JPWO2003093317A1 - ヒトインスリン様成長因子に対する抗体 - Google Patents

Abstract

ｈＩＧＦが関与する癌などの疾患の効果的な治療のために、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの両因子と強く結合し、それらの機能を阻害する抗体およびそれらの抗体断片が求められている。本発明は、ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有し、かつ、バイオセンサービアコアで測定される結合定数が５×１０９Ｍ−１以上の結合活性を有する抗体を提供する。さらに、該抗体を用いるｈＩＧＦ介在性疾患および異常なｈＩＧＦの産生亢進により病態が進行する疾患の診断薬、予防薬および治療薬を提供する。

Description

技術分野
本発明は、インスリン様成長因子（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；以下、ＩＧＦと表記する）に対する抗体およびそれら抗体に由来する抗体断片に関する。本発明はさらに、該抗体および抗体断片をコードするＤＮＡに関する。本発明は、該ＤＮＡを含んでなる組換えベクター、および該組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体に関する。本発明はさらに、該形質転換体を用いた該抗体および抗体断片の製造方法、ならびに該抗体および抗体断片の診断、予防および治療上の用途に関する。
背景技術
ＩＧＦは、乳房、前立腺、肺、結腸などの器官の上皮系細胞の増殖、分化、細胞死（アポトーシス）の制御において非常に重要な役割を果たしている因子であり、その作用は、細胞表面に存在するＩＧＦ受容体（ＩＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；以下、ＩＧＦ−Ｒと表記する）を介して行われている（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１６，３−３４，１９９５）。また、ＩＧＦ結合蛋白質（ＩＧＦ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ；以下、ＩＧＦＢＰと表記する）と呼ばれる蛋白質が存在し、ＩＧＦの作用を促進的あるいは抑制的に制御していることが知られている（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１６，３−３４，１９９５）。
ＩＧＦには、ＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩの２種類が存在し、いずれも一本鎖のポリペプチドからなっており、インスリンの前駆体であるプロインスリンとアミノ酸レベルで約４０％の相同性を有している（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６８，１８３−２２３，１９９６）。ＩＧＦ−Ｒには、インスリン受容体、ＩＧＦ−Ｉ受容体（以下、ＩＧＦ−ＩＲと表記する）、ＩＧＦ−ＩＩ受容体（以下、ＩＧＦ−ＩＩＲと表記する）の３種類が存在する。インスリン受容体とＩＧＦ−ＩＲは、いずれもチロシンキナーゼ型受容体ファミリーに属しており、一本鎖の前駆体から蛋白質分解酵素による切断の結果生じる１３５ｋＤａのαサブユニットと９５ｋＤａのβサブユニットがＳ−Ｓ結合を形成し、さらにα_２β_２のヘテロ４量体の構造をとり、細胞膜上に存在している（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１６，１４３−１６３，１９９５、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，４７，２３５−２５３，１９９８）。インスリン受容体とＩＧＦ−ＩＲは、約６０％の相同性を有しており、インスリンとＩＧＦ−ＩＲ、ＩＧＦとインスリン受容体も弱いながらも結合し、作用する（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６３，１１４８６−１１４９２，１９８８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８，７３９３−７４００，１９９３）。インスリン受容体のαβサブユニットとＩＧＦ−ＩＲのαβサブユニットからなるハイブリッド受容体の存在も確認されており、ハイブリッド受容体は、インスリンよりもＩＧＦ−Ｉに対する結合親和性が高く、ＩＧＦ−ＩＲとして機能していると考えられているが、生体内での役割は不明である（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１６，３−３４，１９９５、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１６，１４３−１６３，１９９５）。ＩＧＦ−ＩＩＲは、単鎖構造をしており、細胞外領域には、３箇所のリガンド結合領域が存在する。リガンド結合領域の１箇所は、ＩＧＦ−ＩＩ結合領域であり、他の２箇所は、マンノース−６−リン酸を含む蛋白質［レニン、プロリフェリン、サイログロブリン、潜在型トランスフォーミング増殖因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β；ＴＧＦ−β）など］と結合する領域である（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１６，３−３４，１９９５）。潜在型ＴＧＦ−βは、ＩＧＦ−ＩＩＲへの結合により活性化されることが報告されている（Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，５２，１７５−１８４，１９９８、Ｈｏｒｍｏｎｅ ＆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３１，２４２−２４６，１９９９）。ＩＧＦ−ＩＩＲは、チロシンキナーゼ活性を有しておらず、ＩＧＦのうち、ＩＧＦ−ＩＩのみと結合する。ＩＧＦ−ＩＩは、ＩＧＦ−ＩＩＲへの結合により分解されることから、ＩＧＦ−ＩＩＲは、ＩＧＦ−ＩＩのアンタゴニストとして機能していると考えられている（Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，５２，１７５−１８４，１９９８）。
ＩＧＦＢＰは、これまでに１０種類（ＩＧＦＢＰ−１からＩＧＦＢＰ−１０）が知られているが、そのうち６種類（ＩＧＦＢＰ−１からＩＧＦＢＰ−６）がＩＧＦに対して高い結合親和性を有している（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，９４，１２９８１−１２９８６，１９９７）。ＩＧＦＢＰ−１からＩＧＦＢＰ−６は、アミノ酸レベルで４０〜６０％の高い相同性を有している。ＩＧＦＢＰは、分解やリン酸化などの様々な翻訳後修飾を受け、ＩＧＦの運搬、分解の抑制、受容体への結合に影響を与え、ＩＧＦの機能を調節していることが明らかとなっている（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２８，６１９−６３７，１９９６、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１８，８０１−８３１，１９９７）。ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−５は、ＩＧＦの作用を促進する場合と抑制する場合があり、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−５のＩＧＦに対する作用はＩＧＦＢＰの分解によって、ＩＧＦＢＰ−１の作用はＩＧＦＢＰ−１のリン酸化によって、それぞれ制御されている（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１６，３−３４，１９９５、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２８，６１９−６３７，１９９６、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｃｌｉｎｉｃｓ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ，２５，５９１−６１４，１９９６）。また、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−５は、細胞膜上に存在するの特異的な受容体に結合すると、ＩＧＦとの結合親和性が低下する。その結果、ＩＧＦＢＰとＩＧＦとが解離し、遊離のＩＧＦが生じる（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１６，３−３４，１９９５、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２８，６１９−６３７，１９９６、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｃｌｉｎｉｃｓ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ，２５，５９１−６１４，１９９６）。一方、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−６は、ＩＧＦの作用を抑制する活性を有している（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１６，３−３４，１９９５、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｃｌｉｎｉｃｓ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ，２５，５９１−６１４，１９９６）。生体内では、血中ＩＧＦの９０％以上は、ＩＧＦＢＰ−３および酸不安定サブユニットと結合し、約１５０ｋＤａの高分子量複合体の形で存在しており、ＩＧＦの分解と血管外への流出が抑制されている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６４，１１８４３−１１８４８，１９８９）。
ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩは、ともに多数の癌細胞（肉腫、白血病、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸癌、胃癌、食道癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、甲状腺癌、脳腫瘍、卵巣癌、子宮癌）に対して強い増殖促進作用を示し（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，６５，３１１−３２０，１９９２、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１，１５９１−１５９５，１９９１、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１２２，５４−５９，１９９５、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，５４，５０２−５０７，１９９７、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３７，１７６４−１７７４，１９９６、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，６２，１９１−１９８，１９９９）、多くの癌細胞においてＩＧＦの過剰発現が確認されている（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，６５，３１１−３２０，１９９２）。また、高転移性癌細胞では、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＲの発現が低転移性癌細胞よりも高いことが報告されている（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，６５，８１２−８２０，１９９６）。このようなＩＧＦの作用は、主としてＩＧＦ−ＩＲを介しているが（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３６，４２９８−４３０３，１９９５、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２８，６０７１−６０７７，１９９９）、乳癌細胞では、ＩＧＦ−ＩＩがインスリン受容体を介して作用することも明らかにされている（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１８，２４７１−２４７９，１９９９）。
前立腺上皮細胞でＩＧＦ−Ｉを過剰発現するトランスジェニックマウスは、約６ヶ月で約５０％が前立腺癌を発症することが報告されている（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，９７，３４５５−３４６０，２０００）。また、マウスでのヒト前立腺癌細胞移植モデルにおいて、アンドロゲン非依存性増殖能の獲得に伴い、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＲの発現が上昇することが示されている（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６１，６２７６−６２８０，２００１）。
ＩＧＦは、また、他の因子と相互作用し、癌細胞の増殖に関与している。乳癌細胞では、エストロゲンにより、ＩＧＦ−Ｉの作用が増強され、かつ、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＲの発現が誘導されることが報告されている（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３６，１２９６−１３０２，１９９５、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６５，２１１７２−２１１７８，１９９０、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１，５３７−５４０，１９９２、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，７５，２５１−２５７，１９９７）。また、エストロゲンは、乳癌細胞におけるＩＧＦＢＰの産生を抑制すること、ＩＧＦ−ＩＩＲの発現を減少させること、ＩＧＦＢＰ分解酵素の発現を増加させることが知られている（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１９３，４６７−４７３，１９９３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，５，８１５−８２２，１９９１）。
逆に、ＩＧＦ−Ｉがエストロゲン受容体の発現を増強させること（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２７，２６７９−２６８６，１９９０、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５２，１９６−２０５，１９９３）、乳癌細胞において、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩがエストロンスルフェイトをエストロンに加水分解するエストロンスルファターゼ活性を増加させることも報告されている（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４，１７５−１７８，１９９９）。
さらに、ＩＧＦは上皮細胞増殖因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；以下、ＥＧＦと表記する）と協調的に作用する。頚癌細胞では、ＥＧＦは、ＩＧＦ−ＩＩの発現を増加させ、さらに、ＩＧＦは、ＥＧＦの増殖促進作用を増強させる（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，９２，１１９７０−１１９７４，１９９５、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５６，１７６１−１７６５，１９９６）。ＥＧＦはＩＧＦＢＰ−３の発現を抑制することで遊離のＩＧＦ量を増加させ、増殖促進作用を増強することも知られている（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５４，３１６０−３１６６，１９９４）。
いくつかの抗細胞増殖活性を有する因子の作用が、ＩＧＦの増殖促進作用を抑制することにより、発揮されていることが知られている。ＴＧＦ−βやレチノイン酸による乳癌細胞の増殖抑制作用は、ＩＧＦＢＰ−３の発現誘導の結果、ＩＧＦの作用が抑制されることによって発揮される（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７０，１３５８９−１３５９２，１９９５、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５６，１５４５−１５５０，１９９６、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３６，１２１９−１２２６，１９９５）。また、ビタミンＤおよびその合成誘導体は、ＩＧＦの乳癌細胞や前立腺癌細胞に対する増殖促進作用を抑制するが、その作用はＩＧＦＢＰの発現上昇およびＩＧＦ−ＩＲ、ＩＧＦ−ＩＩの発現抑制に基づいている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，８９，６５２−６５６，１９９７、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２０，１５７−１６２，１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１５４，４９５−５０４，１９９７、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１３，１３７−１４３，１９９８）。
腫瘍抑制遺伝子産物もＩＧＦの作用に影響を与えることが報告されている。例えば、肉腫細胞などでは、野生型ｐ５３蛋白質はＩＧＦＢＰ−３の発現を誘導する一方、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＲの発現を抑制する（Ｎａｔｕｒｅ，３７７，６４６−６４９，１９９５、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５６，１３６７−１３７３，１９９６、ＤＮＡ ＆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７，１２５−１３１，１９９８、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，９３，８３１８−８３２３，１９９６、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３９，１１０１−１１０７，１９９８）。逆に、乳癌細胞では、ＩＧＦ−Ｉの作用によりｐ５３蛋白質がリン酸化されて、核から細胞質へ移行することにより、ｐ５３蛋白質の機能が損なわれることが知られている（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，５５，４５３−４５８，１９９３）。その他、ウィルムス腫瘍抑制遺伝子産物ＷＴ１により、ＩＧＦ−ＩＲの発現が抑制されること（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６９，１２５７７−１２５８２，１９９４、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４０，４７１３−４７２４，１９９９）、ＩＧＦ−Ｉにより、乳腺由来増殖阻害因子（ｍａｍｍａｒｙ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；ＭＤＧＩ）の発現が抑制されること（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１３，５７７−５８２，１９９８）が報告されている。
エネルギー摂取などのライフスタイルと発癌との関係は、古くから注目されてきたが、種々の動物実験から、エネルギー摂取とＩＧＦの発現、さらに発癌が密接な関係を有していることが明らかにされつつある。前立腺癌を移植されたラットでは、エネルギー摂取を制限すると癌の増殖が抑制され、さらにアポトーシスが誘導される。この効果は、血中ＩＧＦ−Ｉ濃度の減少と相関している（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，９１，５１２−５２３，１９９９）。同様の結果は、乳癌移植マウスでも報告され、さらに、ＩＧＦ−Ｉの投与により増殖抑制作用が認められなくなることからも、エネルギー摂取の制限による癌の増殖抑制においては、ＩＧＦ−Ｉが主要な役割を果たしていることが示唆されている（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５７，４６６７−４６７２，１９９７）。
ＩＧＦと癌との関連性は、臨床的および疫学的な研究からも検討されている。乳癌患者では、血漿および血清中のＩＧＦ−Ｉ濃度が健常者に比べて高いこと（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，２９Ａ，４９２−４９７，１９９３、Ｔｕｍｏｒｉ，８０，２１２−２１５，１９９４）、乳癌組織では、正常組織に比べて、ＩＧＦ−ＩＲの量が１０倍高いこと（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３，３７３６−３７４０，１９９３）が報告されている。また、乳癌患者の約３０％では、ＩＧＦ−ＩＩＲ遺伝子にヘテロ接合性の消失（Ｌｏｓｓ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ）が認められ、ＩＧＦ−ＩＩＲ遺伝子は癌抑制遺伝子としての機能が示唆されている（Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，４７，２６９−２８１，１９９８）。結腸癌患者では、血清中のＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３の濃度が健常者に比べて高いことが報告されている（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，５７，４９１−４９７，１９９４）。また、結腸癌に進行することが知られている結腸腺腫の患者は、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦＢＰ−２の血清中濃度が高いが、腺腫の切除により、それらの濃度が低下することが示されている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，８５，３４０２−３４０８，２０００）。胃癌組織では、ＩＧＦ−ＩＩの過剰発現が報告されている（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，３７，２２５７−２２６３，２００１）。閉経後の子宮内膜癌患者では、健常者に比べて血清中のＩＧＦ−Ｉ濃度が高く、ＩＧＦＢＰ−１濃度が低い。一方、ＩＧＦＢＰ−３濃度には差は認められなかったことが報告されている（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｊｏｕｒｎａｌ，４４，４１９−４２４，１９９７）。前立腺癌患者では、血清中のＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦＢＰ−２濃度が高く、ＩＧＦＢＰ−３濃度が低いこと（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，７６，１１１５−１１１８，１９９７、Ｕｒｏｌｏｇｙ，５４，６０３−６０６，１９９９、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，７６，１０３１−１０３５，１９９３、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，７７，２２９−２３３，１９９３）、癌組織においては、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５の産生が亢進しており、ＩＧＦＢＰ−３の産生が抑制されていること（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，８１，３７７４−３７８２，１９９６、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，８１，４１１−４２０，１９９６、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，８１，３７８３−３７９２，１９９６）が報告されている。ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦＢＰ発現の同様の変化は、卵巣癌患者の血清および癌組織においても観察されている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，７８，２７１−２７６，１９９４、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，８２，２３０８−２３１３，１９９７、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，７３，１０６９−１０７３，１９９６）。
いくつかの疫学的研究から、ＩＧＦおよびＩＧＦＢＰと癌の罹患危険率に関連性があることが明らかとなっている。乳癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、肺癌などの固形癌においては、罹患危険率の高さと血中のＩＧＦ−Ｉ濃度の高さおよびＩＧＦＢＰ−３濃度の低さが正の相関を示すこと、小児性白血病では、罹患危険率の高さとＩＧＦＢＰ−３濃度の低さが正の相関を示すこと、さらに、乳癌では、罹患危険率の高さとＩＧＦ−ＩとＩＧＦＢＰ−３の濃度比（ＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３）の高さが正の相関を示すことが報告されている（Ｌａｎｃｅｔ，３５１，１３９３−１３９６，１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６，５６３−５６６，１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，９１，６２０−６２５，１９９９、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，９１，１５１−１５６，１９９９、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，６２，２６６−２７０，１９９５、Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，９，５７０−５７３，１９９８、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，４７，１１１−１２０，１９９８、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，８３，１５−１７，１９９９、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，８０，４９４−４９６，１９９９、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，７６，１１１５−１１１８，１９９７）。
ＩＧＦと癌の予後の関連性についても、報告がある。乳癌では、エストロゲン受容体あるいはプロゲステロン受容体が陽性の組織においてＩＧＦ−ＩＲの発現が増加していることが報告されている（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５２，１０３６−１０３９，１９９２）。また、ＩＧＦ−ＩＲの発現により、予後が不良となることを報告している例もある（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５７，３０７９−３０８３，１９９７、Ｃａｎｃｅｒ，５８，１１５９−１１６４，１９９８）。組織内のエストロゲン受容体発現とＩＧＦＢＰ−３発現が逆相関することも報告されている（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５２，５１００−５１０３，１９９２、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５２，１９６−２０５，１９９３）。
また、糖尿病性網膜症や糖尿病性腎症などのような、糖尿病性合併症においては、ＩＧＦ作用の異常亢進が認められている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６，１７０６−１７０９，１９９７、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２７４，Ｆ１０４５−Ｆ１０５３，１９９８）。
さらに、リウマチ滑膜においてＩＧＦ−Ｉの局所的発現が認められること、リウマチ性関節炎の病態形成にＩＧＦ−Ｉが関与していることも報告されている（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，３２，６６−７１，１９８９、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，２２，２７５−２８１，１９９５、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，８１，１５０−１５５，１９９６、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，３９，１５５６−１５６５，１９９６）。
