WO2013112002A1 - 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 바이오마커 - Google Patents

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WO2013112002A1
WO2013112002A1 PCT/KR2013/000629 KR2013000629W WO2013112002A1 WO 2013112002 A1 WO2013112002 A1 WO 2013112002A1 KR 2013000629 W KR2013000629 W KR 2013000629W WO 2013112002 A1 WO2013112002 A1 WO 2013112002A1
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WO
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brain injury
kit
cord blood
alleviation
present
Prior art date
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PCT/KR2013/000629
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김민영
안성수
민경훈
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의료법인 성광의료재단
가천대학교 산학협력단
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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
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    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
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    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the present invention relates to biomarkers for alleviation or alleviation of brain injury symptoms.
  • Brain injury which means destruction or degeneration of brain cells, occurs relatively frequently and extensively. Brain injury is caused by a wide range of internal and external factors, the most common of which includes the largest number of injuries. Traumatic brain injury (TBI) is caused by physical or head injury from external causes. It is called acquired brain injury (ABI) to distinguish the resulting brain injury from damage resulting from a congenital disorder. Brain injury is known to be caused by long-term hypoxia, poisoning by malformations including alcohol, infections and neurological diseases. Chemotherapy may also damage oligodendrocytes that produce neural stem cells and myelin. Other common causes of brain damage include traumatic brain injury, There may be physiological trauma such as stroke, aneurysm, surgery, other neurological disorders, and heavy metal poisoning.
  • Ischemic strokes caused by the ischemic state of brain tissues due to black blockage
  • hemorrhagic strokes that cause blood vessels to bleed into the brain tissues.
  • Ischemic stroke accounts for about 80% of all stroke patients, and about one third of the patients die.
  • the ischemic stroke arises from the inadequate brain circulation of blood caused by the closure of arterial blood inflow.
  • adequate brain blood supply is ensured by the arterial system inside the brain.
  • various diseases including inflammation and atherosclerosis, can cause blood clots, ie, clots that form in blood vessels. Blood clots can interfere with arterial blood flow, leading to cerebral ischemia and subsequent neurological symptoms.
  • Ischemic stroke can also occur by the embolism, which is a piece of thrombus formed in the heart, blocking the blood vessels, leading to reduced perfusion pressure or increased blood viscosity with inappropriate brain blood flow.
  • Cerebral palsy is also a form of brain injury that occurs when brain damage occurs in premature or infancy. Occurs . Cerebral palsy is a disorder that includes motor and postural developmental injuries resulting from various nonprogressive damages to the brain in the fetus or infancy. Motor disturbances in cerebral palsy are often accompanied by sensory, cognitive, communication, strabismus, visual perception and behavioral disorders (Bax M et al., Dev Med Child Neurol 47: 571-576 (2005)). Therapies for cerebral palsy are rehabilitation, including physical, occupational, speech, and psychotherapy. Other treatments include anti-cerebral palsy drugs, injections of Borlinus bacteria, and orthopedic surgery aids. Even with so many treatments, there is no technological and fundamental treatment for cerebral palsy.
  • early diagnosis and immediate rehabilitation treatment can stimulate the plasticity of the brain, thereby maximizing the damage to the brain, which can be considered to be effective in treating brain damage.
  • early treatment programs in children with cerebral palsy have beneficial effects on motor and cognitive development (Blauw- Hospers CH et al., Neurosci Biobehav Rev?> 1 1201-1212 (2007)).
  • erythropoietin EP0 granulocyte colony-stimulating growth factor (G_CSF) and GM an CSF (gr anu 1 ocy t e-macr ophage colony stimulating factor) have the clinical ability to increase brain plasticity ( Maurer Li et al. Curr Med Chem 15: 1407-1411 (2008).
  • G_CSF granulocyte colony-stimulating growth factor
  • GM an CSF gr anu 1 ocy t e-macr ophage colony stimulating factor
  • rhEPO Recombinant human EPO
  • rhEPO Recombinant human EPO
  • rhEPO Recombinant human EPO
  • brain injury traumatic brain injury
  • Parkinson's disease chronic brain disease patients
  • children with cerebral palsy because of its clinical effectiveness and least adverse side effects.
  • rhEPO was associated with cerebral ischemia (Iwai M et al., Stroke 38: 2795-2803 (2007)), and hyperoxygen-induced brain cell death (Kaindl AM et al., Ann Neurol 64: 523-534 (2008)).
  • neuroprotective effects in neonatal with lipopolysaccharide-induced white matter damage Kumral A et al., Neonatology 92: 269-278 (2007)).
  • rhEPO has an angiogenic effect (Marti HH et al., News Physiol Sci 15: 225-229 (2000)) and increases neurogenesis in neonatal stroke patients (Gonzalez FF et al., Dev Neurosci). 29: 321-330 (2007). Moreover, administration of rhEPO to premature infants in the neonatal intensive care unit improves neurodevelopment (Neubauer AP et al., Ann Neurol 67: 657-666 (2010)).
  • EP0 is a glycoprotein hormone produced by the kidney that promotes the production of red blood cells, helping patients with anemia or cancer. More than a million cancer patients and patients with renal impairment are receiving EP0 due to low red blood levels, with annual sales of $ 9 billion worldwide. In addition, young mice administered with EPO have improved brain function, including learning ability, and cognitive function has been reported to be improved in patients with chronic renal failure.
  • Umbilical cord blood is the blood in the umbilical cord and placenta when the baby is born.
  • Hematopoietic stem cells which are the basic cells that make blood, and mesenchymal stem cells that can differentiate into parts of the human body such as cartilage, bones, muscles, and nerves are used. Used for treatment.
  • the cartilage damage and degenerative arthritis treatment system (Katistem) has been demonstrated in clinical trials to completely replace the existing joint surgery in the near future.
  • Chronic degenerative neurological diseases such as stroke, Lou Gehrig's disease, and Alzheimer's disease are expected to be effective in the treatment of cord blood stem cells.
  • cord blood transplantation all diseases requiring hematopoietic stem cell transplantation can be treated with cord blood, and are mainly used to treat incurable diseases such as leukemia, malignant blood disease, congenital metabolic disorders, and immunological disorders, and cord blood transplantation is also used to treat cerebral palsy. .
  • Umbilical cord blood is rich in hematopoietic stem cells that make blood, as well as progenitor cells that regenerate blood vessels and mesenchymal stem cells that regenerate nerve cells. These stem cells help restore and regenerate damaged brain tissue, a major cause of ischemic cerebral palsy. This has been proven in clinical trials. Since 1998, the U.S. has been actively implanting cord blood to treat various cerebral diseases such as cerebral palsy and head injuries. Umbilical cord blood is also available in Germany, China, Thailand, Mexico and Russia. It is treating brain diseases such as cerebral palsy. Of course, in Korea, autologous cord blood transplantation treatment for cerebral palsy patients has recently been in the spotlight.
  • pentraxine 3 or BDNF brain-derived neurotrophic factor is a marker that can monitor the alleviation or alleviation of brain injury symptoms by administration of erythropoietin, umbilical cord blood or erythropoietin and umbilical cord blood and determine prognosis. It was completed.
  • Another object of the present invention is to provide a method for monitoring or prognostic markers for alleviation or alleviation of brain injury symptoms.
  • the present invention provides a binding agent for binding specifically to a protein of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 or a polynucleotide of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO:
  • a binding agent for binding specifically to a protein of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 or a polynucleotide of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: Provided are a kit for monitoring or prognostic analysis of alleviation or alleviation of brain injury symptoms, including primers or probes that specifically bind to polynucleotides.
  • the present inventors have made diligent research efforts to discover novel biomarkers for monitoring or prognostic analysis of alleviation or alleviation of brain injury symptoms.
  • pentraxine 3 or bra in-derived neurotrophic factor (BDNF) causes brain injury symptoms. It was found that the marker could be used to monitor alleviation or mitigation and to determine prognosis.
  • BDNF bra in-derived neurotrophic factor
  • alleviation or alleviation of the brain injury symptoms of the present invention may be induced by erythropoietin, umbilical cord blood or erythropoietin and umbilical cord blood administration.
  • Pentraxine 3 of the present invention is specifically expressed in brain injury patients administered erythropoietin and umbilical cord blood. Moreover, pentraxine 3 has the ability to distinguish between brain injury patients not receiving erythropoietin and umbilical cord blood and brain injury patients receiving erythropoietin and umbilical cord blood, i.e., high expression patterns in brain injury patients with erythropoietin and umbilical cord blood. It is a marker.
  • Pentraxine 3 of the present invention exhibits a pattern of high expression initially (within 24 hours) after administration of erythropoietin and umbilical cord blood to brain-injured patients, and shows a pattern similar to that before administration (time after 24 hours) after administration.
  • pentraxine 3 may be used as a marker to evaluate the timing and extent of the procedure by short-term monitoring of erythropoietin and umbilical cord blood administration.
  • the BDNF of the present invention is specifically expressed in brain injury patients administered erythropoietin and umbilical cord blood. Moreover, BDNF has the ability to distinguish between brain injury patients not receiving erythropoietin and umbilical cord blood and brain injury patients receiving erythropoietin and umbilical cord blood, ie erythropoietin and It is a marker showing the expression pattern that is highly expressed in brain injury patients administered umbilical cord blood.
  • BDNF of the present invention exhibits a low expression pattern initially (within 24 hours) after administration of erythropoietin and umbilical cord blood to brain injury patients, and shows a high expression pattern after 6 months after administration.
  • BDNF can be used as a marker for evaluating the timing and extent of the procedure by long-term monitoring of erythropoietin and umbilical cord blood administration.
  • administration of erythropoietin and umbilical cord blood to a brain injury patient reduces or alleviates brain injury symptoms.
  • the brain injury of the present invention comprises one or more diseases selected from the group consisting of cerebral palsy, stroke, traumatic brain injury and Parkinson's disease.
  • a binding agent that specifically binds to a protein may be, for example, an oligopeptide, a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, a chimeric antibody, a ligand, a PNA (Peptide nucleic acid) or an aptamer. )to be.
  • monitoring in the context of the present invention means identifying the condition of the object to provide information about the efficacy of the treatment.
  • prognosis in the context of the present invention includes the prediction in terms of the disease proliferative process, in particular, the degree of disease remission, disease regeneration, tumor recurrence, metastasis and death.
  • the prognosis in the present invention means the possibility of improving the symptoms of a brain injury patient.
  • the kit of the present invention may be carried out in an immunoassay mode, that is, in an antigen-antibody reaction mode.
  • the antibody specifically binding to the marker of the present invention as described above or It is carried out using aptamers.
  • an antibody refers to a specific protein molecule directed against an antigenic site.
  • an antibody means an antibody that specifically binds to a marker protein, and includes all polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, and recombinant antibodies.
  • the antibody used in the present invention is a polyclonal or monoclonal antibody, preferably a monoclonal antibody.
  • Antibodies may be commonly used in the art, for example, fusion methods (Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6: 511-519 (1976)), recombinant DNA methods (US Pat. No. 4,816, 56) Or phage antibody library methods (Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991) and Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 58, 1-597 (1991)).
  • the general process for manufacturing antibodies is Harlow, E.
  • Antibodies prepared by the above method can be isolated and purified using methods such as gel electrophoresis, dialysis, salt precipitation, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and the like.
  • Polyclonal Antibodies can be obtained by injecting a protein antigen into a suitable animal, collecting antisera from the animal, and then isolating the antibody from the antisera using known affinity techniques.
  • the antibodies of the invention also include functional fragments of antibody molecules, as well as complete forms having two full length light chains and two full length heavy chains.
  • the functional fragment of an antibody molecule means the fragment which has at least antigen binding function, and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2, and Fv.
  • aptamers are ligonucleic acid or peptide molecules, and the general content of aptamers is Bock LC et al., Nature 355 (6360): 564-6 (1992); Hoppe- Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine ". J Mol Med. 78 (8): 426-30 (2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library”. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (24): 14272-7 (1998).
  • the kit of the present invention may be a kit for immunoassay (i ⁇ unoassay).
  • the kit is a Luminex Assay Kit, Protein Microarray Kit or ELISA Kit.
  • the Luminex Assay Kit, Protein Microarray Kit, and Eliza Kit include polyclonal and monoclonal antibodies to any one or more proteins selected from the above protein group, and the polyclonal and monoclonal antibodies to which labeling substances are bound. Secondary antibodies against.
  • kits in the present invention examples include immunochromatography strip kits, luminex assay kits, protein microarray kits, eliza kits, or immunological dot kits. kind is not limited.
  • the kit may further include the necessary elements necessary to perform the ELISA.
  • ELISA kits provide specific antibodies against marker proteins. Include. Antibodies are antibodies that have high specificity and affinity for each marker protein and have little cross reaction to other proteins, and are monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, or recombinant antibodies.
  • the EUSA kit can also include antibodies specific for the control protein.
  • Other ELISA kits are capable of binding reagents that can detect bound antibodies, such as labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes (eg conjugated with the antibody) and substrates or antibodies thereof. Other materials and the like.
  • the kit may additionally include the necessary elements necessary for performing protein microarrays to simultaneously analyze the complex markers.
  • the microarray kit includes antibodies specific for the marker protein bound to the solid phase. Antibodies are antibodies that have high specificity and affinity for each marker protein and have little cross reaction to other proteins and are monoclonal, polyclonal, or recombinant antibodies.
  • the protein microarray kit can also include antibodies specific for the control protein.
  • Other protein microarray kits include reagents that can detect bound antibodies, such as labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes (e.g., fused with antibodies), and substrates or other substances that can bind to antibodies. And the like.
  • the protein is separated from the sample, and the separated protein is hybridized with a protein chip to form an antigen-antibody complex, and the protein is read to confirm the presence or expression of the protein.
