CN1566342B - Sars冠状病毒的s蛋白的抗原表位、其抗体、编码核酸以及含有它们的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开用于治疗和诊断SARS组合物和方法。说明性组合物含有一种或多种SARS肽、编码这些肽的多核苷酸、抗体、表达这些肽的抗原递呈细胞，和对于表达这些肽的细胞特异的T细胞。这些公开的组合物可以例如用于诊断、预防和/或治疗疾病SARS。

Description

SARS冠状病毒的S蛋白的抗原表位、其抗体、编码核酸以及含有它们的组合物

技术领域

本发明涉及新的SARS冠状病毒抗原表位、它的抗体及其抗原结合片断、编码它的核酸、含有它们的药物组合物，诊断和治疗SARS及相关疾病的方法。

背景技术

SARS的病原学

重症急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)是一种急性呼吸道传染病，主要通过近距离空气飞沫和密切接触传播，起病急、传染性强、流行面广、病情严重，病死率高达15％。严重危害到人类的身心健康，并对社会经济造成了很大的损害。2003年全世界范围爆发的SARS发病人数高达8000人左右。WHO于2003年4月16日正式宣布引起SARS的病原体为冠状病毒属中新出现的一种新的病毒，并命名为SARS冠状病毒(SARS-coV)。

SARS冠状病毒的简介

1.SARS-coV概述

SARS  冠状病毒属于巢状病毒目(Order：Nidovirales)，冠病毒科(Family：Cooronaviridae)，冠状病毒属(Genus：Coronavirus)，SARS冠状病毒种(Species：SARS Coronavirus)。根据其基因组结构分类，它属于单链正义RNA病毒[(+)sense，ssRNA Virus]。

2.SARS-coV蛋白质

蛋白质是病毒的一类主要成份，蛋白质的组成氨基酸及顺序决定病毒株系的差异，抗原决定簇则决定其免疫特异性。病毒的蛋白质根据是否存在于病毒颗粒中，分为结构蛋白和非结构蛋白。非结构蛋白指由病毒基因组编码的，在病毒复制或基因表达调控过程中具有一定功能，但不构成病毒颗粒结构的蛋白质。结构蛋白系指构成一个形态成熟的有感染性的病毒颗粒所必需的蛋白质。包括壳体蛋白、包膜蛋白和毒粒酶等。SARS病毒包膜有主要三种糖蛋白，即S蛋白(spike protein)、M蛋白(Membrane protein)和E蛋白(Envelope protein)。

3.S蛋白(spike protein)

S蛋白即病毒颗粒表面伸出包膜的棒-球形糖蛋白。它在与宿主细胞的表面受体结合并介导膜融合进入细胞的过程中起关键作用，也是冠状病毒主要的抗原蛋白。S蛋白由两个结构域组成。靠近N端的部分形成一个球状结构域，靠近C端的部分形成一个穿膜的棒状结构。对已知的冠状病毒的研究已经证明S蛋白与冠状病毒侵入细胞的过程密切相关。细胞中S蛋白前体合成后被切成两个部分S1和S2。其中S1形成成熟蛋白的球状部分，S2形成成熟蛋白的棒状部分。S2包括一个N螺旋，一个M螺旋，一个C螺旋和一个穿膜部分。S1和S2之间通过分子间作用力相互结合。S2的穿膜部分把整个蛋白固定在病毒外壳膜上。冠状病毒的S蛋白长度为1255个氨基酸，是结构蛋白区编码的最大的蛋白质。穿膜区预测发现在1197-1218位氨基酸处有一段穿膜序列，推测可能就是蛋白和病毒外壳膜结合的位置。二级结构预测发现，在约729-770，879-1016，1164-1185位氨基酸处分别可能为S2中的N/M/C螺旋。信号肽预测发现，N端1-13位氨基酸可能为信号肽序列。

对冠状病毒科中的鼠肝炎病毒的侵染过程研究表明：病毒要侵入宿主需要细胞表面受体的介导，参与受体识别的特定位点位于蛋白S1球状部分的内部。当S1通过受体结合位点和宿主细胞膜受体结合后，导致S1和S2蛋白之间的分子间结合力减弱，S1和S2分离，从而暴露S2上的3个螺旋，穿过宿主细胞膜，使病毒外壳膜和宿主细胞膜发生融合。S1和S2之间结合力的强弱是影响冠状病毒侵染性强弱的重要因素之一。

过强自身免疫反应是目前认为最有可能解释冠状病毒引起急性肺损伤的机制。冠状病毒所具有的结构蛋白和5个全新的未知的蛋白进入机体后不能为机体已有的抗体有效结合，导致机体内异体蛋白持续存在，刺激机体发生过度的免疫反应，释出多种大量炎性因子，快速、大规模的破坏肺组织结构，引起急性肺损伤，导致急性呼吸综合症。对病毒感染注射疫苗是最好的预防方法。SARS病人的治疗方法目前正处于研究阶段，如RNA干涉，反义核酸，抗病毒肽，治疗性抗体，肽酶抑制剂等。

SARS-coV抗原表位的研究

抗原表位(epitope)，又称抗原决定簇(antigenic determinant)，是抗原性物质表面诱导相应抗体并与之结合的决定该抗原特异性的特殊化学基团。抗原表位是免疫应答和免疫反应特异性的物质基础。可分为顺序决定簇(连续决定簇)和构象决定簇(不连续决定簇)。抗原表位是抗原中诱生特异性免疫应答的最基本的结构和功能单位，通常8-15个氨基酸大小。

迄今为止，尚未有关于SARS-coV抗原表位的报道，也没有诊断或治疗SARS的有效试剂或药物。

发明内容

本发明涉及一种分离的多核苷酸，其含有选自下列组的序列：

(a)SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16或18所示的核苷酸序列；

(b)编码SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15或17所示氨基酸序列的核苷酸序列；

(c)在中度严紧或高严紧条件下可与(a)或(b)的序列杂交的序列，并基本保持(a)或(b)序列的活性；

(d)(a)或(b)的序列的变体序列，其中含有一个或多个插入、缺失、添加、或替代，并基本保持(a)或(b)序列的活性；

(e)与(a)或(b)的序列有至少约75％同一性的序列；

(f)与(a)或(b)的序列有至少约90％同一性的序列；

(g)(a)或(b)的序列的简并变体；和

(h)以上序列的互补序列。

本发明还涉及一种分离的肽，其含有选自下列组的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15或17所示氨基酸序列；