以上のようにＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩを含めたＩＧＦファミリー蛋白質（ＩＧＦ、ＩＧＦ−Ｒ、ＩＧＦＢＰ）は、癌の発生、増殖、さらには、糖尿病性合併症やリウマチ性関節炎などにおいても重要な役割を果たしている。これらの事実は、ＩＧＦファミリー蛋白質を標的とした癌、糖尿病性合併症、リウマチ性関節炎などの診断、予防、治療の可能性を示唆している。
実際、ＩＧＦ−ＩＲに対するアンチセンスＲＮＡを発現させることで、高転移性のヒト乳癌細胞のマウスでの造腫瘍性および転移性が低下し、生存期間の延長が認められること（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，７，３８４−３９５，２０００）、抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体により、マウスに移植されたヒト横紋筋肉腫細胞やヒト乳癌細胞の増殖が抑制されること（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５４，５５３１−５５３４，１９９４、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，８４，１４１８−１４２３，１９８９、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，２２，１０１−１０６，１９９２）、などＩＧＦ作用を抑制することによる抗腫瘍効果が報告されている（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１３３２，Ｆ１０５−Ｆ１２６，１９９７）。その一方で、抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体では、マウスに移植されたエストロゲン非依存性増殖を示すヒト乳癌細胞の生着は抑制するものの、エストロゲン依存性増殖を示すヒト乳癌細胞の生着や生着したヒト乳癌細胞の増殖は抑制されないことが示されており、ＩＧＦ−ＩＲの作用阻害のみでは、充分な抗腫瘍効果が得られないことも示唆されている（Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，２２，１０１−１０６，１９９２）。
ＩＧＦに対する抗体（以下、抗ｈＩＧＦ抗体と表記する）としては、既にいくつかの抗体が知られている。代表的なヒトＩＧＦ−Ｉに対する抗体（以下、抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体と表記する）としては、ｓｍ１．２が報告されている（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，８１，２３８９−２３９２，１９８４）。ｓｍ１．２は、ｈＩＧＦ−ＩＩと４０％程度の交差反応性を有していること、１〜２μｇ／ｍＬの濃度でウェスタンブロッティング法により、１００ｎｇのｈＩＧＦ−Ｉを検出可能であること、１０〜３０μｇ／ｍＬの濃度で２０ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−Ｉによるマウス繊維芽細胞株ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３の増殖を阻害することが明らかとなっている（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，８１，２３８９−２３９２，１９８４、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，９９，２９６１−２９７０，１９９７）。
その他、抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体としては、Ｖａｌ^５９−ＳｍＣ１２１があり、該抗体は、ヒトインスリンおよびｈＩＧＦ−ＩＩとは反応しないこと、ｈＩＧＦ−Ｉの１０〜１２番目のＬｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐを含むペプチドを認識すること、^１２５Ｉ−ｈＩＧＦ−Ｉを用いたラジオイムノアッセイでは、１ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−Ｉの検出感度を示したことが報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２５，３２７−３３５，１９９０）。
抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体４１／８１は、ｈＩＧＦ−ＩＩとは３％の交差反応性を有しており、また、^１２５Ｉ−ｈＩＧＦ−Ｉを用いたラジオイムノアッセイでは、１ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−Ｉの検出感度を示した（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１４９，１０９−１１２，１９８２）。
抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体３５Ｉ１７は、ｈＩＧＦ−ＩＩと０．５％程度の交差反応性を有していること、１μｇ／ｍＬの濃度でウェスタンブロッティング法により、１μｇのｈＩＧＦ−Ｉを検出可能であること、１２μｇ／ｍＬ以上の濃度でｈＩＧＦ−Ｉによるマウス繊維芽細胞株ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３の増殖を完全に阻害すること、３０μｇ／ｍＬの濃度で１μｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−ＩによるｈＩＧＦ−ＩＲの自己リン酸化を阻害すること、また、^１２５Ｉ−ｈＩＧＦ−Ｉを用いたラジオイムノアッセイでは、０．１ｎＭのｈＩＧＦ−Ｉの検出感度を示すことが報告されている（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１６，５１３−５１８，１９９７）。
抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体ＢＰＬ−Ｍ２３は、ｈＩＧＦ−Ｉに対して１０．５×１０^９Ｍ^−１の結合活性を示し、一方、ｈＩＧＦ−ＩＩおよびヒトインスリンには、それぞれ０．８％および０．０００１％の交差反応性を示すこと、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウサギのＩＧＦとは反応性を示すが、ラットおよびマウスのＩＧＦとは反応しないこと、ラット脂肪細胞に対するｈＩＧＦ−Ｉによる脂肪形成を抑制することが報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２，２０１−２０６，１９８９）。
抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体７Ａ１、１Ｂ３、４Ｃ１、５Ａ７は、ｈＩＧＦ−ＩのＣおよびＤドメインの異なるエピトープを認識すること、ｈＩＧＦ−ＩＩとはそれぞれ６．６％、０．８３％、１２％、１．２％の交差反応性を示すことが報告されている（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１２，７３７−７４４，１９９３）。
３Ｄ１／２／１は、ヒトおよびモルモットのＩＧＦ−Ｉとは反応を示すが、ウサギ、ラット、マウスのＩＧＦ−Ｉとは反応しないこと、ｈＩＧＦ−ＩＩとは、７％の交差反応性を示すことが報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，５４，４７４−４７６，１９８２）。
代表的なヒトＩＧＦ−ＩＩに対する抗体（以下、抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体と表記する）としては、Ｓ１Ｆ２が報告されている。Ｓ１Ｆ２は、ｈＩＧＦ−Ｉと１０％程度の交差反応性を有していること、１μｇ／ｍＬの濃度でウェスタンブロッティング法により、１０〜１００ｎｇのｈＩＧＦ−ＩＩを検出可能であること、１００μｇ／ｍＬの濃度で１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−ＩＩによるヒト繊維芽細胞のＤＮＡ合成促進作用を阻害することが明らかとなっている（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，７，Ｓ２１−Ｓ２７，１９８９、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２４，８７０−８７７，１９８９）。
抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体２Ｈ１１、２Ｂ１１、ＩＤ５、ＩＤ９は、ｈＩＧＦ−ＩＩと反応し、ｈＩＧＦ−Ｉとは反応しないこと、競合酵素免疫測定法（以下、ＥＬＩＳＡと表記する）により、１ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−ＩＩを定量可能であることが報告されている（特開平５−２５２９８７）。
また、ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体をヒトに投与すると、異物として認識されることにより、ヒト体内にマウス抗体に対するヒト抗体（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ：以下、ＨＡＭＡと表記する）が誘導されることが知られている。
ＨＡＭＡは投与されたマウス抗体と反応して、副作用を惹起することや（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２，８８１−８９１，１９８４；Ｂｌｏｏｄ，６５，１３４９−１３６３，１９８５；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，８０，９３２−９３６，１９８８；Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，８２，１２４２−１２４６，１９８５）、投与されたマウス抗体の体内からの消失を速め（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２６，１０１１−１０２３，１９８５；Ｂｌｏｏｄ，６５，１３４９−１３６３，１９８５；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，８０，９３７−９４２，１９８８）、マウス抗体の治療効果を減じてしまうことが知られている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３５，１５３０−１５３５，１９８５；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４６，６４８９−６４９３，１９８６）。
これらの問題点を解決するため、遺伝子組換え技術を利用してヒト以外の動物の抗体をヒト型キメラ抗体あるいはヒト型相補性決定領域（以下、ＣＤＲと表記する）移植抗体などのヒト化抗体にすることが試みられている。ヒト型キメラ抗体とは、抗体の可変領域（以下、Ｖ領域と表記する）がヒト以外の動物の抗体で、定常領域（以下、Ｃ領域と表記する）がヒト抗体である抗体であり（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，８１，６８５１−６８５５，１９８４）、ヒト型ＣＤＲ移植抗体とは、ヒト以外の動物の抗体のＶ領域中のＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体の適切な位置に移植した抗体である（Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２−５２５，１９８６）。これらのヒト化抗体は、マウス抗体などのヒト以外の動物の抗体に比較してヒトへの臨床応用上、様々な利点を有している。例えば、免疫原性および血中での安定性に関しては、ヒト型キメラ抗体では、ヒトに投与した場合、マウス抗体に比べて血中半減期が約６倍伸びたことが報告されている（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，８６，４２２０−４２２４，１９８９）。ヒト型ＣＤＲ移植抗体においても、サルを用いた実験でマウス抗体に比べ免疫原性が低下し、血中半減期が延長したことが報告されている（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５６，１１１８−１１２５，１９９６；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８５，６６８−６７４，１９９５）。即ち、ヒト化抗体は、ヒト以外の動物の抗体に比べ、副作用が少なく、その治療効果が長期間持続することが期待される。また、ヒト化抗体は、遺伝子組換え技術を利用して作製するため、様々な形態の分子として作製することができる。例えば、ヒト抗体の重鎖（以下、Ｈ鎖と表記する）Ｃ領域としてγ１サブクラスを使用すれば、血中で安定、かつ、抗体依存性細胞障害活性などのエフェクター活性の高いヒト化抗体を作製することができる（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５６，１１１８−１１２５，１９９６）。エフェクター活性の高いヒト化抗体は、癌などの標的の破壊が望まれる場合には、極めて有用である。一方、単に標的を中和する作用のみが必要とされる場合や、エフェクター活性による標的の破壊による副作用が懸念される場合には、ヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域としてγ４サブクラスを使用すれば、γ４サブクラスは一般的にエフェクター活性が低いため（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１６６，１３５１−１３６１，１９８７；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１６８，１２７−１４２，１９８８）、副作用を回避でき、かつ、マウス抗体に比べ血中半減期の延長が期待される（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８５，６６８−６７４，１９９５）。さらに、最近の蛋白質工学、遺伝子工学の進歩により、ヒト化抗体を含めた抗体からＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６，１９８８）、ｄｓＦｖ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３２，２４９−２５８，１９９５）、ＣＤＲを含むペプチド（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７１，２９６６−２９７１，１９９６）などのより分子量の小さい抗体断片の作製が可能となっている。これらの抗体断片は、完全な抗体分子に比べ分子量が小さい為、標的組織への移行性に優れている（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５２，３４０２−３４０８，１９９２）。
以上のことから、癌の発生、増殖、さらには、糖尿病性合併症やリウマチ性関節炎において、重要な役割を果たしているＩＧＦファミリー蛋白質はインスリン、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの増殖因子とインスリン受容体、ＩＧＦ−ＩＲおよびＩＧＦ−ＩＩＲの受容体、ならびにＩＧＦＢＰが複雑に絡み合って疾患を制御している。すなわち、これらの相互作用の一部を阻害しても疾患を完全に抑制することは困難である。治療薬として有用と考えられるＩＧＦ−Ｉおよび／あるいはＩＧＦ−ＩＩを認識する抗体は、多数報告があるが、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩと強く結合して、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの機能を同時に阻害できる抗体の報告はない。
また、ヒトへの臨床応用に用いる抗体としては、ヒト化抗体の方がマウス抗体などのヒト以外の動物の抗体より望ましい。しかし、抗ｈＩＧＦ抗体に関してヒト化抗体などの遺伝子組換え抗体の作製の報告、さらには、それらの抗体断片の報告はない。
発明の開示
ｈＩＧＦファミリーが介在する細胞増殖は、多くの癌細胞で機能していることが知られており、ｈＩＧＦが介在する情報伝達を阻害できれば、ヒトにおける固形腫瘍の増殖、転移形成、糖尿病性合併症、リウマチ性関節炎等の疾患の治療に有用であることが期待される。
本発明の目的は、ｈＩＧＦファミリーが介在する情報伝達を遮断し、ＩＧＦによる細胞増殖を阻害する物質を取得し、さらに該物質の利用方法を提供することである。
本発明は、以下の（１）〜（２４）に関する。
（１） ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有し、かつ、バイオセンサービアコアで測定される結合定数が５×１０^９Ｍ^−１以上の結合活性を有する抗体またはその抗体断片。
（２） ヒトＩＧＦ−Ｉに対する結合活性とヒトＩＧＦ−ＩＩに対する結合活性とが同程度である（１）に記載の抗体またはその抗体断片。
（３） 抗体またはその抗体断片の重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号５、６および７、および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号８、９および１０で示されるアミノ酸配列を含む、（１）または（２）に記載の抗体またはその抗体断片。
（４） 抗体が、ヒト以外の動物の抗体または遺伝子組換え抗体である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片。
（５） 遺伝子組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体およびヒト抗体からなる群から選ばれる、（４）に記載の抗体またはその抗体断片。
（６） ヒト以外の動物の抗体のＶＨが配列番号２、および／またはＶＬが配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む、（４）に記載の抗体またはその抗体断片。
（７） ヒト以外の動物の抗体が、ハイブリドーマＫＭ１４６８（ＦＥＲＭ ＢＰ−７９７８）により生産される（３）または（６）に記載の抗体またはその抗体断片。
（８） ヒト型キメラ抗体のＶＨが配列番号２、および／またはＶＬが配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む、（５）に記載の抗体またはその抗体断片。
（９） ヒト型キメラ抗体が、ＫＭ１４６８（ＦＥＲＭ ＢＰ−７９７８）より生産される抗体のＶＨおよび／またはＶＬを含む、（５）または（８）に記載の抗体またはその抗体断片。
（１０） ヒト型キメラ抗体が、ヒト抗体の定常領域を含む、（５）、（８）および（９）のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片。
（１１） ヒト抗体の定常領域が、ヒト抗体ＩｇＧ１クラスおよび／またはκクラスの定常領域からなる（１０）に記載の抗体またはその抗体断片。
（１２） ヒト型キメラ抗体が、形質転換株ＫＭ３００２（ＦＥＲＭ ＢＰ−７９９６）により生産される（５）、（８）〜（１１）のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片。
（１３） ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号５、６および７、および／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号８、９および１０で示されるアミノ酸配列を含む、（４）に記載の抗体またはその抗体断片。
（１４） ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、ＫＭ１４６８（ＦＥＲＭ ＢＰ−７９７８）により生産される抗体のＶＨのＣＤＲおよび／またはＫＭ１４６８（ＦＥＲＭ ＢＰ−７９７８）により生産される抗体のＶＬのＣＤＲを含む、（５）または（１３）に記載の抗体またはその抗体断片。
（１５） ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、ヒト抗体の定常領域を含む、（４）、（１３）および（１４）のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片。
（１６） ヒト抗体の定常領域が、ヒト抗体ＩｇＧ１クラスおよび／またはκクラスの定常領域からなる（１５）に記載の抗体またはその抗体断片。
（１７） 抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である（１）〜（１６）のいずれか１項に記載の抗体断片。
（１８） （１）〜（１７）のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片をコードするＤＮＡ。
（１９） （１８）に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
（２０） （１９）に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
（２１） （２０）に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に請求の範囲（１）〜（１６）のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片を生成蓄積させ、培養物から抗体またはその抗体断片を採取することを特徴とする抗体またはその抗体断片の製造方法。
（２２） （１）〜（１７）のいずれか１項に記載の抗体およびその抗体断片から選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有する医薬。
（２３） （１）〜（１７）のいずれか１項に記載の抗体およびその抗体断片から選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有するヒトＩＧＦ介在性疾患または異常なヒトＩＧＦの産生亢進により病態が進行する疾患の治療薬。
（２４） （１）〜（１７）のいずれか１項に記載の抗体およびその抗体断片から選ばれる少なくとも１種を含有するヒトＩＧＦ介在性疾患または異常なヒトＩＧＦの産生亢進により病態が進行する疾患の診断薬。
本発明の抗ｈＩＧＦ抗体は、ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有し、かつ、バイオセンサービアコアで測定される結合定数が５×１０^９Ｍ^−１以上の結合活性を有する抗体があげられるが、そのなかでもｈＩＧＦ−Ｉに対する結合活性およびｈＩＧＦ−ＩＩに対する結合活性が同程度である抗体であって、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する抗体が好ましい。
ｈＩＧＦ−Ｉに対する結合活性およびｈＩＧＦ−ＩＩに対する結合活性が同程度とは、抗体が、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに同等に結合できることをいう。同等に結合できるとは、ｈＩＧＦ−ＩあるいはｈＩＧＦ−ＩＩに対する抗体の結合活性を数値化し、その相対値で比較することができる。同等の結合活性とは、抗体のｈＩＧＦ−Ｉに対する結合活性を１としたとき、ｈＩＧＦ−ＩＩに対する結合活性が０．１〜１０、好ましくは０．２〜５、さらに好ましくは０．５〜２、最も好ましくは１であるものがあげられる。結合活性の指標としては、表面プラズモン共鳴の原理などを利用したバイオセンサー法（以下、バイオセンサービアコアと表記する）などで測定される結合定数（以下、Ｋ_Ａとも表記する）などがあげられる。
本発明の抗体としては、天然型のｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに存在するエピトープを認識する抗体、天然型のｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの立体構造を認識する抗体などがあげられる。また、ヒト以外の他の生物種のＩＧＦと交差反応性を示してもよい。
ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能としては、乳房、前立腺、肺、結腸などの上皮系細胞の増殖、分化またはアポトーシスの制御などｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩが関与している機能であればいかなるものでもよい。
本発明の抗ｈＩＧＦ抗体としては、ヒト以外の動物の抗体および遺伝子組換え抗体ならびにそれらの抗体断片などがあげられる。
ヒト以外の動物の抗体としては、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体があげられるが、好ましくはモノクローナル抗体があげられる。
本発明のヒト以外の動物のモノクローナル抗体は、ｈＩＧＦをヒト以外の動物に免疫し、免疫された動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞とでハイブリドーマを作製し、次いで単一細胞化したハイブリドーマを選択し、これを培養し、培養上清から精製し、得ることができる。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギなど、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
本発明の抗体としては、好ましくはＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号５、６、および７、および／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号８、９および１０で示されるアミノ酸配列を含む抗体があげられる。
本発明のヒト以外の動物由来のモノクローナル抗体の具体例としては、ハイブリドーマＫＭ１４６８（ＦＥＲＭ ＢＰ−７９７８）が生産するラット抗体ＫＭ１４６８があげられる。
本発明の遺伝子組換え抗体としては、ヒト化抗体およびヒト抗体などがあげられる。
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体などがあげられる。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬとヒト抗体のＣＨおよびＣＬとからなる抗体をいう。
本発明のヒト型キメラ抗体は、ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有し、かつ、バイオセンサービアコアで測定される結合定数が５×１０^９Ｍ^−１以上の結合活性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
本発明のｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに結合するヒト型キメラ抗体（以下、抗ｈＩＧＦキメラ抗体と表記する）としては、配列番号５、６、７で示されるアミノ酸配列からなるＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、および／または配列番号８、９、１０で示されるアミノ酸配列からなるＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、を含む抗ｈＩＧＦキメラ抗体、ハイブリドーマＫＭ１４６８から生産されるモノクローナル抗体のＶＨおよび／またはＶＬを含む抗ｈＩＧＦキメラ抗体、抗体のＶＨが配列番号２で示されるアミノ酸配列の１〜１１８番目、および／またはＶＬが配列番号４で示されるアミノ酸配列の１〜１０７番目を含む抗ｈＩＧＦキメラ抗体、抗体のＶＨが配列番号２で示されるアミノ酸配列、ヒト抗体のＣＨがｈＩｇＧ１サブクラスのアミノ酸配列からなり、抗体のＶＬが配列番号４で示されるアミノ酸配列、ヒト抗体のＣＬがκクラスのアミノ酸配列からなる抗ｈＩＧＦキメラ抗体、具体的には形質転換株ＫＭ３００２（ＦＥＲＭ ＢＰ−７９９６）が生産する抗ｈＩＧＦキメラ抗体ＫＭ３００２があげられる。これらのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、付加、置換または挿入され、かつ、ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有し、かつ、バイオセンサービアコアで測定される結合定数が５×１０^９Ｍ^−１以上の結合活性を有する抗体も本発明の抗体に包含される。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体をいう。本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有し、かつ、バイオセンサービアコアで測定される結合定数が５×１０^９Ｍ^−１以上の結合活性を有するヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