  • Luminex Assay is a high-throughput quantitative method that can simultaneously measure up to 100 different analytes without pretreatment of small amounts (10-20 patient samples). It is good (pg unit), can be quantified in a short time (3-4 hours), and can replace the existing ELISA or ELISP0T. Assay is placed in a 96-well plate Multiplexed fluorescent microplate analysis method that can analyze more than 100 biological samples in each well at the same time using two kinds of laser detectors to perform signal transmission in real time. The above-mentioned polystyrene beads of different color groups are distinguished and quantified. The 100 beads may be distinguished in the following manner.
  • red fluorescence beads are divided into more than ten stages, and on the other side, orange fluorescence beads are divided into ten stages, showing the difference in intensity, and the beads between them.
  • the red and orange ratios are mixed in different proportions, making up a total of 100 color-coded bead sets.
  • each bead is attached to the antibody of the protein to be analyzed, it is possible to quantify the protein by immuno-antibody reaction using the same.
  • the sample is analyzed using two lasers, one laser detects the beads to find the bead identification number, and the other laser reacts with the antibody attached to the beads. It detects proteins in a sample.
  • 100 in vivo proteins can be analyzed simultaneously in one well. This analysis has the advantage of being able to detect samples as small as 15 ⁇ .
  • Antibodies are antibodies with high specificity and affinity for each marker protein and little cross-reactivity to other proteins, such as monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, or recombinant antibodies.
  • Luminex kits can also include antibodies specific for control proteins.
  • Other Luminex kits include reagents that can detect bound antibodies, such as labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes (e.g., conjugated with antibodies) and their substrates or other substances that can bind to antibodies. It may include.
  • the antibody is conjugated to a micro particle (conjugated) antibody) and the microparticles may be colored latex or colloidal gold particles.
  • the kit for monitoring or prognostic analysis for alleviating or alleviating brain injury symptoms of the present invention comprising an immunochromatography strip for monitoring or prognostic analysis for alleviating or alleviating the brain injury symptoms is shown in 5 minutes. It may be a kit that includes the necessary elements necessary to perform a rapid test (Rapid test).
  • the immunochromatography strip may include (a) a sample pad into which a sample is absorbed; (b) a conjugate pad that binds to a protein of at least one gene selected from the 20 gene groups in the sample; (c) a test membrane which is treated with a test line and a control line including monoclonal antibodies against proteins of any one or more genes selected from the 20 gene groups; (d) an absorption pad on which the remaining sample is absorbed; And (e) a support. Rapid test kits, which also include immunochromatographic strips (I ⁇ unochromatographic strips), include antibodies specific for the marker protein. The antibody is an antibody having high specificity and affinity for each marker protein and little cross reaction to other proteins.
  • the antibody is a monoclonal antibody, polyclonal antibody or recombinant antibody.
  • Rapid test kits may also include antibodies specific for the control protein.
  • Other rapid test kits include reagents capable of detecting bound antibodies, such as nitrocell membranes to which specific and secondary antibodies are immobilized, membranes bound to beads to which antibodies are bound, absorbent pads and samples. And other materials required for diagnosis, such as a pad.
  • the measurement of protein expression level by immunological dot assay may comprise (a) dotting a biological sample on the membrane; (b) reacting an antibody specific for a protein of any one or more genes selected from the group consisting of the 20 genes with the instilled membrane; And (c) said Preferably, the method comprises the steps of adding and developing a secondary antibody conjugated with a marker to the reacted membrane, wherein the ELISA assay comprises (a) antibody 1 specific for a protein of a gene having a nucleotide sequence for the marker.
  • Adsorbing to the solid phase (b) contacting the solid adsorbed antibody 1 with a biological sample of a brain injury patient to form an antigen-antibody complex; (c) treating the antibody 2 specific for the protein encoded by the gene having a nucleotide sequence for the marker to which the labeling substance is bound and binding to the complex; And (d) is preferably a sandwich ELISA assay comprising the step of detecting the concentration of the protein by detecting the label, the protein microarray assay (a) specific for the protein of the gene consisting of the marker Immobilizing the polyclonal antibody on the chip; (b) contacting the immobilized polyclonal antibody 1 with a biological sample of a brain injury patient to form an antigen-antibody complex; (c) treating a monoclonal antibody specific for a protein encoded by a gene having a nucleotide sequence for the marker to which the label is bound to bind the complex; And (d) detecting the label and measuring the concentration of the protein.
  • antigen-antibody complex means a combination of a marker protein and an antibody specific thereto, and the amount of antigen-antibody complex formed can be measured quantitatively through the size of a signal of a detection ion label. Do.
  • the detection label may be selected from the group consisting of enzymes, fluorescent materials, ligands, luminescent materials, microparticles, redox molecules and radioisotopes, but is not necessarily limited thereto.
  • enzymes include ⁇ -glucuronidase and ⁇ -D-.
  • Glucosidase ⁇ -D-galactosidase, urease, peroxidase or alkaline phosphatase, acetylcholinesterase, glucose oxidase, nucleokinase and GDPase, RNase, glucose oxidase and luciferase, phosphope Lactokinase, phosphoenolpyruvate carboxylase, aspartate aminotransferase, phosphphenolpyruvate decarboxylase, ⁇ -latamase and the like, but are not limited thereto.
  • Fluorescent materials include, but are not limited to, fluorescein, isothiocyanate, rhodamine, phycoerythrin, phycocyanin, allophycocyanin, 0-phthalaldehyde, fluorescamine, and the like.
  • Ligands include, but are not limited to, biotin derivatives.
  • Luminescent materials include, but are not limited to, acridinium ester, luciferin, luciferase, and the like.
  • Microparticles include, but are not limited to, colloidal gold, colored latex, and the like.
  • Redox molecules include ferrocene, ruthenium complex, biologen, quinone, Ti ion, Cs ion, diimide, 1,4-benzoquinone, hydroquinone, K4 W (CN) 8, [Os (bpy) 3] 2+, [RU (bpy) 3] 2+, [MO (CN) 8] 4- and the like.
  • Radioisotopes include, but are not limited to, 3H, 14C, 32P, 35S, 36C1, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 1251, 1311, 186Re, and the like.
  • the protein expression level is preferably measured by ELISA.
  • ELISA is a direct ELISA using a labeled antibody that recognizes an antigen attached to a solid support, an indirect ELISA using a labeled antibody that recognizes a capture antibody in a complex of antibodies that recognize an antigen attached to a solid support, attached to a solid support
  • Direct sandwich ELISA using another labeled antibody that recognizes the antigen in the antibody-antigen complex a labeled antibody that recognizes the antibody after reacting with another antibody that recognizes the antigen in the complex of the antigen and the antibody attached to the solid support
  • Various ELISA methods include indirect sandwich ELISA using secondary antibodies.
  • the antibody is attached to a solid support and the sample is reacted, followed by enzymatic coloration by attaching a labeled antibody that recognizes the antigen of the antigen-antibody complex. It is detected by the sandwich ELISA method which attaches labeled secondary antibody to the antibody which recognizes an antigen, and enzymatically develops.
  • Western blot using at least one antibody against the marker is used.
  • the whole protein is separated from the sample, electrophoresed to separate the protein according to size, and then transferred to the nitrosarose membrane to react with the antibody.
  • the amount of protein produced by the expression of the gene can be confirmed, and the monitoring or prognosis for alleviation or alleviation of brain injury symptoms can be analyzed.
  • the detection method consists of examining the expression level of the marker gene in the control group and the expression level of the marker gene in the brain injury patients administered erythropoietin and umbilical cord blood.
  • mRNA or protein levels are absolute (eg, Or relative (eg, relative strength of a signal).
  • immunohistostaining is performed using at least one antibody against the marker.
  • paraffin embedding blocks are prepared by methods well known in the art. These are sliced into pieces of several thicknesses and attached to glass slides, and then reacted with one of the above antibodies by a known method. Thereafter, the unreacted antibody is washed and labeled with one of the above-mentioned detection labels to read whether or not the antibody is labeled on a microscope.
  • one or more antibodies against the marker are arranged at a predetermined position on the substrate to use a protein chip immobilized at a high density.
  • the protein is separated from the sample, and the separated protein is hybridized with the protein chip to form an antigen-antibody complex, and then read and checked for the presence or expression of the protein.
  • Monitoring or prognosis for alleviation or alleviation of brain damage Can be analyzed.
  • the kit of the invention may be a microarray.
  • the kit of the invention is a gene amplification kit.
  • kit of the present invention When the kit of the present invention is a microarray, a probe is immobilized on the solid surface of the microarray.
  • kit of the present invention When the kit of the present invention is a gene amplification kit, it includes a primer.
  • the probe or primer used in the kit of the present invention has a sequence complementary to nucleotides of SEQ ID NO: 2 or nucleotides of SEQ ID NO: 4.
  • the term “complementary” means having a degree of complementarity that can be selectively hybridized to the above-described nucleotide sequence under certain specific hybridization or annealing conditions.
  • the term “complementary” has a meaning different from that of the term perfectly complementary, and the primers or probes of the present invention can be selectively hybridized to the above-described nucleotide sequence, so long as it has one or more mismatches. (mismatch) can have a nucleotide sequence.
  • primer can serve as an initiation point for template-directed DNA synthesis under suitable conditions (ie, four different nucleoside triphosphates and polymerases) in a suitable complete solution at a suitable temperature.
  • suitable conditions ie, four different nucleoside triphosphates and polymerases
  • Suitable lengths of primers are typically 15-30 nucleotides, although varying with various factors, such as temperature and the use of the primer.
  • Short primer molecules General ⁇ demands a lower temperature in order to form a stable complex heunseong sufficiently the mold with a layer.
  • the sequence of primers is a sequence that is completely complementary to some sequences of the template. It is not necessary to have it, and if it has a complementary complementarity within the range that can be common with the template to perform the primer-specific action, it is divided. Therefore, the primer in the present invention does not need to have a sequence that is perfectly complementary to the above-described nucleotide sequence as a template, and is sufficient if it has a sufficient complementarity within a range capable of becoming a primer by acting on this gene sequence.
  • the design of such primers can be easily carried out by those skilled in the art with reference to the above-described nucleotide sequence, for example, by using a program for primer design (eg, PRIMER 3 program).
  • probe refers to a linear oligomer of natural or modified monomers or linkages, including deoxyribonucleotides and ribonucleotides and capable of specifically localizing to the target nucleotide sequence, which is naturally occurring Or artificially synthesized.
  • the probe of the present invention is preferably single chain and oligodioxyribonucleotides.
  • nucleotide sequence of the marker of the present invention to be referred to in the preparation of the primer or probe is SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, the primer or probe can be designed with reference to this sequence.
  • the probe is used as a hybridizable array element and is immobilized on a substrate.
  • Preferred gases include suitable rigid or semi-rigid supports such as membranes, filters, chips, slides, wafers, fibers, magnetic beads or nonmagnetic beads, gels, flows, plates, polymers, microparticles and capillaries.
  • Said localization array element is arranged and immobilized on said gas. This immobilization is carried out by chemical bonding methods or by covalent binding methods such as UV.
  • the hybridization array element can be bonded to a modified glass surface that includes an epoxy compound or an aldehyde group, and can also be bonded by UV at the polylysine coated surface.
  • the localization array element can be bound to the gas via a linker (eg, ethylene glycol oligomer and diamine).
  • sample DNA to be applied to the microarray of the present invention can be labeled and is shaken with the array elements on the microarray.
  • the conditions for homogenization can vary. Detection and analysis of the degree of localization may vary depending on the labeling agent.
  • the kit for monitoring or prognostic analysis for alleviating or alleviating the brain injury symptoms of the present invention can be carried out on the basis of localization.
  • a probe having a sequence complementary to the nucleotide sequence of the marker of the present invention described above is used.
  • Monitoring or prognosis for the alleviation or alleviation of brain injury symptoms can be analyzed by a shake-based analysis using a probe that is common to the nucleotide sequence of the marker of the present invention described above.
  • the label of the probe can provide a signal to detect whether it is active, which can be linked to a lygonucleotide.
  • Suitable labels include fluorophores (eg, fluorescein, phycoerythrin, rhodamine, lissamine, and Cy3 and Cy5 (Pharmacia), chromophores, chemilumines, magnetic particles, radioisotopes Elements (P32 and S35), mass labels, electron dense particles, enzymes (alkaline phosphatase or horseradish peroxidase), cofactors, substrates for enzymes, heavy metals (eg gold) and antibodies, streptavidin, biotin And hapten with specific binding partners such as digoxigenin and chelating groups.
  • fluorophores eg, fluorescein, phycoerythrin, rhodamine, lissamine, and Cy3 and Cy5 (Pharmacia)
  • chromophores eg, phyco
  • Labeling is carried out in a variety of methods conventionally practiced in the art, such as nick translation methods, random priming methods (Mult ipr ime DNA labeling systems booklet, "Amersham” (1989)), and chination methods (Maxam & Gilbert). , Methods in Enzymology, 65: 499 (1986)). Labels are fluorescent, radioactive, colorimetric, gravimetric, X-ray diffraction or absorption, magnetic, enzymatic It provides a signal that can be detected by activity, mass analysis, binding affinity, shaking high frequency, and nanocrystals.
  • the nucleic acid sample to be analyzed may be prepared using mRNAs obtained from various biological samples, and preferably, may be prepared using mRNAs obtained from blood. Instead of the probe, the cDNA to be analyzed may be labeled to perform a shake reaction-based analysis.
  • probes When using probes, probes are localized with cDNA molecules.
  • suitable isomerization conditions can be determined in a series of procedures by an optimization procedure. This procedure is carried out by a person skilled in the art to establish a protocol for use in the laboratory. For example, conditions such as temperature, concentration of components, shake and wash time, complete fluid components and their pH and ionic strength depend on various factors such as probe length and GC amount and target nucleotide sequence. Detailed conditions for the shake are described in Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001); And MLM Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer® Ver lag New York Inc. NY 1999).