(b)本发明的多核苷酸编码的序列；

(c)与本发明的多核苷酸编码的氨基酸序列有至少约70％同一性的序列；

(d)与本发明的多核苷酸编码的氨基酸序列有至少约90％同一性的序列；和

(e)(a)序列的含有一个或多个氨基酸插入、缺失、替代、添加并基本保持其活性的变体。

本发明还涉及表达载体，包含可操作地与表达控制序列连接的本发明的多核苷酸。

本发明还涉及用根据本发明的表达载体转化或转染的宿主细胞，例如原核细胞(包括大肠杆菌细胞)和真核细胞(如酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞)

本发明还涉及分离的抗体、或其抗原结合片断，其特异地与本发明的肽结合。

本发明还涉及本发明的肽的衍生物、聚合物、串联体或环化结构，或包含至少一种根据本发明的肽的融合蛋白。

本发明还涉及与本发明的肽结合的核酸适配子，例如oligobody。

本发明还涉及检测患者是否患有SARS的方法，包括步骤：

(a)从患者得到生物学样品；

(b)用可结合本发明的肽的结合剂接触此生物学样品；

(c)检测样品中与该结合剂结合的肽的量；和

(d)将此肽量与预先确定的截断值进行比较，由此确定患者是否患有SARS。

本发明还涉及一种诊断试剂盒，其含有：

(a)本发明的多核苷酸；

(b)与本发明的多核苷酸在中等严紧或高严紧条件下杂交的多核苷酸；

(c)本发明的肽；

(d)本发明肽的衍生物、聚合物、串连体或环化结构；

(e)本发明的融合蛋白；或

(f)与本发明的肽结合的结合剂。

本发明还涉及检测患者是否患有SARS的方法，其特征在于使用了本发明诊断试剂盒。

本发明还涉及刺激和/或扩增特异针对病毒蛋白的T细胞的方法，包括在足以允许T细胞得到刺激和/或扩增的条件和时间下用至少一个选自下列的成分接触T细胞：

(a)本发明的多核苷酸；

(b)本发明的肽或融合蛋白；

(c)本发明的肽的衍生物、聚合物、串连体或环化结构；

(d)表达本发明的肽的抗原呈递细胞。

本发明还涉及分离的T细胞群，包含根据本发明的方法制备的T细胞。

本发明还涉及组合物，包含选自可药用载体和免疫刺激剂的第一成分，和选自如下的第二成分：

(a)本发明的多核苷酸；

(b)本发明的肽；

(c)本发明的肽的衍生物、聚合物、串连体或环化结构；

(d)本发明的抗体；

(e)本发明的融合蛋白；

(f)本发明的T细胞群；和

(g)表达本发明的肽的抗原呈递细胞。

优选地，所述组合物是喷鼻、喷口、滴眼及雾化吸入用药的形式。

本发明还涉及刺激患者免疫应答的方法，包括给患者施用本发明的组合物。

本发明还涉及为患者治疗SARS冠状病毒感染或SARS的方法，包括给患者施用治疗有效量的本发明核酸的反义核酸、本发明的肽或其衍生物、聚合物、串联体或环化结构、本发明的抗体或其抗原结合片断、本发明的核酸适配子、T细胞群或本发明的组合物。

本发明还涉及确定患者是否被SARS冠状病毒感染或患有SARS的方法，包括步骤：

(a)从患者得到生物学样品；

(b)用本发明多核苷酸接触此生物学样品；

(c)检测样品中与该寡核苷酸杂交的多核苷酸的量；和

(d)将与该多核苷酸杂交的多核苷酸的量与预先确定的截断值进行比较，由此确定患者是否患有SARS。

本发明还涉及抑制患者体内SARS冠状病毒感染或SARS发展的方法，包括步骤：

(a)将分离自患者的CD4+和/或CD8+T细胞与至少一种选自如下的成分一起孵育：(i)本发明的多核苷酸；(ii)本发明的肽；和(iii)表达本发明的肽的抗原呈递细胞，使得T细胞增殖；

(b)给患者施用有效量的此增殖的T细胞，

由此抑制患者体内SARS的发展。

本发明还涉及含有SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15和/或17所示氨基酸序列的SARS冠状病毒S蛋白，或其含有一个或多个氨基酸插入、缺失、替代、添加并基本保持其活性的变体。

本发明还涉及编码上述蛋白的多核苷酸序列，或其含有一个或多个核苷酸插入、缺失、替代、添加并基本保持其活性的变体。

具体实施方式

本发明人利用Geysen HM等((1984)Proc Natl Acad Sci U.S.A.81：3998)多中心同步多肽合成(Simultaneous multipin peptide synthesis)技术按照SARS冠状病毒的S蛋白的1255个氨基酸全序列由第n至第(n+9)号氨基酸顺序合成1246个十肽片段，建立SARS冠状病毒S蛋白的抗原肽库。用免疫学方法测定各肽片的抗原反应性，确定SARS冠状病毒S蛋白连续性抗原表位的数目、氨基酸顺序，及其在肽链中的定位及抗原强度。结果，得到9个阳性肽表位。

由此，本发明提供了SARS冠状病毒S蛋白的表位，即本发明的肽。还涉及编码本发明肽的多核苷酸，抗体及其抗原结合片断，免疫原性组合物，药物组合物，诊断试剂盒，诊断和治疗SARS的方法等。

多核苷酸

“分离的”在此用于指多核苷酸基本上不带有其它编码序列，以及该DNA区段不含有大份额的无关编码DNA，如染色体大片段或其它功能性基因或肽编码区。当然，这是指原始分离的DNA区段，并不排除之后人为在该区段中加入的基因或编码区。

本领域技术人员将明了，多核苷酸可以是单链的(编码链或反义链)或双链的，而且可以是DNA(基因组DNA、cDNA或合成的DNA)或RNA分子。

多核苷酸可以含有天然序列(即编码本发明肽或其部分的内源性序列)或可以含有该序列的变体、或生物学或抗原功能等同物。正如以下进一步描述的，多核苷酸变体可以含有一或多个替代、添加、缺失和/或插入，优选地，以致所编码的肽的免疫原性相对于天然肽不减少。一般可以按本文所述方法评价对该编码肽的免疫原性的影响。术语变体”也包括异种来源的同源基因。

