CN116789810A - 用于检测或诊断新型布尼亚病毒的单克隆抗体、其应用及产品 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于检测或诊断新型布尼亚病毒的单克隆抗体、其应用及产品。该单克隆抗体选自单克隆抗体SF‑M3或单克隆抗体SF‑M4。其应用包括非诊断目的检测新型布尼亚病毒、制备检测新型布尼亚病毒的检测产品、制备诊断新型布尼亚病毒相关疾病的诊断产品、制备抑制新型布尼亚病毒感染的药物、或制备治疗新型布尼亚病毒相关疾病的药物。其产品以单克隆抗体SF‑M3为捕获抗体，且以单克隆抗体SF‑M4为检测抗体。本发明的单克隆抗体SF‑M3、SF‑M4能特异性结合新型布尼亚病毒核壳蛋白的不同位点，由它们构建的免疫检测或诊断试剂盒灵敏度高，特异性强，能快速、准确地检测出新型布尼亚病毒。

Description

用于检测或诊断新型布尼亚病毒的单克隆抗体、其应用及 产品
技术领域
本发明涉及一种用于检测或诊断新型布尼亚病毒的单克隆抗体，其相关应用，以及相关产品(如试剂盒等)，属于生物医药技术领域。
背景技术
新型布尼亚病毒又称发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever withthrombocytopenia syndrome virus，SFTSV)，会引发疾病发热伴血小板减少综合征，这是一种严重危害人类健康的烈性传染病。该病毒于2009年在中国首次分离，2011年首次报道[1]，目前主要流行于我国中部和东部至少16个省，日本、韩国和美国均有相关病例报道[2-4]。该病毒主要通过蜱虫传播，密切接触患者、直接接触患者血液、体液及气溶胶等的医务人员或其陪护者均可被感染[5-8]。目前研究证实了人与人接触传播为新型布尼亚病毒的传播途径之一[9,10]。
新型布尼亚病毒为布尼亚病毒科，白蛉病毒属，分节段的单负链RNA病毒，病毒颗粒呈球形，直径为80～100nm，内有病毒基因组RNA、核壳蛋白和RNA依赖的RNA聚合酶蛋白所组成的RNP复合物，外有脂质包膜，表面可见刺突[11]。迄今为止人类对新型布尼亚病毒感染既无特效治疗药物，也无安全有效疫苗，人群普遍易感。国内报道危重患者死亡率极高(6.3％-30％)[12]，而韩国报道的病死率更高32.6％[13]，总死亡率达18％[14]。危重患者即使治疗康复，但仍因该病导致终身严重后遗症。大量临床数据表明，早期诊断、及时临床救治可以大大减少发热伴血小板减少综合征重症患者的发生率和病死率[15,16]。但由于多数SFTSV感染者早期缺乏特异的临床表现，仅有发热、血小板和白细胞减少，胃肠道，神经及多功能脏器损伤等临床症状，难以和其它出血热病毒如人类无形体病、出血热、钩端螺旋体病、莱姆病相区分。因此，迫切需要开发快速、可靠、标准化的SFTSV早期、特异的抗原、抗体检测试剂盒，为我国应对SFTS突发疫情提供检测试剂储备，平时为临床救治、流行病学疫情的监测与预警提供技术方法。
目前SFTSV的诊断方法主要包括病毒分离、血清学抗体和核酸检测。病毒分离是SFTSV感染实验室诊断的金标准，但病毒分离需要在三级生物安全实验室进行，分离时间长，很难达到早期诊断，更不利于基层单位的推广；当前，SFTSV感染诊断主要依赖于抗体诊断，但有文献报道，IgM在SFTSV患者发热11天后，血清抗体滴度仍然很低，甚至还检测不到抗体。Wu等[17]建立的N-IgM检测方法在发病6天内检测抗体的阳性率为18％，发病7-12天检测的阳性率只有58％。虽然目前已经有商品化的抗体检测方法，该方法对动物血清和患者血清检测结果与中和实验结果完全一致[18]。但是抗体检测方法始终无法达到早期诊断的目的，且抗体诊断与布尼亚病毒其他成员间存在交叉现象，在疫区中往往是几种出血热病毒同时流行，血清学抗体诊断方法显然已经无法满足早期、确切诊断的目的。而核酸检测方法，虽然可以达到早期诊断的目的，但目前来说，核酸检测方法仍然无法做到大规模的快速筛查。正如新型冠状病毒引起的肺炎，为达到早期诊断，早期隔离，使用核酸检测方法进行大规模筛查，不仅需要大批量的专业技术人员及相关的设备配套，一个标本从开始核酸提取到出结果，最快也要2个小时，每台仪器最多也只能上样检测94个样品，整个核酸筛查下来，经济成本居高不下。而SFTSV作为一种同样也能引起人传人的烈性传染病，一旦病毒大规模爆发流行，一种早期有效、简单、快速、方便的检测方法最为重要，而目前真正能够达到这种目的的检测方法只有基于免疫学原理的血清学抗原诊断方法。
