KR101412649B1 - 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 바이오마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은 에리스로포이에틴 및 제대혈 투여에 따른 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 분석용 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 에리스로포이에틴 및 제대혈 투여에 따른 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 마커를 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명을 이용하면 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화를 효과적으로 모니터링 할 수 있다.

Description

뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 바이오마커{Biomarker Indicative of Reduce or Alleviation of Symptom of Brain Injury}

본 발명은 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 바이오마커에 관한 것이다.

뇌 세포들의 파괴 또는 퇴화를 의미하는 뇌손상(brain injury)은 비교적 빈번하고 광범위하게 일어난다. 뇌손상은 광범위한 내적 및 외적 요인들에 의해 일어나는데, 가장 많은 수의 손상을 포함하는 흔한 유형은 외부 원인으로부터의 물리적인 외상 또는 두부 손상에 따른 외상성 뇌손상(TBI)이며, 생후에 발생하는 뇌손상을 선천성 장애로부터 기인한 손상과 구별하기 위하여 후천적 뇌손상(ABI)이라고 불린다. 뇌손상은 장기적 저산소증, 알코올을 포함한 기형 발생물질들에 의한 중독, 감염 및 신경학적 질병 등이 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 또한, 화학요법(chemotherapy)은 신경줄기세포 및 미엘린(myelin)을 생성하는 올리고덴드로사이트(oligodendrocyte)에 손상을 입힐 수도 있다. 이 외에도 뇌손상의 흔한 원인으로는 외상적 뇌손상, 뇌졸중, 동맥류, 수술, 기타 신경학적 장애, 및 중금속 중독 등과 같은 생리적 외상이 있을 수 있다.

뇌졸중은 크게 2가지로 나누는데, 뇌조직으로 가는 혈액 공급의 감소 혹은 차단으로 뇌조직의 허혈상태로 발생하는 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke)과 혈관이 터져 뇌조직으로 출혈을 일으키는 출혈성 뇌졸중(hemorrhagic stroke)으로 구분하고 있으며, 허혈성 뇌졸중은 전체 뇌졸중 환자의 약 80% 정도를 차지하고 환자의 약 3분의 1은 사망하는 심각한 질환이라고 할 수 있다. 특히 상기 허혈성 뇌졸중은 동맥 혈액 유입의 폐쇄에 의해 유발되는 혈액의 불충분한 뇌 순환으로부터 발생한다. 통상적으로, 적절한 뇌 혈액 공급은 뇌 내부의 동맥 체계에 의해 보장된다. 그러나 염증 및 죽상동맥경화증을 포함하는 다양한 질환은 혈전, 즉, 혈관에 생성되는 혈괴를 발생시킬 수 있다. 혈전은 동맥 혈류를 방해하여, 뇌 허혈 및 후속적인 신경 증상을 일으킬 수 있다. 허혈성 뇌졸중은 또한 심장에서 형성된 혈전의 조각인 색전이 혈관을 차단함으로써 발생될 수 있고, 부적절한 뇌 혈류와 함께 감소된 관류 압력 또는 증가된 혈액 점성을 유발한다.

상기 뇌졸중에 이용 가능한 두 가지 치료법이 있다. 하나는 혈류를 증가시킴으로써 동맥에서의 산소 및 글로코오스의 결핍을 완화시키는 것이고, 다른 하나는 대뇌 허혈 및 흥분독성에 의해 유도되는 신경 파괴를 차단하는 것을 통해 뉴런을 보호하는 것이다. 임상적으로 이용되는 뉴런 보호제는 칼슘 채널 차단체, 글루타메이트 수용체의 일종인 NMDA 수용체 길항제 등이 있다. 그러나 상기 치료방법은 효능이 낮은 반면에 부작용 발생률이 높아 상기 치료제의 효력을 증가시킬 수 있고 동시에 정상조직에 미치는 부작용을 크게 줄일 수 있는 방법의 개발이 절실하게 필요한 상황이다.

뇌성마비(Cerebral palsy, CP) 역시 뇌손상의 한 형태로서 뇌성숙이 이루어지지 않은 태아기, 혹은 영아기에서 뇌의 손상이 일어난 경우에 발생한다. 뇌성마비는 운동 및 자세 발달 손상을 포함하는 장애의 하나로 태아 또는 유아기에 뇌에 다양한 비진행성 손상을 입어 발생하게 된다. 뇌성마비에서 운동 장애는 흔히 감각, 인지, 의사소통, 사시, 시지각 및 행동 장애를 동반한다(Bax M et al., Dev Med Child Neurol 47:571-576(2005)). 뇌성마비에 대한 치료법은 신체, 노동, 언어 및 심리 치료를 포함하는 재활 치료이다. 그 밖에 다른 치료 방법으로 항-뇌성마비 약물, 보툴리누스균의 주사, 정형외과 수술, 보조기 등이 있다. 이렇게 많은 치료를 하여도 현재까지는 뇌성마비에 대한 획기적이고 근본적인 치료 방법은 없는 실정이다.

최근 연구들은 뇌 가소성의 가능성을 자극함으로써 잠재적 효과를 나타낼 수 있다고 보고하고 있으며, 이것은 뇌손상 환자에서 긍정적인 효과를 나타낸다(Harvey RL., Phys Med Rehabil Clin N Am 14:S1-S5(2003), Wittenberg GF., Dev Med Child Neurol 51(Suppl 4):130-133(2009)). 성인에서보다는 소아의 뇌가 보다 높은 잠재적 가소성을 갖는다고 생각되어지는데, 예를 들면 뇌손상이 있는 어린 랫트(생후 10일)가 뇌손상이 있는 늙은 랫트(생후 63일 또는 180일)에 비해 보다 빠르고 완전한 뇌손상 회복을 나타낸다(Yager JY et al., Behav Brain Res 173:171-180(2006)). 즉, 초기 진단 및 즉각적인 재활치료가 뇌 가소성을 자극하여 손상된 뇌를 최대로 개선시킴으로써 뇌손상 치료에 효과적인 결과를 가져올 수 있다고 볼 수 있다. 따라서 뇌성마비 유아의 초기 치료 프로그램은 운동 및 인지 발달에 있어 유익한 효과를 가져온다(Blauw-Hospers CH et al., Neurosci Biobehav Rev 31:1201-1212(2007)).

