KR20010089776A - 프리온 단백질을 추출하는 방법 및 킷트 - Google Patents

프리온 단백질을 추출하는 방법 및 킷트 Download PDF

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제이.알퍼트 앤드류
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제이.알퍼트 앤드류
마이클 디. 러프
미합중국 농무부
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Abstract

본 발명은 생물학적 물질, 예를 들면 동물조직 또는 산물 등으로부터 프리온 단백질을 추출하는 방법에 관한 것이다. 특정의 예로서, 균질화된 양의 뇌로부터 비정상적인 프리온 단백질이 헥사플루오로-2-프로판올로 추출된다. 수용액의 이온강도를 증가시키므로써 상기 헥사플루오로-2-프로판올이 수성 뇌 제제로부터 분리된다.
상기 유기 추출물 중의 프리온 단백질은 더 정제되거나, 또는 상기 추출물은 프리온 단백질의 존재, 특히 비정상적인 프리온 단백질에 대해 면역분석(immunoassay) 등에 의하여 시험될 수 있다. 상기 추출방법은 비정상적인 프리온 단백질의 존재에 대하여, 예를 들면 전이성의 스폰지형 뇌질환(TSE)의 진단 등에 대하여 시험될 수 있다. 대표도는 원으로 표시된 것으로서 방사성에 의하여 검출된 것 및 실선으로 표시된 것으로서 280㎚에서의 흡수로 검출된 것으로서의 I-프리온(I-prion) 단백질의 HILIC로부터 수득된 크로마토그램을 나타내고 있다.

Description

프리온 단백질을 추출하는 방법 및 킷트{Method and kit for extracting prion protein}
프리온 질병들 또는 전이성의 스폰지형 뇌질환(TSE)들은 중추신경계의 점진적인 퇴행성 질병(progressive degenerative disorders)들의 원인이 되어 죽음에 이르게 한다(Prusiner, Med. Res. Rev. 16 : 487, 1996 ; Weissman, FEBS Letters 289 : 3, 1996). 양의 전이성의 스폰지형 뇌질환인 진전병(scrapie)이 200여년 전에 처음으로 발표되었으며(Pattison, Vet. Rec. 123 : 661, 1988), 이들 질병들의 원형이다. 이들 질병들에 대한 치료법들은 알려져 있지 않으며, 동물에서의 이러한 질병의 존재에 대한 치사 전의 시험방법들도 알려져 있지 않다. 프리온 질병들은 정상적인 주 프리온 단백질이 응집물을 형성하는 비정상적인 구조로의 형태적 변화에 의해 유발된다. 최근 영국에서의 소과 동물에서의 스폰지형 뇌질환의 발발 및 이 TSE와 그 새로운 변종인 인간 TSE, 크로이펠츠-야곱병(Creutzfeld-Jakob)(Bruce et al., Nature 389 : 498, 1997)과의 관계 때문에, TSE들의 진단에 대해 민감하고도 정확한 새로운 방법이 요구되고 있다. 이상적으로, 이 진단법은 동물들이 임상적인 징후들을 보이기 전에, 그리고 이들 동물들이 인간의 식품체계 속으로 또는 인간에게 사용하기 위하여 제조되는 약품들 내로 들어가기 전에 동물들을 시험하는데 사용될 수 있어야 한다.
TSE들의 질병-유발 시약들을 준비하고, 정제하는데 사용되었던 대부분의 방법들은 효소 및 계면활성제 처리 및 원심분리들의 복합적인 절차들을 포함한다(Bolton et al., J. Virol. 53 : 596, 1985). 비정상적인 프리온 단백질은 전형적인 생물학적인 완충제들에서 거의 용해되지 않는다. 정제한 비정상적인 프리온 단백질을 수득하는 하나의 방법은 친수성의 상호작용 크로마토그래피(HILIC ; hydrophilic ineteraction chromatography)이며(Alpert, J., Chromatogr. 499 : 177, 1990), 이는 역상 크로마토그래피(reversed-phase chromatography)의 역이다. 전형적으로, 이는 70 내지 85%의 유기용매로 시작하여 유기용매의 감소 구배로 운전한다. 용리는 최소 극성에서 최대 극성으로의 순서에서 이루어진다. 대체적으로 HILIC의 유기 이동상들은 막 단백질들(Jeno et al., Anal. Biochem. 215 : 292, 1993), β-아밀로이드 펩티드(1-43)(Alpert et al., Eighth Symposium of the Protein Society, July 1994, San Diego, CA) 및 히스톤(Lindner et al., J. Chromatogr. A. 782 : 55, 1997) 등과 같이 수성용액에서 유리가 일어나지 않는 단백질들과 혼화될 수 있다. 계면활성제들 및 다른 변성제들은 빈 공간 내 또는 그 근처에서 유리되는 한편, 단백질들 및 펩티드들은 일반적으로 잘 보류된다.
HILIC 정제 후, 상기 프리온 단백질은 모세관 전기영동 면역분석(capillary electrophoresis immunoassay)(Schmerr and Jenny, Electrophoresis 19 : 409, 1998)을 사용하거나 또는 모세관 등전위 집중(capillary isoelectric focusing)(Schmerr et al., J. Chromatogr. A. 802 : 135, 1998)에 의하여 검출될 수 있다.
앞서 언급한 바와 같이, 비정상적인 프리온 단백질을 검출하기 위한 현존하는 분석적 방법들은 사후에 사용되어 왔으며, 따라서 비정상적인 프리온 단백질에 대한 치사 전 분석이 요구되고 있다. 게다가, 수의사의 진단 실험실들에서 용이하게 획득할 수 없는 장치들을 필요로 하는 초원심분리의 단계 없이 비정상적인 프리온 단백질을 분리하는 방법이 요구되고 있다. 원심분리는 응집물로서의 프리온 단백질의 존재를 필요로 하며, 그 큰 크기는 원심분리 시험관 내에서 덩어리(pellet)를 형성하기에 충분하다. 이러한 응집물들은 용해시키기 어려우며, 후속의 단계들에서 검출된다. 원심분리의 사용은 또한 단량체성의 비정상적인 프리온 단백질을 검출할 가능성을 위태롭게 하여 어떠한 분석에서의 민감도를 잠재적으로 저하시킨다. 또한, TSE로 감염된 가축을 시험하기 위한 신속하고, 신뢰할 수 있는 정량 면역분석과 같은 현장분석이 보다 더 요구되고 있다. 따라서, 당해 기술분야에서는 비정상적인 프리온 단백질을 추출하기 위한 효율적이고, 간단한 방법이 요구되고 있다.
게다가, 생성된 상기 항체들은 원래의 비정상적인 프리온 단백질에 대해 형성된 항체를 제외하고 그 단량체성 형태에서 비정상적인 프리온 단백질을검출한다(Korth et al., Nature 390 : 74, 1997). 그 결과, 비정상적인 프리온 단백질은 강한 계면활성제들 또는 변성물들로 해집(deaggregate)되어야 하며, 계속해서 이들 변성물들은 대부분의 면역분석을 수행하기 전에 제거되어야 한다. 따라서, 당해 기술분야에서는 면역분석을 위하여는 계면활성제들 또는 변성물들 없이 프리온 단백질을 추출하는 신속하고, 간단한 방법이 요구되고 있다.
본 발명은 응집된 또는 단량체성의 형태를 불문하고 모든 크기의 비정상적인 프리온 단백질을 추출하는 새로운 방법을 제공한다. 본 발명은 살아있는 동물로부터 수득한 시료들 내의 비정상적인 프리온 단백질에 대하여 예를 들면 면역분석과 같은 시험을 가능하게 한다. 예를 들면, 혈액 시료들에 기초한 진단이 가능하도록 하고, 이는 살아있는 동물들의 시험을 가능하게 하고, 감염된 동물들을 그 무리로부터 제거하는 것을 용이하게 하며, 또한 소비재의 가능한 오염을 제거한다.
본 발명은 비정상적인 프리온 단백질을 포함하는 것으로 의심되는 생물학적 물질로부터 비정상적인 프리온 단백질을 추출하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 생물학적 물질의 등장 또는 저장의 수성 제제와 추출용매의 혼합물을 상기 생물학적 물질로부터 상기 추출용매 내로 비정상적인 프리온 단백질이 추출되기에 유효한 조건 하에서 배양시키는 것을 포함한다. 상기 추출용매는 비정상적인 프리온 단백질이 그에 용해될 수 있는 극성 유기용매이며, 이는 저장 또는 등장의 수성 용액과는 혼화될 수 있으나, 유방향성(lyotropic) 수성 용액과는 혼화될 수 없는 것이다. 상기 혼합물의 유방향성 활성은 증가되어 추출용매가 구분된 상으로 상기 생물학적물질의 상기 수성 제제로부터 분리되도록 하여 상기 생물학적 물질로부터 어떠한 비정상적인 프리온 단백질도 포함하는 추출용매를 수득할 수 있다.
