KR20180128971A - 지카 바이러스 검출용 면역 크로마토그래피 분석 장치 - Google Patents

지카 바이러스 검출용 면역 크로마토그래피 분석 장치 Download PDF

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게이타 스즈키
히사히코 이와모토
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다나카 기킨조쿠 고교 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, 지카 바이러스 감염의 진단을 간이하면서 또한 신속히 행할 수 있는 면역 크로마토그래피 분석 장치에 관한 것이고, 프라비 바이러스과에 속하는, 지카 바이러스 이외의 바이러스에 대한 교차 반응을 경감시켜, 지카 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 면역 크로마토그래피 분석 장치를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은, 시료 첨가부와, 표지 물질 유지부와, 검출부를 갖는 크로마토그래프 매체부와, 흡수부를 포함하는, 지카 바이러스(Zika virus)를 검출하기 위한 면역 크로마토그래피 분석 장치이며, 상기 표지 물질 유지부 및 검출부가, 서열 번호 1로 표시되는 지카 바이러스의 비구조성 단백질인 NS1을 인식하는 항체를 함유하는 면역 크로마토그래피 분석 장치에 관한 것이다.

Description

지카 바이러스 검출용 면역 크로마토그래피 분석 장치
본 발명은, 지카 바이러스를 검출하기 위한 면역 크로마토그래피 분석 장치, 면역 크로마토그래피 분석 키트 및 면역 크로마토그래피 분석 방법에 관한 것이다.
지카 바이러스 감염증을 야기하는 지카 바이러스(Zika virus)는, 뎅기 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스 등과 함께 플라비바이러스과(Flavivirus)에 속하는 바이러스이다. 지카 바이러스는 인간을 포함하는 척추 동물에 널리 분포하고, 모기나 진드기와 같은 벡터를 통해 전파되는 것이 알려져 있다. 또한, 지카 바이러스는 모자 수직 감염이나 성적 접촉에 의한 감염, 혈액 감염 등에 의해 전파되는 것도 보고되어 있다.
인간이 지카 바이러스에 감염되면, 3 내지 12일의 잠복 기간 후, 급성 발열(소위 지카열)이 일어나고, 또한 비화농성의 결막염, 두통, 근육통, 관절통 등의 다양한 증상이 나타난다.
지카 바이러스 감염증에 대해서는, 현재 시점에서 유효한 약제나 백신은 개발되어 있지 않다. 한편, 지카 바이러스 감염의 확대를 방지하기 위해서, 지카 바이러스 감염의 조기 진단이 요망되고 있다.
종래, 지카 바이러스 감염의 진단은, 혈액 검사, 소변 검사, 타액 검사에 있어서, 지카 바이러스의 RNA를 검출함으로써 행해져 왔다(비특허문헌 1). 또한, 혈청학적 방법으로서, 지카 바이러스 감염자가 체 내에 갖는 지카 바이러스에 대한 항체(IgM이나 IgG)를 ELISA나 형광 항체법으로 검출하는 것도 행해져 왔다(비특허문헌 2).
Chen, LH; Hamer, DH(2 February 2016). "Zika Virus: Rapid Spread in the Western Hemisphere. "Annals of Internal Medicine Hayes, Edward B. "Zika Virus Outside Africa". Emerging Infectious Diseases 15(9): 1347-50
그러나, 상기 RNA의 검출에 의한 지카 바이러스 감염의 진단에는, 특별한 설비나 시약 등이 필요하기 때문에 비용이 들고, 또한 이들 검사에는 반일부터 하루 정도의 시간이 걸리며, 검사 결과가 얻어질 때까지 장시간을 요하였다.
또한, 상기 지카 바이러스에 대한 항체를 검출하는 방법은, 지카 바이러스를 직접 검출하는 것은 아니고, 지카 바이러스에 감염되고 나서 소정 기간 경과 후에 인간의 체 내에서 만들어지는 IgM이나 IgG를 검출함으로써, 간접적으로 지카 바이러스 감염의 진단을 행하는 것이기 때문에, 지카 바이러스 감염 초기의 진단으로서는 부적합하였다. 또한 당해 방법은, 지카 바이러스를 직접 검출하는 것이 아니기 때문에, 예를 들어 지카 바이러스와 같은 프라비 바이러스과에 속하는 뎅기 바이러스나 웨스트 나일 바이러스 감염과 구별하여 진단하는 것은 어려웠다. 그 때문에, 지카 바이러스를 직접 검출함으로써, 감염 초기로부터 지카 바이러스 감염의 진단을 행하는 방법이 요구되었다.
그래서 본 발명은, 지카 바이러스 감염의 진단을 간이하면서 또한 신속히 행할 수 있는 면역 크로마토그래피 분석 장치를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 지카 바이러스 자체를 직접 검출함으로써, 지카 바이러스 감염을 조기에 발견할 수 있으며, 또한 지카 바이러스 이외의 프라비 바이러스과에 속하는 바이러스에 대한 교차 반응이 경감되어, 지카 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 면역 크로마토그래피 분석 장치를 제공하는 것을 목적으로 하는 것이다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구한 결과, 면역 크로마토그래피 분석 장치에 있어서, 지카 바이러스의 비구조성 단백질인 NS1을 인식하는 항체를 사용함으로써, 상기 과제를 해결할 수 있음을 알아내고, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
1. 시료 첨가부와, 표지 물질 유지부와, 검출부를 갖는 크로마토그래프 매체부와, 흡수부를 포함하는, 검체 중의 지카 바이러스를 검출하기 위한 면역 크로마토그래피 분석 장치이며,
상기 표지 물질 유지부 및 상기 검출부가, 서열 번호 1로 표시되는 지카 바이러스의 비구조성 단백질인 NS1을 인식하는 항체를 함유하는 면역 크로마토그래피 분석 장치.
2. 상기 표지 물질 유지부 및 상기 검출부의 적어도 한쪽이, 상기 비구조성 단백질인 NS1의 전체 아미노산 서열 중에 존재하는 서열 번호 2 내지 4로 표시되는 3개의 아미노산 서열 중, 적어도 하나의 아미노산 서열을 인식하는 항체를 함유하는, 상기 1에 기재된 면역 크로마토그래피 분석 장치.
3. 상기 표지 물질 유지부 및 상기 검출부가, 상기 비구조성 단백질인 NS1의 전체 아미노산 서열 중에 존재하는 서열 번호 2 내지 4로 표시되는 3개의 아미노산 서열 중, 적어도 하나의 아미노산 서열을 인식하는 항체를 함유하는, 상기 2에 기재된 면역 크로마토그래피 분석 장치.
4. 상기 1 내지 3 중 어느 하나에 기재된 면역 크로마토그래피 분석 장치와, 검체를 희석하여 전개하기 위한 검체 희석액을 포함하는 면역 크로마토그래피 분석 키트.
5. 상기 4에 기재된 면역 크로마토그래피 분석 키트를 사용하여, 검체 중의 지카 바이러스를 검출하는 면역 크로마토그래피 분석 방법이며, 이하의 공정 (1) 내지 (4)를 포함하는 면역 크로마토그래피 분석 방법.
(1) 검체 희석액에 의해 검체를 희석한 검체 함유액을 시료로 하여, 시료 첨가부에 첨가하는 공정
(2) 표지 물질 유지부에 유지되어 있는 지카 바이러스의 비구조성 단백인 NS1을 인식하는 항체에 의해, 검체 중의 지카 바이러스를 인식시키는 공정
(3) 상기 검체 및 상기 항체를 이동상으로 하여 크로마토그래프 매체부에 전개시키는 공정
(4) 전개된 상기 이동상 중의 지카 바이러스를, 검출부에 포함되는 지카 바이러스의 비구조성 단백질인 NS1을 인식하는 항체에 의해 검출하는 공정
본 발명은, 면역 크로마토그래피 분석 장치에 있어서, 지카 바이러스가 갖는 비구조성 단백질인 NS1을 인식하는 항체를 사용함으로써, 지카 바이러스 이외의 다른 바이러스 등과의 교차 반응을 억제하여, 지카 바이러스를 신속하면서 또한 특이적으로 검출할 수 있다. 특히, 지카 바이러스의 NS1의 전체 아미노산 서열 중에 존재하는 서열 번호 2 내지 4로 표시되는 3개의 아미노산 서열 중, 적어도 하나의 아미노산 서열을 인식하는 항체를 사용함으로써, 지카 바이러스를 보다 특이적으로 검출할 수 있다.
도 1은, 본 발명의 일 실시 형태의 면역 크로마토그래피 분석 장치의 구조를 설명하기 위한 단면도이다.
이하에, 본 발명을 실시하기 위한 형태를 설명한다.
