CZ20012469A3

CZ20012469A3 - Způsob pro extrakci prionového proteinu a souprava k jeho provádění

Info

Publication number: CZ20012469A3
Application number: CZ20012469A
Authority: CZ
Inventors: Andrew J. Alpert; Mary Jo Schmerr
Original assignee: The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture
Priority date: 1999-01-08
Filing date: 2000-01-07
Publication date: 2002-02-13
Also published as: JP2002534681A; EP1147415A4; OA11745A; BR0007274A; WO2000040966A1; EA004953B1; HK1044588A1; IL143974A0; PL349132A1; EE200100358A; EP1147415A1; HUP0104890A2; AU2604300A; AU761319B2; US6150172A; GEP20033036B; HK1044588B; HUP0104890A3; NO20013193L; NZ513215A

Description

Způsob -a—kit pro extrakci prionového proteinu /£Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu pro extrakci prionového proteinu z biologického materiálu, jako je například zvířecí tkáň nebo biologická kapalina. Extrakce umožňuje testování přítomnosti abnormálního prionového proteinu, například za účelem diagnostiky přenosných spongiformních encefalopatií.

Dosavadní stav techniky

Prionová onemocnění neboli přenosné spongiformní encefalopatie (TSE) způsobují progresivní degenerativní onemocnění centrálního nervového systému vedoucí ke smrti (Prusiner, Med. Res. Rev. 16: 487, 1996; Weissman, FEBS Letters 289: 3, 1996). Scrapie, TSE u ovcí, byla poprvé popsána před 200 lety (Pattison, Vet. Rec., 123: 661, 1988) a je prototypem tohoto onemocněni. Není známá žádná léčba tohoto onemocnění a nejsou známé žádné testy pro diagnostiku onemocnění u zvířete ante mortem. Prionová onemocněni jsou způsobena konformačními změnami normálního prionového proteinu jedince na abnormální strukturu, která vytváří agregáty. Z důvodu nedávného výskytu hovězí spongiformní encefalopatie v Velké Británii a spojitosti této TSE a nové varianty Crezútzfeld-Jakobovi nemoci (Bruče et al., Nátuře, 389: 498, 1997), lidské TSE, existuje potřeba nových metod, které by byly sensitivní a přesné v diagnostice TSE. Ideálně by měly být tyto diagnostické testy použity pro testování zvířat před tím, než vykazují klinické příznaky a před tím, než zvířata vstoupí do lidského potravního řetězce nebo než jsou použita pro farmaceutické prostředky určené pro použití u člověka.

Většina způsobů používaných pro přípravu a přečištění agens způsobujících TSE obsahuje komplexní sekvenci zpracování enzymy a detergentními činidly a odstředění (Bolton et al., J. Virol., 53: 596, 1985). Abnormální prionový protein je špatně rozpustný v typických biologických pufrech. Jednou metodou pro získání přečištěného abnormálního prionového proteinu je hydrofilní interakční chromatografie (HILIC) (Alpert, J. Chromatogr. 499: 177, 1990), což je opak chromatografie s reverzní fází. Obvykle se zahájí s 70-85% organickým rozpouštědlem a postupně se snižuje gradient organického rozpouštědla. Eluce probíhá v pořadí od nejméně do nejvíce polárních sloučenin. Většina organických mobilních fází HILIC je kompatibilních s proteiny, které se normálně nevyskytují volně ve vodném roztoku, jako jsou membránové proteiny (Jeno et al., Anal. Biochem. 215: 292, 1993), β-amyloidový peptid (143) (Alpert et al., Eighth Symposium of the Protein Society, July 1994, San Diego, CA) a histony (Lindner et al., J. Chromatogr. A. 782: 55, 1997). Surfaktanty a jiná denaturační činidla eluují při téměř prázdném objemu, zatímco proteiny a peptidy jsou obvykle dobře zachovány.

Po HILIC přečištění může být prionový protein detekován imunotestem s kapilární elektroforesou (Schmerr and Jenny, Electrophoresis 19: 409, 1998) nebo kapilárním isoelektrickým isofokusováním (Schmerr et al., J. Chromatograph. Ά. 802: 135, 1998) .

Jak bylo uvedeno výše, současné analytické metody pro detekci abnormálního prionového proteinu se obvykle používají až posmrtně a proto existuje potřeba testu na abnormální prionový protein, který by mohl být použit za života zvířete. Dále je potřeba způsob pro izolaci abnormálního prionového proteinu bez kroků ultracentrifugace, které vyžadují zařízení, které není obvykle přítomno ve veterinárních diagnostických laboratořích. Odstředění vyžaduje přítomnost abnormálního prionového proteinu ve formě agregátů, jejichž velká velikost usnadňuje tvorbu pelet v centrifugačních trubičkách. Takové agregáty se obtížně rozpouštějí a detekují se v dalších krocích. Použití centrifugace také ohrožuje možnost detekce monomerního abnormálního prionového proteinu, což potenciálně snižuje sensitivitu testu. Existuje tedy naléhavá potřeba rychlého, spolehlivého testu, jako je kvalitativní imunotest, pro testování dobytka na infekci ΤΞΕ. Proto existuje v oboru potřeba jednoduché metody pro extrakci abnormálního prionového proteinu.

Dále, protilátky, které byly připraveny, detekují abnormální prionový protein v jeho monomerní formě, s výjimkou protilátky připravené k přirozenému abnormálnímu prionovému proteinu (Korth et al., Nátuře 390: 74, 1997). Proto musí být abnormální prionový protein deagregován silnými detergentními činidly nebo denaturujícími činidly; tato denaturační činidla musí být potom před provedením imunotestu odstraněna. Proto existuje potřeba rychlé, jednoduché metody pro extrakci prionového proteinu bez detergentních nebo denaturačních činidel za účelem analýzy v imunotestu.

Předkládaný vynález poskytuje nový způsob pro extrakci abnormálního prionového proteinu všech velikostí, včetně agregované nebo monomerní formy. Vynález umožňuje testování abnormálního prionového proteinu ve vzorcích od živého zvířete, například za použití imunotestu. Například může být diagnosa provedena ze vzorků krve, což umožňuje testování živých zvířat a usnadňuje odstranění infikovaných zvířat ze stád a brání možné kontaminaci produktů určených pro potraviny.

• · ··

Β · · · · · ···· · • · · « · ·«· •β ·· *·· ·♦· ·· ···

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje způsob pro extrakci abnormálního prionového proteinu z biologického materiálu podezřelého z toho, že obsahuje abnormální prionový protein. Způsob zahrnuje inkubaci směsi extrakčního rozpouštědla a isotonického nebo hypotonického vodného přípravku biologického materiálu za podmínek účinných pro extrakci abnormálního prionového proteinu z biologického materiálu do extrakčního rozpouštědla. Extrakční rozpouštědlo je polární organické rozpouštědlo, ve kterém je abnormální prionový protein rozpustný, a je mísitelné s hypotonickým nebo izotonickým vodným roztokem, ale je nemísitelné s lyotropním vodným roztokem. Lyotropní aktivita směsi se zvýší tak, že dojde extrakční rozpouštědlo se separuje jako samostatní fáze od vodného přípravku biologického materiálu, za zisku extrakčního rozpouštědla obsahujícího jakýkoliv abnormální prionový protein z biologického materiálu.

Vynález se dále týká způsobu pro detekci přítomnosti abnormálního prionového proteinu u zvířete, který zahrnuje testování separovaného extrakčního rozpouštědla připraveného výše uvedeným způsobem, na přítomnost abnormálního prionového proteinu.

Vynález také poskytuje kit pro izolování abnormálního prionového proteinu z biologického vzorku. Kit obsahuje extrakční rozpouštědlo, které má charakteristiky uvedené výše, a lyotropní sůl nebo vodný roztok lyotropní soli pro přidání do vodného přípravku biologického vzorku, kde způsobí to, že organické rozpouštědlo se stane nemísitelným s vodným přípravkem, v jiném provedení vynález kit obsahuje detekční • ♦ · 0 0 0 0 · 4·0

I · »»· « · « Φφ

0 0 0 0 0 Φ Φ 0 Φ • · 0 ♦ φ φ000 ·· ·· 000 ·00 0« 000 test na prionový protein, výhodně test na abnormální prionový protein.

Proto je předmětem vynálezu rychlý způsob pro izolaci abnormálního prionového proteinu z biologického vzorku.