众所周知，抗原检测方法的好坏完全取决于所选择的靶标抗原和所使用的检测抗体的性能，好的靶标抗原及其特异性抗体建立的检测方法的敏感性可完全取代于核酸检测。在血清学抗原诊断方面，目前尚未有商品化试剂盒报道，Aiko Fukuma等[19]利用SFTSV核壳蛋白特异性单抗与多抗建立的双抗体夹心检测方法就能在发病早期特异地检测到发热伴血小板减少综合征患者血清中的核壳蛋白，然而作为多抗配单抗，其检测的灵敏度也只有3500-12200TCID50/ml，仍然有很大需要改进的地方。且因该方法使用的捕获抗体为多克隆抗体，在后续生产过程中也存在批间差异，很难实现标准化和商品化。卢静等研究也证实了核壳蛋白具有很强的抗原性，在病毒感染患者早期血清中便有高浓度的核壳特异性抗体存在[15]，进一步证实了以核壳蛋白作为靶抗原建立抗原诊断方法应该适用于SFTSV感染的早期诊断。鉴于此，在SFTSV大规模爆发之前，研制其血清学特异性的抗原诊断方法，其方法的性能指标要达到核酸检测方法的敏感性和特异性，并且覆盖整个病原感染的急性期，作为未来应对大规模疫情的技术储备十分必要。
参考文献：
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发明内容
本发明的主要目的是：克服现有技术存在的问题，提供用于检测或诊断新型布尼亚病毒的单克隆抗体，能特异性结合新型布尼亚病毒的核壳蛋白(即N蛋白)；同时还提供其相关应用、以及相关产品，例如免疫检测或诊断试剂盒，灵敏度高，特异性强，能快速、准确地检测出新型布尼亚病毒。
本发明解决其技术问题的技术方案如下：
一种用于检测或诊断新型布尼亚病毒的单克隆抗体，其特征是，所述抗体选自单克隆抗体SF-M3或单克隆抗体SF-M4；
所述单克隆抗体SF-M3包括重链和轻链，所述重链包括：重链CDR1，其氨基酸序列为GFTFSSYT；重链CDR2，其氨基酸序列为ITSGGSYT；重链CDR3，其氨基酸序列为TRDNYGTFFDY；所述轻链包括：轻链CDR1，其氨基酸序列为QDVNTA；轻链CDR2，其氨基酸序列为SAS；轻链CDR3，其氨基酸序列为QQHFSTPLT；
所述单克隆抗体SF-M4包括重链和轻链，所述重链包括：重链CDR1，其氨基酸序列为：GFNFNINA；重链CDR2，其氨基酸序列为：IRSKNNNYAT；重链CDR3，其氨基酸序列为：VRGDYAMDY；所述轻链包括：轻链CDR1，其氨基酸序列为：QGISNY；轻链CDR2，其氨基酸序列为：YTS；以及轻链CDR3，其氨基酸序列为：QQYSKLPYT。
优选地，所述单克隆抗体SF-M3的重链还包括：重链FR1，其氨基酸序列为：DVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAAS；重链FR2，其氨基酸序列为：MSWVRQTPEK RLEWVAT；重链FR3，其氨基酸序列为：HYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSED TAMYYC；重链FR4，其氨基酸序列为：WGQGTTLTVSS；
或者，所述单克隆抗体SF-M3的轻链还包括：轻链FR1，其氨基酸序列为：DIVMTQSHKFMSTSVRDRVSITCRAS；轻链FR2，其氨基酸序列为：VAWYQQKPGQSPN LLIY；轻链FR3，其氨基酸序列为：YRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYY C；轻链FR4，其氨基酸序列为：FGAGTKLELK；
或者，所述单克隆抗体SF-M4的重链还包括：重链FR1，其氨基酸序列为：EVHLSETGGGLVQPKGSLRLSCAAS；重链FR2，其氨基酸序列为：MNWVRQAPGKGLDW VAR；重链FR3，其氨基酸序列为：YYADSVKDRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAVY YC；重链FR4，其氨基酸序列为：WGQGTSVIVSS；
或者，所述单克隆抗体SF-M4的轻链还包括：轻链FR1，其氨基酸序列为：DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSAS；轻链FR2，其氨基酸序列为：LNWFQQRPDGIVQ LLIF；轻链FR3，其氨基酸序列为：SLNSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYY C；轻链FR4，其氨基酸序列为：FGGGTKLEIK。
优选地，所述单克隆抗体SF-M3的重链可变区序列与SEQ ID No.1具有90％-100％的序列同一性；
或者，所述单克隆抗体SF-M3的轻链可变区序列与SEQ ID No.2具有90％-100％的序列同一性；
或者，所述单克隆抗体SF-M4的重链可变区序列与SEQ ID No.3具有90％-100％的序列同一性；
或者，所述单克隆抗体SF-M4的轻链可变区序列与SEQ ID No.4具有90％-100％的序列同一性。
优选地，所述单克隆抗体SF-M3、单克隆抗体SF-M4分别为IgG分子。
本发明还提供：
