CN112379090A - 新型冠状病毒抗体检测试剂盒及其制备方法与应用 - Google Patents

新型冠状病毒抗体检测试剂盒及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112379090A
CN112379090A CN202110019972.5A CN202110019972A CN112379090A CN 112379090 A CN112379090 A CN 112379090A CN 202110019972 A CN202110019972 A CN 202110019972A CN 112379090 A CN112379090 A CN 112379090A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
antibody
novel coronavirus
kit
igm
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110019972.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112379090B (zh
Inventor
石晓娟
苗景赟
闫爽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Baipusai Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Beijing Baipusai Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Baipusai Biotechnology Co Ltd filed Critical Beijing Baipusai Biotechnology Co Ltd
Priority to CN202110019972.5A priority Critical patent/CN112379090B/zh
Publication of CN112379090A publication Critical patent/CN112379090A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112379090B publication Critical patent/CN112379090B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms

Abstract

本发明提供一种新型冠状病毒抗体检测试剂盒及其制备方法与应用。所述试剂盒包括：IgG结合分子，抗IgM抗体，荧光标记的新型冠状病毒S1蛋白，荧光标记的新型冠状病毒N蛋白，S1蛋白的hIgG抗体阳性标准品，N蛋白的hIgG抗体阳性标准品，S1蛋白的hIgM抗体阳性标准品，N蛋白的hIgM抗体阳性标准品，阴性对照hIgG抗体样品，阴性对照hIgM抗体样品；其中，所述IgG结合分子与抗IgM抗体负载于不同粒径的纳米颗粒上。本发明的试剂盒用于新型冠状病毒抗体检测，可在1‑2h内快速完成血清中新型冠状病毒中和性抗体的检测，待检样品用量少，特异性强，灵敏度高，重复性好，操作简单，实验室要求低以及安全性高。

Description

新型冠状病毒抗体检测试剂盒及其制备方法与应用
技术领域
本发明是关于一种血清学检测新型冠状病毒抗体的方法，具体地说，是关于一种检测新型冠状病毒IgG和IgM抗体的荧光免疫检测试剂盒及其制备方法与应用，属于细胞生物学和免疫检验技术领域。
背景技术
新型冠状病毒SARS-CoV-2 (2019-nCoV)是2019年新发现的一种病毒，可导致人类病毒性肺炎或肺部感染。它包含四种主要的结构蛋白：刺突蛋白（Spike protein，S蛋白），核衣壳蛋白（Nucleocapsid，N蛋白），膜蛋白（Membrane protein，M蛋白），包膜蛋白（Envelope protein，E蛋白）。S蛋白是冠状病毒非常重要的表面蛋白，与病毒的传染能力密切相关，S蛋白包含S1、S2和受体结合域（RBD）。N蛋白在冠状病毒中含量丰富，是一种高度免疫原性蛋白，参与基因组复制和细胞信号通路调节。被新型冠状病毒感染后，人体会产生相应的特异性抗体进行防御，其中特异性抗体IgM最早产生并进行早期防御，随后产生IgG抗体。IgM抗体多在发病3-5天后开始出现阳性，可提示近期感染。IgG抗体是再次免疫应答产生的主要抗体，通常提示病情进入恢复期或存在既往感染。新型冠状病毒感染的血清学检测便是通过检测血液样本中S蛋白和N蛋白的特异性抗体IgM和IgG的存在及含量，来间接判断体内有无病毒及病毒感染情况。目前，在国家卫生健康委员会已发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》中也明确提出：在原有诊疗方案的基础上增加了血清学检测，作为确诊病例和疑似病例的诊断依据之一。
此外，在新型冠状病毒疫苗的评估过程中，因疫苗本身的限制，并不能百分之百保护接种者（临床保护数据：Moderna mRNA疫苗 94.5%，BioNtech mRNA疫苗 95%，阿斯利康腺病毒疫苗62%-90%），对于疫苗本身的效价，以及疫苗接种后的保护效力，都有必要进行评估。对于SARS-CoV-2而言，直接针对S蛋白的中和抗体才能够中和病毒的毒力、阻止病毒对机体的感染。但是这并不意味着针对其他部分的抗体无效，包含N蛋白或者其他非结构蛋白的疫苗抗原也许可以诱导机体产生更为均衡的体液免疫和T细胞免疫应答。因此接种疫苗后，血清中S蛋白和N蛋白的特异性抗体IgM和IgG的存在和滴度也是新型冠状疫苗评估指标之一。