当进行多核苷酸或肽序列比较时，如果在按下述方法进行最大匹配比对后，两个序列中的核苷酸或氨基酸序列相同，则认为这两个序列是“同一的”。典型地，两个序列之间的比较通过在比较窗中对序列进行比较以鉴定和比较局部区域的序列相似性来进行。本文所用“比较窗”是指具有至少约20个连续位置的区段，在该区段中可以在一个序列和具有相同数目连续位置的参考序列最佳比对后对这两个序列进行比较。

为了序列比较，可以采用Lasergene生物信息软件包中的Megalign程序(DNASTAR公司，Madison，WI)，利用默认参数进行序列的最佳比对。

或者，为了序列比较，可以利用以下方法进行序列的最佳比对：Smith和Waterman的局部同一性算法((1982)Add.APL.Math 2∶482)；Needleman和Wunsch的同一性比对算法((1970)J.Mol.Biol.48∶443)；Pearson和Lipman的相似性搜索方法((1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85∶2444)；这些算法的计算机执行程序(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group(GCG)，575Science Dr.，Madison，WI)；或目测。

适合于确定序列同一性和序列相似性百分数的算法的一个优选例子是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述在Altschul等(1977)Nucl.Acid.Res.25∶3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215∶403-410。采用例如本文所述参数，BLAST和BLAST 2.0可以用于确定本发明的多核苷酸和肽的序列同一性百分数。执行BLAST分析的软件可以通过国立生物技术信息中心为公众所获得。

因此，本发明包括与本文所公开序列基本同一的多核苷酸和肽序列，例如当采用本文所述方法(例如采用标准参数的BLAST分析，描述如下)时，与本发明多核苷酸或肽序列相比含有至少50％序列同一性、优选至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性的那些序列。本领域技术人员将明了，考虑密码子简并性、氨基酸相似性、读框的定位等，可以对这些值进行适当调整以确定两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。

在其它实施方案中，本发明指向在中等严紧条件下与本文提供的多核苷酸、或其片段、或其互补序列能够杂交的多核苷酸。在分子生物学领域中杂交技术是熟知的。

“杂交”包括任何能使核酸的一条链通过碱基配对与一条互补核酸链结合的程序。因此，严格地说，该术语是指靶序列的互补序列与测试序列结合的能力，反之亦然。

典型地，“杂交条件”根据测量杂交时所用条件的“严紧性”程度来分类。严紧性程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)为依据。例如，“最大严紧性”典型地发生在约Tm-5℃(低于探针Tm 5℃)；“高等严紧性”发生在Tm以下约5-10℃；“中等严紧性”发生在探针Tm以下约10-20℃；“低严紧性”发生在Tm以下约20-25℃。作为替代，或者进一步地，杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和/或一或多次的严紧性洗涤为依据。例如，6×SSC＝极低严紧性；3×SSC＝低至中等严紧性；1×SSC＝中等严紧性；0.5×SSC＝高等严紧性。从功能上说，可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严格同一或近严格同一的核酸序列；而采用高等严紧性条件确定与该探针有约80％或更多序列同一性的核酸序列。

对于要求高选择性的应用，典型地期望采用相对严紧的条件来形成杂交体，例如，选择相对低的盐和/或高温度条件。Sambrook等(Sambrook，J.等(1989)分子克隆，实验室手册，Cold Spring Harbor Press，Plainview，N.Y.)提供了包括中等严紧性和高等严紧性在内的杂交条件。

为便于说明，用于检测本发明的多核苷酸与其它多核苷酸杂交的合适的中度严紧条件包括：用5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)溶液预洗；在50-65℃下在5×SSC中杂交过夜；随后用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC在65℃下各洗涤两次20分钟。本领域技术人员应当理解，能容易地操作杂交严格性，如改变杂交溶液的含盐量和/或杂交温度。例如，在另一个实施方案中，合适的高度严格杂交条件包括上述条件，不同之处在于杂交温度升高到例如60-65℃或65-70℃。

探针和引物

在本发明的其它实施方案中，本文提供的多核苷酸序列或其互补序列可以有利地用作核酸杂交的探针或引物。同样地，预期含有如下序列区域的核酸区段将是尤其有用的，该序列区域是与本文所公开的30个核苷酸长的连续序列具有相同序列或与之互补的至少约15个核苷酸长的连续序列。这些核苷酸探针与目的序列特异杂交的能力使它们能够用于检测给定样品中是否存在互补序列。然而，还可以预想其它用途，例如将该序列信息用于制备突变种引物、或在其它遗传结构的构建中使用的引物。

多核苷酸在宿主细胞中的表达

在本发明的其它实施方案中，可以将编码本发明肽、或其融合蛋白或其功能性等同物的多核苷酸序列或其片段用于重组DNA分子中，以指导肽在适合宿主细胞中的表达。由于遗传密码固有的简并性，可以制备编码基本上相同或功能上等同的氨基酸序列的其它DNA序列，并且可以采用这些序列克隆和表达指定的肽。

本领域技术人员将明了，在某些情况下制备具有非天然密码子的肽编码核苷酸序列可能是有利的。例如，可以选择特定原核或真核宿主偏倚的密码子，以增加蛋白质表达速率，或制备具有期望性质，如比天然序列产生的转录本具有更长半寿期的重组RNA转录本。

在本发明的另一实施方案中，可以将天然、修饰的、或重组的核酸序列与异源序列连接在一起以编码融合蛋白。例如，为了在肽文库中筛选肽活性的抑制剂，编码能够被商业可获得抗体识别的嵌合蛋白质可能是有用的。还可以对融合蛋白质进行改造使其在该肽编码序列和异源蛋白质序列之间含有切割位点，以便使该肽可以通过切割和纯化与该异源部分分离开。

为了表达期望的肽，可以将编码该肽或其功能性等同物的核苷酸序列插入适合的表达载体中，即该载体含有该插入编码序列转录和翻译所必要的元件。可以采用本领域技术熟知的方法构建含有编码目的肽的序列和适合的转录及翻译控制元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术、和体内遗传重组。这些技术描述于Sambrook，J.等(1989)分子克隆，实验室手册，Cold Spring Harbor Press，Plainview，N.Y.；和Ausubel，F.M.等(1989)当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley & Sons，纽约，N.Y.。