Předmětem vynálezu je také způsob pro časnou detekci pro organismy infikované abnormálním prionovým proteinem.

Dalším předmětem vynálezu je technika extrakce v rozpouštědlu pro izolaci abnormálního prionového proteinu z biologického vzorku.

Ještě jiným předmětem vynálezu je zjednodušení analytického testování biologického materiálu od zvířete nebo od člověka na přítomnost abnormálního prionového proteinu.

Ještě jiným předmětem vynálezu je poskytnutí extraktu obsahujícího abnormální prionový protein pro další testování nebo přečištění.

Tyto a další předměty vynálezu jsou podrobněji popsány v podrobném popisu vynálezu a připojených výkresech.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1: Chromatogram z HILIC I- prionového proteinu, jak byl detekován podle radioaktivity (prázdná kolečka) a absorbance při 280 nm (plná čára).

Obr. 2: Vazba protilátky na I-prionový protein frakce HILIC.

♦ ♦ ·· 0 · *0 0*0 40 *0040

Φ Φ ··· 4 0 04

ΦΦ00 Φ *040

ΦΦ ·0 *0* 044 40000

Podrobný popis vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje způsoby pro extrakci abnormálního prionového proteinu z biologického materiálu. Extrahovaný produkt může být testován imunotestem na přítomnost abnormálního prionového proteinu. Tato extrakce abnormálního prionového proteinu, společně s imunotestem, může být použita pro diagnostiku infekce TSE u živých organismů a může být proto použita v celém světě pro testování TSE infekce u zvířat i u člověka. Proto se předkládaný vynález týká testování na prionový protein v klinických a veterinárních laboratořích, které nemají drahé odstředivky, a také umožňuje testování v terénu.

Vodný přípravek biologického materiálu se smísí s extrakcním rozpouštědlem za vzniku směsi. Extrakční rozpouštědlo je polární organické rozpouštědlo, ve kterém je abnormální prionový protein rozpustný, a je misitelné s nonlyotropním izotonickým vodným roztokem, ale je nemísitelné s lyotropním vodným roztokem. V konkrétním provedení je extrakcním rozpouštědlem hexafluor-2-propanol (též hexafluorisopropanol nebo HFIP). Ačkoliv v příkladech uvedených dále jsou objemy extrakčniho pufru a vodného přípravku biologickém materiálu přibližně stejné, může být použit jakýkoliv poměr, který vede k zisku dvou různých fází, jak je popsáno dále.

Ve výhodných provedeních se směs inkubuje při teplotě v rozmezí od přibližně 20 °C do přibližně 100 °C. Nicméně, může být použita jakákoliv teplota, při které jsou jak extrakční rozpouštědlo, tak vodný přípravek biologického materiálu ve vodné fázi, tj. teplota mezi teplotou tuhnutí a teplotou varu.

*9 * V ··« ♦ · · ·· ·· · ♦«« • · ··♦ · · ·φ ····· · · · · ·· • Φ · · · ·«·» ·· ·♦ «·« ··· 99···

Směs extrakční rozpouštělo-biologický materiál se inkubuje za podmínek účinných pro extrakci abnormálního prionového proteinu z biologického materiálu do extrakčního rozpouštědla. Po inkubaci se lyotropní aktivita směsi zvýší tak, že se extrakční rozpouštědlo separuje od vodného přípravku. Extrakční rozpouštědlo obsahující prionový protein se odstraní od vodného přípravku biologického materiálu.

V předkládaném vynálezu může být lyotropní aktivita směsi extrakční rozpouštědlo-vodný přípravek zvýšena přidáním lyotropní soli. S1 může být přidána ve formě pevného materiálu přímo do směsi, nebo může být přidána jako koncentrovaný vodný roztok. Výhodnými příklady lyotropních solí jsou síran sodný a síran amonný. Ve specifických provedeních, popsaných dále, se iontová síla zvýší přidáním přibližně poměru 1:1 (obj./obj.) 0,5 M síranu sodného do směsi.

Vynález je zejména výhodný proto, že nevyžaduje získání jakéhokoliv materiálu z biopsie nebo pitvy. V předkládaném vynálezu může být biologickým materiálem vzorek od živého zvířete. Způsob podle předkládaného vynálezu umožňuje extrakci abnormálního prionového proteinu z biologické kapaliny nebo orgánové biopsie pro analytické testování. Alternativně může být biologický materiál získán z biopsie nebo pitevního materiálu, například z produktu ze zvířete, který má být použit v potravě, farmacii, kosmetice nebo jiném oboru a který je určen pro použití člověkem nebo jiným zvířetem. V dalším provedení může být způsob podle předkládaného vynálezu použit pro odstranění prionového proteinu z takových materiálu pro zajištění toho, že infekční priony nebudou přeneseny.

Způsob extrakce podle předkládaného vynálezu může být

·· • • ·	·· •	• • * •	» M *	9 · « fl • ·	• ·· •
• ·	• ·	•	V	• ·	•
♦ ·	··		···	• ·	«··

použit jak pro extrakci normálního prionového proteinu, tak pro extrakci abnormálního prionového proteinu. Předběžným zpracováním biologického vzorku proteinasou-K může být normální prionový protein tráven. Proto, je-li požadován pouze abnormální prionový protein, tak může být vodný přípravek biologického materiálu předem zpracován proteinasou-K před smísením s extrakčním rozpouštědlem.

Extrakční roztok obsahující jakýkoliv prionový protein může být sušen za zisku extrakční pelety. Prionový protein v roztoku nebo extrakční peletě může být dále přečištěn, například chromatografií s hydrofilní interakcí.

Abnormální prionový protein u zvířete může být detekován testováním materiálu v separované extrakční peletě na jeho přítomnost. Výhodně je testovacím způsobem imunotest na abnormální prionový protein. Vzorek může být zpracován proteinasou-K před izolací prionového proteinu tak, že není izolován žádný normální prionový protein.

V jiném aspektu vynález poskytuje kity pro izolování abnormálního prionového proteinu z biologického vzorku. V jednom provedeni obsahuje kit extrakční rozpouštědlo, například hexafluor-2-propanol. Kit dále obsahuje lyotropní sůl nebo vodný roztok lyotropní soli, který se přidává do vodného přípravku biologického vzorku proto, aby se extrakční rozpouštědlo stalo nemísitelným s vodným přípravkem.

Vynález dále poskytuje kit pro detekci přítomnosti abnormálního prionového proteinu v biologickém vzorku. Kromě složek popsaných výše obsahuje detekční kit také detekční test pro detekci abnormálního prionového proteinu. Výhodným detekčním testem na přítomnost abnormálního prionového • · · ·« ·Φ φ a · • · · ·· φ · · * • ♦ · · · φφφ ·· ·♦ φφφ φ·· φφ φ«φ proteinu je imunotest.

Ačkoliv byly tato extrakční metoda a kit vyvinuty primárně pro diagnostiku scrapie (TSE u ovcí), jsou použitelné pro diagnostiku jiných TSE u jiných obratlovců, zejména u savců a ptáků, jako jsou lidé, skot, prasata, losi, jeleni, drůbež a hlodavci. Abnormální prionový protein může být detekován ve tkáních zvířat a člověka již dva týdny po infekci. Významnou aplikací způsobu podle předkládaného vynálezu je detekce abnormálního prionového proteinu v lidské krvi. Tato technika může být také použita pro abnormálního prionového proteinu z materiálu používanému pro výrobu farmaceutických nebo jiných výrobků určených pro použití u člověka, včetně potravinových doplňků.

Termín přibližně, jak je zde použit, znamená v rozmezí 20%, lépe v rozmezí 10% a nejlépe v rozmezí 5% od dané hodnoty nebo rozsahu.

Biologické materiály

Předkládaný vynález se týká extrakce prionového proteinu z biologického materiálu. Obecně, prionové proteiny se vyskytují u obratlovců, jak bylo popsáno výše. Proto je za většiny okolností biologický materiál od zvířete nebo od člověka. Prionový protein může být také produkován během fermentačního procesu eukaryotickými buňkami. Může být exprimován jako rekombinantní prionový protein. Velmi významná je možnost současné exprese endogenního prionového proteinu buňkami, které byly rekombinantně modifikovány tak, aby exprimovaly jiný protein. Tato možnost je pravděpodobnější tehdy, když jsou buňky neurálního původu, jako jsou PC12 buňky. V tomto případě může být biologický materiál produkt ♦ · 9# · ·Φ· • · · ·♦ ·· · ·· • Φ *·· · · ·« • · ♦ · · · φ · φ ·· ·· ΦΦΦ ♦·· ΦΦ ΦΦΦ fermentace, například rekombinantní protein.