目前用于血清学检测新型冠状病毒抗体的方法包括酶联免疫法（ELISA）、胶体金免疫层析法法、S-Flow流式检测和荧光素酶免疫沉淀法。ELISA法操作简单且较为常见，此方法灵敏度相对高，载体标准化难度较低，但是检测速度慢、易污染、步骤较为繁琐。胶体金法特点是无需特殊处理标本，操作简单，用时短，无需检测仪器，对检测技术对人员、场所的限制较低，可广泛应用于基层医疗单位及现场检测，然而胶体金法对结果的确定只能是定性检测，无法定量，也无法进行抗体滴度比较。S-Flow流式检测是基于过表达S蛋白的293T细胞株建立的，受细胞培养条件和细胞状态的限制，并且只能检测S蛋白的抗体，无法同时兼顾N蛋白抗体的检测。荧光素酶免疫沉淀法是将荧光素酶偶联在S蛋白或N蛋白上，抗体与蛋白结合后，再通过能够与抗体Fc段结合的磁珠将荧光素酶-S蛋白或N蛋白-抗体复合物沉淀下来，使用荧光素酶底物显色试剂盒进行显色检测，此方法操作繁琐，而且检测灵敏度较ELISA和S-Flow低。
因此，关于新型冠状病毒IgG和IgM抗体检测分析方法仍需进一步研发。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测新型冠状病毒IgG和IgM抗体的试剂盒。
本发明的另一目的是提供一种检测新型冠状病毒IgG和IgM抗体的新方法（含非诊断目的的检测方法）。
具体而言，一方面，本发明提供检测新型冠状病毒IgG和IgM抗体的试剂盒，其是一种新型冠状病毒抗体的荧光免疫检测试剂盒，所述试剂盒包括：
IgG结合分子，抗 IgM 抗体，荧光标记的新型冠状病毒S1蛋白，荧光标记的新型冠状病毒N蛋白，S1蛋白的 hIgG 抗体阳性标准品，N蛋白的 hIgG 抗体阳性标准品，S1蛋白的hIgM 抗体阳性标准品，N蛋白的 hIgM抗体阳性标准品，阴性对照 hIgG 抗体样品，阴性对照 hIgM 抗体样品；
其中，所述IgG结合分子负载于第一纳米颗粒上，所述抗IgM抗体负载于第二纳米颗粒上，所述第一纳米颗粒与第二纳米颗粒粒径不同。
根据本发明的具体实施方案，本发明的试剂盒中，所述第一纳米颗粒、第二纳米颗粒各自独立地为非磁性纳米颗粒或磁性纳米颗粒，各纳米颗粒粒径1-30μm，并且，第一纳米颗粒与第二纳米颗粒的粒径差为2-20μm，可被流式细胞仪区分。纳米颗粒的材质可以是所属领域中任何可行的材质，例如可以是水凝胶颗粒。
根据本发明的具体实施方案，本发明的试剂盒中，所述IgG结合分子可以为Protein G、Protein A、Protein L或抗IgG的抗体；所述抗IgM抗体为抗人源 IgM 的鼠源单克隆抗体或抗IgM的其他种属单克隆抗体或多克隆抗体。
根据本发明的具体实施方案，本发明的试剂盒中，所述荧光标记的新型冠状病毒S1蛋白为荧光标记的新型冠状病毒S-trimer蛋白或荧光标记的新型冠状病毒S1蛋白的RBD。
根据本发明的具体实施方案，本发明的试剂盒中，所述荧光标记的新型冠状病毒S1蛋白所用的荧光染料包括PE、FITC、APC或Alexa Flour染料等荧光素中的一种或多种；荧光标记的新型冠状病毒N蛋白中所用的荧光染料为FITC、PE、APC或 Alexa Flour等荧光素中的一种或多种。在本发明的优选的具体实施方案中，标记新型冠状病毒S1蛋白与标记新型冠状病毒N蛋白的荧光染料不同，例如，所述荧光标记的新型冠状病毒S1蛋白为PE标记的新型冠状病毒S1蛋白；荧光标记的新型冠状病毒N蛋白为FITC标记的新型冠状病毒N蛋白。
根据本发明的具体实施方案，本发明的试剂盒中：
S1蛋白的 hIgG抗体阳性标准品，为抗新型冠状病毒S1蛋白的人IgG1亚型单克隆抗体，或为抗新型冠状病毒S1蛋白人源IgG型多克隆抗体；
N蛋白的 hIgG抗体阳性标准品，为抗新型冠状病毒N蛋白的人IgG1亚型单克隆抗体，或为抗新型冠状病毒N蛋白人源IgG型多克隆抗体；
S1蛋白的 hIgM 抗体阳性标准品， 为抗新型冠状病毒S1蛋白的人IgM亚型单克隆抗体，或为抗新型冠状病毒S1蛋白人源IgM型多克隆抗体；
N蛋白的 hIgM抗体阳性标准品，为抗新型冠状病毒N蛋白的人IgM亚型单克隆抗体，或为抗新型冠状病毒N蛋白人源IgG型多克隆抗体；
阴性对照hIgG抗体样品（hIgG同型对照样品），为与新型冠状病毒S1蛋白和新型冠状病毒N蛋白无结合的人源免疫球蛋白IgG；
阴性对照hIgM抗体样品（hIgM同型对照样品），为与新型冠状病毒S1蛋白和N蛋白无结合的人源免疫球蛋白IgM；
所述试剂盒还包括最低检出限参考品，其为8~20份不同发病时间的新型冠状病毒IgG和IgM抗体阳性血清样本灭活后混合得到的，检测时按照比例稀释使用。
根据本发明的具体实施方案，本发明的试剂盒，其中还包括流式检测缓冲液，所述流式检测缓冲液为含有0.5-2% BSA蛋白的0.01M磷酸盐缓冲液，pH7.4。
本发明的试剂盒可用于同时检测新型冠状病毒S1蛋白和N蛋白的IgG和IgM抗体。
另一方面，本发明还提供了一种利用本发明的试剂盒进行非诊断目的的新型冠状病毒抗体检测方法，其包括：
分别取负载IgG结合分子的纳米颗粒和负载抗 IgM 抗体的纳米颗粒加入反应管内，加入流式检测缓冲液洗涤，加入荧光标记的新型冠病毒S1蛋白、荧光标记的新型冠状病毒N蛋白和待测样品，于4℃孵育20min~1h；用流式检测缓冲液洗涤后，加入PBS液重悬细胞，进行流式检测。