또한, 본 명세서에 있어서 「고정」이란, 항체가 이동하지 않도록 막 등의 담체에 배치되어 있는 것을 의미하고, 「유지」란, 막 등의 담체 중 또는 표면을 이동 가능하게 배치되는 것을 의미한다.
또한, 본 명세서에 있어서, 항체가 특정한 단백질을 「인식한다」는 것은, 항원 항체 반응에 의해 항체가 당해 단백질이 갖는 아미노산 서열의 일부와 결합하는 것을 나타낸다. 또한, 항체가 특정한 아미노산 서열을 「인식한다」는 것은, 항체가 특정한 아미노산 서열의 전체 또는 그 일부와 항원 항체 반응에 의해 결합하는 것을 나타낸다.
<검체>
본 발명의 면역 크로마토그래피 분석 장치는 검체 중의 지카 바이러스를 검출한다. 본 발명에 사용할 수 있는 검체는, 지카 바이러스를 포함할 가능성이 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로는 지카 바이러스 감염자의 혈청, 혈장, 전혈, 정액, 골수액 등을 들 수 있다. 바람직하게는 신속 진단의 관점에서, 전혈, 혈청 및 혈장이다.
<면역 크로마토그래피 분석 장치>
본 발명의, 지카 바이러스를 검출하기 위한 면역 크로마토그래피 분석 장치는, 검체를 함유하는 시료(이하, 간단히 시료라고도 함)를 첨가하는 시료 첨가부와, 표지 물질을 유지하는 표지 물질 유지부와, 지카 바이러스를 검출하는 검출부를 갖는 크로마토그래프 매체부와, 검출부를 통과한 액체를 흡수하는 흡수부를 구비하고, 표지 물질 유지부 및 검출부가, 지카 바이러스의 비구조성 단백질인 NS1을 인식하는 항체를 함유하는 것을 특징으로 하고 있다.
(항체)
본 발명의 면역 크로마토그래피 분석 장치에 사용하는 항체는, 지카 바이러스의 비구조성 단백질인 NS1(nonstructural protein NS1, 이하 간단히 NS1이라고도 함)을 인식하는 항체이다.
지카 바이러스의 NS1은, 서열 번호 1로 표시되는 352개의 아미노산을 포함하고, 다른 프라비 바이러스와 동일하게 바이러스의 복제 등에 관계되는 단백질인 것이 시사되어 있지만, 상세한 기능, 구조는 불분명하다.
본 발명에 있어서는, 지카 바이러스가 갖는 각종 단백질 중에서도 특히 NS1을 인식하는 항체를 사용함으로써, 지카 바이러스 이외의 다른 바이러스 등과의 교차 반응을 억제하여, 지카 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 것이다. 본 발명에 있어서의 항체에 의하면, 예를 들어 지카 바이러스와 같은 프라비 바이러스과에 속하는, 뎅기 바이러스 등에 대한 교차 반응을 경감시킬 수 있다. 구체적으로는, 서열 번호 6으로 표시되는 뎅기 바이러스의 비구조성 단백질의 NS1에 대해서는, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이 교차 반응을 나타내지 않는다.
특히, 면역 크로마토그래피 분석 장치의 표지 물질 유지부 및 검출부의 적어도 한쪽이, NS1을 인식하는 항체 중에서도 특히, NS1의 전체 아미노산 서열 중에 존재하는 서열 번호 2 내지 4로 표시되는 3개의 아미노산 서열 중, 적어도 하나의 아미노산 서열을 인식하는 항체를 함유하는 것이 바람직하다. 상기 아미노산 서열의 적어도 하나를 인식하는 항체를 사용함으로써, 지카 바이러스 이외의 다른 항원과의 교차 반응을 보다 저감시킬 수 있어, 지카 바이러스를 보다 특이적으로 검출할 수 있다.
서열 번호 2의 아미노산 서열(ENGVQLTVVV GSVKNPMWRG PQRLPVPVNE LPHGWKAWGK)은 NS1의 전체 아미노산 서열 중 81번째로부터 120번째까지의 아미노산 서열에 해당하고, 서열 번호 3의 아미노산 서열(SYFVRAAKTN NSFVVDGDTL KECPLEHRAW NSF)은 NS1의 전체 아미노산 서열 중 121번째로부터 153번째까지의 아미노산 서열에 해당하고, 서열 번호 4의 아미노산 서열(GP LSHHNTREGY RTQVKGPWHS EELEIRFEEC PGTKVYV)은 NS1의 전체 아미노산 서열 중 249번째로부터 287번째까지의 아미노산 서열에 해당한다. 또한, 보다 C 말단측이며, NS1의 전체 아미노산 서열 중 291번째로부터 320번째까지의 아미노산 서열에 해당하는 서열 번호 5(CGTRGPSLRS TTASGRVIEE WCCRECTMPP)를 인식하는 항체를 사용한 경우에서도 검출은 가능하지만, 다른 바이러스 NS1 단백질과 상동성이 높기 때문에, 특이성이 부족할 것이 추측된다.
본 발명에 있어서의 항체로서는, 예를 들어 폴리클로날 항체나 모노클로날 항체 등의 천연형 항체, 유전자 재조합 기술을 사용하여 제조될 수 있는 키메라 항체, 인간화 항체나 단일쇄 항체, 인간 항체 산생 트랜스제닉 동물 등을 사용하여 제조될 수 있는 인간 항체, 파지 디스플레이에 의해 제작된 항체 및 이들의 결합성 단편이 포함된다. 감도의 관점에서 모노클로날 항체인 것이 바람직하다.
(항체의 제작 방법)
지카 바이러스의 NS1을 인식하는 항체의 제작 방법에 대해서, 이하 예시적으로 설명을 한다.
항체 산생 동물종으로서는, 예를 들어 인간, 마우스, 래트, 토끼, 염소, 말 등을 사용할 수 있다. 면역 글로불린으로서는, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD 중 어느 것이든 된다.
일 실시 형태에 있어서, 면역원으로서의 지카 바이러스 NS1 펩티드는, 기지의 일반적인 제조 방법에 의해 제조할 수 있다. 즉, 지카 바이러스로부터 추출 정제한 지카 바이러스 NS1 펩티드, 또는 클로닝된 지카 바이러스 NS1의 유전자를 대장균 등의 숙주에서 유전자 공학적으로 발현시켜 추출 정제한 지카 바이러스 NS1 펩티드, 나아가 지카 바이러스 NS1 펩티드의 일부를 구성하는 폴리펩티드를 면역원으로서 사용할 수 있다.
모노클로날 항체는 통상법에 따라서, 상기 면역원으로 면역시킨 마우스의 비장 세포와 골수종 세포를 하이브리드 시켜, 목적으로 하는 항체를 산생하는 하이브리도마를 선택하고, 이 하이브리도마로부터 산생되는 모노클로날 항체를 수득한다[예를 들어, 쾰러와 밀스타인의 기법(Nature 256(1975) 495-497)을 참조]. 폴리클로날 항체는, 통상의 방법에 의해, 상기 면역원을 산생 동물(예를 들어, 인간, 마우스, 래트, 토끼, 염소, 말 등)에 면역시켜 얻은 항혈청 중으로부터 목적으로 하는 항체를 분리함으로써 얻어진다.
모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마 클론의 스크리닝은, 하이브리도마를, 예를 들어 마이크로타이터 플레이트 중에서 배양하고, 증식이 보인 웰의 배양 상청의 상기 면역원에 대한 반응성을, 예를 들어 ELISA 등의 효소 면역 측정법에 의해 측정함으로써 행할 수 있다.
이 하이브리도마는, 배지(예를 들어, 10％ 소태아 혈청을 포함하는 DMEM)를 사용하여 배양하고, 그 배양액의 원심 상청을 모노클로날 항체 용액으로 할 수 있다. 또한, 본 하이브리도마를 유래하는 동물의 복강에 주입함으로써, 복수를 생성시켜, 얻어진 복수를 모노클로날 항체 용액으로 할 수 있다. 모노클로날 항체는 단리 및/또는 정제되는 것이 바람직하다.
이와 같이 하여, 지카 바이러스의 NS1을 인식하는 항체를 제작할 수 있다.
또한, 지카 바이러스의 NS1을 인식하는 항체는 시판되는 것을 구입하여 사용할 수도 있다. 예를 들어, clone 2801116(Monoclonal Antibody To Zika Virus Ns1 Protein, Aalto Bio Reagent사)이나 clone 2901126(Monoclonal Antibody To Zika Virus NS1 Protein, Aalto Bio Reagent사) 등을 구입하여 사용할 수 있다.