뇌 가소성 요소들을 증대시키는 것은 특히 유아기 재활치료의 효과를 극대화시킬 수 있을 것이다. 최근, 에리스로포이에틴(erythropoietin, EPO), G-CSF(granulocyte colony-stimulating growth factor) 및 GM-CSF(granulocyte-macrophage colony stimulating factor)가 뇌 가소성을 증대시키는 임상학적 능력을 갖는다는 것이 알려졌다(Maurer MH et al., Curr Med Chem 15:1407-1411(2008)). 또한, 다른 신경 성장 인자, 섬유아세포 성장인자-2 및 8, 상피세포 성장인자, 소닉 헤지호그, 뼈 형태형성 단백질 4, 뇌유래 신경성장 인자 및 혈관내피 세포성장 인자가 신경보호 효과 및 신경재생 효과를 갖고 있다는 것이 알려졌다. 이러한 분자들 가운데 재조합 인간 에리스로포이에틴(recombinant human EPO, rhEPO)는 임상적 유효성 및 가장 적은 부작용을 나타내기 때문에 뇌성마비 유아에게 더욱 효과적일 수 있다. 동물실험에서 rhEPO는 뇌 허혈(Iwai M et al., Stroke 38:2795-2803(2007)), 산소과다-유도 뇌세포 사멸(Kaindl AM et al., Ann Neurol 64:523-534(2008)) 및 지질다당질-유도 백질 손상을 입은 신생아(Kumral A et al., Neonatology 92:269-278(2007))에서 신경보호 효과를 나타내었다. 또한, rhEPO는 혈관형성 효과(Marti HH et al., News Physiol Sci 15:225-229(2000))를 갖는다는 것이 알려져 있으며 신생아 뇌졸중 환자에서 신경발생을 증가시킨다(Gonzalez FF et al., Dev Neurosci 29:321-330(2007)). 더욱이 중환자실에 있는 초미숙아에게 rhEPO를 투여하면 신경발달을 개선된다(Neubauer AP et al., Ann Neurol 67:657-666(2010)).

최근, 혈액-뇌 장벽(blood-brain-barrier)을 통과시켜 뇌에 신경보호 약물인 에리스로포이에틴(erythropoietin, EPO)을 전달시키는데 성공하였고(Zhou QH et al., Mol Pharm. 7(6):2148-55(2010)), 이를 통해 뇌졸중 등에 의해서 발생하는 뇌 손상을 조기에 효과적으로 대처하는데 도움이 될 것으로 기대되고 있으며, 다른 외상성 뇌 손상, 파킨슨병, 만성 뇌질환에도 적용될 수 있을 것으로 기대되고 있다.

EPO는 신장에서 생산되는 당단백질 호르몬으로 적혈구 생성을 촉진하여 빈혈이나 암 치료를 받는 환자들에게 도움을 준다. 백만 명 이상의 암환자와 신장 기능 손상이 있는 환자들은 낮은 적혈수 수치 때문에 EPO를 투여하고 있으며, 전세계의 연간 판매액은 90억 달러에 이르고 있다. 또한, EPO를 투여한 어린 마우스들은 학습 능력을 포함하여 뇌기능이 향상되었으며, EPO를 투여한 만성 신부전 환자들에서 인지기능이 향상된다고 보고되는 등 EPO는 뇌에서도 좋은 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.

또한, EPO, G-CSF(granulocyte colony-stimulating growth factor) 및 GM-CSF(granulocyte-macrophage colony stimulating factor)가 뇌 가소성을 증대시키는 임상학적 능력을 갖는다는 것이 보고되었으며(Maurer MH et al., Curr Med Chem 15:1407-1411(2008)) 다른 신경 성장 인자, 섬유아세포 성장인자-2 및 8, 상피세포 성장인자, 소닉 헤지호그, 뼈 형태형성 단백질 4, 뇌유래 신경성장 인자 및 혈관내피 세포성장 인자가 신경보호 효과 및 신경재생 효과를 갖고 있다는 것이 알려졌다. 이러한 분자들 가운데 재조합 인간 에리스로포이에틴(recombinant human EPO, rhEPO)는 임상적 유효성 및 가장 적은 부작용을 나타내기 때문에 뇌졸중, 외상성 뇌 손상, 파킨슨병 및 만성 뇌질환에 효과적일 수 있다. 동물실험에서 rhEPO는 뇌 허혈(Iwai M et al., Stroke 38:2795-2803(2007)), 산소과다-유도 뇌세포 사멸(Kaindl AM et al., Ann Neurol 64:523-534(2008)) 및 지질다당질-유도 백질 손상을 입은 신생아(Kumral A et al., Neonatology 92:269-278(2007))에서 신경보호 효과를 나타내었다. 또한, rhEPO는 혈관형성 효과(Marti HH et al., News Physiol Sci 15:225-229(2000))를 갖는다는 것이 알려져 있으며 신생아 뇌졸중 환자에서 신경발생을 증가시킨다(Gonzalez FF et al., Dev Neurosci 29:321-330(2007)). 더욱이 중환자실에 있는 초미숙아에게 rhEPO를 투여하면 신경발달을 개선된다(Neubauer AP et al., Ann Neurol 67:657-666(2010)).

제대혈은 아기가 태어날 때 탯줄과 태반에 들어있는 혈액으로, 혈액을 만드는 기본 세포인 조혈모세포 및 연골, 뼈, 근육, 신경 등 인체 각 부분으로 분화할 수 있는 간엽줄기세포가 풍부해 줄기세포를 이용한 치료에 사용된다. 현재 3상 임상시험이 진행되고 있는 연골 손상 및 퇴행성 관절염 치료제(카티스템)의 경우 손상된 연골을 완벽하게 재생시키는 치료효과가 임상시험에서 입증돼 머지않아 기존 인공관절 수술을 상당부분 대치할 것으로 기대되며 뇌졸중, 루게릭병, 알츠하이머병 등 만성 퇴행성 신경계 질환도 제대혈 줄기세포를 이용한 치료가 효과적이라는 사실이 동물실험에서 확인돼 현재 임상시험을 준비 중이다. 기본적으로 조혈모세포 이식이 필요한 질병은 모두 제대혈 치료가 가능하고, 백혈병 등의 암과 악성 혈액질환, 선천성 대사장애, 면역장애 질환 등 난치병 치료에 주로 사용되며, 뇌성마비 치료에도 제대혈 이식이 시행되고 있다.