本発明のｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに結合するヒト型ＣＤＲ移植抗体（以下、抗ｈＩＧＦ ＣＤＲ移植抗体と表記する）としては、配列番号５、６、７で示されるアミノ酸配列からなるＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、および／または配列番号８、９、１０で示されるアミノ酸配列からなるＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、を含む抗ｈＩＧＦ ＣＤＲ移植抗体、ハイブリドーマＫＭ１４６８から生産されるモノクローナル抗体のＶＨのＣＤＲおよび／またはＶＬのＣＤＲを含む抗ｈＩＧＦ ＣＤＲ移植抗体、抗体のＶＨが配列番号１５で示されるアミノ酸配列の１〜１１８番目、および／またはＶＬが配列番号１６で示されるアミノ酸配列の１〜１０７番目を含む抗ｈＩＧＦ ＣＤＲ移植抗体、抗体のＶＨが配列番号１５で示されるアミノ酸配列、ヒト抗体のＣＨがｈＩｇＧ１サブクラスのアミノ酸配列からなり、抗体のＶＬが配列番号１６で示されるアミノ酸配列、ヒト抗体のＣＬがκクラスのアミノ酸配列からなる抗ｈＩＧＦ ＣＤＲ移植抗体があげられる。これらのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、付加、置換または挿入され、かつ、ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有し、かつ、バイオセンサービアコアで測定される結合定数が５×１０^９Ｍ^−１以上の結合活性を有する抗体も本発明の抗体に包含される。
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体なども含まれる。
ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルスなどを感染させ不死化し、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養上清中より該抗体を精製することができる。
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、ｓｃＦｖなどの抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を表面に発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、さらに、遺伝子工学的手法により２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物を意味する。具体的には、例えば、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞をマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニックマウスを作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体産生ハイブリドーマを取得し、培養することで培養上清中にヒト抗体を産生蓄積させることができる。
本発明の抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖおよびＣＤＲを含むペプチドなどがあげられる。
Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦａｂは、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに結合する抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂを製造することができる。
Ｆ（ａｂ’）_２は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦ（ａｂ’）_２は、本発明のｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに結合する抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させ、作製することができる。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）_２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦａｂ’は、本発明のｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに結合するＦ（ａｂ’）_２を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂ’を製造することができる。
ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと表記する）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のｓｃＦｖは、本発明のｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに結合する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ｓｃＦｖを製造することができる。
ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。
本発明のｄｉａｂｏｄｙは、本発明のｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに結合する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡをＰのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるように構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ｄｉａｂｏｄｙを製造することができる。
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７−７０４，１９９４）に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
本発明のｄｓＦｖは、本発明のｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに結合する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ｄｓＦｖを製造することができる。
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
本発明のＣＤＲを含むペプチドは、本発明のｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに結合する抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ＣＤＲを含むペプチドを製造することができる。
また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によって製造することもできる。
本発明の抗体は、本発明のｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに結合する抗体および抗体断片に放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質などを化学的あるいは遺伝子工学的に結合させた抗体の誘導体を包含する。
本発明の抗体の誘導体は、本発明のｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに結合する抗体および抗体断片のＨ鎖あるいはＬ鎖のＮ末端側あるいはＣ末端側、抗体および抗体断片中の適当な置換基あるいは側鎖、さらには抗体および抗体断片中の糖鎖などに放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質などを化学的手法（抗体工学入門、金光修著、地人書館、１９９４）により結合させることにより製造することができる。
また、本発明のｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに結合する抗体および抗体断片をコードするＤＮＡと、結合させたい蛋白質をコードするＤＮＡを連結させて発現用ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入し、発現させることにより製造することができる。
放射性同位元素としては、^１３１Ｉ、^１２５Ｉなどがあげられ、例えば、クロラミンＴ法などにより抗体に結合させることができる。
低分子の薬剤としては、ナイトロジェン・マスタード、サイクロフォスファミドなどのアルキル化剤、５−フルオロウラシル、メソトレキセートなどの代謝拮抗剤、ダウノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン、ドキソルビシンなどの抗生物質、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンのような植物アルカロイド、タモキシフェン、デキサメタソンなどのホルモン剤などの抗癌剤（臨床腫瘍学、日本臨床腫瘍研究会編、癌と化学療法社、１９９６）、またはハイドロコーチゾン、プレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリン、インドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート、ペニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスファミド、アザチオプリンなどの免疫抑制剤、マレイン酸クロルフェニラミン、クレマシチンのような抗ヒスタミン剤などの抗炎症剤（炎症と抗炎症療法、医歯薬出版株式会社、１９８２）などがあげられる。例えば、ダウノマイシンと抗体を結合させる方法としては、グルタールアルデヒドを介してダウノマイシンと抗体のアミノ基間を結合させる方法、水溶性カルボジイミドを介してダウノマイシンのアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法などがあげられる。
高分子の薬剤としては、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと表記する）、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどがあげられる。これらの高分子化合物を抗体および抗体断片に結合させることにより、（１）化学的、物理的あるいは生物的な種々の因子に対する安定性の向上、（２）血中半減期の顕著な延長、（３）免疫原性の消失、抗体産生の抑制、などの効果が期待される（バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店、１９９３）。例えば、ＰＥＧと抗体を結合させる方法としては、ＰＥＧ化修飾試薬と反応させる方法などがあげられる（バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店、１９９３）。ＰＥＧ化修飾試薬としては、リジンのε−アミノ基の修飾剤（特昭６１−１７８９２６）、アスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシル基の修飾剤（特昭５６−２３５８７）、アルギニンのグアニジノ基の修飾剤（特平２−１１７９２０）などがあげられる。
蛋白質としては、免疫担当細胞を活性化するサイトカイン、例えば、ヒトインターロイキン２（以下、ｈＩＬ−２と表記する）、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（以下、ｈＧＭ−ＣＳＦと表記する）、ヒトマクロファージコロニー刺激因子（以下、ｈＭ−ＣＳＦと表記する）、ヒトインターロイキン１２（以下、ｈＩＬ−１２と表記する）などがあげられる。また、癌細胞を直接障害する活性を有するリシンやジフテリア毒素などの毒素を用いることができる。例えば、蛋白質との融合抗体ついては、抗体および抗体断片をコードするｃＤＮＡに蛋白質をコードするｃＤＮＡを連結させ、融合抗体をコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物あるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、融合抗体を製造することができる。
本発明のｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに対する抗体および抗体断片は、ＥＬＩＳＡ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，１９８８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）、バイオセンサービアコアで測定されるＫ_Ａ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４５，２２９−２４０，１９９１）、およびｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩによる細胞増殖に対する阻害活性（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４８，４０８３−４０９２，１９８８）などを測定することにより、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに対する結合活性、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する活性を評価することができる。
本発明のｈＩＧＦが介在する疾患または異常なｈＩＧＦの産生亢進により病態が進行する疾患としては、軽度・重度に関わらず、ｈＩＧＦによる異常な細胞増殖により病態が進行する疾患であればいかなる疾患も包含し、具体的には癌、糖尿病性合併症、リウマチ性関節炎などがあげられる。
以下に、ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有し、かつ、バイオセンサービアコアで測定される結合定数が５×１０^９Ｍ^−１以上の結合活性を有する抗体またはその抗体断片の作製方法および活性評価について記す。
１．ｈＩＧＦに対するヒト以外の動物のモノクローナル抗体の作製
（１）抗原の調製
ｈＩＧＦをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などに導入、発現させ、組換え型ｈＩＧＦ蛋白質を得る。あるいは、ｈＩＧＦ部分配列を有する合成ペプチドを抗原に用いることもできる。
抗原用部分ペプチドとしては、５〜３０残基程度の蛋白質部分配列が選択される。変性していない天然の構造を有している状態の該蛋白質を認識する抗体を取得するためには、立体構造上蛋白質の表面に存在している部分配列を抗原ペプチドとして選択する必要がある。立体構造上蛋白質表面に存在する部分は、Ｇｅｎｅｔｙｘ Ｍａｃなど市販の蛋白質配列解析ソフトを用い、親水性の高い部分配列を予測することで推測することができる。すなわち、一般的に親水性の低い部分は立体構造上蛋白質の内部に存在する場合が多く、親水性の高い部分は蛋白質表面に存在する場合が多いためである。また、蛋白質のＮ末端、Ｃ末端は蛋白質表面に存在する場合が多い。しかしながら、このように選択した部分ペプチドが目的通りの抗体を確立する抗原となるとは限らない。
部分ペプチドには蛋白質と架橋するために、システインを末端に付加する。蛋白質の内部配列を選択した場合には、必要に応じペプチドのＮ末端はアセチル化、Ｃ末端はアミド化する。
部分ペプチドは一般的な液相、固相ペプチド合成法およびそれらを適宜組み合わせる方法、またはそれらに準じる方法によって合成することができる（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，１９７９；Ｖｏｌ．２，１９８０；Ｖｏｌ．３，１９８１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；ペプチド合成の基礎と実験、丸善、１９８５；続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、廣川書店、１９９１；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５，１６１−２１４，１９９０）。
また、自動ペプチド合成機を用いることもできる。ペプチド合成機によるペプチドの合成は、島津製作所製ペプチド合成機、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．社（以下、ＡＢＩ社と表記する）製ペプチド合成機、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ Ｉｎｃ．社（以下、ＡＣＴ社と表記する）製ペプチド合成機などの市販のペプチド合成機上で、適当に側鎖を保護したＮα−Ｆｍｏｃ−アミノ酸あるいはＮα−Ｂｏｃ−アミノ酸などを用い、それぞれの合成プログラムに従って実施することができる。
原料となる保護アミノ酸および担体樹脂は、ＡＢＩ社、島津製作所、国産化学（株）、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ社、渡辺化学（株）、ＡＣＴ社またはペプチド研究所（株）などから入手することができる。また、原料となる保護アミノ酸、保護有機酸、保護有機アミンは報告されている合成法に従って、あるいはそれに準じて合成することができる（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，１９７９；Ｖｏｌ．２，１９８０；Ｖｏｌ．３，１９８１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；ペプチド合成の基礎と実験、丸善、１９８５；続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、廣川書店、１９９１；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５，１６１−２１４，１９９０）。
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
免疫に用いる動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなどハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものでもよい。下記に、マウスおよびラットを用いる例を説明する。
３〜２０週令のマウスまたはラットに、上記１（１）で調製した抗原を免疫し、その動物の脾臓、リンパ節、末梢血より抗体産生細胞を採取する。免疫は、動物の皮下、静脈内または腹腔内に適当なアジュバントとともに抗原を数回投与することにより行う。アジュバントとしては、フロインドの完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）または、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなどがあげられる。また、ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと表記する）やＫｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（以下、ＫＬＨと表記する）などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いることができる。各抗原の投与後３〜７日目に免疫動物の眼底静脈叢あるいは尾静脈より採血し、抗原として用いたｈＩＧＦに対する反応性をＥＬＩＳＡなどで確認し、その血清が十分な抗体価を示したマウスまたはラットを抗体産生細胞の供給源とする。抗原の最終投与後３〜７日目に、免疫したマウスまたはラットより公知の方法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）に準じて脾臓などを摘出し、抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させる。
（３）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞である８−アザグアニン耐性骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１−５１９，１９７６）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）（Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９−２７０，１９７８）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２３，１５４８−１５５０，１９７９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）など、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖可能な骨髄腫細胞であればいかなるものでもよい。これらの細胞株の培養および継代については公知の方法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）に従い、細胞融合時までに２×１０^７個以上の細胞数を確保する。
（４）細胞融合
上記で得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを洗浄したのち、ポリエチレングリコール−１０００（以下、ＰＥＧ−１０００と表記する）などの細胞凝集性媒体を加え、細胞を融合させ、培地中に懸濁する。細胞の洗浄にはＭｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（以下、ＭＥＭと表記する）またはＰｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（以下、ＰＢＳと表記する）などを用いる。また、融合細胞を懸濁する培地としては、目的の融合細胞のみを選択的に得られるように、ＨＡＴ培地｛通常培地［ＲＰＭＩ−１６４０培地に１．５ｍＭグルタミン、５０μＭ ２−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍＬジェンタマイシンおよび１０％牛胎児血清（以下、ＦＣＳと表記する）を加えた培地］に０．１ｍＭヒポキサンチン、１５μＭチミジンおよび０．４μＭアミノプテリンを加えた培地｝を用いる。
培養後、培養上清の一部を取り、ＥＬＩＳＡにより抗原蛋白質に反応し、非抗原蛋白質に反応しないサンプルを選択する。次いで、限界希釈法により単一細胞化を行い、ＥＬＩＳＡにより安定して高い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして選択する。
（５）ハイブリドーマの選択
抗ｈＩＧＦモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択は、公知の方法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）に従い、以下に述べるＥＬＩＳＡにより行う。これらの方法により、後述する抗ｈＩＧＦキメラ抗体、抗ｈＩＧＦ ＣＤＲ移植抗体またはそれらの抗体断片を産生する形質転換株の培養上清中に含まれる抗体あるいはすべての精製抗体の結合活性を測定することができる。
ＥＬＩＳＡ
抗原を９６穴ＥＬＩＳＡプレートに固定化し、ハイブリドーマなどの培養上清あるいは精製抗体を第一抗体として反応させる。
第一抗体反応後、プレートを洗浄して第二抗体を添加する。第二抗体としては、第一抗体を認識することができる抗体を、ビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射性同位元素などで標識した抗体を用いる。具体的にはハイブリドーマ作製の際にマウスを用いたのであれば、第二抗体としてはマウス抗体を認識できる抗体を、あるいはハイブリドーマ作製の際にラットを用いたのであれば、第二抗体としてはラット抗体を認識できる抗体を用いる。
反応後、第二抗体の標識物質に応じた反応を行ない、抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとして選択する。
当該ハイブリドーマの具体例としては、ハイブリドーマＫＭ１４６８などがあげられる。ハイブリドーマＫＭ１４６８は、平成１４年３月２６日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６ 郵便番号 ３０５−８５６６）にＦＥＲＭ ＢＰ−７９７８として寄託されている。
（６）モノクローナル抗体の精製
０．５ｍＬのプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）を腹腔内投与し、２週間飼育した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、１（４）で得られた抗ｈＩＧＦモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞５×１０^６〜２×１０^７細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。該マウスまたはヌードマウスから腹水を採取し、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カラムあるいはセルロファインＧＳＬ２０００（生化学工業社製）のカラムなどを用いて、ＩｇＧあるいはＩｇＭ画分を回収し、精製モノクローナル抗体とする。
精製モノクローナル抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットなどを用いて行うことができる。蛋白質濃度は、ローリー法あるいは２８０ｎｍでの吸光度より算出することができる。
抗体のサブクラスとは、クラス内のアイソタイプのことであり、例えば、マウスでは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ヒトでは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４があげられる。
（７）モノクローナル抗体の活性評価
培養上清中あるいは精製した抗ｈＩＧＦモノクローナル抗体のｈＩＧＦに対する結合活性は、上記１（５）の結合ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、およびバイオセンサービアコアなどにより測定することができる。
結合ＥＬＩＳＡとは、抗原を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに固定化し、第一抗体として反応させ、第一抗体を認識することができる標識した二次抗体を反応させて、標識物を検出することにより、抗原と抗体との結合活性を測定する方法である。具体的には、固定化する抗原としては、ｈＩＧＦ−ＩやｈＩＧＦ−ＩＩの精製蛋白質や部分配列を有するペプチドがあげられる。第一抗体としては、ハイブリドーマなどの培養上清あるいは精製抗体などの測定対象物があげられる。第二抗体としては、第一抗体を認識することができる抗体を、ビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射性同位元素などで標識した抗体があげられる。具体的には、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された抗ラットイムノグロブリン（以下、ｒＩｇと表記する）マウス抗体などがあげられる。
競合ＥＬＩＳＡとは、あらかじめｈＩＧＦ−ＩあるいはｈＩＧＦ−ＩＩをＥＬＩＳＡプレートに固定化し、測定対象物である抗体と、ｈＩＧＦ−ＩあるいはｈＩＧＦ−ＩＩとを同時に添加して、反応させ、プレートに固定化した抗原と反応対象物である抗体の反応を、反応液中に添加したもう一種あるいは同一の抗原が阻害することを、プレートに結合する一次抗体の量の変化で測定する方法である。抗体の結合量の変化は抗体に対する二次抗体により検出する。また、天然型のｈＩＧＦおよびｈＩＧＦの部分ペプチドを用いた競合ＥＬＩＳＡにより、天然型のｈＩＧＦとの反応性および抗原エピトープを解析することができる。抗体がｈＩＧＦの立体構造を認識しているか否かは、通常行われる構造的解析法により調べることができる。構造的解析法としては、例えば、Ｘ線結晶解析、核磁気共鳴法などがあげられる。
バイオセンサービアコアによる測定とは、２分子間の結合と解離に伴うセンサーチップ表面で生じる微量な質量変化を光学現象により、ＳＰＲシグナルとして検出するものである。本法での測定から導きだされた結合速度定数（以下、Ｋａｓｓと表記する）、解離速度定数（以下、Ｋｄｉｓｓと表記する）から、Ｋ_Ａ＝Ｋａｓｓ／Ｋｄｉｓｓで計算される結合定数（以下、Ｋ_Ａと表記する）が算出される。Ｋ_Ａは、Ｍ^−１の単位で表される。バイオセンサービアコアでの測定は、添付の使用説明書に従って至適な測定条件下で行うことができる。至適な測定条件としては、センサーチップへ固定化するリガンドの量は、式１により算出される最小値と式２で算出される最大値の間の範囲であることが好ましい。また、アナライトの結合量は、式３で算出される最大結合量以下であることが好ましい。式１、式２および式３において、リガンドとはセンサーチップに固定化する分子を示し、アナライトとは流路系を介して添加する分子を示し、Ｓとはリガンドの結合部位数を示す。ＲＵとは、Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｕｎｉｔの略であり、センサーチップ表面での単位面積あたりの質量の変化量を示し、１ＲＵ＝１ｐｇ／ｍｍ^２に相当する。バイオセンサービアコアでの測定では、最大結合量が維持できるように流速および洗浄条件を設定することにより、蛋白質の結合様式に則った結合定数の解析を行うことができる。

また、ｈＩＧＦ依存的な増殖を示す細胞株のｉｎ ｖｉｖｏあるいはｉｎ ｖｉｔｒｏの増殖に対する抗体の影響を検討することにより、ｈＩＧＦの機能を阻害する本発明の抗体の活性を測定することができる。
ｈＩＧＦ依存的な増殖を示す細胞株の増殖に対する影響とは、ｈＩＧＦ依存的な増殖を示す細胞株のｈＩＧＦ存在下でのｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞増殖、あるいはマウスなどの動物に移植したｈＩＧＦ依存的な増殖を示す細胞株のｉｎ ｖｉｖｏでの細胞増殖に対する、本発明の抗体あるいは抗体断片の影響をいう。
ｈＩＧＦ依存的な増殖を示す細胞株のｈＩＧＦ存在下でのｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞増殖としては、ｈＩＧＦ非添加の基礎培地にｈＩＧＦを添加した培地で細胞を培養したときの細胞増殖などがあげられる。ｈＩＧＦ非添加の基礎培地としては、ＴＦ／ＢＳＡ培地［Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）に１０μｇ／ｍＬのヒトトランスフェリン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）、２００μｇ／ｍＬのＢＳＡを添加した培地］などがあげられる。細胞の増殖を測定する方法としては、細胞増殖試薬ＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ社製）を使用して測定することができる。
ｈＩＧＦ依存的な増殖を示す細胞株のｉｎ ｖｉｖｏでの細胞増殖としては、マウスなどの動物に細胞を移植したときの動物体内での細胞の増殖などがあげられる。細胞の増殖を測定する方法としては、例えば、腫瘍塊としてマウス体内に生着する場合には、腫瘍塊の体積を測定して細胞の増殖の指標とすることができる。
ｈＩＧＦ依存的な増殖を示す細胞株としては、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２２）、ヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３８）、ヒト骨肉腫細胞株ＭＧ６３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１４２７）などがあげられる。また、ｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子を導入した形質転換株などがあげられる。
ｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子を導入した形質転換株としては、クローン化されたｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子が導入されて、ｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子非導入時と比べてｈＩＧＦ−Ｉの発現量が増大した細胞株があげられる。具体的には、ヒト肺癌細胞株Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５）にｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子を導入した形質転換体などがあげられる。ｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子は、文献（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，４，１９１４−１９２０，１９９０）に記載の配列をＰＣＲなどの方法により、クローニングすることができる。
２．ヒト化抗体の作製
（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとしては、ヒト抗体のＣＨおよび／またはＣＬをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであればいかなるものでもよい。ヒト化抗体発現用ベクターは、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体のＣ領域は任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬであることができ、例えば、ヒト抗体のＨ鎖のＩｇＧ１サブクラスのＣ領域（以下、ｈＣγ１と表記する）およびヒト抗体のＬ鎖のκクラスのＣ領域（以下、ｈＣκと表記する）などがあげられる。ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３−１４０，１９９０）、ｐＡＧＥ１０３（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７−１３１０，１９８７）、ｐＨＳＧ２７４（Ｇｅｎｅ，２７，２２３−２３２，１９８４）、ｐＫＣＲ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，７８，１５２７−１５３１，１９８１）、ｐＳＧ１βｄ２−４（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４，１７３−１８０，１９９０）などがあげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７−１３１０，１９８７）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターとエンハンサー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１４９，９６０−９６８，１９８７）、イムノグロブリンＨ鎖のプロモーター（Ｃｅｌｌ，４１，４７９−４８７，１９８５）とエンハンサー（Ｃｅｌｌ，３３，７１７−７２８，１９８３）などがあげられる。
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（以下、タンデム型と表記する）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１−２７８，１９９４）。タンデム型のヒト化抗体発現用ベクターとしては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）、ｐＥＥ１８（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１７，５５９−５６７，１９９８）などがあげられる。
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
（２）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得およびアミノ酸配列の解析
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは以下のようにして取得する。
マウス抗体などを産生するハイブリドーマよりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージあるいはプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、マウス抗体のＣ領域部分あるいはＶ領域部分をプローブとして用い、ＶＨをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージあるいは組換えプラスミドおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージあるいは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージあるいは組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のＶＨおよびＶＬの全塩基配列を決定し、塩基配列よりＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定する。
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなど、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ハイブリドーマから全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３−２８，１９８７）、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）などがあげられる。また、ハイブリドーマからｍＲＮＡを調製するキットとしては、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｃｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）などがあげられる。
ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３４）、あるいは市販のキット、例えば、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ^ＴＭ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）やＴｉｍｅＳａｖｅｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマから抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８−６１，１９９２）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４，１９８９）、λＺＡＰ ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｉ，４９，１９８５）、Ｌａｍｂｄａ ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３，２８０−２８９，１９８３）およびｐＵＣ１８（Ｇｅｎｅ，３３，１０３−１１９，１９８５）などのファージあるいはプラスミドベクターが用いられる。
ファージあるいはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３，２７１−２８９，１９９２）、Ｃ６００（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５９，１７７−１９０，１９６８）、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８−７８２，１９８３）、ＮＭ５２２（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６６，１−１９，１９８３）、Ｋ８０２（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６，１１８−１３３，１９６６）およびＪＭ１０５（Ｇｅｎｅ，３８，２７５−２７６，１９８５）などが用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーからのヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、放射性同位元素あるいは蛍光標識、あるいは酵素標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法あるいはプラーク・ハイブリダイゼーション法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＰＣＲ法と表記する；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３４）によりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
上記方法により選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素等で切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）などのプラスミドベクターにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、ジデオキシ法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，７４，５４６３−５４６７，１９７７）などの反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、塩基配列自動分析装置ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）などを用いて解析することで該ｃＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列からＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）と比較することにより、分泌シグナル配列の長さおよびＮ末端アミノ酸配列を推定でき、さらにはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨおよびＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）と比較することによって見出すことができる。
さらに、ＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列を用いて任意のデータベース、例えば、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴやＰＩＲ−Ｐｒｏｔｅｉｎなどに対してＢＬＡＳＴ法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１５，４０３−４１０，１９９０）などの配列の相同性検索を行い、配列の新規性を検討することができる。
（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
上記２（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬの３’末端側の塩基配列とヒト抗体のＣＨおよびＣＬの５’末端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡとそれぞれ連結し、それぞれを上記２（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。また、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを鋳型として、５’末端に適当な制限酵素の認識配列を有するプライマーを用いてＰＣＲ法によりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを増幅し、それぞれを上記２（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
（４）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）などがあげられるが、その中でも、十分な活性を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。次に、選択したヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）を考慮して塩基配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードする塩基配列を設計する。設計した塩基配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行う。この場合、ＰＣＲでの反応効率および合成可能なＤＮＡの長さから、ＶＨ、ＶＬとも６本の合成ＤＮＡを設計することが好ましい。
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、上記２（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。ＰＣＲ反応後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）などのプラスミドにクローニングし、上記２（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するプラスミドを取得する。
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元のヒト以外の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られている（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６−２７１，１９９１）。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬでは、ＣＤＲのみならず、ＦＲのいくつかのアミノ酸残基が直接的あるいは間接的に抗原結合活性に関与しており、それらアミノ酸残基がＣＤＲの移植に伴い、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの異なるアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられている。この問題を解決するため、ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基やＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用したり、抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらを元のヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６−２７１，１９９１）。ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を如何に効率よく同定するかが、最も重要な点であり、そのためにＸ線結晶解析（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１２，５３５−５４２，１９７７）あるいはコンピューターモデリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，１５０１−１５０７，１９９４）などによる抗体の立体構造の構築および解析が行われている。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来たが、その一方、あらゆる抗体に適応可能なヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製法は未だ確立されておらず、現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討するなどの種々の試行錯誤が必要である。
ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸残基の改変は、改変用合成ＤＮＡを用いて上記２（４）に記載のＰＣＲ法を行うことにより、達成できる。ＰＣＲ後の増幅産物について上記２（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
上記２（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、上記２（４）および（５）で構築したヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。
例えば、上記２（４）および（５）でヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、上記２（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングすることができる。
（７）ヒト化抗体の一過性発現
作製した多種類のヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価するために、上記２（３）および（６）に記載のヒト化抗体発現ベクター、あるいはそれらを改変した発現ベクターを用いてヒト化抗体の一過性発現を行うことができる。発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、その発現量の高さから、サル腎臓由来細胞株ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）が一般に用いられる（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ，２８３，１９９１）。ＣＯＳ−７細胞への発現ベクターの導入法としては、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ，２８３，１９９１）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，８４，７４１３−７４１７，１９８７
発現ベクターの導入後、培養上清中のヒト化抗体の発現量及び抗原結合活性はＥＬＩＳＡ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，１９８８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）などにより測定できる。
（８）ヒト化抗体の安定発現
上記２（３）および（６）に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することによりヒト化抗体を安定に発現する形質転換細胞を得ることができる。
宿主細胞への発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３−１４０，１９９０）などがあげられる。
ヒト化抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、ｄｈｆｒと表記する）が欠損したＣＨＯ細胞（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，７７，４２１６−４２２０，１９８０）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２、以下、ＹＢ２／０細胞と表記する）などがあげられる。
発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に発現する形質転換体は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８ ｓｕｌｆａｔｅ（以下、Ｇ４１８と表記する）などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、またはこれら培地にＦＣＳなどの各種添加物を添加した培地などを用いることができる。得られた形質転換細胞を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を発現蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の発現量および抗原結合活性は、ＥＬＩＳＡにより測定できる。また、形質転換細胞は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ｄｈｆｒ増幅系などを利用してヒト化抗体の発現量を上昇させることができる。
ヒト化抗体は、形質転換細胞の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ８，１９８８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖あるいは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＰＡＧＥと表記する：Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５，１９７０）やウエスタンブロッティング法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １２，１９８８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）などで測定することができる。
（９）ヒト化抗体の活性評価
培養上清中あるいは精製した抗ｈＩＧＦヒト化抗体のｈＩＧＦに対する結合活性は、上記１（７）に示したＥＬＩＳＡおよびバイオセンサービアコアなどにより測定することができる。また、上記１（７）に示したｈＩＧＦ依存的な増殖を示す細胞株のｉｎ ｖｉｖｏあるいはｉｎ ｖｉｔｒｏの増殖に対する抗体の影響を検討することにより、ｈＩＧＦの機能を阻害する本発明の抗体の活性を測定することができる。
３．抗体断片の作製
抗体断片は、上記１および２に記載の抗ｈＩＧＦ抗体をもとに遺伝子工学的手法あるいは蛋白質化学的手法により、作製することができる。
遺伝子工学的手法としては、目的の抗体断片をコードする遺伝子を構築し、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、大腸菌などの適当な宿主を用いて発現、精製を行うなどの方法があげられる。
蛋白質化学的手法としては、ペプシン、パパインなどの蛋白質分解酵素を用いた部位特異的切断、精製などの方法があげられる。
抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、ＣＤＲを含むペプチドなどがあげられる。
（１）Ｆａｂの作製
Ｆａｂは、蛋白質化学的にはＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理することにより、作製することができる。パパインの処理後は、元の抗体がプロテインＡ結合性を有するＩｇＧサブクラスであれば、プロテインＡカラムに通すことで、ＩｇＧ分子やＦｃ断片と分離し、均一なＦａｂとして回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５）。プロテインＡ結合性を持たないＩｇＧサブクラスの抗体の場合は、イオン交換クロマトグラフィーにより、Ｆａｂは低塩濃度で溶出される画分中に回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５）。また、Ｆａｂは遺伝子工学的には、多くは大腸菌を用いて、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記２（２）、２（４）および２（５）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、Ｆａｂ発現用ベクターにクローニングし、Ｆａｂ発現ベクターを作製することができる。Ｆａｂ発現用ベクターとしては、Ｆａｂ用のＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＩＴ１０６（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，１０４１−１０４３，１９８８）などがあげられる。Ｆａｂ発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズマ層にＦａｂを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるＦａｂとすることができ、また、ペリプラズマ層に発現させた場合は、培養上清中に活性を持ったＦａｂが漏出する。リフォールディング後あるいは培養上清からは、抗原を結合させたカラムを用いることにより、均一なＦａｂを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９２）。
（２）Ｆ（ａｂ’）_２の作製
Ｆ（ａｂ’）_２は、蛋白質化学的にはＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理することにより、作製することができる。ペプシンの処理後は、Ｆａｂと同様の精製操作により、均一なＦ（ａｂ’）_２として回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９５）。また、下記３（３）に記載のＦａｂ’をｏ−ＰＤＭやビスマレイミドヘキサンなどのようなマレイミドで処理し、チオエーテル結合させる方法や、ＤＴＮＢ［５，５’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）］で処理し、Ｓ−Ｓ結合させる方法によっても作製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
（３）Ｆａｂ’の作製
Ｆａｂ’は、上記３（２）に記載のＦ（ａｂ’）_２をジチオスレイトールなどの還元剤で処理して得ることができる。また、Ｆａｂ’は遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記２（２）、２（４）および２（５）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、Ｆａｂ’発現用ベクターにクローニングし、Ｆａｂ’発現ベクターを作製することができる。Ｆａｂ’発現用ベクターとしては、Ｆａｂ’用のＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＡＫ１９（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，１０，１６３−１６７，１９９２）などがあげられる。Ｆａｂ’発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズマ層にＦａｂ’を生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるＦａｂ’とすることができ、また、ペリプラズマ層に発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収させることができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、プロテインＧカラムなどを用いることにより、均一なＦａｂ’を精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
（４）ｓｃＦｖの作製
ｓｃＦｖは遺伝子工学的には、ファージまたは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記２（２）、２（４）および２（５）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、ｓｃＦｖ発現用ベクターにクローニングし、ｓｃＦｖ発現ベクターを作製することができる。ｓｃＦｖ発現用ベクターとしては、ｓｃＦｖのＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＨＦＡ（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＆ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，５，４８−５６，１９９４）などがあげられる。ｓｃＦｖ発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、ヘルパーファージを感染させることで、ファージ表面にｓｃＦｖがファージ表面蛋白質と融合した形で発現するファージを得ることができる。また、ｓｃＦｖ発現ベクターを導入した大腸菌の封入体あるいはペリプラズマ層にｓｃＦｖを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｓｃＦｖとすることができ、また、ペリプラズマ層に発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収することができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、陽イオン交換クロマトグラフィーなどを用いることにより、均一なｓｃＦｖを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
（５）ｄｉａｂｏｄｙの作製
ｄｉａｂｏｄｙは遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記２（２）、２（４）および２（５）に記載の抗体のＶＨとＶＬをリンカーがコードするアミノ酸残基が８残基以下となるように連結したＤＮＡを作製し、ｄｉａｂｏｄｙ発現用ベクターにクローニングし、ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターを作製することができる。ｄｉａｂｏｄｙ発現用ベクターとしては、ｄｉａｂｏｄｙのＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＨＦＡ（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，５，４８，１９９４）などがあげられる。ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターを導入した大腸菌の封入体あるいはペリプラズマ層にｄｉａｂｏｄｙを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｄｉａｂｏｄｙとすることができ、また、ペリプラズマ層に発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収することができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、陽イオン交換クロマトグラフィーなどを用いることにより、均一なｓｃＦｖを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
（６）ｄｓＦｖの作製
ｄｓＦｖは遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。まず、上記２（２）、２（４）および２（５）に記載の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡの適当な位置に変異を導入し、コードするアミノ酸残基がシステインに置換されたＤＮＡを作製する。作製した各ＤＮＡをｄｓＦｖ発現用ベクターにクローニングし、ＶＨおよびＶＬの発現ベクターを作製することができる。ｄｓＦｖ発現用ベクターとしては、ｄｓＦｖ用のＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＵＬＩ９（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７−７０４，１９９４）などがあげられる。ＶＨおよびＶＬの発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズマ層にを生成蓄積させることができる。封入体あるいはペリプラズマ層からＶＨおよびＶＬを得、混合し、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｄｓＦｖとすることができる。リフォールディング後は、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過などにより、さらに精製することができる（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７−７０４，１９９４）。
（７）ＣＤＲペプチドの作製
ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法あるいはｔＢｏｃ法等の化学合成法によって作製することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドをコードするＤＮＡを作製し、作製したＤＮＡを適当な発現用ベクターにクローニングし、ＣＤＲペプチド発現ベクターを作製することができる。発現用ベクターとしては、ＣＤＲペプチドをコードするＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＬＥＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＸ４ａ＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などがあげられる。発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズマ層にを生成蓄積させることができる。封入体あるいはペリプラズマ層からＣＤＲペプチドを得、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過などにより、精製することができる（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７−７０４，１９９４）。
（８）抗体断片の活性評価
精製した抗体断片のｈＩＧＦに対する結合活性は、上記１（７）に示したＥＬＩＳＡおよびバイオセンサービアコアなどにより測定することができる。また、上記１（７）に示したｈＩＧＦ依存的な増殖を示す細胞株のｉｎ ｖｉｖｏあるいはｉｎ ｖｉｔｒｏの増殖に対する抗体の影響を検討することにより、ｈＩＧＦの機能を阻害する本発明の抗体の活性を測定することができる。
４．抗ｈＩＧＦ抗体を用いたｈＩＧＦの検出および定量法
本発明は、本発明の抗体を用いて、ｈＩＧＦを免疫学的に検出および定量する方法に関する。従って、本発明の抗体は、後述するｈＩＧＦ介在性疾患および異常なｈＩＧＦの産生亢進により病態が進行する疾患の診断に用いることができる。
本発明の抗体を用いて、ｈＩＧＦを免疫学的に検出および定量する方法としては、蛍光抗体法、ＥＬＩＳＡ、放射性物質標識免疫法（以下、ＲＩＡと表記する）、免疫組織染色法、免疫細胞染色法などの免疫組織化学染色法（ＡＢＣ法、ＣＳＡ法など）、サンドイッチＥＬＩＳＡ（単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック、１９８７；続生化学実験講座５、免疫生化学研究法、東京化学同人、１９８６）などがあげられる。
蛍光抗体法とは、分離した細胞あるいは組織などに、本発明の抗体を反応させ、さらにフルオレセインイソチオシアネート（以下、ＦＩＴＣと表記する）などの蛍光物質で標識した抗Ｉｇ抗体あるいは抗体断片を反応させた後、蛍光色素をフローサイトメーターで測定する方法である。
ＲＩＡとは、分離した細胞あるいはその破砕液、組織あるいはその破砕液、細胞培養上清、血清、胸水、腹水、眼液などに、本発明の抗体を反応させ、さらに放射線標識を施した抗Ｉｇ抗体あるいは抗体断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する方法である。
免疫組織染色法、免疫細胞染色法とは、分離した細胞あるいは組織などに、本発明の抗体を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識を施した抗Ｉｇ抗体あるいは抗体断片を反応させた後、顕微鏡を用いて観察する方法である。
サンドイッチＥＬＩＳＡとは、本発明の抗体で、抗原認識部位の異なる２種類の抗体のうち、あらかじめ一方の抗体はＥＬＩＳＡプレートに吸着させ、もう一方の抗体はＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素で標識しておき、抗体吸着プレートに、分離した細胞あるいはその破砕液、組織あるいはその破砕液、細胞培養上清、血清、胸水、腹水、眼液などを反応させた後、標識した抗体を反応させ、標識物質に応じた反応を行う方法である。
５．ｈＩＧＦ介在性疾患および異常なｈＩＧＦの産生亢進により病態が進行する疾患の診断および治療
本発明の抗ｈＩＧＦ抗体およびその抗体断片は、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩと特異的に結合し、かつ、その機能を阻害するため、ｈＩＧＦ介在性疾患および異常なｈＩＧＦの産生亢進により病態が進行する疾患などの診断、治療において有用であると考えられる。また、ヒト化抗体は、ヒト以外の動物の抗体に比べ、ヒト抗体のアミノ酸配列に由来する部分がほとんどであるため、ヒト体内において免疫原性を示さず、反復投与が可能であり、かつ、その効果が長期間に渡り持続することが期待される。
ｈＩＧＦ介在性疾患および異常なｈＩＧＦの産生亢進により病態が進行する疾患の診断方法としては、被験者の細胞、組織あるいは血清等の生体試料中に存在するｈＩＧＦを上記４に記載した免疫学的に検出する方法があげられる。
本発明の抗ｈＩＧＦ抗体およびその抗体断片は、単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される１つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与をあげることができ、蛋白質またはペプチド製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などがあげられる。経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などがあげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液あるいは両者の混合物からなる担体などを用いて調製される。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該抗体および抗体断片そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該抗体および抗体断片を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体などを用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリンなどが例示される。該抗体および抗体断片、さらには用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重などにより異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。
発明を実施するための最良の形態
実施例１ ｈＩＧＦ−Ｉに対する抗体の作製
（１）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
組換え型ｈＩＧＦ−Ｉ（Ｒ＆Ｄ社製）は、免疫原性を高める目的で以下の方法でメチル化ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社製）とのコンジュゲートを作製し、免疫原とした。すなわち、２回蒸留水に溶解したメチル化ＢＳＡを、メチル化ＢＳＡ：ｈＩＧＦ−Ｉ＝１：４（重量比）になるように４℃で混合し、１０秒間ボルテックスミキサーで攪拌した。その後、連結針付きシリンジを用いて完全フロインドアジュバントあるいは不完全フロインドアジュバントと容量比１：１で混合し、免疫原（以下、メチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉアジュバンドと表記する）とした。
５週令雌ＳＤラットに、完全フロインドアジュバントを用いて上記のように調製したメチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉアジュバンド（１００μｇのｈＩＧＦ−Ｉ相当量）を投与し、２週間後より不完全フロインドアジュバントを用いて同様に調製した免疫原を１週間に１回、計４回投与した。
眼底静脈叢より採血し、その血清中の抗体価を実施例１（４）に示す結合ＥＬＩＳＡで調べ、十分な抗体価を示したラットから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。
脾臓をＭＥＭ（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し、赤血球を除去し、ＭＥＭで３回洗浄し、細胞融合に用いた。
（２）マウス骨髄腫細胞の調製
８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｕ１を通常培地で培養し、細胞融合時に２×１０^７個以上の細胞を確保して、細胞融合に使用した。
（３）ハイブリドーマの作製
実施例１（１）で得られたラット脾細胞と（２）で得られた骨髄腫細胞とを１０：１になるよう混合し、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞に３７℃で攪拌しながら、１．０×１０^２個のラット脾細胞あたり０．２〜１．０ｍＬの融合培地（２ｇのＰＥＧ−１０００、２ｍＬのＭＥＭ、０．７ｍＬのジメチルスルホキシドの混液）を加え、１〜２分間毎に１〜２ｍＬのＭＥＭを数回加えた後、さらに、ＭＥＭを加えて全量が５０ｍＬになるようにした。遠心分離（９００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、緩やかに細胞をほぐした後、１００ｍＬのＨＡＴ培地｛通常培地［ＲＰＭＩ−１６４０培地に１．５ｍＭグルタミン、５０μＭ ２−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍＬジェンタマイシンおよび１０％牛胎児血清（以下、ＦＣＳと表記する）を加えた培地］に０．１ｍＭヒポキサンチン、１５μＭチミジンおよび０．４μＭアミノプテリンを加えた培地｝に懸濁した。
この懸濁液を９６ウェル培養用プレートに１００μＬ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で１０〜１４日間培養した。この培養上清を実施例１（４）に示す結合ＥＬＩＳＡを用いて、メチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉに反応して、陰性対照であるメチル化ＢＳＡ−ＢＳＡ［ＢＳＡを用いて上記実施例１（１）と同様の反応を行い作製したコンジュゲート］に反応しないウェルを選び、さらにＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）と通常培地に換え、２回の単一細胞化を行い、抗ｈＩＧＦ−Ｉラットモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを確立した。
その結果、第１図に示した反応性を有するＫＭ１４６８、ＫＭ１４６９、ＫＭ１４７０、ＫＭ１４７１、ＫＭ１４７２およびＫＭ１４７３の６クローンのハイブリドーマを取得した。各ハイブリドーマが産生する抗体のサブクラスを、サブクラスタイピングキットを用いたＥＬＩＳＡにより検討した結果、いずれもＩｇＧ２ｂであった。
（４）モノクローナル抗体の選択（結合ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡプレートに固定化する抗原としては、実施例１（１）で作製したメチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉおよび陰性対照としてメチル化ＢＳＡ−ＢＳＡを用いた。９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に、上述の抗原をｈＩＧＦ−ＩあるいはＢＳＡの濃度として１０μｇ／ｍＬで５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳと表記する）を１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、被免疫ラット抗血清、抗ｈＩＧＦ−Ｉモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清あるいは精製した抗ｈＩＧＦ−Ｉラットモノクローナル抗体を５０μＬ／ウェルで分注し、室温で２時間反応させた。反応後、各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記する）で洗浄後、４０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社製）を二次抗体として５０μＬ／ウェルで加えて室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を１μＬ／ｍＬで添加した溶液］を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、４１５ｎｍの吸光度（以下、ＯＤ４１５と表記する）をプレートリーダーＥｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。
（５）モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した８週令Ｂａｌｂ／ｃヌード雌マウスに実施例１（３）で得られたハイブリドーマクローンを５〜２０×１０^６細胞／匹でそれぞれ腹腔内注射した。１０〜２１日後に、ハイブリドーマが腹水癌化したマウスから、腹水を採取（１〜８ｍＬ／匹）し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分間）して固形分を除去した。その後、カプリル酸沈殿法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）によりＩｇＧ画分を精製し、精製モノクローナル抗体とした。
実施例２ 抗ｈＩＧＦ−Ｉラットモノクローナル抗体の反応性の検討
（１）ｈＩＧＦ−Ｉの天然の立体構造に対する反応性
実施例１（３）で選択された抗ｈＩＧＦ−Ｉラットモノクローナル抗体の液相系における天然の立体構造を保つｈＩＧＦ−Ｉに対する反応性を、以下に示す競合ＥＬＩＳＡで調べた。
実施例１（４）に示した、実施例１（１）で作製したメチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉを固定化したプレートを準備し、２０μｇ／ｍＬより５倍希釈で段階的に希釈したｈＩＧＦ−Ｉを５０μＬ／ウェルで分注後、抗ｈＩＧＦ−Ｉラットモノクローナル抗体の精製抗体を希釈した溶液（ＫＭ１４６８：６．０μｇ／ｍＬ、ＫＭ１４７０：１．０μｇ／ｍＬ、ＫＭ１４７１：０．１６μｇ／ｍＬ、ＫＭ１４７２：７．０μｇ／ｍＬ、ＫＭ１４７３：１．２μｇ／ｍＬ）を５０μＬ／ウェルで分注し、混合して室温で２時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、４０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社製）を５０μＬ／ウェルで加えて室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を１μＬ／ｍＬで添加した溶液］を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、ＯＤ４１５をプレートリーダーＥｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。
第２図に示したように、抗ｈＩＧＦ−Ｉラットモノクローナル抗体はいずれもｈＩＧＦ−Ｉの液層中の天然の立体構造と反応性を示した。また、本系において、最も高い感度を示したＫＭ１４６８では、液相系に含まれる１６ｎｇ／ｍＬまでの濃度の天然の立体構造を有するｈＩＧＦ−Ｉを検出可能であった。
（２）抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−Ｉの競合的ＥＬＩＳＡでの反応性
抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８は、実施例２（１）においてｈＩＧＦ−Ｉの立体構造を認識している可能性が示唆された。しかしながら、ＫＭ１４６８は、アミノ酸一次配列を認識している可能性も考えられるため、ｈＩＧＦ−Ｉ部分ペプチドとの反応性を解析した。
（２−１）ｈＩＧＦ−Ｉの部分ペプチドの合成
ＷＯ０１／６４７５４に記載の方法に従って、ｈＩＧＦ−Ｉの部分ペプチドを合成した。合成したペプチドは、ｈＩＧＦ−Ｉの１−１８番目（配列番号１７、以下、ｐ１−１８と表記する）、１４−３０番目（配列番号１８、以下、ｐ１４−３０と表記する）、２４−３５番目（配列番号１９、以下、ｐ２４−３５と表記する）、２９−４１番目（配列番号２０、以下、ｐ２９−４１と表記する）、３６−４７番目（配列番号２１、以下、ｐ３６−４７と表記する）、４１−５６番目（配列番号２２、以下、ｐ４１−５６と表記する）、５２−７０番目（配列番号２３、以下、ｐ５２−７０と表記する）、５３−６１番目（配列番号２４、以下、ｐ５３−６１と表記する）、６１−７０番目（配列番号２５、以下、ｐ６１−７０と表記する）に相当するペプチドであり、ｈＩＧＦ−Ｉの全長を網羅するように設計した。上記ペプチドにおいては、内部に存在するＣｙｓについては、ＳｅｒあるいはＡｌａに置換した配列を合成した。また、４１−５６番目に相当する配列については、内部のＣｙｓを有する配列（配列番号２６、以下、ｐ４１−５６Ｃと表記する）も合成した。
（２−２）抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８の抗原認識部位の解析
上記（２−１）で合成した各種ペプチドを用いて、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８の抗原認識部位の解析を以下に示す競合ＥＬＩＳＡで検討した。
実施例１（４）に示したように抗原を固定化したプレートを準備し、４．０μｇ／ｍＬに希釈した抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８を５０μＬ／ウェルで分注後、５０μｇ／ｍＬより３倍希釈で段階的に希釈した各種ペプチド溶液の単独あるいは種々の組合せ、あるいはｈＩＧＦ−Ｉを５０μＬ／ウェルで分注し、混合して室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、二次抗体として４０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社製）を５０μＬ／ウェルで加えて室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を１μＬ／ｍＬで添加した溶液］を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、ＯＤ４１５をプレートリーダーＥｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。結果は、抗体のみを添加した時のＯＤ４１５を１００とした相対値（％）で表示した。
第３図に示したように、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−Ｉに対する結合は、ｈＩＧＦ−Ｉにより濃度依存的に阻害されたが、各種ペプチドでは、単独あるいは組合せに拘わらず、阻害活性は認められなかった。以上の結果は、ＫＭ１４６８が、ｈＩＧＦ−Ｉの単なるアミノ酸一次配列ではなく、ｈＩＧＦ−Ｉの立体構造を認識していることを強く示唆する。
（３）抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８の競合的ＥＬＩＳＡによる交差反応性の確認
精製した抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−ＩＩおよびヒトインスリンに対する交差反応性を、以下に示した競合ＥＬＩＳＡで検討した。抗原としては、ｈＩＧＦ−Ｉ（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ社製）、ｈＩＧＦ−ＩＩ（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ社製）およびヒトインスリン（和光純薬社製）を使用した。
実施例１（１）で作製したメチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉ抗原、あるいは実施例１（１）と同様に作製したメチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−ＩＩ抗原を、実施例１（４）に示した方法に従って、メチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉ抗原は０．１μｇ／ｍＬの濃度で、メチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−ＩＩ抗原は１．０μｇ／ｍＬの濃度でそれぞれ固定化したプレートを準備し、０．６μｇ／ｍＬに希釈したＫＭ１４６８を２５μＬ／ウェルで分注後、２０μｇ／ｍＬより４倍希釈で段階的に希釈したｈＩＧＦ−Ｉ、ｈＩＧＦ−ＩＩあるいはヒトインスリンを２５μＬ／ウェルで分注し、混合して室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、二次抗体として抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８の場合は、１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社製）を５０μＬ／ウェルで加えて使用した。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を１μＬ／ｍＬで添加した溶液］を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、ＯＤ４１５をプレートリーダーＥｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。結果は、抗体のみを添加した時のＯＤ４１５を１００として相対値（％）で表示した。
結果を第４図に示した。第４図Ａに示したように、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−Ｉに対する結合は、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩで強く阻害された。同様に、第４図Ｂに示したように、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−ＩＩに対する結合は、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩで強く阻害された。また、これらの阻害はｈＩＧＦ−ＩあるいはｈＩＧＦ−ＩＩでそれぞれ同程度であった。すなわち、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８は、ｈＩＧＦ−ＩとｈＩＧＦ−ＩＩの両方に同程度の強さで反応できることを示している。一方、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−ＩあるいはｈＩＧＦ−ＩＩへの結合は、ヒトインスリンでは阻害されなかった。
実施例３ 抗ＩＧＦ抗体とＩＧＦとの反応性の確認
ＫＭ１４６８と二種類の市販抗ｈＩＧＦ抗体との、抗原への反応性の比較を以下のようにして検討した。抗体としては、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８、市販の抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体であるｓｍ１．２（Ｕｐｓｔａｔｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）および市販の抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体であるＳ１Ｆ２（Ｕｐｓｔａｔｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いた。抗原としては、ｈＩＧＦ−Ｉ（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ社製）、ｈＩＧＦ−ＩＩ（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ社製）およびヒトインスリン（和光純薬社製）を使用した。
（１）表面プラズモン共鳴を用いた結合強度の測定
抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８と、抗原であるｈＩＧＦ−ＩあるいはｈＩＧＦ−ＩＩに対する結合活性を解析するために、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８、市販の抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体ｓｍ１．２、および市販の抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体Ｓ１Ｆ２の３種の抗体の、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに対する結合強度を表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を利用したバイオセンサーＢｉａｃｏｒｅ２０００（ビアコア社製）を用いて以下のように測定した。アナライトの希釈並びに測定中の反応緩衝液としては、ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｐＨ７．４）（ビアコア社製）を用いた。
センサーチップＣＭ−５（ビアコア社製）に、アミンカップリング（ビアコア社製）を用いて、３６．０ｐｇ／ｍｍ^２でｈＩＧＦ−Ｉをあるいは４１．７ｐｇ／ｍｍ^２でｈＩＧＦ−ＩＩを固定化し、測定物として２０μｇ／ｍＬより２倍希釈で６段階に希釈した３種類の抗体を、流速２０μＬ／分で２分間添加した後、５分間にわたって測定物の解離を観察した。反応は２５℃で行った。各濃度における結合反応曲線から、結合速度定数Ｋａｓｓ、並びに解離速度定数Ｋｄｉｓｓを算出し、これから各抗体の結合定数Ｋ_Ａ（Ｍ^−１）を算出した。結合定数Ｋ_Ａは、Ｋ_Ａ＝Ｋａｓｓ／Ｋｄｉｓｓで計算される。

結果を第１表に示した。抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−Ｉに対するＫ_Ａは７．８６×１０^９Ｍ^−１であり、ｈＩＧＦ−ＩＩに対するＫ_Ａは８．６３×１０^９Ｍ^−１であった。ＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに対するＫ_Ａの比は、ほぼ１：１であり、ＫＭ１４６８はｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの両者に同程度に強力に結合できることが示された。一方、市販の抗ｈＩＧＦ−Ｉモノクローナル抗体ｓｍ１．２のｈＩＧＦ−Ｉに対するＫ_Ａは１．８６×１０^８Ｍ^−１、ｈＩＧＦ−ＩＩに対するＫ_Ａは７．３５×１０^７Ｍ^−１であった。抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに対するＫ_Ａは、市販の抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体ｓｍ１．２のＫ_Ａと比較してｈＩＧＦ−Ｉに対しては約４２倍、ｈＩＧＦ−ＩＩに対しては約１２０倍であった。また、市販の抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体Ｓ１Ｆ２のｈＩＧＦ−Ｉに対するＫ_Ａは４．６２×１０^８Ｍ^−１、ｈＩＧＦ−ＩＩに対するＫ_Ａは２．４×１０^９Ｍ^−１であった。抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに対するＫ_Ａは、市販の抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体Ｓ１Ｆ２のＫ_Ａと比較してｈＩＧＦ−Ｉに対しては約１８倍、ｈＩＧＦ−ＩＩに対しては約３．６倍であった。すなわち抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８は、市販の抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体であるｓｍ１．２および市販の抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体であるＳ１Ｆ２と比較して、ｈＩＧＦ−Ｉ、ｈＩＧＦ−ＩＩのそれぞれに強い結合力を有していることが示された。
（２）抗ｈＩＧＦ抗体のｈＩＧＦ依存性増殖に対する影響
ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２２）、ヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３８）あるいはヒト骨肉腫細胞株ＭＧ−６３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１４２７）をＴＦ／ＢＳＡ培地［Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）に１０μｇ／ｍＬのヒトトランスフェリン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）、２００μｇ／ｍＬのＢＳＡを添加した培地］で０．５〜１×１０^５細胞／ｍＬに調製し、９６ウェル培養用プレートに１００μＬ／ウェルで分注した。さらに、ＴＦ／ＢＳＡ培地で各濃度に希釈したｈＩＧＦ−Ｉ（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ社製）、ｈＩＧＦ−ＩＩ（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ社製）あるいはヒトインスリン（和光純薬社製）の各因子を５０μＬ／ウェルで、ＴＦ／ＢＳＡ培地で各濃度に希釈した各抗体を５０μＬ／ウェルで添加し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で５日間培養した。培養後、細胞増殖試薬ＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ社製）を２０μＬ／ウェルで分注し、さらに、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で２．５〜４時間培養した後に、ＯＤ４５０ｎｍの吸光度（以下、ＯＤ４５０と表記する）をプレートリーダーＥｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。
第５図Ａには、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７の各因子による増殖曲線をそれぞれ示した。さらに、第５図Ｂには、４０ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−Ｉ存在下、第５図Ｃには、１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−ＩＩの存在下、第５図Ｄには、１００ｎｇ／ｍＬのヒトインスリン存在下での、各抗体添加時の増殖をそれぞれ示した。第５図に示したように、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８は、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩによる細胞増殖を強く阻害し、その増殖阻害活性は、市販の抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体であるｓｍ１．２および市販の抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体であるＳ１Ｆ２よりも高かった。一方、ヒトインスリンによる増殖に対しては、いずれの抗体も影響を与えなかった。以上の結果は、実施例３（１）および（２）の競合ＥＬＩＳＡで認められた各抗体の結合特異性と良く相関しており、また、各抗体の結合により、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能が阻害されることを明確に示したものである。
第６図Ａには、ヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９の各因子による増殖曲線をそれぞれ示した。さらに、第６図Ｂには、１０ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−Ｉ存在下、第６図Ｃには、１０ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−ＩＩの存在下、第６図Ｄには、２０ｎｇ／ｍＬのヒトインスリン存在下での、各抗体添加時の増殖をそれぞれ示した。
第６図に示したように、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８は、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩによる細胞増殖を同程度に強く阻害し、その増殖阻害活性は、市販の抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体であるｓｍ１．２および市販の抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体であるＳ１Ｆ２よりも高かった。一方、ヒトインスリンによる増殖に対しては、いずれの抗体も影響を与えなかった。以上の結果は、実施例３（１）および（２）の競合ＥＬＩＳＡで認められた結合特異性と良く相関しており、また、各抗体の結合により、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能が阻害されることを明確に示したものである。さらに、第６図Ｂに示されるｈＩＧＦ−Ｉ添加時のＨＴ−２９細胞の培養にＫＭ１４６８を添加した場合、および第６図Ｃに示されるｈＩＧＦ−ＩＩ添加時のＨＴ−２９細胞の培養にＫＭ１４６８あるいはＳ１Ｆ２を添加した場合には、それぞれ点線で示される各種抗体および各種増殖因子を添加しない場合よりも、細胞の増殖は抑制された。すなわち、ＨＴ−２９細胞は、自らｈＩＧＦ−ＩあるいはｈＩＧＦ−ＩＩを産生して増殖しており、このように細胞自らが産生した増殖因子による細胞の増殖効果も、抗ｈＩＧＦ抗体は阻害できる。
第７図Ａには、ヒト骨肉腫細胞株ＭＧ−６３の各因子による増殖曲線をそれぞれ示した。さらに、第７図Ｂには、２０ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−Ｉ存在下、第７図Ｃには、２０ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−ＩＩの存在下、第７図Ｄには、２０ｎｇ／ｍＬのヒトインスリン存在下での、各抗体添加時の増殖をそれぞれ示した。第７図に示したように、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８は、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩによる細胞増殖を同程度に強く阻害し、その増殖阻害活性は、市販の抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体であるｓｍ１．２および市販の抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体であるＳ１Ｆ２よりも高かった。一方、ヒトインスリンによる増殖に対しては、いずれの抗体も影響を与えなかった。以上の結果は、実施例３（１）および（２）の競合ＥＬＩＳＡで認められた各抗体の結合特異性と良く相関しており、また、各抗体の結合により、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能が阻害されることを明確に示したものである。
以上の３種類の細胞での、ｈＩＧＦ−ＩあるいはｈＩＧＦ−ＩＩ依存的な細胞増殖の阻害活性は、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８あるいは市販の抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体であるｓｍ１．２あるいは抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体であるＳ１Ｆ２抗体のいずれにも認められた。この細胞増殖の阻害活性は、ｈＩＧＦ−Ｉ依存的な増殖活性の場合には、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８が最も高く、次いで、抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体ｓｍ１．２、抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体Ｓ１Ｆ２であった。また、ｈＩＧＦ−ＩＩ依存的な増殖活性の場合には、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８が最も高く、次いで、抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体Ｓ１Ｆ２、抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体ｓｍ１．２であった。この結果は、実施例３（１）の表面プラズモン共鳴を用いて得られた結合強度の結果とよく一致しており、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８は、ｈＩＧＦ−ＩとｈＩＧＦ−ＩＩの両方に対する結合活性およびｈＩＧＦ−ＩあるいはｈＩＧＦ−ＩＩ依存的な細胞の増殖阻害効果において、市販抗体と比較して優れていることを、明確に示している。
実施例４ ｈＩＧＦ−Ｉ発現細胞の増殖に対する抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８の影響
（１）ｈＩＧＦ−Ｉ発現細胞の構築
以下のようにしてヒト肺癌細胞株Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５）にｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子を導入した形質転換体を作製した。
（１−１）ｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子のクローニングおよび発現ベクターの作製
１×１０^７個のヒト肺癌細胞株ＰＣ−９細胞（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，３９，１５，１９７６）から、ＲＮＡ調製キットＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、４５．６μｇの全ＲＮＡを調製した。調製した全ＲＮＡのうち５μｇを使用して、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、ｃＤＮＡを合成した。
合成したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによってｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子をクローニングした。ｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子増幅用のプライマーとして、配列番号２７と２８に示した塩基配列をそれぞれ有する合成ＤＮＡを設計した。それぞれの合成ＤＮＡは５’末端にプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、並びにｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）へクローニングするための制限酵素認識配列を含んでいる。実際には、上述で得られたヒト肺癌細胞株ＰＣ−９細胞から合成したｃＤＮＡの２０ｎｇを５０μＬのＫＯＤ（＋）ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付ＫＯＤ（＋）Ｂｕｆｆｅｒ＃１（東洋紡績社製）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２ｍＭ塩化マグネシウム、１μＭの配列番号２７と２８に示した塩基配列をそれぞれ有する合成ＤＮＡを含む緩衝液に添加し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ社製）を用いて、９４℃にて１分間加熱した後、２．５単位のＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を添加し、９４℃にて３０秒間、６２℃にて３０秒間、７２℃にて３０秒間のサイクルを３０サイクル行った。それぞれの反応液５０μＬを制限酵素Ｅｃｏ ＲＩ（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ社製）およびＳａｌ Ｉ（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．５ｋｂのｈＩＧＦ−１をコードする遺伝子のＰＣＲ産物を回収した。
次に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素Ｅｃｏ ＲＩおよびＳａｌ Ｉで消化後、Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（以下、ＣＩＡＰと表記する；Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ社製）で末端を脱リン酸化して得られたＤＮＡ０．１μｇと、上記で得られたそれぞれのＰＣＲ産物約０．１μｇを滅菌水に加えて７．５μＬとしＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）７．５μＬを加えて１６℃で一晩反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株より各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従い、反応を行い、塩基配列自動分析装置ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列を決定した。その結果、目的であるｈＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子配列を有する第８図に示したプラスミドｐＢＳ（ＩＩ）ＳＫ（−）／ｈＩＧＦ−Ｉを得た。
次に、上記で得られたｐＢＳ（ＩＩ）ＳＫ（−）／ｈＩＧＦ−ＩのｈＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子を含む制限酵素断片（Ｅｃｏ ＲＩ−Ｋｐｎ Ｉ）とｐＫＡＮＴＥＸ９３のＥｃｏ ＲＩ−Ｋｐｎ Ｉ断片とを連結して、第８図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ｈＩＧＦ−Ｉを構築した。プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ｈＩＧＦ−Ｉの塩基配列を上記と同様に塩基配列自動分析装置ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７を用いて決定した。その結果、目的のｈＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ｈＩＧＦ−Ｉを得た。
（１−２）ｈＩＧＦ−Ｉ形質転換体の作製
実施例１（１−１）で得られたプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ｈＩＧＦ−Ｉを動物細胞に導入して、ｈＩＧＦ−Ｉ発現細胞を以下のよう作製した。
プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ｈＩＧＦ−Ｉを制限酵素ＡａｔＩＩ（東洋紡績社製）で処理して直鎖状化した後、８μｇを４×１０^６細胞のヒト肺癌細胞株Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５）へエレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３−１４０，１９９０）により導入後、１５ｍＬのＲＰＭＩ培地［１０％ＦＣＳ、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（ナカライテスク社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）］に懸濁し、Ｔ７５フラスコ（スミロン社製）に移した。３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で２４時間培養した後、Ｇ４１８を０．２ｍｇ／ｍＬになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示すＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ形質転換株（以下、Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉと表記する）が取得された。
（１−３）Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞の培養上清に産生されたｈＩＧＦ−Ｉの定量
実施例３（１−１）で作製したＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞内において導入したｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子が発現して、該細胞がｈＩＧＦ−Ｉを産生しているかを確認するために、以下の実験を行った。
Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞あるいはＡ５４９細胞をＲＰＭＩ培地で培養を行った後、培養上清を回収して、培養上清中に含まれるｈＩＧＦ−Ｉ量を以下のＥＬＩＳＡ法により測定した。
実施例１（４）に示した、メチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉを固定化したプレートを準備し、陽性対象として２μｇ／ｍＬより５倍希釈で段階的に希釈したｈＩＧＦ−Ｉ、あるいはＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞またはＡ５４９細胞の培養上清を２５μｌ／ウェルで分注後、ＢＳＡ−ＰＢＳで０．６μｇ／ｍＬに希釈した抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８の精製抗体を分注し、混合して室温で２時間反応させた。反応後Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットＩｇ抗体（ＤＫＫＯ社製）を５０μＬ／ウェルで分注し、室温１時間で反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１０００倍希釈した抗ラットＩｇＧ−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ社製）を５０μＬ／ウェルで分注し、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで５回洗浄した後、ＡＢＴＳ基質溶液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を１μＬ／ｍＬで添加した溶液］を５０μｌ／ウェルで加えて発色させ、ＯＤ４１５をプレートリーダーＥｍａｘを用いて測定した。
結果を第９図に示す。第９図Ａに示したように、ｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子が導入されていないＡ５４９細胞の培養上清に対してｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子が導入されたＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞の培養上清では、明らかに結合活性は低下していることから、Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞はｈＩＧＦ−Ｉを発現していることが示された。
（１−４）抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−Ｉ発現細胞の増殖に対する影響
細胞自身が産生するｈＩＧＦ−Ｉに依存した細胞増殖（以下オートクリン細胞増殖と表記する）をＫＭ１４６８が阻害できるかを、実施例３（１−１）で作製したｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子導入細胞Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞を用いて、調べた。
Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞あるいはＡ５４９細胞を１０％ＦＣＳ、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（ナカライテスク社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）（以下、ＲＰＭＩ培地と表記する）で培養した後、それぞれ２×１０^５個／ｍＬの細胞密度になるように１０μｇ／ｍＬのヒトトランスフェリン（ＧＩＢＣＯ社製）、２００μｇ／ｍＬ ＢＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（−ＦＣＳ，−Ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）（以下、無血清培地と表記する）に懸濁した。
Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞あるいはＡ５４９細胞の細胞懸濁液を９６ウェルプレート（スミロン社製）に１００μＬ／ウェルで分注した後、各ウェルに無血清培地で２００μｇ／ｍＬより５倍希釈系で段階的に希釈した抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８を１００μＬ／ウェルで添加し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で５日間培養した。培養後、細胞増殖試薬ＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ社製）を２０μＬ／ウェルで分注し、さらに、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で４時間培養した後に、ＯＤ４５０ｎｍの吸光度（以下、ＯＤ４５０と表記する）をプレートリーダーＥｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。
結果を第１０図に示した。横軸は、培養時の各ウェル中の抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８濃度を示した。破線に示される抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８非添加のＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞の増殖性は、実線に示されるｈＩＧＦ−Ｉを産生しないＡ５４９細胞の増殖性と比較した場合、明らかに増加している。これは、Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞が自己産生するｈＩＧＦ−ＩによってＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞自身の増殖を促すオートクリン増殖を示しているものである。この第１０図に表されるようなオートクリン増殖は、Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞の培養時に抗体ＫＭ１４６８を添加した場合に、濃度依存的に阻害された。一方、Ａ５４９細胞の増殖性には、抗体ＫＭ１４６８は影響を及ぼさなかった。すなわち、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８は、細胞自身が生産するｈＩＧＦ−Ｉによるオートクリン細胞増殖を阻害できることが示された。
（１−５）抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−Ｉ発現細胞の足場非依存性増殖への影響
癌化した細胞は、軟寒天中などの細胞接着のない浮遊状態にも関わらず増殖することができる足場非依存性増殖能を有している。この足場非依存性増殖能は、細胞の造腫瘍性と非常に密接に関連しており、ｈＩＧＦ−Ｉが関与していると考えられている。ＫＭ１４６８が細胞の足場非依存性増殖を阻害できるかを、実施例３（１−１）で作製したＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞を用いて、以下のようにして調べた。
暖めた０．３％ ａｇａｒ ｎｏｂｌｅ（Ｄｉｆｃｏ社製）を含む、ＲＰＭＩ培地（以下、ａｇａｒ−ＲＰＭＩ培地と記す）を、１２ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ社製）に１ｍＬ／ウェルで分注し、数十分室温で放置してゲル化させたプレートを準備した。Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞あるいはＡ５４９細胞をＲＰＭＩ培地で培養した後、１×１０^３個／ｍＬの細胞密度になるように暖めたａｇａｒ−ＲＰＭＩ培地に懸濁した。
Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞あるいはＡ５４９細胞の細胞懸濁液を、１ｍＬ／ウェルで各ウェルに層積した。数分間室温で放置し、ゲル化させた後、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で４週間培養した。培養後、各ウェル内に形成されたコロニー数を顕微鏡下で測定した。
結果を第１１図に示した。第１１図に示したようにｈＩＧＦ−Ｉを生産しているＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞の足場非依存性の細胞増殖性は、Ａ５４９細胞の足場非依存性の細胞増殖性と比較して上昇していた。また、Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞の軟寒天中での培養時に１０μｇ／ｍＬの抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８を添加した場合には、足場非依存性の細胞増殖は、ＫＭ１４６８の添加により完全に阻害された。すなわち、足場非依存性の細胞増殖にはｈＩＧＦ−Ｉが関与しており、ｈＩＧＦ−Ｉ依存的な足場非依存性の細胞増殖は、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８により阻害されることが示された。
（１−６）抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−Ｉ発現細胞に対する腫瘍増殖阻害効果
実施例３（１−１）で作製したＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞を用いて、ｈＩＧＦ−Ｉが関与するｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍形成に対する、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８の腫瘍増殖阻害効果を、以下のように検討した。
Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞あるいはＡ５４９細胞をＲＰＭＩ培地で培養した後、それぞれ１×１０^６個／ｍＬの細胞密度になるようにＰＢＳに懸濁した。
Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞あるいはＡ５４９細胞の細胞懸濁液の１００μＬを６週齢、ヌードマウスＢａｌｂ／ｃ Ａｊｃ−１ ｎｕ（メス）の右胸部に皮下移植した。マウス１匹当たりの移植した細胞数は、１×１０^７個となる。移植直後から、マウス１匹につき５００μｇの抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８を１週間に２回、合計８回にわたって尾静脈から投与した。陰性対象として、同一の腫瘍皮下移植マウスに対してＰＢＳ投与を同時に行った。細胞移植から５日間経過時点から、腫瘍体積を測定した。腫瘍体積（ｍｍ^３）は、腫瘍の長径、短径および高さから、長径×短径×高さ×０．５２３６の式を用いて、算出した。
結果を第１２図に示した。ｈＩＧＦ−Ｉを生産しないＡ５４９細胞とｈＩＧＦ−Ｉを生産しているＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞を移植したマウスの間で、皮下腫瘍の増殖性を比較したとき、Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞を移植したマウスの皮下腫瘍の方が、腫瘍の増殖は亢進していた。また、Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞を移植したマウスでは、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８を投与した場合、皮下腫瘍の増殖は、顕著に阻害された。このことは、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８が、ｈＩＧＦ−Ｉの阻害によりｉｖ ｖｉｖｏにおいても腫瘍の増殖を阻害できることを明確に示している。
実施例５ 抗ｈＩＧＦ−Ｉキメラ抗体の作製
（１）抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８のＶ領域をコードするｃＤＮＡの単離、解析
（１−１）抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８産生ハイブリドーマからのｍＲＮＡの調製
抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８産生ハイブリドーマ細胞ＫＭ１４６８（ＦＥＲＭ ＢＰ７９７８）の５×１０^７個より、ｍＲＮＡの調製キットであるＦａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、ＫＭ１４６８由来のｍＲＮＡを２７μｇ調製した。
（１−２）抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８のＨ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡライブラリーの作製
実施例５（１−１）で取得したＫＭ１４６８のｍＲＮＡの５μｇから、ＴｉｍｅＳａｖｅｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、両端にＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩアダプター配列を有するｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡの全量を２０μＬの滅菌水に溶解後、アガロースゲル電気泳動にて分画し、ＩｇＧクラス抗体のＨ鎖に対応する約１．５ｋｂのｃＤＮＡ断片とκクラスのＬ鎖に対応する約１．０ｋｂのｃＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてそれぞれ約１．０μｇ回収した。次に、λＺＡＰＩＩ Ｐｒｅｄｉｇｅｓｔｅｄ ＥｃｏＲＩ／ＣＩＡＰ−Ｔｒｅａｔｅｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて、各々の約１．５ｋｂのｃＤＮＡ断片０．１μｇおよび約１．０ｋｂのｃＤＮＡ断片０．１μｇと、キットに添付されている制限酵素ＥｃｏＲＩで消化後、Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅで末端を脱リン酸化されたλＺＡＰＩＩベクターの１μｇを、添付の使用説明書に従い、連結した。連結後の各々の反応液のうち２．５μＬをＧｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、λファージにパッケージングし、ＫＭ１４６８のＨ鎖ｃＤＮＡライブラリーとして５．０×１０^４個、Ｌ鎖ｃＤＮＡライブラリーとして４．０×１０^４個のファージクローンを取得した。次に、各々のファージを常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）に従い、ナイロンメンブレンフィルターＨｙｂｏｎｄＮ^＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）上に固定した。
（１−３）抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８のＨ鎖およびＬ鎖のｃＤＮＡのクローニング
実施例５（１−２）で作製したＫＭ１４６８のＨ鎖ｃＤＮＡライブラリー、Ｌ鎖ｃＤＮＡライブリーのナイロンメンブレンフィルターを、ＥＣＬ Ｄｉｒｅｃｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、マウス抗体のＣ領域のｃＤＮＡ［Ｈ鎖はマウスＣγ２ｂｃＤＮＡの断片（Ｎａｔｕｒｅ，２８３，７８６−７８９ １９８０）、Ｌ鎖はマウスＣκｃＤＮＡの断片（Ｃｅｌｌ，２２，１９７−２０７，１９８０）］をプローブとして検出し、プローブに強く結合したファージクローンをＨ鎖、Ｌ鎖各１０クローン取得した。次に、λＺＡＰＩＩ Ｐｒｅｄｉｇｅｓｔｅｄ ＥｃｏＲＩ／ＣＩＡＰ−Ｔｒｅａｔｅｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）の使用説明書に従い、ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｘｃｉｓｉｏｎ法により各ファージクローンをプラスミドに変換した。こうして得られた各プラスミドに含まれるｃＤＮＡの塩基配列をＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、反応を行い、塩基配列自動分析装置ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて決定した。その結果、ｃＤＮＡの５’末端に開始コドンと推定されるＡＴＧ配列が存在する完全長の機能的なＨ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１４６８Ｈ５−２およびＬ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１４６８Ｌ５−１を得た。
（１−４）抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８のＶ領域のアミノ酸配列の解析
プラスミドｐＫＭ１４６８Ｈ５−２に含まれていたＫＭ１４６８のＶＨの全塩基配列を配列番号１に、それから推定されたＫＭ１４６８のＶＨの全アミノ酸配列を配列番号２に、プラスミドｐＫＭ１４６８Ｌ５−１に含まれていたＫＭ１４６８のＶＬの全塩基配列を配列番号３に、それから推定されたＫＭ１４６８のＶＬの全アミノ酸配列を配列番号４にそれぞれ示した。なお、配列番号２および４に記載したアミノ酸配列にそれぞれ対応する塩基配列は、配列番号１および３に記載したもの以外に無数に存在するが、それらはすべて本発明の範囲に包含される。既知の抗体の配列データ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）との比較および精製した抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８のＶＨおよびＶＬのＮ末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサーＰＰＳＱ−１０（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製）を用いて解析した結果との比較から、単離した各々のｃＤＮＡは分泌シグナル配列を含む抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８のＨ鎖およびＬ鎖をコードする完全長ｃＤＮＡであり、ＶＨについては、配列番号２に示したアミノ酸配列の−１９から−１番目が、ＶＬについては、配列番号４に示したアミノ酸配列の−２２から−１番目が分泌シグナル配列であることが明らかとなった。
次に、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の新規性について検討した。配列解析システムとしてＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ １０．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ社製）を用い、既存の蛋白質のアミノ酸配列データベース［ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ（Ｒｅｌｅａｓｅ ３９．０）、ＰＩＲ−Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｒｅｌｅａｓｅ ６５．０）］をＢＬＡＳＴ法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１５，４０３−４１０，１９９０）により検索した。その結果、ＶＨおよびＶＬともに完全に一致する配列は認められず、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８のＶＨおよびＶＬは新規なアミノ酸配列であることが確認された。
また、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを、既知の抗体のアミノ酸配列と比較することにより同定した。ＫＭ１４６８のＶＨのＣＤＲ１、２および３のアミノ酸配列を配列番号５、６および７に、ＶＬのＣＤＲ１、２および３のアミノ酸配列を配列番号８、９および１０にそれぞれ示した。
（２）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
ＷＯ９７／１０３５４に記載のヒトＩｇＧ１、κクラスの抗体を発現できるヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３と実施例５（１−３）で得られたＫＭ１４６８のＨ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドを用いて抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８に由来する抗ｈＩＧＦ−Ｉキメラ抗体発現ベクターを以下のようにして構築した。
まず、ＫＭ１４６８のＶＨおよびＶＬｃＤＮＡをアミノ酸配列が変化しないように発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３に挿入するため、ＰＣＲによってＫＭ１４６８のＶＨおよびＶＬｃＤＮＡを再構築した。プライマーとして、ＶＨｃＤＮＡ用に配列番号１１と１２の塩基配列をそれぞれ有する合成ＤＮＡを、ＶＬｃＤＮＡ用に配列番号１３と１４の塩基配列をそれぞれ有する合成ＤＮＡを設計した。それぞれの合成ＤＮＡは５’末端にｐＫＡＮＴＥＸ９３へクローニングするための制限酵素認識配列を含んでいる。実際には、実施例５（１−３）で得られたプラスミドｐＫＭ１４６８Ｈ５−２の２０ｎｇを５０μＬのＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ＃１（東洋紡績社製）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．５μＭの配列番号１１と１２に示した塩基配列を有する合成ＤＮＡを含む緩衝液に添加し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ社製）を用いて、９４℃にて３分間加熱した後、２．５単位のＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を添加し、９８℃にて１５秒間、６５℃にて２秒間、７４℃にて３０秒間のサイクルを２５サイクル行った。同様に、実施例５（１−３）で得られたプラスミドｐＫＭ１４６８Ｌ５−１の２０ｎｇを５０μＬのＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ＃１（東洋紡績社製）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．５μＭの配列番号１３と１４に示した塩基配列を有する合成ＤＮＡを含む緩衝液に添加し、上記と同様の方法でＰＣＲを行なった。それぞれの反応液１０μＬをアガロースゲル電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．５ｋｂのＶＨのＰＣＲ産物、約０．４３ｋｂのＶＬのＰＣＲ産物をそれぞれ回収した。
次に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＳｍａＩ（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ社製）で消化後、Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（以下、ＣＩＡＰと表記する；Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ社製）で末端を脱リン酸化して得られたＤＮＡ０．１μｇと、上記で得られたそれぞれのＰＣＲ産物約０．１μｇを滅菌水に加えて７．５μＬとし、ＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２のｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ社製）７．５μＬ、制限酵素ＳｍａＩ（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ社製）０．３μＬを加えて２２℃で一晩反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株より各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従い、反応を行い、塩基配列自動分析装置ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列を決定した。こうして目的の塩基配列を有する第１３図に示したプラスミドｐＫＭ１４６８ＶＨおよびｐＫＭ１４６８ＶＬを得た。
次に、上記で得られたｐＫＭ１４６８ＶＨのＶＨｃＤＮＡを含む制限酵素断片（ＮｏｔＩ−ＡｐａＩ）をヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３のＮｏｔＩ−ＡｐａＩ部位に挿入し、第１４図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１４６８Ｈを構築した。さらに、上記で得られたｐＫＭ１４６８ＶＬのＶＬｃＤＮＡを含む制限酵素断片（ＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ）をプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１４６８ＨのＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ部位に挿入し、第１４図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１４６８Ｃｈｉを構築した。プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１４６８Ｃｈｉを用いて、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従い、反応を行い、塩基配列自動分析装置ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてＶＨおよびＶＬｃＤＮＡの塩基配列を決定した結果、目的のＶＨおよびＶＬｃＤＮＡがクローニングされたプラスミドが得られたことを確認した。
（３）抗ｈＩＧＦキメラ抗体の動物細胞を用いた安定発現
実施例５（２−１）で得られた抗ｈＩＧＦキメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１４６８Ｃｈｉを用いて抗ｈＩＧＦキメラ抗体の動物細胞での発現を以下のようにして行った。
プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１４６８Ｃｈｉを制限酵素ＡａｔＩＩ（東洋紡績社製）で処理して直鎖状化した後、１０μｇを４×１０^６細胞のラットミエローマ細胞株ＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）へエレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３−１４０，１９９０）により導入後、４０ｍＬのＨ−ＳＦＭ（５）培地［ＦＣＳを５％含むＨ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）］に懸濁し、９６ウェル培養プレート（住友ベークライト社製）に２００μＬ／ウェルずつ分注した。３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で２４時間培養した後、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍＬになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、コンフルエントになったウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ｈＩＧＦキメラ抗体の濃度を実施例６（１）に示す結合ＥＬＩＳＡにより測定した。
培養上清中に抗ｈＩＧＦキメラ抗体の発現が認められたウェルの形質転換株については、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系を利用して抗体発現量を増加させる目的で、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍＬ、ｄｈｆｒ遺伝子産物のジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ＤＨＦＲと表記する）の阻害剤であるメソトレキセート（以下、ＭＴＸと表記する；ＳＩＧＭＡ社製）を５０ｎＭ含むＨ−ＳＦＭ（５）に１〜２×１０^５細胞／ｍＬになるように懸濁し、２４ウェル培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１ｍＬずつ分注した。３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で１〜２週間培養して、５０ｎＭ ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株がウェルにコンフルエントになった時点で培養上清中の抗ｈＩＧＦキメラ抗体の濃度を実施例６（１）に示す結合ＥＬＩＳＡにより測定した。培養上清中に抗ｈＩＧＦキメラ抗体の発現が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を１００ｎＭ、２００ｎＭと順次上昇させ、最終的にＧ４１８を０．５ｍｇ／ｍＬ、ＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＨ−ＳＦＭ（５）で増殖可能かつ、抗ｈＩＧＦキメラ抗体を高発現する形質転換株を得た。得られた形質転換株については、２回の限界希釈法による単一細胞化を行い、抗ｈＩＧＦキメラ抗体の発現の最も高い形質転換細胞株を得た。ＫＭ１４６８に由来する抗ｈＩＧＦキメラ抗体産生形質転換細胞株としては、ＫＭ３００２があげられる。なお、形質転換細胞株ＫＭ３００２は、平成１４年４月２日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６ 郵便番号 ３０５−８５６６）にＦＥＲＭ ＢＰ−７９９６として寄託されている。
（４）抗ｈＩＧＦキメラ抗体の培養上清からの精製
実施例５（３）で得られた抗ｈＩＧＦキメラ抗体を発現する形質転換細胞株ＫＭ３００２を、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍＬ、ＭＴＸを２００ｎＭ、Ｄａｉｇｏ’ｓ ＧＦ２１（和光純薬社製）を５％の濃度で含むＨ−ＳＦＭに１〜２×１０^５細胞／ｍＬとなるように懸濁し、１７５ｃｍ^２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１００ｍＬずつ分注した。３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で５〜７日間培養し、コンフルエントになった時点で培養上清を回収した。培養上清約１ＬよりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ｈＩＧＦキメラ抗体ＫＭ３００２を精製し、約１０．２ｍｇの精製蛋白質を取得した。得られた抗ｈＩＧＦキメラ抗体ＫＭ３００２の約４μｇを、公知の方法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５，１９７０）に従って電気泳動し、分子量および精製度を調べた。その結果を第１５図に示した。精製した抗ｈＩＧＦキメラ抗体ＫＭ３００２は、非還元条件下では分子量が約１５０キロダルトン（以下、Ｋｄと表記する）の１本のバンドが、還元条件下では約５０Ｋｄと約２５Ｋｄの２本のバンドが認められた。これらの分子量は、ＩｇＧクラスの抗体は、非還元条件下では分子量は約１５０Ｋｄであり、還元条件下では分子内のＳ−Ｓ結合が切断され、約５０Ｋｄの分子量を持つＨ鎖と約２５Ｋｄの分子量を持つＬ鎖に分解されるという報告（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，１９８８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）と一致し、抗ｈＩＧＦキメラ抗体ＫＭ３００２が正しい構造の抗体分子として発現されていることが確認された。また、精製した抗ｈＩＧＦキメラ抗体ＫＭ３００２のＨ鎖およびＬ鎖のＮ末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサーＰＰＳＱ−１０（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製）を用いて解析した結果、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８のＨ鎖およびＬ鎖のＮ末端アミノ酸配列と一致することを確認した。
実施例６抗ｈＩＧＦキメラ抗体ＫＭ３００２の反応性の検討
（１）抗ｈＩＧＦキメラ抗体ＫＭ３００２のｈＩＧＦに対する反応性
抗ｈＩＧＦラット抗体ＫＭ１４６８および実施例５（２−３）で精製した抗ｈＩＧＦキメラ抗体ＫＭ３００２のｈＩＧＦ−Ｉに対する反応性を実施例１（４）に示したＥＬＩＳＡにより検討した。ただし、ＥＬＩＳＡプレートに固定化したメチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉの濃度は、０．５μｇ／ｍＬ、二次抗体として、ラット抗体の場合は、４０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社製）、キメラ抗体の場合は、１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識マウス抗ヒトＩｇＧ１抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて行った。第１６図に示したように、抗ｈＩＧＦキメラ抗体ＫＭ３００２は、ｈＩＧＦ−Ｉに対する抗体濃度依存的な結合活性を示した。また、その活性は、二次抗体が異なるため、直接の比較は困難であるが、抗ｈＩＧＦラット抗体ＫＭ１４６８と同等であることが示唆された。
（２）抗ｈＩＧＦキメラ抗体ＫＭ３００２のｈＩＧＦ依存性細胞増殖に対する影響
抗ｈＩＧＦラット抗体ＫＭ１４６８、実施例５（２−３）で精製した抗ｈＩＧＦキメラ抗体ＫＭ３００２、市販の抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体であるｓｍ１．２（Ｕｐｓｔａｔｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）および市販の抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体であるＳ１Ｆ２（Ｕｐｓｔａｔｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）のｈＩＧＦ依存性細胞増殖に対する影響を実施例３（４）と同様の方法により検討した。ヒト癌細胞株としては、大腸癌細胞株ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３８）を用いた。
第１７図Ａには、２ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−Ｉ存在下、第１７図Ｂには、１０ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−ＩＩの存在下での、各抗体添加時の増殖を示した。第１７図に示したように、ＫＭ３００２は、ＫＭ１４６８と同様、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩによる細胞増殖を強く阻害し、その活性は、市販の抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体であるｓｍ１．２および市販の抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体であるＳ１Ｆ２よりも高かった。また、キメラ抗体であるＫＭ３００２と同一の可変領域を有する抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８は、同等の増殖阻害活性を示した。以上の結果は、ＫＭ１４６８に由来する抗ｈＩＧＦキメラ抗体ＫＭ３００２は、キメラ化後も元のラット抗体ＫＭ１４６８と同等の抗原結合活性および抗原結合特異性を保持していることを示している。
実施例７抗ｈＩＧＦ ＣＤＲ移植抗体の作製
（１）抗ｈＩＧＦ ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡの構築
（１−１）抗ｈＩＧＦ ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の設計
まず、抗ｈＩＧＦ ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。実施例５（１−４）で同定した抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８のＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体のＶＨのＦＲのアミノ酸配列を選択した。公的データベースより、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８のＶＨのＦＲと最も高い相同性を有するヒト抗体のＦＲを検索した結果、ＣＡＭ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，７７，３２３９−３２４３，１９８０）が最も高い相同性（８１．６％）を有していた。そこで、ＣＡＭのＦＲを基に抗ｈＩＧＦ ＣＤＲ移植抗体のＶＨを設計した。ＣＡＭのＦＲには、アミノ酸配列が一義的に決定されていない箇所が４箇所（１３番目、７４番目、７７番目、９０番目）存在し、また、ヒト抗体の配列において、一般的でないアミノ酸残基が、３番目と４０番目に認められた。そこで、これらのアミノ酸残基については、免疫原性をより低下させるため、ヒト抗体で高い頻度で認められるアミノ酸残基（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）へ改変した。このようにして設計したＣＡＭ由来のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８のＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、配列番号１５に記載の抗ｈＩＧＦ ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ．０を設計した。