본 발명은 또한 비정상적인 프리온 단백질에 대해 상기한 바와 같이 제조되어진, 분리된 추출용매를 분석하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 동물에서의 비정상적인 프리온 단백질의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 생물학적 시료로부터 비정상적인 프리온 단백질을 분리하는 키트(kit)를 제공한다. 상기 키트는 앞서 특정한 추출용매 및 생물학적 시료의 수성 제제에 첨가되어 상기 유기용매가 상기 수성 제제와 혼화되지 않도록 하는 유방향성 염 또는 수성 유방향성 염 용액을 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서는, 상기 키트는 프리온 단백질 분석(assay), 바람직하게는 비정상적인 프리온 단백질에 대한 분석을 포함한다.
따라서, 본 발명의 하나의 목적은 생물학적 시료로부터 비정상적인 프리온 단백질을 분리하는 신속한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 비정상적인 프리온 단백질로 감염된 유기체들에 대한 조기 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 생물학적 시료로부터 비정상적인 프리온 단백질을 분리하는 용매 추출 기술을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 비정상적인 프리온 단백질의 존재에 대한 동물 또는 인간으로부터의 생물학적 물질의 분석적 시험을 단순화하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 후속의 시험 또는 정제를 위한 비정상적인 프리온단백질을 포함하는 추출물을 제공하는 것이다.
본 발명의 이들 및 다른 목적들은 본 발명의 첨부된 도면들 및 상세한 설명에서 보다 상세하게 나타날 것이다.
본 발명은 예를 들면 동물 조직들 또는 생물학적 액체 등과 같은 생물학적 물질로부터 프리온 단백질을 추출하는 방법에 관한 것이다. 상기 추출방법은 비정상적인 프리온 단백질의 존재에 대하여, 예를 들면 전이성의 스폰지형 뇌질환(TSE)의 진단 등에 대하여 시험될 수 있다.
도 1은 방사성에 의하여 검출된 것(원) 및 280㎚에서의 흡수로 검출된 것(실선)으로서의125I-프리온 단백질의 HILIC의 크로마토그램이다.
도 2는125I-프리온 단백질의 HILIC 분획들의 항체 결합을 나타내는 도면이다.
본 발명은 생물학적 물질로부터 비정상적인 프리온 단백질을 추출하는 방법을 제공한다. 상기 추출된 생성물은 상기 비정상적인 프리온 단백질에 대한 면역분석에 의해 시험될 수 있다. 이 비정상적인 프리온 단백질의 추출은 면역분석과 함께 살아있는 유기체들의 TSE의 감염에 대해 진단하는 데 사용될 수 있으며, TSE로 감염된 동물들 및 인간들을 시험하기 위한 광범위한 사용을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명은 고가의 원심분리기들이 부족한 진단실 및 수의사의 실험실들에서 프리온 단백질에 대한 시험을 유리하게 가능하게 하며, 또한 당해 기술분야에서 그 이상의 시험을 가능하게 한다.
생물학적 물질의 수성 제제는 상기 추출용매와 결합되어 혼합물을 형성한다. 상기 추출용매는 비정상적인 프리온 단백질이 그에 용해될 수 있는 극성 유기용매이며, 비-유방향성, 등장의 수성 용액과는 혼화될 수 있으나, 유방향성 수성 용액과는 혼화되지 않는 것이다. 특정의 바람직한 구체예로서, 상기 추출용매는 헥사플루오로-2-프로판올(헥사플루오로이소프로판올 또는 HFIP라고도 함)이다. 이하의 실시예들에서 비록 추출 완충제와 생물학적 물질의 수성 제제의 용적들이 대략 균등량이기는 하나, 이하에서 기술하는 바와 같이 2개의 구분된 상들을 얻을 수 있는 어떠한 비율도 사용될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 상기 혼합물은 20 내지 100℃의 범위의 온도에서 배양된다. 그럼에도 불구하고, 상기 추출용매 및 생물학적 물질의 수성 제제들 모두가 액체상태로 존재하는 즉, 어는점과 끓는점 사이의 어떠한 온도도 사용될 수 있다.
상기 추출용매-생물학적 물질 혼합물은 상기 생물학적 물질로부터 상기 추출용매 내로 비정상적인 프리온 단백질이 추출되기에 유효한 조건 하에서 배양된다. 배양 후, 상기 혼합물의 유방향성 활성을 증가시켜 상기 추출용매가 상기 수성 제제로부터 분리되도록 한다. 프리온 단백질을 포함하는 상기 추출용매는 상기 생물학적 물질의 수성 제제로부터 제거된다.
본 발명에 따르면, 상기 추출용매-수성 제제의 유방향성 활성은 유방향성 염의 첨가에 의하여 증가될 수 있다. 상기 염은 고체로서 또는 농축된 수성 용액으로서 직접 상기 혼합물에 첨가될 수 있다. 유방향성 염들의 바람직한 예들에는 황산나트륨(sodium sulfate) 및 황산암모늄(ammonium sulfate)들이 포함된다. 이하에서 구체화된 바와 같은 특정의 구체예에 있어서, 이온세기는 0.5M 황산나트륨을 상기 혼합물에 대략 1 : 1(용적/용적) 비율로 첨가하는 것에 의하여 증가된다.
본 발명은 물질을 사체에서 수득할 필요가 없기 때문에 특히 유리하다. 본 발명에 따르면, 상기 생물학적 물질은 살아있는 동물로부터 시료를 얻을 수 있다. 본 발명의 방법은 분석적 시험을 위하여 생물학적 액체들 또는 장기 조직으로부터 수득된 것이 될 수 있다. 달리, 상기 생물학적 물질은 예를 들면, 음식, 약품, 화장품 등으로 사용될 동물 생산품들 또는 인간이나 다른 동물들이 사용하기 위한 다른 제품들과 같은 사체에서 얻을 수 있다. 달리, 본 발명의 방법은 이러한 물질들로부터 프리온 단백질을 제거하여 감염성의 프리온들이 전염되지 않도록 하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 추출방법은 정상적인 프리온 단백질 및 비정상적인 프리온 단백질 모두를 추출하는 데 사용될 수 있다. 상기 생물학적 물질을 프로테나아제-케이(proteinase-K)로 전처리하는 것에 의하여, 상기 정상적인 프리온 단백질을 소화시킬 수 있다. 따라서, 단지 비정상적인 프리온 단백질 만이 요구되는 경우에, 상기 생물학적 물질의 수성 제제는 이를 상기 추출용매와 혼합하기 전에 프로테나아제-케이로 전처리될 수 있다.
어떠한 프리온 단백질도 포함하는 상기 추출용매도 건조되어 추출용제 펠릿을 수득할 수 있다. 용액 중 또는 추출용제 펠릿 중의 프리온 단백질은 예를 들면 친수성 상호작용 크로마토그래피 등에 의하여 더욱 정제될 수 있다.
동물 내의 비정상적인 프리온 단백질은 그 존재에 대한 분리된 추출용제 펠릿 중의 물질의 분석에 의하여 검출될 수 있다. 바람직하게, 상기 분석방법은 비정상적인 프리온 단백질에 대한 면역분석이다. 상기 시료는 상기 프리온 단백질의분리에 앞서 프로테나아제-케이로 처리되어 정상적인 프리온 단백질이 분리되지 않도록 할 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 생물학적 시료로부터 비정상적인 프리온 단백질을 분리하기 위한 키트를 제공한다. 하나의 구체예에 있어서, 키트는 예를 들면 헥사플루오로-2-프로판올과 같은 추출용매를 포함한다. 상기 키트는 생물학적 시료의 수성 제제에 첨가되어 상기 추출용매가 상기 수성 제제와 혼화되지 않도록 하는 유방향성 염 또는 수성 유방향성 염 수용액을 더 포함한다.
본 발명은 또한 생물학적 시료로부터 비정상적인 프리온 단백질의 존재를 검출할 수 있는 키트를 제공한다. 앞서 설명한 키트 성분들에 더해, 상기 검출 키트는 비정상적인 프리온 단백질에 대한 검출 분석을 포함한다. 비정상적인 프리온 단백질의 존재에 대한 바람직한 검출 분석은 면역분석이다.
이 추출방법 및 키트가 일차적으로는 전이성의 스폰지형 뇌질환인 진전병(양에서의 TSE)의 진단용으로 개발되었기는 하나, 이들은 다른 가축들, 바람직하게는 인간, 소과의 동물, 돼지, 고라니, 사슴, 가금류 및 설치류 등과 같은 포유동물 및 조류들에서의 다른 TSE들의 진단에 유용하다. 비정상적인 프리온 단백질은 감염 후 빠르면 2주 만에 동물들 및 인간들의 조직에서 검출될 수 있다. 본 발명의 방법의 특정의 응용은 인간 혈액 중의 비정상적인 프리온 단백질의 검출이다. 이 기술은 또한 음식물을 포함하여 인간의 약제들 또는 인간이 사용하기 위한 다른 생산품들로 사용된 가공물질로부터 비정상적인 프리온 단백질을 검출하는 데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바에서, '대략' 또는 '대개'라는 용어는 주어진 값 또는 영역의 20% 이내, 바람직하게는 10% 이내, 더욱 바람직하게는 5% 이내를 의미한다.