  • the high stringency conditions are 0.5 M NaHP0 4 , 7% sodium dodecyl sulfate (SDS), 1 mM EDTA at 65 ° C, 0.1 x SSC (standard saline citrate) / 0.1% In SDS it is meant to wash at 68 ° C.
  • high stringency conditions mean washing at 48 ° C. in 6 ⁇ SSC / 0.05% sodium pyrophosphate.
  • Low stringency means washing at 42 ° C., for example, at 0.2 ⁇ SSC / 0.1% SDS.
  • the localization signal can be carried out by various methods, for example, depending on the type of label bound to the probe.
  • the probe may be labeled with an enzyme
  • the substrate of the enzyme can be reacted with the result of the shake reaction to confirm whether it is shaken.
  • Combinations of enzymes / substrates that can be used include ⁇ peroxidase (eg horseradish peroxidase) and chloronaph, aminoethylcarbazole, diaminobenzidine, D-luciferin, lucigenin (bis-N-methylacrididi Nitrate), resorupin benzyl ether, luminol, amplex red reagent (10-acetyl-3, 7-dihydroxyphenoxazine), HYR (p-pheny 1 ened i am i ne-HC 1 and pyrocatechol), Tetramethylbenzidine (TMB), ABTS (2,2'-Azine-di [3-ethyl benzthiazol ine sulfonate]), o-phenylenediamine (OPD) and naph / pyronine; Alkaline phosphatase with bromochloroindolyl phosphate (BCIP), nitro blue te
  • the method of detecting the marker of the present invention comprises: (i) subjecting a probe having a sequence complementary to the nucleotide sequence of the marker of the present invention to a nucleic acid sample; ( ⁇ ) detecting whether the localization reaction occurs.
  • the signal for the nucleotide sequence of the marker of the present invention is stronger in the sample than in the normal sample (for example, a brain injury patient not receiving erythropoietin and umbilical cord blood), it is considered that the brain injury symptoms are alleviated or alleviated.
  • the kit for monitoring or prognostic analysis for the reduction or alleviation of the brain injury symptoms of the present invention may be a gene amplification kit.
  • amplification refers to a reaction that amplifies a nucleic acid molecule.
  • Various amplification reactions have been reported in the art, which is a polymerase Chain Reaction (PCR) (US Pat. Nos. 4,683, 195, 4,683,202, and 4,800, 159), reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT— PCRX Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001) )), Miller, HI (W0 89/06700) and Davey, C. et al.
  • PCR polymerase Chain Reaction
  • nucleic acid sequence based am lifi cat i on (NASBA) US Pat. No. 5,130,238, 5,409,818, 15, 554, 517, and 6, 063, 603), strand displacement amplification and loop-promoted constant temperature amplification (loop—mediated isothermal) amplification; LAMP), but is not limited thereto.
  • Other amplification methods that can be used are described in US Pat. Nos. 5, 242, 794, 5,494,810, 4, 988, 617 and US Pat. No. 09 / 854,317.
  • PCR is the best known nucleic acid amplification method, and many modifications and uses have been developed. For example, touchdown PCR, hot start PCR, nested PCR and booster PCR have been developed by modifying traditional PCR procedures to enhance the specificity or sensitivity of PCR.
  • real-time PCR differential display PCR (DD-PCR), rapid amplification of cDNA ends (RACE), multiplex PCR, inverse polymerase Inverse polymerase chain react ion (IPC), vectorette PCR and thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR) have been developed for specific applications.
  • DD-PCR differential display PCR
  • RACE rapid amplification of cDNA ends
  • IPC inverse polymerase Inverse polymerase chain react ion
  • TAIL-PCR thermal asymmetric interlaced PCR
  • gene amplification reaction is performed to examine the expression level of the nucleotide sequence of the marker of the present invention. Since the present invention analyzes the expression level of the nucleotide sequence of the marker of the present invention, the mRNA amount of the nucleotide sequence of the marker of the present invention is examined in a sample (for example, blood, plasma, serum or urine) of the analyte. The degree of expression of the nucleotide sequence of the marker of is determined.
  • the present invention performs gene amplification reaction using primers that bind to mRNA or cDNA as a template of mRNA in a sample.
  • total RNA is isolated from the sample. Isolation of total RNA can be carried out according to conventional methods known in the art. See Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001); Tesniere , C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9: 242 (1991); Ausubel, FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, John illey & 5o / 75 (1987); and Chomczynski, P.
  • TRIz can be used to easily isolate total RNA in cells.
  • cDNA is synthesized from the isolated mRNA, and the cDNA is amplified. Since the total RNA of the present invention is isolated from human samples, it has a poly-A tail at the end of the mRNA, and cDNA can be easily synthesized by using the ligation and dT primer and reverse transcriptase using this sequence characteristic.
  • the synthesized cDNA is amplified by gene amplification reaction.
  • the primers used in the present invention are hybridized or annealed to one site of the template to form a double chain structure.
  • Conditions for nucleic acid localization suitable for forming such double chain structures include Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001) and Haymes, BD, et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985).
  • Various DNA polymerases can be used for amplification of the present invention and include "Clenau" fragments of E. coli DNA polymerase I, thermostable DNA polymerase and bacteriophage T7 DNA polymerase.
  • the polymerase is a thermostable DNA polymerase obtained from various bacterial species, which include Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophi lus (Tth), Thermus fi liformis, Therm is f 1 avus, Thermococcus literal is, and Pyrococcus furiosus (Pfu).
  • Tiq Thermus aquaticus
  • Tth Thermus thermophi lus
  • Th Thermus fi liformis
  • Therm is f 1 avus
  • Thermococcus literal is, and Pyrococcus furiosus (Pfu).
  • the reaction container When carrying out the polymerization reaction, it is desirable to provide the reaction container with an excess amount of the components required for reaction. Excess of components necessary for amplification reaction means an amount such that the amplification reaction is not substantially limited to the concentration of the components.
  • the amplification process of the present invention can be carried out in a single reactant without changing conditions such as the addition of the reaction product.
  • Annealing in the present invention is carried out under stringent conditions allowing specific binding between the target nucleotide sequence and the primer. Stringent conditions for annealing are sequence-dependent and vary with ambient environmental variables.
  • the cDNA of the nucleotide sequence of the marker of the present invention thus amplified is analyzed by a suitable method to investigate the expression level of the nucleotide sequence of the marker of the present invention. For example, the degree of expression of the nucleotide sequence of the marker of the present invention is examined by performing gel electrophoresis on the amplification reaction product described above and observing and analyzing the resulting band.
  • amplification reaction if the expression of the nucleotide sequence of the marker of the present invention in a biological sample is higher than that of a normal sample (eg, blood, plasma or serum of a brain injury patient not receiving erythropoietin and umbilical cord blood), alleviation of brain injury symptoms is reduced. Or is considered to be relaxed.
  • a normal sample eg, blood, plasma or serum of a brain injury patient not receiving erythropoietin and umbilical cord blood
  • the method for detecting a marker for alleviating or alleviating the brain injury symptoms of the present invention is performed based on the amplification reaction using cDNA, specifically (i) using a primer annealed to the nucleotide sequence of the marker of the present invention Conducting an amplification reaction; And ( ⁇ ) analyzing the product of the amplification reaction to determine the expression level of the nucleotide sequence of the marker of the present invention.
  • the marker of the present invention is a biomolecule that is highly expressed in brain injury patients administered erythropoietin and umbilical cord blood. High expression of such markers can be measured at the mRNA or protein level.
  • the term "high expression” as used herein refers to a case where the expression level of the nucleotide sequence of interest in the sample to be investigated is high compared to the control sample.
  • expression assay methods commonly used in the art, such as RT—PCR methods or ELISA methods (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001)
  • RT—PCR methods or ELISA methods
  • the present invention provides a nucleotide or sequence 4 sequence of SEQ ID NO: 2 in the biological sample of human in order to provide information necessary for monitoring or prognostic analysis for the reduction or alleviation of brain injury symptoms It provides a method for detecting the expression or monitoring of prognostic markers for the reduction or alleviation of brain injury symptoms through a method of detecting the expression of nucleotides of.
  • the biological sample in the present invention means tissue, cells, blood, serum, blood serum, salivary cerebrospinal fluid or urine, preferably blood, plasma or serum, and most preferably plasma.
  • a method for detecting or relieving brain injury symptoms or detecting a prognostic marker includes contents common to a monitor or prognostic kit for monitoring or alleviation of brain injury symptoms.
  • the common content between them is omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.
  • the present invention provides a kit for monitoring or prognostic analysis for the reduction or alleviation of brain injury symptoms following administration of erythropoietin, umbilical cord blood or erythropoietin and umbilical cord blood.
  • the present invention provides a method for detecting prognostic markers or monitoring for alleviation or alleviation of brain injury symptoms following administration of erythropoietin, umbilical cord blood or erythropoietin and umbilical cord blood.
  • the present invention can effectively monitor the alleviation or alleviation of brain injury symptoms following administration of erythropoietin, umbilical cord blood or erythropoietin and umbilical cord blood.
  • A GMPMCGross Motor Performance Measure
  • B Korean Bay ley Scale 2 nd version, Mental Scale
  • C Korean Bay ley Scale 2 nd version , Motor Scale
  • D Social Cognition of 'WeeFIM, Functional Independence Measure for Children'
  • Figure 2 shows changes in the levels of plasma pentraxin (Pentraxin, PTX) 3, (Brain-derived neurotrophic factor) and C-react ive protein (CRP) in brain injury patients before and after 24 hours after erythropoietin and cord blood administration It is a graph.
  • PTX plasma pentraxin
  • CRP C-react ive protein
  • FIG. 3 is a graph showing changes in the level of plasma pentraxine 3 in brain injury patients with time after erythropoietin and umbilical cord blood administration (before administration, after 24 hours, after 4 days, after 8 days). '
  • Figure 4 is a graph showing the average value (24 hours, 11 days, 3 months post-dose, before administration, plasma fentracin 3 (Table 4) for each brain injury patients with erythropoietin and cord blood administration).
  • FIG. 5 is a graph showing changes in plasma BDNF levels according to brain injury patients following erythropoietin and cord blood administration.
  • FIG. 6 is a graph showing changes in the levels of plasma pentraxine 3 and BDNF in brain injury patients (P **) following erythropoietin and cord blood administration.
  • Figure 7 shows the blood of brain injury patients following erythropoietin and umbilical cord blood administration It is a graph showing the mean value of intestinal pentraxine 3 and changes in BDNF levels (24 hours before administration, 4 days, 8 days before administration).
  • FIG. 8 is a graph showing the average value of plasma BDNF level change (24 hours before administration, 6 months before administration) of erythropoietin and umbilical cord blood administration patients.
  • FIG. 9 is a graph showing changes in the plasma CRP levels of brain injury patients according to erythropoietin and umbilical cord blood administration.
  • FIG. 10 is a graph showing the average value of plasma CRP level change (24 hours, 4 days, 8 days after administration, before administration) of erythropoietin and cord blood administration patients.
  • SB bilateral paralysis (Spastic bilateral), SU: Unilateral Paralysis (Spastic unilateral), D: muscle tone more than (Dystonia), C: Martial mujeongwi movement (Choreoathetosis;), A: ataxia (Ataxia) (Bax, 2005) rhEPO Prescription
  • a group of patients prescribed rhEPO were given 250 IU / kg and injected subcutaneously twice a week. 250 IU / kg is greater than the amount used in patients with anemia. Whole blood cell counts were measured every week until discharge to watch for erythrocytosis. The rhEPO regimen was discontinued when hemoglobin levels were elevated above 15 g / dL, and iron supplementation was forbidden during the regimen. For more than a month, the group who received rhEPO was given an average of 7.2 times (1,800 IU / kg) (the equivalent of 5 to 9 injections about 1,500 to 2,500 IU / kg).
  • Umbilical Cord Blood Mononuclear cells were prepared by dissolving cord blood and injected 3.0-5.0 ⁇ 10 7 cells / kg into the blood vessel (peripheral, central vein or artery) with an immunosuppressant (cyclosporine, 100-200 ng / kg, 4 weeks). When administered with EP0, 500 IU / kg of EP0 was first injected intravenously 12 and 2 hours prior to umbilical cord blood (umbilical cord blood was given only once and EP0 was administered 6-10 times). Determination of Pentraxine 3
  • PTX3 pentraxin 3
  • 150 ⁇ of biotinylated ⁇ 3 antibodies were treated on streptavidin-coated microplates and incubated at room temperature for 1 hour, and then washed twice using 400 ⁇ wash buffer. Washed. 3 ⁇ l Pretreatment D was added to 30 ⁇ of plasma samples, incubated for 30 minutes, and standard recombinant PTX3 was prepared by diluting serially from 20 ng / ml to 0.31 ng / ml.
  • sample buffer 100 ⁇ l of sample buffer was first added to the microplate, and 30 ⁇ l of standard sample and sample were added thereto, followed by incubation at room temperature for 2 hours, and washed four times using 400 ⁇ l of washing buffer.
  • 150 ⁇ I of ⁇ 3 detection antibody (HRP conjugated) were treated, incubated at room temperature for 2 hours, and washed four times using a 400 ⁇ wash buffer.
  • 200 ⁇ l of ⁇ was added and reacted for 30 minutes. After 50 ⁇ , stop solution treatment, 450 nm absorbance was measured.