多种表达载体/宿主系统可以用于包含和表达多核苷酸序列。这些包括但不限于重组噬菌体、质粒、或粘粒DNA表达载体转化的细菌等微生物；酵母表达载体转化的酵母；病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)或细菌表达载体(例如Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。

存在于表达载体中的“控制元件”或“调节序列”是指该载体的那些非翻译区域-增强子、启动子、5’和3’非翻译区-它们与宿主细胞的蛋白质相互作用以实施转录和翻译。这些元件可以在其强度和特异性方面变化。依赖于所用的载体系统和宿主，可以采用任何数量的适合转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子。例如，当克隆在细菌系统中时，可以采用诱导型启动子，例如PBLUESCRIPT噬菌粒(Stratagene，La Jolla，Calif.)或PSPORT1质粒(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)的杂合lacZ启动子等。在哺乳动物细胞系统中，一般优选来自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子。如果需要制备含有多拷贝的肽编码序列的细胞系时，有利的是采用具有适合选择标志的基于SV40或EBV的载体。

可以在适合于表达和从细胞培养物中回收该蛋白质的条件下，培养目的多核苷酸序列转化的宿主细胞。根据该序列和/或所用的载体，重组细胞产生的蛋白质可以是分泌的或包含在细胞内。本领域技术人员将明了，可以对含有本发明多核苷酸的表达载体进行设计以含有指导该编码肽分泌通过原核或真核细胞膜的信号序列。可以采用其它的重组结构，将编码目的肽的序列与编码利于可溶性蛋白质纯化的肽域的核苷酸序列连接在一起。这些利于纯化的域包括，但不限于，允许在固定化金属上进行纯化的金属螯合肽如组氨酸-色氨酸组件、允许在固定化免疫球蛋白上纯化的A蛋白域、和用于FLAGS延伸/亲和纯化系统(Immunex Corp.，Seattle，Wash.)的域。

生物学功能等同物

可以对本发明多核苷酸和肽的结构进行修饰和改变，但仍获得编码具有期望特性的肽的功能性分子。正如以上提及的，常常期望在特定多核苷酸序列中引入一或多个突变。在某些情况下，该所获编码肽序列因该突变而发生改变，或在其它情况下，该肽的序列并不因该编码多核苷酸中的一或多个突变而发生变化。

例如，在蛋白质结构中某些氨基酸可以替代其它氨基酸，而不显著丧失与其它结构(如抗体的抗原结合区或底物分子上的结合位点)的相互结合能力。由于一个蛋白质的相互作用能力和性质决定了该蛋白质的生物学功能活性，所以可以在蛋白质序列中进行某些氨基酸序列替代，当然也可以对其根本的DNA编码序列进行替代，从而获得具有相似形式的蛋白质。因此，本发明人考虑到，在本公开的组合物的肽序列中或编码所述肽的相应DNA序列中可以进行多种变化，而不引起它们的生物学用途和活性的明显丧失。

一般基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等，来进行氨基酸替代。考虑到各种前述特性的替代实例是本领域技术人员熟知的，包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。

体内多核苷酸递送技术

在其它实施方案中，含有本发明一或多个多核苷酸的遗传结构被引入体内细胞中。这可以通过采用多种熟知方法中的任一种来实现，为了举例说明的目的以下列出了其中的几种。

递送载体包括腺病毒表达载体、腺伴随病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、非病毒载体等。

肽

本发明在其它方面提供肽组合物。一般地，本发明的肽是来源于哺乳动物物种的分离肽(或其表位、变体、或活性片段)。优选地，该肽由本文所公开的多核苷酸或在中等严紧条件下与本文所公开的多核苷酸序列杂交的序列编码。或者，可以将该肽定义为含有本文所公开氨基酸序列中的连续氨基酸序列的肽、或含有本文所公开的完整氨基酸序列的肽。

本文中，肽的活性片段包括通过常规技术例如诱变、或通过添加、缺失或替代而被修饰的肽的全部或部分，但活性片段仍表现出与本文所述肽具有基本上相同的结构功能、抗原性等。

属于本发明的肽变体包括那些表现出与本文所公开肽有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％、或更高同一性的肽。

优选地，变体含有保守替代。“保守替代”是指一个氨基酸替代具有相似性质的另一个氨基酸，以致肽化学领域的技术人员将预期该肽的二级结构和亲水性质基本上不发生改变。一般可以基于残基的极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性和/或双亲性质的相似性，进行氨基酸替代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；带有非荷电极性头部基团、具有相似亲水值的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。

肽的制备可以采用多种熟知技术中的任意一种。采用本领域普通技术人员已知的多种表达载体中的任何载体，可以容易地从上述DNA序列制备这些序列编码的重组肽。表达可以在任何一种用含有编码重组肽的DNA分子的表达载体转化或转染的适合宿主细胞中得到实现。适合的宿主细胞包括原核细胞、酵母、高等真核细胞如哺乳动物细胞和植物细胞。优选地，所用宿主细胞是大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞系例如COS或CHO。首先可以采用可商业购买获得的滤器，浓缩来自将重组蛋白或肽分泌至培养基中的适合宿主/载体系统的上清液。浓缩后，可以将该浓缩物施加到适合的纯化基质例如亲和基质或离子交换树脂上。最后，可以采用一或多个反相HPLC步骤进一步纯化重组肽。

还可以通过合成手段，采用本领域普通技术人员熟知的技术，制备具有少于约100个氨基酸、一般少于约50个氨基酸的肽部分和其它变体。例如，可以采用任何一种商业可获得的固相技术，例如Merrifield固相合成法，通过将氨基酸顺序地添加到生长的氨基酸链上，合成这些肽。见Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85∶2149-2146，1963。用于自动合成肽的仪器可从供应商例如Perkin Elmer/Applied BioSystems Division (Foster City，CA)处购买获得，并可以按厂家说明书进行操作。

结合剂

表位的确定不仅可以了解有关免疫反应的众多信息，为进一步人工控制免疫反应奠定基础，而且对药物合成、疫苗设计等也具有指导意义。

表位抗体的优点是特异性强，最大的优势是可选择最佳和最具免疫保护潜力的表位以诱生特异性免疫应答，尽量减少无关、干扰和抑制序列可能产生的负作用，具有巨大的应用潜能。而且由于它本身就是抗原决定族，免疫原性强，因此制备出的抗体特异性强，效价高，且易于制备。抗体可制备成外用的多价抗体消毒剂，应用于常规外用消毒剂如一些理化消毒剂不能应用的人体皮肤、粘膜以及食品等的消毒或病毒预防。特异的表位抗体还可开发成诊断和检测试剂盒，应用于病毒的检测及病人的血清学诊断。

因此，本发明还提供特异地与本发明肽结合的药剂，例如抗体和其抗原结合片段。在本文中，如果抗体或其抗原结合片段与本发明肽的反应(在例如ELISA中)处于可检测到的水平，而在相似条件下与无关蛋白质的反应不能被检测到时，则被认为与本发明肽特异结合”。本文所用“结合”是指两个独立分子之间的非共价联接以致形成复合物。结合能力可以通过例如测定形成该复合物的结合常数来评价。结合常数是当用各成分的浓度乘积除该复合物的浓度时获得的值。一般地，在本发明的上下文中，当形成复合物的结合常数大于约10³L/mol时，两个化合物被认为是“相结合的”。该结合常数可以采用本领域熟知的方法测定。

对本发明的肽可通过融合蛋白和肽及其衍生物自身或其聚合物、串连体或环化结构等方式，进行动物免疫制备抗体。抗体的制备方式可参见巴德年主编，当代免疫学技术与应用，北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998)。制备的抗肽抗体用于病毒的外用消毒和预防，如滴眼液、喷鼻剂、食品的洗消液等，以及检测和诊断试剂盒。

对目的抗原肽具有特异性的单克隆抗体可以采用例如Kohler和Milstein的技术(Eur.J.Immunol.6∶511-519，1976)，及其改良方法来制备。

在某些实施方案中，可能优选采用抗体的抗原结合片段。这些片段包括Fab片段，它们可以采用标准技术制备。简而言之，可以通过在A蛋白珠柱上通过亲和层析从抗血清中纯化免疫球蛋白(Harlow和Lane，抗体：实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)，然后通过木瓜蛋白酶消化产生Fab和Fc片段。该Fab和Fc片段可以在A蛋白珠柱上通过亲和层析分离。

可以将本发明的抗表位抗体单独作为被动免疫剂用于预防活治疗SARS-coV的感染，或与一或多种治疗剂偶联在一起。在此方面适合的治疗剂包括放射性核素、分化诱导剂、药物、毒素和它们的衍生物。

治疗剂可以与适合的单克隆抗体直接或间接地(如通过接头基团)偶联(例如共价键合)。或者，可能期望将治疗剂和抗体通过接头基团偶联。接头基团能够作为间隔起作用使抗体和药剂分隔开，以便避免对结合性能的干扰。接头基团还可以用于增强药剂或抗体上取代基的化学反应性，由此增加偶联效率。

可以采用多种途径施用这些抗体和免疫偶联物。典型地，可以静脉内、肌内、或皮下给药，或经喷雾、点滴用于眼、鼻及口腔，或雾化吸入呼吸道及肺中。很明显，该抗体/免疫偶联物的精确剂量将随所用的抗体、抗原密度、和抗体的清除率而改变。

本发明的抗体还包括单链抗体、双价或多价抗体等。

T细胞

免疫治疗组合物可以还，或者作为替代方案可以，含有本发明肽特异性T细胞。这些细胞一般可以在体外或离体采用标准程序制备。

可以用本发明肽、编码本发明肽的多核苷酸和/或表达该肽的抗原呈递细胞(APC)刺激T细胞。该刺激在足以允许产生该肽特异性T细胞的条件和时间下进行。

对于治疗目的，可以在体外或体内扩增响应本发明肽、多核苷酸或APC而增殖的CD4⁺或CD8⁺T细胞的数量。可以有多种途径来实现这些T细胞的体外增殖。例如，可以在添加了或未添加T细胞生长因子(例如白介素2)和/或合成本发明肽的刺激细胞的情况下，将这些T细胞重新暴露于本发明肽或相应于该肽免疫原性部分的短肽下。或者，可以通过克隆扩增在存在本发明肽时增殖的一或多种T细胞的数量。克隆细胞的方法是本领域所熟知的，包括有限稀释。

药物组合物

在其它实施方案中，本发明涉及本文所公开的一或多种多核苷酸、肽、T细胞和/或抗体组合物在可药用溶液中的制剂，用于单独或联合一或多种其它形式的治疗方法施用给细胞或动物。

而且，应当理解，如果希望的话，表达本文所公开肽的核酸区段、RNA、DNA或PNA组合物可以联合其它药剂例如其它蛋白质或肽或各种具有药物活性的药剂一起施用。实际上，对于也可以包括在内的其它成分确实没有限制，只要这些额外药剂在与靶细胞或宿主组织接触时不引起显著的不良反应即可。

可药用赋形剂和载体溶液的配制是本领域技术人员熟知的。同样，对于在各种治疗方案中使用本文所述具体组合物的适合给药和治疗方案(包括例如口服、非肠道途径、呼吸道途径、静脉内、鼻内、眼内、口内、皮下和肌内给药和药物配制)的研制也是本领域技术人员熟知的。

短语“可药用”是指当给人施用时不产生过敏或类似不当反应的分子实体和组合物。含有作为活性成分的蛋白质的水性组合物的制备是本领域熟知的。典型地，将这些组合物制成可注射的液体溶液或悬浮液；还可以制成适于在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式。还可以使该制剂乳化。

免疫原性组合物

在本发明的某些优选实施方案中，提供免疫原性组合物或疫苗。该免疫原性组合物一般含有一或多种药物组合物(例如上面讨论的那些药物组合物)和免疫刺激剂。免疫刺激剂可以是增强或加强针对外源性抗原的(抗体和/或细胞介导的)免疫应答的任何物质。免疫刺激剂的例子包括佐剂、生物可降解微球体(例如polylactic galactide)和脂质体(所述化合物被掺入其中；见例如Fullerton，美国专利4,235,877)。疫苗的制备一般描述于例如M.F.Powell和M.J.Newman编，“疫苗的设计(亚单位和佐剂方法)”(Vaccine Design(the subunit and adjuvant approach))，Plenum Press(NY，1995)。属于本发明范围的药物组合物和免疫原性组合物，或疫苗，还可以含有其它化合物，这些化合物可以具有或没有生物学活性。

基于抗原表位合成的短肽疫苗在人体应用中非常安全，如HIV的短肽疫苗在美国已应用于临床，尽管其疗效不是很理想，但在人群中应用是安全可行的。短肽疫苗的最大缺点之一是免疫原性较完整蛋白质差。为了增强短肽的免疫原性，可将短肽制备成多聚体，如流感病毒血凝素C-端的23氨基酸制备成四聚体，可明显加强免疫原性，使机体产生高效抗体。短肽疫苗以其独特的优势受到越来越多的学者的重视，在微生物学，肿瘤学、自身免疫性疾病等各个领域都有研究。将多个SARS冠状病毒的抗原表位串联在一起，制备多价肽疫苗，可用于预防SARS病毒的感染。

另外，示例性免疫原性组合物可以含有编码一或多种上述肽的DNA，以便原位产生该肽。正如以上所指出的，该DNA可以存在于本领域普通技术人员已知的多种递送系统的任一种中，包括核酸表达系统、细菌和病毒表达系统。许多基因递送技术是本领域所熟知的，例如描述于Rolland，Crit.Rev.Therap.Drug Carrier Systems 15∶143-198，1998，和其引用文献中的那些技术。明显地，免疫原性组合物可以含有多核苷酸和肽两类成分。这些免疫原性组合物可以提供增强的免疫应答。

尽管在本发明的免疫原性组合物中可采用本领域普通技术人员已知的任何适合载体，但载体的类型将随给药方式的改变而改变。可以对本发明的组合物进行配制成用于任何适当的给药方式，包括例如局部、口服、鼻腔、静脉内、颅内、腹膜内、皮下或肌内给药。对于非胃肠道给药，例如皮下注射，该载体优选含有水、盐水、乙醇、脂肪、蜡或缓冲液。对于口服用药，可以采用以上任何种载体或固体载体，例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、和碳酸镁。还可采用生物可降解微球体作为载体用于本发明的药物组合物。

在本发明免疫原性组合物中可以采用多种免疫刺激剂中之任何种。例如，可以将佐剂包括在内。大多数佐剂含有设计用以防止抗原快速代谢的物质，例如氢氧化铝或矿物油，和免疫应答的刺激剂，例如脂质A、百日咳博德特氏菌(Bortadella pertussis)或结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)来源的蛋白质。可从商业途径获得适合的佐剂，例如弗氏不完全佐剂和完全佐剂；Merck佐剂65(Merck and Company，Inc.，Rahway，NJ)；AS-2(SmithKline Beecham，Philadalphia，PA)；铝盐例如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝；钙、铁或锌的盐类；酰化酪氨酸的不溶性悬浮物；酰化糖；阳离子或阴离子衍生多糖；聚磷腈；生物可降解微球体；单磷酰脂A(monophosphoryl lipid A)和quil A。细胞因子，例如GM-CSF或白介素-2、-7或-12，也可以用作佐剂。

本文提供的所有免疫原性组合物均可以采用将抗原、免疫应答增强剂和适合的载体或赋形剂组合在一起的熟知方法制备。本文所述组合物可以作为持续释放制剂(即，施用后实现化合物的缓慢释放的胶囊、海绵或凝胶(例如由多糖组成的)等制剂)的部分施用。这些制剂一般可以采用熟知技术(见例如Coombes等，疫苗(Vaccine)14∶1429-1438，1996)制备，并通过例如口服、直肠或皮下植入，或通过在期望靶位置植入进行施用。

SARS的检测和诊断

一般地，可以基于从患者获得生物样品(例如血液、血清、痰、唾液、尿、粪和/或活检组织)中一或多种本发明肽、抗本发明肽的抗体和/或编码这些肽的多核苷酸的存在，检测该患者是否患有SARS。换言之，可以采用这些肽、抗体和/或编码这些肽的多核苷酸作为标志，指示是否存在SARS或相关疾病。本文提供的结合剂可以检测生物样品中与该药剂结合的抗原的水平。多核苷酸引物和探针可以用于检测编码本发明肽的mRNA的水平，该水平也指示了SARS的存在与否。

SARS治疗

在本发明的其它方面，可以将本文所述组合物用于免疫治疗SARS。在这些方法中，典型地给患者施用组合物。本文所用“患者”是指任何恒温动物，优选哺乳动物，更优选人类。患者可以患有或可以未患有SARS。因此，以上药物组合物和免疫原性组合物可以用于预防SARS的发生或治疗SARS患者。施用可以通过任何适合的方法进行，包括通过静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内、皮内、滴眼、喷鼻、吸入、肛门、阴道、局部和口服途径进行的施用。

新药开发

在筛选得到抗原表位的基础上，还可进行特异性抗病毒药物包括核酸药物等生物工程药物的开发。如应用SELEX技术或靶标切换技术筛选得到与表位肽特异结合的核酸适配子，Oligbody等，作为核酸药物预防或治疗SARS。

下面结合实施例对本发明进一步举例描述，这些实施例是非限制性的。

实施例

实施例1多中心多肽合成

1.制作工作计划

利用多中心多肽合成技术中Gnet软件，将全部SARS冠状病毒S蛋白的氨基酸序列[2]输入计算机，在PepMaker的执行程序下得到全部1246个十肽的合成计划。

2.多肽合成

在PinAID的协助下，完成加样过程，反应时间2h。

操作步骤：

1)按照工作计划，在正确的位置固载Macrocrowns(负载量为1.5μmol/Macrocrowns)。

2)以20％哌啶的DMF溶液在室温下脱Fmoc保护基20min。

3)以干燥DMF洗涤所有Pin2min。

4)以新鲜的甲醇洗涤3次，每次2min。

5)空气干燥30min。

6)按工作计划称取氨基酸，缩合剂及添加剂；按工作计划溶解氨基酸，缩合剂及添加剂(DIC和HOBt)，并配好氨基酸活化酯溶液。

7)启动PinAID，并确认线路畅通。按显示正确位置加入深孔的Beckman反应容器中，最后检查所有的反应孔中全部加入活化的氨基酸。反应体积为300μl。

8)将Pin放入反应容器中，室温反应2h(室温一般指25℃)。

9)将Pin从反应容器中去除，用甲醇洗涤5min，甩去甲醇，晾干2min，再在干燥的DMF中洗5min。

10)观察是否有显示蓝色的Pin。如有，则按照6～10步将此Pin重新缩合，直至蓝色消失。

11)如没有蓝色显示的Pin，则重复2～10步，一直到全部氨基酸缩合完毕。

3.合成肽侧链脱保护及将合成肽Pin上切除

如果序列中含有甲硫氨酸和半胱氨酸时，是则用下述混合试剂：

三氟乙酸(TFA)∶乙二硫醇(EDT)∶苯甲醚∶苯甲硫醚∶水＝33∶1∶2∶2∶2(体积比)

否则，则可用下述混合试剂：

三氟乙酸∶乙二硫醇∶苯甲醚＝38∶1∶1(体积比)

上述试剂均新鲜配制。

操作步骤：

1)10ml离心管贴好标签，并标明每一个合成肽的位置。

2)将Pin从反应板上取下放入10mi正确位置的离心管中。

3)在每一个管中加入1.5ml上面的反应混合试剂，并检查是否将Pin浸没。

4)室温反应2.5h。

5)移走Pin，最好将其放回到原来对应的位置上，以便当发现没有从Pin上切下肽时检查原因。

6)用温和的氮气将溶液浓缩至原体积的10％。

4.提取合成肽并进行鉴定

试剂A：乙醚(干燥)∶石油醚(AR，40～60℃)＝1∶2(体积比)

试剂B：在乙醚∶石油醚溶剂中按0.1％的比例加入巯基乙醇

试剂C：0.1％TFA水溶液∶乙氰＝60∶40

按下列步骤提取合成肽：

1)以每分钟2000～6000转的速度离心6min。

2)检查是否有沉淀生成。如有，则仔细倾倒出上清液；如没有则用氮气小心吹干。

3)用试剂A(4ml)再萃取一次，重复1～3步。

4)仔细检查所有的离心管中是否都有合成肽，并且在空气中晾干。

5)每个干燥的合成肽中加入3ml试剂C，然后用液氮冷冻，再经冷冻干燥，最后得粗品肽。

粗品肽用质谱检测其分子量，以保证合成肽序列的正确性。

实施例2不同肽的包被浓度对实验结果的影响

将合成SARS冠状病毒S蛋白十肽(0.5mg/ml)以1∶100，1∶10稀释，每孔加100μl，4℃过夜。甩干后，以PBS-Tween 20洗涤液洗涤3min×3次，再加入以PBS稀释的病人混合血清，每孔100μl，37℃孵温60min。以PBS-Tween 20洗涤后，加入1∶1000羊抗人HRP酶标二抗，37℃孵温1h。用洗涤液洗涤3min×4次。加入底物溶液，避光室温反应10min，立即以2mol·L^-1H ₂SO₄终止反应。以微量多道滴定扫描仪测定492nm消光值。实验设阳性对照(阳性对照即通过筛选得到的1号阳性肽，此后每次筛选都以它作为阳性对照)，及阴性对照(492nm消光值低于0.25的肽)，无抗原阴性对照以肽包被稀释液代替，余同样品处理。

结果发现，肽的稀释倍数越高，所测消光值越低。在肽以1∶10稀释时，阳性对照的消光值为0.857，而阴性对照的消光值为0.248，及无抗原阴性对照的消光值为0.025。

实施例3病人混合血清的稀释度对实验结果的影响

合成SARS冠状病毒S蛋白十肽(0.5mg/ml)以1∶10稀释，而后加入以PBS稀释1∶10，1∶100，1∶1000的病人混合血清，每孔100μl，37℃孵温60min。以PBS-Tween 20洗涤后，加入1∶1000羊抗人HRP酶标二抗，37℃孵温1h。用洗涤液洗涤3min×4次。加入底物溶液，避光室温反应10min，立即以2mol·L^-1 H₂SO₄终止反应。以微量多道滴定扫描仪测定492nm消光值。实验设阳性对照及阴性对照，无抗原阴性对照以肽包被稀释液代替。

结果发现，用3种稀释度抗体对消光值有明显差别。痊愈病人混合血清以1∶100稀释时，阳性对照的消光值为0.770，而阴性对照的消光值为0.254，无抗原阴性对照的消光值为0.034。

实施例4抗原表位的识别

应用固相ELISA方法筛选SARS冠状病毒S蛋白的抗原表位。以0.05mol·L^-1碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释肽浓度至50μg/ml，每孔加100μl，4℃过夜。甩干后，以PBS-Tween 20洗涤液洗涤3min×3次，加入以PBS稀释的病人混合血清(1∶100)，每孔100μl，37℃孵温60min。PBS-Tween20洗涤后，加入1∶1000以PBS稀释的羊抗人HRP酶标二抗，37℃孵温1h，用洗涤液洗涤3min×4次，加入底物OPD溶液，避光室温反应10min，立即以2mol·L^-1H₂SO₄终止反应，以微量多道滴定扫描仪测定492nm消光值。

阳性肽的消光值结果如下：

1号肽0.7700.8030.8570.6970.6090.596

2号肽0.4390.4240.4860.5550.3770.393

3号肽0.4870.4880.5300.5980.5050.460

4号肽0.4140.4190.4640.4430.4140.545

5号肽0.4440.4550.4590.4900.4960.387

6号肽0.4110.3780.4520.4580.5880.572

7号肽0.4430.4770.6870.639

8号肽0.3470.3250.3530.3750.5060.511

9号肽0.6000.6770.5060.511

阴性对照的消光值为：0.242

无抗原阴性对照的消光值为：0.024

阳性肽的氨基酸和核酸序列如下

1号肽

P    S    G    F    N    T    L    K    P    I    (SEQ ID NO：1)

CCT  TCT  GGT  TTT  AAC  ACT  TTG  AAA  CCT  ATT(SEQ ID NO：2)

2号肽

I    D    A    T    S    T    G    N    Y    N    SEQ ID NO：3)

ATT  GAT  GCT  ACT  TCA  ACT  GGT  AAT  TAT  AAT  (SEQ ID NO：4)

3号肽

T    S    T    G    N    Y    N    Y    K    Y    (SEQ ID NO：5)

ACT  TCA  ACT  GGT  AAT  TAT  AAT  TAT  AAA  TAT  (SEQ ID NO：6)

4号肽

K  D    G    F    L    Y    V    Y    K    G(SEQ ID NO：7)

AAA  GAT  GGG  TTT  CTC  TAT  GTT  TAT  AAG  GGC(SEQ ID NO：8)

5号肽

L    Y    V    Y    K    G    Y    Q    P    I(SEQ ID NO：9)

CTC  TAT  GTT  TAT  AAG  GGC  TAT  CAA  CCT  ATA(SEQ ID NO：10)

6号肽

K    Y    D    E    N    G    T    I    T    D(SEQ ID NO：11)

AAG  TAT  GAT  GAA  AAT  GGT  ACA  ATC  ACA  GAT(SEQ ID NO：12)

7号肽

Y    D    E    N    G    T    I    T    D    A(SEQ ID NO：13)

TAT  GAT  GAA  AAT  GGT  ACA  ATC  ACA  GAT  GCT(SEQ ID NO：14)

8号肽

S    V    I    T    P    G    T    N    A    S(SEQ ID NO：15)

AGT  GTA  ATT  ACA  CCT  GGA  ACA  AAT  GCT  TCA(SEQ ID NO：16)

9号肽

T    T    F    D    D    V    Q    A    P    N  (SEQ ID NO：17)

ACC ACT TTT GAT GAT GTT CAA GCT CCT AAT  (SEQ ID NO：18)

序列表

<110>军事医学科学院毒物药物研究所

<120>SARS冠状病毒的S蛋白的抗原表位、其抗体、编码核酸以及含有它们组合物

<130>not specified

<160>18

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>11

<212>PRT

<213>SARS冠状病毒

<400>1

Pro Set Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile

1               5                   10

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>SARS冠状病毒

<400>2

ccttctggtt ttaacacttt gaaacctatt             30

<210>3

<211>10

<212>PRT

<213>SARS冠状病毒

<400>3

Lle Asp Ala Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn

1               5                   10

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>SARS冠状病毒

<400>4

attgatgcta cttcaactgg taattataat              30

<210>5

<211>10

<212>PRT

<213>SARS冠状病毒

<400>5

Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr

1               5                   10

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>SARS冠状病毒

<400>6

acttcaactg gtaattataa ttataaatat               30

<210>7

<211>10

<212>PRT

<213>SARS冠状病毒

<400>7

Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly

1               5                   10

<210>8

<211>30

<212>DNA

<213>SARS冠状病毒

<400>8 

aaagatgggt ttctctatgt ttataagggc                  30

<210>9

<211>10

<212>PRT

<213>SARS冠状病毒

<400>9

Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile

1               5                   10

<210>10

<211>30

<212>DNA

<213>SARS冠状病毒

<400>10

ctctatgttt ataagggcta tcaacctata             30

<210>11

<211>10

<212>PRT

<213>SARS冠状病毒

<400>11

Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp

1               5                   10

<210>12

<211>30

<212>DNA

<213>SARS冠状病毒

<400>12

aagtatgatg aaaatggtac aatcacagat                       30

<210>13

<211>10

<212>PRT

<213>SARS冠状病毒

<400>13

Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala

1               5                   10

<210>14

<211>30

<212>DNA

<213>SARS冠状病毒

<400>14

tatgatgaaa atggtacaat cacagatgct                        30

<210>15

<211>10

<212>PRT

<213>SARS冠状病毒

<400>l5

Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser

1               5                   10

<210>16

<211>30

<212>DNA

<213>SARS冠状病毒

<400>16

agtgtaatta cacctggaac aaatgcttca    30

<210>17

<211>10

<212>PRT

<213>SARS冠状病毒

<400>17

Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn

1               5                   10

<210>18

<211>30

<212>DNA

<213>SARS冠状病毒

<400>18

accacttttg atgatgttca agctcctaat              30

Claims (13)

1.一种分离的多核苷酸，其由选自下列组的序列组成：

(a)SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16或18所示的核苷酸序列；

(b)编码SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15或17所示氨基酸序列的核苷酸序列；

(c)与(a)或(b)的序列有至少96％同一性并保持(a)或(b)序列的活性的序列；

(d)(a)或(b)的序列的简并变体；和

(e)以上序列的互补序列。

2.一种分离的肽，其氨基酸序列选自：

(a)SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15或17所示氨基酸序列；

(b)权利要求1的多核苷酸编码的序列；和

(c)(a)序列的含有一个氨基酸插入、缺失、替代、添加并保持其活性的变体。

3.表达载体，包含可操作地与表达控制序列连接的权利要求1的多核苷酸。

4.用根据权利要求3的表达载体转化或转染的宿主细胞。

5.权利要求4的宿主细胞，其是原核细胞。

6.分离的抗体、或其抗原结合片段，其特异地与权利要求2的肽结合。

7.一种诊断试剂盒，其含有：

(a)权利要求1的多核苷酸；

(b)权利要求2的肽；或

(c)权利要求6的分离的抗体、或其抗原结合片段。

8.在体外刺激和/或扩增特异针对病毒蛋白的T细胞的方法，包括在足以允许T细胞得到刺激和/或扩增的条件和时间下用至少一个选自下列的成分接触T细胞：

(a)权利要求1的多核苷酸；

(b)权利要求2的肽；和

(c)表达权利要求2的肽的抗原呈递细胞。

9.分离的T细胞群，包含根据权利要求8的方法制备的T细胞。

10.疫苗组合物，包含选自可药用载体和免疫刺激剂的第一成分，和选自如下的第二成分：

(a)权利要求1的多核苷酸；和

(b)权利要求2的肽。

11.权利要求10的疫苗组合物，其中所述免疫刺激剂是佐剂。

12.权利要求10或11的疫苗组合物在制备预防SARS冠状病毒感染或SARS的药物中的用途。

13.权利要求2的肽、权利要求6的抗体或其抗原结合片断、权利要求9的T细胞群或权利要求10或11的疫苗组合物在制备治疗SARS冠状病毒感染或SARS的药物中的用途。