생물학적 물질들
본 발명은 생물학적 물질로부터의 프리온 단백질의 검출을 가능하게 한다. 일반적으로, 프리온 단백질들은 앞서 언급한 바와 같이 가축류에서 발견된다. 따라서, 대부분의 환경들 하에서, 상기 생물학적 물질은 동물 또는 인간으로부터 얻어지는 것이 될 것이다. 프리온 단백질은 또한 진핵세포들에 대한 발효공정들에서 생성될 수 있다. 이는 재조합 프리온 단백질로 표현될 수 있다. 가장 관심의 대상이 되는 것은, 다른 단백질로 발현하도록 재조합적으로 변형된 세포들에 의한 내생적 프리온 단백질의 우연한 발현의 가능성이다. 이러한 가능성은 상기 세포들이 PC12 세포들과 같은 신경 유래의 세포들이라는 가정에서 더욱 그러하다. 이러한 경우에, 상기 생물학적 물질은 예를 들면 재조합 단백질과 같은 발효 산물이 될 수 있다.
동물로부터의 생물학적 물질들의 예들에는 뇌, 근육(심장 포함), 간, 맹장, 췌장, 위장 등의 소화기관, 피부 등과 같은 조직들 및 흉선, 비장, 편도선, 림프절 등과 같은 림프성 조직 등이 포함되나 이들에 제한되는 것은 아니다. 달리, 상기 생물학적 물질은 생물학적 액체가 될 수 있다. 생물학적 액체라는 용어는 뇌척수액, 혈액, 혈청, 혈장, 우유, 소변, 타액, 눈물, 점액 분비물, 땀, 정액 및 이들 성분들을 포함하는 체액들을 의미한다. 이는 또한 재조합 단백질들의 제조에 사용되었거나 또는 이식에 앞서 현탁상태로 세포들을 포함하는 배양액(또는 배양배지)를 의미한다. 또한, 용어 '생물학적 물질들'에는 혈청 단백질들(알부민 및 면역글로블린과 같은), 호르몬, 음식 및 가공된 음식 제품들, 영양보충물, 뼈가루, 동물사료, 세포의 기질 단백질, 젤라틴 및 음식 제조과정 및 최종 음식제품에 사용된 다른 동물 부산물들을 포함하여 동물 기관들 또는 조직들로부터 제조된 제품들이다.
상기 생물학적 물질이 고체 조직 또는 제품들인 경우, 우선 이를 수성 용액 중에 용해시키거나 또는 분산시켜 추출공정에 적합하게 되도록 하여야 한다. 예를 들면, 뇌조직은 슈크로스용액(예를 들면 0.32M 슈크로스) 중에 10용적%로 현탁될 수 있다. 다른 저장 또는 등장의 용액들은 5% 덱스트로스, 인산 완충 염수, 트리tm-완충 염수, HEPES-완충 염수 또는 앞서의 어떠한 완충제들도 포함된다. 상기 수성 용액 중의 생물학적 물질은 또한 균질화, 마쇄 또는 달리 분쇄되어 상기 추출용매와 상기 생물학적 물질 사이에서의 접촉을 극대화시킬 수 있다. 그러나, 생물학적 액체가 상기 생물학적 물질인 경우, 상기 추출용매가 혼화되도록 하기 위하여 상기 생물학적 액체의 이온강도를 희석시키는 것이 아닌 한 액체의 첨가는 필요치 않을 것이다.
프리온 단백질
본 명세서에서 사용된 '프리온 단백질'이란 용어는 신경 조직, 특히 뇌 및 림프성 조질들 및 모든 다른 조직들에서 보다 낮은 수준으로 발현되는 천연의 단백질을 의미한다. 몇몇 환경 하에서, 프리온 단백질은 병원성 구조를 수용하며, 이를 본 명세서에서는 비정상적인 프리온 단백질이라 칭한다. 일부 개체들에서의 상기 프리온 유전자의 특정의 변이들은 상기 병원성 구조를 수용하는 경향을 갖는 프리온 단백질로 나타난다. 전이될 수 있는 감염성의 인자인 상기 프리온에의 어떠한 유기체의 노출은 또한 발병으로 유도하는 형태학적 변화를 유발한다.
비정상적인 프리온 단백질은 정상적인 프리온 단백질 보다 단백질 가수분해에 덜 영향을 받는다. 생물학적 물질이 프로테나아제, 특히 프로테나아제-케이로의 처리로 정상적인 프리온 단백질은 소화되나, 비정상적인 프리온 단백질은 소화되지 않는다.
이하에서의 특정의 실시예들에서, 본 발명의 방법에 의하여 양의 비정상적인 프리온 단백질(PrPsc)이 추출되었다. 그러나, 다른 종들로부터의 다른 프리온 단백질들, 특히 앞서 언급한 것들이 또한 본 발명의 방법을 사용하여 추출될 수 있다.
비정상적인 프리온 단백질의 범주에는 퇴행성 신경성 질병인 구루병(Kuru), 크로이펠츠-야곱병(CJD), 게르스트만-스트라우슬러 증후군(GSS) 및 치명적인 가족성 불면증들에서 발견되는 인간 프리온 단백질들이 포함된다. CJD 및 GSS의 일부의 경우는 상기 프리온 유전자의 공지의 돌연변이들과 관련이 있다. CJD는 또한 TSE들에의 노출과 관련되어 있다. 앞서 언급한 바와 같이, 예를 들면 CJD는 소의 스폰지형 뇌질환과 관련이 있다. 본 발명은 처음으로 사체 부검에 앞서 환자에서의 비정상적인 프리온 단백질을 추출하는 것을 가능하게 한다. 추출된 비정상적인 프리온 단백질의 검출은 이들의 어떠한 질병들을 진단하는 데에도 사용될 수 있다.
진전병(양, 염소의) 및 소의 스폰지형 뇌질환(소의)은 동물들의 비정상적인 프리온 질병들이다. 프리온 단백질들은 또한 닭, 밍크, 돼지, 쥐, 햄스터 및 기니피그들에서도 분리된다. 더욱이, 쥐, 햄스터 및 기니피그는 인간 또는 다른 동물원들로부터의 프리온들에의 노출에 의하여 스폰지형 뇌질환으로 발전될 수 있다. 이들 근원들의 어떠한 것으로부터의 프리온 단백질도 본 발명의 방법에 의하여 검출되거나 또는 추출될 수 있다.
추출용매 및 조건들
본 발명에서 사용하기 위한 추출용매는 유방향성 조건들 하에서 물 또는 수성 용액으로부터 구분된 상으로서 분리될 수 있어야 한다. 동시에, 프리온 단백질은 상기 추출용매 중에 용해되어야 한다. 몇몇 극성 유기용매들이 이들 조건들에 부합된다. 바람직한 극성 유기용매는 헥사플루오로-2-프로판올이다. 사용될 수 있는 다른 용매들에는 이소프로판올; 1,1,1-트리플루오로-2-프로판올(TFIP); 2,2,3,3-테트라플루오로-1-프로판올(tetF1P); 과플루오로-t-부틸알코올(PFtBA); 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로아세톤(HFA); 트리플루오로아세트산(TFA); 2,2,2-트리플루오로-1-에탄올(TFE); 2,2,3,3,4,4,4-헵타플루오로-2-프로판올(HFB); 1,1,1,3,3,4,4,4-옥타플루오로-2-부탄올(OFIB); 1-메틸-2-피롤리디논(NMP)들이 포함된다(Wille et al., J. Mol. Biol., 259 : 608, 1996을 참조). 평가할 만한 다른 가능한 용매들에는 DMSO; 테트라히드로푸란 등이 포함된다. 달리, 물과는 혼화되지 않으나, 그에 프리온 단백질이 용해될 수 있는 용매가 사용될 수 있다.
특정의 구체예에 있어서, 상기 용매는 예를 들면 생리학적 이온강도(등장의수성 용액) 또는 생리학적 이온강도 이하(저장의 수성 용액)에서 물과 혼화된다. 그러나, 상기 완충제가 문턱값 이상의 농도(또는 이온강도)로 존재하는 유방향성 염들을 포함하는 경우, 상기 추출용매는 상기 수성 용액 중에 존재하지 않으며, 상기 2 상들은 추출용매층과 수성 용액층으로 분리된다. 이러한 상태를 본 명세서에서는 '유방향성 조건들'이라 언급한다. 유방향성 조건들을 달성하기 위한 상기 수성 용액의 유방향성 염의 이온강도에 대한 값은 선택된 추출용매 및 사용된 염들에 따라 변할 수 있다. 이는 상기 추출용매와 상기 수성 용액의 혼화성 또는 불혼화성에 대하여 시험하는 것으로서, 적정 또는 유방향성 염의 농도의 계통적 변화에 의하여 쉽게 결정될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 상기 추출용매가 물로부터 분리되는 유방향성 염의 이온강도를 갖는 수성 용액을 유방향성 수성 용액이라 칭한다. 등장의 완충제와 같은 낮은 농도의 유방향성 염들 또는 생리학적 염들을 포함하는 수성 용액은 비-유방향성 용액으로 고려된다.
