IT202000011182A1 - Test domiciliare per la diagnosi integrata di infezione da sars-cov-2 - Google Patents
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Description
"Test domiciliare per la diagnosi integrata di infezione da SARS-CoV-2"
CAMPO DELL'INVENZIONE
La presente invenzione si riferisce a un metodo per la diagnosi integrata di infezione da SARS-CoV-2, basato sulla rivelazione di particelle virali di SARS-CoV-2 e/o di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 della classe IgA in un campione di saliva. L?invenzione riguarda anche dei kit operabili in ambito domiciliare per la diagnosi integrata di infezione da SARS-CoV-2.
STATO DELL?ARTE
Gli sviluppi dell?epidemia di Covid-19 hanno drammaticamente dimostrato una insufficiente capacit? della maggior parte dei Sistemi Sanitari Nazionali nel diagnosticare l?infezione da virus SARS-CoV-2 non solo in larghe fasce della popolazione asintomatica o paucisintomatica, ma purtroppo anche negli individui con forte sospetto clinico di aver contratto la malattia e che sono confinati in ambito domiciliare e non ospedaliero. In questo scenario, le attuali capacit? diagnostiche appaiono su scala mondiale fortemente sottodimensionate. Nonostante numerosi progressi siano stati compiuti nella velocizzazione e semplificazione di test virologici di tipo molecolare (PCR) basati su amplificazione Real-Time del tampone nasale/orofaringeo del paziente, tale metodica, l?unica attualmente accreditata per la diagnosi virologica di infezione da SARS-CoV-2, presenta forti limiti di accessibilit?, richiedendo l?intervento di un operatore professionale per il prelievo, nonch? il trasferimento del campione ad un laboratorio specializzato. Tale metodica comporta inoltre un rischio infettivologico specifico per gli operatori stessi.
I cosiddetti ?test rapidi?, attualmente in forte diffusione, superano solo in parte i limiti sopra descritti. Questi test si identificano in larga parte con test sierologici per la rilevazione qualitativa di anticorpi specifici anti CoV-2 di classe IgG/lgM, in immunocromatografia (Lateral Flow Assay). Il test ? facilmente praticabile con l?utilizzo di una goccia di sangue o di siero, ma l?uso ? comunque riservato, al momento, esclusivamente all?ambito ospedaliero o ambulatoriale. Mentre alcuni studi hanno messo in dubbio l'utilit? diagnostica di questo tipo di test nelle fasi iniziali della infezione (Cassaniti I. et al. J. Med. Virai. 2020), essi sono certamente in grado di fornire informazioni sull'avvenuto contatto con il virus dopo un sufficiente numero di giorni (Guo L. et al. Clin. Infect. Dis. 2020), anche se dubbi ancora esistono sul reale significato protettivo di tale risposta anticorpale.
Sorprendentemente, la gran parte dei test ?rapidi? su citati non sembra includere la valutazione delle immunoglobuline di classe IgA, notoriamente fondamentali nell'immunit? mucosale e pi? specificamente nella protezione da infezioni da parte di virus respiratori, inclusi i coronavirus (Allie, S. R. & Randall, T. D. Clinic Science 2017; Callow, K. A. J. Hyg. (Lond). 1985). Il motivo di tale scelta risiede probabilmente nel fatto che le immunoglobuline IgA specifiche sono meno concentrate nel siero rispetto alle immunoglobuline di altre classi. Esse sono tuttavia le Ig pi? rappresentate nelle secrezioni nasali. Inoltre, studi sulla immunit? mucosale contro i virus influenzali hanno dimostrato come le slgA compaiano precocemente nelle secrezioni nasali dopo la prima infezione (3-5 giorni) e vi permangano per 3-5 mesi, svolgendo un ruolo primario nella resistenza alla reinfezione (Gianchecchi, E. et al. Viruses 2019).
Dalla combinazione di queste informazioni si evince come la rivelazione di IgA secretorie contro SARS-CoV-2 possa rappresentare un indice prezioso e precoce di immunit? individuale contro questo agente.
Fra i diversi test sierologici commerciali attualmente disponibili per SARS-CoV-2, un elenco recentemente pubblicato dalla Johns Hopkins University riporta soltanto un test ELISA convenzionale specifico per la rivelazione delle IgA (Euroimmun, Germania). A fronte di tale scenario, rimane evidente l?esigenza di sviluppare nuove metodiche e kit commerciali che forniscano una possibilit? di diagnosi rapida e affidabile di infezioni da SARS-CoV-2 e che possano essere impiegati in ambito domiciliare da personale non esperto.
SOMMARIO DELL'INVENZIONE
Lo scopo della presente invenzione ? quello di ovviare alle limitazioni delle metodologie attualmente disponibili per la diagnosi di infezioni da SARS-CoV-2, fornendo un test diagnostico semplice, a basso impatto tecnologico, ed operabile in ambito domiciliare, basato sulla rivelazione integrata (a) del virus SARS-CoV-2 (antigene), e b) delle immunoglobuline di classe IgA secretorie specifiche (anti SARS-CoV-2), in un campione di escreato o di saliva dall?orofaringe posteriore.
La rivelazione integrata del virus SARS-CoV-2 e delle immunoglobuline di classe IgA nel campione di saliva, conferisce al metodo della presente invenzione un?elevata affidabilit? e buona sensibilit? per la diagnosi di infezione. Vantaggiosamente, l?esecuzione del test oggetto dell?invenzione non richiede inoltre l?intervento di un operatore sanitario, pu? quindi essere operato direttamente da personale non esperto in ambito domiciliare ed interpretato dal medico tramite, ad esempio, semplice documentazione fotografica.
L?utilizzo del test domiciliare come descritto nella presente invenzione, intende rappresentare solo un primo livello di valutazione dello stato infettivo ed immunologico dell'individuo, ma accessibile in maniera capillare e senza nessun rischio per gli operatori, con vantaggi evidenti non solo per la gestione della corrente emergenza epidemica, ma anche per il monitoraggio nel tempo della sua evoluzione e per studi epidemiologici ed interventi di sanit? pubblica su larga scala.
La possibilit? di raggiungere in maniera capillare individui, sintomatici o asintomatici, per una valutazione sufficientemente sensibile e specifica sia della presenza di infezione che dello sviluppo di una immunit? presumibilmente protettiva, potrebbe infatti non solo indirizzare in maniera mirata il percorso del singolo individuo (con eventuali misure di isolamento o ricovero), ma sarebbe una fonte preziosa di informazioni epidemiologiche per il monitoraggio dell?emergenza epidemica e per la sua gestione sanitaria e politica.
Pertanto, un primo aspetto della presente invenzione riguarda un metodo per la diagnosi di infezione da SARS-CoV-2 basato sulla rivelazione in un campione biologico di particelle virali di SARS-CoV-2 e/o immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA, in cui detto campione biologico ? un campione di saliva.
Un secondo aspetto della presente invenzione riguarda un kit per la diagnosi di infezione da SARS-CoV-2 comprendente uno o pi? mezzi per la rivelazione, mediante test di agglutinazione, di particelle virali di SARS-CoV-2 in un campione di saliva.
Un terzo aspetto della presente invenzione si riferisce a un kit per la diagnosi di infezione da SARS-CoV-2 comprendente uno o pi? mezzi per la rivelazione, mediante test di immunocromatografia a flusso laterale (LFA), di particelle virali di SARS-CoV-2 in un campione di saliva.
Un quarto aspetto dell?invenzione si riferisce a un kit per la diagnosi di infezione da SARS-CoV-2 comprendente uno o pi? mezzi per la rivelazione, mediante test di agglutinazione, di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA in un campione di saliva.
Infine un quinto aspetto della presente invenzione riguarda un kit per la diagnosi di infezione da SARS-CoV-2 comprendente uno o pi? mezzi per la rivelazione, mediante test di immunocromatografia a flusso laterale (LFA), di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA in un campione di saliva.
Altri vantaggi e caratteristiche della presente invenzione risulteranno evidenti dalla seguente descrizione dettagliata.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE
Figura 1. Illustrazione schematica dei componenti e del principio di funzionamento del metodo secondo una forma di realizzazione della presente invenzione. Test CoV2-Agglutinazione di biglie di latex. La sospensione di biglie di latex ha un aspetto lattescente diffuso in assenza di antigene (virus) mentre forma degli aggregati visibili ad occhio nudo in presenza di esso. I due esempi riportati di reazione negativa e positiva hanno solo valore esplicativo e non sono stati ottenuti con questo specifico test.
Figura 2. Due possibili formati per un concentratore del fluido salivare di semplice utilizzo e compatibile con un uso domiciliare da utilizzare nei metodi e kit secondo una forma di realizzazione preferita della presente invenzione. Il formato a) ? rappresentato da una bustina da immergere nel campione. Nel formato b) il concentratore comprende due camere, una per il PEO e l?altra per il campione. In entrambi i casi la concentrazione avviene per osmosi diretta (?forward osmosis?) per richiamo dell?acqua da parte di una soluzione concentrata (?draw solution?) di Polyethylene Oxide (PEO) ad alto peso molecolare (>200 kD). L?interposizione di una membrana da dialisi con cut-off 10-12 kD tra le due soluzioni consente di concentrare nella saliva tutti i componenti di dimensioni superiori, inclusi microrganismi ed anticorpi.
Figura 3. Illustrazione schematica del metodo secondo una forma di realizzazione della presente invenzione. Test per la evidenziazione delle IgA salivari anti SARS-CoV-2 (Spike protein) mediante Test di Agglutinazione di biglie di latex. Il principio ? simile a quello descritto in figura 1, ma in questo caso l?antigene virale ? adsorbito sulla superficie delle biglie, mentre l?agente agglutinante (sotto forma di slgA specifiche) ? contenuto nel campione. I componenti del test sono illustrati dalla legenda. Da notare come la natura dimerica delle slgA faciliti il processo di agglutinazione. ? anche evidenziata la struttura dell?antigene ricombinante, in cui la componente virale (S1) ? fusa alla porzione Fc delle IgG murine. Il potere agglutinante delle IgA salivare potrebbe essere ulteriormente aumentato da anticorpi anti IgA (mono o policlonali, elemento arancione in figura), attraverso la aggregazione di slgA legate a biglie diverse.
Figura 4. Illustrazione schematica del metodo secondo una forma di realizzazione della presente invenzione. Test immunocromatografico (Lateral Flow Assay) per la evidenziazione di slgA anti CoV2-SP1 nell?escreato/saliva del probando. I diversi componenti del test sono illustrati nella legenda. Nella configurazione illustrata in a) la linea di cattura contiene un reagente anti Ulfa-tag. Sul versante sinistro, Timmunocomplesso SP1-gold/slgA viene bloccato sulla linea di cattura da un anticorpo anti IgA marcato con Ulfa-tag (esito positivo). Sul versante destro, un reagente commerciale anti SP1, marcato anch?esso con Ulfa-tag, pu? essere utilizzato come ulteriore controllo positivo. Il segnale della linea di controllo, che contiene Streptavidina, ? fornito da particelle Gold marcate con biotina.
b) Il test pu? anche essere immaginato in una configurazione ad hoc (che richiede manifattura industriale), con il reagente anti IgA direttamente immobilizzato sulla linea di cattura, ed un anticorpo anti-mouse Fc (mFc) sulla linea di controllo. In questa seconda configurazione ? possibile anche immaginare che il coniugato SP1-gold sia gi? presente, in forma essiccata, sulla striscetta. In entrambe le configurazioni il test ? immaginato come un ?dipstick? che il probando immerge in un contenitore contenente la saliva o il suo concentrato.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA
GLOSSARIO
I termini impiegati nella presente descrizione sono come generalmente compresi dall?esperto della tecnica, salvo ove diversamente indicato.
Con l?acronimo SARS-CoV-2, derivante dall?inglese ?Severe Acute Respiratory Syndrome - Coronavirus - 2), la presente invenzione si riferisce al coronavirus 2 da sindrome respiratoria acuta grave, un ceppo virale della specie SARS-related coronavirus (o SARS-CoV), facente parte del genere Betacoronavirus, scoperto intorno alla fine del 2019. Si riferisce in particolare, al settimo coronavirus riconosciuto in grado di infettare gli esseri umani. Lo strato pi? esterno del virus SARS-CoV-2 ? caratterizzato da glicoproteine S (o ?Spike?, dall?inglese ?punta?, ?spuntone?) assemblate a formare delle strutture trimeriche che costituiscono la caratteristica ?corona? che circonda il virione. Le glicoproteine S determinano la specificit? del virus per le cellule epiteliali del tratto respiratorio. L?ectodominio delle proteine Spike ? caratterizzato da due domini distinti: un dominio N-terminale, denominato S1, responsabile per il legame al recettore umano ACE2 nelle cellule epiteliali, e un dominio C-terminale, denominato S2, responsabile della fusione.