  • BD F measurement 150 ⁇ coated with BDNF antibody on a microplate was used. Sample buffer was first placed in microplates at 100 ⁇ l and plasma was added at 50 ul. The plasma used was centrifuged at 10,000 X g for 10 minutes to completely remove platelets. Blood was used. All plasmas were used as EDTA antidiarrheal agents. After incubation at room temperature for 2 hours, 100 ⁇ l of BDNF detection antibody (HRP conjugated) was added immediately without washing, and incubated at room temperature for 1 hour. After washing three times, 200 ⁇ of ⁇ was added and reacted for 30 minutes. After treatment with 50 ⁇ 1 of stop solution, absorbance of 450 nm was measured. Experiment result
  • UCBCUmbilical Cord Blood (UMB) group received rhEPO for 4 weeks after umbilical cord blood, and EP0 group received placebo umbilical cord blood and rhEPO for 4 weeks.
  • placebo umbilical cord blood was administered and placebo rhEPO was administered for 4 weeks.
  • UCB group, EP0 group, and control group received 6 months of rehabilitation.
  • Cognitive and motion scores were measured.
  • the GMPM (FIG. 1A), BSID-II recognition (FIG. 1B), and motion (FIG. 1C) scores in the group treated with cord blood and EP0 showed high scores compared to the EP0 treatment group and the control group.
  • the cord blood and EP0 administration were effective in improving the symptoms of cerebral palsy patients.
  • PTX3 and BDNF levels were measured in plasma of cerebral palsy patients who received EP0 and cord blood.
  • PTX3 increased 24 hours after EP0 and umbilical cord blood administration in patients with Park ** and Kim ** who measured biomarker levels, and BDNF and CRP did not decrease or show a significant difference (FIG. 2).
  • IL-6, IL1B, TNF- ⁇ , CRP, BDNF and PTX3 were measured in plasma of brain injury patients who received EP0 and cord blood.
  • the numerical changes of PTX3C Tables 3 and 4, BDNF (Table 5) and CRP (Table 6) for each patient are shown in the table (-indicates no blood collection).
  • PTX3 increased in 24 hours after administration in patients injected with EP0 and cord blood, and gradually decreased after 4 days and 8 days (FIG. 3).
  • BDNF was individually administered at time post dose for this ** (1) patient.
  • BDNF increased gradually, and in this ** (2) patient, BDNF levels increased and decreased within 24 hours (Fig. 5), but in general, BDNF after 24 hours after the procedure. Decreased and increased after 6 months (FIG. 8).
  • PTX3 increased after 24 hours of umbilical cord blood and EP0 administration, and BDNF did not show any significant difference, but BDNF levels tended to increase after 168 days of administration (FIG. 6).
  • CRP could not confirm a specific change before and after EP0 and umbilical cord blood administration (Fig. 9).
  • PTX3 In the case of conventional inflammatory biomarkers (TNF-a, IL- ⁇ , IL-6), the sensitivity of the inflammatory response was lower than that of PTX3 biomarkers. do.
  • the value considered to be inflammation in the measurement value of PTX3 is 50 ng / ml or more, but the PTX3 level of patients with cord blood and EP0 administration was usually less. There was a difference of about 10-20 ng / ml in the measured values among patients, but the changes and associations of PTX3 levels before and after EP0 and umbilical cord blood were common. Therefore, PTX3 has the potential to be used as a marker for evaluating the timing and extent of the procedure by short-term monitoring.

Abstract

본 발명은 에리스로포이에틴 및 제대혈 투여에 따른 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 분석용 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 에리스로포이에틴 및 제대혈 투여에 따른 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 마커를 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명을 이용하면 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화를 효과적으로 모니터링 할 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
뇌 손상 증세의 경감또는 완화에 대한 바이오마커 【기술 분야】
본 발명은 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 바이오마커에 관한 것이다.
【관련 특허출원】
본 특허출원은 2012 년 1 월 27 일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10-2012-0008259 호 및 제 10—2012-0008270 호에 대하여 우선권을 주장하며， 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 【배경 기술】
뇌 세포들의 파괴 또는 퇴화를 의미하는 뇌손상 (brain injury)은 비교적 빈번하고 광범위하게 일어.난다. 뇌손상은 광범위한 내적 및 외적 요인들에 의해 일어나는데， 가장 많은 수의 손상을 포함하는 흔한 유형은 외부 원인으로부터의 물리적인 외상 또는 두부 손상에 따른 외상성 뇌손상 (Traumatic brain injury, TBI)이며， 생후에 발생하는 뇌손상을 선천성 장애로부터 기인한 손상과 구별하기 위하여 후천적 뇌손상 (ABI)이라고 불린다. 뇌손상은 장기적 저산소증， 알코을을 포함한 기형 발생물질들에 의한 중독， 감염 및 신경학적 질병 등이 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 또한, 화학요법 (chemotherapy)은 신경줄기세포 및 미엘린 (myelin)을 생성하는 올리고덴드로사이트 (ol igodendrocyte)에 손상을 입힐 수도 있다. 이 외에도 뇌손상의 흔한 원인으로는 외상적 뇌손상, 뇌졸중, 동맥류， 수술， 기타 신경학적 장애， 및 중금속 중독 등과 같은 생리적 외상이 있을 수 있다.
뇌졸중은 크게 2가지로 나누는데， 뇌조직으로 가는 혈액 공급의 감소 흑은 차단으로 뇌조직의 허혈상태로 발생하는 허혈성 뇌졸중 (ischemic stroke)과 혈관이 터져 뇌조직으로 출혈을 일으키는 출혈성 뇌졸중 (hemorrhagic stroke)으로 구분하고 있으며, 허혈성 뇌졸중은 전체 뇌졸중 환자의 약 80% 정도를 차지하고 환자의 약 3분의 1은 사망하는 심각한 질환이라고 할 수 있다. 특히 상기 허혈성 뇌졸중은 동맥 혈액 유입의 폐쇄에 의해 유발되는 혈액의 불층분한 뇌 순환으로부터 발생한다. 통상적으로, 적절한 뇌 혈액 공급은 뇌 내부의 동맥 체계에 의해 보장된다. 그러나 염증 및 죽상동맥경화증을 포함하는 다양한 질환은 혈전, 즉， 혈관에 생성되는 혈괴를 발생시킬 수 있다. 혈전은 동맥 혈류를 방해하여， 뇌 허혈 및 후속적인 신경 증상을 일으킬 수 있다. 허혈성 뇌졸중은 또한 심장에서 형성된 혈전의 조각인 색전이 혈관을 차단함으로써 발생될 수 있고， 부적절한 뇌 혈류와 함께 감소된 관류 압력 또는 증가된 혈액 점성을 유발한다.
상기 뇌졸중에 이용 가능한 두 가지 치료법이 있다. 하나는 혈류를 증가시킴으로써 동맥에서의 산소 및 글로코오스의 결핍을 완화시키는 것이고， 다른 하나는 대뇌 허혈 및 흥분독성에 의해 유도되는 신경 파괴를 차단하는 것을 통해 뉴런을 보호하는 것이다. 임상적으로 이용되는 뉴런 보호제는 칼슘 채널 차단체, 글루타메이트 수용체의 일종인 NMDA 수용체 길항제 등이 있다. 그러나 상기 치료방법은 효능이 낮은 반면에 부작용 발생률이 높아 상기 치료제의 효력을 증가시킬 수 있고 동시에 정상조직에 미치는 부작용을 크게 줄일 수 있는 방법의 개발이 절실하게 필요한 상황이다.
뇌성마비 (Cerebral palsy, CP) 역시 뇌손상의 한 형태로서 뇌성숙이 이루어지지 않은 태아기， 혹은 영아기에서 뇌의 손상이 일어난 경우에 발생한다 . 뇌성마비는 운동 및 자세 발달 손상을 포함하는 장애의 하나로 태아 또는 유아기에 뇌에 다양한 비진행성 손상을 입어 발생하게 된다. 뇌성마비에서 운동 장애는 흔히 감각, 인지, 의사소통， 사시, 시지각 및 행동 장애를 동반한다 (Bax M et al . , Dev Med Child Neurol 47:571- 576(2005)). 뇌성마비에 대한 치료법은 물리， 작업, 언어 및 심리 치료를 포함하는 재활 치료이다. 그 밖에 다른 치료 방법으로 항-뇌성마비 약물， 보를리누스균의 주사, 정형외과 수술 보조기 등이 있다. 이렇게 많은 치료를 하여도 현재까지는 뇌성마비에 대한 획기적이고 근본적인 치료 방법은 없는 실정이다.
최근 연구들은 뇌 가소성의 가능성을 자극함으로써 잠재적 효과를 나타낼 수 있다고 보고하고 있으며， 이것은 뇌손상 환자에서 긍정적인 효과를 나타낸다 (Harvey RL., Phys Med Rehab i 1 Clin N Am 14:S1_S5(2003) , Wittenberg GF., Dev Med Child Neurol 51(Suppl 4)： 130-133(2009)) . 성인에서보다는 소아의 뇌가 보다 높은 잠재적 가소성을 갖는다고 생각되어지는데， 예를 들면 뇌손상이 있는 어린 랫트 (생후 10일)가 뇌손상이 있는 늙은 랫트 (생후 63일 또는 180일)에 비해 보다 빠르고 완전한 뇌손상 회복을 나타낸다 (Yager JY et al. , Behav Brain Res 173：171-180(2006)). 즉， 초기 진단 및 즉각적인 재활치료가 뇌 가소성을 자극하여 손상된 뇌를 최대로 개선시킴으로써 뇌손상 치료에 효과적인 결과를 가져올 수 있다고 볼 수 있다. 따라서 뇌성마비 유아의 초기 치료 프로그램은 운동 및 인지 발달에 있어 유익한 효과를 가져온다 (Blauw- Hospers CH et al . , Neurosci Biobehav Rev ?>1 1201-1212(2007) ) .
뇌 가소성 요소들을 증대시키는 것은 특히 유아기 재활치료의 효과를 극대화시킬 수 있을 것이다. 최근, 에리스로포이에틴 (erythropoietin EP0) , G_CSF( granulocyte colony-stimulating growth factor) 및 GM一 CSF ( gr anu 1 ocy t e-macr ophage colony stimulating factor)가 뇌 가소성을 증대시키는 임상학적 능력을 갖는다는 것이 알려졌다 (Maurer 丽 et al . Curr Med Chem 15:1407-1411(2008)). 또한, 다른 신경 성장 인자， 섬유아세포 성장인자 -2 및 8, 상피세포 성장인자, 소닉 헤지호그， 뼈 형태형성 단백질 4, 뇌유래 신경성장 인자 및 혈관내피 세포성장 인자가 신경보호 효과 및 신경재생 효과를 갖고 있다는 것이 알려졌다. 이러한 분자들 가운데 재조합 인간 에리스로포이에틴 (recombinant human EPO, rhEPO)는 임상적 유효성 및 가장 적은 부작용을 나타내기 때문에 뇌졸중， 외상성 뇌 손상， 파킨슨병， 만성 뇌질환 환자 및 뇌성마비 유아에게 더욱 효과적일 수 있다. 동물실험에서 rhEPO는 뇌 허혈 (Iwai M et al .， Stroke 38:2795-2803(2007)), 산소과다 -유도 뇌세포 사멸 (Kaindl AM et al. , Ann Neurol 64 :523-534 (2008)) 및 지질다당질 -유도 백질 손상을 입은 신생아 (Kumral A et al . , Neonatology 92 :269-278(2007))에서 신경보호 효과를 나타냈다. 또한, rhEPO는 혈관형성 효과 (Marti HH et al . , News Physiol Sci 15 :225-229(2000))를 갖는다는 것이 알려져 있으며 신생아 뇌졸중 환자에서 신경발생을 증가시킨다 (Gonzalez FF et al . , Dev Neurosci 29:321-330(2007)). 더욱이 신생아집중치료실에 있는 초미숙아에게 rhEPO를 투여하면 신경발달이 개선된다 (Neubauer AP et al. , Ann Neurol 67： 657- 666(2010)).
최근， 혈액-뇌 장벽 (blood-brain— barrier)을 통과시켜 뇌에 신경보호 약물인 에리스로포이에틴 (erythropoietin, EP0)을 전달시키는데 성공하였고 (Zhou QH et al. , Mol Pharm. 7(6) :2148-55(2010))， 이를 통해 뇌졸중 등에 의해서 발생하는 뇌 손상을 조기에 효과적으로 대처하는데 도움이 될 것으로 기대되고 있으며, 다른 외상성 뇌 손상, 파킨슨병， 만성 뇌질환에도 적용될 수 있을 것으로 기대되고 있다.
EP0는 신장에서 생산되는 당단백질 호르몬으로 적혈구 생성을 촉진하여 빈혈이나 암 치료를 받는 환자들에게 도움을 준다. 백만 명 이상의 암환자와 신장 기능 손상이 있는 환자들은 낮은 적혈수 수치 때문에 EP0를 투여하고 있으며, 전세계의 연간 판매액은 90억 달러에 이르고 있다. 또한， EPO를 투여한 어린 마우스들은 학습 능력을 포함하여 뇌기능이 향상되었으며， EP0를 투여한 만성 신부전 환자들에서 인지기능이 향상된다고 보고되는 등 EP0는 뇌에서도 좋은 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.
제대혈은 아기가 태어날 때 탯줄과 태반에 들어있는 혈액으로， 혈액을 만드는 기본 세포인 조혈모세포 및 연골， 뼈, 근육， 신경 등 인체 각 부분으로 분화할 수 있는 간엽줄기세포가 풍부해 줄기세포를 이용한 치료에 사용된다. 임상시험이 완료된 (clinicaltrials.gov의 NCT01041001) 연골 손상 및 퇴행성 관절염 치료계 (카티스템)의 경우 손상된 연골을 완벽하게 재생시키는 치료효과가 임상시험에서 입증돼 머지않아 기존 인공관절 수술을 상당부분 대치할 것으로 기대되며 뇌졸중， 루게릭병， 알츠하이머병 등 만성 퇴행성 신경계 질환도 제대혈 줄기세포를 이용한 치료가 효과적이라는 사실이 동물실험에서 확인돼 현재 임상시험을 준비 중이다. 기본적으로 조혈모세포 이식이 필요한 질병은 모두 제대혈 치료가 가능하고， 백혈병 등의 암과 악성 혈액질환， 선천성 대사장애, 면역장애 질환 등 난치병 치료에 주로 사용되며， 뇌성마비 치료에도 제대혈 이식이 시행되고 있다.
제대혈에는 피를 만드는 조혈모세포뿐 아니라 혈관을 재생하는 전구세포와 신경세포를 재생시키는 간엽줄기세포가 풍부하다. 이런 줄기세포들이 허혈성 뇌성마비의 주요 원인인 손상된 뇌조직의 기능 회복 및 재생에 도움을 준다. 이는 임상시험에서 입증된 사실이며, 미국의 경우 1998년부터 뇌성마비나 두부 손상 등 각종 뇌질환 치료에 본인의 제대혈을 이식하는 치료를 활발히 시행하고 있으며， 독일 ·중국 ·태국ᅳ멕시코 ·러시아에서도 제대혈로 뇌성마비 등 뇌질환을 치료하고 있다. 물론 국내에서도 최근 뇌성마비 환자를 대상으로 한 자가 제대혈 이식치료가 이뤄져 주목올 받은 바 있으며 분당차병원에서는 뇌성마비 환자를 위한 동종 타가 제대혈과 적혈구 생성인자 치료에 대한 대규모 임상시험을 시행하여 성과를 거두었다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 내용】
【해결하려는 과제】
본 발명자들은 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 분석을 위한 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과， 펜트락신 3 또는 BDNF brain-derived neurotrophic factor)가 에리스로포이에틴， 제대혈 또는 에리스로포이에틴과 제대혈 투여에 의한 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화를 모니터링 할 수 있고 예후를 판정할 수 있는 마커임을 규명함으로써 본 발명올 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 분석용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 마커를 검출하는 방법을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
【과제의 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 서열목록 제 1서열 또는 서열목톡 게 3서열의 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 서열목록 제 2서열의 폴리뉴클레오타이드 또는 서열목록 제 4서열의 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 분석용 키트를 제공한다.
본 발명자들은 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 분석을 위한 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였으며， 그 결과， 펜트락신 3 또는 BDNF( bra in-derived neurotrophic factor)가 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화를 모니터링 할 수 있고 예후를 판정할 수 있는 마커임을 규명하였다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 본 발명의 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화는 에리스로포이에틴， 제대혈 또는 에리스로포이에틴과 제대혈 투여에 의해 유도될 수 있다.
본 발명의 펜트락신 3는 에리스로포이에틴 및 제대혈을 투여한 뇌 손상 환자에게서 특이적으로 발현된다. 더욱이 펜트락신 3는 에리스로포이에틴 및 제대혈을 투여하지 않은 뇌 손상 환자와 에리스로포이에틴 및 제대혈을 투여한 뇌 손상 환자를 구별할 수 있는 능력, 즉 에리스로포이에틴 및 제대혈을 투여한 뇌 손상 환자에게서 고발현되는 발현 패턴을 나타내는 마커이다.
본 발명의 펜트락신 3는 뇌 손상 환자에 에리스로포이에틴 및 제대혈을 투여한 후 초기 (24시간 이내)에 고발현되는 패턴을 나타내며， 투여 후 시간이 경과되면 (24시간 이후) 투여 전과 유사한 패턴을 나타낸다. 본 발명의 일 구현 예에 따르면, 펜트락신 3는 에리스로포이에틴 및 제대혈 투여에 대한 단기간 (short-term) 모니터링으로 시술 시기와 그 정도를 평가하는 마커로서 이용될 수 있다.
본 발명의 BDNF는 에리스로포이에틴 및 제대혈을 투여한 뇌 손상 환자에게서 특이적으로 발현된다. 더욱이 BDNF는 에리스로포이에틴 및 제대혈을 투여하지 않은 뇌 손상 환자와 에리스로포이에틴 및 제대혈을 투여한 뇌 손상 환자를 구별할 수 있는 능력, 즉 에리스로포이에틴 및 제대혈을 투여한 뇌 손상 환자에게서 고발현되는 발현 패턴을 나타내는 마커이다.
본 발명의 BDNF는 뇌 손상 환자에 에리스로포이에틴 및 제대혈을 투여한 후 초기 (24시간 이내)에는 저발현되는 패턴을 나타내며, 투여 후 시간이 경과되면 (6개월 이후)에 고발현되는 패턴을 나타낸다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면， BDNF는 에리스로포이에틴 및 제대혈 투여에 대한 장기간 (long-term) 모니터링으로 시술 시기와 그 정도를 평가하는 마커로서 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 뇌 손상 환자에 에리스로포이에틴 및 제대혈을 투여하면 뇌 손상 증세가 경감 또는 완화된다.
본 발명의 명세서에서 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화는 뇌 손상의 증세를 나타내는 지표들이 증세가 개선되는 방향으로 변화한 것을 의미한다. 본 발명의 일 구현에에 따르면, 본 발명의 뇌 손상은 뇌성마비， 뇌졸중， 외상성 뇌 손상 및 파킨슨병으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 질환을 포함한다.
본 발명에서 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제는 예를 들어, 을리고펩타이드, 모노클로날 항체， 폴리클로날 항체， 키메릭 (chimeric) 항체， 리간드， PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머 (aptamer)이다.
본 발명의 명세서에서 용어 "모니터링" 은 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 확인 하는 것을 의미한다.
본 발명의 명세서에서 용어 "예후 " 는 질병의 진행 가능성 과정, 특히， 질병의 차도, 질병의 재생, 종양 재발， 전이 및 죽음 가능성 측면에서의 예측을 포함한다. 바람직하게는， 본 발명에서의 예후는 뇌 손상 환자의 증세가 개선될 가능성을 의미한다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 본 발명의 키트는 면역분석 (immunoassay) 방식, 즉 항원 -항체 반응 방식으로 실시될 수 있다. 이 경우， 상술한 본 발명의 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시된다.
본 발명에서 "항체" 란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상， 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며， 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.
상기한 바와 같이 새로운 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 마커 단백질이 규명되었으므로， 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며， 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들， 예를 들어, 융합 방법 (Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511ᅳ519(1976))， 재조합 DNA 방법 (미국 특허 제 4,816, 56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법 (Clackson et al , Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol. , 222:58, 1- 597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D.， Using Antibodies: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Press, New York, 1999； Zola, H. , Monoclon l Antibodies-' A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984； 및 Coligan ， CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, i ley /Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며， 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법 (hybridoma method) (Kohler 및 Milstein (1976) European Journal of Immunology 6：511-519 참조)， 또는 파지 항체 라이브러리 (Clackson et al, Nature, 352:624-628， 1991； Marks et al , J. Mol. Biol., 222:58， 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동， 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피， 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리， 정제할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성 (affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.
또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라， 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 , Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv등이 있다. 본 발명에서 앱타머는 을리고핵산 또는 펩타이드 분자이며， 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al., Nature 355(6360) :564-6(1992)； Hoppe- Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8) :426-30(2000) ; Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24) : 14272-7(1998)에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 면역분석 (i匪 unoassay)용 키트일 수 있다. 가장 바람직하게는 상기 키트는 루미넥스 분석 키트， 단백질 마이크로어레이 키트 또는 ELISA 키트이다. 상기 루미넥스 어세이 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 및 엘라이자 키트는 상기 단백질군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 단백질에 대한 다클론 항체 및 단일클론 항체， 그리고 표지물질이 결합된 상기 다클론 항체와 단일클론 항체에 대한 2차 항체를 포함한다.
본 발명에서 키트의 종류의 예로는 면역크로마토그래피 스트립 키트， 루미넥스 어세이 키트， 단백질 마이크로어레이 키트， 엘라이자 키트， 또는 면역학적 도트 키트등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명에서 사용 가능한 키트의 종류가 제한되는 것은 아니다.
상기 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반웅성이 거의 없는 항체로, 단일클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 EUSA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약， 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단 (chromophores), 효소 (예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 키트는 복합마커를 동시에 분석하기 위하여 단백질 마이크로어레이를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. 마이크로어레이 키트는 고체상에 결합된 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반웅성이 거의 없는 항체로， 단일클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 단백질 마이크로어레이 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 단백질 마이크로어레이 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약， 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단， 효소 (예: 항체와 융합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 단백질 마이크로어레이를 이용하여 시료를 분석하는 방법은， 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 흔성화시켜서 항원—항체 복합체를 형성시키고， 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 뇌 손상 증세의 경감또는 완화 판단에 필요한 정보를 제공할 수 있다.
루미넥스 어세이 (Luminex Assay)는 소량 (10— 20 의 환자 시료를 전 처리하지 않은 상태에서 최대 100종류의 어낼라이트 (analyte)를 동시에 측정할 수 있는 고용량 (high-throughput) 정량분석방법으로서 감도가 좋고 (pg단위)， 빠른 시간내에 정량이 가능하여 (3-4시간)， 기존의 엘라이자 (ELISA)나 엘리스팟 (ELISP0T)을 대체할 수 있는 분석방법이다. 상기 루미넥스 어세이 (Luminex Assay)는 96-웰 플레이트 (well plate)에 있는 각각의 웰에서 100가지 이상의 생물학적 시료를 동시에 분석할 수 있는 멀티플렉스 형광 마이크로플레이트 (multiplexed fluorescent microplate) 분석방법으로 두 종류의 레이져 감지기 (laser detector)를 사용하여 실시간으로 신호전달을 진행시킴으로 100개 이상의 다른 색깔 군의 폴리스티렌 비드 (polystyrene bead)를 구별하여 정량한다. 상기 100개의 비드는 다음과 같은 방법으로 구별되도특 구성된다. 한쪽은 붉은 형광 비드 (red fluorescence bead)가 열 단계 이상으로 나뉘어 있고, 다른 한 쪽은 오렌지 형광 비드 (orange fluorescence bead)가 열 단계로 나뉘어 강도 (intensity)의 차이를 보이며 그 사이의 비드 (bead)들은 레드 (red)와 오렌지 (orange)의 비율 (ratio)이 각각 다른 비율로 섞여 있어 전체적으로 100개의 색 -코드 비드 세트 (color-coded bead set)를 구성하고 있다. 또한 각각의 비드에는 분석하고자 하는 단백질의 항체가 부착되어 있어 이를 이용한 면역항체반웅으로 단백질 정량이 가능하다. 이 시료는 두개의 레이저 (laser)를 사용하여 분석하는데， 하나의 레이저 (laser)는 비드 (bead)를 감지 (detect ion)하여 비드 고유번호를 알아내고， 다른 레이저는 비드에 붙어 있는 항체와 반웅한 시료 속의 단백질을 감지하게 된다. 따라서 한 웰에서 동시에 100가지의 생체 내 단백질 분석이 가능하다. 이 분석은 15 μϊ 정도의 적은 시료로도 감지가 가능한 장점이 있다.
본 발명의 루미넥스 (Luminex) 어세이를 수행할 수 있는 루미넥스 (Luminex) 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로， 단일클론 항체， 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 루미넥스 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 루미넥스 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약， 예를 들면， 표지된 2차 항체， 발색단, 효소 (예: 항체와 접합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 상기 항체는 미소입자 (micro particle)와 접합된 항체 (conjugated antibody)일 수 있으며， 또한 상기 미소입자는 착색된 라텍스 (colored latex) 또는 콜로이드성 금 입자 (colloidal gold particle)일 수 있다.
본 발명의 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 분석용 키트에서, 상기 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 분석용 면역크로마토그래피 스트립을 포함하는 키트는ᅳ 5분내 분석결과를 알 수 있는 래피드 테스트 (Rapid test)를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. 상기 면역크로마토그래피 스트립은 (a) 시료가 흡수되는 샘플패드 (sample pad); (b) 시료 내의 상기 20개의 유전자 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 단백질과 결합하는 결합 패드 (conjugate pad); (c) 상기 20개의 유전자 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 단백질에 대한 단일클론 항체를 포함하는 반응선 (test line) 및 대조선 (control line)이 처리되어 있는 반응 막 (test membrane); (d) 잔량의 시료가 흡수되는 흡수패드 (absorption pad); 및 (e) 지지체를 포함하는 것이 바람직하다. 또한 면역크로마토그래피 스트립 (I醒 unochromatographic strip)을 포함하는 래피드 테스트 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 상기 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반웅성이 거의 없는 항체로， 단일클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 래피드 테스트 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 래피드 테스트 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약， 예를 들면， 특이항체와 2차 항체가 고정된 나이트로셀를로오스 멤브레인， 항체가 결합된 비드에 결합된 멤브레인， 흡수 패드와 샘플 패드 등 진단에 필요한 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 본 발명에서 면역학적 도트 어세이에 의한 단백질 발현 수준의 측정은 (a) 막에 생물학적 시료를 점적 (dott ing)하는 단계 ; (b) 상기 20 개의 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 단백질에 특이적인 항체를 상기 점적된 막에 반응시키는 단계; 및 (c) 상기 반응시킨 막에 표시체가 접합된 2차 항체를 첨가하고 발색시키는 단계를 포함하는 것이 바람직하고， 상기 엘라이자 어세이는 (a) 상기 마커에 대한 염기서열을 갖는 유전자의 단백질에 특이적인 항체 1을 고상체에 흡착시키는 단계; (b) 상기 고상체에 흡착된 항체 1과 뇌 손상 환자의 생물학적 시료를 접촉시켜 항원 -항체 복합체 형성하는 단계; (c) 표지물질이 결합된 상기 마커에 대한 염기서열을 갖는 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 특이적인 항체 2를 처리하여 상기 복합체와 결합시키는 단계; 및 (d) 상기 표지물질을 검출하여 단백질의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 샌드위치 엘라이자 어세이인 것이 바람직하며， 상기 단백질 마이크로어레이 어세이는 (a) 상기 마커로 구성된 유전자 의 단백질에 특이적인 다클론 항체를 칩에 고정시키는 단계; (b) 상기 고정된 다클론 항체 1을 뇌 손상 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원 -항체 복합체 형성하는 단계; (c) 표지물질이 결합된 상기 마커에 대한 염기서열을 갖는 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 특이적인 단일클론 항체를 처리하여 상기 복합체와 결합시키는 단계; 및 (d) 상기 표지물질을 검출하여 단백질의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 분석 방법들을 통하여, 대조군에서의 항원 -항체 복합체의 형성량과 에리스로포이에틴 및 제대혈을 투여한 뇌 손상 환자에서의 항원- 항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있다.