本发明检测原理如下：IgG结合分子能够特异性结合所有人IgG亚型型免疫球蛋白的Fc段，而不结合人IgA、IgD、IgE 和IgM，因此负载IgG结合分子的纳米颗粒能够捕获待测样品中的人IgG型抗体。如果捕获的IgG抗体中含有抗S1蛋白的抗体，就能够与荧光（例如PE）标记的新型冠病毒S1蛋白结合，进而将PE标记在第一纳米颗粒上，通流式细胞仪检测就能检测到PE的荧光强度信号；如果IgG结合分子捕获的IgG蛋白是抗N蛋白的抗体，就能够与荧光（例如FITC）标记的新型冠病毒N蛋白结合，进而将FITC标记在第二纳米颗粒上，通流式细胞仪检测就能检测到FITC的荧光强度信号；如果捕获的IgG抗体中没有抗S1蛋白抗体或抗N蛋白的抗体，第一纳米颗粒就不能被标记上PE或FITC，流式检测不到荧光信号。第二纳米颗粒表面的抗人源 IgM抗体为特异性行识别人IgM的μ链的鼠源单克隆抗体，与IgA、IgD、IgE 和IgG无较差反应，同理如果待测样品中含有IgM型的抗S1蛋白的抗体或抗N蛋白的抗体，第二纳米颗粒就会被标记上PE和FITC，可被流式细胞仪检测到荧光强度信号。待测样品中抗体的浓度和亲和力与荧光强度信号成正相关。此外，第一纳米颗粒与第二纳米颗粒的粒径大小不同，通过流式细胞仪的前向散射光测定就可将其二者区分。所以此方法可同时检测待测样品中的S1蛋白和N蛋白的IgM和IgG抗体的存在和滴度。
在本发明的一些具体实施方案中，负载IgG结合分子的纳米颗粒为磁珠Ⅰ-ProteinG，磁珠I粒径为2.8μm，采用缓冲液保存，缓冲液为含0.03% 叠氮钠的0.01M磷酸盐缓冲液，pH7.4，使用量为10μl/样品。
在本发明的一些具体实施方案中，负载抗人源IgM抗体的纳米颗粒为磁珠Ⅱ-抗人源IgM抗体，磁珠II粒径为10μm，采用缓冲液保存，缓冲液为含0.03% 叠氮钠的0.01M磷酸盐缓冲液，pH7.4，使用量为10μl/样品。
在本发明的一些具体实施方案中，优选地，所述PE标记的新型冠状病毒S1蛋白，使用量为1μg/样品。
在本发明的一些具体实施方案中，优选地，所述FITC标记的新型冠状病毒N蛋白，使用量为0.5μg/样品。
在本发明的一些具体实施方案中，优选地，本发明所用S1蛋白的 hIgG 抗体阳性标准品、N蛋白的 hIgG抗体阳性标准品，S蛋白的 hIgM 抗体阳性标准品、N蛋白的 hIgM抗体阳性标准品，均为从新冠康复患者体内获取可变区序列并使用HEK293细胞重组表达获得。
在本发明的一些具体实施方案中，优选地，本发明所用 hIgG 同型对照样品和hIgM 同型对照样品均为本实验室重组表达，且通过流式和 ELISA 验证均与新型冠状病毒S1蛋白和新型冠状病毒N蛋白无非特异性结合。
在本发明的一些具体实施方案中，优选地，最低检出限参考品的3个最佳浓度稀释梯度：L1应检为阳性，稀释比例为1:100；L2可检为阳性或阴性，稀释比例为1:300；L3应检出阴性，稀释比例为1:500。
在本发明的一些具体实施方案中，优选地，所述流式检测缓冲液为含有0.5-2%BSA蛋白的0.01M磷酸盐缓冲液，pH7.4。
在本发明的一些优选具体实施方案中，本发明提供的新型冠状病毒IgG和IgM抗体检测方法包括：分别取10μl负载Protein G的第一纳米颗粒和负载抗 IgM 抗体的第二纳米颗粒加入反应管内，加入200μl 流式检测缓冲液洗涤1次，加入50μl 稀释后的PE标记的新型冠病毒S1蛋白、50μl 稀释后的FITC标记的新型冠状病毒N蛋白 和50μl稀释后的待测样品，于4℃孵育0.5h；用流式检测缓冲液洗涤3次后，加入200μl PBS重悬细胞，进行流式检测。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明以粒径不同的两种纳米颗粒作为载体，通过流式细胞仪进行结果分析，既可同时分析S蛋白的抗体和N蛋白的抗体，又能区分两种蛋白各自的抗体类型（IgG和IgM），可同时检测同一份待测样本中四种抗体，检测效率高，待测样品用量少，这是已有的ELISA法，S-Flow法和荧光素酶免疫沉淀法无法实现的。胶体金法虽然可以实现同时检测IgG和IgM两种不同抗体，但其不能定量分析，本发明中待测样品中抗体的浓度和亲和力与荧光强度信号成正相关，进而可对待测样品中抗体的滴度进行分析，这也弥补胶体金法检测的不足。
本发明中通过检测荧光信号来评估抗体滴度，这较ELISA中通过HRP酶活信号检测更为灵敏，较荧光素酶免疫沉淀法操作更简单。
本发明中用纳米颗粒作为载体，不受细胞培养条件和细胞状态限制，又使用Protein G和抗IgM抗体捕获待测抗体，因此与S-Flow法对比，使用更方便、操作更简单，重复性更好，灵敏度更高。
本发明提供的快速评估新型冠状病毒抗体的分析方法，是对现有新型冠状病毒抗体检测技术的有益补充和提高。即可应用于判断体内有无病毒及病毒感染情况，又可用于新型冠状病毒疫苗接种后的免疫反应的评估。
附图说明
图1为本发明中磁珠Ⅰ和磁珠Ⅱ流式示意图。
图2显示本发明新型冠病毒抗体检测流式图案例。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件。若未特别指明，实施例中所用原料均为市售商品。
本发明实施例所用组分中磁珠Ⅰ-Protein G（Invitrogen，Cat.No.1009D）为直接购买的市售商品。
本发明实施例所用组分磁珠Ⅱ-抗人源IgM抗体是本实验室通过常规小鼠杂交瘤方法筛选到特异性抗人源IgM抗体，经表面等离子共振 (SPR）技术（Biacore T200)）检测其与人源IgM蛋白的亲和力为0.5-1nM水平。扩大杂交瘤细胞生产抗体，将纯化后的抗体按PureProteome™ NHS FlexiBind Magnetic Bead System（Sigma， Cat.No. LSKMAGN04 ）使用说明偶联到NHS-磁珠上获得磁珠Ⅱ-抗人源IgM抗体。