Příklady biologických materiálů od zvířat zahrnují, například, tkáně, jako je mozek, sval (včetně srdečního svalu), játra, appendix, slinivka břišní, orgány gastrointestinálniho traktu, kůže a lymfatická tkáň, jako je thymus, slezina, mandle, lymfatické uzliny a podobně. Alternativně může být biologickým materiálem biologická kapalina. Termín biologická kapalina zahrnuje mozkomišní mok, krev, sérum, plasmu, mléko, moč, sliny, slzy, hlenové sekrety, pot, semeno a tělní kapaliny obsahující tyto složky. Také tento termín zahrnuje kultivační kapaliny (nebo kultivační media) použitá pro produkci rekombinantních proteinů nebo obsahující buňky v suspenzi před transplantací. Termín biologické materiály také zahrnuje výrobky vyrobené ze zvířecích orgánů nebo tkání, včetně sérových proteinů (jako je albumin a imunoglobulin), hormonů, potravy a zpracovaných potravinových výrobků, potravinových doplňků, kostní moučky, potravy pro zvířata, proteinů extracelulární matrice, želatiny, a jiných živočišných vedlejších produktů používaných ve výrobě nebo v konečných výrobcích.

Když je biologickým materiálem pevná tkáň nebo produkt, musí být nejprve rozpuštěn nebo suspendován ve vodném roztoku tak, aby byl vhodný pro proces extrakce. Například, mozková tkáň musí být suspendována v roztoku sacharosy (například 0,32 M sacharose) v 10% (hmot./obj.). Mezi jiné hypotonické nebo izotonické roztoky patří 5% dextrosa, fosfátem pufrovaný salinický roztok, tri-pufrovaný salinický roztok, HEPESpufrovaný salinický roztok nebo jakýkoliv z výše uvedených pufrů. Biologický materiál ve vodném roztoku může být také rozemlet, homogenizován nebo jinak rozrušen pro maximalizaci kontaktu mezi extrakčním rozpouštědlem a biologickým

«0	• 0	*0 0· 0
	•	•	4«	• ·	• 0	0«
•	•	0··	0		« «
•
A	*	0 0	0	0	• 0
a·		0«	• 00		•0	00

materiálem. Nicméně, pokud je biologickou kapalinou biologický materiál, tak nemusí být přidání kapaliny nutné, pokud není nutné pro naředění iontové síly biologické kapaliny pro umožnění mísitelnosti extrakčního rozpouštědla.

Prionový protein

Termín prionový protein, jak je zde použit, označuje přirozený protein exprimovaný v nervové tkáni, zejména v mozku, a nižších koncentracích také v lymfatické tkáni a ve všech ostatních tkáních. Za některých okolností přijímá prionový protein patogenní konformaci a potom se označuje jako abnormální prionový protein. Některé mutace prionového genu u některých jedinců patrně predisponují prionový protein pro přijímání patogenní konformace. Expozice organismu přenosnému infekčnímu činidlu, prionu, může také indukovat konformační změnu vedoucí k patologii.

Abnormální prionový protein je mnohem méně citlivý na proteolýzu než normální prionový protein. Zpracování biologického materiálu proteinasou, zejména proteinasou-K, tráví normální prionový protein, ale ne abnormální prionový protein.

Ve specifických případech uvedených dále je ovčí abnormální prionový protein (PrP^sc) extrahován způsobem podle předkládaného vynálezu. Nicméně, jiné prionové proteiny z jiných druhů, zejména těch, které byly uvedeny výše, mohou být také extrahovány způsobem podle předkládaného vynálezu.

Do kategorie abnormálních prionových proteinů patři lidské prionové proteiny nacházené při neurodegenerativních onemocněních jako je Kuru, Creutzfeld-Jakobova nemoc (CJD),

99	99	9	99 «
•	9	9	9 9	• 9	•	9	9«
•	9	9 99	9	9	9	9	*
♦
9	• • 9	« 9 99	9 999	• 99«	9 99	9	• 9 9«

Gerstmann-Strausslerův syndrom (GSS) a fatální familiární insomnie. Některé případy CJD a GSS jsou asociovány se známými mutacemi prionového genu. CJD je také asociována s expozicí TSE. Například, jak bylo uvedeno výše, je CJD asociována s hovězí spongiformní encefalopatií. Předkládaný vynález poprvé umožňuje extrakci abnormálního prionového proteinu od pacienta před pitvou. Detekce extrahovaného abnormálního prionového proteinu může být použita pro diagnostiku kteréhokoliv z těchto onemocnění.

Scrapie (u ovcí, koz) a hovězí spongiformní encefalopatie (krávy) jsou onemocnění spojená s abnormálním prionovým proteinem u zvířat. Prionové proteiny byly také izolovány u kuřat, norků, prasat, myší, křečků a morčat. Dále, u myší, křečků a morčat se může vyvinout spongiformní encefalopatie po expozici prionům od člověka nebo z jiného zdroje. Prionový protein z jakéhokoliv z těchto zdrojů může být detekován nebo extrahován způsobem podle předkládaného vynálezu.

Extrakční rozpouštědlo a podmínky

Extrakční rozpouštědlo pro použití v předkládaném vynálezu musí být separovatelné jako samostatná fáze od vody nebo vodného roztoku za lyotropních podmínek. Zároveň musi být prionový protein rozpustný v extrakčním rozpouštědle. Některá polární organická rozpouštědla splňují tato kriteria. Výhodným polárním organickým rozpouštědlem je hexafluor-2-propanol. Dalšími použitelnými rozpouštědly jsou isopropanol; 1,1,1trifluor-2-propanol (TFIP); 2,2,3,3-tetrafluor-l-propanol (tetFIP); perfluor-t-butylalkohol (PFtBA); 1,1,1,3,3,3hexafluoraceton (HFA) ; kyselina trifluoroctová (TFA); 2,2,2trifluor-l-ethanol (TFE); 2,2,3,3,4,4,4-heptafluor-2-propanol (HFB); 1,1,1,3,3,4,4,4-oktafluor-2-butanol ((OFIB); 1-methyl13 *«·4 « ·· « ···· • · · ·φ « · ·· ···· • · ♦» * • É ·· 4 »·· • · · ♦φ « · · ·» Φ

Φ Φ Φ 4Φ ··· ««· »φ ·4«

2-pyrrolidinon (ΝΜΡ); viz Wille et al., J. Mol. Biol. 259: 608, 1996. Dalšími rozpouštědly, která mohou být vyzkoušena, jsou DMSO; tetrahydrofuran a podobně. Alternativně může být použito rozpouštědlo, které není mísitelné s vodou, ale ve kterém je prionový protein rozpustný.

Ve specifických provedeních je rozpouštědlo mísitelné s vodou, například při fyziologické iontové síle (v izotonickém vodném roztoku) nebo při nižší než fyziologické iontové sile (v hypotonickém vodném roztoku). Nicméně, když pufr obsahuje lyotropní soli v koncentraci (nebo iontové síle) vyšší než je prahová hodnota, tak není extrakční rozpouštědlo rozpustné ve vodném roztoku: dvě fáze se separují do vrstvy extrakčního rozpouštědla a vodné vrstvy. Toto se zde označuje jako lyotropní podmínky. Hodnota iontové síly lyotropní soli ve vodném roztoku, která způsobuje lyotropní podmínky, se liší podle použitého extrakčního rozpouštědla a použité soli, tato hodnota může být snadno určena titraci nebo jinou systematickou změnou koncentrace lyotropní soli, za testování mísitelnosti nebo nemísitelnosti extrakčního rozpouštědla s vodným roztokem. Vodný roztok s iontovou sílou lyotropní soli, při které se extrakční rozpouštědlo separuje od vody, se označuje jako lyotropní vodný roztok. Vodné roztoky obsahující nižší koncentrace lyotropních solí nebo fyziologických soli, jako jsou izotonické pufry, se považují za non-lyotropní roztoky.

Obvykle se v procesu extrakce rozpouštědlem použiji přibližně stejné objemy extrakčního rozpouštědla a vodného přípravku biologického materiálu. Nicméně, poměr extrakčního rozpouštědla ku vodnému přípravku může být v rozmezí od přibližně 5:1 do přibližně 1:5, lépe od přibližně 3:1 do přibližně 1:3.