编码前文所述单克隆抗体的核酸分子。
含有前文所述核酸分子的杂交瘤细胞。
前文所述单克隆抗体或前文所述核酸分子用于非诊断目的检测新型布尼亚病毒、制备检测新型布尼亚病毒的检测产品、制备诊断新型布尼亚病毒相关疾病的诊断产品、制备抑制新型布尼亚病毒感染的药物、或制备治疗新型布尼亚病毒相关疾病的药物的应用。
本发明还提供：
一种针对新型布尼亚病毒的检测或诊断产品，其特征是，包括前文所述的单克隆抗体，并以单克隆抗体SF-M3为捕获抗体，且以单克隆抗体SF-M4为检测抗体。
优选地，所述检测或诊断产品为采用双抗体夹心ELISA法或胶体金法的免疫检测或诊断试剂盒。
优选地，所述免疫检测或诊断试剂盒还包括：包被捕获抗体的微孔反应板，样品处理液，标记有标记物的检测抗体的工作液，浓缩洗涤液，阳性对照液，阴性对照液，显色液，以及终止液；
所述标记物选自生物素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、胶体金、荧光素；当标记物为生物素时，所述免疫检测或诊断试剂盒还包括：标记有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的亲和素。其中，亲和素能与生物素以1:4的比例结合，起到放大检测信号的作用，能进一步提高检测的灵敏度。
本发明经筛选获得的单克隆抗体SF-M3、SF-M4能特异性结合新型布尼亚病毒核壳蛋白(即N蛋白)的不同位点，而与其它病毒，如登革病毒、乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、黄热病毒、西尼罗病毒均无交叉反应；采用单克隆抗体SF-M3、SF-M4构建的免疫检测或诊断试剂盒能准确、快速地检测出新型布尼亚病毒，检测灵敏度可达4pg/ml，检测新型布尼亚病毒培养上清的最高稀释度为1:25600，灵敏度高，特异性强，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1的免疫印迹结果图。其中，条带1为低分子量蛋白标签；条带2为抗his单抗；条带3为无关单抗；条带4为单抗SF-M3；条带5为单抗SF-M4。
图2为本发明实施例3的灵敏度测定结果图。
图3为本发明实施例3的特异性分析结果图。
图4为本发明实施例4检测模拟患者血清的结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。
实施例1
本实施例为制备抗新型布尼亚病毒核壳蛋白(简称：SFTSV-N蛋白)的单克隆抗体SF-M3和SF-M4。
本实施例的具体内容如下：
a.免疫抗原的制备
采用携带SFTSV-N蛋白基因(Genebank:4J4R_A)的大肠杆菌工程菌株制备基因重组SFTSV-N蛋白，其制备过程按现有的常规方法进行，其中，对于纯化的SFTSV-N蛋白采用考马斯亮蓝(Coomassie)蛋白分析试剂(PIERCE，Cat，No.ED62976)进行常规的定量及免疫原鉴定即可。将所得SFTSV-N蛋白作为免疫抗原。
b.免疫小鼠
取4-6周龄雌性BALB/c小鼠，第一次采用弗氏完全佐剂与等体积SFTSV-N蛋白混匀乳化(抗原终浓度为300μg/ml)，每只小鼠皮下多点注射30μg，之后每10天以弗氏不完全佐剂与等体积SFTSV-N蛋白混匀乳化后免疫，免疫共4次后，于融合前3天每只小鼠腹腔注射SFTSV-N蛋白50μg进行加强免疫。
c.免疫血清抗体效价测定
建立间接ELISA法测定免疫血清抗体效价，具体过程如下：
采用1μg/ml SFTSV-N蛋白的50mM pH9.6碳酸盐缓冲液，包被聚苯乙烯微96孔板，100μl/孔，4℃过夜。次日，用含0.25％酪蛋白(Sigma)的封闭液300μl/孔4℃过夜，弃液并拍干后真空干燥2～12小时，用铝膜袋真空包装4℃保存，用于鼠免疫血清抗体效价测定。
于小鼠第四次免疫后10天尾静脉采血，将鼠免疫血清用含0.1％BSA 10mM PBS以103～106倍稀释，加入96孔板，100μl/孔37℃孵育30分钟，以含0.1％ Tween-20的10mM PBS洗涤液洗板五次后，加入1:1000倍稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗小鼠IgG(Sigma,INC.)，100μl/孔37℃孵育30分钟，洗板(洗板操作同前)，加入TMB显色液，100μl/孔，室温避光显色10分钟，加100μl/孔1M H2SO4终止反应，测450nm吸光值，以免疫前小鼠血清作为阴性对照，以测定值与对照值之比≥2.1为阳性来判断免疫血清的抗体效价。
d.杂交瘤制备和筛选
选择血清抗体效价达1×106的小鼠，于融合前3天腹腔注射SFTSV-N蛋白100μg。在融合当天，无菌取小鼠脾脏，制成脾细胞悬液并与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株NS-1(市售)按10:1的比例混合，在45％聚乙二醇(PEG，MW4000，Sigma)作用下进行融合；其中，按下述步骤将聚乙二醇溶液加入细胞：在37℃水浴中，向含细胞的培养基中缓慢加入1.0mlPEG，边加边轻轻摇匀，并用无血清RPMI-1640培养基终止融合，最后加入10ml含15％胎牛血清的RPMI-1640培养基，室温800rpm离心5min，弃上清，用60ml含15％胎牛血清的RPMI-1640培养基轻轻悬起细胞。将此细胞悬液加入6块96孔培养板上，放置在二氧化碳培养箱中(温度为37℃、5％ CO2的培养箱)。次日向每孔加入100μl含次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶脱氧核苷(HAT，Sigma)的筛选培养基。以后每3天用此筛选培养基给培养物换液一次，直到细胞克隆形成。
为检测产生抗体克隆的存在，采用上文的间接ELISA法检测细胞培养上清。选择强阳性杂交瘤细胞进行克隆化，用有限稀释法连续克隆化2～3次，共获得两株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，命名为SF-M3的杂交瘤细胞株和SF-M4的杂交瘤细胞株。将克隆化后阳性率达100％的细胞扩增培养后液氮冻存。
e.抗SFTSV-N蛋白单克隆抗体腹水的制备以及抗体纯化
采用体内诱生法，在小鼠体内接种杂交瘤细胞SF-M3制备腹水获得单克隆抗体SF-M3，或者在小鼠体内接种杂交瘤细胞SF-M4制备腹水获得单克隆抗体SF-M4。
具体制备方法如下：
每只小鼠腹腔内注射0.5ml弗氏不完全佐剂(Sigma公司)，使瘤细胞能以腹水瘤形式在腹腔内生长。大约1～2周后，将2×106个杂交瘤细胞SF-M3或SF-M4悬浮于无血清RPMI1640培养基中，注入小鼠腹腔。注射杂交瘤细胞SF-M3或SF-M4大约1～2周后，用9号针头放腹水，可反复收集数次。腹水经离心澄清后4℃存放备用。
腹水抗体的纯化采用辛酸-硫酸铵沉淀法，腹水用60mM、pH5.0醋酸缓冲液稀释2倍，用0.1N盐酸调pH值至4.8，液体由清亮变混浊，室温下于30分钟内边搅拌边逐滴缓慢加入辛酸，为每毫升稀释前腹水加33μl辛酸，出现大量沉淀，4℃静置2小时，10000g，4℃离心30分钟，取上清，加入1/10体积pH7.4的100mM磷酸盐缓冲液，并用0.1N氢氧化钠调pH值至7.4，冰浴搅拌下缓慢加入硫酸铵，为每毫升液体加入0.277g硫酸铵即为45％饱和度，4℃静置过夜，10000g，4℃离心30分钟，弃上清，沉淀溶于适量10mM磷酸盐缓冲液，用同样的液体，4℃透析过夜，换液三次。以考马斯亮蓝(Coomassie)蛋白分析试剂(PIERCE，Cat，No.ED62976)定量。测定浓度后的抗体加入终浓度50％的甘油并于-80℃保存。
f.抗SFTSV-N蛋白单克隆抗体亚类鉴定
采用间接ELISA法检测已获得的阳性克隆以确定其产生的抗体亚类。具体过程为：以SFTSV-N蛋白包被微孔板，封闭后与杂交瘤细胞SF-M3或SF-M4的培养上清孵育，再分别与为1:1000倍稀释HRP标记的兔抗小鼠不同亚类特异性免疫球蛋白孵育，具体包括兔抗小鼠IgG1(美国ZYMED LABORATORIES,INC，目录号61-0120)，兔抗小鼠IgG2a(同上，目录号61-0220)，兔抗小鼠IgG2b(同上，目录号61-0320)，兔抗小鼠IgG3(同上，目录号61-0420)，兔抗小鼠IgM(同上，目录号61-6820)。
检测结果显示，杂交瘤细胞株SF-M3分泌的单克隆抗体SF-M3为IgG1阳性，杂交瘤细胞株SF-M4分泌的单克隆抗体SF-M4为IgG2a阳性。
g.SFTSV-N蛋白单克隆抗体的鉴定
(1)间接ELISA法进行单克隆抗体鉴定
分别用重组SFTSV-N蛋白和天然SFTSV抗原包被微孔板，按照常规的间接ELISA法进行检测。(注：重组SFTSV-N蛋白和天然SFTSV抗原的区别在于：重组SFTSV-N蛋白是通过原核表达系统表达的基因重组蛋白，其结构与SFTSV病毒表达的N蛋白可能存在一些区别；天然SFTSV抗原则是SFTSV病毒直接感染细胞产生的N蛋白，完全是SFTSV病毒表达的蛋白成分。)
具体过程为：在包被的微孔板中分别加入1μg/ml的前文已获得的单克隆抗体SF-M3和SF-M4，37℃孵育1h，加入1:1000稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG(Sigma,Inc)，100μl/孔37℃孵育30min，加TMB显色液室温避光显色10min，加1M H2SO4终止反应，测450nm吸光值(A450)。结果如表1所示，表明单克隆抗体SF-M3、SF-M4分别与重组的SFTSV-N蛋白、天然SFTSV抗原均产生很强的特异性反应。
表1间接ELISA反应结果
(2)间接免疫荧光法进行单克隆抗体鉴定
采用SFTSV、登革热病毒(DENV)和西尼罗病毒(WNV)分别感染Vero细胞，当有2/3细胞出现病变时，收集细胞，用预冷的10mM pH7.2 PBS洗细胞两遍，然后将细胞滴于无菌干燥的玻片上，干燥后，制备成涂片，充分干燥，用冷丙酮固定10分钟后吹干，将前文已获得的的单克隆抗体SF-M3和SF-M4分别按10μg/ml的浓度滴在不同的抗原孔中，每孔10μl，同时设阴性和阳性对照，置37℃水浴箱中，孵育45分钟后，取出将抗原片放于染色缸中，用10mMpH7.2 PBS洗3次，吹干，加入荧光标记羊抗小鼠IgG抗体，置37℃水浴箱中，孵育45分钟后，取出将抗原片洗涤4次，吹干，荧光显微镜下观察荧光图像，以荧光的强度和染色形态进行结果判定，检测抗体强度以(±～++++)计为阳性，抗体强度(－)计为阴性。结果如表2所示，表明单克隆抗体SF-M3、SF-M4能与固定在玻片上SFTSV抗原特异性结合，与其他黄病毒属成员，DENV和WNV感染的细胞涂片均无交叉反应。
表2免疫荧光检测结果
SFTSV DENV-1 DENV-2 DENV-3 DENV-4 WNV Vero细胞
SF-M3 ++ - - - - - -
SF-M4 ++ - - - - - -
(3)免疫印迹法进行单克隆抗体特异性分析
将重组的SFTSV-N蛋白，用2×SDS加样缓冲液稀释一倍，将样品加到10％SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶中，电泳分离蛋白质，通过电洗脱使在凝胶上分离出来的蛋白质转印到硝酸纤维膜上，转印膜用含7％脱脂奶和3％BSA的10mM PBS于4℃封闭6小时，将转印膜装在专门的反应板中，分别加入杂交瘤细胞SF-M3或SF-M4的培养上清中，4℃反应过夜，用含有0.5％Tween 20的10mM pH7.2 PBS洗涤膜后，加入1:500倍稀释的HRP标记羊抗鼠IgG，室温反应1小时，用同样的洗涤液洗涤膜后，ECL曝光。
免疫印迹结果如图1所示，表明单克隆抗体SF-M3、SF-M4与重组SFTSV-N蛋白特异性结合，且结合蛋白的相对分子质量为26千道尔顿。特异性蛋白质结合带与预测分子量为26千道尔顿相一致，说明获得的单克隆抗体SF-M3、SF-M4能够特异性识别重组的SFTSV-N蛋白抗原。
h.单克隆抗体识别位点分析
将重组SFTSV-N蛋白以1μg/ml加入50mM pH9.6碳酸盐缓冲液，0.1ml/孔包被聚苯乙烯微96孔板，4℃过夜。次日，加入含0.25％酪蛋白(Sigma)的封闭液0.3ml/孔4℃过夜后，先加0.5mg/ml单抗50μl/孔，再加1:500稀释的辣根过氧化物酶标记单抗50μl/孔，室温孵育1小时，0.5％Tween 20的PBS洗涤五次后加入TMB显色液室温显色10分钟，测A450吸光值。以单抗对同一HRP标记的单抗抑制为100％，以已知无关单抗对标记单抗的抑制为阴性对照，计算各单抗间的抑制率。即抑制率为(1-测定值/阴性对照值)×100。抑制率>75％为相关，>50％为不完全相关，<50％为不相关，<25％为完全不相关。结果如表3所示，表明单克隆抗体SF-M3、SF-M4识别2个不完全相同的抗原位点。
表3识别抗原位点测定结果
i.单克隆抗体的序列
经检测，单克隆抗体SF-M3的重链可变区序列为SEQ ID No.1：
DVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATITSGGSYTHYPD SVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCTRDNYGTFFDYWGQGTTLTVSS。
其中，含有3个CDR：重链CDR1(序列为：GFTFSSYT)、重链CDR2(序列为：ITSGGSYT)、重链CDR3(序列为：TRDNYGTFFDY)；还含有4个框架区FR：重链FR1(序列为：DVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAAS)、重链FR2(序列为：MSWV RQTPEKRLEWVAT)、重链FR3(序列为：HYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDT AMYYC)、重链FR4(序列为：WGQGTTLTVSS)。
单克隆抗体SF-M3的轻链可变区序列为SEQ ID No.2：
DIVMTQSHKFMSTSVRDRVSITCRASQDVNTAVAWYQQKPGQSPNLLIYSASYRYTGVPDRF TGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHFSTPLTFGAGTKLELK。
其中，含有3个CDR：轻链CDR1(序列为：QDVNTA)、轻链CDR2(序列为：SAS)、以及轻链CDR3(序列为：QQHFSTPLT)；还含有4个框架区FR：轻链FR1(序列为：DIVMTQSHKFMSTSVRDRVSITCRAS)、轻链FR2(序列为：VAWYQQKPG QSPNLLIY)、轻链FR3(序列为：YRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYC)、轻链FR4(序列为：FGAGTKLELK)。
单克隆抗体SF-M4的重链可变区序列为SEQ ID No.3：
EVHLSETGGGLVQPKGSLRLSCAASGFNFNINAMNWVRQAPGKGLDWVARIRSKNNNYATYY ADSVKDRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAVYYCVRGDYAMDYWGQGTSVIVSS。
其中，含有3个CDR：重链CDR1(序列为：GFNFNINA)、重链CDR2(序列为：IRSKNNNYAT)、重链CDR3(序列为：VRGDYAMDY)；还含有4个框架区FR：重链FR1(序列为：EVHLSETGGGLVQPKGSLRLSCAAS)、重链FR2(序列为：MNWV RQAPGKGLDWVAR)、重链FR3(序列为：YYADSVKDRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDT AVYYC)、重链FR4(序列为：WGQGTSVIVSS)。
单克隆抗体SF-M4的轻链可变区序列为SEQ ID No.4：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWFQQRPDGIVQLLIFYTSSLNSGVPSRF SGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPYTFGGGTKLEIK。
其中，含有3个CDR：轻链CDR1(序列为：QGISNY)、轻链CDR2(序列为：YTS)、以及轻链CDR3(序列为：QQYSKLPYT)；还含有4个框架区FR：轻链FR1(序列为：DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSAS)、轻链FR2(序列为：LNWFQQRPD GIVQLLIF)、轻链FR3(序列为：SLNSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYC)、轻链FR4(序列为：FGGGTKLEIK)。
实施例2
本实施例为在实施例1所得单克隆抗体SF-M3、SF-M4基础上建立新型布尼亚病毒核壳蛋白(即SFTSV-N蛋白)的免疫检测或诊断试剂盒。
(一)、本实施例试剂盒由以下试剂组成：
(1)单克隆抗体SF-M3包被的微孔反应板。
具体制备过程为：将单克隆抗体SF-M3用10mM磷酸盐缓冲液(pH7.6)稀释至10μg/ml，以150μl/孔包被聚苯乙烯微孔板，于4℃过夜；拍干后，每孔加入300μl/孔的0.25％酪蛋白(Sigma)的封闭液，于4℃过夜以封闭非特异性结合位点。甩干板条，真空干燥12～24h，用铝膜袋真空包装4℃保存备用。
(2)样品处理液：由0.1％的BSA、0.1％ Tween-20 PBS组成。
(3)辣根过氧化物酶(HRP)标记单克隆抗体SF-M4的工作液。
具体制备过程为：将5mg辣根过氧化物酶搅拌溶解于1ml蒸馏水中，加入0.2ml新配0.1M过碘酸钠避光搅拌30min，于1mM pH4.4醋酸钠缓冲液中4℃透析过夜；次日用0.2MpH9.5碳酸盐缓冲液调节10mg单克隆抗体SF-M4至pH值为9.5，加入透析后的辣根过氧化物酶，同样用0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液调节pH值至9.5；室温避光轻轻搅拌2～3h，然后加入0.1ml新配4mg/ml硼氢化钠，4℃避光过夜；次日冰浴上避光搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵(硫酸铵用前先用氨水调pH至7.2)，4℃静置6h后，4℃12000rpm离心30min，弃上清，用适量10mM pH7.2 PBS缓冲液重悬沉淀物，4℃透析过夜，换液三次；收集结合物加入含终浓度1％BSA、50％甘油保护剂，最后用磷酸盐缓冲液稀释1000倍，即为辣根过氧化物酶标记单克隆抗体SF-M4的工作液。
(4)浓缩洗涤液：含有2％ Tween-20的20×PBS，即1L溶液中含有4.56gNaH2PO4，58.02g Na2HPO4·12H2O，175.3g NaCl，15磅20min高压灭菌后，加入20ml Tween-20搅匀，使用时20倍稀释。
(5)阳性对照液：大肠杆菌表达的重组SFTSV-N蛋白，浓度为1μg/ml。
(6)阴性对照液：含0.1％ Tween-20的10mM pH7.4 PBS，即1L溶液中含有4.56gNaH2PO4，58.02g Na2HPO4·12H2O，175.3g NaCl，15磅20min高压灭菌，20倍稀释后加入0.1％Tween-20。
(7)显色液：由显色液A和B组成，使用时取二者等量混匀使用。其中显色液A、B的组成成分如下：
显色液A：将0.89g柠檬酸和0.16g EDTA二钠溶于1000ml水中，115℃高压30min，降至90℃后加TMB 0.25g，摇匀于4℃闭光保存；
显色液B：将9.33g柠檬酸和14.6g EDTA二钠溶于1000ml水中，115℃高压30min后，降至90℃后加0.75％过氧化氢尿素12.8ml，摇匀于4℃闭光保存。
(8)终止液：1M H2SO4。
(二)、本实施例试剂盒的使用方法(双抗体夹心ELISA检测法)：
(1)样品检测
取待测的样品10μl，加入样品处理液90μl，混匀后加入单克隆抗体SF-M3包被的微孔反应板中，同时设阴性对照和阳性对照，37℃温育1h，将浓缩洗涤液20倍稀释后洗涤板条，洗板五次后，加入1:500稀释的HRP标记的单克隆抗体SF-M4，100μl/孔，室温30min，同上洗板八次后加显色液(显色液A和B等量混合，现用现配)，100μl/孔，室温避光10min后，加入终止液，100μl/孔，终止反应。
(2)结果判定：以空白孔调零，于450nm波长测定吸光度(A值)。阳性对照平均值≥0.50，阴性对照平均值≤0.10，实验成立。样品A值≥阴性对照A值平均值×2.1，则判为阳性，反之为阴性。
实施例3
本实施例为对实施例2免疫检测或诊断试剂盒进行灵敏度测定和特异性分析。
(1)重组SFTSV-N蛋白的灵敏度测定
将重组SFTSV-N蛋白从1000ng/mL开始倍比稀释若干梯度，用实施例2免疫检测或诊断试剂盒检测重组SFTSV-N蛋白，同时检测相同浓度的BSA作为阴性对照。以BSA的检测值作为标准，以检测值大于或等于相同BSA浓度检测值的2.1倍的重组SFTSV-N蛋白的最低浓度作为本方法检测该抗原的灵敏度。
结果如图2和表4所示，当重组SFTSV-N蛋白稀释至8pg/ml时，A450＝0.053，是相应浓度的BSA对照(A450＝0.012)的4.42倍，当重组SFTSV-N稀释至4pg/ml时，A450＝0.026，是相应浓度的BSA对照(A450＝0.012)的2.17倍，因此根据上述判断标准，实施例2免疫检测或诊断试剂盒检测重组SFTSV-N蛋白的最低浓度为4pg/ml，保守地说，灵敏度也可达8pg/ml。
表4检测结果
(2)病毒培养上清的特异性分析
采用实施例2免疫检测或诊断试剂盒检测灭活的SFTSV、DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4、JEV(乙型脑炎病毒)、WNV的病毒培养上清，从1:200开始倍比稀释12个梯度进行检测。检测结果显示对SFTSV培养上清的检测灵敏度高达1:51200，而对其他病毒检测结果均为阴性，如图3所示。
实施例4
本实施例为采用实施例2免疫检测或诊断试剂盒的临床试验检测。
检测过程为：将临床血清样本以样品处理液按1:10稀释后采用实施例2免疫检测或诊断试剂盒进行检测。
(1)检测正常人血清
以333例正常人血清为临床血清样本进行检测，用此检测结果确定本检测方法的临界值。对检测值进行分析，计算得平均值为0.01，标准差为0.0042，以平均值加上3个标准差作为本方法的检测临界值即：0.01+0.0042×3＝0.0234，以大于或等于临界值作为判断检测值阳性标准，333例正常人血清均为阴性，可确定本方法的特异度为100％。
(2)检测模拟患者血清
将新型布尼亚病毒SFTSV加入到正常人血清标本中作为模拟SFTSV感染的模拟患者血清标本，于37℃孵育24小时后(保证病毒与血清中的蛋白成分重复结合)，用健康体检的正常人血清标本作为稀释液，对模拟患者血清标本进行梯度稀释后检测。结果如图4所示，表明实施例2免疫检测或诊断试剂盒检测模拟患者血清标本的最低检测限为1:12800。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于检测或诊断新型布尼亚病毒的单克隆抗体，其特征是，所述抗体选自单克隆抗体SF-M3或单克隆抗体SF-M4；
所述单克隆抗体SF-M3包括重链和轻链，所述重链包括：重链CDR1，其氨基酸序列为GFTFSSYT；重链CDR2其氨基酸序列为ITSGGSYT；重链CDR3，其氨基酸序列为TRDNYGTFFDY；所述轻链包括：轻链CDR1，其氨基酸序列为QDVNTA；轻链CDR2，其氨基酸序列为SAS；轻链CDR3，其氨基酸序列为QQHFSTPLT；
所述单克隆抗体SF-M4包括重链和轻链，所述重链包括：重链CDR1，其氨基酸序列为：GFNFNINA；重链CDR2，其氨基酸序列为：IRSKNNNYAT；重链CDR3，其氨基酸序列为：VRGDYAMDY；所述轻链包括：轻链CDR1，其氨基酸序列为：QGISNY；轻链CDR2，其氨基酸序列为：YTS；以及轻链CDR3，其氨基酸序列为：QQYSKLPYT。
2.根据权利要求1所述的用于检测或诊断新型布尼亚病毒的单克隆抗体，其特征是，所述单克隆抗体SF-M3的重链还包括：重链FR1，其氨基酸序列为：DVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAAS；重链FR2，其氨基酸序列为：MSWVRQTPEKRLEW VAT；重链FR3，其氨基酸序列为：HYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMY YC；重链FR4，其氨基酸序列为：WGQGTTLTVSS；
或者，所述单克隆抗体SF-M3的轻链还包括：轻链FR1，其氨基酸序列为：DIVMTQSHKFMSTSVRDRVSITCRAS；轻链FR2，其氨基酸序列为：VAWYQQKPGQSPN LLIY；轻链FR3，其氨基酸序列为：YRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYY C；轻链FR4，其氨基酸序列为：FGAGTKLELK；
或者，所述单克隆抗体SF-M4的重链还包括：重链FR1，其氨基酸序列为：EVHLSETGGGLVQPKGSLRLSCAAS；重链FR2，其氨基酸序列为：MNWVRQAPGKGLDW VAR；重链FR3，其氨基酸序列为：YYADSVKDRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAVY YC；重链FR4，其氨基酸序列为：WGQGTSVIVSS；
或者，所述单克隆抗体SF-M4的轻链还包括：轻链FR1，其氨基酸序列为：DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSAS；轻链FR2，其氨基酸序列为：LNWFQQRPDGIVQLLIF；轻链FR3，其氨基酸序列为：SLNSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYC；轻链FR4，其氨基酸序列为：FGGGTKLEIK。
3.根据权利要求2所述的用于检测或诊断新型布尼亚病毒的单克隆抗体，其特征是，所述单克隆抗体SF-M3的重链可变区序列与SEQ ID No.1具有90％-100％的序列同一性；
或者，所述单克隆抗体SF-M3的轻链可变区序列与SEQ ID No.2具有90％-100％的序列同一性；
或者，所述单克隆抗体SF-M4的重链可变区序列与SEQ ID No.3具有90％-100％的序列同一性；
或者，所述单克隆抗体SF-M4的轻链可变区序列与SEQ ID No.4具有90％-100％的序列同一性。
4.根据权利要求1至3任一项所述的用于检测或诊断新型布尼亚病毒的单克隆抗体，其特征是，所述单克隆抗体SF-M3、单克隆抗体SF-M4分别为IgG分子。
5.编码权利要求1至4任一项所述单克隆抗体的核酸分子。
6.含有权利要求5所述核酸分子的杂交瘤细胞。
7.权利要求1至4任一项所述单克隆抗体或权利要求6所述核酸分子用于非诊断目的检测新型布尼亚病毒、制备检测新型布尼亚病毒的检测产品、制备诊断新型布尼亚病毒相关疾病的诊断产品、制备抑制新型布尼亚病毒感染的药物、或制备治疗新型布尼亚病毒相关疾病的药物的应用。
8.一种针对新型布尼亚病毒的检测或诊断产品，其特征是，包括权利要求1至4任一项所述的单克隆抗体，并以单克隆抗体SF-M3为捕获抗体，且以单克隆抗体SF-M4为检测抗体。
9.根据权利要求8所述针对新型布尼亚病毒的检测或诊断产品，其特征是，所述检测或诊断产品为采用双抗体夹心ELISA法或胶体金法的免疫检测或诊断试剂盒。
10.根据权利要求9所述针对新型布尼亚病毒的检测或诊断产品，其特征是，所述免疫检测或诊断试剂盒还包括：包被捕获抗体的微孔反应板，样品处理液，标记有标记物的检测抗体的工作液，浓缩洗涤液，阳性对照液，阴性对照液，显色液，以及终止液；
所述标记物选自生物素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、胶体金、荧光素；当标记物为生物素时，所述免疫检测或诊断试剂盒还包括：标记有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的亲和素。
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