次に、抗ｈＩＧＦ ＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。実施例５（１−４）で同定した抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８のＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体のＶＬのＦＲのアミノ酸配列を選択した。カバットらは、既知の様々なヒト抗体のＶＬをそのアミノ酸配列の相同性から４種類のサブグループ（ＨＳＧ Ｉ〜ＩＶ）に分類し、さらに、それら各サブグループ毎に共通配列を報告している（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）。それら共通配列は、ヒトにおいてより免疫原性が低下する可能性が考えられることから、それら共通配列を基に抗ｈＩＧＦ ＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列を設計することとした。より活性の高い抗ｈＩＧＦ ＣＤＲ移植抗体を作製するために、設計にあたってはヒト抗体のＶＬの４種類のサブグループの共通配列のＦＲのアミノ酸配列のうち、ＫＭ１４６８のＶＬのＦＲのアミノ酸配列と最も高い相同性を有するＦＲのアミノ酸配列を選択した。第２表には、相同性の検索結果を示した。第２表に示したように、ＫＭ１４６８のＶＬ領域のＦＲのアミノ酸配列はサブグループＩＶと最も高い相同性を有していた。

以上の結果から、ヒト抗体のＶＬのサブグループＩＶの共通配列のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８のＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、配列番号１６に記載の抗ｈＩＧＦ ＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ．０を設計した。
上記で設計した抗ｈＩＧＦ ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ．０およびＶＬのアミノ酸配列ＬＶ．０は、選択したヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列に抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８のＣＤＲのアミノ酸配列のみを移植した配列であるが、一般に、ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、ヒト以外の動物の抗体のＣＤＲのアミノ酸配列の移植のみでは活性が低下してしまうことが多く、それを回避するため、ヒト抗体とヒト以外の動物の抗体で異なっているＦＲのアミノ酸残基のうち、活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基をＣＤＲのアミノ酸配列とともに移植することが行われている。そこで、本実施例においても、活性に影響を与えると考えられるＦＲのアミノ酸残基を同定することを検討した。まず、上記で設計した抗ｈＩＧＦ ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ．０およびＶＬのアミノ酸配列ＬＶ．０よりなる抗体Ｖ領域（ＨＶ０ＬＶ０）の三次元構造をコンピューターモデリングの手法を用いて構築した。三次元構造座標作製に関してはソフトウェアＡｂＭ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社製）を、三次元構造の表示についてはソフトウェアＰｒｏ−Ｅｘｐｌｏｒｅ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社製）あるいはＲａｓＭｏｌ（Ｇｌａｘｏ社製）を用いてそれぞれ添付の使用説明書に従い、行った。また、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８のＶ領域の三次元構造のコンピューターモデルも同様にして構築した。更に、ＨＶ０ＬＶ０のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列において、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８と異なっている残基について順次、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８の相当する位置に見られる残基へ改変したアミノ酸配列からなる三次元構造モデルを同様にして構築し、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８、ＨＶ０ＬＶ０および改変体のＶ領域の三次元構造を比較した。その結果、ＨＶ０ＬＶ０のＦＲのアミノ酸残基の中で抗原結合部位の三次元構造を変化させ、抗体の活性に影響を与えると考えられる残基として、ＨＶ．０では１番目のＧｌｎ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇを、ＬＶ．０では１番目のＡｓｐ、９番目のＡｓｐ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、２２番目のＡｓｎ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＰｒｏ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＶａｌ、８４番目のＶａｌを選択した。これらの選択したアミノ酸残基のうち、少なくとも１つ以上をラット抗体ＫＭ１４６８に見られるアミノ残基へ改変し、様々な改変を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬを設計した。
（１−２）抗ｈＩＧＦ ＣＤＲ移植抗体のＶＨをコードするｃＤＮＡの構築
実施例６（１−１）で設計した抗ｈＩＧＦ ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ．０をコードするｃＤＮＡをＰＣＲを用いて以下のようにして構築した。
まず、設計したアミノ酸配列に配列番号２に記載の抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８のＨ鎖の分泌シグナル配列を繋げて完全な抗体アミノ酸配列とした。次に、該アミノ酸配列を遺伝子コドンに変換した。１つのアミノ酸残基に対して複数の遺伝子コドンが存在する場合は、抗体の遺伝子の塩基配列に見られる使用頻度（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）を考慮し、対応する遺伝子コドンを決定した。決定した遺伝子コドンを繋げて、完全な抗体Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列を設計し、更に５’末端と３’末端にＰＣＲ反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列（ヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列も含む）を付加した。設計した塩基配列を５’末端側から約１００塩基ずつ計６本の塩基配列に分け（隣り合う塩基配列は、その末端に約２０塩基の重複配列を有するようにする）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順で、合成オリゴヌクレオチドを合成した（ＧＥＮＳＥＴ社製）。
各オリゴヌクレオチドを最終濃度が０．１μＭとなるように５０μＬの反応液に加えて、０．５μＭ Ｍ１３ ｐｒｉｍｅｒ ＲＶ（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ社製）、０．５μＭ Ｍ１３ ｐｒｉｍｅｒ Ｍ４（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ社製）および１単位のＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を用いて、ＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに添付の使用説明書に従い、ＰＣＲを行った。この際の反応条件は使用説明書に記された条件（９４℃ ３０秒間、５０℃ ３０秒間、７４℃ ６０秒間のサイクルを３０サイクル）に従った。該反応液をエタノール沈殿した後、滅菌水に溶解し、適当な制限酵素処理を行った後に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に連結した。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、形質転換株の株よりプラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列を解析した結果、目的の塩基配列を有するプラスミドを得た。
次に、実施例６（１−１）で設計したＦＲのアミノ酸残基の改変は、変異を有する合成オリゴヌクレオチドを作製し、上記のＰＣＲを行うか、上記で作製したＨＶ．０をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡを鋳型として変異を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行い、増幅断片を単離することで達成した。改変後のアミノ酸残基の遺伝子コドンについては、ラット抗体ＫＭ１４６８で見られる遺伝子コドンとなるように行った。
（１−３）抗ｈＩＧＦ ＣＤＲ移植抗体のＶＬをコードするｃＤＮＡの構築
実施例６（１−１）で設計した抗ｈＩＧＦ ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列ＬＶ．０をコードするｃＤＮＡをＰＣＲを用いて以下のようにして構築した。
まず、設計したアミノ酸配列に配列番号４に記載の抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８のＬ鎖の分泌シグナル配列を繋げて完全な抗体アミノ酸配列とした。次に、該アミノ酸配列を遺伝子コドンに変換した。１つのアミノ酸残基に対して複数の遺伝子コドンが存在する場合は、抗体の遺伝子の塩基配列に見られる使用頻度（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）を考慮し、対応する遺伝子コドンを決定した。決定した遺伝子コドンを繋げて、完全な抗体Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列を設計し、更に５’末端と３’末端にＰＣＲ反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列（ヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列も含む）を付加した。設計した塩基配列を５’末端側から約１００塩基ずつ計６本の塩基配列に分け（隣り合う塩基配列は、その末端に約２０塩基の重複配列を有するようにする）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順で、合成オリゴヌクレオチドを合成した（ＧＥＮＳＥＴ社製）。
各オリゴヌクレオチドを最終濃度が０．１μＭとなるように５０μＬの反応液に加えて、０．５μＭ Ｍ１３ ｐｒｉｍｅｒ ＲＶ（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ社製）、０．５μＭ Ｍ１３ ｐｒｉｍｅｒ Ｍ４（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ社製）および１単位のＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を用いて、ＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに添付の使用説明書に従い、ＰＣＲを行った。この際の反応条件は使用説明書に記された条件（９４℃ ３０秒間、５０℃ ３０秒間、７４℃ ６０秒間のサイクルを３０サイクル）に従った。該反応液をエタノール沈殿した後、滅菌水に溶解し、適当な制限酵素処理を行った後に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に連結した。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、形質転換株よりプラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列を解析した結果、目的の塩基配列を有するプラスミドを得た。
次に、実施例６（１−１）で設計したＦＲのアミノ酸残基の改変は、変異を有する合成オリゴヌクレオチドを作製し、上記のＰＣＲを行うか、上記で作製したＬＶ．０をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡを鋳型として変異を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行い、増幅断片を単離することで達成した。改変後のアミノ酸残基の遺伝子コドンについては、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８で見られる遺伝子コドンとなるように行った。
（２）抗ｈＩＧＦ ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
ＷＯ９７／１０３５４に記載のヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３の適当な位置に実施例６（１−２）および実施例（１−３）で得られたＨＶ．０およびＬＶ．０をコードするｃＤＮＡおよびそれらの改変体をコードするｃＤＮＡを挿入し、各種抗ｈＩＧＦ ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築した。
（３）抗ｈＩＧＦ ＣＤＲ移植抗体の動物細胞を用いた安定発現
抗ｈＩＧＦ ＣＤＲ移植抗体の動物細胞を用いた安定発現および培養上清からの抗体の精製は、上記実施例５（３）に記載の方法に従い行った。
産業上の利用可能性
本発明は、ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有し、かつ、バイオセンサービアコアで測定される結合定数が５×１０^９Ｍ^−１以上の結合活性を有する抗体を提供することを目的とする。さらに、本発明は、該抗体を用いるヒトＩＧＦ介在性疾患または異常なヒトＩＧＦの産生亢進により病態が進行する疾患の診断薬、予防薬および治療薬を提供することを目的とする。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
第１図は、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体のｈＩＧＦ−Ｉに対する特異的な反応性を示す（結合ＥＬＩＳＡ）。
第２図は、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体の液相系における天然の立体構造を有するｈＩＧＦ−Ｉに対する反応性を示す（競合ＥＬＩＳＡ）。
第３図は、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−Ｉに対する結合における各種ペプチドによる阻害活性を示す。横軸が各種ペプチド濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸が結合活性（％）を示す。用いた各種ペプチドについては、図中に示した。
第４図は、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩへの結合に対する、ｈＩＧＦ−Ｉ、ｈＩＧＦ−ＩＩおよびヒトインスリンでの阻害活性を示した図である。ＡがＫＭ１４６８とｈＩＧＦ−Ｉとの結合、ＢがＫＭ１４６８とｈＩＧＦ−ＩＩとの結合に対する各因子による阻害をそれぞれ示す。横軸が各種因子濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸が因子非添加時を１００％としたときの結合活性（％）を示す。■がｈＩＧＦ−Ｉ、○がｈＩＧＦ−ＩＩ、△がヒトインスリンを添加したときの反応性をそれぞれ示す。
第５図は、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８、ｓｍ１．２およびＳ１Ｆ２のｈＩＧＦおよびヒトインスリンによるヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７の増殖に対する影響を示す。Ａが各因子による細胞増殖活性を示す。横軸が各種因子濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸が増殖（ＯＤ４５０）を示す。○がｈＩＧＦ−Ｉ、●がｈＩＧＦ−ＩＩ、□がヒトインスリンの活性をそれぞれ示す。ＢがｈＩＧＦ−Ｉ、ＣがｈＩＧＦ−ＩＩ、Ｄがヒトインスリンによる増殖活性に対する各種抗体の影響をそれぞれ示す。横軸が抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸が増殖（ＯＤ４５０）をそれぞれ示す。細点線は抗体非添加時の増殖を、点線は各因子非添加時の増殖をそれぞれ示す。○がＫＭ１４６８、□がｓｍ１．２、■がＳ１Ｆ２の活性をそれぞれ示す。
第６図は、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８、ｓｍ１．２およびＳ１Ｆ２のｈＩＧＦおよびヒトインスリンによるヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９の増殖に対する影響を示す。Ａが各因子による細胞増殖活性を示す。横軸が各種因子濃度（ｎｇ／ｍＬ）、縦軸が増殖（ＯＤ４５０）を示す。○がｈＩＧＦ−Ｉ、●がｈＩＧＦ−ＩＩ、□がヒトインスリンの活性をそれぞれ示す。ＢがｈＩＧＦ−Ｉ、ＣがｈＩＧＦ−ＩＩ、Ｄがヒトインスリンによる増殖活性に対する各種抗体の影響をそれぞれ示す。横軸が抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸が増殖（ＯＤ４５０）をそれぞれ示す。細点線は抗体非添加時の増殖を、点線は各因子非添加時の増殖をそれぞれ示す。○がＫＭ１４６８、□がｓｍ１．２、■がＳ１Ｆ２の活性をそれぞれ示す。
第７図は、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８、ｓｍ１．２およびＳ１Ｆ２のｈＩＧＦおよびヒトインスリンによるヒト骨肉腫細胞株ＭＧ６３の増殖に対する影響を示す。Ａが各因子による細胞増殖活性を示す。横軸が各種因子濃度（ｎｇ／ｍＬ）、縦軸が増殖（ＯＤ４５０）を示す。○がｈＩＧＦ−Ｉ、●がｈＩＧＦ−ＩＩ、□がヒトインスリンの活性をそれぞれ示す。ＢがｈＩＧＦ−Ｉ、ＣがｈＩＧＦ−ＩＩ、Ｄがヒトインスリンによる増殖活性に対する各種抗体の影響をそれぞれ示す。横軸が抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸が増殖（ＯＤ４５０）をそれぞれ示す。細点線は抗体非添加時の増殖を、点線は各因子非添加時の増殖をそれぞれ示す。○がＫＭ１４６８、□がｓｍ１．２、■がＳ１Ｆ２の活性をそれぞれ示す。
第８図は、プラスミドｐＢＳ（ＩＩ）ＳＫ（−）／ｈＩＧＦ−ＩおよびｐＫＡＮＴＥＸ９３／ｈＩＧＦ−Ｉの造成工程を示した図である。
第９図は、Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞におけるｈＩＧＦ−Ｉの発現を示した図である。Ａは、組換えｈＩＧＦ−Ｉ蛋白質による阻害度を示す。横軸は添加した組換えｈＩＧＦ−Ｉ蛋白質の濃度、縦軸は発色（ＯＤ４１５）を示す。Ｂは、Ａ５４９細胞およびＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞の培養上清中に含まれるｈＩＧＦ−Ｉを示す。白抜きはＡ５４９細胞、網掛けはＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞をそれぞれ示す。
第１０図は、ＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−Ｉ発現細胞に対する細胞増殖阻害効果を示す。破線は抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８非添加のＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞の増殖性を、実線は抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８非添加のＡ５４９細胞の細胞増殖をそれぞれ示す。■は抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８を添加したＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞の増殖性を、○は抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８を添加したＡ５４９細胞の増殖性をそれぞれ示す。
第１１図は、ＫＭ１４６８の足場非依存性増殖阻害効果を示した図である。図中の白抜きのカラムはＡ５４９細胞のコロニー形成数を、網掛けのカラムはＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞の形成数を、黒塗りのカラムは抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８を添加したＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞の形成数をそれぞれ示す。
第１２図は、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８の抗腫瘍効果を示した図である。横軸は腫瘍移植後の経過日数を、縦軸は腫瘍体積をそれぞれ示す。Ａ５４９細胞を移植したマウスのうち、●は抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８非添加時を、○は抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８添加時をそれぞれ示す。Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞を移植したマウスのうち、■は抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８非添加時を、□は抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８添加時をそれぞれ示す。
第１３図は、プラスミドｐＫＭ１４６８ＶＨおよびｐＫＭ１４６８ＶＬの造成工程を示した図である。
第１４図は、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１４６８Ｃｈｉの造成工程を示した図である。
第１５図は、精製した抗ｈＩＧＦキメラ抗体ＫＭ３００２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１５％グラジエントゲルを使用）の電気泳動パターンを示した図である。左側が非還元条件、右側が還元条件でそれぞれ電気泳動を行った図である。レーンＭが非還元時は高分子量マーカーおよび還元時は低分子量マーカー、レーン１がＫＭ３００２の泳動パターンをそれぞれ示す。
第１６図は、抗ｈＩＧＦラット抗体ＫＭ１４６８および抗ｈＩＧＦキメラ抗体ＫＭ３００２のｈＩＧＦ−Ｉに対する反応をそれぞれ示す。横軸が抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸が結合活性（ＯＤ４１５）をそれぞれ示す。○がＫＭ１４６８、●がＫＭ３００２の反応性をそれぞれ示す。
第１７図は、、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８、ｓｍ１．２、Ｓ１Ｆ２および抗ｈＩＧＦキメラ抗体ＫＭ３００２のｈＩＧＦによるヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９の増殖に対する影響を示す。ＡがｈＩＧＦ−Ｉ、ＢがｈＩＧＦ−ＩＩによる増殖活性に対する各種抗体の影響を示す。横軸が抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸が増殖（ＯＤ４５０）をそれぞれ示す。細点線は抗体非添加時の増殖を、点線は各因子非添加時の増殖をそれぞれ示す。○がＫＭ１４６８、●がＫＭ３００２、△がｓｍ１．２、▲がＳ１Ｆ２の活性をそれぞれ示す。
以下に実施例により、本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

Claims (24)

1. ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有し、かつ、バイオセンサービアコアで測定される結合定数が５×１０^９ Ｍ^−１以上の結合活性を有する抗体またはその抗体断片。
2. ヒトＩＧＦ−Ｉに対する結合活性とヒトＩＧＦ−ＩＩに対する結合活性とが同程度である請求の範囲第１項に記載の抗体またはその抗体断片。
3. 抗体またはその抗体断片の重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号５、６および７、および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号８、９および１０で示されるアミノ酸配列を含む、請求の範囲第１項または第２項に記載の抗体またはその抗体断片。
4. 抗体が、ヒト以外の動物の抗体または遺伝子組換え抗体である、請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片。
5. 遺伝子組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体およびヒト抗体からなる群から選ばれる、請求の範囲第４項に記載の抗体またはその抗体断片。
6. ヒト以外の動物の抗体のＶＨが配列番号２、および／またはＶＬが配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む、請求の範囲第４項に記載の抗体またはその抗体断片。
7. ヒト以外の動物の抗体が、ハイブリドーマＫＭ１４６８（ＦＥＲＭ ＢＰ−７９７８）により生産される請求の範囲第３項または第６項に記載の抗体またはその抗体断片。
8. ヒト型キメラ抗体のＶＨが配列番号２、および／またはＶＬが配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む、請求の範囲第５項に記載の抗体またはその抗体断片。
9. ヒト型キメラ抗体が、ＫＭ１４６８（ＦＥＲＭ ＢＰ−７９７８）より生産される抗体のＶＨおよび／またはＶＬを含む、請求の範囲第５項または第８項に記載の抗体またはその抗体断片。
10. ヒト型キメラ抗体が、ヒト抗体の定常領域を含む、請求の範囲第５項、８および９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片。
11. ヒト抗体の定常領域が、ヒト抗体ＩｇＧ１クラスおよび／またはκクラスの定常領域からなる請求の範囲第１０項に記載の抗体またはその抗体断片。
12. ヒト型キメラ抗体が、形質転換株ＫＭ３００２（ＦＥＲＭ ＢＰ−７９９６）により生産される請求の範囲第５項、第８項〜第１１項のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片。
13. ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号５、６および７、および／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号８、９および１０で示されるアミノ酸配列を含む、請求の範囲第４項に記載の抗体またはその抗体断片。
14. ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、ＫＭ１４６８（ＦＥＲＭ ＢＰ−７９７８）により生産される抗体のＶＨのＣＤＲおよび／またはＫＭ１４６８（ＦＥＲＭ ＢＰ−７９７８）により生産される抗体のＶＬのＣＤＲを含む、請求の範囲第５項または第１３項に記載の抗体またはその抗体断片。
15. ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、ヒト抗体の定常領域を含む、請求の範囲第４項、第１３項および第１４項のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片。
16. ヒト抗体の定常領域が、ヒト抗体ＩｇＧ１クラスおよび／またはκクラスの定常領域からなる請求の範囲第１５項に記載の抗体またはその抗体断片。
17. 抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である請求の範囲第１項〜第１６項のいずれか１項に記載の抗体断片。
18. 請求の範囲第１項〜第１７項のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片をコードするＤＮＡ。
19. 請求の範囲第１８項に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
20. 請求の範囲第１９項に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
21. 請求の範囲第２０項に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に請求の範囲第１項〜第１６項のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片を生成蓄積させ、培養物から抗体またはその抗体断片を採取することを特徴とする抗体またはその抗体断片の製造方法。
22. 請求の範囲第１項〜第１７項のいずれか１項に記載の抗体およびその抗体断片から選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有する医薬。
23. 請求の範囲第１項〜第１７項のいずれか１項に記載の抗体およびその抗体断片から選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有するヒトＩＧＦ介在性疾患または異常なヒトＩＧＦの産生亢進により病態が進行する疾患の治療薬。
24. 請求の範囲第１項〜第１７項のいずれか１項に記載の抗体およびその抗体断片から選ばれる少なくとも１種を含有するヒトＩＧＦ介在性疾患または異常なヒトＩＧＦの産生亢進により病態が進行する疾患の診断薬。

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