	4Φ
•	♦	v	··
* ·	···
•	•	« · ·
	•	• V
4 ·

«9 *

*		«
	• ·	··
*	•	•	•
	• ·	•	•
•	•	•	•
ve	IH	·«·

Po smísení extrakčního rozpouštědla s vodným přípravkem může být směs inkubována po určitou dobu a při určité teplotě pro zlepšení extrakce prionového proteinu do extrakčního pufru. Inkubační čas může být různý od 1 minuty do hodin a může být určen analýzou extrahovaného materiálu na přítomnost prionového proteinu. Poté, co dosáhne závislost množství prionového proteinu v extrakčním materiálu na čase fáze plató, což se určí pomocí chromatografie nebo imunotestů, nebo obou, jak je popsáno v příkladech, nemá další inkubace vliv na výtěžek prionového proteinu. Ve specifických provedeních je inkubační doba 5 minut.

Dále, teplota inkubace může být upravena pro zvýšení účinnosti extrakce, pod podmínkou, že při dané teplotě jsou jak extrakční rozpouštědlo, tak vodný roztok v kapalném stavu. Vyšší teploty, t.j. teploty vyšší než teplota místnosti, jsou výhodné, protože zvyšují rozpustnost prionového proteinu v extrakčním rozpouštědle. Zejména výhodné jsou teploty v rozmezí přibližně 50-60 °C. Stejně jako jiné proměnné, jako je iontová síla vodného přípravku a doba inkubace, může být optimální teplota určena běžnými pokusy a testováním.

Separace fází

Různé lyotropní soli mohou být použity pro zvýšení iontové síly vodného roztoku, což indukuje separaci fází. Výhodnými solemi jsou síran sodný a síran amonný, které jsou lyotropní. Obě se použijí v koncentracích nižších, než jsou koncentrace, které srážejí proteiny. Například, v konkrétním provedení se 0,5 M roztok síranu sodného přidá ke stejnému objemu směsi extrakční rozpouštědlo/vodný přípravek což vede ke konečné koncentraci síranu sodného 0,25 M. Tato koncentrace je

• 9 « 9 9 9	·· 9	9 9 9 •	9 9 * 9	·· 9 · 9 9	• 9

9 9	9 9	9	9	9 9
··	99	♦ •9	f 9*	9 9	9 9

dostatečná pro indukci separace fází HFIP a vody. Mohou být použity I jiné soli, s podmínkou, že mohou dosáhnout požadované lyotropní aktivity v koncentraci, při které jsou rozpustné. Termín lyotropní aktivita, jak je zde použit, označuje schopnost lyotropního solného roztoku vytvářet struktury.Lyotropní aktivita je dosažena dosažením koncentrace lyotropní soli dostatečné pro indukci separace fází mezi organickou a vodnou fází. Vyloučeny jsou koncentrace lyotropní soli způsobující srážení proteinů.

lyotropní nebo struktury-vytvářející soli, též známé jako kosmotropy, navozují uspořádání vodného roztoku, za vyloučení organických rozpuštěných látek. Pokud je organickou rozpuštěnou látkou extrakční rozpouštědlo, dojde k separaci fází. Pokud je organickou rozpuštěnou látkou protein, dojde k vysolení proteinu z roztoku, mezi dobré soli vytvářející struktury patří síran sodný a amonný, fosfáty, citráty atd. (Washabaugh and Collins, J. Biol. Chem. 261: 12477, 1986). (Mezi soli rozrušující strukturu, neboli chaotropy, patří guanidiniumhydrochlorid, chloristan sodný, bromid sodný atd. tyto mají opačný účinek; způsobují sloučení organických solutů s vodnými roztoky). Iontová síla vodného roztoku je funkcí celkového počtu iontů v roztoku, bez ohledu na to, zda se jedná o ionty vytvářející strukturu nebo o ionty rozrušující struktury. Termín iontová síla se týká koncentrace solí.

Jak bylo uvedeno výše, lyotropní sůl může být přidána ve formě pevné látky nebo ve formě koncentrované kapaliny, s podmínkou, že konečná koncentrace lyotropní soli je účinná pro indukci separace fází. Výhodně je konečný poměr extrakčního rozpouštědla k vodné fázi (která obsahuje vodný přípravek biologického materiálu a jakýkoliv roztok soli) po zvýšení lyotropní aktivity směsi přibližně 1:10 až přibližně 10:1 (výhodně (jak je uvedeno dále) přibližně 1:3 až přibližně 3:1, s podmínkou, že při nižším poměru extrakčního rozpouštědla k vodné fázi je konečná koncentrace soli stále ještě dosti vysoká pro indukci separace fází.

Po zvýšení lyotropní aktivity se extrakční rozpouštědlo, které nyní obsahuje jakýkoliv prionový protein, který byl přítomen v biologickém materiálu, separuje od vodného přípravku. Separace probíhá během několika minut a je dokončena tehdy, když jsou obě fáze čiré a je mezi nimi patrná diskrétní separace. Po úplné separaci dvou fázi může být extrakční rozpouštědlo, nyní obsahující jakýkoliv prionový protein, odebráno, například odsátím pipetou nebo injekční stříkačkou, nebo pomocí separační baňky.

Extrakční rozpouštědlo obsahující jakýkoliv prionový protein (zde označované jako extrakt) může být sušeno, například odpařením, lyofilizací nebo vakuovým odstředěním, za zisku vysoce koncentrovaného nebo suchého extraktu. Extrakt může obsahovat další složky, včetně buněčných lipidů, proteinů navázaných na lipidovou membránu a jiných hydrofobnějších buněčných složek. Pokud je to žádoucí, může být prionový protein izolován nebo přečištěn od těchto složek, například chromatografií s hydrofilní interakcí, jak je popsána dále, nebo jinými chromatografickými technikami (kationtovou výměnou chromatografií, gelovou chromatografií, chromatografií s reverzní fází a afinitní chromatografií, například na protilátkové koloně).

Alternativně může být koncentrovaný nebo sušený extrahovaný materiál analyzován přímo, jak je popsáno dále, na přítomnost prionového proteinu.

• · · · * · · 9 · ·· ·· ··· «·« ·♦ ·««

Detektor prionového proteinu; imunotesty

Různé detekční testy na prionové proteiny, včetně testu pro selektivní detekci abnormálních prionových proteinů, jsou známé v oboru jako účinný nástroj pro detekci prionového proteinu. Bylo ověřeno, že kapilární gelová elektroforesa je účinný analytický nástroj pro detekci abnormálního prionového proteinu (Schmerr and Jenny, Electrophoresis 19: 409, 1998). Výhodnou metodou je imunotest, například imunotest popsaný ve Schmerr and Jenny, výše. Antisérum popsané v tomto odkazu je specifické pro abnormální prionový protein, protože bylo zjistino, že reaguje ve westernovém poenosu s mozky infikovanými scrapie, ale ne s normálními mozky. Jiná antiséra reaktivní s prionovými proteiny jsou dobce známá v oboru. Výhodným ímunotestem je ELISA test (napdíklad Grathwohl et al., J. Virol. Methods, 64: 205, 1997).

Tak je v nikterých případech detekce přítomnosti prionového proteinu, zejména abnormálního prionového proteinu, založena na biofyzikálních a chemických charakteristikách prionového proteinu. Mezi tyto charakteristiky patří resistence na proteinasy (zejména na proteinasu K) a profil trávení (proteolytickými enzymy, glukolytickými enzymy, chemickými ěinidly, teplem, denaturačními činidly atd.). Mohou být hodnoceny efekty takových zpracování na zřetelnou molekulovou hmotnost a izoelektrický bod a různé vazebné testy. Resistence na proteinasy a profil trávení mohou být detekovány chromatografií, gelovou elektroforesou a jinými technikami citlivými na molekulovou hmotnost. Izoelektrický bod může být měřen pomocí kapilárního isoelektrického fokusování (IEF) nebo gelového isoelektrického fokusování, ačkoliv kapilární IEF může měřit pl prionu 3-krát lépe než všechny gely. Dále, kvalitativní stanovení celkového náboje (kyselosti nebo

• *	« •	»··	» a a •	• • · •	ta a •	« v	• a
*	•	• ·	•	•	*		•
a			• a »			• a		4 4

zásaditosti) může být určeno iontovou výměnou chromatografií. Další biofyzikální techniky známé v oboru mohou být také použity pro identifikaci prionového proteinu.