일반적으로, 대략 등량의 추출용매와 생물학적 물질의 상기 수성 제제가 용매 추출공정에서 사용되었다. 그러나, 수성 제제에 대한 추출용매의 상기 비율은 5 : 1 내지 1 : 5, 바람직하게는 3 : 1 내지 1 : 3의 범위로 변할 수 있다.
상기 추출용매를 상기 수성 제제와 혼합한 후, 프리온 단백질의 상기 추출 완충제 내로의 추출을 증진시키기 위해 상기 혼합물을 일정 시간 동안 특정의 온도에서 배양시킬 수 있다. 상기 배양시간은 1분 내지 수 시간의 범위에서 변할 수 있으며, 프리온 단백질의 존재에 대하여 추출된 물질을 분석하는 것에 의하여 결정될 수 있다. 크로마토그래피나 면역분석 기술 또는 이들 두 가지 모두를 사용하여측정될 수 있는, 시간 대비 상기 추출 물질 중에서의 프리온 단백질의 양이 정체기에 도달한 후에는, 그 이상의 배양이 상기 프리온 단백질 수율에 영향을 주지 않을 것이다. 특정의 구체예에서, 상기 배양시간은 5분이다.
게다가, 상기 추출용매와 수성 용액들이 선택된 온도에서 모두 액체로 주어진다면, 추출의 효율을 증가시키기 위하여 배양의 온도가 조절될 수 있다. 보다 따뜻한 온도, 즉 실온 이상의 온도가 추출용매 중의 프리온 단백질의 용해도를 증가시키기 때문에 바람직하다. 50 내지 60℃의 범위의 온도가 특히 유용하다. 상기 수성 제제의 이온강도 및 배양의 시간 등과 같은 다른 변수들과 함께, 적정의 온도가 일률적인 실험 및 시험에 의하여 결정될 수 있다.
상분리
상기 수성 용액의 이온강도를 증가시키고, 그에 의하여 상분리가 일어나도록 하기 위하여 유방향성 염들이 사용될 수 있다. 바람직한 염들 중에는 유방향성인 황산나트륨 및 황산암모늄이 있다. 두 가지 모두 단백질들을 침전시키는 농도 이하의 농도에서 사용되었다. 예를 들면, 특정의 구체예에 있어서, 황산나트륨의 0.5M 용액이 등량의 추출용매/수성 제제 혼합물에 첨가되어 0.25M 황산나트륨의 최종 농도가 된다. 이 농도는 HFIP 및 물의 상분리를 일으키는 데 충분하다. 다른 염들 또한 이들이 용해될 수 있는 농도에서 요구되는 유방향성 활성을 달성할 수 있다면 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 '유방향성 활성'이라는 용어는 유방향성 염 용액의 구조-형성 특성들을 의미한다. 상기 유기상 및 수성상들의 상분리를 유도하기 위해서는 상기 유방향성 활성은 충분한 농도의 유방향성 염에 의하여 달성된다. 상기 유방향성 염의 단백질 침전 농도는 회피된다.
또한, 코스모트로프(kosmotropes)로도 알려진, '유방향성' 또는 '구조-형성'염들은 수성 용액의 정렬화와 그에 의한 유기 용질들의 방출을 증진시킨다. 만일 상기 유기 용질이 상기 추출용매라면, 상분리가 일어난다. 만일 이것이 단백질이라면, 상기 단백질은 용액 중에서 염석된다. 좋은 구조-형성염들에는 황산나트륨, 황산암모늄, 인산염, 시트르산염 등이 포함된다(Washabaugh and Collins, J. Biol. Chem., 261 : 12477, 1986). (구조-파괴염들 또는 카오트로프(chaotropes)들에는 구아니딘 염산염(guanidinium hydrochlorides), 과염소산 나트륨(sodium perchlorate), 브롬화 나트륨(sodium bromide) 등이 포함된다. 이들은 부의 효과를 갖는다; 이들은 유기 용질들을 수성 용액으로 이동시킨다.) 수성 용액의 이온강도는 이들이 구조-형성 또는 구조-파괴 이온들인지의 여부에 관계없이 용액 중의 이온의 총수의 함수이다. '이온강도'라는 용어는 염의 농도에 관계된 것이다.
앞서 언급한 바와 같이, 최종의 유방향성 염 농도가 상기 상분리를 유도하기에 유효한 한, 상기 유방향성 염은 고체 또는 농축된 액체로서 첨가될 수 있다. 수성상에 대한 추출용매의 보다 낮은 농도에서, 최종 염 농도가 상분리를 유도하기에 여전히 충분히 높다면, 상기 혼합물(이는 생물학적 물질의 수성 제제 및 다른 염 용액을 포함한다)의 유방향성 활성이 증가한 후, 수성상에 대한 추출용매의 최종 비율은 바람직하게는 1 : 10 내지 10 : 1, 보다 바람직하게는(또한 이하에서 예시된 바와 같이) 1 : 3 내지 3 : 1이다.
유방향성 활성을 증가시킨 후, 이제는 생물학적 물질 중에 존재하는 어떠한프리온 단백질들도 포함하는 상기 추출용매는 상기 수성 제제로부터 분리된다. 상기 분리공정은 수분이 걸리며, 2 상들이 그들 사이에 분명하고 그리고 구분된 분리가 관찰되면 종료된다. 일단 2 상들이 완전히 분리되면, 이제 어떠한 프리온 단백질들도 포함되는 상기 추출용매는 예를 들면 피펫 또는 주사기로 또는 분액플라스크로 인출하는 것에 의하여 제거되거나 또는 회수될 수 있다.
어떠한 프리온 단백질들도 포함되는 상기 추출용매(여기에서는 '추출물'로 정의된)는 예를 들면 증발에 의하여, 동결건조(lyophilization)에 의하여 또는 진공원심분리에 의하여 건조되어 고도로 농축된 또는 건조된 추출물을 수득할 수 있다. 상기 추출물은 세포성 지질들, 지질 막-결합 단백질들 및 다른 보다 소수성인 세포성 성분들을 포함하여 다른 성분들을 포함할 수 있다. 필요하다면, 예를 들면 이하에서 예시화한 친수성 상호작용 크로마토그래피, 또는 다른 크로마토그래피 기술들(예를 들면 항체 컬럼에 대한 양이온 교환 크로마토그래피, 겔투과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피)에 의해 이들 성분들로부터 프리온 단백질을 단리하거나 또는 정제해낼 수 있다.
달리, 상기 농축된 또는 건조된 추출물질은 이하에서 기술하는 바와 같이 비정상적인 프리온 단백질을 검출하기 위하여 직접적으로 분석될 수 있다.
프리온 단백질 검출기 ; 면역분석
비정상적인 프리온 단백질을 선택적으로 검출하는 분석을 포함하여 여러 프리온 단백질 검출 분석들이 당해 기술분야에서 프리온 단백질을 분석하는 데 유용한 도구가 될 것으로 알려져 있다. 모세관 겔 전기영동이 비정상적인 프리온 단백질에 대한 유효한 분석적 도구가 되는 것으로 입증되었다(Schmerr and Jenny, Electrophoresis, 19 : 409, 1998). 바람직한 방법은 예를 들면 앞서의 Schmerr and Jenny에서 기술된 면역분석이다. 이 참조문헌에서 기술된 항혈청은 이것이 웨스턴 블럿 분석에서 정상적인 뇌가 아닌 진전병으로 감염된 뇌와 반응하는 것으로 알려져 있듯이 비정상적인 프리온 단백질에 대해 특이적이다. 프리온 단백질과 반응성인 다른 항혈청들도 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다. 바람직한 면역분석은 플레이트 ELISA이다(예를 들면, Grathwohl et al., J. Virol. Methods, 64 : 205, 1997).
따라서, 몇몇 경우에서는, 프리온 단백질, 특히 비정상적인 단백질의 존재의 검출은 프리온 단백질의 생물 물리학적 특성들 및 화학적 특성들에 기초한다. 이들에는 프로테나아제(특히 프로테나아제-케이) 저항성 및 소화 프로파일(단백질 가수분해 효소, 당분해 효소, 화학약품들, 열, 변성체들 등과 함께)이 포함된다. 외견상의 분자량 및 등전위점에 대한 이러한 처리들의 효과 및 여러 결합 분석들이 평가될 수 있다. 프로테나아제 저항성 및 소화 프로파일은 크로마토그래피, 겔 전기영동 및 다른 분자량-감응성 기술들에 의하여 검출될 수 있다. 모세관 등전위 집중이 대부분의 겔들 보다 프리온 pI를 측정하는 데 3배나 더 효과적이기는 하나, 모세관 등전위 집중(IEF) 또는 겔 등전위 집중 등을 사용하여 등전위점을 측정할 수 있다. 더욱이, 전체 하전의 정량적인 결정(산도 또는 염기도)은 이온교환 크로마토그래피에 의하여 결정될 수 있다. 당해 기술분야에서 알려진 다른 생물 물리학적 기술들이 또한 프리온 단백질을 확인하는 데 사용될 수 있다.
프리온 단백질의 검출에 대한 분석들의 예들에는 가열 후, 브롬화 시아노겐 절단, 뉴러미니다아제(neuraminidase) 처리 등(Bolton et al., J. Virol., 53 : 596, 1985); 글리코시다아제 처리 및 렉틴 결합(Somerville and Ritchie, J. Gen. Virol., 71 : 883, 1990); 프로테나아제-케이 저항성(Race et al., Am. J. Vet. Res., 53 : 883, 1992); 및 면역분석(Farquhar et al., J. Virol. Methods, 24 : 215, 1989)을 포함하여 단백질의 외견상의 분자량 및 등전위점을 포함한다.
달리, 추출된 그리고 바람직하게는 정제된 프리온 단백질의 시퀀싱 또는 마이크로시퀀싱이 그 동정을 명백하게 확인할 수 있도록 해 준다.
프리온 단백질에 대한 면역분석은 당해 기술분야에서 알려진 기술들, 예를 들면 적절한 생리학적 시료들 등 중에서 그 수준을 측정하는 면역분석(immunoassay)(예를 들면, 콜로이드성 금(colloidal gold), 효소 또는 방사성 동위원소 표지 등을 사용하는), 웨스턴 블럿 분석(western blots), 침전반응들, 응집화 분석(agglutination assays)(예를 들면 겔 응집 분석(gel agglutination assays), 적혈구응집 분석들(hemagglutination assays)), 보족 고정화 분석(complement fixation assays), 면역형광 분석(immunofluorescence assays), 단백질 A 및 단백질 G 분석들, 면역전기영동 분석(immunoelectrophoresis assays)들과 함께, 방사성 면역분석(radioimmunoassay), ELISA(효소-결합 immunosorbant 분석), "샌드위치" 면역분석('sandwich' immunoassays), 면역방사관측 분석(immunoradiometric assay), 겔 확산 침전 반응(gel diffusion precipitation reactions), 면역확산 분석(immunodiffusion assays)들에 의하여 수행될 수 있다. 하나의 구체예에 있어서, 1차 항체에 대한 표지의 검출에 의하여 항체 결합이 검출되었다. 다른 구체예에서는, 1차 항체에의 2차 항체 또는 시약의 결합을 검출하는 것에 의하여 1차 항체가 검출되었다.
본 발명의 추출방법은 프리온 단백질의 저렴한 공급원을 제공하는 것이며, 이는 부가의 항체들을 생성하는데 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 추출조건이 통상의 추출조건들과 크게 다르기 때문에, 본 발명에 따라 추출된 프리온 단백질은 다른 배좌(conformation)을 가질 수 있으며, 면역조치에 사용된다면 다른 항체의 분포를 유도할 수 있다.
이 방법은 추출시간을 1 내지 2시간으로 단축시킨다. 더욱이, 그 단순성 때문에, 자동화가 가능하다. 이 방법은 모든 분자성 크기의 프리온 단백질들을 추출하며, 따라서 제한되지 않는다. 이 방법은 또한 비정상적인 프리온 단백질을 용해시키며, 따라서 대부분의 면역분석들에서 이를 검출하는 데 사용될 수 있다. 더욱이, 의미있을 정도로 상기 비정상적인 프리온 단백질의 감염성을 감소시켜 공정을 보다 안전하게 만든다.
키트
본 발명을 실현하기 위한 성분들은 통상적으로 키트 형태로 제공될 수 있다. 그 간단한 구체예에 있어서, 본 발명의 키트는 추출용매, 바람직하게는 HFIP 및 상기 추출용매-수성 제제 혼합물의 유방향성 활성을 증가시키기 위한 유방향성 염(또는 농축된 유방향성 염 용액)을 제공한다. 각 성분의 양들은 특정된 횟수의 분석을 위하여 사전-측정될 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 상기 키트는 시료 용기,바람직하게는 플라스틱 또는 프리온 단백질의 비-특이성 결합을 피하기 위하여 처리된 물질로 시료 용기를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용기라는 용어는 그 광범위한 의미 즉, 물질 또는 시약을 수용하기 위한 어떠한 저장소라는 의미를 갖는다. 이는 시약들을 저장하기 위하여 통상적으로 사용되는 유리, 플라스틱, 세라믹, 금속 또는 다른 어떠한 물질들로도 제조될 수 있다. 그러나, 수용가능한 물질은 저장하기 위한 내용물과 반응하지 않는 것이 될 것이다.
상기 키트는 또한 생물학적 시료 중의 정상적인 프리온 단백질을 소화시키기 위한 프로테나아제-케이를 포함할 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 키트는 상기 생물학적 시료의 수성 제제에 대한 용적 표시기를 갖는 시료 용기를 포함한다. 이 구체예에 있어서, 상기 극성 유기용매 및 상기 유방향성 염들은 상기 시료 용기와 연계하여 사용하기 위한 사전-측정된 단위들로 적절하게 제공된다. 상기 생물학적 시료 제제는 상기 시료 용기 내에 저장될 수 있다. 상기 사전-측정된 단위의 추출용매가 첨가되고, 계속해서 혼합될 수 있다. 계속해서, 상기 사전-측정된 단위의 유방향성 염이 첨가되어 상기 추출용매 및물의 상분리를 유도한다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 생물학적 시료의 상기 수성 제제를 처리하기 위한 프로테나아제-케이가 바람직하게는 사전-측정된 단위로 키트 중에 제공된다.
조직 시료로부터 프리온 단백질을 추출하기 위한 키트는 0.32M 슈크로스 용액 또는 인산염 완충 염수 등과 같이 상기 생물학적 물질의 상기 수성 제제에 대하여 조직의 균질화를 위한 희석 완충제를 포함할 수 있다.
상기 키트가 생물학적 물질 또는 시료 중의 비정상적인 프리온 단백질의 존재를 검출하기 위한 키트의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 키트는 앞서 언급한 바와 같이 비정상적인 프리온 단백질 검출기 또는 분석기를 제공한다. 앞서 언급한 바와 같이, 면역분석이 본 발명에 따라 추출된 비정상적인 프리온의 검출에 바람직하다.
또 다른 구체예에 있어서, 상기 키트는 면역크로마토그래피 막 또는 지지체를 포함한다. 어떠한 프리온 단백질도 포함하는 상기 추출용매는 상기 지지체에 직접 적용되거나 또는 재용해화 후에 건조된 추출물이 적용될 수 있다. 적절한 조건들 하에서, 프리온 단백질은 상기 지지체를 통하여 흐를 수 있다. 이는 예를 들면 항-프리온 항체의 부동화 또는 검출된 프리온 단백질의 부동화에 의하여 포획될 수 있다. 면역크로마토그래피 분석들에 대하여 당해 기술분야에서 알려진 여러 방법들 및 기구들이 본 발명에서 적용될 수 있다. 실험실적 장치들을 구할 수 없는 현장 조건들 하에서는 면역크로마토그래피 분석들이 특히 유용하다. 이러한 분석들의 예들이 미합중국 특허 제5,248,619호, 제5,451,504호, 제5,500,375호, 제5,624,809호 및 제5,658,801호 등에서 제공된다.
본 발명의 키트는 바람직하게는 포장 및 예를 들면, 포장 상에 또는 포장 내용물로서 그 사용을 위한 설명서들을 포함한다.
본 발명의 이하의 비-제한적인 실시예들을 참조하여 보다 잘 이해될 수 있으며, 이들 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것으로 제공된 것이다.
실시예 1
감염된 양의 뇌 및 림프절로부터 추출된 비정상적인 프리온 단백질의 분석
2마리의 진전병으로 감염된 양들 각각으로부터 수득한 뇌 및 림프절을 10% 사르코실(sarcosyl) 중에서 균질화시키고, 정상적인 주 프리온 단백질은 소화시키나 프리온 단백질의 변형된 비정상적인 형태는 소화시키지 않는 프로테나아제-케이로 처리하였다. 균질물과 HFIP의 등량(0.5mM)을 혼합하고, 56℃에서 5분 동안 배양시켰다. 이 혼합물에, 0.5M 황산나트륨(Na2SO4) 0.5mM을 첨가하고, 그 혼합물을 다시 5분간 더 배양시켰다. 이들 조건들 하에서, 상기 HFIP층이 상기 수성층으로부터 분리되었다. 상기 HFIP층을 회수하고, 원심분리기 내에서 건조시켰다. 상기 건조된 시료들을 증류수 25㎕ 중에서 재현탁시키고, 혼합시켰다. 상기 시료의 10㎕를 20% SDS 완충제 5㎕와 혼합시키고, 100℃에서 5분간 끓였다.
10%에서 15%까지의 구배의 폴리아크릴아미드 겔 상에서 웨스턴 블럿 분석이 수행되었다. 상기 단백질은 표준 조건 하에서 상기 폴리아크릴아미드겔로부터 니트로셀룰로오스로 전이되었다. 상기 니트로셀룰로오스는 5% 물고기 젤라틴과 함께 배양시켜 밀폐되었고, 트리스-트윈 완충제(Tris-Tween buffer)로 세척되었다. 상기 니트로셀룰로오스는 토끼의 항-프리온 단백질(1 내지 2,500배로 희석된 모든 프리온 단백질에 대해 제기된 항원; Kascak et al., Immunol. Invest., 26 : 259, 1997; Miller et al., J. Vet. Diagn. Invest. 5 : 309; Kascak et al., J. Virol., 59 : 676, 1986을 또한 참조)과 함께 하룻밤 동안 배양시켰다. 항-프리온항원과의 배양 후, 상기 니트로셀룰로오스는 트리스-트윈으로 세척되고, 계속해서 항-토끼IgG-HRP(양고추냉이 퍼옥시다아제) 결합물과 반응시키고 한 시간 동안 배양시켰다. 계속해서 상기 니트로셀룰로오스는 충분히 과도하게 세척하고, 화학발광시약(Pierce UltraSuperSignal; 등록상표명)으로 전개시켰다. 퍼옥시다아제 활성은 화학발광 현상기(chemiluminescent imager(케미-이메이저-4000(Chemi-Imager-4000); Alpha, Innotech)를 사용하여 검출하였다.
물질 2.75㎕를 포함하는 2마리의 진전병으로 감염된 양들로부터의 추출물들은 뇌조직 및 림프절 조직 모두에 대해 비정상적인 프리온 단백질을 표시하는 띠(bands)들을 생성하였다. 한 마리의 진전병으로 감염된 양으로부터의 물질 1.5㎕를 포함하는 뇌조직 추출물 역시 비정상적인 프리온 단백질을 나타내는 띠를 생성하였다. 정상적인(감염되지 않은) 양으로부터의 유사한 추출물들의 웨스턴 블럿 분석은 비정상적인 프리온 단백질을 나타내는 어떠한 띠들도 생성하지 않았다.
실시예 2
감염된 양의 뇌 및 림프절로부터 추출되고 정제된 비정상적인 프리온 단백질의 분석
이 실시예는 친수성 상호작용 크로마토그래피(HILIC)를 사용하여 비정상적인(진전병의) 프리온 단백질(PrPsc)의 계속되는 정제 및 분석을 보여준다. 양의 뇌 및 림프절들을 포함하는 조직 시료를 앞서 설명한 바와 같이 계면활성제 및 프로테나아제-케이로 처리하였다. 그 결과의 추출물들을 HILIC 컬럼에 적용시키고, 0.1% 트리플루오로아세트산 및 50mM 헥사플루오로-2-프로판올 중의 아세토니트릴의 감소구배로 용리시켰다. 상기 컬럼으로부터의 회수는 방사성으로 표지된 프리온 단백질로 결정된 바와 같이 대략 75%이었다. 건조 후, 상기 수집된 피크 분획들을 물에 재현탁시키고, 그리고 상기 프리온 단백질에 대해 특이적인 항체들로 분석하였다. 간섭하는 계면활성제들이 제거되었기 때문에, 상기 방법은 프리온 단백질의 효율적인 정제 뿐만 아니라 면역분석에 의한 시험을 가능하게 하였다.
실시예 3
감염된 양의 뇌로부터 추출된 비정상적인 프리온 단백질의 분석
양의 뇌 물질의 준비
웨스턴 블럿 분석에 의해 비정상적인 프리온에 대해 양성인 현장 케이스(Race et al., Am. J. Vet. Res. 53 : 883, 1992)로부터 진전병으로 감염된 양의 뇌들을 수득하였다. 3개의 양성의 뇌들의 집단을 만들었다. 여기에서 시행된 모든 실험들에 대하여 동일한 집단이 사용되었다. 진전병에 감염되지 않은 무리의 양으로부터, 웨스턴 블럿 분석에 의해 비정상적인 프리온 단백질에 대해 음성인 정상적인 뇌들을 수득하였다. 상기 뇌 물질들은 Bolton 및 그의 동료들의 방법(J. Virol. 53 : 596, 1985)의 변형에 의하여 크로마토그래피용으로 준비되었다. 간단하게, 상기 뇌간은 절개되어 제거되었고, 평량되고 그리고 0.32M 슈크로스 내(10중량/용적%)에 위치되었다. 계속해서, 상기 물질은 브링크만 폴리트론(Brinkman Polytron; Kinematica AG, Lucerne Switzerland)으로 0.7㎝의 스테인레스강 제너레이터를 사용하여 고속에서 60초 동안 균질화시켰다. 상기 균질화물을 10,000g에서 20분 동안 원심분리시켜 미립자들을 제거하고, 그리고 그 결과의 상청액을 230,000g에서 1시간 동안 원심분리시켰다. 계속해서, 이 펠릿을 일련의 세척 및 앞서의 초원심분리에 적용시켰다. 상기 시료를 10% 소듐 라우릴 설페이트(sodium lauryl sulfate) 및 프로테나아제-케이(50㎍/㎖)를 포함하는 10mM 트리스, pH 7.4로 처리하였다. 최종의 초원심분리 후, 상기 시료를 10mM 트리스 pH 7.4 중에 재현탁시켰다(최초의 뇌 시료의 200㎕/g).
친수성 상호작용 크로마토그래피(HILIC)
상기 시료를 100℃에서 10분 동안 2mM EDTA, 5% SDS 및 10% 헥사플루오로-2-프로판올을 포함하는 0.01M 트리스 염산염, pH 8.00 중에 용해시켰다. SDS 처리 후, 상기 시료를 0.1% TFA산 및 50mM 헥사플루오로-2-프로판올을 포함하는 100% 아세토니트릴로 이루어진 용액(완충제 A) 중에 위치시키고, 친수성 상호작용 컬럼에 적용시켰다. 사용된 모든 컬럼들은 200*4.6㎜; 5㎛; 300Å의 규격을 갖는 것으로서, PolyLC사(Columbia, MD, USA)으로부터 구입한 것이다. 폴리왁스 엘피(PolyWAX LP; 등록상표; 음이온교환 물질), 폴리히드록시에틸 에이(PolyHYDROXYETHYL A; 등록상표; 중성 물질) 및 폴리설포에틸(PolySULFOETHYL; 등록상표; 강한 양이온교환 물질)의 3개의 단위 포장(3개의 등록상표들 모두는 PolyLC사의 재산권들이다)들이 평가되었다. 유속은 0.5㎖/분이다. PrPsc의 용리를 위한 조건들은 최초 8분 동안 100% A로 시작하여 계속해서 15분간 0.1% 트리플루오로아세트산과 50mM 헥사플루오로-2-프로판올을 포함하는 100% 물(완충제 B)로의 선형구배 및 계속해서 10분간 100% B로 하였다. 피크 분획들이 수집되고, 진공 원심분리기(Savant Instruments,Farmingdale, NY, USA) 중에서 건조되었다. 분획들은 10㎕의 탈이온수에 재현탁되고, 그리고 PrPsc에 대한 면역블럿 분석에 의해 양성으로 시험된 상기 분획들이 모세관 전기영동 분석에 사용되었다.
프리온 단백질의 125 I로의 표지
PrPsc를 아이오도겐(IODOGEN; 등록상표; Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용하여125I로 표지시켰다. 이를 완충제 A로 평형화시킨, 폴리왁스 엘피(등록상표; PolyLC사)를 포함하는 고상추출 카트릿지에 통과시키는 것에 의해 상기 표지된 단백질을 상기 유리125I로부터 분리시켰다. 상기 표지된 PrPsc를 완충제 B를 사용하여 상기 카트릿지로부터 용리시켰다. 상기 미결합된125I는 상기 카트릿지 상에 보류시켰으며, 이는 고체 방사성폐기물로서 폐기될 수 있다. 상기 표지된 PrPsc를 포함하는 상기 분획들을 진공 원심분리기 중에서 건조시키고, 물에 용해시키고, 완충제 A 중에 1/10로 희석시키고, 그리고 상기 HPLC 컬럼에 적재시켰다.
돗트 블럿 분석
HILIC 크로마토그래피로부터의 피크 분획의 1㎕ 분취물을 니트로셀룰로오스 페이퍼에 적용시키고, 건조시키고, 그리고 계속해서 500mM 염화나트륨, 0.05% 트윈 20(TTBS) 및 5% 물고기 젤라틴을 포함하는 20mM 트리스, pH 7.5 중에서 1시간 동안 배양시켰다. 상기 블럿을 TTBS로 2회 세척하고, 계속해서 상기 프리온 단백질의펩티드(펩티드 142-154로 된 토끼의 항체들)들로 제조된 항체의 1/500 희석물과 함께 25℃에서 3시간 동안 배양시켰다. 배양 후, 상기 블럿을 TTBS로 2회 세척하고, 계속해서 비오틴화 단백질 G(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)와 함께 1시간 동안 배양시켰다. 다시 상기 블럿을 앞서와 같이 세척하였다. 뉴트라비딘(NeutrAvidin; 등록상표; Pierce, Rockford, IL, USA)와 결합된 양고추냉이 퍼옥시다아제를 상기 블럿에 첨가하고, 25℃에서 1시간 동안 배양시켰다. 배양 후, 상기 블럿을 TTBS로 6회 세척하였다. 세척 후, 상기 분획을 슈퍼시그널(SuperSignal; 등록상표) 서브스트레이트(Pierce사) 시스템 중에서 10분간 배양시키고, 계속해서 코닥 엑스-오맷 에이알(X-OMAT AR; Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA) x-선 필름에 15초간 노출시켰다.
125 IPrP sc 에 대한 결합 분석
상기 폴리왁스 엘피 컬럼으로부터 수득된125I를 포함하는 분획을 상기 프리온 단백질의 잔기 142-154에 대응하는 펩티드들로 생성된 항체에 대한 결합능력에 대해 분석하였다. 방사성물질을 포함하는 시험관을 새번트 진공 원심분리기(Savant vacuum centrifuge) 중에서 42℃에서 건조시키고, 그리고 10㎕ 수중에 재현탁시키고, 계속해서 0.1% BSA 중의 완충제-함유 염들로 희석시켰다. 폴리염화비닐 판을 0.1M 탄산나트륨, pH 9.0 중의 상기 항체로 피복하였다. 상기 완충제로 세척한 후, 100㎕의125I-PrPsc를 상기 폴리염화비닐 판상에서 37℃에서 2시간 동안 배양시키고, 계속해서 4℃에서 하룻밤 동안 배양시켰다. 상기 폴리염화비닐 판을 세척하고 개개의 웰들내로 분획하고, 계수하였다. 상기 웰들 중의 cpm으로부터 배경 cpm을 차감하였다.
모세관 전기영동 조건들
유리 영역 모세관 전기영동(Schmerr and Jenny, Electrophoresis 19 : 409, 1998)이 베크만 피/에이스 5500(P/ACE 5500; Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA) 상에서 수행되었다. 공냉식 아르곤 레이저(Beckman Instruments)를 사용하여 488㎚에서의 여기 및 520㎚에서의 방출로 레이저-유도 형광(LIF) 검출이 수행되었다. 변형되지 않은 모세관들을 베크만사(Beckman Instruments)로부터 구입하였다. 20㎝(검출기까지의 길이) * 201㎛ 직경의 모세관을 200mM 트리신, pH 8.0과 함께 사용하였다. 이 완충제는 0.1% 엔-옥틸글루코시드(Boehringer Mannheim GmbH, Indianapolis, IN, USA) 및 0.1% BSA(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)들을 포함한다. 분리에 대한 준비에 있어서, 상기 모세관을 0.25M 수산화나트륨으로 1분 동안 세정해내고, 물로 2분 동안 세정한 다음, 완충제로 2분 동안 세정하였다. 상기 분리조건들은 20℃에서 3분간 30KV이었다. 전류는 대략 20㎂이었다. 상기 시료는 15초 동안 주입되었고, 그 다음에 구동 완충제가 5초간 주입되었다. 상기 시료 용적은 대략 0.95nℓ이었다. 세정들은 고압 하에서 수행되었으며, 시료 주입은 저압 하에서 수행되었다.
면역 복합체 및 프리온 결합 분석
형광체 표지된 펩티드를 대략 2피코몰(pmols) 포함하는 형광체-표지된 펩티드 15㎕를 친화성-정제된 토끼의 IgG와 혼합하여 항체의 형광체-표지된 펩티드와의결합을 증명하였다. 상기 HILIC 크로마토그래피로부터의 피크 분획 1㎕를 상기 분석물에 첨가하였다. 상기 성분들을 혼합한 후, 상기 시료들을 25℃에서 10분 동안 배양시켰다.
결과
정제 및 요오드화 후의 PrPsc의 크로마토그램을 도 1에 나타내었다. 상기125I-표지된 프리온 단백질의 방사성(cpm)은 흡수에 의하여 검출된 최종의 피크를 제외하고는 280㎚에서의 흡수와 일치한다. 비정상적인 단백질의 수율은 상기 컬럼 상에 적재한125I의 회수에 기초하여 대략 76% 이었다. cpm 및 A280 흡수의 피크들은 결합 분석에서 항체 활성을 나타내는 피크들과 일치한다(도 2). 결합 분석에서 대략 25분에서의 주 피크는 도 1에서125I-PrP 및 25분에서의 A280 흡수에 대한 피크와 일치한다. 진전병으로 감염된 양의 뇌들의 추출물(정제하지 않은)로부터의 크로마토그램(도시하지 않음)에 대하여도 유사한 결과들이 얻어졌다.
비정상적인 프리온 단백질에 대한 넓은 범위의 pI값들이 문헌들에서 보고되어 왔다(위에서의 Schmerr and Jenny; Safar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 6373, 1990; Somerville et al., J. Gen. Virol. 70 : 25, 1989). 이 단백질의 pI는 이 단백질의 컬럼 충진물들에의 결합에 영향을 줄 수 있다. 양으로 하전된 폴리왁스 엘피 컬럼과 중성의 폴리히드록에틸 에이 컬럼들에 대한 보류시간들 사이에 큰 차이는 없었다. 이는 상기 단백질이 산성일 것이라는 것을 의미한다.SDS를 포함하는 비정상적인 프리온 단백질이 넓은 범위에서 음으로 하전된 폴리설포에틸 에이 컬럼으로부터 용리되었다. 따라서, 상기 폴리왁스 엘피 컬럼 상에서 정제된 비정상적인 프리온 단백질을 상기 폴리설포에틸 에이 컬럼 상에서 재-구동시켰다. 그 빈 공간 내 또는 그 근처에서의 용리액은 결국 산성이어야 함을 나타내고 있다. 이는 겔 등전위 집중 및 모세관 전기 집중 두 가지 모두에 의하여 확인되었다(Schmerr et al., Chromatogr. A. 802 : 135, 1998). pI값들은 3.00에서의 주 종들과 함께 3 내지 6에 분포하고 있다. 이들 결과들은 친수성 상호작용 크로마토그래피에서, 중성 또는 음이온교환 물질을 사용하는 것이 필요함을 의미한다.
HILIC로 정제된 시료들을 사용하는 모세관 면역전기영동에서, 그 결과의 전기영동도(eletropherogram)(도시하지 않음)는 정상적인(감염되지 않은) 양으로부터 수득된 시료들이 반응하지 않는 반면에, 감염된 양으로부터 수득된 시료들은 반응하는 것을 나타내고 있다. SDS가 모세관 전기영동 분석을 포함한 전형적인 면역분석들을 저해하기 때문에, 이러한 분석법들을 수행하기 위하여는 SDS를 제거하여야 할 필요가 있다. SDS가 빈 공간 내 또는 그 근처에서 용리되기 때문에, 모세관 전기영동을 사용하는 경쟁적 분석은 HILIC 크로마토그래피 후에 시료들에 대해 수행될 수 있다(Jeno et al., Anal. Biochem., 215 : 292, 1993).
실시예 4
감염된 양의 혈액으로부터 추출된 비정상적인 프리온 단백질의 분석
TSE-감염된 양으로부터 수득된 혈액 시료들로부터 들소가죽 피복 원심분리분획(buffy coat centrifuge fractions)들을 트리스 완충 염수로 희석시켰다(10%조직 : 90% 완충제). 계속해서, 정상적인 주 프리온 단백질은 소화시키고, 프리온 단백질의 변형된 비정상적인 형태는 소화시키지 않도록 상기 시료들을 프로테나아제-케이로 처리하였다. 소화 후, 상기 처리된 시료를 등량의 헥사플루오로-2-프로판올과 혼합시키고, 56℃에서 5분 동안 배양시켰다. 등량의 0.5M 황산나트륨을 첨가하고 그 상들을 분리되도록 방치하였다. HFIP를 포함하는 층을 제거하고, 그 시료를 진공 원심분리기 내에서 건조시켰다.