Una seconda proteina di rivestimento, nota come dimero emagglutinina-esterasi (HE), pi? piccola della proteina S, svolge una funzione importante durante la fase di rilascio del virus all?interno delle cellule ospite. Il virus ? costituito anche da proteine di membrana che attraversano il rivestimento esterno, interagendo all?interno del virione con il complesso RNA-proteina.
Il genoma del virus ? costituito da un singolo filamento di RNA a polarit? positiva di grande dimensione (da 27 a 32 kb nei diversi virus), associato alla proteina N, che ne aumenta la stabilit?.
Con l?acronimo COVID-19 (dall?acronimo inglese Coronavirus Disease 19), o malattia respiratoria acuta da SARS-CoV-2, si intende una malattia infettiva respiratoria causata dal virus SARS-CoV-2. Il virus si trasmette per via aerea, molto spesso sotto forma di goccioline respiratorie. La malattia ? caratterizzata da una serie di sintomi descritti come simil-influenzali, tra cui febbre, tosse, respiro corto, e disturbi gastrointestinali. Nei casi pi? gravi pu? verificarsi una polmonite, una sindrome da distress respiratorio acuto, sepsi, shock settico, fino a provocare il decesso del paziente.
Con l?acronimo IgA, la presente invenzione si riferisce alle immunoglobuline di classe A. Le IgA costituiscono circa il 15% delle immunoglobuline presenti nel sangue ma sono presenti anche nella saliva, nelle lacrime, nelle secrezioni gastriche, e nel latte materno. Le IgA possono fornire pertanto una protezione contro infezioni delle mucose, comprendenti il tratto respiratorio, alte e basse vie e tratto gastrointestinale, stomaco e intestino. Con l?acronimo slgA l'invenzione si riferisce in maniera specifica alle immunoglobuline di classe A secretorie, presenti principalmente nelle secrezioni nasali e mucosali in forma prevalentemente dimerica ma anche tri- o tetramerica. Esse contengono, rispetto alle IgA piasmatiche, due componenti proteiche aggiuntive, la catena J (?joining?) e la componente Secretoria. Le slgA sono secrete dalle cellule del plasma adiacenti alle cellule epiteliali mucosali e rappresentano il principale mediatore umorale dell?immunit? mucosale.
Come menzionato, lo scopo della presente invenzione ? fornire un test rapido, affidabile, e operabile in ambito domiciliare, per la diagnosi di infezioni da SARS-CoV-2. Il test della presente invenzione si basa sulla rivelazione integrata del virus SARS-CoV-2, e/o delle immunoglobuline secretorie anti-SARS-CoV-2 di classe IgA, agenti anticorpali immediatamente coinvolti nella difesa dal contagio da parte del virus e particolarmente importanti per la valutazione dell'immunit? mucosale.
Pertanto, un primo aspetto della presente invenzione si riferisce a un metodo per la diagnosi di infezione da SARS-CoV-2 basato sulla rivelazione in un campione biologico di particelle virali di SARS-CoV-2 e/o di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 della classe IgA, in cui detto campione biologico ? un campione di saliva.
In particolare, secondo un aspetto dell?invenzione, la rivelazione di particelle virali di SARS-CoV-2 e/o di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 della classe IgA in detto campione biologico corrisponde ad una diagnosi positiva di infezione da SARS-CoV-2.
Inoltre, secondo un aspetto dell?Invenzione, la rivelazione di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA in detto campione biologico rappresenta un indice positivo dello sviluppo di una riposta immunitaria al virus SARS-CoV-2.
Il campione di saliva sottoposto ad analisi secondo il metodo della presente invenzione ? preferibilmente un campione di saliva dell?orofaringe posteriore, o un campione di secrezioni orofaringee. Secondo un aspetto dell?invenzione, detto campione di saliva pu? essere ottenuto da un soggetto asintomatico, oppure da un soggetto che gi? presenta i sintomi di infezione da SARS-CoV-2, ad esempio sintomi di moderata entit?, quali febbre, tosse, respiro corto, disturbi gastrointestinali, oppure sintomi pi? gravi, quali polmonite.
Come gi? accennato, lo strato esterno delle particelle virali di SARS-CoV-2 ? costituito principalmente da glicoproteine Spike, composte da due subunit?, S1 ed S2, organizzate a formare delle strutture trimeriche sulla superficie del virione.
Pertanto, secondo un aspetto della presente invenzione, la rivelazione di dette particelle virali di SARS-CoV-2 in detto campione di saliva, si basa sulla rivelazione di uno o pi? antigeni del virus SARS-CoV-2, in particolare sulla rivelazione di subunit? S1 di proteine Spike di SARS-CoV-2 e/o subunit? S2 di proteine Spike di SARS-CoV-2.
La rivelazione di detti uno o pi? antigeni di SARS-CoV-2, e/o di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA, pu? essere condotta utilizzando reagenti che siano in grado di legare selettivamente detti uno o pi? antigeni e/o dette immunoglobuline di classe IgA formando un complesso, ed impiegando mezzi in grado di rivelare la formazione di detto complesso, ad esempio generando un segnale facilmente rivelabile ad occhio nudo.
Secondo un aspetto dell?invenzione, detta rivelazione, in un campione di saliva, di uno o pi? antigeni del virus SARS-CoV-2, pu? essere effettuata mediante test di agglutinazione. L?agglutinazione ? un fenomeno macroscopico che pu? essere apprezzato ad occhio nudo su uno sfondo chiaro o trasparente e non richiede alcuna strumentazione tecnica. Un primo requisito necessario perch? l?agglutinazione possa avvenire ? che l?antigene da rivelare sia presente in numerose copie ripetute sul microorganismo, requisito soddisfatto dalle proteine Spike di SARS-CoV-2. Un secondo requisito ? che il virus sia presente in alto titolo nel campione biologico da analizzare. In un aspetto preferito dell'invenzione, detto test di agglutinazione ? un test di agglutinazione di biglie di latex (Latex Agglutination Test). In questo test specifico, la presenza dell?antigene viene evidenziata dalla agglutinazione (?dumping?) di particelle di latex (generalmente blu o nere) ricoperte di anticorpi specifici contro l?antigene stesso.
Secondo un aspetto dell'invenzione, dette biglie di latex possono essere rivestite con anticorpi anti-SARS-CoV-2. Preferibilmente, dette biglie di latex possono essere rivestite con anticorpi anti-SARS-CoV-2 in concentrazione compresa tra 2 e 0.2 mg per mg di latex.
Secondo un aspetto preferito dell?invenzione, detti anticorpi anti-SARS-CoV-2 sono anticorpi anti-proteine Spike di SARS-CoV-2. In particolare, detti anticorpi anti-SARS-CoV-2 possono essere scelti tra anticorpi anti-subunit? S1 di proteine Spike di SARS-CoV-2, e/o anticorpi anti-subunit? S2 di proteine Spike di SARS-CoV-2.
Esempi non limitanti di anticorpi anti-SARS-CoV-2 commercialmente disponibili che possono essere utilizzati nei metodi e kit qui descritti includono anticorpi di coniglio policlonali anti-proteine Spike di SARS-CoV-2 (#434243 MyBioSource, oppure Cat. No.: 3525 ProSci Inc.), anticorpi di coniglio monoclonali anti-proteine Spike di SARS-CoV-2 (40150-R007 Sino Biological), o anticorpi murini monoclonali anti-proteine Spike di SARS-CoV-2 (#GTX632604 GenTex).
La preparazione delle biglie di latex rivestite dagli anticorpi, o ?sensibilizzate?, secondo una delle forme della presente invenzione, pu? essere effettuata utilizzando una qualsiasi delle procedure standard note nel settore, ad esempio impiegando kit e/o reagenti anticorpali disponibili commercialmente, secondo le indicazioni dei rispettivi fornitori. In particolare, l'aggiunta di albumina di siero bovino (BSA) alla sospensione di biglie di latex pu? essere utile per aumentare la stabilit? dei coniugati e per bloccare dei siti aspecifici di legame sulla superficie della biglia.
Secondo un aspetto dell?invenzione, detto metodo di agglutinazione di biglie di latex, comprende i seguenti passaggi: i) mettere in contatto detto campione di saliva per un tempo di almeno 5 minuti, preferibilmente compreso tra 2 e 5 minuti con dette biglie di latex, ii) rivelare la comparsa di agglutinazione, per cui la comparsa di agglutinazione indica la presenza di uno o pi? antigeni del virus SARS-CoV-2, e per estensione di vinoni potenzialmente infettanti, in detto campione di saliva da analizzare.
Per verificare che il processo di agglutinazione osservato sia effettivamente indicativo della presenza di uno o pi? antigeni del virus SARS-CoV-2 all'interno del campione di saliva da analizzare, e non sia invece legato ad un processo aspecifico di aggregazione, o ?falso positivo?, il metodo della presente invenzione pu? prevedere un passaggio in cui ? valutata l'agglutinazione, mediante biglie di latex, di un campione di controllo.
Pertanto, un aspetto della presente invenzione si riferisce a un metodo secondo una qualsiasi delle forme precedentemente descritte, in cui un primo volume di reagente comprendente dette biglie di latex ? messo in contatto con un volume di detto campione di saliva da analizzare, e un secondo volume di reagente comprendente dette biglie di latex ? messo in contatto con un volume di un campione di controllo per un tempo di almeno 5 minuti, preferibilmente compreso tra 2 e 5 minuti, e in cui la comparsa di agglutinazione in detto campione biologico da analizzare e l?assenza di agglutinazione in detto campione di controllo indicano la presenza di uno o pi? antigeni del virus SARS-CoV-2 in detto campione biologico da analizzare.
Un campione di controllo adatto secondo la presente invenzione ?, ad esempio, una sospensione in cui sono assenti detti antigeni del virus SARS-CoV-2. Per visualizzare agevolmente l?agglutinazione, il metodo della presente invenzione secondo una qualsiasi delle forme qui descritte, pu? comprendere l?uso di uno o pi? vetrini e/o uno o pi? cartoncini per test di agglutinazione.
Vetrini che possono essere impiegati per il test di agglutinazione secondo la presente invenzione sono ad esempio, vetrini caratterizzati da due concavit?, in modo che i test di agglutinazione sul campione da analizzare e sul campione di controllo (sicuramente negativo) possano essere condotti simultaneamente fianco a fianco.
In una forma di realizzazione, ad esempio, un volume pari a 15 microlitri di sospensione di biglie di latex sensibilizzate pu? essere posto sulla superficie concava di un apposito vetrino da microscopia, accanto ad un uguale volume del campione di saliva da testare. Le due gocce di liquido possono essere mescolate prima con l?estremit? di una punta sterile e poi con un leggero movimento di rotazione orbitale dell?intero vetrino. L?eventuale reazione di agglutinazione apparir? come una distribuzione irregolare delle biglie in aggregati (dumping). Per facilitare la visualizzazione degli aggregati ? anche possibile osservare il vetrino contro lo sfondo di un cartoncino chiaro. Una forma di realizzazione preferita del metodo ? illustrata a titolo esemplificativo in Figura 1.
Secondo un ulteriore aspetto della presente invenzione, detta rivelazione, in un campione di saliva, di uno o pi? antigeni del virus SARS-CoV-2, pu? essere effettuata mediante test di immunocromatografia a flusso laterale (Lateral Flow Assay, LFA). In particolare, secondo un aspetto dell?invenzione, detto test di immunocromatografia a flusso laterale comprende i passaggi di:
i) mettere in contatto un volume di una soluzione comprendente detto campione di saliva da analizzare con un supporto solido; detto supporto solido ? caratterizzato da (a) una prima area ?di cattura? comprendente un agente di cattura immobilizzato, capace di formare un complesso con uno o pi? antigeni del virus SARS-CoV-2 e da (b) una seconda area ?di controllo? comprendente un agente di controllo immobilizzato capace di formare un complesso con un agente di rivelazione;
ii) diagnosticare infezioni da SARS-CoV-2 quando un segnale visibile ad occhio nudo compare nella prima area ?di cattura? e un segnale visibile ad occhio nudo compare nella seconda area ?di controllo?. Per visibile ad occhio nudo s?intende ad esempio colorato in modo da essere rivelabile alla vista.