Příklady testů pro detekci prionového proteinu zahrnují testy pro stanoveni zřetelné molekulové hmotnosti a izoelektrického bodu proteinu, včetně takových stanovení po zpracování teplem, štěpení bromkyanem, zpracování neuraminidasou atd. (Bolton et al., J. Virol. 53: 596, 1985); zpracováni glykosidasou a vazbou lektinu (Somerville and Ritchie, J. Gen. Virol. 71: 883, 1990); stanovení resistence na proteinasu-K (Race te al., Am. J. Vet. Res. 53: 883, 1992); a imunotesty (Farquhar et al., J. Virol. Methods, 24: 215, 1989).

Alternativně, sekvencování nebo mikrosekvencování extrahovaného - a výhodně přečištěného - prionového proteinu umožňuje jednoznačné potvrzení jeho identity.

Imunotesty na prionový protein mohou být provedeny za použití technik známých v oboru, jako je například radioimunotest_r ELISA (enzymový imunosorbentní test), sandwichové imunotesty, imunoradiometrické testy, srážení a difuse v gelech, imunodifusní testy, imunotesty in šitu (za použití koloidního zlata, enzymových nebo radioizotopových značkovacích činidel), westernový přenos, srážecí reakce, aglutinační testy (například gelové aglutinační testy, hemaglutinační testy), komplement-fixační testy, imunofluorescenční testy, testy s proteinem A nebo s proteinem G, imunoelektroforetické testy, měření jejich koncentrací ve vhodných fyziologických vzorcích, atd. V jednom provedení je vazba protilátky detekována detekcí značkovacího činidla na primární protilátce. V jiném provedení je primární protilátka

• 4	«4	4	}	04
• ·	•	• 4	• 4	4	0	44
• 0	• ··	4	•	•	•
♦ 4	4 4	4	4	•	0
4·	44	4··	«04	♦ *		40

detekována detekcí vazby sekundární protilátky nebo činidla na primární protilátku.

Extrakční metoda podle předkládaného vynálezu poskytuje levný zdroj prionového proteinu, který může být použit pro přípravu dalších protilátek. Dále, protože se extrakční podmínky podle předkládaného vynálezu značně liší od běžných extrakčních podmínek, může mít prionový protein extrahovaný způsobem podle předkládaného vynálezu jinou konformaci a může vyvolávat tvorbu jiné populace protilátek, když je použit pro imunizaci.

Způsob podle předkládaného vynálezu zkracuje extrakční dobu na 1 až 2 hodiny. Dále, vzhledem ke své jednoduchosti může být způsob automatizován. Způsob extrahuje prionové proteiny všech molekulových velikostí, takže není omezen. Také solubilizuje abnormální prionový protein tak, že většina imunotestů může být použita pro jeho detekci. Dále, není nevýznamné, že snižuje infekčnost abnormálního prionového proteinu, což činí proces bezpečnějším.

Kity

Složky pro provedení předkládaného vynálezu mohou být výhodně dodávány ve formě křtu. V nej jednodušším provedení obsahuje kit podle předkládaného vynálezu extrakční rozpouštědlo, výhodně HFIP, a lyotropní sůl (nebo koncentrovaný roztok lyotropní soli) pro zvýšení lyotropní aktivity směsi extrakční rozpouštědlo-vodný přípravek. Množství každé složky může být předem odměřeno pro konkrétní počet testů. V dalším provedení kit obsahuje kontainer pro vzorek, výhodně z plastu nebo materiálu zpracovaného pro vyloučení nespecifické vazby prionového proteinu.

* 1·* · ··

I · · ·· • * 0· * «·Φ· 0

Termín zásobník, jak je zde použit, má nejširší význam, t.j, jedná se o jakékoliv zařízení pro uchovávání materiálu nebo činidla. Může být vyroben ze skla, plastu, keramiky, kovu nebo jiného materiálu obvykle používaného pro uchovávání činidel. Nicméně, jakýkoliv materiál nesmí být reaktivní s obsahem, který v něm má být přechováván.

Kit může také obsahovat proteinasu-K pro trávení normálního prionového proteinu v biologickém vzorku.

V dalším provedení obsahuje kit zásobník pro vzorek s ukazatelem objemu pro vodný přípravek biologického vzorku. V tomto provedení jsou polární organické rozpouštědlo a lyotropní sůl optimálně dodány v předem odměřených jednotkách určených pro použití se zásobníkem pro vzorky. Přípravek biologického vzorku může být vložen do zásobníku pro vzorky. Potom se přidá předem odměřená jednotka extrakčniho rozpouštědla a provede se smísení. Potom se přidá předem odměřená jednotka lyotropní soli pro indukci separace fází extrakčniho rozpouštědla a vody.V ještě dalším provedení kit obsahuje proteinasu-K pro zpracování vodného přípravku biologického vzorku, výhodně v předem odměřené jednotce.

Kit pro extrakci prionového proteinu ze vzorku tkáně může obsahovat ředící pufr, jako je 0,32 M roztok sacharosy nebo fosfátem pufrovaného salinického roztoku, pro homogenizaci tkáně pro přípravu vodného přípravku biologického materiálu.

V dalším provedení, ve kterém je kitem kit pro detekci přítomnosti abnormálního prionového proteinu v biologickém materiálu nebo vzorku, obsahuje kit detektor nebo test pro detekci přítomnosti abnormálního prionového proteinu, jak je «V ·* ·»« ·«» ·· * 0« · 0 _ „ 0 0 * 0· 0 00 0 »····♦··*♦

9000 0 000 • 0 00 ·· · 009 ··· popsán výše. Imunotesty, jak jsou popsány výše, jsou výhodné pro detekci abnormálního prionového proteinu extrahovaného způsobem podle předkládaného vynálezu.

V ještě dalším provedení kit obsahuje imunochromatografickou membránu nebo nosič. Extrakční rozpouštědlo obsahující jakýkoliv prionový protein může být aplikováno na nosič přímo, nebo může být aplikován sušený extrakt, například po resolubilizaci. Za vhodných podmínek může prionový protein procházet přes nosič. Může být zachycen, například imobilizovanou anti-prionovou protilátkou, a imobilizovaný prionový protein může být detekován. Mnoho metod a prostředků pro imunochromatografické testy může být použito v předkládaném vynálezu. Imunochromatografické testy jsou zejména vhodné pro použití v terénu, kde není laboratorní vybavení. Příklady takových testů jsou uvedeny v US patentech č. 5248619, 5451504, 5500375, 5624809 a 5658801.

Kit podle předkládaného vynálezu výhodně obsahuje návod pro jeho použití, například příbalový leták.

Předkládaný vynález může být lépe pochopen podle následujících příklad, které nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1: Analýza abnormálního prionového proteinu extrahovaného z mozků a lymfatických uzlin infikovaných ovcí

Mozky a lymfatické uzliny od dvou ovcí infikovaných scrapie se homogenizovaly v 10% sarkosylu a zpracovaly se proteinasou22

• 0	0»	0	•	00
• 0	•	·	• 0	•	0	• ·
•	•	• 00	0	Φ	•	0
•	•	* 0 ·	*	0	0 0	0
*	•	0 Φ	•	Φ	0	0
··		• 0 «	• ΦΦ	00		« 0

K pro trávení normálního prionového proteinu, ale ne abnormální formy prionového proteinu. Stejné objemy (0,5 mM) homogenátu a HFIP se smísily a provedla se inkubace po dobu 5 minut při teplotě 56 °C. Do této směsi se přidalo 0,5 mM 0,5 M NazSOí a směs se inkubovala po dobu dalších 5 minut. Za těchto podmínek se HFIP vrstva separovala od vodné vrstvy. HFIP vrstva se odebrala a sušila se na odstředivce. Sušené vzorky se resuspendovaly ve 25 μΐ destilované vody a smísily se. 10 μΐ vzorku se potom smísilo s 5 μΐ 20% SDS pufru a směs se vařila po dobu 5 minut při teplotě 100 °C.