제대혈에는 피를 만드는 조혈모세포뿐 아니라 혈관을 재생하는 전구세포와 신경세포를 재생시키는 간엽줄기세포가 풍부하다. 이런 줄기세포들이 허혈성 뇌성마비의 주요 원인인 손상된 뇌조직의 기능 회복 및 재생에 도움을 준다. 이는 임상시험에서 입증된 사실이며, 미국의 경우 1998년부터 뇌성마비나 두부 손상 등 각종 뇌질환 치료에 본인의 제대혈을 이식하는 치료를 활발히 시행하고 있으며, 독일·중국·태국·멕시코·러시아에서도 제대혈로 뇌성마비 등 뇌질환을 치료하고 있다. 물론 국내에서도 최근 뇌성마비 환자를 대상으로 한 자가 제대혈 이식치료가 이뤄져 주목을 받은 바 있으며 분당차병원에서는 뇌성마비 환자를 위한 동종 타가 제대혈과 적혈구 생성인자 치료에 대한 대규모 임상시험을 시행하여 성과를 거두었다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 분석을 위한 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, BDNF(brain-derived neurotrophic factor)가 에리스로포이에틴 및 제대혈 투여에 의한 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화를 모니터링 할 수 있고 예후를 판정할 수 있는 마커임을 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 분석용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 마커를 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 서열목록 제2서열의 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 분석용 키트를 제공한다.

본 발명자들은 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 분석을 위한 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였으며, 그 결과, BDNF가 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화를 모니터링 할 수 있고 예후를 판정할 수 있는 마커임을 규명하였다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화는 에리스로포이에틴 및 제대혈 투여에 의해 유도될 수 있다.

본 발명의 BDNF는 에리스로포이에틴 및 제대혈을 투여한 뇌 손상 환자에게서 특이적으로 발현된다. 더욱이 BDNF는 에리스로포이에틴 및 제대혈을 투여하지 않은 뇌 손상 환자와 에리스로포이에틴 및 제대혈을 투여한 뇌 손상 환자를 구별할 수 있는 능력, 즉 에리스로포이에틴 및 제대혈을 투여한 뇌 손상 환자에게서 고발현되는 발현 패턴을 나타내는 마커이다.

본 발명의 BDNF는 뇌 손상 환자에 에리스로포이에틴 및 제대혈을 투여한 후 초기(24시간 이내)에는 저발현되는 패턴을 나타내며, 투여 후 시간이 경과되면(6개월 이후)에 고발현되는 패턴을 나타낸다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, BDNF는 에리스로포이에틴 및 제대혈 투여에 대한 장기간(long-term) 모니터링으로 시술 시기와 그 정도를 평가하는 마커로서 이용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 뇌 손상 환자에 에리스로포이에틴 및 제대혈을 투여하면 뇌 손상 증세가 경감 또는 완화된다.

본 발명의 명세서에서 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화는 뇌 손상의 증세를 나타내는 지표들이 증세가 개선되는 방향으로 변화한 것을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현에에 따르면, 본 발명의 뇌 손상은 뇌성마비, 뇌졸중, 외상성 뇌 손상 및 파킨슨병으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 질환을 포함한다.

본 발명에서 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제는 예를 들어, 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)이다.

본 발명의 명세서에서 용어 “모니터링”은 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 확인 하는 것을 의미한다.

본 발명의 명세서에서 용어 “예후”는 질병의 진행 가능성 과정, 특히, 질병의 차도, 질병의 재생, 종양 재발, 전이 및 죽음 가능성 측면에서의 예측을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에서의 예후는 뇌 손상 환자의 증세가 개선될 가능성을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 키트는 면역분석(immunoassay) 방식, 즉 항원-항체 반응 방식으로 실시될 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시된다.

본 발명에서 “항체”란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

상기한 바와 같이 새로운 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 마커 단백질이 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.

본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology , 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol . Biol ., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol . Biol ., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

본 발명에서 앱타머는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med . 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA . 95(24):142727(1998)에 상세하게 개시되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트일 수 있다. 가장 바람직하게는 상기 키트는 루미넥스 분석 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 또는 ELISA 키트이다.

상기 루미넥스 어세이 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 및 엘라이자 키트는 상기 단백질군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 단백질에 대한 다클론 항체 및 단일클론 항체, 그리고 표지물질이 결합된 상기 다클론 항체와 단일클론 항체에 대한 2차 항체를 포함한다.

본 발명에서 키트의 종류의 예로는 면역크로마토그래피 스트립 키트, 루미넥스 어세이 키트, 단백질 마이크로어레이 키트, 엘라이자 키트, 또는 면역학적 도트 키트등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명에서 사용 가능한 키트의 종류가 제한되는 것은 아니다.

상기 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단일클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

또한, 상기 키트는 복합마커를 동시에 분석하기 위하여 단백질 마이크로어레이를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. 마이크로어레이 키트는 고체상에 결합된 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단일클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 단백질 마이크로어레이 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 단백질 마이크로어레이 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 융합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 단백질 마이크로어레이를 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화 판단에 필요한 정보를 제공할 수 있다.

루미넥스 어세이(Luminex Assay)는 소량(10-20 ㎕)의 환자 시료를 전 처리하지 않은 상태에서 최대 100종류의 어낼라이트(analyte)를 동시에 측정할 수 있는 고용량(high-throughput) 정량분석방법으로서 감도가 좋고(pg단위), 빠른 시간내에 정량이 가능하여(3-4시간), 기존의 엘라이자(ELISA)나 엘리스팟(ELISPOT)을 대체할 수 있는 분석방법이다. 상기 루미넥스 어세이(Luminex Assay)는 96-웰 플레이트(well plate)에 있는 각각의 웰에서 100가지 이상의 생물학적 시료를 동시에 분석할 수 있는 멀티플렉스 형광 마이크로플레이트(multiplexed fluorescent microplate) 분석방법으로 두 종류의 레이져 감지기(laser detector)를 사용하여 실시간으로 신호전달을 진행시킴으로 100개 이상의 다른 색깔 군의 폴리스티렌 비드(polystyrene bead)를 구별하여 정량한다. 상기 100개의 비드는 다음과 같은 방법으로 구별되도록 구성된다. 한쪽은 붉은 형광 비드(red fluorescence bead)가 열 단계 이상으로 나뉘어 있고, 다른 한 쪽은 오렌지 형광 비드(orange fluorescence bead)가 열 단계로 나뉘어 강도(intensity)의 차이를 보이며 그 사이의 비드(bead)들은 레드(red)와 오렌지(orange)의 비율(ratio)이 각각 다른 비율로 섞여 있어 전체적으로 100개의 색-코드 비드 세트(color-coded bead set)를 구성하고 있다. 또한 각각의 비드에는 분석하고자 하는 단백질의 항체가 부착되어 있어 이를 이용한 면역항체반응으로 단백질 정량이 가능하다. 이 시료는 두개의 레이저(laser)를 사용하여 분석하는데, 하나의 레이저(laser)는 비드(bead)를 감지(detection)하여 비드 고유번호를 알아내고, 다른 레이저는 비드에 붙어 있는 항체와 반응한 시료 속의 단백질을 감지하게 된다. 따라서 한 웰에서 동시에 100가지의 생체 내 단백질 분석이 가능하다. 이 분석은 15 ㎕ 정도의 적은 시료로도 감지가 가능한 장점이 있다.