또한, 지카 바이러스의 NS1을 인식하는 항체 중, 특히 서열 번호 2 내지 4로 표시되는 3개의 아미노산 서열의 적어도 하나의 아미노산 서열을 인식하는 항체는, 예를 들어 상기와 같이 지카 바이러스의 NS1을 인식하는 항체를 제작한 경우, 서열 번호 2 내지 4로 표시되는 3개의 아미노산 서열에 상당하는 펩티드 단편을 사용한 ELISA 시험이나 웨스턴 블로팅 등에 의해, 상기 지카 바이러스의 NS1을 인식하는 항체를 산생하는 하이브리도마 중으로부터, 서열 번호 2 내지 4로 표시되는 3개의 아미노산 서열에 대하여 보다 강한 반응성을 나타내는 항체를 산생하는 하이브리도마를 선택함으로써, 입수하여 사용할 수 있다.
(면역 크로마토그래피 분석 장치)
이어서, 도면을 참조하면서 본 발명의 면역 크로마토그래피 분석 장치의 일 실시 형태에 대하여 설명한다.
본 발명의 면역 크로마토그래피 분석 장치의 일 실시 형태로서는, 도 1에 도시한 바와 같이, 시료 첨가부(1), 표지 물질 유지부(2), 크로마토그래프 매체부(3), 검출부(4), 흡수부(5), 배킹 시트(6)로 구성되어 있다.
시료 첨가부(1)는 면역 크로마토그래피 분석 장치에 있어서, 검체를 함유하는 시료를 첨가하는 부위이다. 시료 첨가부(1)에서는 시료가 신속히 흡수되지만, 빠르게 시료가 이동해가는 성질의 다공질 시트로 구성할 수 있다. 다공질 시트로서는, 예를 들어 셀룰로오스 여과지, 유리 섬유, 폴리우레탄, 폴리아세테이트, 아세트산셀룰로오스, 나일론, 면포 등을 들 수 있다.
표지 물질 유지부(2)에는, 후술하는 표지 물질로 표지화된 표지 항체(이하, 간단히, 표지 항체라고도 함)가 유지되어 있으며, 상기 표지 항체가 검체 중의 피검출 물질과 결합하는 부위이다. 이 표지 항체는 지카 바이러스의 NS1을 인식하는 항체이며, 표지 물질 유지부(2) 내를 시료가 이동할 때에 상기 항체와 검체 중의 상기 지카 바이러스의 NS1이 결합한다.
표지 물질 유지부(2)에는, 유리 섬유, 셀룰로오스 등의 막이 통상 사용된다.
표지 물질 유지부(2)의 표지 항체의 함유량은 통상 0.05μg/장치 내지 0.5μg/장치이며, 바람직하게는 0.05μg/장치 내지 0.25μg/장치이며, 보다 바람직하게는 0.07μg/장치 내지 0.1μg/장치이다. 또한, 표지 물질 유지부(2)의 단위 면적당 표지 항체의 함유량은 통상 0.05μg/cm2 내지 1.0μg/cm2이며, 바람직하게는 0.1μg/cm2 내지 0.8μg/cm2이며, 보다 바람직하게는 0.17μg/cm2 내지 0.6μg/cm2이다.
면역 크로마토그래피 분석에 있어서 항체를 표지하는 표지 물질로서는, 일반적으로 효소 등도 사용되지만, 피검출 물질의 존재를 눈으로 보아 판정하기에 적합한 점에서, 표지 물질로서는, 불용성 담체를 사용하는 것이 바람직하다. 즉, 본 발명에 있어서, 표지 물질 유지부(2)가 함유하는 항체로서는, 지카 바이러스의 NS1을 인식하는 항체를 불용성 담체에 감작시킴으로써 표지화한 표지 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 지카 바이러스의 NS1을 인식하는 항체를 불용성 담체에 감작시키는 수단은, 공지된 방법에 따르면 된다.
표지 물질로서의 불용성 담체에는, 금, 은 또는 백금 등의 금속 입자, 산화철 등의 금속 산화물 입자, 황 등의 비금속 입자 및 합성 고분자를 포함하는 라텍스 입자 또는 기타의 불용성 담체를 사용할 수 있다. 상술한 바와 같이 불용성 담체는, 피검출 물질의 존재를 시각적으로 판정하기에 적합한 표지 물질이며, 눈으로 보는 판정을 용이하게 하기 위해서는 유색인 것이 바람직하다. 금속 입자 및 금속 산화물 입자는, 그 자체가 입경에 따른 특정한 자연색을 나타내는 것이며, 그 색채를 표지로서 이용할 수 있다.
표지 물질로서의 불용성 담체는, 특히 금 입자가, 검출이 간편하며, 또한 응집되기 어려워 비특이적인 발색이 일어나기 어려운 점에서 바람직하다. 금 입자의 평균 입경은, 예를 들어 10nm 내지 250nm, 바람직하게는 35nm 내지 120nm이다. 평균 입경은, 투과형 전자 현미경(TEM: 니혼 덴시(주)제, JEM-2010)에 의해 촬영한 투영 사진을 사용하여 무작위로 100개의 입자의 투영 면적 원 상당 직경을 계측하고, 그 평균값으로부터 산출할 수 있다. 표지 물질 유지부에 있어서의 금 입자의 함유량은 표지 물질 유지부의 단위 면적당, 통상 0.006μg/cm2 내지 0.42μg/cm2이며, 바람직하게는 0.01μg/cm2 내지 0.3μg/cm2이며, 보다 바람직하게는 0.01μg/cm2 내지 0.2μg/cm2이다. 상기 범위로 설정함으로써, 표지된 입자가 분산된 채 전개하고, 항체의 인식 부위가 저해되지 않아 고감도화할 수 있기 때문이다.
크로마토그래프 매체부(3)는 크로마토그래프의 전개 부위이다. 크로마토그래프 매체부(3)는, 모관 현상을 나타내는 미세 다공성 물질을 포함하는 불활성의 막이다. 크로마토그래프에서 사용되는 검출 시약, 고정화 시약 또는 피검출 물질 등과 반응성을 갖지 않는다는 관점에서, 또한 본 발명의 효과가 향상된다는 관점에서, 예를 들어 니트로셀룰로오스제 멤브레인(이하, 니트로셀룰로오스 멤브레인이라고도 함)이나, 아세트산셀룰로오스제 멤브레인(이하, 아세트산셀룰로오스 멤브레인이라고도 함)이 바람직하고, 니트로셀룰로오스 멤브레인이 더욱 바람직하다. 또한, 셀룰로오스류 멤브레인, 나일론 멤브레인 및 다공질 플라스틱 천류(예를 들어 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 등)도 사용 가능하다.
니트로셀룰로오스 멤브레인으로서는, 니트로셀룰로오스가 주체로 포함되어 있으면 되고, 순품 또는 니트로셀룰로오스 혼합품 등 니트로셀룰로오스를 주재로 하는 멤브레인을 사용할 수 있다.
니트로셀룰로오스 멤브레인은, 또한 모세관 현상을 촉진시키는 물질을 함유시킬 수도 있다. 당해 물질로서는, 막면의 표면 장력을 저하시키고, 친수성을 초래하는 물질이 바람직하다. 예를 들어, 당류, 아미노산의 유도체, 지방산에스테르, 각종 합성 계면 활성제 또는 알코올 등의 양친매성 작용을 갖는 물질이며, 피검출 물질의 이동에 영향이 없고, 표지 물질의 발색에 영향을 미치지 않는 물질이 바람직하다.
니트로셀룰로오스 멤브레인은 다공성이며, 모세관 현상을 나타낸다. 이 모세관 현상의 지표는 흡수 속도(흡수 시간: capillary flow time)를 측정함으로써 확인할 수 있다. 흡수 속도는 검출 감도와 검사 시간에 영향을 미친다.
상기와 같은 니트로셀룰로오스 멤브레인이나 아세트산셀룰로오스 멤브레인으로 대표되는 크로마토그래프 매체부(3)의 형태 및 크기는 특별히 제한되는 것은 아니고, 실제의 조작점 및 반응 결과의 관찰점에 있어서 적절하면 된다.
또한 조작을 보다 간편하게 하기 위해서는, 크로마토그래프 매체부(3)의 이면에, 플라스틱 등을 포함하는 지지체를 설치하는 것이 바람직하다. 이 지지체의 성상은 특별히 제한되는 것은 아니지만, 눈 관찰 판정에 의해 측정 결과의 관찰을 행하는 경우에는, 지지체는, 표지 물질에 의해 초래되는 색채와 유사하지 않은 색채를 갖는 것이면 바람직하고, 통상 무색 또는 백색인 것이 바람직하다.