Supporti solidi idonei ad essere utilizzati nel test di immunocromatografia a flusso laterale della presente invenzione sono ad esempio supporti comprendenti una membrana e/o carta attraverso cui la soluzione del campione da analizzare pu? migrare per azione capillare.
Esempi non limitanti di detti supporti solidi includono ad esempio membrana in nitrocellulosa, Acetato di Cellulosa, polyvinylidene fluoride (PVDF), Nylon e polyethersulfone (PES), differenti fra loro per porosit? e carica elettrica. Detti supporti possono avere una forma idonea allo svolgimento del test, quale, ad esempio, una forma a striscetta.
L?agente di rivelazione utilizzato nel test di immunocromatografia a flusso laterale secondo la presente invenzione pu? essere aggiunto alla soluzione comprendente detto campione di saliva da analizzare oppure, in alternativa, pu? essere direttamente incorporato su/in detto supporto solido.
In particolare, secondo un aspetto dell?invenzione, detto agente di rivelazione pu? essere incorporato su/in detto supporto solido su/in un?area che precede detta prima area ?di cattura?. In questo modo, l?analita presente della soluzione del campione biologico da analizzare, migrando attraverso detto supporto solido, incontra ed interagisce con detto agente di rivelazione, per poi essere successivamente bloccato, e quindi rivelato, su/in detta area ?di cattura?.
Detto agente di rivelazione pu? essere in forma liquida o in forma essiccata, preferibilmente ? in forma essiccata se incorporato su/in detto supporto solido.
Un agente di rivelazione adatto ad essere utilizzato nel test di immunocromatografia a flusso laterale per la rivelazione di uno o pi? antigeni di SARS-CoV-2 secondo una delle forme della presente invenzione, ? un composto in grado di legare uno o pi? antigeni del virus SARS-CoV-2, coniugato ad un agente marcatore.
In un aspetto preferito dell?invenzione, detto agente di rivelazione ? un anticorpo anti-SARS-CoV-2, coniugato ad un agente marcatore.
Esempi non limitanti di agenti marcatori che possono essere coniugati a detto agente di rivelazione, includono biglie di latex, o nanoparticelle di oro colloidale di diametro compreso tra 10 e 80 nm.
In una forma preferita dell?invenzione, detto agente marcatore ? una nanoparticella di oro di diametro pari a 40 nm.
La prima area ?di cattura? e la seconda area ?di controllo? come descritte nella presente invenzione, possono essere realizzate sul supporto solido selezionato per test di immunocromatografia a flusso laterale, in una forma a scelta tra spot circolare o linea. Un agente di cattura immobilizzato idoneo per la formazione di un complesso con uno o pi? antigeni del virus SARS-CoV-2, pu? essere, ad esempio, un anticorpo anti-SARS-CoV-2. Preferibilmente, detto anticorpo anti-SARS-CoV-2 ? un anticorpo antiproteine Spike di SARS-CoV-2.
Un agente di controllo immobilizzato idoneo per la formazione di un complesso con uno degli agenti di rivelazione indicati, pu? essere un anticorpo capace di riconoscere la porzione Fc (comune, non legante l?antigene) dell?anticorpo di rivelazione (es. un anticorpoanti rat Fc se l?agente rivelatore ? un anticorpo generato nel ratto).
In una forma di realizzazione preferita del test di immunocromatografia a flusso laterale per la rivelazione di uno o pi? antigeni di SARS-CoV-2, detto agente di cattura immobilizzato ? un anticorpo anti-subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2; detto agente di controllo immobilizzato ? un anticorpo policlonale anti rat IgG (porzione Fc); e detto agente di rivelazione ? un anticorpo monoclonale di ratto anti-subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2 coniugato ad una nanoparticella di oro dal diametro di 40 nm.
I supporti solidi per test di immunocromatografia a flusso laterale secondo una delle forme di realizzazione descritte nella presente invenzione, possono essere fabbricati impiegando uno o pi? kit commerciali disponibili e/o impiegando tecniche industriali note nel settore.
Come gi? accennato, uno dei vantaggi della presente invenzione consiste nella possibilit? di combinare la rivelazione di uno o pi? antigeni del virus SARS-CoV-2 in un campione di saliva, alla rivelazione di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA nello stesso campione, fornendo pertanto un metodo diagnostico affidabile e robusto per l'identificazione di infezione da SARS-CoV-2 e l'individuazione di una immunit? mucosale specifica.
Secondo un aspetto della presente invenzione, detta rivelazione di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA pu? essere effettuata impiegando test analoghi a quelli utilizzati per la rivelazione di uno o pi? antigeni di SARS-CoV-2 precedentemente descritti, quali, ad esempio, test di agglutinazione e/o test di immunocromatografia a flusso laterale.
Detta rivelazione di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA pu?, ad esempio, essere condotta mediante test di agglutinazione di biglie di latex. In questo caso, dette biglie di latex possono essere rivestite, o sensibilizzate, con antigeni nativi o ricombinanti del virus SARS-CoV-2.
Secondo un aspetto dell?invenzione, dette biglie di latex sono rivestite con antigeni nativi o ricombinanti del virus SARS-CoV-2 in concentrazione compresa tra 0.2 e 2 mg per mg di latex. In particolare, un aspetto preferito dell?invenzione si riferisce ad un test di agglutinazione mediante biglie di latex per la rivelazione di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA, in cui dette biglie sono rivestite con subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2, dette subunit? S1 sono fuse con la porzione Fc della immunoglobulina lgG1 di topo. Un esempio non limitante di subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2 utilizzabile per il rivestimento di dette biglie di latex, ? rappresentato da subunit? S1 di proteine Spike ricombinanti in cui la sequenza 1-685 della subunit? S1 ? fusa con la porzione Fc della Immunoglobulina lgG1 di topo (Cat: 40591 -V05H1, Sino Biological).
Secondo un ulteriore aspetto dell?invenzione, detto test di agglutinazione mediante biglie di latex per la rivelazione di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA, comprende i seguenti passaggi: i) mettere in contatto detto campione di saliva per un tempo di almeno 2 minuti, preferibilmente compreso tra 2 e 5 minuti con dette biglie di latex, ii) rivelare la comparsa di agglutinazione, per cui la comparsa di agglutinazione indica la presenza di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA in detto campione di saliva da analizzare.
Per confermare il corretto funzionamento della procedura di agglutinazione per la rivelazione di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA, anche in questo caso ? possibile effettuare il test su un campione ?di controllo?. Un idoneo campione ?di controllo? ? ad esempio una sospensione in cui siano assenti dette immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA. In alternativa, come controllo ? possibile utilizzare biglie prive dell?antigene SP1 (empty beads).
Pertanto, un aspetto dell?invenzione si riferisce ad un metodo di rivelazione di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA mediante test di agglutinazione di biglie di latex, in cui un primo volume di reagente comprendente dette biglie di latex ? messo in contatto con un volume di detto campione biologico da analizzare, e un secondo volume di reagente comprendente dette biglie di latex ? messo in contatto con un volume di un campione di controllo per un tempo di almeno 2 minuti, preferibilmente compreso tra 2 e 5 minuti, e in cui la comparsa di agglutinazione in detto campione di saliva da analizzare e l?assenza di agglutinazione in detto campione di controllo indicano la presenza di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA in detto campione di saliva da analizzare.
Sebbene le IgA secretorie siano gli anticorpi pi? rappresentati nella saliva (5-15 mg/dl, contro 1.5 mg/dl delle IgG e 0.5 delle IgM), e la struttura dimerica ne aumenti la capacit? agglutinante (4 siti di legame per l?antigene su ogni dimero), ? possibile che la quantit? di anticorpi specifici anti SP1 presenti nel fluido orofaringeo risulti comunque insufficiente a determinare una reazione macroscopicamente apprezzabile.
Pertanto, secondo un aspetto dell?invenzione, al fine di aumentare il potere agglutinante delle IgA secretorie presenti nel campione, detto volume di reagente comprendente le biglie di latex, pu? includere anche un agente agglutinante, quali anticorpi anti-immunoglobuline umane di classe IgA, ad esempio un anticorpo diretto contro la porzione Fc delle IgA umane.
Il test di agglutinazione mediante biglie di latex per la rivelazione di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA in una delle forme precedentemente descritte, comprende anche in questo caso uno o pi? vetrini e/o uno o pi? cartoncini per test di agglutinazione. Una forma di realizzazione preferita del metodo ? illustrata a titolo esemplificativo in Figura 3.
Come menzionato, la rivelazione di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA pu? essere condotta anche mediante test di immunocromatografia a flusso laterale.
Secondo un aspetto dell'invenzione, detto test di immunocromatografia a flusso laterale per la rivelazione di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA, comprende i passaggi di:
i) mettere in contatto un volume di una soluzione comprendente detto campione di saliva da analizzare con un supporto solido; detto supporto solido ? caratterizzato da (a) una prima area ?di cattura? comprendente un agente di cattura immobilizzato, capace di formare un complesso con dette immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA, e da (b) una seconda area ?di controllo? comprendente un agente di controllo immobilizzato capace di formare un complesso con un agente di rivelazione;
ii) diagnosticare la presenza di anticorpi salivari anti SARS-CoV-2 quando un segnale visibile ad occhio nudo compare nella prima area ?di cattura? e un segnale visibile ad occhio nudo compare nella seconda area ?di controllo?.
Supporti solidi idonei ad essere utilizzati nel test di immunocromatografia appena descritto possono essere scelti tra gli esempi gi? citati nella presente descrizione.
Analogamente, l?agente di rivelazione utilizzato in detto test di immunocromatografia a flusso laterale per la rivelazione di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA, pu? essere aggiunto alla soluzione comprendente detto campione di saliva da analizzare o, in alternativa, pu? essere direttamente incorporato su/in detto supporto solido, secondo una delle modalit? gi? descritte.
Un agente di rivelazione adatto ad essere impiegato in detto test di immunocromatografia per la rivelazione di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA ?, secondo un aspetto dell?invenzione, un agente in grado di legare dette immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA.
In particolare, in un aspetto preferito dell?invenzione, detto agente di rivelazione ? la subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2, fusa con la porzione Fc della immunoglobulina lgG1 di topo, dove detta subunit? S1 ? coniugata ad un agente marcatore. Un esempio non limitante di subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2 utilizzabile come agente di rivelazione, ? rappresentato da subunit? S1 di proteine Spike ricombinanti in cui la sequenza 1-685 della subunit? S1 ? fusa con la porzione Fc della Immunoglobulina lgG1 di topo (Cat: 40591-V05H1, Sino Biological); detta subunit? ? coniugata ad un agente marcatore.
Detto agente marcatore pu? essere nuovamente scelto tra biglie di latex, o nanoparticelle di oro di diametro compreso tra 10 e 80 nm, preferibilmente ? una nanoparticella di oro di diametro pari a 40 nm.
Un agente di cattura immobilizzato idoneo per la rivelazione di immunoglobuline di classe IgA mediante test di immunocromatografia a flusso laterale, ? un anticorpo antiimmunoglobuline di classe IgA. In particolare, in un aspetto dell'invenzione, detto agente di cattura immobilizzato ? un anticorpo anti-immunoglobuline di classe IgA monoclonale o policlonale, preferibilmente ? un anticorpo anti-porzione Fc della immunoglobulina IgA umana.
Esempi non limitanti di anticorpi anti-immunoglobuline di classe IgA disponibili commercialmente che possono essere utilizzati come agenti di cattura secondo il metodo della presente invenzione, comprendono anticorpi murini monoclonali [1H9] anti-lgA umane (ab7383, Abcam), anticorpi murini anti-lgA umane, clone 15D6, in grado di riconoscere un epitopo contenuto nel dominio CH2 del frammento Fc di IgA umane (# 5104-3104 Bio-Rad), o anticorpi di capra policlonali anti-lgA secretorie umane (20-IG02, Fitzgerald).
In particolare, in una forma di realizzazione dell'invenzione, detto agente di cattura immobilizzato ? un anticorpo anti-immunoglobuline di classe IgA; detto agente di controllo immobilizzato ? un anticorpo anti-porzione Fc della immunoglobulina lgG1 di topo; e detto agente di rivelazione ? la subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2 fuso con la porzione Fc della immunoglobulina IgG 1 di topo, dove detta subunit? S1 ? coniugata ad una nanoparticella di oro di 40 nm.
In una forma alternativa di realizzazione del test di immunocromatografia per la rivelazione di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA, detta soluzione comprendente detto campione di saliva da analizzare include anticorpi antiimmunoglobuline di classe IgA marcati con Ulfa-tag capaci di formare un complesso con dette immunoglobuline di classe IgA; detto agente di cattura immobilizzato ? un anticorpo anti-Ulfa-tag; detto agente di controllo immobilizzato ? streptavidina; detto agente di rivelazione comprende un primo agente di rivelazione costituito da nanoparticelle di oro marcate con biotina capaci di legare detto agente di controllo immobilizzato, e un secondo agente di rivelazione costituito dalla subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2 fuso con la porzione Fc della immunoglobulina lgG1 di topo, coniugata ad una nanoparticella di oro di 40 nm, detta subunit? S1 ? in grado di formare un complesso con dette immunoglobuline di classe IgA. Una prima ed una seconda forma di realizzazione preferite del metodo sono illustrate a titolo esemplificativo in Figura 4.
Tutti i test secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione della presente invenzione, possono essere eseguiti sullo stesso campione di saliva in parallelo, o in maniera sequenziale, per ottenere una diagnosi pi? accurata.
Come gi? accennato, tutti i test per la rivelazione di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione della presente invenzione, possono essere utilizzati anche per la valutazione dello sviluppo di immunit? al virus SARS-CoV-2, in particolare per la valutazione dello sviluppo di immunit? mucosale al virus SARS-CoV-2.
Nel caso in cui i limiti di sensibilit? del metodo, in una delle sue forme qui descritte, rendessero necessaria la concentrazione del campione, parte integrante della presente invenzione, in una qualsiasi delle sue forme di realizzazione, sar? anche un apposito dispositivo concentratore di facile uso domiciliare.
Tale dispositivo si basa sul principio della osmosi diretta (forward osmosis), ed in particolare sulla possibilit? di allontanare la gran parte dell?acqua e dei soluti a basso peso molecolare contenuti nel fluido salivare (ma non i microrganismi o macromolecole come gli anticorpi, che risultano cos? arricchiti) tramite il richiamo osmotico da parte di una soluzione concentrata (draw solution) di polyethylene oxide (PEO) ad alto peso molecolare (>200 kDa) attraverso una membrana semipermeabile. A questo fine sar? possibile utilizzare una comune membrana da dialisi di cellulosa con ?cut-off? di 10 kDa facilmente disponibile sul mercato.
Pertanto, il metodo della presente invenzione, in una qualsiasi delle sue forme di realizzazione, pu? comprendere un ulteriore passaggio di concentrazione di detto campione biologico precedente a detto passaggio di rivelazione. Detto passaggio di concentrazione pu? essere effettuato mediante osmosi diretta, preferibilmente mediante una membrana di cellulosa con cut-off pari a 10 kDa.
Il processo osmotico consente di ottenere una significativa concentrazione del campione salivare (pari a circa 4-5 volte rispetto alla concentrazione iniziale), nel giro di pochi minuti (tra cinque e dieci minuti).
Esempi di dispositivi idonei per la concentrazione del campione salivare secondo la presente invenzione, includono una ?bustina? costituita da un segmento di tubo da dialisi parzialmente riempito di PEO a secco o ad alta concentrazione, da immergere nel bicchierino contenente il campione da concentrare, oppure un contenitore costituito da due camere, una contenente la soluzione di PEO e l?altra il campione, separate dalla membrana di dialisi disposta verticalmente o orizzontalmente (Figura 2).
? oggetto della presente invenzione anche un kit per la diagnosi di infezione da SARS-CoV-2 comprendente uno o pi? mezzi per la rivelazione, mediante test di agglutinazione, di particelle virali di SARS-CoV-2 in un campione di saliva. Detto kit pu? comprendere mezzi di agglutinazione rivestiti con un reagente in grado di legare uno o pi? antigeni del virus SARS-CoV-2, secondo una qualsiasi delle forme precedentemente descritte.
Un esempio di reagente in grado di legare uno o pi? antigeni del virus SARS-CoV-2 ? rappresentato da anticorpi anti-SARS-CoV-2, in particolare anticorpi anti-proteine Spike del virus SARS-CoV-2. In una forma preferita di realizzazione, detti anticorpi anti-proteine Spike del virus SARS-CoV-2 sono scelti tra anticorpi anti-subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2 o anticorpi anti-subunit? S2 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2.
In una forma di realizzazione del kit, detti mezzi di agglutinazione sono biglie di latex. Detto kit pu? comprendere anche uno o pi? supporti solidi per test di agglutinazione secondo una delle forme precedentemente descritte.
Un ulteriore aspetto della presente invenzione si riferisce a un kit per la diagnosi di infezione da SARS-CoV-2 comprendente uno o pi? mezzi per la rivelazione, mediante test di immunocromatografia a flusso laterale (LFA), di particelle virali di SARS-CoV-2 in un campione di saliva. Detto kit pu? comprendere mezzi di supporto solidi scelti fra quelli precedentemente descritti, capaci di assorbire detto campione di saliva per azione capillare. Questi mezzi di supporto solidi possono essere caratterizzati da (a) una prima area ?di cattura? comprendente un agente di cattura immobilizzato, capace di formare un complesso con uno o pi? antigeni del virus SARS-CoV-2 e da (b) una seconda area ?di controllo? comprendente un agente di controllo immobilizzato capace di formare un complesso con un agente di rivelazione.
Preferibilmente, secondo una forma di realizzazione, detti mezzi di supporto solidi sono in forma di striscia. In particolare, detta prima area ?di cattura? e detta seconda area ?di controllo? possono essere realizzate in forma di spot circolare o di linea.
Secondo un aspetto dell?invenzione, detti mezzi di supporto solidi possono essere caratterizzati da (c) una terza area che precede detta area ?di cattura?, comprendente un agente di rivelazione in forma disidratata.
Secondo un ulteriore aspetto dell?invenzione, detto agente di rivelazione pu? anche essere incorporato nel kit sotto forma di una o pi? aliquote preconfezionate.
Un agente di rivelazione idoneo ad essere impiegato nel presente test ? un agente di rivelazione in grado di legare uno o pi? antigeni del virus SARS-CoV-2 coniugato ad un agente marcatore, secondo una qualsiasi delle forme precedentemente descritte.
In una forma preferita di realizzazione, detto agente di rivelazione ? un anticorpo anti-SARS-CoV-2 coniugato ad un agente marcatore, dove detto agente marcatore ? una nanoparticella di oro di diametro compreso tra 10 e 80 nm.
Secondo un aspetto dell?invenzione, detto agente di cattura immobilizzato ? un anticorpo anti-SARS-CoV-2, preferibilmente ? un anticorpo anti-proteine Spike di SARS-CoV-2.
Secondo un aspetto dell?invenzione, detto agente ?di controllo? immobilizzato un anticorpo policlonale capace di riconoscere direttamente l?agente rivelatore.
In particolare, in una forma preferita di realizzazione del kit, detto agente di cattura immobilizzato ? un anticorpo anti-subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2; detto agente di controllo immobilizzato ? un anticorpo anti rat IgG, porzione Fc; e detto agente di rivelazione ? un anticorpo monoclonale di ratto anti-subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2 coniugato ad una nanoparticella di oro dal diametro di 40 nm.
? oggetto della presente invenzione anche un kit per la diagnosi di infezione da SARS-CoV-2 comprendente uno o pi? mezzi per la rivelazione, mediante test di agglutinazione di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA in un campione di saliva.
In questo caso, detti mezzi di agglutinazione sono rivestiti con un reagente in grado di legare dette immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA in un campione di saliva, secondo una delle forme precedentemente descritte.
In una forma di realizzazione preferita dell?invenzione, detti reagenti in grado di legare dette immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA sono subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2, fuse con la porzione Fc della immunoglobulina lgG1 di topo.
In una forma di realizzazione del kit, detti mezzi di agglutinazione sono biglie di latex. Detto kit pu? comprendere anche uno o pi? supporti solidi per test di agglutinazione secondo una delle forme precedentemente descritte.
Detto kit pu? anche essere utilizzato per la valutazione della risposta immunitaria al virus SARS-CoV-2.
? oggetto della presente invenzione anche un kit per la diagnosi di infezione da SARS-CoV-2 comprendente uno o pi? mezzi per la rivelazione mediante test di immunocromatografia a flusso laterale (LFA) di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA in un campione di saliva. Detto kit pu? comprendere mezzi di supporto solidi scelti fra quelli precedentemente descritti, capaci di assorbire detto campione di saliva per azione capillare. Questi mezzi di supporto solidi possono essere caratterizzati da (a) una prima area ?di cattura? comprendente un agente di cattura immobilizzato, capace di formare un complesso con immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA e da (b) una seconda area ?di controllo? comprendente un agente di controllo immobilizzato capace di formare un complesso con un agente di rivelazione. Preferibilmente, secondo una forma di realizzazione dell'invenzione, detti mezzi di supporto solidi sono in forma di striscia. In particolare, detta prima area ?di cattura? e detta seconda area ?di controllo? possono essere realizzate in forma di spot circolare o di linea.
Secondo un aspetto dell'invenzione, detti mezzi di supporto solidi possono essere caratterizzati anche da (c) una terza area che precede detta area ?di cattura?, in cui detta terza area comprende un agente di rivelazione disidratato.
Secondo un ulteriore aspetto dell?invenzione, detto agente di rivelazione pu? anche essere incorporato nel kit sotto forma di una o pi? aliquote preconfezionate.
Un agente di rivelazione idoneo ad essere impiegato nel presente test ? un agente in grado di legare immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA, coniugato ad un agente marcatore, secondo una qualsiasi delle forme precedentemente descritte.
In una forma preferita di realizzazione, detto agente di rivelazione ? la subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2, fusa con la porzione Fc della immunoglobulina lgG1 di topo, in cui detta subunit? S1 ? coniugata ad un agente marcatore.
Preferibilmente, detto agente marcatore ? una nanoparticella di oro di diametro compreso tra 10 e 80 nm.
Secondo un aspetto dell?invenzione, detto agente di cattura immobilizzato ? un anticorpo anti-immunoglobuline di classe IgA, preferibilmente ? un anticorpo antiimmunoglobuline di classe IgA monoclonale o policlonale, generato nel topo o nella capra.
Secondo un aspetto dell?invenzione, detto agente ?di controllo? immobilizzato ? un anticorpo anti-porzione Fc della immunoglobulina lgG1 di topo.
In una forma di realizzazione preferita del kit, detto agente di cattura immobilizzato ? un anticorpo anti-immunoglobuline di classe IgA; detto agente di controllo immobilizzato ? un anticorpo anti-porzione Fc della immunoglobulina lgG1 di topo; e detto agente di rivelazione ? la subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2 fuso con la porzione Fc della immunoglobulina lgG1 di topo, dove detta subunit? S1 ? coniugata ad una nanoparticella di oro di 40 nm.
Detto kit pu? ulteriormente comprendere una o pi? aliquote comprendenti anticorpi anti-immunoglobuline di classe IgA marcati con Ulfa-tag capaci di formare un complesso con dette immunoglobuline di classe IgA.
In questo caso, in un?altra forma di realizzazione del kit (Figura 4a) detto agente di cattura immobilizzato ? un anticorpo anti-Ulfa-tag; detto agente di controllo immobilizzato ? streptavidina; detto agente di rivelazione comprende un primo agente di rivelazione costituito da nanoparticelle di oro marcate con biotina capaci di legare detto agente di controllo immobilizzato, e un secondo agente di rivelazione costituito dalla subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2 fuso con la porzione Fc della immunoglobulina lgG1 di topo, coniugata ad una nanoparticella di oro di 40 nm, detta subunit? S1 ? in grado di formare un complesso con dette immunoglobuline di classe IgA.
Detto kit in una qualsiasi delle sue forme di realizzazione, pu? anche essere usato per la valutazione di risposta immunitaria al virus SARS-CoV-2.
Un ulteriore aspetto della presente invenzione si riferisce alla combinazione di almeno un kit adatto per la rivelazione di particelle virali di SARS-CoV-2 in un campione di saliva, e di almeno un kit adatto per la rivelazione di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 in detto campione di saliva, secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione precedentemente descritte, per una diagnosi pi? accurata di infezioni da SARS-CoV-2, e/o per la valutazione della risposta immunitaria al virus SARS-CoV-2.
I kit secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione della presente invenzione possono ulteriormente comprendere un dispositivo per la concentrazione di detto campione di saliva secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione precedentemente descritte, dove detto dispositivo include una membrana di dialisi con cut-off pari a 10 kDa.
Di seguito sono riportate alcune forme di realizzazione della presente invenzione:
1. Metodo per la diagnosi di infezione da SARS-CoV-2 comprendente un passaggio di rivelare in un campione biologico particelle virali di SARS-CoV-2 e/o di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 della classe IgA, in cui detto campione biologico ? un campione di saliva.
2. Metodo secondo la forma di realizzazione 1, in cui detto campione biologico ? ottenuto da un soggetto con sintomi di infezione da SARS-CoV-2 o da un soggetto asintomatico.
3. Metodo secondo le forme di realizzazione 1 o 2, in cui la rivelazione di dette particelle virali di SARS-CoV-2 consiste nella rivelazione di uno o pi? antigeni del virus SARS-CoV-2, in cui detti uno o pi? antigeni sono subunit? S1 di proteine Spike di SARS-CoV-2 e/o subunit? S2 di proteine Spike di SARS-CoV-2.
4. Metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 1 a 3, in cui detto passaggio di rivelazione di particelle virali di SARS-CoV-2 ? effettuato mediante test di agglutinazione.
5. Metodo secondo la forma di realizzazione 4, in cui detto test di agglutinazione ? un test di agglutinazione di biglie di latex (Latex Agglutination Test, LAT).
6. Metodo secondo la forma di realizzazione 5, in cui dette biglie di latex sono rivestite con anticorpi anti-SARS-CoV-2.
7. Metodo secondo la forma di realizzazione 6, in cui dette biglie di latex sono rivestite con anticorpi anti-SARS-CoV-2 in concentrazione compresa tra 0.2 e 2 mg per mg di latex.
8. Metodo secondo le forme di realizzazione 6 o 7, in cui detti anticorpi anti-SARS-CoV-2 sono anticorpi anti-proteine Spike di SARS-CoV-2.
9. Metodo secondo la forma di realizzazione 8, in cui detti anticorpi anti-SARS-CoV-2 sono scelti tra anticorpi anti-subunit? S1 di proteine Spike di SARS-CoV-2, e/o anticorpi anti-subunit? S2 di proteine Spike di SARS-CoV-2.
10. Metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 5 a 9 comprendente i seguenti passaggi: i) mettere in contatto detto campione di saliva per un tempo compreso tra 2 e 5 minuti con dette biglie di latex, ii) rivelare la comparsa di agglutinazione, per cui la comparsa di agglutinazione indica la presenza di particelle virali di SARS-CoV-2 in detto campione di saliva da analizzare.
11. Metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 5 a 10, in cui un primo volume di reagente comprendente dette biglie di latex ? messo in contatto con un volume di detto campione biologico da analizzare, e un secondo volume di reagente comprendente dette biglie di latex ? messo in contatto con un volume di un campione di controllo per un tempo compreso tra 2 e 5 minuti, e in cui la comparsa di agglutinazione in detto campione biologico da analizzare e l?assenza di agglutinazione in detto campione di controllo indicano la presenza di particelle virali di SARS-CoV-2 in detto campione biologico da analizzare.
12. Metodo secondo la forma di realizzazione 11, in cui detto campione di controllo comprende una sospensione in cui sono assenti detti antigeni del virus SARS-CoV-2.
13. Metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 5 a 12, in cui in detto test di agglutinazione di biglie di latex sono usati uno o pi? vetrini e/o uno o pi? cartoncini per test di agglutinazione.
14. Metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 1 a 3, in cui detto passaggio di rivelazione di particelle virali di SARS-CoV-2 ? effettuato mediante test di immunocromatografia a flusso laterale (Lateral Flow Assay, LFA).
15. Metodo secondo la forma di realizzazione 14, in cui detto test di immunocromatografia a flusso laterale comprende i passaggi di:
i) mettere in contatto un volume di una soluzione comprendente detto campione di saliva da analizzare con un supporto solido; detto supporto solido ? caratterizzato da (a) una prima area ?di cattura? comprendente un agente di cattura immobilizzato, capace di formare un complesso con uno o pi? antigeni del virus SARS-CoV-2 e da (b) una seconda area ?di controllo? comprendente un agente di controllo immobilizzato capace di formare un complesso con un agente di rivelazione;
ii) diagnosticare infezioni da SARS-CoV-2 quando un segnale visibile ad occhio nudo compare nella prima area ?di cattura? e un segnale visibile ad occhio nudo compare nella seconda area ?di controllo?.
16. Metodo secondo la forma di realizzazione 15, in cui in detto passaggio i) ? usato un supporto solido comprendente una membrana e/o carta attraverso cui la soluzione comprendente detto campione di saliva da analizzare migra per azione capillare.
17. Metodo secondo le forme di realizzazione 15 o 16, in cui detto supporto solido ? scelto tra membrana in nitrocellulosa, acetato di Cellulosa, polyvinylidene fluoride (PVDF), Nylon e polyethersulfone (PES), differenti fra loro per porosit? e carica elettrica.
18. Metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 15 a 17, in cui detto agente di rivelazione ? contenuto in detta soluzione comprendente detto campione di saliva da analizzare.
19. Metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 15 a 17, in cui detto agente di rivelazione ? incorporato su/in detto supporto solido.
20. Metodo secondo la forma di realizzazione 19, in cui detto agente di rivelazione ? incorporato su/in detto supporto solido su/in un?area che precede detta prima area ?di cattura?.
21. Metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 15 a 20, in cui detto agente di rivelazione ? in forma essiccata.
22. Metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 15 a 21, in cui detto agente di rivelazione ? in grado di legare uno o pi? antigeni del virus SARS-CoV-2.
23. Metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 15 a 22, in cui detto agente di rivelazione ? un anticorpo anti-SARS-CoV-2, detto anticorpo ? coniugato ad un agente marcatore.
24. Metodo secondo la forma di realizzazione 23, in cui detto agente marcatore ? una nanoparticella di oro di diametro compreso tra 10 e 80 nm.
25. Metodo secondo le forme di realizzazione 23 o 24, in cui detto agente marcatore ? una nanoparticella di oro colloidale di diametro pari a 40 nm.
26. Metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 15 a 25, in cui detta prima area ?di cattura? e detta seconda area ?di controllo? sono in forma di spot circolare o di linea.
27. Metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 15 a 26, in cui detto agente di cattura immobilizzato ? un anticorpo anti-SARS-CoV-2.
28. Metodo secondo la forma di realizzazione 27, in cui detti anticorpi anti-SARS-CoV-2 sono anticorpi anti-proteine Spike di SARS-CoV-2.
29. Metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 15 a 28, in cui detto agente di controllo immobilizzato un anticorpo capace di riconoscere la porzione Fc (comune, non legante l?antigene) dell?anticorpo di rivelazione (es. un anticorpo anti rat Fc se l?agente rivelatore ? un anticorpo generato nel ratto).
30. Metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 15 a 29, in cui detto agente di cattura immobilizzato ? un anticorpo anti-subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2; detto agente di controllo immobilizzato ? un anticorpo mono o policlonale anti-lgG di ratto (porzione Fc); e detto agente di rivelazione ? un anticorpo monoclonale di ratto anti-subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2 coniugato ad una nanoparticella di oro dal diametro di 40 nm.
31. Metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 1 a 30, in cui detta rivelazione di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA ? effettuata mediante test di agglutinazione.
32. Metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 1 a 31, in cui detta rivelazione di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA ? condotta mediante test di agglutinazione di biglie di latex (Latex Agglutination Test, LAT). 33. Metodo secondo la forma di realizzazione 32 in cui dette biglie di latex sono rivestite con antigeni nativi o ricombinanti del virus SARS-CoV-2.
34. Metodo secondo le forme di realizzazione 32 o 33, in cui dette biglie di latex sono rivestite con antigeni nativi o ricombinanti del virus SARS-CoV-2 in concentrazione compresa tra 0.2 e 2 mg per mg di latex.
35. Metodo secondo le forme di realizzazione 33 o 34, in cui dette biglie di latex sono rivestite con subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2, dette subunit? S1 sono fusi con la porzione Fc della immunoglobulina lgG1 di topo.
36. Metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 32 a 35, comprendente i seguenti passaggi: i) mettere in contatto detto campione di saliva per un tempo compreso tra 2 e 5 minuti con dette biglie di latex, ii) rivelare la comparsa di agglutinazione, per cui la comparsa di agglutinazione indica la presenza di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA in detto campione di saliva da analizzare.
37. Metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 32 a 35, in cui un primo volume di reagente comprendente dette biglie di latex ? messo in contatto con un volume di detto campione biologico da analizzare, e un secondo volume di reagente comprendente dette biglie di latex ? messo in contatto con un volume di un campione di controllo per un tempo compreso tra 2 e 5 minuti, e in cui la comparsa di agglutinazione in detto campione di saliva da analizzare e l?assenza di agglutinazione in detto campione di controllo indicano la presenza di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA in detto campione di saliva da analizzare.
38. Metodo secondo la forma di realizzazione 37, in cui detto campione di controllo ? un campione in cui sono assenti dette immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA.
39. Metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 32 a 38, in cui detto volume di reagente comprendente le biglie di latex, include anche anticorpi antiimmunoglobuline umane di classe IgA.
40. Metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 32 a 39, in cui in detto test di agglutinazione di biglie di latex sono usati uno o pi? vetrini e/o uno o pi? cartoncini per test di agglutinazione.
41. Metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 1 a 30, in cui detta rilevazione di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA ? condotta mediante test di immunocromatografia a flusso laterale (Lateral Flow Assay, LFA).
42. Metodo secondo la forma di realizzazione 41 , in cui detto test di immunocromatografia a flusso laterale comprende i passaggi di:
i) mettere in contatto un volume di una soluzione comprendente detto campione di saliva da analizzare con un supporto solido; detto supporto solido ? caratterizzato da (a) una prima area ?di cattura? comprendente un agente di cattura immobilizzato, capace di formare un complesso con dette immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA, e da (b) una seconda area ?di controllo? comprendente un agente di controllo immobilizzato capace di formare un complesso con un agente di rivelazione;
ii) diagnosticare la presenza di anticorpi salivari anti SARS-CoV-2 quando un segnale visibile ad occhio nudo compare nella prima area ?di cattura? e un segnale visibile ad occhio nudo compare nella seconda area ?di controllo?.
43. Metodo secondo la forma di realizzazione 42, in cui in detto passaggio i) ? usato un supporto solido comprendente una membrana e/o carta attraverso cui la soluzione comprendente detto campione di saliva da analizzare migra per azione capillare. 44. Metodo secondo le forme di realizzazione 42 o 43, in cui detto supporto solido ? scelto tra membrana in nitrocellulosa, acetato di cellulosa, polyvinylidene fluoride (PVDF), Nylon e polyethersulfone (PES), differenti fra loro per porosit? e carica elettrica.
45. Metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 42 a 44, in cui detto agente di rivelazione ? contenuto in detta soluzione comprendente detto campione biologico da analizzare.
46. Metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 42 a 44, in cui detto agente di rivelazione ? incorporato su/in detto supporto solido.
47. Metodo secondo la forma di realizzazione 46, in cui detto agente di rivelazione ? incorporato su/in detto supporto solido su/in un?area che precede detta prima area ?di cattura?.
48. Metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 42 a 47, in cui detto agente di rivelazione ? in forma essiccata.
49. Metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 42 a 48, in cui detto agente di rivelazione ? in grado di legare dette immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA.
50. Metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 42 a 49, in cui detto agente di rivelazione ? la subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2, fuso con la porzione Fc della immunoglobulina lgG1 di topo, detta subunit? S1 ? coniugata ad un agente marcatore.
51. Metodo secondo la forma di realizzazione 50, in cui detto agente marcatore ? una nanoparticella di oro di diametro compreso tra 10 ed 80 nm.
52. Metodo secondo le forme di realizzazione 50 o 51, in cui detto agente marcatore ? una nanoparticella di oro colloidale di diametro pari a 40 nm.
53. Metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 42 a 52, in cui detta prima area ?di cattura? e detta seconda area ?di controllo? sono in forma di spot circolare o di linea.
54. Metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 42 a 53, in cui detto agente di cattura immobilizzato ? un anticorpo anti-immunoglobuline di classe IgA.
55. Metodo secondo la forma di realizzazione 54, in cui detto agente di cattura immobilizzato ? un anticorpo murino anti-immunoglobuline di classe IgA monoclonale o policlonale.
56. Metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 42 a 55, in cui detto agente di controllo immobilizzato ? un anticorpo anti-porzione Fc della immunoglobulina lgG1 di topo.
57. Metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 42 a 56, in cui detto agente di cattura immobilizzato ? un anticorpo anti-immunoglobuline di classe IgA; detto agente di controllo immobilizzato ? un anticorpo anti-porzione Fc della immunoglobulina lgG1 di topo; e detto agente di rivelazione ? la subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2 fuso con la porzione Fc della immunoglobulina lgG1 di topo, dove detta subunit? S1 ? coniugata ad una nanoparticella di oro di 40 nm.
58. Metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 42 a 56, in cui detta soluzione comprendente detto campione di saliva da analizzare include anticorpi anti-immunoglobuline di classe IgA marcati con Ulfa-tag capaci di formare un complesso con dette immunoglobuline di classe IgA; detto agente di cattura immobilizzato ? un anticorpo anti-Ulfa-tag; detto agente di controllo immobilizzato ? streptavidina; detto agente di rivelazione comprende un primo agente di rivelazione costituito da nanoparticelle di oro marcate con biotina capaci di legare detto agente di controllo immobilizzato, e un secondo agente di rivelazione costituito dalla subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2 fuso con la porzione Fc della immunoglobulina lgG1 di topo, coniugata ad una nanoparticella di oro di 40 nm, detta subunit? S1 ? in grado di formare un complesso con dette immunoglobuline di classe IgA.
59. Metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 1 a 58, comprendente un passaggio di concentrazione di detto campione biologico precedente a detto passaggio di rivelazione.
60. Metodo secondo la forma di realizzazione 59, in cui detto passaggio di concentrazione ? effettuato mediante osmosi diretta.
61. Metodo secondo le forme di realizzazione 59 o 60, in cui detto passaggio di concentrazione ? effettuato mediante una membrana di cellulosa con cut-off pari a 10 kDa.
62. Metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 1 a 61, per cui la rivelazione di antigeni del virus SARS-CoV-2 e/o di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 della classe IgA in detto campione biologico corrisponde ad una diagnosi positiva di infezione da SARS-CoV-2.
I metodi secondo una qualsiasi forma di realizzazione qui descritti potranno essere usati oltre che per la diagnosi anche per la rivelazione di immunit? mucosale verso il virus SARS-CoV-2.
63. Kit per la diagnosi di infezione da SARS-CoV-2 comprendente uno o pi? mezzi per la rivelazione, mediante test di agglutinazione, di particelle virali di SARS-CoV-2 in un campione di saliva.
64. Kit secondo la forma di realizzazione 63, comprendente mezzi di agglutinazione rivestiti con un reagente in grado di legare uno o pi? antigeni del virus SARS-CoV-2.
65. Kit secondo la forma di realizzazione 64, in cui detto reagente in grado di legare uno o pi? antigeni del virus SARS-CoV-2 ? un anticorpo anti-SARS-CoV-2.
66. Kit secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 64 a 65, in cui detto reagente in grado di legare uno o pi? antigeni del virus SARS-CoV-2 ? un anticorpo anti-proteina Spike del virus SARS-CoV-2.
67. Kit secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 64 a 66, in cui detto reagente in grado di legare uno o pi? antigeni del virus SARS-CoV-2 ? un anticorpo anti-subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2 o un anticorpo antisubunit? S2 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2.
68. Kit secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 64 a 67, in cui detti mezzi di agglutinazione sono biglie di latex.
69. Kit secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 63 a 68, ulteriormente comprendente uno o pi? supporti solidi per test di agglutinazione.
70. Kit per la diagnosi di infezione da SARS-CoV-2 comprendente uno o pi? mezzi per la rivelazione, mediante test di immunocromatografia a flusso laterale (LFA), di particelle virali di SARS-CoV-2 in un campione di saliva.
71. Kit secondo la forma di realizzazione 70, ulteriormente comprendente una o pi? aliquote di un agente di rivelazione.
72. Kit secondo le forme di realizzazione 70 o 71, comprendente mezzi di supporto solidi in grado di assorbire detto campione di saliva per azione capillare; detti mezzi di supporto solidi sono caratterizzati da (a) una prima area ?di cattura? comprendente un agente di cattura immobilizzato, capace di formare un complesso con uno o pi? antigeni del virus SARS-CoV-2 e da (b) una seconda area ?di controllo? comprendente un agente di controllo immobilizzato capace di formare un complesso con un agente di rivelazione.
73. Kit secondo la forma di realizzazione 72, in cui detti mezzi di supporto solidi sono caratterizzati da (c) una terza area che precede detta area ?di cattura?, comprendente un agente di rivelazione immobilizzato.
74. Kit secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 71 a 73, in cui detto agente di rivelazione ? in grado di legare uno o pi? antigeni del virus SARS-CoV-2.
75. Kit secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 71 a 74, in cui detto agente di rivelazione ? un anticorpo anti-SARS-CoV-2, detto anticorpo ? coniugato ad un agente marcatore.
76. Kit secondo la forma di realizzazione 75, in cui detto agente marcatore ? una nanoparticella di oro di diametro compreso tra 10 ed 80 nm.
77. Kit secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 72 a 76, in cui detto agente ?di cattura? immobilizzato ? un anticorpo anti-SARS-CoV-2.
78. Kit secondo la forma di realizzazione 77, in cui detto anticorpo anti-SARS-CoV-2 ? un anticorpo anti-proteine Spike di SARS-CoV-2.
79. Kit secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 72 a 78, in cui detto agente ?di controllo? immobilizzato un anticorpo capace di riconoscere la porzione Fc (comune, non legante l?antigene) dell?anticorpo di rivelazione (es. un anticorpo anti rat Fc se l?agente rivelatore ? un anticorpo generato nel ratto).
80. Kit secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 72 a 79, in cui detto agente di cattura immobilizzato ? un anticorpo anti-subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2; detto agente di controllo immobilizzato ? un anticorpo anti rat IgG (porzione Fc); e detto agente di rivelazione ? un anticorpo monoclonale di ratto anti-subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2 coniugato ad una nanoparticella di oro dal diametro di 40 nm.
81. Kit secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 72 a 80, in cui detta prima area ?di cattura? e detta seconda area ?di controllo? sono in forma di spot circolare o di linea.
82. Kit per la diagnosi di infezione da SARS-CoV-2 comprendente uno o pi? mezzi per la rivelazione, mediante test di agglutinazione di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA in un campione di saliva.
83. Kit secondo la forma di realizzazione 82, comprendente mezzi di agglutinazione rivestiti con un reagente in grado di legare immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA in un campione di saliva.
84. Kit secondo le forme di realizzazione 82 o 83, in cui detto reagente in grado di legare immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA ? costituito da antigeni nativi o ricombinanti del virus SARS-CoV-2.
85. Kit secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 82 a 84, in cui detto reagente in grado di legare dette immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA ? la subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2, fuso con la porzione Fc della immunoglobulina IgG 1 di topo.
86. Kit secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 83 a 85, in cui detti mezzi di agglutinazione sono biglie di latex.
87. Kit secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 83 a 86, comprendente uno o pi? supporti solidi per test di agglutinazione.
88. Kit per la diagnosi di infezione da SARS-CoV-2 comprendente uno o pi? mezzi per la rivelazione, mediante test di immunocromatografia a flusso laterale (LFA) di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA in un campione di saliva.
89. Kit secondo la forma di realizzazione 88, ulteriormente comprendente una o pi? aliquote di un agente di rivelazione.
90. Kit secondo le forme di realizzazione 88 o 89, comprendente mezzi di supporto solidi in grado di assorbire detto campione di saliva per azione capillare; detti mezzi di supporto solidi sono caratterizzati da (a) una prima area ?di cattura? comprendente un agente di cattura immobilizzato, capace di formare un complesso con immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA e da (b) una seconda area ?di controllo? comprendente un agente di controllo immobilizzato capace di formare un complesso con un agente di rivelazione.
91. Kit secondo la forma di realizzazione 90, in cui detti mezzi di supporto solidi sono caratterizzati da (c) una terza area che precede detta area ?di cattura?, comprendente un agente di rivelazione immobilizzato.
92. Kit secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 89 a 91, in cui detto agente di rivelazione ? in grado di legare dette immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA.
93. Kit secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 89 a 92, in cui detto agente di rivelazione ? la subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2, fusa con la porzione Fc della immunoglobulina lgG1 di topo, detta subunit? S1 ? coniugata ad un agente marcatore.
94. Kit secondo la forma di realizzazione 93, in cui detto agente marcatore ? una nanoparticella di oro di diametro compreso tra 10 ed 80 nm.
95. Kit secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 89 a 94, in cui detto agente ?di cattura? immobilizzato ? un anticorpo anti-immunoglobuline di classe IgA.
96. Kit secondo la forma di realizzazione 95, in cui detto agente di cattura immobilizzato ? un anticorpo anti-immunoglobuline di classe IgA monoclonale o policlonale.
97. Kit secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 89 a 96, in cui detto agente ?di controllo? immobilizzato ? un anticorpo anti-porzione Fc della immunoglobulina lgG1 di topo.
98. Kit secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 89 a 97, in cui detto agente di cattura immobilizzato ? un anticorpo anti-immunoglobuline di classe IgA; detto agente di controllo immobilizzato ? un anticorpo anti-porzione Fc della immunoglobulina lgG1 di topo; e detto agente di rivelazione ? la subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2 fuso con la porzione Fc della immunoglobulina lgG1 di topo, dove detta subunit? S1 ? coniugata ad una nanoparticella di oro di 40 nm.
99. Kit secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 89 a 97, ulteriormente comprendente una o pi? aliquote di anticorpi anti-immunoglobuline di classe IgA marcati con Ulfa-tag capaci di formare un complesso con dette immunoglobuline di classe IgA.
100. Kit secondo la forma di realizzazione 99, in cui detto agente di cattura immobilizzato ? un anticorpo anti-Ulfa-tag; detto agente di controllo immobilizzato ? streptavidina; detto agente di rivelazione comprende un primo agente di rivelazione costituito da nanoparticelle di oro marcate con biotina capaci di legare detto agente di controllo immobilizzato, e un secondo agente di rivelazione costituito dalla subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2 fuso con la porzione Fc della immunoglobulina lgG1 di topo, coniugata ad una nanoparticella di oro di 40 nm, detta subunit? S1 ? in grado di formare un complesso con dette immunoglobuline di classe IgA.
101. Kit secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 89 a 100, in cui detta prima area ?di cattura? e detta seconda area ?di controllo? sono in forma di spot circolare o di linea.
102. Combinazione di kit comprendente almeno un kit secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 63 a 81 e almeno un kit secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 82 a 101 per la diagnosi di infezione da SARS-CoV-2 e per la valutazione della risposta immunitaria al virus SARS-CoV-2.
103. Kit secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione da 63 a 102, ulteriormente comprendente un dispositivo per la concentrazione di detto campione di saliva.
104. Kit secondo la forma di realizzazione precedente in cui detto dispositivo include una membrana di dialisi con cut-off pari a 10 kDa.
ESEMPI
Di seguito sono riportati alcuni esempi non limitativi delle metodologie secondo la presente invenzione.
1. Test di Agglutinazione di biglie di latex per la rivelazione di SARS-CoV-2 (proteine Spike) nella saliva
1.1. Preparazione dei reagenti anticorpali: gli anticorpi anti SARS-CoV-2 Spike Protein, subunit? 1 (SP1) (per opzioni vedi pagina 9 riga 19) sono purificati da eventuali conservanti e diluiti alla concentrazione di 0.5 mg/ml in due diversi tamponi (Reaction buffer A e B), utilizzando il kit ?Antibody Concentration and Clean Up Kit for Latex & Europium: Abcam? cat # ab269965. A questo fine 50 microgrammi di ciascun reagente sono diluiti all?interno della cartuccia/filtro nel tampone desiderato fino ad un volume finale di 500 microlitri e centrifugati a 15000g per 2-5 minuti a 4?C fino ad ottenere un volume finale di circa 100 microlitri; dopo aver riportato il volume a 500 microlitri con lo stesso tampone (A o B), questa stessa operazione ? ripetuta per altre quattro volte. Alla fine del quinto lavaggio la concentrazione dell?anticorpo ? determinata mediante metodo colorimetrico (Bradford) e portata (mediante ulteriore centrifugazione o diluizione con lo stesso tampone) al valore finale di 0.5 mg/ml.
1.2. Coniugazione dell?anticorpo alle biglie di latex: Tale procedura ? svolta secondo le istruzioni del kit Latex Conjugation kit -400 nm Black Abcam cat # ab26989, con piccole modifiche. Per individuare, per ciascun anticorpo, le condizioni ottimali di concentrazione e pH per il legame covalente alle biglie, sono approntate 6 reazioni: 3 diverse concentrazioni (0.5, 0.1 e 0.05 mg/ml), ciascuna nei due diversi tamponi A e B a pH differente. Per ogni reazione, 40 microlitri di anticorpo sono usati per risospendere accuratamente le sfere di latex liofilizzate in fondo alla provetta fornita dal kit; la reazione di legame dell?anticorpo alle biglie ? condotta a temperatura ambiente per 15 minuti, trascorsi i quali ciascuna reazione verr? interrotta con l'aggiunta di 1 mi di Quencer 1x, fornito dallo stesso kit. Dopo 5 minuti a temperatura ambiente le provette verranno centrifugate a 10000 rpm per 1 minuto in una centrifuga da bancone, il sopranatante rimosso e le biglie ulteriormente risospese in 40 microlitri del tampone di conservazione (Storage buffer) presente nel kit. In alternativa potr? essere usato del semplice PBS. In entrambi i casi ? aggiunta albumina bovina (BSA) alla concentrazione finale di 1 mg/ml (0.1%). Questa ultima aumenta la stabilit? del coniugato e funge anche da agente bloccante dei siti aspecifici di legame. La sospensione cos? ottenuta (1% v/v di latex in PBS/BSA 0.1%) ? conservata a 4?C ed utilizzata per le procedure successive.
1.3. Reazione di agglutinazione: Per la reazione di agglutinazione, 15 microlitri di ciascuno dei coniugati sono deposti con una micropipetta sulla superficie concava di un apposito vetrino da microscopia, accanto ad un uguale volume del campione da testare. Le due gocce di liquido sono mescolate prima con l?estremit? di una punta sterile e poi con un leggero movimento di rotazione orbitale dell?intero vetrino. L?eventuale reazione di agglutinazione appare come una distribuzione irregolare delle biglie in aggregati (dumping). Altrimenti la sospensione mantiene un aspetto omogeneamente lattescente. Il tempo massimo di reazione ? di 5 minuti. Per facilitare la visualizzazione degli aggregati ? opportuno osservare il vetrino contro lo sfondo di un cartoncino chiaro. Sono utilizzati vetrini che contengono due concavit? (Bioclass s.r.l., codice articolo 01.4290.07), in modo che la reazione ?vera? (campione da analizzare) e quella di controllo (campione sicuramente negativo) vengano condotte simultaneamente fianco a fianco.
1.4. Controllo negativo: il controllo negativo ? rappresentato, rispettivamente, dal semplice terreno di coltura in cui le particelle virali vengono prodotte, o da una sospensione di virus ricombinante (MLV) non esprimente la proteina Spike. 2. Test di Agglutinazione di biglie di latex per la rivelazione di IgA secretorie (slgA) specifiche anti SARS-Cov-2 S-alvcoprotein nella saliva
2.1. Preparazione dell?antigene: L?antigene ricombinante SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1-mFc Recombiant Protein. Cat: 40591-V05H1, (Sino Biological), inizialmente in forma liofilizzata da PBS sterile pH 7.4 contenente Trealoso e Mannitolo come stabilizzanti, ? purificato dagli agenti conservanti e diluito alla concentrazione di 0.5 mg/ml in due diversi tamponi (Reaction buffer A e B) utilizzando il kit ?Antibody Concentration and Clean Up Kit for Latex & Europium: Abcam cat # ab269965?. A questo fine 50 microgrammi di antigene (ricostituito in dH20) sono diluiti all'interno della cartuccia/filtro nel tampone desiderato fino ad un volume finale di 500 microlitri e centrifugati a 15000g per 2-5 minuti a 4?C, fino ad ottenere un volume finale di circa 100 microlitri; dopo aver riportato il volume a 500 microlitri con lo stesso tampone (A o B), questa stessa operazione ? ripetuta per altre quattro volte. Alla fine del quinto lavaggio la concentrazione dell?anticorpo ? determinata mediante metodo colorimetrico (Bradford) ed aggiustata (mediante ulteriore centrifugazione o diluizione con lo stesso tampone) al valore finale di 0.5 mg/ml.
2.2. Coniugazione dell?antigene alle biglie di latex: Tale procedura ? svolta secondo le istruzioni del kit ?Latex Conjugation kit? 400 nm Black (Abcam cat # ab26989)?, con piccole modifiche. In particolare, sono approntate 6 reazioni: 3 diverse concentrazioni (0.5, 0.1 e 0.05 mg/ml) di proteina, ciascuna nei due diversi tamponi A e B. Per ogni reazione, 40 microlitri di ciascuna soluzione di antigene (pari rispettivamente a 20, 4 e 2 microgrammi) sono usati per risospendere accuratamente le biglie di latex liofilizzate in fondo alla provetta fornita dal kit; la reazione di legame (covalente) dell?antigene alle biglie ? condotta a TA per 15 minuti, trascorsi i quali ciascuna reazione ? interrotta con l'aggiunta di 1 mi di Quencer 1x, fornito dallo stesso kit. Dopo 5 minuti a temperatura ambiente le provette vengono centrifugate a 10000 rpm per 1 minuto in una centrifuga da bancone, il sopranatante rimosso e le biglie ulteriormente risospese in 40 microlitri del tampone di conservazione (Storage buffer) presente nel kit. In alternativa pu? essere usato del semplice PBS. In entrambi i casi ? aggiunta albumina bovina (BSA) alla concentrazione finale di 1 mg/ml (0.1%). Questa ultima aumenta la stabilit? del coniugato e funge anche da agente bloccante dei siti aspecifici di legame. La sospensione cos? ottenuta (1% v/v di latex in PBS/BSA 0.1%) ? conservata a 4?C ed utilizzata per le procedure successive.
2.3. Reazione di agglutinazione: Per la reazione di agglutinazione ? seguito il protocollo descritto al punto 1.3.
3. Test di Immunocromatografia a flusso laterale (LFA) per la rivelazione di IgA secretorie (slgA) specifiche anti SARS-Cov-2 S-alvcoprotein nella saliva Secondo una prima forma di realizzazione, il test pu? essere realizzato impiegando un kit commerciale ?Universal Lateral Flow Assay Kit, Expedeon 4300-0100?.
3.1. Preparazione dell?agente di cattura (anti human IgA coniugato con Ulfatag): L?anticorpo anti human IgA (per opzioni vedi pag. 17 riga 15) ? ulteriormente purificato dagli additivi presenti, trasferito nel tampone di coniugazione e portato alla concentrazione di 0.5 mg/ml attraverso cinque cicli di centrifugazione (15000 g x 1-3 minuti) e risospensione nelle apposite cartucce (cut-off 10 kD) fornite nel kit Antibody Concentration & Clean-up Kit (AbSelectTM). La reazione di marcatura con Ulfa-tag ? condotta a temperatura ambiente per un minimo di 3 ore risospendendo il contenuto di un vial del kit di coniugazione (Lightning-Link? Ulfa-tag Conjugation Kit) con 100 microlitri di anticorpo (quantit? finale 50 microgrammi) preventivamente mescolato con 10 microlitri di ?LL Modifier? , ed aggiungendo alla fine della incubazione 10 microlitri di Quencer. Il reagente cos? ottenuto ? conservato a 4?C fino all?utilizzo nel test LFA. La stessa procedura di coniugazione ? anche applicata ad un reagente anti-Spike protein (S1) di provata efficacia (questo non deve necessariamente essere di classe IgA) per fungere da controllo positivo nel test LFA.
3.2. Preparazione dell?antigene coniugato alle particelle di oro: l?antigene (SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1-mFc, Sino Biological) ? purificato dagli additivi presenti, trasferito nel tampone di coniugazione e portato alla concentrazione di 0.5 mg/ml attraverso cinque cicli di centrifugazione (15000 g x 1-3 minuti) e risospensione nelle apposite cartucce (cut-off 10 kD) fornite nel kit ?Antibody Concentration & Clean Up Kit? (AbPureTM). La reazione di coniugazione covalente alle microparticelle InnovaCoat? GOLD (40 nm) ? condotta a temperatura ambiente per 15 minuti in un volume di 50 microlitri (10 di anticorpo 40 di buffer di reazione fornito dal kit) e bloccata con l'aggiunta di 5 microlitri di Quencer 10 x (sempre fornito dal kit, InnovaCoat? GOLD (20 OD) Conjugation Kit); al fine di rimuovere l?antigene non legato, il prodotto della reazione (50 microlitri) ? diluito con 500 microlitri di acqua deionizzata contente il Quencer 1x, centrifugato (9000 g x 10 minuti) e risospesa in 50 microlitri di Quencer 1x contenente BSA 0.5 % come agente stabilizzante e bloccante. Assumendo un recupero delle microparticelle del 100%, questo volume dovrebbe corrispondere ad una densit? ottica (OD) pari a 20. Al fine di ottimizzare la reazione di marcatura sono state testate tre diverse quantit? di antigene (2.5, 1 e 0.5 microgrammi) mantenendo inalterati i volumi sopra descritti.
3.3. Immunocromatografia per le IgA anti SARS-CoV SP1: i coniugati descritti sopra possono essere utilizzati secondo le indicazioni contenute nell?Llniversal Lateral Flow Assay kit (Universal Lateral Fior Assay Kit, Expedeon). L?anticorpo di cattura (coniugato con Ulfa-tag) ? diluito ad una concentrazione di 100 ug/ml (range 50-150 ug/ml) in tampone di corsa BSA 0.1% (1 mg/ml) e l?antigene da 20 OD (vedi sopra) a 6 OD nello stesso tampone. 75 microlitri di campione (nel nostro caso fluido salivare o fluido salivare concentrato) sono mischiati con 5 microlitri di ciascuno dei due reagenti (anticorpo di cattura ed antigene/rivelatore) e con 5 microlitri di particelle GOLD biotinilate (1 OD), sempre fornite dal kit, in una piastra da 96 pozzetti. Dopo 5 minuti di incubazione (necessari per la formazione dei complessi antigene-anticorpo) nel pozzetto ? inserita la striscetta ?universale?, immergendola dal lato pi? sottile (sample pad). Dopo venti minuti di incubazione a temperatura ambiente, in caso di esito positivo, si osservano due bande colorate, una in corrispondenza della linea di cattura (l?anticorpo immobilizzato anti Ulfa riconosce il complesso CoV-2SP1-GOLD IgA anti-SP1 anti IgA-Ulfa-tag) ed una in corrispondenza della linea a di controllo (le particelle GOLD-biotina vengono riconosciute dalla Streptavidina) (Figura 4a). L?assenza di colorazione sulla linea di cattura, pur in presenza di una linea di controllo visibile, ? interpretata come risultato negativo. Per verificare il funzionamento del sistema, il campione salivare ed il reagente di cattura (anti IgA-Ulfa tag) possono essere sostituiti dall?anticorpo anti Spike protein precedentemente coniugato con Ulfa-tag (vedi sopra); questo far? direttamente da ponte tra le biglie coniugate con l?antigene e l?anticorpo anti Ulfa-tag sulla linea di cattura (figura 4a, parte destra).
Secondo una diversa forma di realizzazione (Figura 4b):
L?anticorpo di cattura (anti IgA) non ? marcato ma pu? essere direttamente immobilizzato (in forma di linea o spot) sul supporto solido;
L?anticorpo anti-mouse IgG-Fc, capace di riconoscere direttamente la coda Fc presente nell?antigene SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1-mFc, pu? essere immobilizzato sulla linea di controllo;
Il coniugato CoV-2 SP1/GOLD pu? essere posto direttamente, in forma essiccata, in un segmento della striscetta a monte della linea di cattura (?coniugate pad?); in alternativa, per semplificare l?assemblaggio della striscetta stessa, il coniugato pu? essere posto direttamente (in forma liquida o essiccata) sul fondo del bicchierino in cui il probando introduce il fluido salivare dopo averlo recuperato dal concentratore. Dopo aver mescolato il contenuto del contenitore con un bastoncino di plastica ed aver atteso per 5 minuti, la striscetta pu? essere inserita e la reazione avviata.
Claims (15)
1. Metodo per la diagnosi di infezione da SARS-CoV-2 comprendente un passaggio di rivelare in un campione biologico particelle virali di SARS-CoV-2 e/o immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA, in cui detto campione biologico ? un campione di saliva.
2. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detto passaggio di rivelazione di particelle virali di SARS-CoV-2 ? effettuato mediante test di agglutinazione di biglie di latex (Latex Agglutination Test, LAT) e in cui in cui dette biglie di latex sono rivestite con anticorpi anti-proteine Spike di SARS-CoV-2, in particolare anticorpi anti-subunit? S1 di proteine Spike di SARS-CoV-2.
3. Metodo secondo le rivendicazioni 1, in cui detto passaggio di rivelazione di particelle virali di SARS-CoV-2 ? effettuato mediante test di immunocromatografia a flusso laterale (Lateral Flow Assay, LFA) e comprende i passaggi di:
i. mettere in contatto un volume di una soluzione comprendente detto campione di saliva da analizzare con un supporto solido; detto supporto solido ? caratterizzato da (a) una prima area ?di cattura? comprendente un agente di cattura immobilizzato, capace di formare un complesso con uno o pi? antigeni del virus SARS-CoV-2 e da (b) una seconda area ?di controllo? comprendente un agente di controllo immobilizzato capace di formare un complesso con un agente di rivelazione;
ii. diagnosticare infezioni da SARS-CoV-2 quando un segnale visibile ad occhio nudo compare nella prima area ?di cattura? e un segnale visibile ad occhio nudo compare nella seconda area ?di controllo?;
detto test di immunocromatografia a flusso laterale ? caratterizzato del fatto che in detto passaggio i) ? usato un supporto solido comprendente una membrana e/o carta attraverso cui la soluzione comprendente detto campione di saliva da analizzare migra per azione capillare; in cui detto agente di rivelazione ? un anticorpo anti-SARS-CoV-2, detto anticorpo ? coniugato ad un agente marcatore, in particolare in cui detto agente marcatore ? una nanoparticella di oro di diametro compreso tra 10 e 80 nm; in cui detto agente di cattura immobilizzato ? un anticorpo anti-proteine Spike di SARS-CoV-2, in particolare detto agente di cattura immobilizzato ? un anticorpo anti-subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2; e in cui detto agente di controllo ? un anticorpo capace di riconoscere la porzione Fc di detto anticorpo di rivelazione.
4. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, in cui detta rivelazione di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA ? effettuata mediante test di agglutinazione di biglie di latex (Latex Agglutination Test, LAT), in cui dette biglie di latex sono rivestite con antigeni nativi o ricombinanti del virus SARS-CoV-2, in particolare, dette biglie di latex sono rivestite con subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2, dette subunit? S1 sono fuse con la porzione Fc della immunoglobulina lgG1 di topo.
5. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui un primo volume di reagente comprendente dette biglie di latex ? messo in contatto con un volume di detto campione biologico da analizzare, e un secondo volume di reagente comprendente dette biglie di latex ? messo in contatto con un volume di un campione di controllo per un tempo compreso tra 2 e 5 minuti, e in cui la comparsa di agglutinazione in detto campione di saliva da analizzare e l?assenza di agglutinazione in detto campione di controllo indicano la presenza di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA in detto campione di saliva da analizzare.
6. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5, in cui detto passaggio di rivelazione di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA ? condotto mediante test di immunocromatografia a flusso laterale (Lateral Flow Assay, LFA), e comprende i passaggi di:
i. mettere in contatto un volume di una soluzione comprendente detto campione di saliva da analizzare con un supporto solido; detto supporto solido ? caratterizzato da (a) una prima area ?di cattura? comprendente un agente di cattura immobilizzato, capace di formare un complesso con dette immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA, e da (b) una seconda area ?di controllo? comprendente un agente di controllo immobilizzato capace di formare un complesso con un agente di rivelazione;
ii. diagnosticare la presenza di anticorpi salivari anti-SARS-CoV-2 quando un segnale visibile ad occhio nudo compare nella prima area ?di cattura? e un segnale visibile ad occhio nudo compare nella seconda area ?di controllo; detto test di immunocromatografia a flusso laterale ? caratterizzato dal fatto che in detto passaggio i) ? usato un supporto solido comprendente una membrana e/o carta attraverso cui la soluzione comprendente detto campione di saliva da analizzare migra per azione capillare; in cui detto agente di rivelazione ? un agente in grado di legare dette immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA, in particolare in cui detto agente di rivelazione ? la subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2, fusa con la porzione Fc della immunoglobulina lgG1 di topo, detta subunit? S1 ? coniugata ad un agente marcatore; in cui detto agente marcatore ? una nanoparticella di oro di diametro compreso tra 10 e 80 nm; e in cui detto agente di cattura immobilizzato ? un anticorpo anti-immunoglobuline di classe IgA.
7. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, comprendente un passaggio di concentrazione di detto campione biologico precedente a detto passaggio di rivelazione, in cui detto passaggio di concentrazione ? effettuato mediante osmosi diretta.
8. Metodo per la valutazione di risposta immunitaria al virus SARS-CoV-2 comprendente i passaggi di un metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 4 a 7.
9. Kit per la diagnosi di infezione da SARS-CoV-2 comprendente (i) uno o pi? mezzi per la rivelazione, mediante test di agglutinazione, di particelle virali di SARS-CoV-2 in un campione di saliva, e (ii) uno o pi? supporti solidi per test di agglutinazione, in cui detti uno o pi? mezzi per la rivelazione mediante test di agglutinazione compendono mezzi di agglutinazione rivestiti con un reagente in grado di legare uno o pi? antigeni del virus SARS-CoV-2, in cui detto reagente in grado di legare uno o pi? antigeni del virus SARS-CoV-2 ? un anticorpo anti-proteine Spike del virus SARS-CoV-2, in particolare ? un anticorpo anti-subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2, o un anticorpo anti-subunit? S2 di proteine Spike di SARS-CoV-2; e in cui detti mezzi di agglutinazione sono biglie di latex.
10. Kit per la diagnosi di infezione da SARS-CoV-2 comprendente (i) uno o pi? mezzi per la rivelazione, mediante test di immunocromatografia a flusso laterale (LFA), di particelle virali di SARS-CoV-2 in un campione di saliva, e (ii) una o pi? aliquote di un agente di rivelazione, in cui detti uno o pi? mezzi per la rivelazione mediante test di immunocromatografia a flusso laterale (LFA) sono mezzi di supporto solidi in grado di assorbire detto campione di saliva per azione capillare; detti mezzi di supporto solidi sono caratterizzati da (a) una prima area ?di cattura? comprendente un agente di cattura immobilizzato, capace di formare un complesso con uno o pi? antigeni del virus SARS-CoV-2 e da (b) una seconda area ?di controllo? comprendente un agente di controllo immobilizzato capace di formare un complesso con un agente di rivelazione;
in cui detto agente di rivelazione ? un anticorpo anti-SARS-CoV-2, detto anticorpo ? coniugato ad un agente marcatore, in particolare in cui detto agente marcatore ? una nanoparticella di oro di diametro compreso tra 10 e 80 nm;
in cui detto agente di cattura immobilizzato ? un anticorpo anti-proteine Spike di SARS-CoV-2, in particolare detto agente di cattura immobilizzato ? un anticorpo anti-subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2;
e in cui detto agente di controllo immobilizzato ? un anticorpo capace di riconoscere la porzione Fc di detto anticorpo di rivelazione.
11. Kit per la rivelazione di immunit? mucosale verso SARS-CoV-2 comprendente (i) uno o pi? mezzi per la rivelazione, mediante test di agglutinazione, di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA in un campione di saliva, e (ii) uno o pi? supporti solidi per test di agglutinazione, in cui detti uno o pi? mezzi per la rivelazione mediante test di agglutinazione sono mezzi di agglutinazione rivestiti con un reagente in grado di legare dette immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA, in cui detto reagente in grado di legare dette immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA ? costituito da antigeni nativi o ricombinanti del virus SARS-CoV-2, in particolare ? la subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2, fuso con la porzione Fc della immunoglobulina lgG1 di topo; e in cui detti mezzi di agglutinazione sono biglie di latex.
12. Kit per la rivelazione di immunit? mucosale verso SARS-CoV-2 comprendente (i) uno o pi? mezzi per la rivelazione, mediante test di immunocromatografia a flusso laterale (LFA), di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA in un campione di saliva, e (ii) una o pi? aliquote di un agente di rivelazione, in cui detti uno o pi? mezzi per la rivelazione mediante test di immunocromatografia a flusso laterale (LFA) sono mezzi di supporto solidi in grado di assorbire detto campione di saliva per azione capillare; detti mezzi di supporto solidi sono caratterizzati da (a) una prima area ?di cattura? comprendente un agente di cattura immobilizzato, capace di formare un complesso con dette immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA e da (b) una seconda area ?di controllo? comprendente un agente di controllo immobilizzato capace di formare un complesso con un agente di rivelazione;
in cui detto agente di rivelazione ? in grado di legare dette immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA, in particolare in cui detto agente di rivelazione ? la subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2, fuso con la porzione Fc della immunoglobulina lgG1 di topo, detta subunit? S1 ? coniugata ad un agente marcatore; in cui detto agente marcatore ? una nanoparticella di oro di diametro compreso tra 10 e 80 nm;
in cui detto agente di cattura immobilizzato ? un anticorpo anti-immunoglobuline di classe IgA.
13. Kit secondo la rivendicazione 12, ulteriormente comprendente (iii) una o pi? aliquote di anticorpi anti-immunoglobuline di classe IgA marcati con Ulfa-tag capaci di formare un complesso con dette immunoglobuline di classe IgA, e (iv) uno o pi? mezzi per la rivelazione, mediante test di immunocromatografia a flusso laterale (LFA), di immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 di classe IgA in un campione di saliva in cui detto agente di cattura immobilizzato ? un anticorpo anti- Ulfa-tag; detto agente di controllo immobilizzato ? streptavidina; detto agente di rivelazione comprende un primo agente di rivelazione costituito da nanoparticelle di oro marcate con biotina capaci di legare detto agente di controllo immobilizzato, e un secondo agente di rivelazione costituito dalla subunit? S1 di proteine Spike del virus SARS-CoV-2 fusa con la porzione Fc della immunoglobulina lgG1 di topo, coniugata ad una nanoparticella di oro di 40 nm, detta subunit? S1 ? in grado di formare un complesso con dette immunoglobuline di classe IgA.
14. Combinazione di kit comprendente almeno un kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 9 o 10 e almeno un kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 11 a 14 per la diagnosi di infezione da SARS-CoV-2, e/o per la valutazione della risposta immunitaria al virus SARS-CoV-2.
15. Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 9 a 15, ulteriormente comprendente un dispositivo per la concentrazione di detto campione di saliva, in cui detto dispositivo include una membrana di dialisi con cut-off pari a 10 kDa.
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