본 발명의 루미넥스(Luminex) 어세이를 수행할 수 있는 루미넥스(Luminex) 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단일클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 루미넥스 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 루미넥스 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 접합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 상기 항체는 미소입자(micro particle)와 접합된 항체(conjugated antibody)일 수 있으며, 또한 상기 미소입자는 착색된 라텍스(colored latex) 또는 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)일 수 있다.

본 발명의 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 분석용 키트에서, 상기 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 분석용 면역크로마토그래피 스트립을 포함하는 키트는, 5분내 분석결과를 알 수 있는 래피드 테스트(Rapid test)를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. 상기 면역크로마토그래피 스트립은 (a) 시료가 흡수되는 샘플패드(sample pad); (b) 시료 내의 상기 20개의 유전자 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 단백질과 결합하는 결합 패드(conjugate pad); (c) 상기 20개의 유전자 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 단백질에 대한 단일클론 항체를 포함하는 반응선(test line) 및 대조선(control line)이 처리되어 있는 반응 막(test membrane); (d) 잔량의 시료가 흡수되는 흡수패드(absorption pad); 및 (e) 지지체를 포함하는 것이 바람직하다. 또한 면역크로마토그래피 스트립(Immunochromatographic strip)을 포함하는 래피드 테스트 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 상기 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단일클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 래피드 테스트 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 래피드 테스트 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 특이항체와 2차 항체가 고정된 나이트로셀룰로오스 멤브레인, 항체가 결합된 비드에 결합된 멤브레인, 흡수 패드와 샘플 패드 등 진단에 필요한 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 면역학적 도트 어세이에 의한 단백질 발현 수준의 측정은 (a) 막에 생물학적 시료를 점적(dotting)하는 단계; (b) 상기 20 개의 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 단백질에 특이적인 항체를 상기 점적된 막에 반응시키는 단계; 및 (c) 상기 반응시킨 막에 표시체가 접합된 2차 항체를 첨가하고 발색시키는 단계를 포함하는 것이 바람직하고, 상기 엘라이자 어세이는 (a) 상기 마커에 대한 염기서열을 갖는 유전자의 단백질에 특이적인 항체 1을 고상체에 흡착시키는 단계; (b) 상기 고상체에 흡착된 항체 1과 뇌 손상 환자의 생물학적 시료를 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성하는 단계; (c) 표지물질이 결합된 상기 마커에 대한 염기서열을 갖는 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 특이적인 항체 2를 처리하여 상기 복합체와 결합시키는 단계; 및 (d) 상기 표지물질을 검출하여 단백질의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 샌드위치 엘라이자 어세이인 것이 바람직하며, 상기 단백질 마이크로어레이 어세이는 (a) 상기 마커로 구성된 유전자 의 단백질에 특이적인 다클론 항체를 칩에 고정시키는 단계; (b) 상기 고정된 다클론 항체 1을 뇌 손상 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성하는 단계; (c) 표지물질이 결합된 상기 마커에 대한 염기서열을 갖는 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 특이적인 단일클론 항체를 처리하여 상기 복합체와 결합시키는 단계; 및 (d) 상기 표지물질을 검출하여 단백질의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.

상기 분석 방법들을 통하여, 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 에리스로포이에틴 및 제대혈을 투여한 뇌 손상 환자에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있다.

본 발명에서 용어 “항원-항체 복합체”란 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.

이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자 (microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)8 , [Os(bpy) 3 ] 2+ ,[RU(bpy) 3 ] 2+, [MO(CN) 8 ] 4- 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I , 186Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.

단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다.

또한, 바람직하게는, 상기 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후를 분석할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 유전자의 발현량과 에리스로포이에틴 및 제대혈을 투여한 뇌 손상 환자에서의 마커 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직 염색을 실시하는 것이다. 뇌 손상 환자의 조직 및 에리스로포이에틴 및 제대혈을 투여한 뇌 손상 환자의 조직을 채취 및 고정한 후, 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 ㎛ 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 상기의 항체 중 선택된 1개와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독한다.

또한, 바람직하게는, 상기 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후를 분석할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 마이크로어레이일 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 유전자 증폭 키트이다.

본 발명의 키트가 마이크로어레이인 경우에는, 마이크로어레이의 고상표면에 프로브가 고정화 되어 있다. 본 발명의 키트가 유전자 증폭 키트인 경우에는 프라이머를 포함한다.

본 발명의 키트에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 서열목록 제2서열의 뉴클레오티드에 대하여 상보적인 서열을 갖는다. 본 명세서에서 용어“상보적(complementary)”은 어떤 특정한 혼성화(hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서 용어 “상보적”은 용어 완전 상보적(perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.

프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 상술한 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다.

프라이머 또는 프로브 제작 시 참조하여야 하는 본 발명 마커의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제2서열이며, 이 서열을 참조하여 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

본 발명의 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 분석용 키트는 혼성화에 기초하여 실시할 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브가 이용된다.

상술한 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 혼성화 되는 프로브를 이용하여 혼성화-기초 분석을 하여 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후를 분석할 수 있다.

프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5(Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생물학적 시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있으며, 바람직하게는 혈액에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.

프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO₄, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.

혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethyl benzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. 따라서 본 발명의 마커를 검출하는 방법을 혼성화에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브를 핵산 시료에 혼성화시키는 단계; (ii) 상기 혼성화 반응 발생 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대해 판단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대한 혼성화 시그널이 정상 시료(예컨대, 에리스로포이에틴 및 제대혈을 투여하지 않은 뇌 손상 환자)보다 강하게 나오는 경우에는 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화된 것으로 판단된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 분석용 키트는 유전자 증폭 키트일 수 있다.

본 명세서에 기재된 용어“증폭”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification; TMA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction(CP-PCR), 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR), 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification(NASBA), 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 키트를 프라이머로 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 본 발명은 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 분석하는 것이기 때문에, 분석 대상의 시료(예컨대, 혈액, 혈장, 혈청 또는 소변)에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 mRNA 양을 조사하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 결정한다.

따라서 본 발명은 원칙적으로 시료 내의 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.

mRNA를 얻기 위하여, 시료에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol . Biol . Rep ., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal . Biochem. 162:156(1987)). 예컨대, TRIzol을 이용하여 용이하게 세포내의 총 RNA를 분리할 수 있다. 이어, 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 시료로부터 분리되는 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 이어, 유전자 증폭 반응을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus (Pfu)를 포함한다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg^{2 +}와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링은 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

이렇게 증폭된 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 cDNA를 적합한 방법으로 분석하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 이러한 증폭 반응을 통하여, 생물학적 시료에서 본 발명 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현이 정상 시료(예컨대, 에리스로포이에틴 및 제대혈을 투여하지 않은 뇌 손상 환자의 혈액, 혈장 또는 혈청)보다 높게 나오는 경우에는 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화된 것으로 판단된다.

따라서 본 발명의 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 마커의 검출 방법을 cDNA를 이용하는 증폭반응에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (ⅰ) 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 어닐링되는 프라이머를 이용하여 증폭 반응을 실시하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 증폭 반응의 산물을 분석하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현정도를 결정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 마커는 에리스로포이에틴 및 제대혈을 투여한 뇌 손상 환자에서 고발현 되는 생체 분자이다. 이러한 마커의 고발현은 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “고발현”은 조사 대상의 시료에서의 대상이 되는 뉴클레오티드 서열의 발현 정도가 대조군 시료와 비교하여 높은 경우를 의미한다. 예컨대, 당업계에서 통상적으로 이용되는 발현 분석 방법, 예컨대 RT-PCR 방법 또는 ELISA 방법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))에 따라 발현 분석을 한 경우, 발현이 많은 것으로 분석되는 경우를 의미한다. 예를 들어, 상술한 분석 방법에 따라 분석한 결과, 본 발명의 마커가 대조군과 비교하여 2-10 배 정도 고발현 되는 경우, 본 발명에서의 “고발현”으로 판정하고 뇌 손상 증세가 경감 또는 완화된 것으로 판정한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 분석에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드의 발현을 검출하는 방법을 통해 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에서의 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨를 의미하고, 바람직하게는 혈액, 혈장 또는 혈청을 의미하며, 가장 바람직하게는 혈장을 의미한다.

본 발명의 명세서에서 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 마커를 검출하는 방법은 상기 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 분석용 키트와 공통된 내용을 포함하고 있기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해서 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 에리스로포이에틴 및 제대혈 투여에 따른 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 분석용 키트를 제공한다.

(ⅱ) 본 발명은 에리스로포이에틴 및 제대혈 투여에 따른 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

(ⅲ) 본 발명을 이용하면 에리스로포이에틴 및 제대혈 투여에 따른 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화를 효과적으로 모니터링 할 수 있다.

도 1은 에리스로포이에틴 및 제대혈 투여에 따른 뇌성마비 환자의 임상학적 변화(Gross Motor Performance Measure, GMPM)를 측정한 결과이다.
도 2는 에리스로포이에틴 및 제대혈 투여에 따른 뇌성마비 환자의 임상학적 변화(Korean Bayley Scale 2^nd version, BSID-II 인지)를 측정한 결과이다.
도 3은 에리스로포이에틴 및 제대혈 투여에 따른 뇌성마비 환자의 임상학적 변화(Korean Bayley Scale 2^nd version, BSID-II 동작)를 측정한 결과이다.
도 4는 에리스로포이에틴 및 제대혈 투여에 따른 뇌 손상 환자의 혈장 펜트락신 3의 수치 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 에리스로포이에틴 및 제대혈 투여에 따른 뇌 손상 환자의 혈장 BDNF의 수치 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 에리스로포이에틴 및 제대혈 투여에 따른 뇌 손상 환자(P**)의 혈장 펜트락신 3 및 BDNF의 수치 변화를 나타낸 그래프이다.
도 7은 에리스로포이에틴 및 제대혈 투여에 따른 뇌 손상 환자의 혈장 펜트락신 3 및 BDNF 수치 변화의 평균값(투여 후 8일)을 나타낸 그래프이다.
도 8은 에리스로포이에틴 및 제대혈 투여에 따른 뇌 손상 환자의 혈장 BDNF 수치 변화의 평균값(투여 후 6개월)을 나타낸 그래프이다.
도 9는 에리스로포이에틴 및 제대혈 투여에 따른 뇌 손상 환자의 혈장 CRP의 수치 변화를 나타낸 그래프이다.
도 10은 에리스로포이에틴 및 제대혈 투여에 따른 뇌 손상 환자의 혈장 CRP 수치 변화의 평균값을 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

재료 및 방법

환자 등록

2009년 3월에서 2010년 1월까지 뇌성마비로 분당 차 병원, 재활의학과에 등록된 환자의 샘플을 수집하였다. 포함 기준은 1) 유전학적 장애가 없으며, 2) MRI를 통해 뇌 손상이 관찰되거나, 또는 비정상적인 신경발달을 설명할 수 있는 출산 전후의 이력이 있는 환자, 3) 임상진단 명이 뇌성마비로 비정상적 근긴장과 움직임 및 운동 발달이 늦어지는 환자, 4) 초기 헤모글로빈 농도가 13.5 g/dL 미만인 환자, 5) 입원기간 동안에 재활하는데 문제가 없는 환자를 실험의 대상으로 하였다. 그 외에 2년 전에 전두엽부위 뇌경색이 발생되었던 이**(3), 장기적으로 파킨슨병이 지속되고 있었던 이**(4), 경등도의 열공성 뇌경색으로 기억력 감퇴가 나타났던 P**(성인)을 대상으로 제대혈과 EPO를 처방하였다. rhEPO를 치료받은 환자는 사전에 동의를 받았으며, 본 실험의 시험법은 분당 차병원 임상시험심사위원회에서 사전에 허가를 받았다.

뇌성마비 환자들의 인구통계

실험군	제대혈+EPO 투여군(n=31)	EPO 투여군(n=33)	대조군(n=32)
남성 수(%)	23(74.2%)	23(69.7%)	23(71.0%)
나이(개월수)	36.84±19.4	43.9±24.7	38.3±18.4
출생시 임신일수(일)	237.6±34.6	230.3±35.0	246.4±28.7
조산(%)	18(58.1 %)	23(39.7%)	17(29.3%)
출생시 몸무게(kg)	2.2±0.9	2.0±0.9	2.4±0.7
정상체중/저체중/초저체중/초극저체중	13/9/8/1	11/8/10/4	16/13/2/1
대근육 운동 기능 분류 시스템(GMFCS) Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ/Ⅴ	4/3/5/10/9	5/4/11/7/6	2/1/12/9/8

뇌성마비 환자의 발병원인 및 유형분류

원인 및 유형 분류 체계	SB/SU/D/C/A	SB/SU/D/C/A	SB/SU/D/C/A
조산 후 백색질연화증(n=49)	15/0/2/0/0	19/0/0/0/0	13/0/0/0/0
출생 후 저산소증(n=18)	4/1/1/0/0	3/0/1/0/0	5/0/2/1/0
혈관질환(n=6)	0/3/0/0/0	0/2/0/0/0	0/1/0/0/0
뇌의 비정상적 발달(n=4)	0/0/0/0/0	0/0/1/0/1	1/0/0/0/1
뇌염(n=2)	0/0/0/0/0	0/0/1/0/0	0/0/1/0/0
핵황달(n=3)	0/0/0/0/0	0/0/1/1/0	0/0/0/1/0
저혈당증(n=1)	0/0/0/0/0	0/0/0/0/0	1/0/0/0/0
원인미상(n=13)	2/0/1/0/2	3/0/0/0/0	1/0/1/0/3

SB: 양측마비(Spastic bilateral), SU: 일측성 마비(Spastic unilateral), D: 근긴장이상(Dystonia), C: 무도무정위운동(Choreoathetosis), A: 운동실조(Ataxia) (Bax, 2005)

rhEPO 의 처방

rhEPO를 처방받은 환자 그룹은 250 IU/kg을 처방 받고, 일주일에 두 번 피하주사로 주입하였다. 250 IU/kg은 빈혈증 환자에게 사용되는 양보다 많다. 적혈구 증가증이 생기는 것을 주시하기 위해 매 주마다 퇴원하기 전까지 전혈 세포 수를 측정하였다. rhEPO 처방은 헤모글로빈 수치가 15g/dL 이상 높아지면 중단하였으며, 처방 기간 동안에 철분 보조제의 섭취를 금하였다. 한 달이 넘는 기간 동안 rhEPO를 처방받은 그룹은 평균 7.2회(1,800 IU/kg)을 처방받았다(주사 5회에서 9회는 약 1,500에서 2,500 IU/kg을 처방 받은 것과 동일하다).

제대혈의 처방

제대혈을 녹여 단핵세포를 준비하고 3.0-5.0×10⁷ 세포/kg를 혈관(말초, 중심정맥 또는 동맥)으로 면역억제제(cyclosporine, 100-200 ng/kg, 4주)와 함께 주사하였다. EPO와 함께 투여할 경우, 제대혈을 투여하기 12시간 및 2시간 전에 500 IU/kg의 EPO를 먼저 정맥 주사하였다(제대혈은 1회만 투여하였고, EPO는 4-6회 투여하였음).

BDNF 의 측정

환자들에게 제대혈을 투여하기 전 및 후(24시간, 4일, 8일, 6개월)에 혈액을 채취하였다. BDNF 측정을 위하여 BDNF 항체를 마이크로플레이트에 150 μl씩 코팅된 것을 이용하였다. 샘플 버퍼를 100 μl씩 마이크로플레이트에 먼저 넣고, 혈장을 50 ul 씩 첨가하였다. 이때 사용된 혈장은 혈소판이 완전히 제거되게끔 10,000 x g에서 10분간 원심분리된 혈액을 사용하였다. 모든 혈장은 EDTA 항응고제로 이용하였다. 상온에서 2시간 동안 배양한 후, 세척과정 없이 곧바로 BDNF 검출 항체(HRP conjugated)를 100 μl씩 넣고, 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 이후 세척과정을 3번 후에 200 μl의 TMB를 넣고 30분간 반응시키고, 50 μl의 스톱 솔루션 처리 후, 450 nm 흡광도를 측정하였다.

실험결과

EPO 및 제대혈 투여에 따른 뇌성마비 환자의 임상학적 변화

UCB(Umbilical Cord Blood, 제대혈)군은 제대혈 투여 2주 후 rhEPO를 투여하였고, EPO군은 플라시보 제대혈 투여 2주 후 rhEPO를 투여하였다. 대조군은 플라시보 제대혈 투여 2주 후 플라시보 rhEPO를 투여하였으며, UCB군, EPO군 및 대조군 모두 6개월간 재활치료를 병행하였다. 제대혈 투여 또는 플라시보 제대혈 투여 후 1개월, 3개월 및 6개월이 경과한 시점에 대동작 운동 수행능력(Gross Motor Performance Measure, GMPM), 한국인 베일리 영유아발달검사 II(Bayley Scales of Infant Development test II, BSID-II) 인지 및 동작 점수를 측정하였다. 그 결과, 제대혈과 EPO를 함께 처리한 군에서 GMPM(도 1), BSID-II 인지(도 2) 및 동작(도 3) 점수에서 모두 EPO 단독 처리군 및 대조군과 비교하여 높은 점수를 나타냈다. 이로써, 제대혈 및 EPO 투여가 뇌성마비 환자의 증세 개선에 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다.

EPO 및 제대혈 투여에 따른 뇌손상 환자의 임상학적 변화

박** 환자의 경우, 뇌손상 후 거의 4년이 경과된 시점으로 호전을 기대하기는 어려운 상황이었으나 EPO 및 제대혈 투여 후 임상적 호전이 많이 관찰되었다. 주변 사람들을 왼손으로 잡아당기거나 닥치는대로 물어뜨는 행동, 소리지르기가 계속되었으나 EPO 및 제대혈 투여 후 단기간 내에 이러한 행동이 상당히 교정되었으며, 작업치료 시에도 차분히 앉아서 과제에 집중하는 모습을 나타내었다. 또한, 스스로 휠체어에서 일어나는 동작, 색깔 구별 및 10 자리의 덧셈, 뺄셈이 가능하게 되었으며, 이전에 사용하지 않던 오른손으로 볼펜 누르기 및 악수 등의 움직임이 발생하게 되었다.

김** 환자의 경우, 좌측 마비가 심하나 실제적으로는 중증 사지 마비 수준으로 고개를 가누고 앉아 있는 것도 어려운 상태로 좌측 편측 무시로 인한 시공간 인지가 부족하였고, 우측으로 눈동자의 치우침이 있었으나 EPO 및 제대혈 투여 후, 좌측에 대한 공간능력 및 사물에 대한 인식이 증가하였고 눈동자가 중앙 및 왼쪽으로 오는 시간이 증가하였다. 또한, 기존에는 머리 가누기를 거의 하지 못하였으나, 체간 힘의 증가로 침상에서 머리 가누기 시간이 증가하였고 방향성 또한 향상되었으며, 휠체어를 탄 상태에서 지지대 없이도 머리를 들고 유지할 수 있게 되었다. 한편, 발병 이후 우울증이 있어 항우울제를 투약 중이었으나 EPO 및 제대혈 투여 이후 표정이 밝아지고 웃음이 많아졌으며, 휠체어로 이동시 스스로 하려는 움직임이 많아졌다. 발의 근력이 약하여 스스로 움직이기 어려웠으나 발을 스스로 돌려 움직일 정도로 근력이 향상되었으며, 일상생활동작 수행시, 보호자의 다양한 지시에 빠른 반응을 보이게 되었다.

고** 환자의 경우, 사지마비 및 식물인간 상태로 외부 자극에 대한 반응을 전혀 보이지 않는 환자였으나, EPO 및 제대혈 투여 후 외부 지시에 따른 눈깜빡임 수행의 정확도 빈도가 향상되었으며, 빛과 소리로 이루어진 복합적인 자극을 주는 인지치료를 시행하였을 때, 수행의 정확도 빈도가 향상되었다. 시술 전에는 수면이 2-5시간가량 지속되다가 깨어나는 경우가 많았으나, 시술 후에는 7시간 이상 안전적으로 수면하는 날이 많았다.

이**(1) 환자의 경우, 전두엽 손상으로 인해 같은 말을 반복하고 보호자의 다른 말을 따라하는 보속증 증상이 심하였으나 EPO 및 제대혈 시술 이후 보속증 증상이 감소하고, 다른 말의 시작을 본인 스스로 말할 수 있게 되었고 사용 가능한 단어의 범주가 증가하였다. 전두엽 손상으로 주의 집중력이 많이 감소하였고, 특히 시간에 대한 지남력 및 보호자 이외의 사람에 대한 지남력 또한 감소한 상태였으나 시술 이후 담당 주치의를 알아보고, 반응 속도 또한 약간 빨라진 모습이 관찰되었다. 또한, 우울증이 있어 항우울제를 복용하였으나 시술 이후 성경이 쾌활해졌으며, 적극적으로 언어 의사표현이 가능하게 됐을 뿐 아니라 농담도 할 수 있게 되었다. 시술 이전에는 서있는 자세 및 보행 패턴이 나타나지 않았고, 보호자의 전적인 도움 하에 보행 연습을 하면서 환측인 좌측 뿐만 아니라 정상인 우측에도 체중을 싣지 못하고 무게 중심에 대한 정확한 개념이 없었으나 시술 이후 무게 중심 이동에 대한 개념을 이해하였고, 그 결과 보통의 도움 하에서 보행이 가능하게 되었다. 또한, 발목 관절의 운동 가동범위가 증가하여 서있는 자세 및 보행 동작 시 발이 끌리는 양상이 감소하였으며, 시술 전 본인 신체에 대한 인지력이 부족하여 신체의 사용 및 공간에 대한 파악력이 부족하였으나 시술 이후 좌측 신체에 대한 인식력이 증가하고, 스스로 사용하려는 모습이 관찰되었다.

이**(2) 환자의 경우, 전반적인 뇌 위축 및 사지 마비 상태이기 때문에 시술 이전에는 주위 빛과 소리 자극에 대한 반응이 전혀 관찰되지 않았으나 EPO 및 제대혈 시술 이후 사람들이 크게 말할 때 고개를 돌리는 반응이 때때로 관찰되었다. 의미있는 사지의 움직임은 시술 이후에도 여전히 관찰되지 않았으나 통증에 대한 반응의 정도 및 무의식 상태에서 움직임을 볼 때 움직임의 범위가 커지고 빈도 또한 증가하였다. 또한, 오랜만에 보는 사람들에게 눈물을 흘리는 반응을 보이는 등 주위 사물에 대한 인지력이 약간 향상되는 모습이 관찰되었다.

진** 환자의 경우, EPO 및 제대혈 시술 이전에는 심한 신근 패턴(Extensor pattern)으로 인해서 기능적인 움직임 및 자세 유지가 매우 힘들었으나 시술 이후 하지의 심한 신근 패턴이 감소되었고, 이로 인하여 수동적으로 앉는 자세를 만들어 줄 경우 보호자의 지지 하에 앉아 있는 시간이 증가하였다. 시술 이전에는 인지력 저하로 인하여 음식물을 계속 입에 물고 있는 모습이 관찰되었으나 시술 이후 연하이지를 이용하여 구두 섭취가 가능해졌고, 보호자의 지시 하에 식사 시간이 감소하였으며, 좋고 싫은 것에 대한 표현이 명확해졌다. 또한,“똥, 오줌” 등 의사 표현을 하기 시작하여 대소변을 가리기 시작하였으며, 소리에 대한 반응 속도가 증가하여 사람의 말소리가 들리거나 음악 소리에 대한 시선 이동이 증가하였다. 체간의 근력 증가로 머리 가누기의 범위가 약간 증가하였고, 평행봉 잡은 상태에서 보통의 도움 하에서 10분가량 서있는 것이 가능해졌다. 하지의 경직도가 근긴장도(Modified ashworth scale) 상 G2에서 G1+로 호전되었고, 양측 어깨 및 고관절의 운동가동 범위가 증가하였다(시술 1개월 후). 앉기/서기 균형이 zero → poor로 호전되었으며(6개월 후), 시술 6개월 째 우측 상 하지는 경직(MAS로)이 G1, 좌측 상지는 G1, 하지는 G0로 큰 호전이 관찰되었다. 시술 6개월 째 웃음이 증가하였고, 사람들이 하는 말을 더 많이 알아들으며 음성으로 사람에 대한 선호도를 판단하고, 무조건 거부하는 것(자기 주장을 지나치게 피력함)에서 벗어나 호불호를 명확히 구분하여 거부하는 모습 관찰되었다(감정 조절하는 능력이 생김). 시술 6개월 째 언어평가 때 1, 2번째 손가락으로 번호를 표시하거나 눈깜빡임으로 의사를 표현하는 것이 가능해졌으며(지속시간이 길지는 않음), ‘아’ 발성이 증가하였고, 혀와 턱의 반사적인 움직임이 감소하였다.