그 펠릿을 물에 재현탁시키고, 그 현탁액을 95% 아세토니트릴, 5% 물, 0.1% 트리플루오로아세트산 및 50mM HFIP를 포함하는 유기 크로마토그래피 이동상 중에 투입하였다. 상기 이동상을 폴리히드록시에틸 아스파르트아미드(PolyHYDROXYETHYL Aspartamide; 등록상표; PolyLC, Inc.)의 고상 추출 카트릿지에 적용시켰다. 이 지지체로부터 비정상적인 프리온 단백질을 100% 물, 0.1% 트리플루오로아세트산 및 50mM HFIP로 용리시키고, 계속해서 건조시키고, 물에 재현탁시켰다.
비정상적인 프리온 단백질의 존재는 모세관 면역전기영동에 의하여 검출되었다. TSE로 감염되지 않은 혈액의 대조 시료들에 대한 전기영동도에서는 비정상적인 프리온 단백질이 검출되지 않았다.
실시예 5
감염된 꼬리 검은 사슴(mule deer) 혈액으로부터 추출된 비정상적인 프리온 단백질의 분석
TSE-감염된 꼬리 검은 사슴으로부터 수득한 혈액 시료들로 상기 실시예 4의절차를 반복하였다. 모세관 면역전기영동에 의해 비정상적인 프리온 단백질의 존재가 검출되었다. TSE로 감염되지 않은 혈액의 대조 시료들에 대한 전기영동도에서는 비정상적인 프리온 단백질이 검출되지 않았다.
실시예 6
TSE-감염된 고라니(elk)로부터 수득한 혈액 시료들로 상기 실시예 4의 절차를 반복하였다. 모세관 면역전기영동에 의해 비정상적인 프리온 단백질의 존재가 검출되었다. TSE로 감염되지 않은 혈액의 대조 시료들에 대한 전기영동도에서는 비정상적인 프리온 단백질이 검출되지 않았다.
본 명세서에서 언급한 모든 특허들, 특허출원들, 시험 원형들 및 간행물들은 본 명세서에 그들 전체로서 참고로 인용되었다.
본 발명은 본 명세서에 기술된 특정의 구체예들에 의하여 한정되는 것은 아니다. 결국, 본 명세서에 기술된 그것들에 더해 본 발명의 여러 변형들이 앞서의 상세한 설명 및 첨부된 도면들로부터 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 분명하게 될 것이다. 이러한 변형들은 첨부된 특허청구범위들의 범주 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

Claims (26)

  1. (가) 추출용매와 등장 또는 저장의 생물학적 물질의 수성 제제와의 혼합물을 비정상적인 프리온 단백질이 상기 생물학적 물질로부터 상기 추출용매 내로 추출되기에 유효한 조건들 하에서 배양시키는 단계, 여기에서 상기 추출용매는
    (1) 상기 비정상적인 프리온 단백질이 용해될 수 있는 극성의 유기용매 및
    (2) 비-유방향성 수성 용액과는 혼화되나, 유방향성 수성 용액과는 혼화되지 않는 것이며; 또한
    (나) 상기 혼합물의 유방향성 활성을 증가시켜 상기 추출용매가 상기 생물학적 물질의 수성 제제로부터 분리되어 상기 생물학적 물질로부터 어떠한 프리온 단백질들도 포함하는 유기용매를 수득하는 단계;
    를 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는 비정상적인 프리온 단백질을 포함하는 것으로 여겨지는 생물학적 물질로부터 비정상적인 프리온 단백질을 추출하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 추출용매가 헥사플루오로-2-프로판올임을 특징으로 하는 상기 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 생물학적 물질이 가축들로부터 수득되는 조직 또는 생물학적 액체임을 특징으로 하는 상기 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 조직이 뇌조직임을 특징으로 하는 상기 방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 생물학적 액체가 뇌척수액, 혈액, 혈장 및 혈청으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 상기 방법.
  6. 제 3 항에 있어서, 상기 생물학적 액체가 인간의 혈액임을 특징으로 하는 상기 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 혼합물이 20 내지 100℃의 범위의 온도에서 배양됨을 특징으로 하는 상기 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 배양이 대략 56℃에서 이루어짐을 특징으로 하는 상기 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 유방향성 활성이 상기 혼합물에 0.5M 황산나트륨을 1 : 1의 비율(용적/용적)로 첨가하는 것에 의해 증가되는 것을 특징으로 하는 상기 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 생물학적 물질의 상기 등장 또는 저장의 수성 제제 중의상기 생물학적 물질이 프로테나아제-케이로 처리됨을 특징으로 하는 상기 방법.
  11. 제 1 항에 있어서,
    (다) 비정상적인 프리온 단백직을 포함하는 상기 추출용매를 건조시켜 추출물 펠릿을 수득하는 단계를 더 포함함을 특징으로 하는 상기 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    (라) 상기 건조된 추출물 펠릿을 물에 용해시키고 그리고 상기 비정상적인 프리온 단백질을 정제하는 단계를 더 포함함을 특징으로 하는 상기 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 정제단계가 친수성 상호작용 크로마토그래피 및 모세관 전기영동으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 방법을 포함함을 특징으로 하는 상기 방법.
  14. 비정상적인 프리온 단백질에 대하여 제 1 항에서 규정된 방법에 의하여 제조되어진, 분리된 추출용매를 분석하는 것을 포함함을 특징으로 하는 동물 중의 비정상적인 프리온 단백질의 존재를 검출하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 분석이 비정상적인 프리온 단백질에 대한 면역분석을 포함함을 특징으로 하는 상기 방법.
  16. 제 14 항에 있어서, 상기 생물학적 시료가 가축들로부터 수득되는 조직 또는 생물학적 액체임을 특징으로 하는 상기 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 조직이 뇌조직임을 특징으로 하는 상기 방법.
  18. 제 16 항에 있어서, 상기 생물학적 액체가 뇌척수액, 혈액, 혈장 및 혈청으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 상기 방법.
  19. 제 16 항에 있어서, 상기 생물학적 액체가 인간의 혈액임을 특징으로 하는 상기 방법.
  20. (가) 헥사플루오로-2-프로판올과 생물학적 물질의 비-유방향성 수성 제제의 대략 등량의 혼합물을 비정상적인 프리온 단백질이 상기 생물학적 물질로부터 상기 헥사플루오로-2-프로판올 내로 추출되기에 유효한 조건들 하에서 배양시키는 단계; 및
    (나) 상기 혼합물에 대략 등량의 0.5M 황산나트륨 용액을 첨가하여 상기 생물학적 물질의 상기 수성 제제로부터 상기 헥사플루오로-2-프로판올을 분리시켜 상기 생물학적 물질로부터 어떠한 비정상적인 프리온 단백질도 포함하는 추출용매를 수득하는 단계;들을 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는 비정상적인 프리온 단백질을 포함하는 것으로 여겨지는 생물학적 물질로부터 비정상적인 프리온 단백질을 추출하는 방법.
  21. (가) 추출용매, 여기에서 상기 추출용매는
    (1) 상기 비정상적인 프리온 단백질이 용해될 수 있는 극성의 유기용매 및
    (2) 저장 또는 등장의 수성 용액과는 혼화되나, 유방향성 수성 용액과는 혼화되지 않는 것이며; 또한
    (나) 생물학적 시료의 수성 제제에 첨가되어 상기 유기용매가 상기 수성 제제와 혼화되지 않도록 하는 유방향성 염 또는 수성 유방향성 염 용액;들을 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는 생물학적 시료로부터 비정상적인 프리온 단백질을 분리하기 위한 키트.
  22. 제 21 항에 있어서, 생물학적 시료의 상기 수성 제제에 대한 용적 표시기를 갖는 시료 용기를 더 포함하며, 여기에서 상기 극성 유기용매와 상기 유방향성 염 또는 수성 유방향성 염 용액들이 시료 용기와 함께 사용하기 위한 사전-측정된 단위들로 제공되는 것을 특징으로 하는 상기 키트.
  23. 제 21 항에 있어서, 생물학적 시료의 상기 수성 제제를 처리하기 위한 프로테나아제-케이를 더 포함함을 특징으로 하는 상기 키트.
  24. (가) 추출용매, 여기에서 상기 추출용매는
    (1) 비정상적인 프리온 단백질이 용해될 수 있는 극성의 유기용매 및
    (2) 비-유방향성 수성 용액과는 혼화되나, 유방향성 수성 용액과는 혼화되지 않는 것이며;
    (나) 생물학적 시료의 수성 제제에 첨가되어 상기 추출용매가 상기 수성 제제와 혼화되지 않도록 하는 유방향성 염 또는 수성 유방향성 염 용액; 및
    (다) 비정상적인 프리온 단백질 검출 분석;들을 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는 생물학적 시료로부터 비정상적인 프리온 단백질을 분리하기 위한 키트.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 검출 분석이 면역분석임을 특징으로 하는 상기 키트.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 면역분석이 면역크로마토그래피 분석임을 특징으로 하는 상기 키트.
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