本发明实施例所用PE标记的新型冠状病毒S1蛋白（Acrobiosystems，Cat.No.SPN-C52H9）和FITC标记的新型冠状病毒N蛋白（Acrobiosystems，Cat.No. NUN-C51H9）均为本实验通过真核细胞HEK293细胞表达，再通过常规偶联方法标记上PE和FITC荧光素获得。
本发明实施例所用S1蛋白的 hIgG 抗体阳性标准品、S蛋白的 hIgM 抗体阳性标准品、为从新冠康复患者体内获取可变区序列并使用HEK293细胞重组表达获得，两个抗体的可变区相同，恒定区分别为人源IgG1和IgM。可变区序列为：VH:EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDDYMHWVKQRPEQGLEWIGWIDPDNGDTEYASKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCTTLIYYYGSNSDYWGQGTTLTVSS（SEQ ID No. 1）
VL:DIQMTQSPSSLSASLGGKVTITCKASQDINKYIAWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDNLPRTFGGGTKLEIK（SEQ ID No. 2）。
本发明实施例所用N蛋白的 hIgG抗体阳性标准品， N蛋白的 hIgM抗体阳性标准品，为从新冠康复患者体内获取可变区序列并使用HEK293细胞重组表达获得。N蛋白的hIgG 抗体阳性标准品和N蛋白的 hIgM 抗体阳性标准品所用抗体的可变区相同，恒定区分别为人源IgG1和IgM。可变区序列为： VH:EVQLVESGAEVKASGAAVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADEGAYTMYMELSSLRSEDTAVYYCARGGWADGGNKGWYFDLWGRGTMVTVSS（SEQ ID No. 3）
VL:DIVMTQSPSSLSTSVNDRVTITCRASQSISSYLNWYQQRPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGADDTLTISSLQPEDFATAACQQSYSTPPTFGQGTKVEIK（SEQ ID No. 4）。
本发明实施例所用阴性对照 hIgG 抗体样品(Acrobiosytems，Cat.No. DN1-H5257) 。阴性对照 hIgM 抗体样品为本实验室使用HEK293细胞重组表达，其可变区与阴性对照 hIgG 抗体样品(Acrobiosytems，Cat.No. DN1-H5257)相同，恒定区改为IgM亚型，且通过流式和 ELISA 验证均与新型冠状病毒S1蛋白和新型冠状病毒N蛋白无非特异性结合。
本发明实施例中待测样品的稀释、磁珠洗涤均使用流式检测缓冲液，其组成为含有0.5-2% BSA蛋白的0.01M磷酸盐缓冲液，pH7.4。
本发明实施例中，确定每个待测样品对应PE标记的新型冠状病毒S1蛋白的量为0.1μg，对应 FITC标记的新型冠状病毒N蛋白使用量为0.05μg。
本发明实施例中，所用最低检出限参考品为10份不同发病时间的新型冠状病毒IgG和IgM抗体阳性血清样本，灭活后混合，通过优化实验条件，获得3个最佳浓度稀释梯度，L1应检为阳性，L2可检为阳性或阴性，L3应检出阴性。
本发明采用流式细胞仪检测新型冠状病毒抗体的磁珠免疫荧光方法，并进行灵敏度、特异性和精密度的优化。
实施例1、新型冠状病毒抗体检测试剂盒构建
本实施例提供的新型冠状病毒抗体的磁珠荧光免疫检测试剂盒，规格为100TEST，包括如下组分：
1. 磁珠Ⅰ-Protein G，规格为1ml；磁珠I粒径为2.8μm，采用缓冲液保存，缓冲液为含0.03% 叠氮钠的0.01M磷酸盐缓冲液，pH7.4，使用量为10μl/样品；
2. 磁珠Ⅱ-抗人源 IgM抗体，规格为1ml；磁珠II粒径为10μm，采用缓冲液保存，缓冲液为含0.03% 叠氮钠的0.01M磷酸盐缓冲液，pH7.4，使用量为10μl/样品；
3. PE标记的新型冠状病毒S1蛋白，冻干粉形式，1瓶，规格为10μg；
4. FITC标记的新型冠状病毒N蛋白，为冻干粉形式，1瓶，规格为5μg；
5. S蛋白的 hIgG 抗体阳性标准品，为冻干粉形式，1瓶，规格为10μg；
6. N蛋白的 hIgG 抗体阳性标准品，为冻干粉形式，1瓶，规格为10μg；
7. S蛋白的 hIgM抗体阳性标准品，为冻干粉形式，1瓶，规格为10μg；
8. N蛋白的 hIgM抗体阳性标准品，为冻干粉形式，1瓶，规格为10μg；
9. hIgG 同型对照样品，为冻干粉形式，1瓶，规格为10μg；
10. hIgM 同型对照样品，为冻干粉形式，1瓶，规格为10μg；
11. 最低检测限参考品，规格为100μl。
12. 流式检测缓冲液：2% BSA蛋白的0.01M磷酸盐缓冲液，1瓶，规格为200mL。
实施例2、试剂盒操作方法
实施例1的试剂盒使用时，操作方法如下：
1. 取PE标记的新型冠状病毒S1蛋白，加入100μl无菌超纯去离子水重构，浓度为100μg/ml，使用流式检测缓冲液配制浓度为2μg/ml工作液，备用。
2. 取FITC标记的新型冠状病毒N蛋白，加入100μl无菌超纯去离子水重构，浓度为50μg/ml，使用流式检测缓冲液配制浓度为1μg/ml工作液，备用。
3. 抗体阳性标品和抗体同型对照样品，均加入100μl无菌超纯去离子水重构，浓度为100μg/ml，再使用流式检测缓冲液稀释一系列浓度梯度，推荐浓度为0.003μg/ml，0.03μg/ml，0.3μg/ml和3μg/ml，备用。
4. 取最低检测限参考品，使用流式检测缓冲液按1:100、1:300和1:500稀释成工作液，备用。
5. 将磁珠Ⅰ-Protein G和磁珠Ⅱ-抗人源 IgM抗体分别吹打均匀，分别取10μl置于1.5ml 离心管内或96孔U型板的孔内，加入200μl 流式检测缓冲液，吹打均匀，使用磁力器或离心（1000rpm，5min），弃上清液，备用。
6. 向含有混合磁珠的离心管内或96孔U型板的孔内分别加入50μl 稀释后的PE标记的新型冠病毒S1蛋白、50μl 稀释后的FITC标记的新型冠状病毒N蛋白 和50μl稀释后的待测样品，于4℃孵育0.5h。
7. 孵育后使用磁力器或离心（1000rpm，5min），弃上清液，加200μl 流式检测缓冲液，洗涤3次后，弃上清液。
8. 向含反应管或板孔内，加入200μl PBS 重悬磁珠，并转移至流式上样管内，进行流式检测。
9. 保存FCS格式文件，拷贝于装备流式分析软件的电脑上，进行数据分析。
本发明的磁珠Ⅰ和磁珠Ⅱ流式图见图1。新型冠病毒抗体检测流式图参见图2。
实施例3、加速稳定性验证
将实施例2的试剂盒分别置于37℃存放0、1、5、10天，再对新型冠状病毒抗体阳性标准品进行检测，每个样品8个浓度梯度，对检测数据进行统计分析，可接受标准为：与对照组（0小时组）比较，EC50值的RSD值≤20.0%。不同时间测定结果见表1，与对照组比较，EC50值的RSD均小于20%，试剂盒在-20℃下至少可保存12个月。
表1 试剂盒加速稳定性实验结果
Figure 55996DEST_PATH_IMAGE001
实施例4、冻融稳定性验证
将实施例2的试剂盒中冻干组分重构后，按每管20μl进行分装，置于-70℃分别冻融1、2、3次，再对新型冠状病毒抗体阳性标准液样品进行检测，每个样品8个浓度梯度，对检测数据进行统计分析，可接受标准为：与对照组（0小时组）比较，EC50值的RSD值≤20.0%。不同时间测定结果见表2，与对照组比较，EC50值的RSD均小于20%，冻融3次对该试剂盒检测结果无影响。
表2 试剂盒组分冻融稳定性实验结果
Figure 504295DEST_PATH_IMAGE002
实施例5、专属性验证
按实施例2试剂盒中的操作方法，在稀释样品的流式检测缓冲液中添加0，10%，20%和50%的正常人血清配制含人血清基质的稀释液，分别用这些稀释液去配制新型冠状病毒抗体阳性标准品，每个样品8个浓度梯度，进行实验检测后对数据进行分析，可接受标准为：与对照组（流式检测缓冲液组）的检测数据进行比较，EC50值的RSD值≤20.0%。检测结果见表3，EC50之间的RSD值，均≤20.0%，证明该检测方法不受人血清成分感染，专属性强，可用于人血清样本检测。
表3 检测方法的专属性检测结果
Figure 815191DEST_PATH_IMAGE003
实施例6、检测方法精密度验证
按实施例2试剂盒中的操作方法，由2名操作人员不同天各自独立检测3份新型冠状病毒抗体阳性标准品，每个样品8个浓度梯度，对检测数据进行统计分析，可接受标准为：6组检测数据的EC50值的RSD值均≤20.0%。检测结果见表4，由该6组数据计算EC50值的RSD值为19%，小于20.0%，证明该检测方法有重复性和中间精密度良好。
表4 检测方法的重复性与中间精密度的检测结果
Figure 475979DEST_PATH_IMAGE004
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京百普赛斯生物科技股份有限公司
<120> 新型冠状病毒抗体检测试剂盒及其制备方法与应用
<130> GAI20CN7738
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asp
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Ser Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Leu Ile Tyr Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 124
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Ala Ser Gly Ala
1 5 10 15
Ala Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Gly Ala Tyr Thr Met Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Trp Ala Asp Gly Gly Asn Lys Gly Trp Tyr Phe Asp
100 105 110
Leu Trp Gly Arg Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Thr Ser Val Asn
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Asp Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Ala Ala Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105

Claims (10)

1.一种新型冠状病毒抗体的荧光免疫检测试剂盒，该试剂盒包括：
IgG结合分子，抗 IgM 抗体，荧光标记的新型冠状病毒S1蛋白，荧光标记的新型冠状病毒N蛋白，S1蛋白的 hIgG 抗体阳性标准品，N蛋白的 hIgG 抗体阳性标准品，S1蛋白的hIgM 抗体阳性标准品，N蛋白的 hIgM抗体阳性标准品，阴性对照 hIgG 抗体样品，阴性对照 hIgM 抗体样品；
其中，所述IgG结合分子负载于第一纳米颗粒上，所述抗IgM抗体负载于第二纳米颗粒上，所述第一纳米颗粒与第二纳米颗粒粒径不同。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述第一纳米颗粒、第二纳米颗粒各自独立地为非磁性纳米颗粒或磁性纳米颗粒，各纳米颗粒粒径1-30μm，并且，第一纳米颗粒与第二纳米颗粒的粒径差为2-20μm。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述IgG结合分子为Protein G、Protein A、Protein L或抗IgG的抗体；所述抗IgM抗体为抗人源 IgM 的鼠源单克隆抗体或抗IgM的其他种属单克隆抗体或多克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述荧光标记的新型冠状病毒S1蛋白为荧光标记的新型冠状病毒S-trimer蛋白或荧光标记的新型冠状病毒S1蛋白的RBD。
5.根据权利要求1或4所述的试剂盒，其中，所述荧光标记的新型冠状病毒S1蛋白所用的荧光染料包括PE、FITC、APC或Alexa Flour染料中的一种或多种；荧光标记的新型冠状病毒N蛋白中所用的荧光染料为FITC、PE、APC或 Alexa Flour中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述荧光标记的新型冠状病毒S1蛋白为PE标记的新型冠状病毒S1蛋白；荧光标记的新型冠状病毒N蛋白为FITC标记的新型冠状病毒N蛋白。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其中：
S1蛋白的 hIgG抗体阳性标准品，为抗新型冠状病毒S1蛋白的人IgG1亚型单克隆抗体，或为抗新型冠状病毒S1蛋白人源IgG型多克隆抗体；
N蛋白的 hIgG抗体阳性标准品，为抗新型冠状病毒N蛋白的人IgG1亚型单克隆抗体，或为抗新型冠状病毒N蛋白人源IgG型多克隆抗体；
S1蛋白的 hIgM 抗体阳性标准品， 为抗新型冠状病毒S1蛋白的人IgM亚型单克隆抗体，或为抗新型冠状病毒S1蛋白人源IgM型多克隆抗体；
N蛋白的 hIgM抗体阳性标准品，为抗新型冠状病毒N蛋白的人IgM亚型单克隆抗体，或为抗新型冠状病毒N蛋白人源IgG型多克隆抗体；
阴性对照 hIgG 抗体样品，为与新型冠状病毒S1蛋白和新型冠状病毒N蛋白无结合的人源免疫球蛋白IgG；
阴性对照 hIgM 抗体样品，为与新型冠状病毒S1蛋白和N蛋白无结合的人源免疫球蛋白IgM；
所述试剂盒还包括最低检出限参考品，其为8~20份不同发病时间的新型冠状病毒IgG和IgM抗体阳性血清样本灭活后混合得到的，检测时按照比例稀释使用。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其中还包括流式检测缓冲液，所述流式检测缓冲液为含有0.5-2% BSA蛋白的0.01M磷酸盐缓冲液，pH7.4。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，该试剂盒用于同时检测新型冠状病毒S1蛋白和N蛋白的IgG和IgM抗体。
10.一种利用权利要求1~9任一项所述的试剂盒进行非诊断目的的新型冠状病毒抗体检测方法，其包括：
分别取负载IgG结合分子的纳米颗粒和负载抗 IgM 抗体的纳米颗粒加入反应管内，加入流式检测缓冲液洗涤，加入荧光标记的新型冠病毒S1蛋白、荧光标记的新型冠状病毒N蛋白和待测样品，于4℃孵育20min~1h；用流式检测缓冲液洗涤后，加入PBS液重悬细胞，进行流式检测。
CN202110019972.5A 2021-01-07 2021-01-07 新型冠状病毒抗体检测试剂盒及其制备方法与应用 Active CN112379090B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110019972.5A CN112379090B (zh) 2021-01-07 2021-01-07 新型冠状病毒抗体检测试剂盒及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110019972.5A CN112379090B (zh) 2021-01-07 2021-01-07 新型冠状病毒抗体检测试剂盒及其制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112379090A true CN112379090A (zh) 2021-02-19
CN112379090B CN112379090B (zh) 2021-04-16

Family

ID=74590873

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110019972.5A Active CN112379090B (zh) 2021-01-07 2021-01-07 新型冠状病毒抗体检测试剂盒及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112379090B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113238048A (zh) * 2021-05-11 2021-08-10 上海真测生物科技有限公司 一种诊断标志物及其在区分新冠病毒感染和新冠病毒灭活疫苗接种中的应用
CN115232826A (zh) * 2021-04-22 2022-10-25 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种基于1096骨架序列的新冠病毒疫苗

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101363849A (zh) * 2008-09-24 2009-02-11 深圳市菲鹏生物股份有限公司 间接标记纳米颗粒的抗体检测捕获法及其试剂盒
CN111337673A (zh) * 2020-05-18 2020-06-26 博奥赛斯（天津）生物科技有限公司 一种用于新型冠状病毒免疫检测的合成多肽组合物及应用
CN111337682A (zh) * 2020-05-18 2020-06-26 博奥赛斯（天津）生物科技有限公司 一种新型冠状病毒IgM/IgG磁微粒化学发光免疫检测试剂盒
EP3715847A1 (en) * 2020-02-20 2020-09-30 Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG A method and reagents for the diagnosis of sars-cov-2

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101363849A (zh) * 2008-09-24 2009-02-11 深圳市菲鹏生物股份有限公司 间接标记纳米颗粒的抗体检测捕获法及其试剂盒
EP3715847A1 (en) * 2020-02-20 2020-09-30 Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG A method and reagents for the diagnosis of sars-cov-2
CN111337673A (zh) * 2020-05-18 2020-06-26 博奥赛斯（天津）生物科技有限公司 一种用于新型冠状病毒免疫检测的合成多肽组合物及应用
CN111337682A (zh) * 2020-05-18 2020-06-26 博奥赛斯（天津）生物科技有限公司 一种新型冠状病毒IgM/IgG磁微粒化学发光免疫检测试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LAURENT DROUOT ET AL: "Evaluation of Humoral Immunity to SARS-CoV-2: Diagnostic Value of a New Multiplex Addressable Laser Bead Immunoassay", 《FRONTIERS IN MICROBIOLOGY》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115232826A (zh) * 2021-04-22 2022-10-25 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种基于1096骨架序列的新冠病毒疫苗
CN115232826B (zh) * 2021-04-22 2023-09-26 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种基于1096骨架序列的新冠病毒疫苗
CN113238048A (zh) * 2021-05-11 2021-08-10 上海真测生物科技有限公司 一种诊断标志物及其在区分新冠病毒感染和新冠病毒灭活疫苗接种中的应用
CN113238048B (zh) * 2021-05-11 2024-03-15 抗码(苏州)生物科技有限公司 一种诊断标志物及其在区分新冠病毒感染和新冠病毒灭活疫苗接种中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112379090B (zh) 2021-04-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Algaissi et al. SARS-CoV-2 S1 and N-based serological assays reveal rapid seroconversion and induction of specific antibody response in COVID-19 patients
Faustini et al. Detection of antibodies to the SARS-CoV-2 spike glycoprotein in both serum and saliva enhances detection of infection
ES2664173T3 (es) Ensayo para anticuerpos contra el virus jc
Anderson et al. Development and evaluation of a Luminex multiplex serology assay to detect antibodies to bovine herpes virus 1, parainfluenza 3 virus, bovine viral diarrhoea virus, and bovine respiratory syncytial virus, with comparison to existing ELISA detection methods
CN112379090B (zh) 新型冠状病毒抗体检测试剂盒及其制备方法与应用
US20210088517A1 (en) MULTIPLEX HIGH-THROUGHPUT FLOW CYTOMETRY DETECTION OF SARS-COV-2-SPECIFIC IgG, IgA AND IgM
Mehdi et al. Development of a fast SARS-CoV-2 IgG ELISA, based on receptor-binding domain, and its comparative evaluation using temporally segregated samples from RT-PCR positive individuals
EP3084441B1 (en) Improved diagnostic test for csfv antibodies
Khan et al. Simultaneous detection of antibodies to six nonhuman-primate viruses by multiplex microbead immunoassay
US20230072761A1 (en) Immunoassay for Detecting Zika Virus Infection
Cáceres‐Martell et al. Single‐reaction multi‐antigen serological test for comprehensive evaluation of SARS‐CoV‐2 patients by flow cytometry
US10309964B2 (en) Method for assessing risk of human cytomegalovirus active infection in body and related kit
Ferris et al. Utility of recombinant integrin αvβ6 as a capture reagent in immunoassays for the diagnosis of foot-and-mouth disease
CN106632618A (zh) 一种猪戊型肝炎病毒orf2重组蛋白的制备方法及其orf2蛋白和检测试剂盒
US20230176054A1 (en) Coronavirus assay
WO2022032497A1 (zh) 用于检测冠状病毒中和抗体的试剂盒、方法
WO2021221082A1 (ja) ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシド断片および該断片を用いて抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出する方法およびキット
Lazutka et al. Saliva as an alternative specimen for detection of Schmallenberg virus-specific antibodies in bovines
Gaber et al. Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) immunoglobulins using chemiluminescence immunoassay and its correlation with neutralizing antibodies
CA2671474C (en) A method for detecting human parvovirus antigen
CN105136782A (zh) 一种免疫磁微粒化学发光法hcmv ie1抗原检测试剂盒
Corcoran et al. Improved detection of acute parvovirus B19 infection by immunoglobulin M EIA in combination with a novel antigen EIA
WO2022165982A1 (zh) 一种抗体检测方法
US11287423B2 (en) Assay for JC virus antibodies
Buhling et al. Simultaneous detection and differentiation of anti-Helicobacter pylori antibodies by flow microparticle immunofluorescence assay

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant