указанный органический растворитель стал несмешиваемым с указанным водным препаратом.
    21. Набор по п.20, дополнительно включающий протеиназу К для обработки указанного водного препарата биологического материала.
    22. Набор для обнаружения аномального прионного белка в биологическом материале и, при необходимости, для выделения аномального прионного белка из биологического материала, содержащий
    1) средства для выделения аномального прионного белка, включающие
    а) растворитель для экстракции, который представляет собой полярный органический растворитель, в котором растворим указанный аномальный прионный белок и который смешивается с нелиотропным водным раствором, но не смешивается с лиотропным водным раствором; и (б) лиотропную соль или водный раствор лиотропной соли для добавления к водному препарату биологического материала, чтобы указанный растворитель для экстракции стал несмешиваемым с указанным водным препаратом; и
  2. 2) средство для обнаружения аномального прионного белка.
    23. Набор по п.22, в котором указанное средство предназначено для обнаружения аномального прионного белка методом иммуноанализа, в частности методом иммунохроматографического анализа.
EA200100756A 1999-01-08 2000-01-07 Способ обнаружения и выделения аномального прионного белка и набор для его осуществления EA004953B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11527299P 1999-01-08 1999-01-08
US09/420,850 US6150172A (en) 1999-01-08 1999-10-19 Method and kit for extracting prion protein
PCT/US2000/000457 WO2000040966A1 (en) 1999-01-08 2000-01-07 Method and kit for extracting prion protein

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200100756A1 EA200100756A1 (ru) 2001-12-24
EA004953B1 true EA004953B1 (ru) 2004-10-28

Family

ID=26813023

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200100756A EA004953B1 (ru) 1999-01-08 2000-01-07 Способ обнаружения и выделения аномального прионного белка и набор для его осуществления

Country Status (23)

Country Link
US (1) US6150172A (ru)
EP (1) EP1147415A4 (ru)
JP (1) JP2002534681A (ru)
KR (1) KR20010089776A (ru)
CN (1) CN1135235C (ru)
AU (1) AU761319B2 (ru)
BR (1) BR0007274A (ru)
CA (1) CA2358285A1 (ru)
CZ (1) CZ20012469A3 (ru)
EA (1) EA004953B1 (ru)
EE (1) EE200100358A (ru)
GE (1) GEP20033036B (ru)
HK (1) HK1044588B (ru)
HU (1) HUP0104890A3 (ru)
ID (1) ID29442A (ru)
IL (1) IL143974A0 (ru)
NO (1) NO20013193L (ru)
NZ (1) NZ513215A (ru)
OA (1) OA11745A (ru)
PL (1) PL349132A1 (ru)
SK (1) SK9492001A3 (ru)
TR (1) TR200101935T2 (ru)
WO (1) WO2000040966A1 (ru)

Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2250800C (en) 1996-04-03 2004-02-17 Stichting Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid Method for the detection of prion diseases
US6331296B1 (en) 1999-06-01 2001-12-18 Stanley B. Prusiner Food additives which affect conformationally altered proteins
US6720355B2 (en) * 1997-02-21 2004-04-13 The Regents Of The University Of California Sodium dodecyl sulfate compositions for inactivating prions
US20060008494A1 (en) * 1997-02-21 2006-01-12 The Regents Of The University Of California Complete inactivation of infectious proteins
US6322802B1 (en) 1999-06-01 2001-11-27 The Regents Of The University Of California Method of sterilizing
US6719988B2 (en) 1997-02-21 2004-04-13 The Regents Of The University Of California Antiseptic compositions for inactivating prions
FR2774988B1 (fr) * 1998-02-16 2000-05-05 Commissariat Energie Atomique Procede de purification de la prpres a partir d'un echantillon biologique et ses applications
GB9902659D0 (en) * 1999-02-05 1999-03-31 Microbiological Res Authority Assay with reduced background
WO2000048003A1 (en) * 1999-02-11 2000-08-17 Id-Lelystad, Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid B.V. Prion test
US6605445B1 (en) * 1999-02-22 2003-08-12 Bayer Corporation Rapid method of determining clearance of prion protein
US7041807B1 (en) 1999-06-23 2006-05-09 Caprion Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to a YYX epitope of a mammalian prion protein
US6437102B1 (en) * 1999-11-24 2002-08-20 Bayer Corporation Method of separating prions from biological materials
US20030050276A1 (en) * 2001-08-15 2003-03-13 Cunanan Crystal M. Treatment of tissue, instruments and work surfaces to remove infectious agents
IES20010042A2 (en) * 2001-01-19 2002-12-11 Enfer Technology Ltd Test for transmissible spongiform encephalopathies
US20020192731A1 (en) * 2001-04-12 2002-12-19 H. Shih Jason C. Method and composition for sterilizing surgical instruments
US20050123970A1 (en) * 2001-04-25 2005-06-09 Can Ozbal High throughput autosampler
US8414774B2 (en) * 2001-04-25 2013-04-09 Agilent Technologies, Inc. Systems and methods for high-throughput screening of fluidic samples
WO2002093168A1 (en) * 2001-05-15 2002-11-21 Gradipore Limited Prion diagnostic test
FR2827047B1 (fr) * 2001-07-03 2003-09-26 Apoh Technollgies Sa Procede de separation et/ou detection et/ou identification et/ou quantification de proteines prions
US6591991B2 (en) * 2001-08-06 2003-07-15 Luce Belle Collapsible tire stand
US7045297B2 (en) * 2001-11-14 2006-05-16 Prion Developmental Laboratories, Inc. Rapid prion-detection assay
US20030092090A1 (en) * 2001-11-14 2003-05-15 Kiamars Hajizadeh Rapid prion-detection device, system, and test kit
RU2309410C2 (ru) † 2002-02-28 2007-10-27 Майкроусенс Байофейдж Лимитед Связывание патологических форм прионовых белков
AU2003280457A1 (en) * 2002-06-27 2004-01-19 University Of Marlyland, Baltimore Methods for detecting and inactivating a prion
DE10230141B4 (de) * 2002-07-04 2004-07-15 Priontype Gmbh Verfahren und Kit zur Anreicherung und zum Nachweis von veränderten Prion-Proteinen (PrPSc)
US20040018575A1 (en) * 2002-07-29 2004-01-29 Craig Rappin Sample preparation device and method
US20040018120A1 (en) * 2002-07-29 2004-01-29 Craig Rappin Sample preparation device and method
CH693953A5 (de) * 2002-10-15 2004-05-14 Tecan Trading Ag Verfahren zum Anreichern von Proteinloesungen durch hydrophile Wechselwirkungschromatographie (HILIC) und Verduennungsloesung fuer proteinhaltige Fluessigkeiten.
US20040175775A1 (en) * 2002-11-08 2004-09-09 Neil Cashman Method of detecting PrPsc in eye fluid
AU2003296953A1 (en) * 2002-12-12 2004-07-09 Strategic Diagnostics Inc. Compositions and methods for detecting animal by product in feed
FR2849205B1 (fr) * 2002-12-20 2005-02-11 Afssa Procede d'amplification de la detection de la prpsc et utilisation d'un ligand adjuvant macrocyclique pour une telle amplification
US20090068640A1 (en) * 2003-06-27 2009-03-12 Robert Rohwer Methods for detecting and inactivating a prion
US20050054003A1 (en) * 2003-09-10 2005-03-10 Stenland Christopher J. Prion clearance using particulate metal oxides
DE10354207B8 (de) * 2003-11-20 2006-06-14 Priontype Gmbh & Co.Kg Verfahren zum Nachweis von pathologisch veränderten Prion-Proteinen (PrPSc) und Kit zur Durchführung des Verfahrens
JP4724816B2 (ja) * 2005-09-06 2011-07-13 シャープ株式会社 タンパク質の測定方法
DE102006044795A1 (de) * 2006-09-13 2008-03-27 Schweigert, Florian, Prof. Dr.med.vet. Bestimmung von Inhaltsstoffen aus biologischen Materialien
CA2689145A1 (en) * 2007-06-04 2008-12-11 Pressure Biosciences Inc. Pressure-enhanced extraction and partitioning of molecules
US8410426B2 (en) * 2007-11-02 2013-04-02 Agilent Technologies, Inc. Devices and methods for coupling mass spectrometry devices with chromatography systems
US20120156794A1 (en) * 2008-03-19 2012-06-21 Florian Schweigert Method for the extraction and detection of fat-soluble components from biological materials
EP2288696A4 (en) * 2008-05-07 2012-02-15 Pressure Biosciences Inc EXTRACTION OF BIOMOLECULAR COMPLEXES WITH ALTERNATIVE HYDROSTATIC PRESSURE
KR20120044279A (ko) 2009-04-15 2012-05-07 아브락시스 바이오사이언스, 엘엘씨 무-프리온 나노입자 조성물 및 방법
CN103255142B (zh) * 2012-02-21 2017-07-25 上海转基因研究中心 一种利用RNAi调控内源性朊蛋白表达的方法及其应用
CN102757493A (zh) * 2012-07-11 2012-10-31 北京健翔和牧生物科技有限公司 一种制备鸡痘病毒抗体的方法
JP6819800B2 (ja) * 2017-11-06 2021-01-27 株式会社島津製作所 超臨界流体クロマトグラフを用いた成分分離方法
US11808675B2 (en) * 2019-06-13 2023-11-07 Agilent Technologies, Inc. Room temperature methods for preparing biological analytes
CN114615973A (zh) * 2019-11-08 2022-06-10 中央硝子株式会社 选择性杀灭含有蛋白质聚集体的细胞的方法、其试剂盒、蛋白质错误折叠病治疗药及自血液制品中去除蛋白质聚集体的制剂