또한, 크로마토그래프 매체부(3) 상에는, 비특이적인 흡착에 의해 분석의 정밀도가 저하되는 것을 방지하기 위해서, 필요에 따라서 크로마토그래프 매체부(3)에 공지된 방법으로 블로킹 처리를 행할 수 있다. 일반적으로 블로킹 처리는, 소혈청 알부민, 스킴 밀크, 카제인 또는 젤라틴 등의 단백질이 적합하게 사용된다. 이러한 블로킹 처리 후에, 필요에 따라서 예를 들어 Tween20, TritonX-100 또는 SDS 등의 계면 활성제를 1개 또는 2개 이상 조합하여 세정해도 된다.
검출부(4)는 상기 크로마토그래프 매체부(3) 상의 임의의 위치에 형성되어 있고, 지카 바이러스의 NS1을 인식하는 항체를 함유한다. 검출부(4)에 대한 지카 바이러스의 NS1을 인식하는 항체의 고정화는, 통상법에 따라서 행할 수 있다.
검출부(4)에서는, 크로마토그래프 매체부 상을 이동상으로서 통과한 검체 중의 지카 바이러스가, 검출부(4)에 고정되어 있는 지카 바이러스의 NS1을 인식하는 항체와, 표지 물질이 결합된 지카 바이러스의 NS1을 인식하는 항체에 의해 샌드위치상으로 끼워지도록 특이적으로 결합한다.
검출부(4)에 함유되는, 지카 바이러스의 NS1을 인식하는 항체의 함유량은, 통상 0.1μg/장치 내지 3.0μg/장치이며, 바람직하게는 0.3μg/장치 내지 2.0μg/장치이며, 보다 바람직하게는 0.3μg/장치 내지 1.0μg/장치이다. 또한, 검출부(4)의 단위 면적당, 지카 바이러스의 NS1을 인식하는 항체의 함유량은 통상 0.04μg/cm2 내지 1.0μg/cm2이며, 바람직하게는 0.125μg/cm2 내지 0.8μg/cm2이며, 보다 바람직하게는 0.125μg/cm2 내지 0.42μg/cm2이다.
흡수부(5)는 크로마토그래프 매체부(3)의 말단에, 검출부(4)를 통과한 검체나 전개액 등의 액체를 흡수시키기 위해 설치된다. 본 발명에 있어서, 흡수부(5)는 예를 들어 유리 섬유, 펄프, 셀룰로오스 파이버 등, 또는 그들 부직포에 아크릴산 중합체 등의 고분자, 에틸렌옥시드기 등을 갖는 친수성 약제를 함유시킨 것이 사용되고, 특히 바람직하게는 유리 섬유이다.
배킹 시트(6)는 기재이다. 편면에 점착제를 도포하거나, 점착 테이프를 부착하거나 함으로써, 편면이 점착성을 가지고, 해당 점착면 상에 시료 첨가부(1), 표지 물질 유지부(2), 크로마토그래프 매체부(3), 검출부(4) 및 흡수부(5)의 일부 또는 전부가 밀착되어 설치되어 있다. 배킹 시트(6)는, 점착제에 의해 시료액에 대하여 불투과성, 비투습성이 되는 것이면, 기재로서는 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 면역 크로마토그래피 분석 장치는, 제품화하기 전에 통상적으로 건조 처리에 실시된다. 건조 온도는 예를 들어 20℃ 내지 50℃, 건조 시간은 0.5시간 내지 1시간이다.
본 발명의 면역 크로마토그래피 분석 장치에 있어서, 표지 물질 유지부 및 검출부의 적어도 한쪽은, 지카 바이러스의 NS1의 전체 아미노산 서열 중에 존재하는 서열 번호 2 내지 4로 표시되는 3개의 아미노산 서열 중, 적어도 하나의 아미노산 서열을 인식하는 항체를 함유하는 것이 바람직하다. 상기 아미노산 서열의 적어도 하나를 인식하는 항체를 사용함으로써, 다른 항원과의 교차 반응을 보다 저감시킬 수 있어, 지카 바이러스를 보다 특이적으로 검출할 수 있다.
이 때, 표지 물질 유지부 및 검출부의 한쪽만이, 지카 바이러스의 NS1의 전체 아미노산 서열 중에 존재하는 서열 번호 2 내지 4로 표시되는 3개의 아미노산 서열 중, 적어도 하나의 아미노산 서열을 인식하는 항체를 함유한다고 해도, 표지 물질 유지부 및 검출부 중 상기 항체를 함유하지 않는 쪽은, 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 어느 아미노산 서열을 인식하는 항체를 함유하면 된다.
보다 바람직하게는, 표지 물질 유지부 및 검출부가 모두, 지카 바이러스의 NS1의 전체 아미노산 서열 중에 존재하는 서열 번호 2 내지 4로 표시되는 3개의 아미노산 서열 중, 적어도 하나의 아미노산 서열을 인식하는 항체를 함유하는 경우이다.
또한, 표지 물질 유지부 및 검출부가 함유하는 항체의 모두가, 지카 바이러스의 NS1의 전체 아미노산 서열 중에 존재하는 서열 번호 2 내지 4로 표시되는 3개의 아미노산 서열 중, 적어도 하나의 아미노산 서열을 인식하는 항체이며, 또한 표지 물질 유지부 및 검출부가 함유하는 상기 항체의 양쪽 모두 동일한 서열 번호로 표시되는 아미노산 서열을 인식하는 항체여도 된다. 이 경우, 표지 물질 유지부가 함유하는 항체와 검출부가 함유하는 항체는, 동일한 서열 번호로 표시되는 아미노산 서열 중에서, 상이한 개소의 아미노산 서열과 결합하게 된다고 추측된다.
본 발명의 면역 크로마토그래피 분석 장치는, 검체 중에 존재하는 지카 바이러스를 검출하는 것임과 동시에, 검체 중에 존재하는 지카 바이러스에 대한 항체(인간 IgM 및/또는 인간 IgG)를 검출할 수 있도록, 이하에 설명하는 바와 같이 장치를 설계할 수도 있다.
본 발명의 면역 크로마토그래피 분석 장치에 있어서, 표지 물질 유지부(2)에는, 지카 바이러스의 NS1을 인식하는 항체 이외에도, 별도로 검체 중에 존재하는 항체(인간 IgM 및/또는 인간 IgG)를 인식하는 항체를 함유시킨다.
이 경우, 또한 상기 크로마토그래프 매체부(3) 상에, 서열 번호 1로 표시되는 지카 바이러스의 NS1의 전체 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 1개 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 또는 이들 펩티드에 다른 단백질 등을 부가한 펩티드 등을 함유하는 검출부를, 상술한 검출부(4)와는 별도로 설치한다. 바람직하게는, 상술한 서열 번호 2 내지 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드의 적어도 1종의 펩티드, 또는 서열 번호 2 내지 4로 표시되는 아미노산 서열의 1개 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 또는 이들 펩티드에 다른 단백질 등을 부가한 펩티드의 적어도 1종의 펩티드를 함유하는 검출부를, 상술한 검출부(4)와는 별도로 설치한다.
면역 크로마토그래피 분석 장치가 이와 같은 구성을 가짐으로써, 검체 중에 존재하는 지카 바이러스에 대한 항체를 검출하는 것도 가능해진다.
이것은, 예를 들어 지카 바이러스 감염자로부터 채취한 혈액 등을 검체로 한 경우, 당해 검체 중에 포함되는 지카 바이러스의 NS1을 인식하는 항체(인간 IgM 및/또는 인간 IgG)를, 표지 물질 유지부(2)가 함유하는 인간 IgM 및/또는 인간 IgG를 인식하는 항체에 인식시키고, 또한 크로마토그래프 매체부(3) 상에 검출부(4)와는 별도로 설치된 상기 검출부가 함유하는 상기 펩티드에, 상기 인간 IgM 및/또는 인간 IgG를 인식하는 항체가 결합함으로써, 검체 중에 존재하는 지카 바이러스에 대한 항체를 검출할 수 있다는 것이다.
이와 같이, 상기 면역 크로마토그래피 분석 장치에 의하면, 검체 중에 존재하는 지카 바이러스를 직접 검출할 수 있음과 동시에, 검체 중에 존재하는 지카 바이러스에 대한 항체(인간 IgM 및/또는 인간 IgG)를 검출함으로써 간접적으로도 지카 바이러스 감염을 감별할 수 있다.
검체 중에 존재하는 지카 바이러스와 그것에 대한 항체의 비율은, 지카 바이러스에 감염되고 난 후의 일수 등에도 의존하기 때문에, 양자를 동시에 검출함으로써, 지카 바이러스 감염으로부터의 경과 일수를 대략 추정하는 것이 가능하다.
또한, 상술한 바와 같이, 표지 물질 유지부가 지카 바이러스의 NS1을 인식하는 항체와 지카 바이러스에 대한 항체를 인식하는 항체를 양쪽 모두 함유하는 경우, 각각의 항체는, 양쪽 항체가 서로 반응하여 응집되지 않는 항체를 선택하는 것이 바람직하다. 양쪽 항체가 서로 반응하여 응집되는 경우에는, 표지 물질 유지부부터 검출부에 이르기까지 양쪽 항체가 접촉되지 않도록, 본 장치를 임의로 설계하면 된다.
<면역 크로마토그래피 분석 키트>
본 발명의 면역 크로마토그래피 분석 키트는, 상기 면역 크로마토그래피 분석 장치와, 검체를 희석하여 전개하기 위한 검체 희석액을 포함한다.
본 발명의 면역 크로마토그래피 분석 키트에 있어서, 검체 희석액은 전개액으로서도 사용할 수 있는 것이다. 검체 희석액은 통상 용매로서 물을 사용하고, 이것에 완충액, 염 및 비이온성 계면 활성제를 함유한다. 또한, 예를 들어 항원 항체 반응의 촉진 또는 비특이적 반응을 억제하기 위한 단백질, 고분자 화합물(PVP 등), 이온성 계면 활성제 또는 폴리 음이온, 또는 항균제, 킬레이트제 등의 1종 또는 2종 이상을 첨가해도 된다.
검체 희석액을 전개액으로서 사용하는 경우에는, 검체와 전개액을 미리 혼합한 것을 시료로 하여, 시료 첨가부에 공급·첨가하여 전개시킬 수도 있고, 먼저 검체를 함유하는 시료를 시료 첨가부에 공급·첨가한 후, 전개액을 시료 첨가부에 공급·첨가하여 전개시켜도 된다.
<면역 크로마토그래피 분석 방법>
본 발명의 면역 크로마토그래피 분석 방법은 이하의 공정 (1) 내지 (4)를 포함하고, 상기 면역 크로마토그래피 분석 키트를 사용하여 검체에 포함되는 지카 바이러스를 검출한다.
(1) 검체 희석액에 의해 검체를 희석한 검체 함유액을 시료로 하여, 시료 첨가부에 첨가하는 공정
(2) 표지 물질 유지부에 유지되어 있는 지카 바이러스의 비구조성 단백인 NS1을 인식하는 항체에 의해, 검체 중의 지카 바이러스를 인식시키는 공정
(3) 상기 검체 및 상기 항체를 이동상으로 하여 크로마토그래프 매체부에 전개시키는 공정
(4) 전개된 상기 이동상 중의 지카 바이러스를, 검출부에 포함되는 지카 바이러스의 비구조성 단백질인 NS1을 인식하는 항체에 의해 검출하는 공정
각 공정에 대하여 이하에 설명한다.
(1) 검체 희석액에 의해 검체를 희석한 검체 함유액을 시료로 하여, 시료 첨가부에 첨가하는 공정
공정 (1)에서는, 첫째로, 검체를, 측정 정밀도를 저하시키지 않고, 면역 크로마토그래피 그래프 매체 중을 원활하게 이동하는 정도의 농도로, 검체 희석액으로 조정 또는 희석하여 검체 함유액으로 하는 것이 바람직하다. 검체 희석액은 상술한 것을 사용할 수 있다. 둘째로, 검체 함유액을 시료로 하여, 시료 첨가부(1) 상에 소정량(통상, 0.1ml 내지 2ml) 첨가한다. 시료가 시료 첨가부(1)에 첨가되면, 시료 첨가부(1) 중에서 이동을 개시한다.
본 발명에 있어서 사용하는 검체는, 상술한 바와 같이, 피검출 물질인 지카 바이러스를 포함할 가능성이 있는 것이며, 구체적으로는, 지카 바이러스에 감염된 환자의, 혈청, 혈장, 전혈, 정액, 골수액 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
(2) 표지 물질 유지부에 유지되어 있는 지카 바이러스의 비구조성 단백인 NS1을 인식하는 항체에 의해, 검체 중의 지카 바이러스를 인식시키는 공정
공정 (2)는, 공정 (1)에 있어서 시료 첨가부에 첨가된 시료를, 표지 물질 유지부(2)로 이동시켜, 표지 물질 유지부에 유지되어 있는, 표지 물질이 결합된 지카 바이러스의 NS1을 인식하는 항체에 의해, 검체 중의 피검출 물질인 지카 바이러스를 인식시키는 공정이다. 표지 물질은 상술한 것을 사용할 수 있다.
(3) 상기 검체 및 상기 항체를 이동상으로 하여 크로마토그래프 매체부에 전개시키는 공정
공정 (3)은, 공정 (2)에 있어서 피검출 물질인 지카 바이러스가 표지 물질 유지부에 있어서 표지 물질이 결합된 지카 바이러스의 NS1을 인식하는 항체에 인식된 후, 검체 및 상기 항체를, 크로마토그래프 매체부 상을 이동상으로서 통과시키는 공정이다.
(4) 전개된 상기 이동상 중의 지카 바이러스를, 검출부에 포함되는 지카 바이러스의 비구조성 단백질인 NS1을 인식하는 항체에 의해 검출하는 공정
공정 (4)는, 크로마토그래프 매체부 상을 이동상으로서 통과한 검체 중의 지카 바이러스가, 항원·항체의 특이적 결합 반응에 의해, 검출부에 고정되어 있는 지카 바이러스의 NS1을 인식하는 항체와, 상기 공정 (2)에 있어서 표지 물질이 결합된 지카 바이러스의 NS1을 인식하는 항체에 의해 샌드위치상으로 끼워지도록 특이적으로 결합하여, 검출부가 착색되는 공정이다.
피검출 물질인 지카 바이러스가 존재하지 않는 경우에는, 시료의 수분에 용해된 표지 시약은, 크로마토그래프 매체부 상의 검출부를 통과해도 특이적 결합 반응이 일어나지 않으므로, 검출부가 착색되지 않는다.
마지막으로, 검체 함유액 내의 수분은 흡수부(5)로 이동한다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 의해 재차 설명하지만, 본 발명이 하기 예에 제한되는 것은 아니다.
제조예 1(항체의 제작)
지카 바이러스의 NS1을 인식하는 항체를 이하와 같이 제작하였다.
먼저, 서열 번호 1로 표시되는 지카 바이러스의 NS1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 합성하였다. His-tag 발현용 벡터인 pET302/NT-His를 제한 효소 EcoRI로 절단한 후, 탈인산화 처리로서 알칼리 포스파타아제에 의해 처리하여, 상기 펩티드와 혼합하고, DNA Ligation Kit Ver.2(다카라 바이오)를 사용하여 라이게이션 반응을 행하였다.
목적 유전자를 조합한 재조합 NS1 플라스미드를 재조합 단백 발현용 숙주 E. coli BL(DE3)pLysS(Novagen)에 도입하였다. 도입균을 LB 한천 평판 배지에서 배양하고, 얻어진 콜로니를 LB 액체 배지에서 배양하였다. 또한 1mM IPTG(다카라 바이오)를 첨가하여 재조합 NS1의 발현을 유도한 후, E. coli를 회수하였다. 회수한 균을 가용화 버퍼[0.5％ TrironX-100(sigma), 10mM Imidazole(이미다졸), 20mM Phosphate(포스페이트) 및 0.5M NaCl(pH 7.4)(Amersham)]에 재부유시키고, 초음파 처리에 의해 가용화한 후, 재조합 NS1을 His trap Kit(Amersham)를 사용하여 정제하였다. 이 정제 단백질을 인산 완충 생리 식염수(이하, PBS라고 칭함)에 대하여 투석하고, 목적으로 하는 재조합 NS1로 하였다.
얻어진 재조합 NS1을 면역용 항원으로 하여, 재조합 NS1에 대한 모노클로날 항체를 제작하였다. 모노클로날 항체의 제작은 다음과 같이 통상법에 따라서 행하였다. 100μg의 재조합 NS1과 등량의 Adjuvant Complete Freund(Difco)를 혼합하고, 마우스(BALB/c, 5주령, 닛본 SLC)에 3회 면역시키고, 그 비장 세포를 세포 융합에 사용하였다. 세포 융합에는, 마우스의 골수종 세포인 Sp2/0-Ag14 세포(Shulman 등, 1978)를 사용하였다. 세포의 배양에는, Dulbecco's Modified Eagle Medium(Gibco)에 L-글루타민 0.3mg/ml, 페니실린 G 칼륨 100단위/ml, 황산 스트렙토마이신 100μg/ml, Gentacin 40μg/ml를 첨가하고(DMEM), 이것에 소태아 혈청(JRH)을 10％가 되도록 첨가한 배양액을 사용하였다. 세포 융합은, 면역 마우스의 비장 세포와 Sp2/0-Ag14 세포를 혼합하고, 거기에 Polyethylene glycol solution(폴리에틸렌 글리콜 용액)(Sigma)을 첨가함으로써 행하였다. 융합 세포는 HAT-DMEM[0.1mM Sodium Hypoxantine(나트륨 하이포잔틴), 0.4μM Aminopterin(아미노프테린) 및 0.016mM Thymidine(티미딘)(Gibco)을 포함하는 혈청 첨가 DMEM]에서 배양하고, 효소 결합 항체법(ELISA)에 의해 배양 상청 중의 항체 산생을 확인하였다. 항체 산생 양성의 세포를 HT-DMEM[0.1mM Sodium Hypoxantine 및 0.16mM Thymidine을 포함하는 혈청 첨가 DMEM]에서 배양하고, 또한 혈청 첨가 DMEM에서 배양을 계속하였다.
클로닝한 세포는, 2,6,10,14-Tetramethylpentadecane(테트라메틸펜타데칸)(Sigma)을 접종해 둔 마우스(BALB/c, 리타이어, 닛본 SLC)에 복강 내 접종하고, 복수를 채취하였다. 이 복수를 단백질 G 칼럼에 제공하고, 모노클로날 항체를 정제하였다.
이와 같이 하여 얻어진 모노클로날 항체에 대하여, 재조합 NS1을 96웰 플레이트에 고정화한 직접 ELISA법으로 항체를 스크리닝하였다.
그 결과, 지카 바이러스의 NS1을 인식하는 3종류의 항체가 얻어졌다. 이하 이 3종류의 항체를 No.1 내지 No.3의 항체로 하여 설명한다.
참고예 1(ELISA 시험)
제조예 1에서 제작한 지카 바이러스의 NS1을 인식하는 각 항체(No.1 내지 No.3의 항체)가, 서열 번호 2 내지 4로 표시되는 3개의 아미노산 서열 중, 적어도 하나의 아미노산 서열을 인식하는지 여부에 대해서, ELISA 시험을 행함으로써 조사하였다. ELISA 시험에서 사용한 펩티드는, 서열 번호 2 내지 4로 표시되는 아미노산 서열 각각을 포함하는 펩티드 3종류(하기에 나타내는 펩티드 1 내지 3)이며, 펩티드의 화학 합성법의 통상적인 방법인 펩티드 고상 합성법에 의해 제작하였다.
펩티드 1: ENGVQLTVVV GSVKNPMWRG PQRLPVPVNE LPHGWKAWGK(서열 번호 2)
펩티드 2: SYFVRAAKTN NSFVVDGDTL KECPLEHRAW NSF(서열 번호 3)
펩티드 3: GP LSHHNTREGY RTQVKGPWHS EELEIRFEEC PGTKVYV(서열 번호 4)
먼저, Nunc Immuno modules(Thermo Fisher Scientific사제, 코드 469949) ELISA용 96웰 플레이트에, 상기 펩티드 1 내지 3의 혼합물(이하, 혼합 펩티드라고 함)을 100ng/mL의 농도로 고정화하였다.
1차 항체로서, 상기 제작한 No.1 내지 No.3의 각 항체 용액(1μg/mL) 100μL를 각각 개개의 웰에 첨가하여 37℃에서 1시간 인큐베이트한 후, 1차 항체 용액을 제거하고, 웰을 300μL PBST(PBS 중 0.05％ Tween20)로 3회 워시하였다. 그 후 1％ BSA 용액 100μL를 웰에 첨가하고, 7℃에서 1.5시간 인큐베이트하였다. 그 후 BSA 용액을 제거하고, 웰을 300μL PBST(PBS 중 0.05％ Tween20)로 3회 워시하고, 웰에 남은 액은, 페이퍼 타올에 두드려 제거하였다.
2차 항체로서, Anti Mouse IgG(H+L), Rabbit, IgG Whole, Peroxidase Conjugated(와코 쥰야쿠사제, 코드 014-17611) 1mg/mL를 100μL, 웰에 첨가하고, 37℃에서 1.5시간 인큐베이트하였다. 그 후 2차 항체 용액을 제거하고, 웰을 300μL PBST(PBS 중 0.05％ Tween20)로 3회 워시하고, 웰에 남은 액은 페이퍼 타올에 두드려 제거하였다.
웰에 발색 기질로서 Sure Blue Reserve TMB Microwell Peroxidase Substrate(1-Component)(KPL사제, 코드 53-00-01)를 100μL 첨가하여, 15분 반응시키고, 2N 황산을 100μL 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 마이크로플레이트 리더(BIORAD사제)로 450nm의 흡광도를 측정하였다. 블랭크와 비교하여 반응이 보인 것을 +, 보이지 않은 것을 -로 하였다. 결과를 표 1에 나타낸다.
Figure pct00001
이 결과로부터, No.1 및 No.2의 항체는, 서열 번호 2 내지 4로 표시되는 3개의 아미노산 서열 중, 적어도 하나의 아미노산 서열을 인식하는 것을 알았다.
<실시예 1>
검체 희석액, 및 시료 첨가부(1)와, 표지 물질 유지부(2)와, 검출부(4)를 갖는 크로마토그래프 매체부(3)와, 흡수부(5)를 포함하는 면역 크로마토그래피 분석 장치를 포함하는 면역 크로마토그래피 분석 키트를 제작하였다.
또한, 표지 물질 유지부가 함유하는 항체에는, 상기에서 제작한 No.1의 항체를 사용하고, 검출부가 함유하는 항체에는, 상기에서 제작한 No.2의 항체를 사용하였다. 이하 상세하게 설명한다.
(1) 시료 첨가부의 제작
시료 첨가부로서 유리 섬유을 포함하는 부직포(밀리포어사제: 300mm×30mm)를 사용하였다.
(2) 표지 물질 유지부의 제작
금 콜로이드 현탁액(다나까 긴조꾸 고교사제: LC40nm) 0.5ml에, 인산 완충액(pH 7.4)으로 0.05mg/ml의 농도가 되도록 희석한 상기 No.1 항체를 0.1ml 첨가하고, 실온에서 10분간 정치하였다.
이어서, 1질량％의 소혈청 알부민(BSA)을 포함하는 인산 완충액(pH 7.4)을 0.1ml 첨가하고, 또한 실온에서 10분간 정치하였다. 그 후, 충분히 교반한 후, 8000×g으로 15분간 원심 분리를 행하고, 상청을 제거한 후, 1질량％의 BSA를 포함하는 인산 완충액(pH 7.4)을 0.1ml 첨가하였다. 이상의 수순으로 표지 물질 용액을 제작하였다.
상기 제작한 표지 물질 용액 300μL에, 300μL의 10질량％ 트레할로오스 수용액과 1.8mL의 증류수를 첨가한 것을 12mm×300mm의 유리 섬유 패드(밀리포어사제)에 균일해지게 첨가한 후, 진공 건조기에서 건조시켜, 표지 물질 유지부를 제작하였다.
(3) 크로마토그래프 매체부 및 검출부의 제작
멤브레인으로서 니트로셀룰로오스를 포함하는 시트(밀리포어사제, 상품명: HF120, 300mm×25mm)를 사용하였다.
이어서, 5질량％의 이소프로필알코올을 포함하는 인산 완충액(pH 7.4)으로 1.0mg/ml의 농도가 되도록, 상기 No.2 항체를 희석한 용액 150μL를, 건조된 멤브레인 상의 검출부에 1mm의 폭으로 면역 크로마토그래피용 디스펜서 「XYZ3050」(BIODOT사제)를 사용하여 1μL/mm의 양(1 시트당 25μL)으로 라인 형상으로 도포하였다.
또한, 금 나노 입자 표지 시약의 전개 유무나 전개 속도를 확인하기 위해 검출 부위의 하류에, 금 나노 입자 표지 물질과 넓게 친화성을 갖는 염소 유래 항혈청을 인산 완충액(pH 7.4)으로 희석한 액을 컨트롤 부위(컨트롤 라인)에 도포하였다. 그 후, 50℃에서 30분간 건조시키고, 실온에서 밤새 건조시켜, 크로마토그래프 매체부 및 검출부를 제작하였다.
(4) 면역 크로마토그래피 분석 장치의 제작
이어서, 배킹 시트를 포함하는 기재에, 시료 첨가부, 표지 물질 유지부, 검출부를 갖는 크로마토그래프 매체부, 전개된 시료나 표지 물질을 흡수하기 위한 흡수부로서 유리 섬유제 부직포를 순차로 접합시켰다. 그리고, 재단기로 폭이 5mm가 되도록 재단하고, 면역 크로마토그래피 분석 장치로 하였다. 또한, 표지 물질 유지부의 시료 전개 방향의 길이를 12mm로 하였다.
(5) 검체 희석액의 조제
1질량％의 비이온성 계면 활성제(나카라이테스크사제 NP-40과 니치유사제 노니뎃트 MN-811의 1:1 혼합물)를 포함하는 50mM의 HEPES 완충액(pH 7.5)을 조제하고, 검체를 희석 처리하기 위한 검체 희석액으로 하였다.
<실시예 2>
실시예 1에 있어서, 표지 물질 유지부가 함유하는 항체를, 상기 제작한 No.2의 항체로 하고, 검출부가 함유하는 항체를, 상기 제작한 No.1의 항체로 한 점을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 하여, 실시예 2의 면역 크로마토그래피 분석 키트를 제작하였다.
<실시예 3>
실시예 1에 있어서, 표지 물질 유지부가 함유하는 항체를, 상기 제작한 No.2의 항체로 한 점을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 하여, 실시예 3의 면역 크로마토그래피 분석 키트를 제작하였다.
<실시예 4>
실시예 2에 있어서, 표지 물질 유지부가 함유하는 항체를, 상기 제작한 No.3의 항체로 한 점을 제외하고는, 실시예 2와 동일하게 하여, 실시예 4의 면역 크로마토그래피 분석 키트를 제작하였다.
<실시예 5>
실시예 1에 있어서, 표지 물질 유지부가 함유하는 항체를, 상기 제작한 No.3의 항체로 한 점을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 하여, 실시예 5의 면역 크로마토그래피 분석 키트를 제작하였다.
시험예 1(지카 바이러스 NS1 재조합 항원을 사용한 측정)
본 시험에서는, 상기 제작한 실시예 1 내지 5의 면역 크로마토그래피 분석 키트를 사용하고, 지카 바이러스 NS1 재조합 항원을 검체로 하여 측정을 행하였다. 검체로서는, Zika Virus NS1 Recombinant Antigen(MeridianLife Science사제)을 사용하고, 농도가 5ng/mL, 또는 20ng/mL가 되게 검체 희석액으로 희석하여, 검체 함유액을 조제하고, 이것을 양성 검체 시료로 하였다.
상기 조제한 각검체 함유액 90μL를 면역 크로마토그래피 분석 장치의 시료 첨가부에 첨가하여 전개시키고, 15분 후에 테스트 라인을 눈으로 보아 확인하였다. 테스트 라인의 빨간선이 보다 강하게 발색된 것을 「+++」, 빨간선이 강하게 발색된 것을 「++」, 빨간선이 발색된 것을 「+」, 빨간선이 조금 발색된 것을 「±」, 빨간선을 눈으로 확인할 수 없는 것을 「-」로 하였다. 결과를 표 2에 나타낸다.
또한, 상기 양성 검체 대신에 PBS 및 인간 표준 혈청(Access Bio사제)을 사용한 음성 검체 시료를 제작하고, 동일한 시험을 행하였다. 결과를 표 2에 나타낸다.
Figure pct00002
이 결과, 지카 바이러스의 NS1을 인식하는 항체를 사용한 본 발명의 면역 크로마토그래피 분석 장치에 의하면, 검체 중의 지카 바이러스를 검출할 수 있음을 알았다. 특히, 표지 물질 유지부와 검출부에, 서열 번호 2 내지 4로 표시되는 3개의 아미노산 서열 중, 적어도 하나의 아미노산 서열을 인식하는 No.1 또는 No.2의 항체를 함유시킨 실시예 1 내지 3의 면역 크로마토그래피 분석 장치에서는, 보다 높은 감도로 지카 바이러스를 검출할 수 있음을 알았다.
시험예 2(불활성화된 지카 바이러스를 사용한 측정)
본 시험에서는, 상기 제작한 실시예 1 내지 4의 면역 크로마토그래피 분석 키트를 사용하고, 불활성화된 지카 바이러스를 검체로 하여 측정을 행하였다. 검체로서는, Zika virus Heat in activated virus(Zept Metrix사제, 원액 농도: TCID50=1×105.23U/mL)를 사용하고, 그 농도가 원액, 10배 희석, 100배 희석, 1000배 희석이 되게, 검체 희석액으로 희석하여, 검체 함유액을 조제하였다.
조제한 검체 함유액을 시료로 하여, 시험예 1과 동일하게 측정을 행하였다. 결과를 표 3에 나타낸다.
Figure pct00003
이 결과, 검체를 Zika Virus NS1 Recombinant Antigen으로서 양성 반응이 보인 실시예 1 내지 4의 면역 크로마토그래피 분석 키트에 대해서, 검체를 불활성화된 지카 바이러스로 한 경우에도, 동일하게 양성 반응을 나타냈다.
또한, 특히 표지 물질 유지부와 검출부에, 서열 번호 2 내지 4로 표시되는 3개의 아미노산 서열 중, 적어도 하나의 아미노산 서열을 인식하는 No.1 또는 No.2의 항체를 함유시킨 실시예 1 내지 3의 면역 크로마토그래피 분석 키트에서는, 보다 높은 감도로 불활성화된 지카 바이러스를 검출할 수 있음을 알았다.
시험예 3(뎅기 바이러스를 사용한 측정)
본 시험에서는, 상기 제작한 실시예 1 내지 4의 면역 크로마토그래피 분석 키트를 사용하고, 불활성화한 뎅기 바이러스를 검체로 하여 측정을 행하였다. 검체로서는, Dengue Virus type2 AbD(serotec사제)를 사용하고, 농도가 1×107pfu/mL가 되게 검체 희석액으로 희석하고, 검체 함유액을 조제하였다.
조제한 검체 함유액을 시료로 하여, 시험예 1과 동일하게 측정을 행하였다. 결과를 표 4에 나타낸다.
Figure pct00004
이 결과, 본 발명의 면역 크로마토그래피 분석 키트는, 지카 바이러스와 상동성이 높은 뎅기 바이러스에 대하여 교차 반응을 일으키지 않아, 지카 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있음을 알았다.
이상의 실시예의 결과에 의해, 지카 바이러스의 NS1을 인식하는 항체를 사용한 본 발명의 면역 크로마토그래피 분석 장치에 의하면, 검체 중의 지카 바이러스를 검출할 수 있음을 알았다. 특히, 표지 물질 유지부와 검출부에, 서열 번호 2 내지 4로 표시되는 3개의 아미노산 서열 중, 적어도 하나의 아미노산 서열을 인식하는 항체인, No.1 또는 No.2의 항체를 함유시킨 면역 크로마토그래피 분석 키트에서는, 특히 높은 감도로 지카 바이러스를 검출할 수 있음을 알았다.
또한, 지카 바이러스의 NS1을 인식하는 항체를 사용한 본 발명의 면역 크로마토그래피 분석 장치에 의하면, 지카 바이러스와 상동성이 높은 다른 바이러스에 대하여 교차 반응을 일으키지 않아, 지카 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있음을 알았다.
본 발명을 특정한 양태를 사용하여 상세하게 설명하였지만, 본 발명의 의도와 범위를 벗어나지 않고 각종 변경 및 변형이 가능한 것은, 당업자에 있어서 명확하다. 또한 본 출원은 2016년 5월 17일자로 출원된 일본 특허 출원(일본 특허 출원 제2016-098845호)에 기초하고 있으며, 그 전체가 인용에 의해 원용된다.
1 시료 첨가부
2 표지 물질 유지부
3 크로마토그래프 매체부
4 검출부
5 흡수부
6 배킹 시트
SEQUENCE LISTING <110> TANAKA KIKINZOKU KOGYO K.K. <120> IMMUNOCHROMATOGRAPHY ANALYSIS APPARATUS FOR DETECTING ZIKA VIRUS <130> W522652 <150> JP2016/098845 <151> 2016-5-17 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 352 <212> PRT <213> Zika Virus <400> 1 Asp Val Gly Cys Ser Val Asp Phe Ser Lys Lys Glu Thr Arg Cys Gly 1 5 10 15 Thr Gly Val Phe Ile Tyr Asn Asp Val Glu Ala Trp Arg Asp Arg Tyr 20 25 30 Lys Tyr His Pro Asp Ser Pro Arg Arg Leu Ala Ala Ala Val Lys Gln 35 40 45 Ala Trp Glu Glu Gly Ile Cys Gly Ile Ser Ser Val Ser Arg Met Glu 50 55 60 Asn Ile Met Trp Lys Ser Val Glu Gly Glu Leu Asn Ala Ile Leu Glu 65 70 75 80 Glu Asn Gly Val Gln Leu Thr Val Val Val Gly Ser Val Lys Asn Pro 85 90 95 Met Trp Arg Gly Pro Gln Arg Leu Pro Val Pro Val Asn Glu Leu Pro 100 105 110 His Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys Ser Tyr Phe Val Arg Ala Ala Lys 115 120 125 Thr Asn Asn Ser Phe Val Val Asp Gly Asp Thr Leu Lys Glu Cys Pro 130 135 140 Leu Glu His Arg Ala Trp Asn Ser Phe Leu Val Glu Asp His Gly Phe 145 150 155 160 Gly Val Phe His Thr Ser Val Trp Leu Lys Val Arg Glu Asp Tyr Ser 165 170 175 Leu Glu Cys Asp Pro Ala Val Ile Gly Thr Ala Val Lys Gly Arg Glu 180 185 190 Ala Ala His Ser Asp Leu Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Glu Lys Asn Asp 195 200 205 Thr Trp Arg Leu Lys Arg Ala His Leu Ile Glu Met Lys Thr Cys Glu 210 215 220 Trp Pro Lys Ser His Thr Leu Trp Thr Asp Gly Val Glu Glu Ser Asp 225 230 235 240 Leu Ile Ile Pro Lys Ser Leu Ala Gly Pro Leu Ser His His Asn Thr 245 250 255 Arg Glu Gly Tyr Arg Thr Gln Val Lys Gly Pro Trp His Ser Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ile Arg Phe Glu Glu Cys Pro Gly Thr Lys Val Tyr Val Glu 275 280 285 Glu Thr Cys Gly Thr Arg Gly Pro Ser Leu Arg Ser Thr Thr Ala Ser 290 295 300 Gly Arg Val Ile Glu Glu Trp Cys Cys Arg Glu Cys Thr Met Pro Pro 305 310 315 320 Leu Ser Phe Arg Ala Lys Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg 325 330 335 Pro Arg Lys Glu Pro Glu Ser Asn Leu Val Arg Ser Met Val Thr Ala 340 345 350 <210> 2 <211> 40 <212> PRT <213> Zika Virus <400> 2 Glu Asn Gly Val Gln Leu Thr Val Val Val Gly Ser Val Lys Asn Pro 1 5 10 15 Met Trp Arg Gly Pro Gln Arg Leu Pro Val Pro Val Asn Glu Leu Pro 20 25 30 His Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys 35 40 <210> 3 <211> 33 <212> PRT <213> Zika Virus <400> 3 Ser Tyr Phe Val Arg Ala Ala Lys Thr Asn Asn Ser Phe Val Val Asp 1 5 10 15 Gly Asp Thr Leu Lys Glu Cys Pro Leu Glu His Arg Ala Trp Asn Ser 20 25 30 Phe <210> 4 <211> 39 <212> PRT <213> Zika Virus <400> 4 Gly Pro Leu Ser His His Asn Thr Arg Glu Gly Tyr Arg Thr Gln Val 1 5 10 15 Lys Gly Pro Trp His Ser Glu Glu Leu Glu Ile Arg Phe Glu Glu Cys 20 25 30 Pro Gly Thr Lys Val Tyr Val 35 <210> 5 <211> 30 <212> PRT <213> Zika Virus <400> 5 Cys Gly Thr Arg Gly Pro Ser Leu Arg Ser Thr Thr Ala Ser Gly Arg 1 5 10 15 Val Ile Glu Glu Trp Cys Cys Arg Glu Cys Thr Met Pro Pro 20 25 30 <210> 6 <211> 380 <212> PRT <213> Dengue Virus <400> 6 Met Asn Ser Arg Ser Thr Ser Leu Ser Val Ser Leu Val Leu Val Gly 1 5 10 15 Val Val Thr Leu Tyr Leu Gly Val Met Val Gln Ala Asp Ser Gly Cys 20 25 30 Val Val Ser Trp Lys Asn Lys Glu Leu Lys Cys Gly Ser Gly Ile Phe 35 40 45 Ile Thr Asp Asn Val His Thr Trp Thr Glu Gln Tyr Lys Phe Gln Pro 50 55 60 Glu Ser Pro Ser Lys Leu Ala Ser Ala Ile Gln Lys Ala His Glu Glu 65 70 75 80 Gly Ile Cys Gly Ile Arg Ser Val Thr Arg Leu Glu Asn Leu Met Trp 85 90 95 Lys Gln Ile Thr Pro Glu Leu Asn His Ile Leu Ser Glu Asn Glu Val 100 105 110 Lys Leu Thr Ile Met Thr Gly Asp Ile Lys Gly Ile Met Gln Ala Gly 115 120 125 Lys Arg Ser Leu Gln Pro Gln Pro Thr Glu Leu Lys Tyr Ser Trp Lys 130 135 140 Thr Trp Gly Lys Ala Lys Met Leu Ser Thr Glu Ser His Asn Gln Thr 145 150 155 160 Phe Leu Ile Asp Gly Pro Glu Thr Ala Glu Cys Pro Asn Thr Asn Arg 165 170 175 Ala Trp Asn Ser Leu Glu Val Glu Asp Tyr Gly Phe Gly Val Phe Thr 180 185 190 Thr Asn Ile Trp Leu Lys Leu Arg Glu Lys Gln Asp Val Phe Cys Asp 195 200 205 Ser Lys Leu Met Ser Ala Ala Ile Lys Asp Asn Arg Ala Val His Ala 210 215 220 Asp Met Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Ala Leu Asn Asp Thr Trp Lys Ile 225 230 235 240 Glu Lys Ala Ser Phe Ile Glu Val Lys Ser Cys His Trp Pro Lys Ser 245 250 255 His Thr Leu Trp Ser Asn Gly Val Leu Glu Ser Glu Met Ile Ile Pro 260 265 270 Lys Asn Phe Ala Gly Pro Val Ser Gln His Asn Tyr Arg Pro Gly Tyr 275 280 285 His Thr Gln Thr Ala Gly Pro Trp His Leu Gly Lys Leu Glu Met Asp 290 295 300 Phe Asp Phe Cys Glu Gly Thr Thr Val Val Val Thr Glu Asp Cys Gly 305 310 315 320 Asn Arg Gly Pro Ser Leu Arg Thr Thr Thr Ala Ser Gly Lys Leu Ile 325 330 335 Thr Glu Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Leu Pro Pro Leu Arg Tyr Arg 340 345 350 Gly Glu Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg Pro Leu Lys Glu 355 360 365 Lys Glu Glu Asn Leu Val Asn Ser Leu Val Thr Ala 370 375 380

Claims (5)

  1. 시료 첨가부와, 표지 물질 유지부와, 검출부를 갖는 크로마토그래프 매체부와, 흡수부를 포함하는, 검체 중의 지카 바이러스를 검출하기 위한 면역 크로마토그래피 분석 장치이며,
    상기 표지 물질 유지부 및 상기 검출부가, 서열 번호 1로 표시되는 지카 바이러스의 비구조성 단백질인 NS1을 인식하는 항체를 함유하는 면역 크로마토그래피 분석 장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 표지 물질 유지부 및 상기 검출부의 적어도 한쪽이, 상기 비구조성 단백질인 NS1의 전체 아미노산 서열 중에 존재하는 서열 번호 2 내지 4로 표시되는 3개의 아미노산 서열 중, 적어도 하나의 아미노산 서열을 인식하는 항체를 함유하는 면역 크로마토그래피 분석 장치.
  3. 제2항에 있어서, 상기 표지 물질 유지부 및 상기 검출부가, 상기 비구조성 단백질인 NS1의 전체 아미노산 서열 중에 존재하는 서열 번호 2 내지 4로 표시되는 3개의 아미노산 서열 중, 적어도 하나의 아미노산 서열을 인식하는 항체를 함유하는 면역 크로마토그래피 분석 장치.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 면역 크로마토그래피 분석 장치와, 검체를 희석하여 전개하기 위한 검체 희석액을 포함하는 면역 크로마토그래피 분석 키트.
  5. 제4항에 기재된 면역 크로마토그래피 분석 키트를 사용하여, 검체 중의 지카 바이러스를 검출하는 면역 크로마토그래피 분석 방법이며, 이하의 공정 (1) 내지 (4)를 포함하는 면역 크로마토그래피 분석 방법.
    (1) 검체 희석액에 의해 검체를 희석한 검체 함유액을 시료로 하여, 시료 첨가부에 첨가하는 공정
    (2) 표지 물질 유지부에 유지되어 있는 지카 바이러스의 비구조성 단백인 NS1을 인식하는 항체에 의해, 검체 중의 지카 바이러스를 인식시키는 공정
    (3) 상기 검체 및 상기 항체를 이동상으로 하여 크로마토그래프 매체부에 전개시키는 공정
    (4) 전개된 상기 이동상 중의 지카 바이러스를, 검출부에 포함되는 지카 바이러스의 비구조성 단백질인 NS1을 인식하는 항체에 의해 검출하는 공정
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