본 발명에서 용어 "항원 -항체 복합체" 란 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원 -항체 복합체의 형성량은 검출 라벨 (detect ion label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.
이러한 검출 라벨은 효소, 형광물， 리간드， 발광물， 미소입자 (microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며， 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제， β-D- 글루코시다제， β-D-갈락토시다제, 우레아제， 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제， 아세틸콜린에스테라제， 글루코즈 옥시다제， 핵소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제， 포스포프럭토키나제， 포스포에놀피루베이트 카복실라제， 아스파르테이트 아미노트랜스페라제， 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트， 로다민, 피코에리테린， 피코시아닌， 알로피코시아닌， 0-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르， 루시페린， 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금， 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠， 퀴논, Ti 이온, Cs 이온， 디이미드， 1,4-벤조퀴논， 하이드로퀴논, K4 W(CN)8 ， [Os(bpy) 3 ] 2+ , [RU(bpy) 3 ] 2+， [MO(CN) 8 ] 4- 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36C1 , 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 1251， 1311 , 186Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.
단백질 발현수준 측정은 바람직하게는， ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반웅시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는， 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원 -항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원 -항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA방법에 의해서 검출한다.
또한， 바람직하게는, 상기 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고， 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음， 니트로샐루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반웅시킨다. 생성된 항원 -항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여， 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후를 분석할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 유전자의 발현량과 에리스로포이에틴 및 제대혈을 투여한 뇌 손상 환자에서의 마커 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적 (예:
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또는 상대적 (예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.
또한, 바람직하게는， 상기 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직 염색을 실시하는 것이다. 뇌 손상 환자의 조직 및 에리스로포이에틴 및 제대혈을 투여한 뇌 손상 환자의 조직을 채취 및 고정한 후, 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후， 이와 상기의 항체 중 선택된 1개와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후， 반응하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독한다.
또한， 바람직하게는， 상기 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은， 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 흔성화시켜서 항원 -항체 복합체를 형성시키고， 이를 판독하여， 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후를 분석할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면， 본 발명의 키트는 마이크로어레이일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 유전자 증폭 키트이다.
본 발명의 키트가 마이크로어레이인 경우에는， 마이크로어레이의 고상표면에 프로브가 고정화 되어 있다. 본 발명의 키트가 유전자 증폭 키트인 경우에는 프라이머를 포함한다.
본 발명의 키트에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 서열목록 제 2서열의 뉴클레오티드 또는 서열목록 제 4서열의 뉴클레오티드 에 대하여 상보적인 서열을 갖는다. 본 명세서에서 용어 "상보적 (complementary)" 은 어떤 특정한 흔성화 (hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 흔성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것올 의미한다. 따라서 용어 "상보적" 은 용어 완전 상보적 (perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며， 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 흔성화할 수 있을 정도이면， 하나 또는 그 이상의 미스매치 (mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머" 는 적합한 온도에서 적합한 완층액 내에서 적합한 조건 (즉， 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형 -지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일 -가닥 을리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소， 예컨대， 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 층분히 안정된 흔성 복합체를 형성하기 위하여 일반 \적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.
프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 흔성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 층분한 상보성을 가지면 층분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 상술한 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며， 이 유전자 서열에 흔성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 층분한 상보성을 가지면 층분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램 (예: PRIMER 3프로그램)을 이용하여 할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "프로브" 는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄 (linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 흔성화 할 수 있으며， 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며， 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다.
프라이머 또는 프로브 제작 시 참조하여야 하는 본 발명 마커의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제 2서열 또는 서열목록 제 4서열이며， 이 서열을 참조하여 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기한 프로브는 흔성화 어레이 요소 (hybridizable array element)로서 이용되며， 기체 (substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서， 예컨대, 막， 필터, 칩, 슬라이드， 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드， 겔, 류빙， 플레이트, 고분자， 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 흔성화 어레이 요소는 상기의 기체 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어， 상기 흔성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도톡 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고， 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한， 상기 흔성화 어레이 요소는 링커 (예 : 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.
한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지 (labeling)될 수 있고， 마이크로어레이상의 어레이 요소와 흔성화된다. 흔성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 흔성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.
본 발명의 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 분석용 키트는 흔성화에 기초하여 실시할 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브가 이용된다.
상술한 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 흔성화 되는 프로브를 이용하여 흔성화 -기초 분석을 하여 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후를 분석할 수 있다.
프로브의 표지는 흔성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 을리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단 (예컨대， 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin) , 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5(Pharmacia) )， 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소 (P32 및 S35), 매스 표지， 전자밀집입자, 효소 (알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제)， 조인자， 효소에 대한 기질， 중금속 (예컨대, 금) 그리고 항체， 스트렙타비딘， 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법， 예컨대， 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법， 무작위 프라이밍 방법 (Mult ipr ime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65 :499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정， 중량 측정， X-선 회절 또는 흡수， 자기， 효소적 활성， 매스 분석， 결합 친화도, 흔성화 고주파， 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.
분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생물학적 시료 (biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있으며， 바람직하게는 혈액에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 흔성화 반응 -기초 분석을 실시할 수도 있다.
프로브를 이용하는 경우 프로브를 cDNA 분자와 흔성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 흔성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용올 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어， 온도， 성분의 농도， 흔성화 및 세척 시간， 완층액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 흔성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al .， Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor , N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springerᅳ Ver lag New York Inc. N.Y. 1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어， 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHP04, 7% SDS (sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65 °C 조건으로 흔성화하고， 0.1 x SSC( standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68 °C 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는， 고 엄격조건은 6 X SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48°C 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어， 0.2 X SSC/0.1% SDS에서 42°C 조건으로 세척하는 것을 의미한다.
흔성화 반응 이후에， 흔성화 반응을 통하여 나오는 흔성화 시그널을 검출한다. 흔성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어， 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 흔성화 반웅 결과물과 반웅시켜 흔성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소 /기질의 조합은ᅳ 퍼옥시다아제 (예컨대， 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프를， 아미노에틸카바졸， 디아미노벤지딘， D-루시페린， 루시게닌 (비스 -N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르， 루미놀, 암플렉스 레드 시약 (10-아세틸 -3， 7- 디하이드톡시페녹사진)， HYR( p-pheny 1 ened i am i ne-HC 1 and pyrocatechol ) , TMB(tetramethylbenzidine) , ABTS(2,2 '-Azine-di [3-ethyl benzthiazol ine sulfonate]), o-페닐렌디아민 (OPD) 및 나프를 /파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트 (BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움 (NBT), 나프를 -AS-B1-포스페이트 (naphthol-AS-Bl-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m- PMS(phenzaine methosul fate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. 따라서 본 발명의 마커를 검출하는 방법을 흔성화에 기초하여 실시하는 경우에는， 구체적으로 (i) 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브를 핵산 시료에 흔성화시키는 단계; (Π) 상기 흔성화 반웅 발생 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 흔성화 과정에 의한 흔성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대해 판단할 수 있다. 즉， 시료에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대한 흔성화 시그널이 정상 시료 (예컨대， 에리스로포이에틴 및 제대혈을 투여하지 않은 뇌 손상 환자)보다 강하게 나오는 경우에는 뇌 손상 증세의 경감또는 완화된 것으로 판단된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면， 본 발명의 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 분석용 키트는 유전자 증폭 키트일 수 있다.
본 명세서에 기재된 용어 "증폭" 은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다 . 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며， 이는 중합효소 연쇄반웅 (PCR) (미국 특허 제 4,683， 195， 4,683,202, 및 4,800, 159호)， 역전사-중합효소 연쇄반응 (RT— PCRXSambrook 등， Molecular Cloning. A Laboratory Manual , 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)) , Miller, H. I. (W0 89/06700) 및 Davey, C. 등 (EP 329, 822)의 방법, 리가아제 연쇄 반웅 (ligase chain reaction; LCR)(17, 18)， Gap-LCR(W0 90/01069), 복구 연쇄 반웅 (repair chain reaction; EP 439,182)， 전사 -매개 증폭 (transcript ion-mediated amplification; TMA, W0 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제 (self sustained sequence replication, W0 90/06995) , 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭 (selective amplification of target polynucleotide sequences , 미국 특허 제 6，410，276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반웅 (consensus sequence primed polymerase chain react ion (CP-PCR) , 미국 특허 제 4,437, 975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (arbitrari ly primed polymerase chain react ion(AP- PCR), 미국 특허 제 5, 413, 909호 및 제 5, 861, 245호)， 핵산 염기서열 기반 증폭 (nucleic acid sequence based am l i f i cat i on(NASBA) , 미국 특허 겨 ]5,130,238호， 제 5,409,818호， 겨 15, 554, 517호， 및 제 6, 063, 603호)， 가닥 치환 증폭 (strand displacement amplification) 및 고리 -증재 항온성 증폭 (loop— mediated isothermal amplification; LAMP)를 포함하나， 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제 5, 242， 794， 5,494,810, 4, 988, 617호 및 미국 특허 제 09/854, 317호에 기술되어 있다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로， 그의 많은 변형과 웅용들이 개발되어 있다. 예를 들어， PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운 (touchdown) PCR, 핫 스타트 (hot start) PCR, 네스티드 (nested) PCR 및 부스터 (booster) PCR이 개발되었다. 또한， 실시간 (real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR) , cDNA 말단의 신속 증폭 (rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반웅 (inverse polymerase chain react ion: IPC ) , 백토레트 (vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J. , 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Spr inger-Ver lag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며， 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명의 키트를 프라이머로 이용하여 실시하는 경우에는， 유전자 증폭 반웅을 실시하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 본 발명은 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 분석하는 것이기 때문에， 분석 대상의 시료 (예컨대, 혈액， 혈장, 혈청 또는 소변)에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 mRNA 양을 조사하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 결정한다.
따라서 본 발명은 원칙적으로 시료 내의 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반옹을 실시한다. mRNA를 얻기 위하여， 시료에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다 (참조: Sambrook, J . et al . , Molecular Cloning. A Laboratory Manual , 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)； Tesniere, C. et al . , Plant Mol . Biol . Rep., 9:242(1991)； Ausubel, F.M. et al. , Current Protocols in Molecular Biology, John illey & 5o/75(1987); 및 Chomczynski, P. et al . , Anal. Biochem. 162：156(1987)). 예컨대， TRIz 을 이용하여 용이하게 세포내의 총 RNA를 분리할 수 있다. 이어， 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 시료로부터 분리되는 것이기 때문에， mRNA의 말단에는 폴리 -A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 을리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다 (참조: PNAS USA, 85： 8998 ( 1988)； Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al . , Molecular Cloning. A Laboratory Manual , 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(200D) . 이어， 유전자 증폭 반웅을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다.
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 흔성화 또는 어닐링되어， 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 흔성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor , N.Y.(2001) 및 Haymes , B. D. , 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다. 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며， E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우" 단편， 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는， 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq) , Thermus thermophi lus (Tth) , Thermus f i liformis, Therm is f 1 avus , Thermococcus literal is, 및 Pyrococcus furiosus (Pfu)를 포함한다.
중합 반웅을 실시할 때， 반웅 용기에 반웅에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반옹에 필요한 성분들의 과량은， 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다.
Mg2+와 같은 조인자， dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반웅 흔합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반웅에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실， 완층액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반웅물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서 어닐링은 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열 -의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다. 이렇게 증폭된 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 cDNA를 적합한 방법으로 분석하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 예를 들어， 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고， 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 이러한 증폭 반웅을 통하여， 생물학적 시료에서 본 발명 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현이 정상 시료 (예컨대， 에리스로포이에틴 및 제대혈을 투여하지 않은 뇌 손상 환자의 혈액， 혈장 또는 혈청)보다 높게 나오는 경우에는 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화된 것으로 판단된다.
따라서 본 발명의 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 마커의 검출 방법을 cDNA를 이용하는 증폭반웅에 기초하여 실시하는 경우에는， 구체적으로 ( i ) 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 어닐링되는 프라이머를 이용하여 증폭 반응을 실시하는 단계; 및 (Π) 상기 증폭 반응의 산물을 분석하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현정도를 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 마커는 에리스로포이에틴 및 제대혈을 투여한 뇌 손상 환자에서 고발현 되는 생체 분자이다. 이러한 마커의 고발현은 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "고발현" 은 조사 대상의 시료에서의 대상이 되는 뉴클레오티드 서열의 발현 정도가 대조군 시료와 비교하여 높은 경우를 의미한다. 예컨대 , 당업계에서 통상적으로 이용되는 발현 분석 방법， 예컨대 RT— PCR 방법 또는 ELISA 방법 (참조: Sambrook, J. et al . , Molecular Cloning. A Laboratory Manual , 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))에 따라 발현 분석을 한 경우， 발현이 많은 것으로 분석되는 경우를 의미한다. 예를 들어， 상술한 분석 방법에 따라 분석한 결과 , 본 발명의 마커가 대조군과 비교하여 2-10 배 정도 고발현 되는 경우， 본 발명에서의 "고발현" 으로 판정하고 뇌 손상 증세가 경감 또는 완화된 것으로 판정한다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 분석에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 서열목록 제 2서열의 뉴클레오타이드 또는 서열목록 제 4서열의 뉴클레오타이드의 발현을 검출하는 방법을 통해 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 마커를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명에서의 생물학적 시료는 조직， 세포， 혈액， 혈청， 혈찾， 타액ᅳ 뇌척수액 또는 뇨를 의미하고， 바람직하게는 혈액， 혈장 또는 혈청을 의미하며， 가장 바람직하게는 혈장올 의미한다.
본 발명의 명세서에서 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 마커를 검출하는 방법은 상기 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터 또는 예후 분석용 키트와 공통된 내용을 포함하고 있기 때문에， 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해서 그 기재를 생략한다.
【발명의 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
( i ) 본 발명은 에리스로포이에틴， 제대혈 또는 에리스로포이에틴과 제대혈 투여에 따른 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 분석용 키트를 제공한다.
(ii) 본 발명은 에리스로포이에틴, 제대혈 또는 에리스로포이에틴과 제대혈 투여에 따른 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 마커를 검출하는 방법을 제공한다.
(iii) 본 발명을 이용하면 에리스로포이에틴， 제대혈 또는 에리스로포이에틴과 제대혈 투여에 따른 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화를 효과적으로 모니터링 할 수 있다. 【도면의 간단한 설명】
도 1은 에리스로포이에틴 및 제대혈 투여에 따른 뇌성마비 환자의 임상학적 변화를 측정한 결과이다.
(A) GMPMCGross Motor Performance Measure), (B) 한국 베일리 영유아 발달검사 인지 척도 (Korean Bay ley Scale 2nd version, Mental Scale), (C) 한국 베일리 영유아 발달검사 동작 척도 (Korean Bay ley Scale 2nd version, Motor Scale), (D) '아동용 일상생활 기능독립측정 (WeeFIM, Functional Independence Measure for Children)'의 사회인지기능 (Social cognition)
도 2는 에리스로포이에틴 및 제대혈 투여 전과 투여 후 24시간 째에 따른 뇌 손상 환자의 혈장 펜트락신 (Pentraxin, PTX) 3, (Brain-derived neurotrophic factor) 및 CRP(C-react ive protein)의 수치 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 에리스로포이에틴 및 제대혈 투여 후 시간별 (투여 전， 24시간 후， 4일 후, 8일 후)에 따른 뇌 손상 환자의 혈장 펜트락신 3의 수치 변화를 나타낸 그래프이다. '
도 4는 에리스로포이에틴 및 제대혈 투여에 따른 뇌 손상 환자별 혈장 펜트락신 3(표 4) 수치 변화의 평균값 (투여 전, 투여 후 24시간, 11일， 3개월)을 나타낸 그래프이다.
(a) 투여 전 및 투여 후 1일 째 비교， (b) 투여 후 1일 째 및 11일째 비교, (c) 투여 후 11일째 및 3개월 째 비교, (d) 투여 전 및 투여 후 11일 째 비교， (e) 투여 전 및 투여 후 3개월 째 비교， (f) 투여 후 1일 째 및 3개월 째 비교， (g) 투여 전, 투여 후 24시간， 11일， 3개월 째 비교.
도 5는 에리스로포이에틴 및 제대혈 투여에 따른 뇌 손상 환자별 혈 장 BDNF의 수치 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 에리스로포이에틴 및 제대혈 투여에 따른 뇌 손상 환자 (P**) 의 혈장 펜트락신 3 및 BDNF의 수치 변화를 나타낸 그래프이다.
도 7은 에리스로포이에틴 및 제대혈 투여에 따른 뇌 손상 환자의 혈 장 펜트락신 3 및 BDNF 수치 변화의 평균값 (투여 전， 투여 후 24시간， 4일 , 8일)을 나타낸 그래프이다.
도 8은 에리스로포이에틴 및 제대혈 투여에 따른 뇌 손상 환자의 혈 장 BDNF 수치 변화의 평균값 (투여 전， 투여 후 24시간， 6개월)을 나타낸 그 래프이다.
도 9는 에리스로포이에틴 및 제대혈 투여에 따른 뇌 손상 환자별 혈 장 CRP의 수치 변화를 나타낸 그래프이다.
도 10은 에리스로포이에틴 및 제대혈 투여에 따른 뇌 손상 환자의 혈 장 CRP 수치 변화의 평균값 (투여 전, 투여 후 24시간, 4일， 8일)을 나타낸 그래프이다. 이하， 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이 들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다 는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
【실시예】
재료 및 방법
환자 등록
2009년 3월에서 2010년 1월까지 뇌성마비로 분당 차 병원， 재활의학과에 등록된 환자의 샘플을 수집하였다. 포함 기준은 1) 유전학적 장애가 없으몌 2) MRI를 통해 뇌 손상이 관찰되거나， 또는 비정상적인 신경발달을 설명할 수 있는 출산 전후의 이력이 있는 환자， 3) 임상진단 명이 뇌성마비로 비정상적 근긴장과 움직임 및 운동 발달이 늦어지는 환자， 4) 초기 헤모글로빈 농도가 13.5 g/dL 미만인 환자， 5) 입원기간 동안에 재활하는데 문제가 없는 환자를 실험의 대상으로 하였다. 그 외에 2년 전에 전두엽부위 뇌경색이 발생되었던 이 **(3)， 장기적으로 파킨슨병이 지속되고 있었던 이 **(4)， 경등도의 열공성 뇌경색으로 기억력 감퇴가 나타났던 P**(성인)을 대상으로 제대혈과 EP0를 처방하였다. rhEPO를 치료받은 환자는 사전에 동의를 받았으며, 본 실험의 시험법은 분당 차병원 임상시험심사위원회에서 사전에 허가를 받았다.
【표 1】
뇌성마비 환자들의
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000031_0002
【표 2】
뇌성마비 환자의 발병원인 및 유형분류
Figure imgf000031_0003
Figure imgf000032_0001
SB: 양측마비 (Spastic bilateral), SU: 일측성 마비 (Spastic unilateral), D: 근긴장이상 (Dystonia), C: 무도무정위운동 (Choreoathetosis；)， A: 운동실조 (Ataxia) (Bax, 2005) rhEPO의 처방
rhEPO를 처방받은 환자 그룹은 250 IU/kg을 처방 받고， 일주일에 두 번 피하주사로 주입하였다. 250 IU/kg은 빈혈증 환자에게 사용되는 양보다 많다. 적혈구 증가증이 생기는 것을 주시하기 위해 매 주마다 퇴원하기 전까지 전혈 세포 수를 측정하였다. rhEPO 처방은 헤모글로빈 수치가 15g/dL 이상 높아지면 중단하였으며， 처방 기간 동안에 철분 보조제의 섭취를 금하였다. 한 달이 넘는 기간 동안 rhEPO를 처방받은 그룹은 평균 7.2회 (1,800 IU/kg)을 처방받았다 (주사 5회에서 9회는 약 1,500에서 2,500 IU/kg을 처방 받은 것과 동일하다). 제대혈의 처방 제대혈을 녹여 단핵세포를 준비하고 3.0-5.0X107 세포 /kg를 혈관 (말초， 중심정맥 또는 동맥)으로 면역억제제 (cyclosporine, 100-200 ng/kg, 4주)와 함께 주사하였다. EP0와 함께 투여할 경우， 제대혈을 투여하기 12시간 및 2시간 전에 500 IU/kg의 EP0를 먼저 정맥 주사하였다 (제대혈은 1회만 투여하였고， EP0는 6-10회 투여하였음). 펜트락신 3의 측정
환자들에게 제대혈을 투여하기 전 및 후 (24시간， 4일， 8일)에 혈액을 채취하였다. 펜트락신 3(Pentraxin 3， PTX3) 측정을 위하여 스트렙타비딘이 코팅된 마이크로플레이트에 150 μΐ의 비오티닐화 ΡΤΧ3 항체를 처리하여 1시간 동안 상온에서 배양한 후 400 μΐ의 세척 버퍼를 이용하여 두 번 세척하였다. 혈장 샘폴 30 μΐ에 3 μ 1 Pretreatment D를 넣고， 30분간 배양한 후 표준 재조합 PTX3는 20 ng/ml에서 0.31 ng/ml까지 2배로 계열 희석하여 준비하였다. 마이크로플레이트에 100 μΐ의 샘플 버퍼를 먼저 넣고 30 μΐ의 표준 샘플과 샘플을 첨가한 후 2시간동안 상온에서 배양하고 400 μΐ의 세척 버퍼를 이용하여 4 회 세척하였다. 150 μ I의 ΡΤΧ3 검출 항체 (HRP conjugated)를 처리하고， 2시간 동안 상온에서 배양한 후 400 μΐ의 세척 버퍼를 이용하여 4 회 세척하였다. 200 μ 1의 ΤΜΒ를 넣고 30분간 반응시키고, 50 μΐ의 스톱 솔루션 처리 후, 450 nm 흡광도를 측정하였다.
BDNF의 측정
환자들에게 제대혈을 투여하기 전 및 후 (24시간, 4일， 8일, 6개월)에 혈액을 채취하였다. BD F 측정을 위하여 BDNF 항체를 마이크로플레이트에 150 μΐ씩 코팅된 것을 이용하였다. 샘플 버퍼를 100 μΐ씩 마이크로플레이트에 먼저 넣고， 혈장을 50 ul 씩 첨가하였다. 이때 사용된 혈장은 혈소판이 완전히 제거되게끔 10,000 X g에서 10분간 원심분리된 혈액을 사용하였다. 모든 혈장은 EDTA 항웅고제로 이용하였다. 상온에서 2시간 동안 배양한 후， 세척과정 없이 곧바로 BDNF 검출 항체 (HRP conjugated)를 100 μ 1씩 넣고， 상온에서 1시간동안 배양하였다. 이후 세척과정을 3번 후에 200 μΐ의 ΤΜΒ를 넣고 30분간 반응시키고， 50 μ 1의 스톱 솔루션 처리 후， 450 nm흡광도를 측정하였다. 실험결과
EP0및제대혈 투여에 따른 뇌성마비환자의 임상학적 변화
UCBCUmbilical Cord Blood, 제대혈)군은 제대혈을 투여하고 4주간 rhEPO를 투여하였고, EP0군은 플라시보 제대혈을 투여하고 4주간 rhEPO를 투여하였다. 대조군은 플라시보 제대혈을 투여하고 4주간 플라시보 rhEPO를 투여하였으며， UCB군, EP0군 및 대조군 모두 6개월간 재활치료를 병행하였다. 제대혈 투여 또는 플라시보 제대혈 투여 후 1개월， 3개월 및 6개월이 경과한 시점에 대동작 운동 수행능력 (Gross Motor Performance Measure, GMPM), 한국판 베일리 영유아발달검사 iKBayley Scales of Infant Development test II, BSID-II) 인지 및 동작 점수를 측정하였다. 그 결과, 제대혈과 EP0를 함께 처리한 군에서 GMPM (도 1A), BSID-II 인지 (도 1B) 및 동작 (도 1C) 점수에서 모두 EP0 단독 처리군 및 대조군과 비교하여 높은 점수를 나타냈다. 이로써， 제대혈 및 EP0 투여가 뇌성마비 환자의 증세 개선에 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다.
EP0및제대혈 투여에 따른 뇌손상환자의 임상학적 변화
박 ** 환자의 경우， 뇌손상 후 거의 4년이 경과된 시점으로 호전을 기대하기는 어려운 상황이었으나 EP0 및 제대혈 투여 후 임상적 호전이 많이 관찰되었다. 주변 사람들을 왼손으로 잡아당기거나 닥치는대로 물어뜨는 행동， 소리지르기가 계속되었으나 EP0 및 제대혈 투여 후 단기간 내에 이러한 행동이 상당히 교정되었으며, 작업치료 시에도 차분히 앉아서 과제에 집중하는 모습을 나타내었다. 또한 스스로 휠체어에서 일어나는 동작, 색깔 구별 및 10 자리의 덧셈， 뺄셈이 가능하게 되었으며， 이전에 사용하지 않던 오른손으로 볼펜 누르기 및 악수 등의 움직임이 발생하게 되었다.
김 ** 환자의 경우, 좌측 마비가 심하나 실제적으로는 중증 사지 마비 수준으로 고개를 가누고 앉아 있는 것도 어려운 상태로 좌측 편측 무시로 인한 시공간 인지가 부족하였고， 우측으로 눈동자의 치우침이 있었으나 EP0 및 제대혈 투여 후, 좌측에 대한 공간능력 및 사물에 대한 인식이 증가하였고 눈동자가 중앙 및 왼쪽으로 오는 시간이 증가하였다. 또한ᅳ 기존에는 머리 가누기를 거의 하지 못하였으나， 체간 힘의 증가로 침상에서 머리 가누기 시간이 증가하였고 방향성 또한 향상되었으며， 휠체어를 탄 상태에서 지지대 없이도 머리를 들고 유지할 수 있게 되었다. 한편， 발병 이후 우울증이 있어 항우울제를 투약 중이었으나 EP0 및 제대혈 투여 이후 표정이 밝아지고 웃음이 많아졌으며， 휠체어로 이동시 스스로 하려는 움직임이 많아졌다. 발의 근력이 약하여 스스로 움직이기 어려웠으나 발을 스스로 돌려 움직일 정도로 근력이 향상되었으며, 일상생활동작 수행시， 보호자의 다양한 지시에 빠른 반응을 보이게 되었다.
고 ** 환자의 경우, 사지마비 및 식물인간 상태로 외부 자극에 대한 반웅을 전혀 보이지 않는 환자였으나, EP0 및 제대혈 투여 후 외부 지시에 따른 눈깜빡임 수행의 정확도 빈도가 향상되었으며, 빛과 소리로 이루어진 복합적인 자극을 주는 인지치료를 시행하였을 때， 수행의 정확도 빈도가 향상되었다. 시술 전에는 수면이 2-5시간가량 지속되다가 깨어나는 경우가 많았으나， 시술 후에는 7시간 이상 안전적으로 수면하는 날이 많았다.