Analýza westernovým přenosem se provedla na 10%-15% gradientovém polyakrylamidovém gelu. Protein se přenesl z polyakrylamidového gelu na nitrocelulosu za standardních podmínek. Nitrocelulosa se blokovala inkubací s roztokem 5% rybí želatiny a promyla se Tris-Tween pufrem. Nitrocelulosa se inkubovala přes noc s králičím anti-prionovým proteinem (protilátka proti celému prionu naředěná 1:2500; Kascak et al., Immunol. Invest. 26: 259, 1997; viz též Miller et al., J. Vet. Diagn. Invest. 5: 309; Kascak et al., J. Virol. 59: 676, 1986). Po inkubaci s anti-prionovou protilátkou se nitrocelulosa promyla Tris-Tween a potom reagovala s konjugátem anti-králičí IgG-HRP (křenová peroxidasa) a inkubovala se po dobu 1 hodiny. Nitrocelulosa se potom důkladně promyla a reagovala s chemiluminiscentním činidlem (Pierce UltraSuperSignal®) . Peroxidasová aktivita se detekovala pomocí chemiluminiscenčního detektoru (ChemiImager-4000; Alpha, Innotech).

Extrakty od obou ovcí infikovaných scrapie obsahující 2,75 μΐ materiálu produkovaly proužky ukazující na přítomnost abnormálního prionového proteinu jak pro mozkovou tkáň, tak pro tkáň lymfatických uzlin. Extrakt mozkové tkáně obsahující

		•	•	··		•
• *	*	• ·	··	•	•
•	•	• ·*	*		*	k
	•	• · ·	•	•
• ·	« *		•		•	•
	··	• ♦4	f ··	f ·		··

1,5 μΐ materiálu od jedné z ovcí infikovaných scrapie také produkoval proužek ukazující na přítomnost abnormálního prionového proteinu. Westernový přenos podobných extraktů od normální (neinfikované) ovce neprodukoval žádný proužek ukazující na přítomnost abnormálního prionového proteinu.

Příklad 2: Analýza abnormálního prionového proteinu extrahovaného a přečištěného z mozků a lymfatických uzlin infikovaných ovcí

Tento příklad ukazuje další přečištění a analýzu abnormálního (scrapie) prionového proteinu (PrP^sc) za použití chromatografie s hydrofilní interakcí (HILIC). Vzorky tkáně z ovčích mozků a lymfatických uzlin byly zpracovány detergentním činidlem a proteinasou-K stejně jako v předešlém příkladu. Získané extrakty se aplikovaly na HILIC kolonu a eluovaly se klesajícím gradientem acetonitrilu v 0,1% kyselině trifluoroctové a 50 mM hexafluor-2-propanolu. Zisk z kolony byl přibližně 75%, jak bylo zjištěno pomocí radioaktivním jodem značeného prionového proteinu. Po sušení byly odebrané píkové frakce resuspendovány ve vodě a testovány pomocí protilátek specifických pro prionový protein. Způsob umožňuje účinné přečištění prionového proteinu, stejně jako testování imunotestem, protože nevyužívá interferujících detergentních činidel.

Příklad 3: Analýza abnormálního prionového proteinu extrahovaného z mozku infikovaných ovcí

Příprava materiálu ovčího mozku:

Mozky ovcí infikovaných scrapie byly získány od ovcí, které byly pozitivní na abnormální prion podle westernová přenosu

··	• fc	fc	fc	··
v ·	B	• B	• fc	• ·	• ·
• ·	B··	•	B	• fc
• fc	b e ·	fc	fc	• fc ·
• fc	• ·	fc	•	fc *
• ·	··	· ·	• •b	··	« ·

(Race te al., Am. J. Vet. Res. 53: 883, 1992). Soubor byl připraven ze 3 pozitivních mozků. Stejný soubor byl použit pro všechny uvedené pokusy. Normální mozky byly od ovcí ze stád bez scrapie a byly negativní na abnormální prionový protein podle westernového přenosu. Mozky byly připraveny pro chromatografií modifikací metody podle Bolton et al·., J. Virol. 53: 596, 1985. Stručně, mozkové kmeny byly odebrány, zváženy a vloženy do 0,32 M sacharosy (10% hmot./obj.). Materiál se potom homogenizoval po dobu 60 sekund na Brinkman Polytron (Kinmatica AG, Lucerne Switzerland) za použití 0,7 cm generátoru z nerezové oceli při nejvyšší rychlosti. Homogenát se odstředil při 10000 g po dobu 20 minut pro odstranění částeček materiálu a získaný kapalný supernatant se odstředil při 230000 g po dobu 1 hodiny. Tato peleta se potom zpracovala sérií výplachů a ultracentrifugací, jak byly popsány výše. Vzorek se potom zpracoval 10 mM Tris pH 7,4 obsahujícím 10% lauryl síran sodný a proteinasu K (50 μg/ml). Po poslední ultracentrifugací se vzorek resuspendoval v 10 mM Tris, pH 7,4 (200 μg/ml počátečního vzorku mozku).

Chromatografie s hydrofilní interakcí (HILIC)

Vzorek se solubilizoval v 0,01 M Tris Hel, pH 8,0 obsahujícím 2 mM EDTA, 5% SDS a 10% hexafluor-2-propanol při 100 °C po dobu 10 minut. Po zpracování SDS se vzorek vnesl do rozpouštědla skládajícího se ze 100% acetonitrilu obsahujícího 0,1% kyselinu trifluoroctovou a 50 mM hexafluor-2-propanolu (pufr A) a aplikoval se do hydrofilní interakční kolony. Všechny použité kolony byly od PolyLC, lne. (Columbia, MD, USA) a měly rozměry 200 x 4,6 mm; 5 μιη; 300-A. Použily se tři náplně, PolyWAX LP™ (aniontový iontoměničový materiál), PolyHYDROXYETHYL A™ {neutrální materiál) a PolySULFOETHYL A™ (silný kationtový iontoměničový materiál) (všechny tři o • · ··Β· • ·*

Β ·Β«·

Β ·« • *Β ♦ *·♦·

	*	Bt
	•	Β · * B	··
	B	a » B
	B	B ·
• a	B··	··	a ·

obchodní známky jsou vlastnictvím PolyLC, lne.). Průtok byl 0,5 ml/min. Podmínky pro eluci PrP^sc byly 100% A po dobu 3 minut a potom lineární gradient do 100% vody obsahující 0,1% kyselinu trifluoroctovou a 50 mM hexafluor-2-propanol {pufr B) v 15 minutách, a potom 100% B po dobu 10 minut. Píkové frakce se odebraly a sušily se ve vakuové odstředivce (Savant Instruments, lne., Farmingdale, NY, USA). Frakce se resuspendovaly v 10 μΐ deionizované H2O a frakce pozitivní v imunopřenosu na PrP^sc se použily v kapilární elektroforese.

125

Značení prionového proteinu I

PrP^sc se značil ¹²⁵I za použití IODOGEN™ (Pierce, Rocford,

125

IL, USA). Značený protein se separoval od volného I zpracováním na náplni pro extrakci na pevné fázi obsahující PolyWAX™ (PolyLC, lne.), která byla uvedena do rovnováhy pufrem A. Značený PrP se eluoval pomocí pufru B. nenavázaný ¹²⁵I zůstal zachycen v náplni a mohl být dodstraněn jako pevný sc radioaktivní odpad. Frakce obsahující značený PrP se sušily ve vakuové odstředivce, rozpustily se ve vodě, naředily se 1/10 v pufru A a vnesly se HPLC kolony.

Hybridizace na skvrnách μΐ podíly píkových frakcí z HILIC chromatografie se aplikovaly na nitrocelulosový papír, sušily se a potom se inkubovaly v 20 mM Tris, pH 7,5, obsahujícím 500 mM NaCl, 0,05% Tween 20 (TTBS) a 5% rybí želatinu po dobu 1 hodiny. Skvrny se potom prorayly 2x TTBS a potom se inkubovaly s ředěním 1/500 protilátek připravených proti peptidům prionového proteinu po dobu 3 hodin při teplotě 25 °C (králičí protilátky k peptidu 142-154). Po inkubaci se skvrny promyly 2x TTBS a potom se inkubovaly s biotinylovaným proteinem G •000 • *♦··

0 0 0·

A 00 >··

0 0« • 0 ·0 · ♦ ·

0 00

0 0 0 0 >00« «00 «·0 0*0 (Βίο-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) po dobu 1 hodiny.

Skvrny se znovu promyly stejným způsobem. Ke skvrnám se přidala křenová peroxidasa navázaná na NeutrAvidin™ (Pierce, Rocford, IL, USA) a provedla se inkubace po dobu 1 hodiny při teplotě 25 °C. Po inkubaci se skvrny promyly 6x TTBS. Po promytí se skvrny inkubvaly v SuperSignal® Substráte (Pierce) systému po dobu 10 minut a exponovaly se na Kodak X-OMAT AR (Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA) rentgenovém filmu po dobu 15 sekund.

Vazebný test pro ¹²⁵IPrP^sc

125

Frakce obsahující I z PolyWAX LP kolony se testovaly na vazbu na protilátku, která byla připravena k peptidu odpovídajícímu zbytkům 142-154 prionového proteinu. Zkumavky obsahující radioaktivitu se sušily v Savant cakuové odstředivce při teplotě 42 °C a resuspendovaly se v 10 μΐ H2O a potom se naředily pufrem obsahujícím sole v 0,1% BSA. PVC plotna se potáhla protilátkou v 0,1 M Na2CO3, pH 9,0. Po promytí výše uvedeným pufrem se 100 μΐ ¹²⁵I-PrP^sc inkubovalo na plotnách při 37 °C po dobu 2 hodin a potom přes noc při teplotě 4 °C. Plotna se promyla a nastříhala na jednotlivé jamky, které se potom analyzovaly. Cpm pozadí se odečetlo od cpm jamek.

Podmínky kapilární elektroforesy

Volná kapilární elektroforesa (Schmerr and Jenny, Electrophoresis 19: 409, 1998) se provedla na Beckman P/ACE 5500 (beckman Instruments, Fullerton, CA, USA). Detekce pomocí fluorescence indukované laserem (LIF) se provedla za použití vzduchem chlazeného argonového laseru (Beckman Instruments) s excitací při 488 nm a emisí při 520 nm. Nemodifikované kapiláry byly získány od Beckman Instruments. 20 cm (délka k

♦♦		• * ·· ·
» »	•	··		« ·	• ·
•	•	♦ ··	•		• *
	*	• · ·	•	•	• · ·
		• ·			• ·
	♦ ·	«·		9«	• 9

detektoru) x 201 μια I.D. kapilára se použila s 200 mM tricinu, pH 8,0. Tento pufr obsahuje 0,1% N-oktylglukosidu (Boehringer Manheim GmbH, Indianapolis, IN, USA) a 0,1% BSA (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA). Při přípravě pro separaci byla kapilára promývána po dobu 1 minuty 0,25 M NaOH, po dobu 2 minut H2O a potom po dobu 2 minut pufrem. Separačni podmínky byly 30 KV po dobu 3 minut při 20 °C. Proud byl přibližně 20 μΑ. Vzorek se injikoval po dobu 15 sekund a potom se po dobu 5 sekund injikoval pracovní pufr. Objem vzorku byl přibližně 0,95 nl. Výplachy byly provedeny za vysokého tlaku a injikování vzorku bylo provedeno za nízkého tlaku.

Vazebné testy pro imunokomplexy a priony μΐ peptidů značeného fluoresceinem obsahující přibližně 2 pmol peptidů značeného fluoresceinem se smísilo safinitně přečištěným králičím IgG pro demonstrování vazby protilátky na peptid značený fluoresceinem. 1 μΐ píkových frakcí z HILIC chromatografie se přidal do testu. Po smísení složek se vzorky inkubovaly při 25 °C po dobu 10 minut.

Výsledky

SC

Chromatogram PrP a přečištění a jodinaci je uveden na obr.

1. Radioaktivita (cpm) z prionových proteinů značených I odpovídá absorbanci při 280 nm, s výjimkou posledního píku detekovaného absorbanci. Výtěžek abnormálního proteinu, určený podle zpětného zisku I vneseneho do kolony, byl přibližně 76%. Píky cpm a Ά280 absorbance odpovídají pikům vykazujícím aktivitu s protilátkou ve vazebném testu (obr. 2). Hlavní pík ve vazebném testu v přibližně 25 minutě odpovídá pikům pro

125

IPrP a A280 absorbanci ve 25 minutě z obr. 1. Podobné výsledky byly získány pro chromatogram (není uveden) z •fc fcfc • · fc • ♦ fcfcfc • · · fc · • · · · ·· ♦·

fc	fc	fcfc
• fc	• fc	fc	•	• fc
•	»	*	•
fc	•	• fc	fc
fc	•	fc	•
···	···	• fc		• fc

extraktu (nepřečištěného) mozků ovcí infikovaných scrapie.

(ro abnormální prionový protein bylo v literatuře popsáno široké rozpětí pí hodnot (Schmerr and Jenny, výše; Safar et al., proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 6373, 1990; Somerville et al., J. Gen. Virol. 70: 25, 1989). pí tohoto proteinu může ovlivňovat vazbu tohoto proteinu na náplň kolony, nebyly pozorovány významné odlišnosti retenčních časů pro PolyWAX LP kolonu s pozitivním nábojem a neutrální PolyHYDROXYETHYL A kolonu. Toto naznačuje, že protein může být kyselý. Vzorky abnormálního prionového proteinu obsahující SDS eluovaly z negativně nabité PolySULFOETHYL A kolony v širokém spektru. Proto byl abnormální prionový protein přečištěný na PolyWAX LP koloně znovu přečištěn na PolySULFOETHYL A koloně. Jeho eluce při nebo téměř připrázdném objemu kolony naznačuje, že je kyselý. Toto bylo potvrzeno jak gelovým isoelektrickým fokusováním, tak kapilárním elektrickým fokusováním (Schmerr et al., Chromatogr. A. 802: 135, 1998). pí hodnoty jsou v rozmezí 3-6 s většinou při 3. Tyto výsledky ukazují, že v hydrofilní interakční chromatografií je nutné použít neutrální nebo aniontový iontoměničový materiál.

V kapilární imunoelektroforese za použití HILIC přečištěných vzorků získané elektroferogramy (nejsou uvedeny) ukazují, že vzorky od infikovaných ovcí reagovaly, zatímco vzorky od normálních (neinfikovaných) ovcí neragovaly. Protože SDS inhibuje typické imunotesty včetně kapilární elektroforesy, je nutné pro provedení takových testů odstranit SDS. Kompetiční test využívající kapilární elektroforesy může být proveden na vzorcích po HILIC chromatografií, protože SDS eluuje při nebo téměř při prázdném objemu kolony (Jeno et al., Anal. Bioochem. 215: 292, 1993).

»* 9« •»9 • > 99 · • 9 99 *999

999 • 9 *9 • 99 *9

999

Příklad 4: Analýza abnormálního prionového proteinu extrahovaného od infikovaných ovcí

Frakce bohaté na leukocyty ze vzorků krve od ovcí infikovaných TSE se naředily Tris pufrovaným salinickým roztokem (10% tkáně:90% pufru). Vzorky se potom zpracovaly proteinasou K pro trávení normálních prionových proteinů, kde toto trávení neměnilo abnormální formy abnormálního prionového proteinu. Po trávení se zpracované vzorky smísily se stejným objemem hexafluor-2-propanolu (HFIP) a inkubovaly se při 56 °C po dobu 5 minut. Přidal se stejný objem 0,5 M síranu sodného a fáze se nechaly separovat. Vrstva obsahující HFIP se odstranila a vzorky se sušily ve vakuové odstředivce.

Peleta se resuspendovala ve vodě a suspenze se vnesla do organické chromatografické mobilní fáze obsahující 95% acetonitrilu, 5% vody, 0,1% kyseliny trifluoroctové a 50 mM HFIP. Mobilní fáze se aplikovala do vložky pro extrakci na pevné fázi PolyHYDROXYETHYL Aspartamide^ítm) (PolyLC, lne.). Abnormální prionový protein eluoval z tohoto nosiče při použití 100% vody, 0,1% kyseliny trifluoroctové a 50 mM HFIP a potom se sušil a resuspendoval se ve vodě.

Přítomnost abnormálního prionového proteinu se detekovala kapilární imunoelektroforesou. Abnormální prionový protein nebyl detekován v elektroforetogramech kontrolních vzorků krve, které nebyly infikovány TSE.

Příklad 5: Analýza abnormálního prionového proteinu extrahovaného z krve infikovaných křížených jelenů

Postup podle příkladu 4 se opakoval se vzorky krve od křížených jelenů infikovaných TSE. Přítomnost abnormálního

• » * * ♦ φ prionového proteinu se detekovala kapilární imunoelektroforesou. Abnormální prionový protein nebyl detekován v elektroforetogramech kontrolních vzorků krve, které nebyly infikovány TSE.