윤** 환자의 경우, EPO 및 제대혈 시술 이후 목의 움직임 및 눈동자가 따라가는 시간이 증가하였고, 강한 자극이 주어질 경우 왼쪽 상하지에서 하지는 Fair+(기존: Trace-Zero)까지, 상지는 Poor+(기존: Trace-Zero)까지 움직임이 가능해져 본인 의사를 적극적으로 표현하고 싶을 때 보호자를 왼손으로 치거나 발을 이용하는 모습이 관찰되었으며, 손을 달라고 할 경우 왼손을 움직여 주는 모습까지 관찰되었다. 눈앞에서 물체를 좌우로 움직일 때 수평 방향으로 눈동자의 따라감 정도가 증가하였고, 예전에는 눈동자를 고정하지 못하였으나 시술 이후 3초까지 사물에 눈동자를 고정하는 것이 가능해졌다(일관성은 다소 낮은 편임). 또한, 시술 이전에는 얼굴 근육의 톤이 높아 차가운 물체로 자극할 때 불수의적으로 입술을 오므리는 것이 관찰되었으나 시술 이후 톤이 감소하여 구강치료 시 입술을 오물거리고 2개 손가락이 드나들 정도로 입술의 수의적 벌림이 가능해졌으며, 보호자가 써 주는 글씨에 대해서 분명히 반응하는 모습이 관찰되었다. 머리 가누기가 증가하였고, 바닥에서 떼고 일정 수준 들고 있을 수 있게 되었고(사람들이 몰려오거나 큰 소리를 내면 고개를 들어 소리 나는 방향을 보고, 앉은 자세에서도 기존에는 고개를 숙이고 있었으나 고개를 들어 주위 환경을 살핌), 의료진의 회진 시 고개를 들어 인사를 하는 모습 관찰되었다.

EPO 및 제대혈 투여 후 이**(3) 환자의 경우, 전신의 운동 상태가 좋아져서 활동성이 향상되었으며, 이**(4) 파킨슨 환자는 낮에 눈을 잘 뜨고 있지 못하였으나 눈을 잘 뜨고 견딜 수 있게 되었고, P** 환자는 기억력이 향상되었다.

혈관 염증 바이오마커의 수치 변화

EPO 및 제대혈을 투여한 뇌성마비 환자를 대상으로 혈장에서 PTX3 및 BDNF의 수치를 측정하였다. 바이오마커 수치를 측정한 박** 환자 및 김** 환자에서 EPO 및 제대혈 투여 24시간 후 PTX3가 증가하였으며, BDNF 및 CRP는 다소 감소하거나 큰 차이를 보이지 않았다(도 4).

EPO 및 제대혈을 투여한 뇌손상 환자를 대상으로 혈장에서 IL-6, IL1B, TNF-α, CRP, BDNF 및 PTX3의 수치를 측정하였다. 각 환자별 PTX3(표 3), BDNF(표 4) 및 CRP(표 5)의 수치 변화는 표로 나타내었다(-는 혈액 채취를 하지 않은 경우임). 이들 가운데 PTX3가 EPO 및 제대혈을 주사한 환자에게서 투여 후 24시간에 증가하였다가, 4일 후 및 8일 후 점차 감소하는 것을 확인하였다(도 5, 도 7-8).

한편, BDNF는 개별적으로는 이**(1) 환자의 경우 투여 후 시간에 따라 점차 BDNF가 증가하였고, 이**(2) 환자의 경우는 24시간 내에 BDNF 수치가 증가하였다가 감소하는 특징을 나타내었지만(도 6), 대체적으로 시술 전에 비하여, 시술 후 24시간 후에는 BDNF가 감소하였다가 6개월 이후에는 증가하는 성향을 나타냈다(도 9). P** 환자의 경우, 제대혈 및 EPO 투여 24시간 후 PTX3는 증가하였고, BDNF는 수치에 있어 큰 차이가 나타나지 않았으나, 투여 6개월 이후에는 BDNF 수치가 증가하는 경향을 나타내었다(도 7). 한편, CRP의 경우 EPO 및 제대혈 투여 전후에 특이한 변화를 확인할 수 없었다(도 10).

환자별 PTX3 수치의 변화

이름	투여 전	투여 24시간 후	투여 4일 후	투여 8일 후
김**	0.25	19.26	-	1.10
고**	0.97	4.69	-	-
이**(1)	0.09	16.22	1.13	3.65
이**(2)	0.51	9.72	1.89	-
박**	0.01	3.45	-	-
진**	0.04	12.67	-	-
윤**	0.03	4.47	-	0.42
이**(3)	0.57	24.29	-	-
이**(4)	1.22	27.25	-	-
P**	0.14	19.22	-	-

환자별 BDNF 수치의 변화

이름	투여 전	투여 24시간 후	투여 4일 후	투여 8일 후
김**	1.25	0.74	-	0.61
고**	6.03	1.35	-	-
이**(1)	2.24	3.57	4.41	5.09
이**(2)	1.87	4.35	2.27	-
박**	5.36	0.59	-	-
진**	2.11	1.65	-	-
윤**	6.26	2.66	-	2.04
이**(3)	2.21	0.00	-	-
이**(4)	1.46	2.29	-	-
P**	1.84	2.37	-	-

환자별 CRP 수치의 변화

이름	투여 전	투여 24시간 후	투여 4일 후	투여 8일 후
김**	437	449	-	418
고**	460	419	-	-
이**(1)	298	428	314	358
이**(2)	434	446	444	-
박**	393	402	-	-
진**	446	417	-	-
윤**	449	461	-	450
이**(3)	246	679	-	-
이**(4)	-	-	-	-
P**	722	885	-	-

기존의 염증 바이오마커(TNF-α, IL-1β, IL-6)의 경우, PTX3 바이오마커와 비교하여 염증 반응에 대한 민감성이 떨어져 환자들의 염증 바이오마커 수치를 측정한 결과, 변화가 없었던 것으로 추정된다. 한편, PTX3의 측정 수치에 있어 염증으로 간주되는 수치는 50 ng/ml 이상이나, 대개 제대혈 시술 및 EPO 투여 환자들의 PTX3 수치는 그 이하였다. 환자들간 측정 수치에서 약 10-20 ng/ml 내외의 차이가 있었으나, 공통적으로 EPO 및 제대혈 투여 전, 후 PTX3 수치의 변화 및 연관성이 뚜렷하게 나타났다. 따라서 PTX3는 단기간 모니터링으로 시술 시기와 그 정도를 평가하는 마커로서 이용될 수 있는 가능성을 지닌다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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7. 인간의 혈액, 혈장 또는 혈청 시료에 있는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드의 발현을 검출하는 방법을 통해 에리스로포이에틴(erythropoietin) 및 제대혈 투여에 의한 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 마커를 검출하는 방법.
   
8. 제 7 항에 있어서, 상기 뇌 손상은 뇌성마비, 뇌졸중, 외상성 뇌 손상 및 파킨슨병으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 질환을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
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11. 제 7 항에 있어서, 상기 방법은 마이크로어레이 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
    
12. 제 7 항에 있어서, 상기 방법은 유전자 증폭 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
    
13. 제 7 항에 있어서, 상기 방법은 항원-항체 반응 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.

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