이 **(1) 환자의 경우, 전두엽 손상으로 인해 같은 말을 반복하고 보호자의 다른 말을 따라하는 보속증 증상이 심하였으나 EP0 및 제대혈 시술 이후 보속증 증상이 감소하고， 다른 말의 시작을 본인 스스로 말할 수 있게 되었고 사용 가능한 단어의 범주가 증가하였다. 전두엽 손상으로 주의 집중력이 많이 감소하였고， 특히 시간에 대한 지남력 및 보호자 이외의 사람에 대한 지남력 또한 감소한 상태였으나 시술 이후 담당 주치의를 알아보고， 반응 속도 또한 약간 빨라진 모습이 관찰되었다. 또한， 우울증이 있어 항우을제를 복용하였으나 시술 이후 성격이 쾌활해졌으며， 적극적으로 언어 의사표현이 가능하게 됐을 뿐 아니라 농담도 할 수 있게 되었다. 시술 이전에는 서있는 자세 및 보행 패턴이 나타나지 않았고， 보호자의 전적인 도움 하에 보행 연습을 하면서 환측인 좌측 뿐만 아니라 정상인 우측에도 체중을 싣지 못하고 무게 중심에 대한 정확한 개념이 없었으나 시술 이후 무게 중심 이동에 대한 개념을 이해하였고, 그 결과 보통의 도움 하에서 보행이 가능하게 되었다. 또한， 발목 관절의 운동 가동범위가 증가하여 서있는 자세 및 보행 동작 시 발이 끌리는 양상이 감소하였으며, 시술 전 본인 신체에 대한 인지력이 부족하여 신체의 사용 및 공간에 대한 파악력이 부족하였으나 시술 이후 좌측 신체에 대한 인식력이 증가하고, 스스로 사용하려는 모습이 관찰되었다.
이 **(2) 환자의 경우, 전반적인 뇌 위축 및 사지 마비 상태이기 때문에 시술 이전에는 주위 빛과 소리 자극에 대한 반응이 전혀 관찰되지 않았으나 EP0 및 제대혈 시술 이후 사람들이 크게 말할 때 고개를 돌리는 반웅이 때때로 관찰되었다. 의미있는 사지의 움직임은 시술 이후에도 여전히 관찰되지 않았으나 통증에 대한 반웅의 정도 및 무의식 상태에서 움직임을 볼 때 움직임의 범위가 커지고 빈도 또한 증가하였다. 또한， 오랜만에 보는 사람들에게 눈물을 흘리는 반응을 보이는 등 주위 사물에 대한 인지력이 약간 향상되는 모습이 관찰되었다.
진 ** 환자의 경우， EP0 및 제대혈 시술 이전에는 심한 신근 패턴 (Extensor pattern)으로 인해서 기능적인 움직임 및 자세 유지가 매우 힘들었으나 시술 이후 하지의 심한 신근 패턴이 감소되었고， 이로 인하여 수동적으로 앉는 자세를 만들어 줄 경우 보호자의 지지 하에 앉아 있는 시간이 증가하였다. 시술 이전에는 인지력 저하로 인하여 음식물을 계속 입에 물고 있는 모습이 관찰되었으나 시술 이후 연하이지를 이용하여 구두 섭취가 가능해졌고， 보호자의 지시 하에 식사 시간이 감소하였으며， 좋고 싫은 것에 대한 표현이 명확해졌다. 또한, "똥， 오줌" 등 의사 표현을 하기 시작하여 대소변을 가리기 시작하였으며 , 소리에 대한 반웅 속도가 증가하여 사람의 말소리가 들리거나 음악 소리에 대한 시선 이동이 증가하였다. 체간의 근력 증가로 머리 가누기의 범위가 약간 증가하였고， 평행봉 잡은 상태에서 보통의 도움 하에서 10분가량 서있는 것이 가능해졌다. 하지의 경직도가 근긴장도 (modified Ashworth scale, MAS) 상 G2에서 G1+로 호전되었고， 양측 어깨 및 고관절의 운동가동 범위가 증가하였다 (시술 1개월 후). 앉기 /서기 균형이 zero → poor로 호전되었으며 (6개월 후), 시술 6개월 째 우측 상 하지는 경직 (MAS로)이 G1, 좌측 상지는 G1, 하지는 G0로 큰 호전이 관찰되었다. 시술 6개월 째 웃음이 증가하였고, 사람들이 하는 말을 더 많이 알아들으며 음성으로 사람에 대한 선호도를 판단하고, 무조건 거부하는 것 (자기 주장을 지나치게 피력함)에서 벗어나 호불호를 명확히 구분하여 거부하는 모습 관찰되었다 (감정 조절하는 능력이 생김). 시술 6개월 째 언어평가 때 1， 2번째 손가락으로 번호를 표시하거나 눈깜빡임으로 의사를 표현하는 것이 가능해졌으며 (지속시간이 길지는 않음)， '아' 발성이 증가하였고， 혀와 턱의 반사적인 움직임이 감소하였다.
윤 ** 환자의 경우, EP0 및 제대혈 시술 이후 목의 움직임 및 눈동자가 따라가는 시간이 증가하였고， 강한 자극이 주어질 경우 왼쪽 상하지에서 하지는 Fair+ (기존: Trace-Zero)까지， 상지는 Poor+ (기존: Trace-Zero)까지 움직임이 가능해져 본인 의사를 적극적으로 표현하고 싶을 때 보호자를 왼손으로 치거나 발을 이용하는 모습이 관찰되었으며, 손을 달라고 할 경우 왼손을 움직여 주는 모습까지 관찰되었다. 눈앞에서 물체를 좌우로 움직일 때 수평 방향으로 눈동자의 따라감 정도가 증가하였고， 예전에는 눈동자를 고정하지 못하였으나 시술 이후 3초까지 사물에 눈동자를 고정하는 것이 가능해졌다 (일관성은 다소 낮은 편임). 또한, 시술 이전에는 얼굴 근육의 톤이 높아 차가운 물체로 자극할 때 불수의적으로 입술을 오므리는 것이 관찰되었으나 시술 이후 톤이 감소하여 구강치료 시 입술을 오물거리고 2개 손가락이 드나들 정도로 입술의 수의적 벌림이 가능해졌으며， 보호자가 써 주는 글씨에 대해서 분명히 반응하는 모습이 관찰되었다. 머리 가누기가 증가하였고, 바닥에서 떼고 일정 수준 들고 있을 수 있게 되었고 (사람들이 몰려오거나 큰 소리를 내면 고개를 들어 소리 나는 방향을 보고, 앉은 자세에서도 기존에는 고개를 숙이고 있었으나 고개를 들어 주위 환경을 살핌)， 의료진의 회진 시 고개를 들어 인사를 하는 모습 관찰되었다.
EP0 및 제대혈 투여 후 이 **(3) 환자의 경우， 전신의 운동 상태가 좋아져서 활동성이 향상되었으며， 이 **(4) 파킨슨 환자는 낮에 눈을 잘 뜨고 있지 못하였으나 눈을 잘 뜨고 견딜 수 있게 되었고, P** 환자는 기억력이 향상되었다. 혈관 염증 바이오마커의 수치 변화
EP0 및 제대혈을 투여한 뇌성마비 환자를 대상으로 혈장에서 PTX3 및 BDNF의 수치를 측정하였다. 바이오마커 수치를 측정한 박 ** 환자 및 김 ** 환자에서 EP0 및 제대혈 투여 24시간 후 PTX3가 증가하였으며， BDNF 및 CRP는 다소 감소하거나 큰 차이를 보이지 않았다 (도 2).
EP0 및 제대혈을 투여한 뇌손상 환자를 대상으로 혈장에서 IL-6, IL1B, TNF-α , CRP, BDNF 및 PTX3의 수치를 측정하였다. 각 환자별 PTX3C표 3, 4)， BDNF (표 5) 및 CRP (표 6)의 수치 변화는 표로 나타냈다 (-는 혈액 채취를 하지 않은 경우임). 이들 가운데 PTX3가 EP0 및 제대혈을 주사한 환자에게서 투여 후 24시간에 증가하였다가, 4일 후 및 8일 후 점차 감소하는 것을 확인하였다 (도 3).
한편， BDNF는 개별적으로는 이 **(1) 환자의 경우 투여 후 시간에 TKR2013/000629
따라 점차 BDNF가 증가하였고， 이 **(2) 환자의 경우는 24시간 내에 BDNF 수치가 증가하였다가 감소하는 특징을 나타내었지만 (도 5), 대체적으로 시술 전에 비하여, 시술 후 24시간 후에는 BDNF가 감소하였다가 6개월 이후에는 증가하는 성향을 나타냈다 (도 8). P** 환자의 경우， 제대혈 및 EP0 투여 24시간 후 PTX3는 증가하였고, BDNF는 수치에 있어 큰 차이가 나타나지 않았으나, 투여 168일 이후에는 BDNF 수치가 증가하는 경향을 나타내었다 (도 6). 한편， CRP의 경우 EP0 및 제대혈 투여 전후에 특이한 변화를 확인할수 없었다 (도 9).
【표 3】
환자별 PTX3수치의 변화 (ng/ml)
Figure imgf000039_0001
【표 4】
환자별 PTX3 수치의 변화 (ng/ml)
Figure imgf000040_0001
【표 5】
환자별 BDNF 수치의 변화 (ng/ml)
Figure imgf000041_0001
【표 6】
환자별 CRP 수치의 변화 (ng/ml)
Figure imgf000041_0002
Figure imgf000042_0001
기존의 염증 바이오마커 (TNF-a , IL-Ιβ , IL—6)의 경우， PTX3 바이오마커와 비교하여 염증 반응에 대한 민감성이 떨어져 환자들의 염증 바이오마커 수치를 측정한 결과, 변화가 없었던 것으로 추정된다. 한편, PTX3의 측정 수치에 있어 염증으로 간주되는 수치는 50 ng/ml 이상이나, 대개 제대혈 시술 및 EP0 투여 환자들의 PTX3 수치는 그 이하였다. 환자들간 측정 수치에서 약 10-20 ng/ml 내외의 차이가 있었으나, 공통적으로 EP0 및 제대혈 투여 전， 후 PTX3 수치의 변화 및 연관성이 뚜렷하게 나타났다. 따라서 PTX3는 단기간 모니터링으로 시술 시기와 그 정도를 평가하는 마커로서 이용될 수 있는 가능성을 지닌다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서， 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
서열목록 제 1서열의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 서열목록 제 3서열의 아미노산 서열을 갖는 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 서열목록 제 2서열의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 또는 서열목록 제 4서열의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 뇌 손상의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 분석용 키트.
【청구항 2】
제 1 항에 있어서， 상기 뇌 손상은 뇌성마비, 뇌졸중， 외상성 뇌 손상 및 파킨슨병으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 질환을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
【청구항 3】
제 1 항에 있어서， 상기 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화는 에리스로포이에틴 (erythropoietin), 제대혈 또는 에리스로포이에틴과 제대혈 투여에 의한 것을 특징으로 하는 키트.
【청구항 4】
제 1 항에 있어서， 상기 키트는 면역분석 (i醒 unoassay)용 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
【청구항 5】
제 1 항에 있어서， 상기 키트는 마이크로어레이인 것을 특징으로 하는 키트.
【청구항 6】
제 1 항에 있어서， 상기 키트는 유전자 증폭 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
【청구항 7】
인간의 생물학적 시료에 있는 서열목록 제 2서열의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 또는 서열목록 제 4서열의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 검출하는 방법을 통해 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화에 대한 모니터링 또는 예후 마커를 검출하는 방법.
【청구항 8】
제 7 항에 있어서, 상기 뇌 손상은 뇌성마비， 뇌졸중， 외상성 뇌 손상 및 파킨슨병으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 질환을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 9]
제 7 항에 있어서, 상기 뇌 손상 증세의 경감 또는 완화는 에리스로포이에틴 (erythropoietin) 및 제대혈 투여에 의한 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 10】
제 7 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액， 혈장 또는 혈청인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 11】
제 7 항에 있어서, 상기 방법은 마이크로어레이 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법 . 【청구항 12】
제 7 항에 있어서 , 상기 방법은 유전자 증폭 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법 . 【청구항 13】
제 7 항에 있어서， 상기 방법은 항원 -항체 반웅 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법 .
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2005042561A2 (en) * 2003-10-31 2005-05-12 Neuren Pharmaceuticals Limited Neural regeneration peptides and methods of use
WO2007106986A1 (en) * 2006-03-17 2007-09-27 Stem Cell Therapeutics Corp. Dosing regimes for lh or hcg and epo for treatment of neurological disorders

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005042561A2 (en) * 2003-10-31 2005-05-12 Neuren Pharmaceuticals Limited Neural regeneration peptides and methods of use
WO2007106986A1 (en) * 2006-03-17 2007-09-27 Stem Cell Therapeutics Corp. Dosing regimes for lh or hcg and epo for treatment of neurological disorders

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRINES, M. L. ET AL.: "Erythropoietin crosses the blood-brain barrier to protect against experimental brain injury", PNAS, vol. 97, no. 19, 12 September 2000 (2000-09-12), pages 10526 - 10531 *
KUMRAL, A. ET AL.: "Erythropoietin in neonatal brain protection: The past, the present and the future", BRAIN DEV., vol. 33, 24 November 2010 (2010-11-24), pages 632 - 643 *
VILLA, P. ET AL.: "Erythropoietin selectively attenuates cytokine production and inflammation in cerebral ischemia by targeting neuronal apoptosis", J. EXP. MED., vol. 198, no. 6, 15 September 2003 (2003-09-15), pages 971 - 975 *

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