Příklad 6: Analýza abnormálního prionového proteinu extrahovaného z krve infikovaných losů

Postup podle příkladu 4 se opakoval se vzorky krve od losů infikovaných TSE. Přítomnost abnormálního prionového proteinu se detekovala kapilární imunoelektroforesou. Abnormální prionový protein nebyl detekován v elektroforetogramech kontrolních vzorků krve, které nebyly infikovány TSE.

Všechny patenty, patentové přihlášky, testovací protokoly a publikace citované v předkládaném vynálezu jsou zde uvedeny jako odkazy ve své úplnosti.

Předkládaný vynález není omezen specifickými popsanými provedeními. Různé modifikace vynálezu budou odborníkům v oboru jasné z uvedeného popisu a připojených výkresů. Takové modifikace spadají do rozsahu předkládaného vynálezu, jak je definován připojenými patentovými nároky.

Claims

1. Způsob pro extrakci abnormálního prionového proteinu z biologického materiálu podezřelého z toho, že obsahuje abnormální prionový protein, vyznačující se tím, že zahrnuje:

(a) inkubaci směsi extrakčního rozpouštědla a izotonického nebo hypotonického vodného přípravku biologického materiálu za podmínek účinných pro extrakci abnormálního prionového proteinu z uvedeného biologického materiálu do uvedeného extrakčního rozpouštědla, kde uvedené extrakční rozpouštědlo je:

(i) polární organické rozpouštědlo, ve kterém je uvedený abnormální prionový protein rozpustný; a (ii) mísitelné s non-lyotropním vodným roztokem, ale nemísitelné s lyotropním vodným roztokem; a (b) zvýšení lyotropní aktivity směsi pro separaci uvedeného extrakčního rozpouštědla z uvedeného vodného přípravku uvedeného biologického materiálu za zisku extrakčního rozpouštědla obsahujícího jakýkoliv abnormální prionový protein z uvedeného biologického materiálu.

2. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že uvedeným extrakčním rozpouštědlem je hexafluor-2-propanol.

3. Způsob podle nároku 1 v y z n a č u j i c i se tím, že uvedeným biologickým materiálem je tkáň nebo biologická kapalina od obratlovce. 4. Způsob podle nároku 3 v y z n a č u j i c i se tím, že uvedenou tkání je mozková tkáň.

·· ·· • » » • * ·99

9 * · · ♦ • · · · ·· ··

» • • ♦ ♦· · • · • * • · * • · 9· ··

5. Způsob podle nároku 3vyznačující se tím, že uvedená biologická kapalina je vybrána ze skupiny zahrnující mozkomíšní mok, krev, plasmu a sérum.

6. Způsob podle nároku 3vyznačuj ící se t í m, že uvedenou biologickou kapalinou je lidská krev.

7. Způsob podle nároku lvyznačujici se tím, že uvedená směs se inkubuje při teplotě v rozmezí od přibližně 20 °C do přibližně 100 °C.

8. Způsob podle nároku 7vyznačující se tím, že uvedená inkubace je provedena při teplotě přibližně 56 °C.

9. Způsob podle nároku lvyznačujici se tím, že uvedená lyotropní aktivita je zvýšena přidáním 0,5 M síranu sodného v poměru přibližně 1:1 (obj./obj.) k uvedené směsi.

10. Způsob podle nároku lvyznačujici se tím, že uvedený biologický materiál v uvedeném izotonickém nebo hypotonickém přípravku biologického materiálu je zpracován proteinasou K.

11. Způsob podle nároku lvyznačujici se tím, že dále zahrnuje (c) sušení extrakčního rozpouštědla obsahujícího abnormální prionový protein za zisku extrakční pelety.

12. Způsob podle nároku 11 vyznačující se tím, že dále zahrnuje (d) rozpuštění uvedené sušené extrakční pelety ve vodě a přečištění uvedeného abnormálního prionového proteinu.

»· w • · *· · • • * ·· ·· • • 99 • • ·♦· • • • 9 • · • · « • • * 9 * • · • * • 9 99 • 4 ··· **· 99

13. Způsob podle nároku 12 vyznačující se tím, že uvedené přečištění zahrnuje způsob vybraný ze skupiny zahrnující hydrofilní interakční chromátografii a kapilární elektroforesu.

14. Způsob pro detekci přítomnosti abnormálního prionového proteinu u zvířete vyznačující se tím, že zahrnuje testování uvedeného separovaného extrakčního rozpouštědla připraveného způsobem podle nároku 1 na abnormální prionový protein.

15. Způsob podle nároku 14 vyznačující se tím, že uvedený test zahrnuje imunotest na abnormální prionový protein.

16. Způsob podle nároku 14 vyznačující se tím, že uvedeným biologickým materiálem je tkáň nebo biologická kapalina od obratlovce.

17. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že uvedenou tkání je mozková tkáň.

18. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že uvedená biologická kapalina je vybrána ze skupiny zahrnující mozkomíšní mok, krev, plasmu a sérum.

19. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že uvedenou biologickou kapalinou je lidská krev.

20. Způsob pro extrakci abnormálního prionového proteinu z biologického materiálu podezřelého z toho, že obsahuje abnormální prionový protein, vyznačující se tím, že zahrnuje:

• v « · · • · ··· ♦ · · · φ ♦ · φ

Φ· ··

9 ΦΦ b • * ·· · • * • · • · · • · • Φ ·· ··· ΦΦ • Φ

(a) inkubaci směsi přibližně stejných množství hexafluor-2propanolu a non-lyotropního přípravku biologického materiálu za podmínek účinných pro extrakci uvedeného abnormálního prionového proteinu z uvedeného biologického materiálu do uvedeného hexafluor-2-propanolu;

(b) přidáni přibližně stejného objemu roztoku 0,5 M síranu sodného do uvedené směsi pro separaci uvedeného hexafluor-2propanolu z uvedeného vodného přípravku uvedeného biologického materiálu za zisku extrakčního rozpouštědla obsahujícího jakýkoliv abnormální prionový protein z uvedeného biologického materiálu.

21. Kit pro izolaci abnormálního prionového proteinu z biologického vzorku vyznačující se tím, že obsahuje:

(a) extrakční rozpouštědlo, kde uvedené extrakční rozpouštědlo je:

(i) polární organické rozpouštědlo, ve kterém je uvedený abnormální prionový protein rozpustný; a (ii) mísitelné s non-lyotropním vodným roztokem, ale nemísitelné s lyotropním vodným roztokem; a (b) lyotropní sůl nebo vodný roztok lyotropní soli pro přidání do vodného přípravku biologického vzorku tak, že se uvedené organické rozpouštědlo stane nemísitelným s uvedeným vodným přípravkem.

22. Kit podle nároku 21 vyznačující se tím, že dále obsahuje zásobník pro vzorky s ukazatelem objemu pro uvedený vodný přípravek biologického vzorku, kde uvedené polární organické rozpouštědlo a uvedená lyotropní sůl nebo vodný roztok lyotropní soli jsou dodány v předem odměřených jednotkách pro použití s uvedeným zásobníkem pro vzorky.

0 *0 0 * 00 00 0 0 0 0 • ··· • 0 0 0 0 • • • 0 0 0 * 0 0 0 • 0 • 0 0 • • 0 0 0 0 · * 0 >00 000 00 0*0

23. Kit podle nároku 21 vyznačující se tím, že dále obsahuje proteinasu-K pro zpracování uvedeného vodného přípravku biologického vzorku.

24. Kit pro detekci přítomnosti abnormálního prionového proteinu z biologického vzorku vyznačující se tím, že obsahuje:

(a) extrakční rozpouštědlo, kde uvedené extrakční rozpouštědlo je:

(i) polární organické rozpouštědlo, ve kterém je uvedený abnormální prionový protein rozpustný; a (ii) mísitelné s non-lyotropním vodným roztokem, ale nemísitelné s lyotropním vodným roztokem;

(b) lyotropní sůl nebo vodný roztok lyotropní soli pro přidání do vodného přípravku biologického vzorku tak, že se uvedené organické rozpouštědlo stane nemísitelným s uvedeným vodným přípravkem; a (c) detekční test pro abnormální prionový protein.

25. Kit podle nároku 24 vyznačující se tím, že uvedeným detekčním testem je imunotest.

26. Kit podle nároku 25 vyznačující se tím, že uvedeným imunotestem je imunochromatografický test.