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6020537A (en) * 1994-05-13 2000-02-01 The Regents Of The University Of California Prion protein standard and method of making same
US5998149A (en) * 1996-04-05 1999-12-07 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of detecting transmissible spongiform encephalopathies
US5808011A (en) * 1996-07-01 1998-09-15 Biopure Corporation Method for chromatographic removal of prions

Also Published As

Publication number Publication date
JP2002534681A (ja) 2002-10-15
US6150172A (en) 2000-11-21
NZ513215A (en) 2002-12-20
KR20010089776A (ko) 2001-10-08
EP1147415A1 (en) 2001-10-24
HUP0104890A3 (en) 2003-09-29
IL143974A0 (en) 2002-04-21
HK1044588B (zh) 2004-12-03
AU2604300A (en) 2000-07-24
SK9492001A3 (en) 2002-06-04
ID29442A (id) 2001-08-30
WO2000040966A1 (en) 2000-07-13
PL349132A1 (en) 2002-07-01
AU761319B2 (en) 2003-06-05
NO20013193L (no) 2001-08-15
EE200100358A (et) 2002-12-16
EA200100756A1 (ru) 2001-12-24
GEP20033036B (en) 2003-07-25
NO20013193D0 (no) 2001-06-25
TR200101935T2 (tr) 2002-01-21
HK1044588A1 (en) 2002-10-25
CN1135235C (zh) 2004-01-21
EP1147415A4 (en) 2004-06-30
OA11745A (en) 2005-05-13
CA2358285A1 (en) 2000-07-13
CZ20012469A3 (cs) 2002-02-13
HUP0104890A2 (hu) 2002-04-29
CN1342266A (zh) 2002-03-27
BR0007274A (pt) 2001-10-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA004953B1 (ru) Способ обнаружения и выделения аномального прионного белка и набор для его осуществления
Schmerr et al. Use of capillary electrophoresis and fluorescent labeled peptides to detect the abnormal prion protein in the blood of animals that are infected with a transmissible spongiform encephalopathy
US7087213B2 (en) Method of preparing cow brain homogenate
JP5048522B2 (ja) 誤って折り畳まれたタンパク質およびプリオンを検出する方法
DK174032B1 (da) Sæt samt fremgangsmåde til immunometrisk dosering, der kan anvendes på hele celler
RU2444735C1 (ru) Связывающее вещество патологического прионного белка и способ обнаружения патологического прионного белка
US20040115730A1 (en) Test for transmissible spongiform encephalopathies
AU2002226643A1 (en) Test for transmissible spongiform encephalopathies
US20030044868A1 (en) Method for detecting prion proteins in tissue samples
Sivajothi et al. Detection of antibodies against Trypanosoma evansi in sheep by indirect ELISA in Rayalaseema region of Andhra Pradesh.
Ofori et al. Characterization of a 60‐kDa thermally stable antigenic protein as a marker for the immunodetection of bovine plasma‐derived food ingredients
CA2205179A1 (en) Spongiform encephalopathy detection methods
US20040175775A1 (en) Method of detecting PrPsc in eye fluid
MXPA01006875A (en) Method and kit for extracting prion protein
BG64291B1 (bg) М...'од и ки' за ...к''рахиран... на прион про'...ин
ZA200105304B (en) Method and kit for extracting prion protein.
JP4470014B2 (ja) 赤血球抗原の検査方法
HUT77339A (hu) Eljárás szivacsszerű agybetegség kimutatására
KR20230148118A (ko) 생체 시료 내 지질 연관 단백질의 질량 분석을 위한 지질 연관 단백질의 정제 및 농축 방법
KR20060051862A (ko) 프리온 식별용 펩타이드
US20090104181A1 (en) Antibodies for Discrimination of Prions
KR20230148764A (ko) 알츠하이머병 또는 경도 인지장애 진단을 위한 비응집성 용해조성물 및 이를 이용한 진단 방법
RU2235329C1 (ru) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СУБКОМПОНЕНТОВ Clr2s2 ПЕРВОГО КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА
JP2004340924A (ja) プリオン識別抗体
US20110053791A1 (en) Method for detecting or determining abnormal prion protein associated with transmissible spongiform encephalopathy in blood-derived specimen or body fluid-derived specimen

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU