CN116082504A - 靶向人lilrb2的纳米抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗LILRB2的纳米抗体、编码所述纳米抗体的核酸、包含所述核酸的表达载体、包含所述纳米抗体的药物组合物、以及制备药物的用途。

Description

靶向人LILRB2的纳米抗体及其应用
技术领域
本发明属于抗体工程领域，具体涉及一种用于诊断或治疗肿瘤的治疗性单域抗体，特别是涉及一种抗LILRB2的纳米抗体、其衍生蛋白以及用于制备药物的用途。
背景技术
纳米抗体是目前最小的抗体分子，最初由比利时科学家Hamers在骆驼血液中发现，它是工程化抗体产品中备受关注的一类。纳米抗体主要优点：一是体积是普通抗体的1/10，因为体积小，其在动物组织体内的穿透力强，如，可以通过人体的脑组织，可以达到高密度的肿瘤内部，而普通抗体却不能，这使得可以通过纳米抗体来治疗某些肿瘤或脑部疾病；二是抗原特异性好；三是易于基因改造，方便人工改造以获得对抗不同病原的抗体；四是稳定性高，如，纳米抗体在体内不被自然分解的时间比普通抗体长(意味着药效时间更持久)，纳米抗体甚至能从人胃中通过而保持有效性。
LILRB2，又称ILT4，主要在髓系细胞上表达，包括单核细胞、树突状细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞。基因学研究显示多种肿瘤微环境中的肿瘤关联巨噬细胞(TAM)高表达LILRB2，抑制LILRB2(小鼠的对应蛋白叫Pirb)降低Treg和MDSC在肿瘤组织的侵入。动物实验显示Pirb抗体抑制抑制肿瘤生长，并与PD-1抗体有协同作用。LILRB2主要在骨髓细胞表达、其它组织表达有限，这令on-target、off-tissue毒性比较轻微。人LILRB2是髓细胞成熟过程中重要的稳态表面调节因子，是一种有前途的、专门针对髓细胞功能测定的髓免疫检查点靶点，具有重要的治疗价值。
发明内容
现有技术中的ScFv、Fab或全IgG类抗LILRB2抗体分子，结构复杂、分子较大，虽然能将活性分子连接到LILRB2上，但影响活性分子的功能、方法复杂、负载效率也较低；纳米抗体分子较小、易于操作，但人源化程度低、亲和力不高，延长半衰期的性能有待进一步提高。
针对上述现有技术的不足，本发明提供一系列抗人LILRB2纳米抗体序列及制备方案。
第一方面，本发明提供一种抗LILRB2的纳米抗体，根据本发明的实施例，所述纳米抗体能够特异性结合LILRB2，且所述纳米抗体中的VHH链的互补决定区CDR为选自下组的一种或多种：
(1)SEQ ID NO：14所示的CDR1，SEQ ID NO：15所示的CDR2，和SEQ ID NO：16所示的CDR3；
(2)SEQ ID NO：17所示的CDR1，SEQ ID NO：18所示的CDR2，和SEQ ID NO：19所示的CDR3；
(3)SEQ ID NO：20所示的CDR1，SEQ ID NO：21所示的CDR2，和SEQ ID NO：22所示的CDR3；
(4)SEQ ID NO：23所示的CDR1，SEQ ID NO：21所示的CDR2，和SEQ ID NO：24所示的CDR3；
(5)SEQ ID NO：25所示的CDR1，SEQ ID NO：26所示的CDR2，和SEQ ID NO：27所示的CDR3。
(6)SEQ ID NO：28所示的CDR1，SEQ ID NO：29所示的CDR2，和SEQ ID NO：30所示的CDR3。
(7)SEQ ID NO：31所示的CDR1，SEQ ID NO：32所示的CDR2，和SEQ ID NO：33所示的CDR3。
(8)SEQ ID NO：34所示的CDR1，SEQ ID NO：35所示的CDR2，和SEQ ID NO：36所示的CDR3。
(9)SEQ ID NO：25所示的CDR1，SEQ ID NO：37所示的CDR2，和SEQ ID NO：27所示的CDR3。
进一步，在本发明的一些实施方案中，上述纳米抗体是人源化的VHH或骆驼源化的VHH。
进一步，在本发明的一些实施方案中，上述纳米抗体具有如SEQ ID NO：3至SEQ IDNO：12任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：12任一项所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
本发明所述的“至少80％同一性”为例如至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、进一步优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％同一性等≥80％的任何百分比的同一性。
第二方面，本发明提供一种融合蛋白，根据本发明的实施例，其包括能够特异性结合LILRB2的功能结构域，所述功能结构域由上述任一项所述的抗LILRB2的纳米抗体构成。
本发明提供的纳米抗体可以与其他的任意蛋白或物质融合，以实现不同的目的，例如与荧光蛋白、酶或放射性元等结合以实现易于检测的目的，再如与治疗LILRB2介导相关疾病的药物分子融合以实现更佳的治疗目的。与该纳米抗体融合的蛋白类型，本领域技术人员可以根据实际需要或目的合理选择，无论融合何种类型的物质融合，其也在本发明的范围内。
第三方面，本发明提供一种抗LILRB2的抗体，根据本发明的实施例，所述抗体为传统抗体或其功能性片段，所述抗体的重链可变区由前述任一项所述的抗LILRB2的纳米抗体构成；
进一步，上述功能性片段为所述传统抗体的Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、scFv或sdFv结构。
传统抗体在结构上由两条相同的重链和两条相同的轻链组成，轻链具有轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)；重链具有重链可变区(VH)和重链恒定区(CH1，CH2，CH3和/或CH4)。在本发明公开了具有能够特异性结合LILRB2的纳米抗体的结构前提下，本领域技术人员容易想到利用本发明的纳米抗体对传统抗体以改造，例如将本发明纳米抗体的CDR区结构应用到传统抗体上，以获得可以特异性结合LILRB2的传统抗体，这类传统体也是属于本发明的保护范围；进一步地，基于传统抗体的结构，其部分结构例如Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、scFv或sdFv结构等也是具有LILRB2结合特异性的，这也是属于本发明的保护范围。
第四方面，本发明提供了一种治疗疾病的组合物，其包括如上任一项所述的抗LILRB2的纳米抗体、如上所述的融合蛋白或如上所述的抗体，以及药学上可接受的辅料。
本发明所提供的药物组合物含有本发明实施例所述的抗体或抗原结合片段中的至少一种(例如，一种、两种、三种或四种)，本文所述的任何抗体或抗原结合片段中的两种或更多种(例如，两种、三种或四种)可以以任何组合存在于药物组合物中。可以以本领域已知的任何方式配制药物组合物。
药物组合物还可以含有药学可接受的载体。如本文使用的，“药学可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。药学可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等等中的一种或多种及其组合。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。药学可接受的载体可以进一步包含少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增加抗体的贮存期限或效力。
本发明所提供的药物的剂型并没有严格的限制，可根据药剂领域的现有方法制备成各种剂型，通过口服、鼻吸、直肠、肠胃外或经皮给药等方式施用于需要治疗的患者。
第五方面，本发明提供一种分离的核酸分子，其编码如上任一项所述的纳米抗体。
基于本发明公开的内容，本领域技术人员通过本领域常规技术容易获得编码上述纳米抗体以及融合蛋白的多核苷酸分子，并基于密码子的简并性，该多核酸分子是多变的，其具体的碱基序列存在多种可能性，基于此，无论其多核酸分子如何变化，只要其能够编码本发明的纳米抗体或融合蛋白即属于本发明的保护范围。
第六方面，本发明提供含有如上所述的核酸分子的载体。
第七方面，本发明提供含有如上所述的载体的重组细胞。
本发明实施例提供了包括本文公开的分离的多核苷酸(例如，编码本文公开的多肽的多核苷酸)的重组载体(例如表达载体)、引入了重组载体的宿主细胞(即，使得所述宿主细胞含有多核苷酸和/或含多核苷酸的载体)、以及通过重组技术产生重组抗体多肽或其片段。
如本文所用，“载体”是当载体被引入宿主细胞时能够将一个或多个目标多核苷酸递送至所述宿主细胞的任何构建体。“表达载体”能够在已引入表达载体的宿主细胞中递送和表达一个或多个目标多核苷酸作为编码的多肽。因此，在表达载体中，目标多核苷酸通过与调控元件诸如启动子、增强子和/或多聚腺苷酸尾可操作地连接而定位于载体中表达，所述调控元件位于载体内或宿主细胞的基因组中的目标多核苷酸的整合位点处或所述整合位点附近或所述整合位点两侧，使得目标多核苷酸将在引入了所述表达载体的宿主细胞中得以翻译。
可以通过本领域已知的方法，例如电穿孔、化学转染(例如DEAE-葡聚糖)、转化、转染以及感染和/或转导(例如用重组病毒)将载体引入到宿主细胞中。因此，载体的非限制性实施例包括病毒载体(可用于产生重组病毒)、裸DNA或RNA、质粒、粘粒、噬菌体载体以及与阳离子缩合剂相关的DNA或RNA表达载体。
本发明实施例提供了用上文描述的载体转化的宿主细胞。宿主细胞可以是原核或真核细胞。优选的原核宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)。优选地，真核细胞选自：原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。更优选地，宿主细胞是哺乳动物细胞，包括但不限于CHO和COS细胞。优选的真菌细胞是酿酒酵母。
第八方面，本发明提供制备如上任一项所述的纳米抗体的方法，其包括：培养如上所述的重组细胞，从培养产物中分离纯化获得所述纳米抗体。
需要说明的是，制备本发明的纳米抗体、融合蛋白和抗体可以通过化学合成的方法，也可以是通过基因工程技术实现，或者是其他的方法，无论以何种方法制备本发明前述的纳米抗体、融合蛋白或抗体，其都是属于本发明的保护范围。
第九方面，提供了本发明如上任一项所述的抗LILRB2纳米抗体、如上所述的融合蛋白、如上所述的抗体、如上所述的组合物、如上所述的核酸分子、如上所述的载体、或如上所述的重组细胞的用途，用于预防、治疗和/或改善实体瘤或血液瘤。
优选地，所述实体瘤为肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌、胰腺导管癌、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性髓性白血病(AML)、子宫内膜癌、肝细胞癌、黑素瘤、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、胶质瘤、胃癌、肾癌、睾丸癌、食管癌、宫颈癌、鳞茎肺癌、白血病、甲状腺癌、肝癌、尿路上癌症或头颈部癌症。
为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列源于两个或更多个物种的抗体。通常，轻链与重链两者的可变区均对应于抗体的源于一个哺乳动物物种(例如小鼠、大鼠、兔等)的具有所需特异性、亲和力和能力的可变区，而恒定区与抗体中源于另一物种(通常是人)的序列同源以避免在那个物种中引发免疫应答。
“纳米抗体”通常如在WO 2008/020079或WO 2009/138519中所定义，且在一个具体的方面通常表示VHH、人源化的VHH或骆驼源化的VH(诸如骆驼源化的人VH)，或通常表示序列优化的VHH(例如为了化学稳定性和/或溶解度、与已知人框架区的最大重叠和最大表达而优化)。“纳米抗体”用基因工程方法获得，主要有3类，第一类是从骆驼科动物HCAb获得的重链可变区，为单一的折叠单元，保留了完整的抗原结合活性，是最小的天然抗体片段。第二类是从鲨鱼等软骨鱼IgNAR获得的重链可变区，用VNAR表示。第三类是从人源或鼠源单抗获得的重链或轻链可变区，保留了抗原结合活性，但亲和性和可溶性大为下降。
“Fc区”或“Fc”是指免疫球蛋白重链的C端区，其含有铰链区的至少一部分、CH2结构域和CH3结构域，其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与位于免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)上的Fc受体结合或与经典补体系统的第一组分(例如C1q)结合，包括天然序列Fc区和变异Fc区。通常，人IgG重链Fc区为自其Cys226或Pro230位置的氨基酸残基至羧基末端的区段，但其边界可能有变化。Fc区的C-末端赖氨酸(残基447，依照EU编号系统)可以存在或可以不存在。Fc还可以指隔离的这一区域，或在包含Fc的蛋白多肽的情况下，例如“包含Fc区的结合蛋白”，还称为“Fc融合蛋白”(例如，抗体或免疫粘合素)。本发明的抗体中天然序列Fc区包括人IgG1，IgG2(IgG2A，IgG2B)，IgG3和IgG4。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc区包含抗体的两条重链的每一条的CH2和CH3恒定结构域；IgM和IgEFc区包含在每条多肽链中的三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。
“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。术语“免疫结合”是指发生在抗体分子和抗原(对于该抗原而言抗体为特异性的)之间的特异性结合反应。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以相互作用的平衡解离常数(KD)表示，其中KD值越小，表示亲和力越高。两分子间的的免疫结合性质可使用本领域中公知的方法定量。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。指特定抗体-抗原相互作用的“结合速率常数”(Ka或Kon)和“解离速率常数”(Kd或Koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出，可用任何有效的方法测量KD、Ka和Kd值。在优选的实施方案中，用生物发光干涉测量法来测量解离常数。在其它优选的实施方案中，可用表面等离子共振技术(例如Biacore)或KinExa来测量解离常数。
“载体”是指能够运输与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可以连接另外的DNA区段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点和游离型哺乳动物载体的细菌载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可以在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，并由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们有效连接的基因的表达。
“核酸分子”旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，并且可以是cDNA。
本发明取得了以下有益的技术效果：
本发明的抗LILRB2纳米抗体能高亲和力结合人LILRB2，并阻断LILRB2和其受体HLA-G的结合，从而对肿瘤具有潜在的治疗价值。
附图说明
图1显示了ELISA检测抗LILRB2嵌合抗体与重组人LILRB2蛋白的结合；
图2显示了FACS检测抗LILRB2嵌合抗体在human LILRB2/293细胞上的结合活性；
图3显示了FACS检测抗LILRB2嵌合抗体在cyno LILRB2/293细胞上的结合活性；
图4显示了ELISA检测LILRB2嵌合抗体对重组LILRB2结合HLA-G的阻断活性1；
图5显示了ELISA检测LILRB2嵌合抗体对重组LILRB2结合HLA-G的阻断活性2。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1：骆驼纳米抗体免疫噬菌体库构建
利用抗原免疫骆驼，分离外周血单核细胞(PBMC)并提取总RNA进行反转录，以反转录产物为模板扩增纳米抗体重链可变区(variable domain of the heavy-chain ofheavy chain antibody,VHH)并连入噬菌体展示载体，电转入大肠杆菌TG1感受态细胞，构建骆驼免疫库。
具体地，骆驼免疫两周一次，共4次。每次注射0.8mg人LILRB2胞外区重组蛋白，佐以弗氏完全/不完全佐剂(Sigma，F5881,F5506)，采取皮下多点注射的方式。每次免疫后2周采集1mL血分离血清，用免疫原作为测定抗原，通过ELISA法分别测定血清中全抗体(IgG)和重链抗体(heavy chain antibody，HcAb)的滴度。当血清滴度达到建库要求后，采集100mL骆驼外周血并用分离试剂盒(天津灏洋，Cat:TBD2011CM)分离PBMC，提取PBMC的总RNA反转获得cDNA，作为后续扩增VHH片段的模板。根据相关文献和数据库中检索到驼源VHH抗体的基因，设计并合成VHH抗体库构建引物，PCR扩增出抗体可变区基因序列。随后利用核酸内切酶对载体和扩增的抗体片段进行酶切。采用T4连接酶的连接方式构建连接产物，利用电转染技术将连接产物转入到TG1菌种之中。最终构建了一个1.8×108骆驼抗人LILRB2 VHH抗体免疫库，用于特异性抗人LILRB2纳米抗体的筛选。为检测文库的正确率，随机选取50个克隆进行菌落PCR，结果显示插入率达到90％。
利用Biotinylated-LILRB2(Acro,Cat.LI2-H82F5)为抗原，通过液相淘选的方法对所构建的骆驼免疫库进行筛选，获得特异性噬菌体展示纳米抗体。通过原始库呈现及筛选和鉴定获得了10株可同时结合人LILRB2的重组蛋白的噬菌体展示的纳米抗体：A3、A7、B9、C7、D5、D6、E1、E5、E8和G3。
实施例2：抗人LILRB2纳米抗体及对照抗体的制备
同靶点对照抗体JTX-8064(序列来源：CN111699196A，SEQ ID NO.53和54)进行可变区基因合成，其重、轻链可变区序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，将轻重链序列分别克隆至含有human kappa/IgG1轻重链恒定区的真核瞬时表达载体中，获得对照抗体轻链和重链表达质粒。将获得的对照抗体轻链和重链表达质粒，转入大肠杆菌扩增，分离获得大量含对照抗体轻链和重链的质粒，提取质粒并进行乙醇沉淀，并根据转染试剂293fectin(Cat:12347019，Gibco)的操作说明，分别将对照抗体的轻、重链质粒转入HEK293细胞中重组表达。细胞转染后5-6天，取培养上清，利用ProA亲和层析柱对表达上清进行纯化，获得对照抗体。
根据噬菌体展示的纳米抗体测序结果，设计引物，通过PCR方法克隆至含有人Fc(hFc)编码基因的真核瞬时表达载体中，并在HEK293细胞中重组表达。细胞转染5-6天后，取培养上清，利用ProA亲和层析柱对表达上清进行纯化，获得chA3、chA7、chB9、chC7、chD5、chD6、chE1、chE5、chE8和chG3重组蛋白。chA3可变区序列见SEQ ID NO.3，chA7可变区序列见SEQ ID NO.4，chB9可变区序列见SEQ ID NO.5，chC7可变区序列见SEQ ID NO.6，chD5可变区序列见SEQ ID NO.7，chD6可变区序列见SEQ ID NO.8，chE1可变区序列见SEQ IDNO.9，chE5可变区序列见SEQ ID NO.10，chE8可变区序列见SEQ ID NO.11，chG3可变区序列见SEQ ID NO.12，其中以下划线示出了相应的CDR(根据Kabat CDR的定义)，恒定区序列见SEQ ID NO.13。
SEQ.ID NO.1:JTX-8064重链可变区氨基酸序列
QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLNTYAMGVSWIRQPPGKALEWLASIWWNGNKYNNPSLKSRLTVTKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAHSRIIRFTDYVMDAWGQGTLVTVSS
SEQ.ID NO.2:JTX-8064轻链可变区氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSTSVGDRVTITCRASEDIYNDLAWYQQKPGKAPKLLIYNANSLHTGVASRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDVATYFCQQYYDYPLTFGQGTKLEIK
SEQ.ID NO.3:chA3 VHH氨基酸序列
QVQLQESGGGLVQAGGSLTLSCAVSGISFGTRAMAWFRQAPGKEREGVASIQADTYISYADSVKGRFTISKDSGKNTLNLQMNNLKPEDTAVYYCAVGDLWGSHLQPHGYNYWGQGTQVTVSS
chA3抗原互补决定区CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：14、15和16。
SEQ.ID NO.4:chA7 VHH氨基酸序列
QVQLQESGGGSVQPGGRLRLSCETSGYTSSRNWMGWFRQAPGKEREGVASIYTDNGSAYYADSVKGRFTISVDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAGRIRPPAGTRWPGPLVESAYNTWGRGTQVTVSS
chA7抗原互补决定区CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：17、18和19。
SEQ.ID NO.5:chB9 VHH氨基酸序列
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTDSRYCMGWFRQVPGKEREKVATIYNGDGNTYYDDSVKGRFTISQGNAKNTLFLEMNNLKPEDTAMYYCAAIKAYGSNWCPAVEYSDWGQGTQVTVSS
chB9抗原互补决定区CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：20、21和22。
SEQ.ID NO.6:chC7 VHH氨基酸序列
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASEYTDSRYCMAWFRQVPGKEREKVAIIYNGDGNTYYDDSVKGRFTISQSVAKNTLYLQMNNLKPEDTGMYYCAAIKAYGSNWCRAVEYSDWGQGTQVTVSS
chC7抗原互补决定区CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：23、21和24
SEQ.ID NO.7:chD5 VHH氨基酸序列
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCVASGYPRSSVCMGWYRQAPGKEREGVAAIFTGGGTPYYGDSVKGRFTISQDNAVNTVSLQMNDLKPEDTAMYYCAAELTYCSGGPWTDPVGYWGQGTQVTVSS
chD5抗原互补决定区CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：25、26和27。
SEQ.ID NO.8:chD6 VHH氨基酸序列
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTGSGYCMGWFRQVPGKEREKVATIYNGYPGDGDPSYDDSVKGRFTISQDTAKNTVYLQMNDLKPEDTAMYYCAAINAYGSNWCQIVEYAHWGVGTQVTVSS
chD6抗原互补决定区CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：28、29和30。
SEQ.ID NO.9:chE1 VHH氨基酸序列
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCVGSGFTFRHYAMNWARQAPGKGIEWVASIGTPGLPEAYADSVKGRFTISRDDAKNTLYLQMDNLKTEDTGVYYCARSSDCGGGTCRPPGQGTQVTVSS
chE1抗原互补决定区CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：31、32和33。
SEQ.ID NO.10:chE5 VHH氨基酸序列
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCVASGYPRSSVCMGWYRQAPGKEREGVAAIFTGGGTPYYGDSVKGRFTISQDNAVNTVSLQMNDLKPEDTAMYYCAVELTYCSGGPWTDPVGYWGQGTQVTVSS
chE5抗原互补决定区CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：25、26和27。
SEQ.ID NO.11:chE8 VHH氨基酸序列
QVQLQESGGGLVQPGGSLNLSCAASGFTFSNSFMTWVRQAPGKRPEWVREWVAGISGDGQYTSYADFAK GRFTISRDNAKSTMYLQLNNLKTEDTAIYYCEKSSTERGQGTQVTVSS
chE8抗原互补决定区CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：34、35和36。
SEQ.ID NO.12:chG3 VHH氨基酸序列
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYPRSSVCMGWYRQAPGKEREGVAAIFTGGGRPYYADSVKGRFTISQDNAVNTVSLQMNNLKPEDTAMYYCAAELTYCSGGPWTDPVGYWGQGTQVTVSS
chG3抗原互补决定区CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：25、37和27。
SEQ.ID NO.13:hFc恒定区氨基酸序列
ASEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
实施例3：嵌合抗体亲和力检测
利用Fortebio公司的Octet QKe system仪器，采用抗人抗体Fc段的捕获抗体(AHC)生物探针捕获抗体Fc段的方法测定抗体亲和力。测定时将chA3、chA7、chB9、chC7、chD5、chD6、chE1、chE5、chE8和chG3嵌合抗体及对照抗体JTX-8064，用PBS缓冲液稀释至4ug/ml，流经AHC探针(Cat:18-0015，PALL)表面，时间为120s。LILRB2重组蛋白(购于ACRO，Cat#LI2-H5220)60nm；作为流动相，结合时间为300s，解离时间为300s。实验完毕，扣除空白对照响应值，用软件进行1：1Langmuir结合模式拟合，计算抗原抗体结合的动力学常数。
动力学参数如下表1所示，结果表明这10株嵌合抗体均与LILRB2重组蛋白结合，结合活性与对照抗体相当。
表1.嵌合抗体与LILRB2重组蛋白的亲和力测定结果
样本 KD(M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
JTX-8064 4.93E-09 4.28E+05 2.11E-03
chA3 1.43E-10 3.47E+05 4.95E-05
chA7 6.03E-09 4.38E+05 2.64E-03
chB9 <1.0E-12 4.24E+05 <1.0E-07
chC7 <1.0E-12 3.88E+05 <1.0E-07
chD5 <1.0E-12 3.98E+05 <1.0E-07
chD6 4.11E-10 387000 0.000159
chE1 3.66E-09 1.62E+05 5.93E-04
chE5 1.65E-10 3.41E+05 5.61E-05
chE8 6.36E-09 3.96E+05 2.52E-03
chG3 4.40E-10 2.95E+05 1.30E-04
实施例4：ELISA检测抗LILRB2嵌合抗体的结合活性
将人LILRB2重组蛋白(KN表达)，4℃包被过夜，包被浓度1ug/mL；PBS洗板3次后，加入5％BSA PBS，37℃封闭60min，PBST洗板3次；加入10ug/ml的chA3、chA7、chB9、chC7、chD5、chD6、chE1、chE5、chE8和chG3嵌合抗体及对照抗体JTX-8064，37℃孵育60min，PBST洗板4次；加入1:5000稀释的HRP-anti-human Fc(Cat：109-035-098，Jackson ImmunoResearch)，37℃孵育45min，PBST洗板4次；加入TMB底物显色，37℃孵育10min后，加入2MHCl终止反应；以630nm为参比波长，读取并记录波长450nm下孔板的吸光度A450nm-630nm。
实验结果表明chA3、chA7、chB9、chC7、chD5、chD6、chE1、chE5、chE8和chG3嵌合抗体及对照抗体JTX-8064均可以特异性的与人LILRB2重组蛋白结合(图1)。
实施例5：FACS检测抗LILRB2嵌合抗体与重组表达人LILRB2的293细胞(humanLILRB2/293)的结合活性
利用瞬转human LILRB2的293细胞(human LILRB2/293)，检测嵌合抗体与人LILRB2结合情况，取2E5细胞分别与不同浓度的抗LILRB2抗体结合，chA3、chA7、chB9、chC7、chD5、chD6、chE1、chE5、chE8和chG3嵌合抗体及对照抗体JTX-8064，从132nm开始4倍梯度稀释3个梯度。4℃避光孵育60min，充分PBS洗涤后，加入1:200稀释的FITC标记的羊抗人抗体(sigma,F9512),4℃避光孵育30min后充分PBS洗涤，重悬于200ul的PBS中，流式细胞仪检测。
结果显示(图2)，chA3、chA7、chB9、chC7、chD5、chD6、chE1、chE5、chE8和chG3嵌合抗体及对照抗体JTX-8064具有相当的结合能力。
实施例6：FACS检测抗LILRB2嵌合抗体与重组表达食蟹猴LILRB2的293细胞(cynoLILRB2/293)的结合活性
利用瞬转食蟹猴LILRB2的293细胞(cyno LILRB2/293)，检测嵌合抗体与食蟹猴LILRB2结合情况，取2E5细胞分别与不同浓度的抗LILRB2抗体结合，chA3、chA7、chB9、chC7、chD5、chD6、chE1、chE5、chE8和chG3嵌合抗体及对照抗体JTX-8064，从132nM开始4倍梯度稀释4个梯度。4℃避光孵育60min，充分PBS洗涤后，加入1:200稀释的FITC标记的羊抗人抗体(sigma,F9512),4℃避光孵育30min后充分PBS洗涤，重悬于200ul的PBS中，流式细胞仪检测。
结果显示(图3)，chE1与食蟹猴LILRB2具有较强结合活性，与对照抗体JTX-8064相当。
实施例7：ELISA检测抗LILRB2嵌合抗体对重组LILRB2结合HLA-G的阻断活性
将人HLA-G胞外区重组蛋白(Kactus，Cat.HLG-HE41F)，用PBS稀释至1ug/mL，100ul/孔，包被酶联板，4℃包被过夜；5％BSA封闭液37℃恒温培养箱封闭120min，PBST洗板3次；取100uL chA3、chA7、chB9、chC7、chD5、chD6、chE1、chE5、chE8和chG3嵌合抗体及对照抗体JTX-8064待测样本(66nM起始，3倍梯度稀释12个梯度)，加入100ul 0.4ug/ml的LILRB2-mFc(NCBI号：AAH36827，22-461氨基酸)，混匀后，37℃反应30min，取100uL加入HLA-G包被孔；37℃恒温培养箱60min PBST洗板4次；加入1:5000稀释的HRP-anti-mouse IgG(Cat：115-035-071，Jackson Immuno Research)反应45min，PBST洗板4次；最后加入TMB底物显色，37℃恒温培养箱反应15min，2M HCl终止反应，读取并记录波长450nm下孔板的吸光度。结果显示(图4，图5，表2)，除chA7和chE1无阻断活性，chE8具有部分阻断活性，其余嵌合抗体均具有明确的阻断活性，且阻断活性与对照抗体相当。
表2.ELISA检测LILRB2嵌合抗体对重组LILRB2结合HLA-G的阻断活性IC50
JTX-8064 chE1 chE5 chE8 chG3 chC7
IC50(nM) 0.860 不阻断 0.604 1.193 0.593 0.834
JTX-8064 chA3 chA7 chB9 chD5 chD6
IC50(nM) 1.001 0.928 不阻断 1.039 0.537 0.952
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种抗LILRB2的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体能够特异性结合LILRB2，且所述纳米抗体中的VHH链的互补决定区CDR为选自下组的一种或多种：
(1)SEQ ID NO：25所示的CDR1，SEQ ID NO：26所示的CDR2，和SEQ ID NO：27所示的CDR3；
(2)SEQ ID NO：31所示的CDR1，SEQ ID NO：32所示的CDR2，和SEQ ID NO：33所示的CDR3；
(3)SEQ ID NO：34所示的CDR1，SEQ ID NO：35所示的CDR2，和SEQ ID NO：36所示的CDR3；
(4)SEQ ID NO：25所示的CDR1，SEQ ID NO：37所示的CDR2，和SEQ ID NO：27所示的CDR3。
2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体是人源化的VHH或骆驼源化的VHH。
3.根据权利要求1或2所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体具有如SEQ ID NO：7、9、10、11、12任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：7、9、10、11、12任一项所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
4.一种融合蛋白，其特征在于，其包括能够特异性结合LILRB2的功能结构域，所述功能结构域由权利要求1-3任一项所述的抗LILRB2的纳米抗体构成。
5.一种药物组合物，其特征在于，其包括权利要求1-3任一项所述的抗LILRB2的纳米抗体或权利要求4所述的融合蛋白，以及药学上可接受的辅料。
6.一种分离的核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1-3任一项所述的抗LILRB2的纳米抗体或编码权利要求4所述的融合蛋白。
7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求6所述的核酸分子。
8.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求7所述的表达载体。
9.制备权利要求1-3任一项所述的纳米抗体的方法，其特征在于，其包括：培养权利要求8所述的重组细胞，从培养产物中分离纯化获得所述纳米抗体。
10.权利要求1-3任一项所述的抗LILRB2的纳米抗体、权利要求4所述的融合蛋白、权利要求5所述的组合物、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体、或权利要求8所述的重组细胞在制备药物中的用途，所述药物用于预防、治疗和/或改善实体瘤或血液瘤。
11.根据权利要求10所述的用途，所述实体瘤为肺癌、胰腺癌、子宫内膜癌、黑素瘤、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、胶质瘤、胃癌、肾癌、睾丸癌、食管癌、宫颈癌、甲状腺癌或肝癌；所述血液瘤为慢性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病。
12.根据权利要求10所述的用途，所述实体瘤为非小细胞肺癌、胰腺导管癌、肝细胞癌、尿路上癌症或头颈部癌症。
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